WO2012144726A2 - 폴로-유사 키나아제 1의 종양항원 단백질 또는 유전자 - Google Patents

폴로-유사 키나아제 1의 종양항원 단백질 또는 유전자 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a tumor antigen protein or gene of polo-like kinase 1, specifically a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 derived from polo-like kinase 1 or variants having a functionally equivalent characteristics thereof It relates to a tumor antigen recognized by cytotoxic T lymphocytes in combination with MHC class I antigen or ⁇ antigen.
  • Polo-like kinase KPolo-like kinase 1 Plkl and serine-threonine kinase are cell divisions, mitotic entry, spindle formation, chromosome segregation, And cytokinesis.
  • Plkl overexpressed in NIH3T3 cells promotes transformation, forms cancer in nude mice, and plays a role in indicating the origin or prognosis of cancer.
  • Plkl is overexpressed in approximately 80% or more of human tumors, and increased expression correlates with poor prognosis and patient survival in various cancers.
  • Plkl inhibitors such as scytonemin, B-2536, HMN-214, 0N-01910, and poloxin, are being developed to assess the potential for treating cancer, and some of them are in clinical trials. Since many tumor antigens are immunotolerant as autoantigens, it is difficult to induce specific immune responses. Dendritic cells are the most potent antigen presenting cells and can break resistance against autoantigens by effectively priming naive T cells in vitro and in vivo. Meanwhile, among the molecules that regulate the cell cycle, Aurora A,
  • Topoisomerase ⁇ ⁇ ( ⁇ ⁇ ), Foxml, and Ran have already been reported as tumor antigens.
  • Aurora A is defined as a new marker for cellular immunological treatment of cancer. Immunogenicity of ⁇ ⁇ is demonstrated by vaccination in mRNA-electrolayered DCs in mouse systems. Foxml and Ran peptides can induce cytotoxic T cell activity in human PBMC and HLA-A2 transgenic mice.
  • Plkl is an important cell cycle protein and is closely related to these proteins. If Plkl induces specific immune response to tumor cells, it may be used as a target for immunotherapy to specifically remove tumor cells. This is not known at all.
  • the present invention includes a protein consisting of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 derived from the polo-like kinase KPolo-like kinase 1) or a variant having a functionally equivalent characteristic thereof, and comprising an MHC class I antigen or a ⁇ antigen In combination to provide tumor antigens recognized by cytotoxic T lymphocytes.
  • the present invention includes proteins consisting of amino acid sequences of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 derived from Polo-Hke kinase 1 or variants having functionally equivalent properties thereof, Binding to an antigen or a ⁇ antigen to provide a tumor antigen recognized by cytotoxic ⁇ lymphocytes.
  • the present invention provides a tumor prevention or treatment composition comprising the tumor antigen as an active ingredient.
  • the present invention provides a tumor prevention or treatment method comprising the tumor antigen as an active ingredient.
  • an antigen-presenting cell wherein a complex between an MHC class I antigen or a ⁇ antigen and the tumor antigen is presented on the surface of a cell having antigen-presenting ability.
  • an antigen-presentation in which a complex between an MHC class I antigen or a ⁇ antigen and the tumor antigen is presented, the method comprising introducing a gene encoding the tumor antigen into a cell having an antigen-presenting ability It provides a method for producing a cell.
  • composition for preventing or treating tumor comprising the antigen-presenting cell is provided.
  • a method for preventing or treating tumor, comprising the antigen-presenting cell comprising the antigen-presenting cell is provided.
  • a cytotoxic ⁇ lymphocyte that specifically recognizes a complex between an MHC class I antigen or a ⁇ antigen and the tumor antigen presented to the antigen-presenting cell.
  • composition for the prevention or treatment of tumors comprising the cytotoxic ⁇ lymphocytes.
  • a method for preventing or treating tumors comprising the cytotoxic ⁇ lymphocytes is provided.
  • Plkl may be a new target of T lymphocytes as a tumor antigen for general-purpose tumor immunotherapy, thereby completing the present invention.
  • the present invention will be described in detail.
  • the present invention includes proteins consisting of amino acid sequences of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 derived from polo-like kinase 1, or variants having functionally equivalent properties thereof, in combination with MHC class I antigens or ⁇ antigens Provides tumor antigens recognized by cytotoxic T lymphocytes.
  • the polo-like kinase 1 is preferably derived from mouse or human, but is not limited thereto.
  • variant having functionally equivalent properties means that even if some of the amino acids of the tumor antigen are substituted or deleted, they have a functionally equivalent property with the tumor antigen protein derived from the polo-like kinase 1.
  • the protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is SEQ ID NO:
  • the protein consisting of the amino acid sequence of 3 can be encoded from a gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4.
  • the present invention also provides a tumor antigen gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 encoding the tumor antigen protein.
  • the gene may be in the form of DNA or RNA.
  • the present invention provides a composition for the prevention or treatment of tumors comprising the tumor antigen as an active ingredient.
  • the tumor may be one expressing polo-like kinase 1, and the tumor expressing polo-like kinase 1 may be malignant melanoma, lymphoma, colon cancer, glioma, kidney cancer, ovarian cancer, breast cancer, glioblastoma, leukemia. , And cervical cancer, but is not limited thereto.
  • the present invention also provides a method for preventing or treating tumors, comprising administering an effective amount of the tumor antigen to a subject in need thereof.
  • a medicament containing the tumor antigen protein of the present invention or a variant having functionally equivalent properties thereof as an active ingredient is, for example, Tumor antigens may be prevented, relapsed, or treated by administering the tumor antigen to tumor patients or the like alone or using a cell carrier.
  • Tumor antigens of the present invention bind to MHC class I antigens or ⁇ antigens in antigen-presenting cells and are present at high density on the cell surface, thereby efficiently proliferating tumor-specific CTLs in the body, thereby preventing and re-inhibiting tumors. (relapse), or treatment is achieved.
  • Tumor antigens of the present invention can be used alone or in combination of two or more of the proteins or variants having functionally equivalent characteristics thereof, and by containing them as an active ingredient by injection with an immunoadjuvant to effectively establish cellular immunity. It may be administered orally in a particulate form.
  • An effective amount for administering the tumor antigen of the present invention to prevent or treat a tumor may be appropriately selected depending on the age, sex, condition, and symptoms of the disease of the patient, and preferably 0.1 to 500 mg of the tumor antigen per day. Can be.
  • the present invention also provides antigen-presenting cells wherein a complex between an MHC class I antigen or a ⁇ antigen and the tumor antigen is presented on the surface of a cell having antigen-presenting ability.
  • the antigen-presenting cell may be at least one selected from the group consisting of dendritic cells, monocytes, CD4 T cells, B cells, and ⁇ ⁇ T (ga ⁇ a delta T) cells, wherein the CD4 ⁇ cells, ⁇ cells And ⁇ ⁇ ⁇ cells are preferably in a naive state, in an activated state, or in an expanded state, but are not limited thereto.
  • the present invention also provides a method for producing an antigen-presenting cell, wherein a complex between the MHC class I antigen or a ⁇ antigen and the tumor antigen is provided, the method comprising introducing a gene encoding the tumor antigen into a cell having an antigen-presenting ability.
  • the gene may be in the form of DNA or RNA.
  • a virus vector may be used, but is not limited thereto.
  • a virus vector method for example, retrovirus, Lentivirus, Adenovirus, Adeno-associated virus, Herpes virus, Waxonia virus, Pox virus, Poliovirus, Sindbis virus
  • a method in which the DNA of the present invention is mixed and introduced into a DNA virus or an RNA virus.
  • a method using a retrovirus, a lentivirus, an adenovirus, an adeno-associated virus, a herpes virus, a waxsinia virus, or the like is particularly preferable.
  • a retrovirus, a lentivirus, an adenovirus, an adeno-associated virus, a herpes virus, a waxsinia virus, or the like is particularly preferable.
  • an electric stratification method may be used, but is not limited thereto.
  • the present invention also provides a composition for preventing or treating tumor, comprising the antigen-presenting cell.
  • the present invention also provides a method for preventing or treating tumors comprising administering an effective amount of the antigen-presenting cells to a subject in need thereof.
  • the antigen-presenting cells of the present invention may be formulated in the form of cell therapeutics known in the art, and may be administered by injection with an adjuvant or as a particulate formulation to effectively establish cellular immunity by containing them as an active ingredient. May be administered.
  • An effective amount for administering an antigen-presenting cell of the present invention to prevent or treat a tumor may be appropriately selected according to the age, sex, condition, and symptoms of a disease of the patient, preferably 0.1 to 500 mg of antigen-presenting per day. Cells may be administered.
  • the present invention also provides cytotoxic T lymphocytes that specifically recognize a complex between an MHC class I antigen or a ⁇ antigen and the tumor antigen presented to the antigen-presenting cell.
  • the cytotoxic T lymphocytes preferably include, but are not limited to, CD4 T cells or CD8 T cells.
  • the present invention provides a composition for preventing or treating tumors comprising the cytotoxic T lymphocytes.
  • the present invention also provides a method for preventing or treating a tumor comprising an effective amount of the cytotoxic T lymphocytes in a subject in need thereof.
  • the cytotoxic T lymphocytes of the present invention can be formulated in the form of cell therapy known in the art, and by containing them as an active ingredient, the cellular immunity can be effectively administered by injection or injection in combination with an adjuvant adjuvant, or as a particulate formulation. It can be administered orally.
  • An effective amount for administering the cytotoxic T lymphocytes of the present invention to prevent or treat a tumor may be appropriately selected according to the age, sex, condition and symptoms of the disease of the patient, preferably
  • cytotoxic T lymphocytes may be administered per day.
  • Proteins derived from polo-like kinase 1 of the present invention or variants having functionally equivalent properties thereof may be combined with an MHC class I antigen or a ⁇ antigen to form a complex, thereby allowing the complex to be recognized by cytotoxic T lymphocytes. By identifying the antigen, it can be used for immunotherapy of general tumors.
  • FIG. 1 shows Western expression of Plkl expression in mouse tumor cell lines, human tumor cell lines, and mouse normal tissues.
  • Figure 2 shows the levels of IFN- ⁇ -producing T cells following mPlklRNA / DCs and mSuvRNA / DCs vaccination.
  • Figure 3 shows the levels of IFN- ⁇ -producing T cells following mPlklRNA / DCs and huPlklRNA / DCs vaccination.
  • Figure 5 shows the tumor growth inhibition by mPlklRNA / DCs and mSuvRNA / DCs vaccination.
  • Figure 6 shows the tumor growth inhibition according to the mPlklRNA / DCs and huPlklRNA / DCs vaccination.
  • Figure 7 shows the levels of IFN- ⁇ -producing T cells of CD4 + and CD8 + T lymphocytes following mPlklRNA / DCs vaccination.
  • 8 shows tumor growth inhibition of CD4 + and CD8 + T lymphocytes following mPlklRNA / DCs vaccination.
  • Figure 9 shows the level of IFN- ⁇ producing ⁇ cells for huPlklRNA / DCs, huCEARNA / DCs, and DCs to confirm huPlkl specific cellular immune responses of in vitro induced huPlkl specific CTLs.
  • FIG. 10 shows the level of IFN- ⁇ -producing T cells of CD4 + and CD8 + T lymphocytes according to CTL induction of huPlklRNA / DCs.
  • mice C57BL / 6 mice (H-2b, 6-8 weeks old) and Balb / c mice (H-2d, 6-8 weeks old) were purchased from Orient Bio (Gapyeong, Gyeonggi-do, Korea) and used. The mice were maintained and handled according to the guidelines of the animal care community association.
  • Human peripheral blood was obtained from seven healthy volunteers and peripheral mononuclear cells were isolated using Ficoll-Hypaque (Amersham Pharmacia Biotech, USA) density gradient centrifugation. Volunteer human leukocyte antigen (HLA) -A subtypes were determined by sequence-based typing in the HLA laboratory. Consents and approvals for this study were obtained from volunteers and the IRB Research Committee at Garlic University School of Medicine.
  • Cancer cells include GL26 (H-2b; glioma), MC-38 (H-2b; colorectal cancer), B16F10 (H-2b; malignant melanoma), Renaca (H-2d; kidney cancer), and CT26 (H-2d).
  • Colon cancer with 10% heat inactivated fetal bovine serum (fetal bovine serum, FBS, Gibco, Grand Island, NY, USA), 2 mM glutamine, 100 U / mL penicillin (penici 1 Hn), and 100 / complete DMEM under complete supply of / g / mL streptomycin In Dulbecco's Moified Eagle Medeum).
  • EL4 H-2b; Lymphoma
  • YAC-1 H-2a; Lymphoma
  • EL4 H-2b; Lymphoma
  • YAC-1 H-2a; Lymphoma
  • GL26 is Dr. In John S. Yu (Cedars Sinai Medical Center, Los Angeles, CA, USA)
  • MC-38, EL4, B16F10, Renca, CT26 and YAC-1 are American Type Culture Collect ion (ATCC, Manassas, VA, USA) Purchased from
  • CDNA was used as a mouse Plkl template for polymerase chain reaction (PCR) amplification from GL26 tumor cells. PCR conditions were as follows: 2 minutes at 94 ° C; 15 seconds at 94 ° C, 30 seconds at 60 ° C, and 30 cycles of 1 minute at 72 ° C; 10 minutes at 72 ° C.
  • Primers for mouse Plkl were 5'-ccc aagctt (Hind IE) ATG AAT GCA GCG GCC AAA GCT G-3 '(forward primer) and 5'-eg gaattc (EcoR I) CTA GGA GGC CTT GAG GCG GTT G-3 (Reverse primer). PCR products were cloned into pcDNA3.1 vector (Invitrogen, Grand island, NY, USA). The cloned gene was confirmed by sequencing.
  • Example 1-2 Bone marrow-derived dendritic cell culture
  • dendritic cells bone marrow cells were collected from the bone marrow of the tibia and femur of C57BL / 6 mice, and then used hypotonic buffer (hypotonic buffer, 9.84 g / L NH4C1, 1 g / L KHC03, and 0.1 mM EDTA). Red blood cells were removed. From Balb / c Mice for Vaccination of CT26 Tumor Model Dendritic cells were prepared. The cells were washed twice with serum-free RPMI-1640 medium, followed by granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF, e-bioscience, San Diego, CA, USA).
  • hypotonic buffer hypotonic buffer
  • GM-CSF granulocyte macrophage colony-stimulating factor
  • rodent-derived recombinant interleukin-4 recombinant murine interleukin-4, Ib4, e ⁇ bioscience
  • the complete medium containing IL-4 was supplemented. On day 6 of culture, nonadhesive and loosely floating cells (dendritic cells) were collected.
  • Example 1-3 Plkl mRNA Electrostratum into Dendritic Cells
  • the mouse Plkl / pcDNA3.1 plasmid was cut with a Seal and the cut DNA was used as a template for performing in vitro transcription (IVT) by mMessage mMachine T7 Ultra Kit CAmbion, Austin, TX, USA).
  • IVT in vitro transcription
  • the mRNA concentration and quality were measured by spectrophotometry and agarose gel electrophoresis.
  • RNA samples were aliquoted and stored at _70 ° C. After 6 days of incubation, the dendritic cells were prepared in Opt i-MEM medium at a concentration of 2.5 ⁇ 10 7 cells / mL, and 200 ⁇ of the cell suspension was placed in a 2- ⁇ cuvette and 20 g of RNA was added thereto.
  • the cell suspension was placed in an electroporator (ElectroSquarePorator, ECM 830, BTX, San Diego, CA, USA) and given 300V current for 500 us.
  • Cells transfected with RNA were immediately removed from the cuvette and completely loaded with GM-CSF, IL-4 and LPS (1 / g / mL: Sigma, Saint Louis, M0, USA) in dendritic cells for 24 hours. Matured.
  • the transfer efficiency of the dendritic cells by the electro-lamellar method was measured by EGFP RNA through FACS analysis.
  • Example 2 Preparation of dendritic cell vaccine loaded with huPlkl RNA Example 2-1.
  • PCR polymerase chain reaction
  • Primers for human Plkl were 5'-ATG AGT GCT GCA GTG ACT TCA GGG M-3 '(forward primer) and 5'-TTA GGA GGC CTT GAG ACG GTT GCT-3' (reverse primer).
  • PCR products were cloned into pcDNA3.1 T0P0 vector (Invitrogen, Grand island, NY, USA). The cloned gene was confirmed by sequencing.
  • Example 2-2. CD14 + Monocytes -Derived Human Dendritic Cell Culture
  • the template DNA was removed from the mixture by A tailing, and each tumor antigen RNA was recovered only by the Plkl RNA by phenol / chloroform extraction and ethanol precipitation. The recovered RNA was measured using nanodrop spectrophotometry (ND-1000, USA). Transfer of Tumor Antigen RNA to Human Dendritic Cells is based on Opti-MEM. After washing twice with medium (Gibco BRL. USA) and suspended in 200 ul, 40 ug of tumor antigen RNA per 1X10 6 dendritic cell was mixed and subjected to 300 V, 500 usee conditions using an electric stratifier (BTX, USA).
  • BTX electric stratifier
  • mice tumor cell line, human tumor cell line, and mouse normal tissue are finely ground with a surgical mass and made into small pieces, which are then prepared for cell lysis containing cocktail inhi bi tor (pr omega, Madison, Wis.). Suspended in layer solution. The suspension was homogenized using Precellys 24 lyser (Bertin Technologies, Cedex, France). Cancer cells were lysed in the same serous solution. Protein concentration was measured by a bicinconic acid assay (bicinchoninic acid assay, Pierce, Rockford, IL, USA).
  • Total protein 50 was isolated on> polyacrylamide gel), and nitrocells were blotted onto a rhode membrane (Schleicher & Schuell, Dassel, Germany) and then anti-Plkl antibody (Cell signaling technology, Danvers, MA, USA The band was visualized by enhanced chemi luminescence (ECL) staining (Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany).
  • ECL enhanced chemi luminescence
  • mouse tumor cells were identified as B16F10CH-2b; Malignant melanoma), EL4 (H-2b; lymphoma), MC-38 (H-2b; colorectal cancer), GL26 (H-2b; glioma), Renaca (H-2d; kidney cancer), and CT26 (H Mouse Plk-1 was strongly expressed in -2d; colorectal cancer), but weakly in YAC-1 (H-2a; lymphoma). As shown in FIG.
  • human Plkl also has SK0V3C ovarian cancer, MCF7 breast cancer), T98G (glioblastoma), L0V0 (colon cancer), and SK-MEL5 melanoma, which correspond to human tumor cell lines derived from different organs, respectively. , K562 (leukemia) , and HeLa (cervical cancer) It was confirmed that it is expressed. As shown in FIG. Lc, mouse Plkl was not expressed in the brain, lymph nodes, bone marrow, lung, liver, kidney, and intestine of C57BL / 6 mouse normal breakfast (H-2b), but was weakly expressed in the spleen. . From these results, it was confirmed that Plkl protein was strongly expressed in most tumor cell lines.
  • splenocytes were magnetic beads (MACS) conjugated with monoclonal antibodies specific for CD4- or CD8- (magnetic antibody cell sorter [MACS]; Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany) and reacted at 4 ° C for 15 minutes. After incubation, cells were washed with PBS containing 2 mM EDTA and passed through a MACS magnetic separation column. After isolation, the purity of each T lymphocyte was> 90% by FACS analysis.
  • MCS magnetic beads
  • ELISPQT Assay Enzyme-linked I® unoSpot assay
  • the EL I SPOT kit was purchased from BD Bioscience (Qume Drive, San Jose, Calif., USA) and used according to the manufacturer's instructions.
  • Splenocytes (5 ⁇ 10 4 cells / well) were seeded in 96-well plates coated with anti-mouse IFN- ⁇ antibody.
  • mPlklRNA / DCs, mSuvRNA / DCs, CEARNA / DCs and DCs were put into target cells. Plates were incubated at 37 ° C for 20 hours. The cells were removed and the plates washed three times with washout. Then biotin Labeled anti-mouse IFN- [gamma] antibodies were added to the cells and incubated for 2 hours at room temperature. After three washes streptavidin-streptavidin-horseradish peroxidase was added to each well and incubated for 1 hour at room temperature.
  • a chromogenic substrate (3-amino-9-ethyl carbazole [AEC]) was added to each well. After spots were quenched with distilled water and the plates were dried overnight in the dark. The number of spots corresponding to IFN- ⁇ -producing T cells was measured using an automatic AID-ELISP0T—reader (Strassberg, Germany).
  • mPlkl RNA / DCs and mSuv RNA / DCs vaccination can induce Plkl- and Suv-specific IFN- ⁇ -producing T cells in vitro.
  • mPlkl-specific T lymphocytes do not significantly respond to mSuvRNA / DC and CEARNA / DC as inappropriate targets.
  • splenic lymphocytes from mice vaccinated with mPlklRNA / DCs and unloaded DCs were also expressed in huPlklRNA / DC and in vitro IFN—Y-ELISP0T assays. Stimulation with mPlklRNA / DC. As shown in FIG. 3, mPlkl-specific T lymphocytes were able to recognize huPlkl at a level similar to mPlkl. These results are due to the high homology of the amino acids of mouse and human Plkl, demonstrating that human PlklRNA / DC can also induce effective Plkl-specific immune response in vitro.
  • Example 6 Cytotoxicity Assay A standard 51 Cr-release assay was performed. Splenocytes were extracted from each mouse and reactivated with 4 % paraformaldehyde-fixed MC-38 cells in vitro for 5 days before being used as effector cells. 53 ⁇ 4) C0 2 , MC-38, GL26, mPlklRNA / DCs, CEARNA / DCs, DCs, YAC-1, CT26, labeled with 100 mCi [ 51 Cr] -sodium chromate per 1 ⁇ 10 6 cells for 1 hour at 37 ° C. And normal spleen lymphocytes Used as target cells. 51 Cr-labeled target cells were incubated with effector cells at 37 ° C. for 4 hours.
  • mice C57BL / 6 mice (6-8 weeks old) were vaccinated with MC-38 cells (2 ⁇ 10 5 eel Is). Two days after MC—38 cell inoculation, mice were vaccinated with 1 ⁇ 10 6 cells mPlklRNA / DCs, MC38TL / DCs, mSuvRNA / DCs, or DC once a week for three weeks.
  • mice were vaccinated with 1 ⁇ 10 6 cells mPlklRNA / DCs, MC38TL / DCs, mSuvRNA / DCs, or DC once a week for three weeks.
  • B16F10 tumor model C57BL / 6 mice (6-8 weeks old) were vaccinated with B16F10 cells (2 ⁇ 10 5 eel Is).
  • mice were vaccinated with IX 10 6 cells mPlklRNA / DCs, mSuvRNA / DCs, B16F10TL / DCs, or DCs once a week for three weeks.
  • Balb / c mice (6-8 weeks old) were vaccinated with CT26 cells (2 ⁇ 10 5 cells) to prepare a CT26 tumor model.
  • mice were vaccinated with 1 ⁇ 10 6 cells mPlklRNA / DCs, mSuvRNA / DCs, or DCs once a week for three weeks.
  • mice vaccinated with mPlklRNA / DCs showed therapeutic effect in MC—38 and B16F10 tumor models of C57BL / 6 mice 20 days after tumor inoculation, and mPlklRNA / DCs vaccination Balb / c mice showed tumor growth inhibition in the C26 tumor model.
  • Tumor growth inhibitory effect of vaccination of mPlklRNA / DCs showed the same effect as vaccination of mSurRNA / DCs. From these results, it was confirmed that Plkl can be used as a tumor antigen such as survivin, which is known as a general tumor antigen.
  • Plkl can be used as a tumor antigen such as survivin, which is known as a general tumor antigen.
  • mice vaccinated with PlklRNAs were vaccinated in MC-38-bearing mice. As shown in FIG. 6, mice vaccinated with huPlklRNA / DCs showed a marked decrease in tumor growth similar to mPlklRNA / DCs. These results are due to the high homology of the amino acids of mouse and human Plkl, demonstrating that human PlklRNA / DC can also induce effective Plkl-specific immune response in vivo.
  • Example 8 Absence of T Lymphocyte Subpopulations In Vivo To determine what type of T lymphocytes are involved in anticancer effects in the MC-38 tumor model, anti-CD4 monoclonal antibody (GK1.5; eBioscience) And anti-CD8 monoclonal antibodies (2.43: a gift from Prof. Byoung S. Kwon in Ulsan University, Ulsan, Korea) were used for the removal of CD4 + and CD8 + T lymphocytes. C57BL / 6 mice were intraperitoneally injected with purified anti-mouse CD4 or CD8 antibody or lgG 100 / g at 0, 7, 14 days after 2X10 5 MC-38 cells inoculation.
  • CD4 + and CD8 + T lymphocytes were isolated from splenic lymphocytes of mice vaccinated with mPlklRNA / DCs and unloaded DCs and then stimulated with mPlklRNA / DC. As shown in FIG. 7, both CD4 + and CD8 + T lymphocytes showed high frequency of IFN- ⁇ -producing T cells by mPlklRNA / DCs vaccination, indicating that they can induce an effective Plkl-specific immune response in vitro. Can be.
  • Thl T helper l cells
  • CD4 + T cells were plated under antipolarization conditions for 4 days with anti-CD3 antibody (0KT3, 2 ug / mL) and anti-CD28 antibody (2ug / mL Stimulated).
  • Thl conditions were IL_12 (5 ng / mL) and anti-IL-4 mAb (5 ug / mL).
  • Thl CD4 + T cells were harvested and polarized to Thl CD4 + T cells by staining with anti-human CD40L antibody and anti-human CXCR3 antibody with fluorescent material attached to them for characterization. It was confirmed.
  • the ratio of purified CD8 +: Thl polarized CD4 was 2: 1 at 10) in RPMI 1640 medium added with fetal bovine serum (Gibco-BRL), 2 mM 1-glutamine, and 1% penici 11 in-streptomycin (Cambrex).
  • Plkl RNA transfer was incubated with mature dendritic cells at final concentrations of 2.0 ⁇ 10 6 / well and 1.0 ⁇ 10 5 / well, respectively. On day 7 of culture the cells were harvested and re-stimulated.
  • Plkl RNA transfer mature dendritic cells were placed on plates at a density of 1.0 ⁇ 10 5 cells / well and harvested T cells were added at a density of 1.0 ⁇ 10 6 cells / well. 20 U / mL IL-2 (Endogen) was added every 3 days from the 8th day of culture. After three restimulations, Plkl specific immune response was measured. To this end, we used target cells that sensitized or did not sensitize huPlkl RNA to human dendritic cells, and human T using dendritic cells sensitized with CEA RNA as an unrelated antigen to prove that they were Plk-1 specific CTLs. After incubation for 24 hours with lymphocytes, IFN-Y- ELISP0T assay was performed.

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Abstract

본 발명은 폴로-유사 키나아제 1(Polo-like kinase 1) 유래의 종양항원 단백질 또는 유전자에 관한 것으로, 폴로-유사 키나아제 1 유래의 단백질 또는 이들과 기능적으로 동등한 특성을 갖는 변이체가 MHC 클래스Ⅰ 항원 또는 Ⅱ 항원과 결합하여 복합체를 형성함으로써 상기 복합체가 세포독성 T 림프구에 의해 인식될 수 있는 종양항원임을 규명함으로써 범용 종양의 면역치료에 이용할 수 있다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
폴로 -유사 키나아제 1의 종양항원 단백질 또는 유전자
【기술분야】
본 발명은 폴로 -유사 키나아제 1 의 종양항원 단백질 또는 유전자에 관한 것으로， 구체적으로 폴로 -유사 키나아제 1 유래의 서열번호 1 또는 서열번호 3 의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질 또는 이들과 기능적으로 동등한 특성을 갖는 변이체를 포함하고， MHC 클래스 I 항원 또는 Π 항원과 결합하여 세포독성 T 림프구에 의해 인식되는 종양항원 등에 관한 것이다.
【배경기술】
세포 분열 부전은 유사분열에 의존하는 것이고， 암의 발달 및 진행과 연관되어 있다. 폴로—유사 키나아제 KPolo-like kinase 1， Plkl), 세린-트레오닌 키나아제 (serine-threonine kinase)는 세포 분할， 즉 유사분열 엔트리 (mitotic entry), 스핀들 형성 (spindle formation), 염색체 분리 (chromosome segregation), 및 세포질 분열 (cytokinesis)에 중요한 역할을 한다. NIH3T3 세포에서 과발현된 Plkl 은 형질전환을 촉진시키고, 누드 마우스에서 암을 형성하며， 암의 기원 또는 예후를 나타내는 역할을 한다. Plkl 은 인간 종양의 대략 80% 이상에서 과발현되고， 증가된 발현량은 좋지않은 예후 및 다양한 암에서의 환자의 생존 확률과 상관관계를 가진다. 더욱이， 안티센스 을리고뉴클레오티드 및 siRNA(small interfering RNA)에 의한 Plkl 의 하향조절은 종양 세포에서 증식의 급격한 감소 및 세포사멸을 일으키나， 생체외 (in vitro) 정상 세포에서는 그렇지 않으며, 이종 모델에서도 종양 성장의 강력한 억제 효과를 나타낸다. 최근, scytonemin, B-2536, HMN-214, 0N-01910, 및 poloxin 과 같은 몇몇 Plkl 저해제들은 암을 치료하기 위한 잠재성을 평가하고자 개발 중이고, 그들 중 몇몇은 임상실험 중에 있다. 많은 종양 항원은 자기항원으로서 면역허용원이므로， 특정한 면역 반웅을 유도하는 것은 어렵다. 수지상 세포는 가장 강력한 항원제시세포로서， 생체외 및 생체내에서 미접촉 T 세포 (Naive T cell)를 효과적으로 프라이밍함으로써 자기항원에 대항하여 저항력을 깰 수 있다. 한편 세포 주기를 조절하는 분자들 가운데， Aurora A,
Topoisomerase Π α(ΤορΠ α), Foxml , 및 Ran 은 종양항원으로 이미 보고된바 있다. Aurora A 는 암의 세포 면역학적치료의 새로운 표지로 정의된다. ΤορΠ α의 면역원성은 마우스 시스템에서 mRNA-전기층격된 DCs 에서 백신접종에 의해 증명된다. Foxml 및 Ran 펩타이드는 인간 PBMC 및 HLA-A2 유전자이식 (transgenic) 마우스에서 세포독성 T 세포 활동을 유도할 수 있다. Plkl 은 중요 세포 주기 단백질로서 이러한 단백질과 밀접한 연관을 가지는 것으로， 이러한 Plkl 이 종양세포에 대해 특이적인 면역 반웅을 유발한다면， 종양세포를 특이적으로 제거하는 면역치료의 표적으로 사용될 수 있을 것이나， 현재까지 이에 대해 전혀 알려진바 없다.
【발명의 상세한 설명】
【기술적 과제】
본 발명은 폴로 -유사 키나아제 KPolo-like kinase 1) 유래의 서열번호 1 또는 서열번호 3 의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질 또는 이들과 기능적으로 동등한 특성을 갖는 변이체를 포함하고， MHC 클래스 I 항원 또는 Π 항원과 결합하여 세포독성 T 림프구에 의해 인식되는 종양항원을 제공하고자 한다.
그러나， 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며， 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
【기술적 해결방법】
본 발명은 폴로 -유사 키나아제 l(Polo-Hke kinase 1) 유래의 서열번호 1 또는 서열번호 3 의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질 또는 이들과 기능적으로 동등한 특성을 갖는 변이체를 포함하고， 丽 C 클래스 I 항원 또는 Π 항원과 결합하여 세포독성 Τ 림프구에 의해 인식되는 종양항원을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로， 상기 종양항원을 유효성분으로 포함하는 종양 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 구현예로， 상기 종양항원을 유효성분으로 포함하는 종양 예방 또는 치료방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 구현예로， MHC 클래스 I 항원 또는 Π 항원 및 상기 종양항원 간의 복합체가 항원-제시능을 갖는 세포의 표면에 제시된， 항원 -제시 세포를 제공한다.
본 발명의 또 다른 구현예로， 항원-제시능을 갖는 세포에 상기 종양항원을 코딩하는 유전자를 도입하는 단계를 포함하는， MHC 클래스 I 항원 또는 Π 항원 및 상기 종양항원 간의 복합체가 제시된 항원 -제시 세포의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 구현예로， 상기 항원 -제시 세포를 포함하는， 종양 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 구현예로， 상기 항원 -제시 세포를 포함하는， 종양 예방 또는 치료방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 구현예로， 상기 항원 -제시 세포에 제시되는， MHC 클래스 I 항원 또는 Π 항원 및 상기 종양항원 간의 복합체를 특이적으로 인식하는 세포독성 Τ 림프구를 제공한다.
본 발명의 또 다른 구현예로， 상기 세포독성 Τ 림프구를 포함하는 종양 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 구현예로， 상기 세포독성 Τ 림프구를 포함하는 종양 예방 또는 치료방법을 제공한다.
종래 폴로 -유사 키나아제 KPolo-like kinase 1， Plkl)이 종양세포에 대해 특이적인 면역 반응을 유발함으로써， 종양세포를 특이적으로 제거하는 면역치료의 표적으로 사용될 수 있는지에 대해서는 전혀 알려진바 없다. 이에， 본 발명자들은 Plkl 이 범용 종양 면역치료를 위한 종양항원으로써 T 림프구의 새로운 표적이 될 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다. 이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
구체적으로, 본 발명은 폴로 -유사 키나아제 1 유래의 서열번호 1 또는 서열번호 3 의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질 또는 이들과 기능적으로 동등한 특성을 갖는 변이체를 포함하고， MHC 클래스 I 항원 또는 Π 항원과 결합하여 세포독성 T 림프구에 의해 인식되는 종양항원을 제공한다.
상기 폴로 -유사 키나아제 1 은 마우스 또는 인간 유래인 것이 바람직하나， 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 "기능적으로 동등한 특성을 갖는 변이체 "란 종양항원의 아미노산중 일부가 치환 또는 삭제되더라도 상기 폴로 -유사 키나아제 1 유래의 종양항원 단백질과 기능적으로 동등한 특성을 갖는 것을 의미한다.
상기 서열번호 1 의 아미노산 서열로 이루어진 단백질은 서열번호
2 의 염기서열로 이루어진 유전자로부터 코딩될 수 있고， 상기 서열번호
3 의 아미노산 서열로 이루어진 단백질은 서열번호 4 의 염기서열로 이루어진 유전자로부터 코딩될 수 있다.
또한， 본 발명은 상기 종양항원 단백질을 코딩하는 서열번호 2 또는 서열번호 4 의 염기서열로 이루어진 종양항원 유전자를 제공한다. 상기 유전자는 DNA또는 RNA 형태일 수 있다.
또한， 본 발명은 상기 종양항원을 유효성분으로 포함하는 종양 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
상기 종양은 폴로 -유사 키나아제 1 을 발현하는 것일 수 있고， 상기 폴로 -유사 키나아제 1 을 발현하는 종양은 악성혹색종, 림프종， 대장암， 신경교종， 신장암， 난소암， 유방암, 교모세포종, 백혈병, 및 자궁경부암을 포함하는 것이 바람직하나， 이에 제한되지 않는다.
또한， 본 발명은 종양 예방 또는 치료가 필요한 개체에 유효량의 상기 종양항원을 투여하는 것올 포함하는 종양 예방 또는 치료방법을 제공한다.
본 발명의 종양항원 단백질， 또는 이들과 기능적으로 동등한 특성을 갖는 변이체를 유효성분으로 함유하는 의약은 예를 들면， 본 발명의 종양항원을 단독 또는 세포 운반체를 이용하여 종양 환자 등에게 투여함으로써 종양 예방， 재발억제 (relapse), 또는 치료할 수 있다. 본 발명의 종양항원이 항원제시 세포 내에서 MHC 클래스 I 항원 또는 Π 항원과 결합하여， 세포 표면에 고밀도로 제시됨으로써, 종양 특이적 CTLs 가 체내에서 효율적으로 증식하게 되어， 이로써 종양의 예방， 재발억제 (relapse), 또는 치료가 달성된다.
본 발명의 종양항원은 단백질， 또는 이들과 기능적으로 동등한 특성을 갖는 변이체를 단독 또는 2 종 이상을 조합하여 이용할 수 있고， 이들을 유효성분으로 함유함으로써 세포성 면역이 효과적으로 성립되도록 면역 보강제와 함께 주사로 투여하거나， 입자상의 제형으로 하여 경구로 투여할 수 있다. 종양을 예방 또는 치료하기 위해 본 발명의 종양항원을 투여하는 유효량은 환자의 연령， 성별， 상태， 질병의 증상에 따라 적절히 선택될 수 있으며， 바람직하게는 1 일 0.1 내지 500mg 의 종양항원을 투여할 수 있다.
또한， 본 발명은 MHC 클래스 I 항원 또는 Π 항원 및 상기 종양항원 간의 복합체가 항원-제시능을 갖는 세포의 표면에 제시된， 항원- 제시 세포를 제공한다.
상기 항원-제시능을 갖는 세포는 수지상 세포， 단핵세포， CD4 T 세포， B 세포 및 γ δ T(ga隱 a delta T) 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있고， 상기 CD4 Τ 세포， Β 세포 및 γ δ Τ 세포는 미경험 (naive) 상태， 활성화 상태， 또는 증폭 (expansion)된 상태인 것이 바람직하나， 이에 제한되지 않는다.
또한， 본 발명은 항원—제시능을 갖는 세포에 상기 종양항원을 코딩하는 유전자를 도입하는 단계를 포함하는， MHC 클래스 I 항원 또는 Π 항원 및 상기 종양항원 간의 복합체가 제시된 항원 -제시 세포의 제조방법을 제공한다.
상기 유전자는 DNA또는 RNA 형태일 수 있다.
본 발명의 DNA 를 투여하여 세포 내로 도입하는 방법으로는， 바이러스 백터에 의한 방법을 사용할 수 있으나， 이에 제한되지 않는다. 바이러스 백터에 의한 방법으로는, 예를 들면 레트로바이러스， 렌티바이러스， 아데노바이러스， 아데노관련바이러스， 헤르페스바이러스, 왁시니아바이러스， 폭스바이러스 , 폴리오바이러스, 신드비스바이러스 등의
DNA 바이러스 또는 RNA 바이러스에 본 발명의 DNA 를 흔합하여 도입하는 방법을 들 수 있다. 이 중에서, 레트로바이러스， 렌티바이러스， 아데노바이러스， 아데노관련바이러스， 헤르페스바이러스， 왁시니아바이러스 등을 이용한 방법이 특히 바람직하다. 또한， 본 발명의
RNA 를 투여하여 세포 내로 도입하는 방법으로는 전기층격법을 사용할 수 있으나， 이에 제한되지 않는다.
또한， 본 발명은 상기 항원 -제시 세포를 포함하는， 종양 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
또한， 본 발명은 종양 예방 또는 치료가 필요한 개체에 유효량의 상기 항원 -제시 세포를 투여하는 것을 포함하는 종양 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 항원 -제시세포는 당업계에 알려진 세포치료제의 형태로 제제화될 수 있으며， 이들을 유효성분으로 함유함으로써 세포성 면역이 효과적으로 성립되도록 면역 보강제와 함께 주사로 투여하거나， 입자상의 제형으로 하여 경구 투여할 수 있다. 종양을 예방 또는 치료하기 위해 본 발명의 항원 -제시세포를 투여하는 유효량은 환자의 연령， 성별， 상태, 질병의 증상에 따라 적절히 선택될 수 있으며， 바람직하게는 1 일 0.1 내지 500mg의 항원 -제시세포를 투여할 수 있다.
또한， 본 발명은 상기 항원 -제시 세포에 제시되는， MHC 클래스 I 항원 또는 Π 항원 및 상기 종양항원 간의 복합체를 특이적으로 인식하는 세포독성 T 림프구를 제공한다.
상기 세포독성 T 림프구는 CD4 T 세포 또는 CD8 T 세포를 포함하는 것이 바람직하나， 이에 제한되지 않는다.
또한， 본 발명은 상기 세포독성 T 림프구를 포함하는 종양 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
또한， 본 발명은 종양 예방 또는 치료가 필요한 개체에 유효량의 상기 세포독성 T 림프구를 포함하는 종양 예방 또는 치료방법을 제공한다. 본 발명의 세포독성 T 림프구는 당업계에 알려진 세포치료제의 형태로 제제화될 수 있으며， 이들을 유효성분으로 함유함으로써 세포성 면역이 효과적으로 성립되도톡 면역 보강제와 함께 주사로 투여하거나， 입자상의 제형으로 하여 경구 투여할 수 있다. 종양을 예방 또는 치료하기 위해 본 발명의 세포독성 T 림프구를 투여하는 유효량은 환자의 연령， 성별， 상태， 질병의 증상에 따라 적절히 선택될 수 있으며， 바람직하게는
1일 0.1 내지 500mg의 세포독성 T 림프구를 투여할 수 있다. 【유리한 효과】
본 발명의 폴로 -유사 키나아제 1 유래의 단백질 또는 이들과 기능적으로 동등한 특성을 갖는 변이체는 MHC 클래스 I 항원 또는 Π 항원과 결합하여 복합체를 형성함으로써 상기 복합체가 세포독성 T 림프구에 의해 인식될 수 있는 종양항원임을 규명함으로써 범용 종양의 면역치료에 이용할 수 있다ᅳ
【도면의 간단한 설명】
도 1 은 마우스 종양 세포 라인， 인간 종양 세포 라인， 및 마우스 정상 조직에서 Plkl의 발현을 웨스턴 블랏팅으로 측정한 것이다.
도 2 는 mPlklRNA/DCs 및 mSuvRNA/DCs 백신접종에 따른 IFN-γ- producing T cells의 수준을 나타낸 것이다.
도 3 은 mPlklRNA/DCs 및 huPlklRNA/DCs 백신접종에 따른 IFN-γ— producing T cells의 수준을 나타낸 것이다.
도 4 는 mPlklRNA/DCs 백신접종에 따른 세포독성 활성을 나타낸 것이다.
도 5 는 mPlklRNA/DCs 및 mSuvRNA/DCs 백신접종에 따른 종양 성장 억제능을 나타낸 것이다.
도 6 은 mPlklRNA/DCs 및 huPlklRNA/DCs 백신접종에 따른 종양 성장 억제능을 나타낸 것이다.
도 7은 mPlklRNA/DCs 백신접종에 따른 CD4+와 CD8+ T 림프구의 IFN- γ -producing T cells의 수준을 나타낸 것이다. 도 8 은 mPlklRNA/DCs 백신접종에 따른 CD4+ 와 CD8+ T 림프구의 종양 성장 억제능을 나타낸 것이다.
도 9 는 시험관내 유도된 huPlkl 특이 CTLs 의 huPlkl 특이 세포성 면역반응을 확인하기 위한 huPlklRNA/DCs, huCEARNA/DCs , 및 DCs 에 대한 IFN- γ producing Τ cells의 수준을 나타낸 것이다
도 10은 huPlklRNA/DCs 의 CTL유도에 따른 CD4+와 CD8+ T 림프구의 IFN-γ -producing T cells의 수준을 나타낸 것이다.
【발명의 실시를 위한 형태】
이하， 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐， 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다. [실시예] 본 발명의 이해를 돕기 위한 실시예에 사용되는 실험 동물은 암컷
C57BL/6 마우스 (H-2b, 6-8 주령) 및 Balb/c 마우스 (H-2d, 6-8 주령)를 오리엔트 바이오 (가평， 경기도， 한국)에서 구입하여 사용하였다. 상기 마우스는 동물 보호 지역협회의 지침에 따라 유지되고 다루어진 것이다. 인간 말초혈액은 7 명의 건강한 자원자로부터 획득하였으며， 말초단핵세포는 Ficoll-Hypaque(Amersham Pharmacia Biotech, 미국) 밀도 구배 원심분리를 사용하여 분리하였다. 자원자의 인간 백혈구 항원 (HLA)-A 서브타입 (subtypes)은 HLA 실험실에서 서열 기반의 타이핑으로 결정하였다. 본 연구를 위한 동의서 및 승인서는 자원자들 및 가를릭 대학교 의과대학의 IRB 연구위원회로부터 획득하였다.
암세포는 GL26(H-2b; 신경교종)， MC-38(H-2b; 대장암)， B16F10(H- 2b; 악성혹색종), Renaca(H-2d; 신장암) 및 CT26(H-2d; 대장암)를 10% 열불활성 우태아혈청 (fetal bovine serum, FBS, Gibco, Grand Island, NY, USA), 2 mM 글루타민 (glutamine), 100 U/mL 페니실린 (penici 1 Hn)， 및 100 //g/mL 스트랩토마이신 (streptomycin) 공급 하에 완전 DMEM(complete Dulbecco's Moified Eagle Medeum)에서 배양하였다. EL4(H-2b; 림프종) 및 YAC-l(H-2a; 림프종)을 10% 열불활성 우태아혈청， 2 mM 글루타민， 100 U/mL 페니실린 및 100 /zg/mL 스트렙토마이신 공급 하에 완전 RPMI- 1640(Cambrex) 배지에서 배양하였다. GL26 은 Dr. John S. Yu( Cedars Sinai Medical Center, Los Angeles, CA, USA)에서， MC-38, EL4, B16F10, Renca, CT26 및 YAC-1 는 American Type Culture Col lect ion(ATCC, Manassas , VA, USA)에서 구입하였다.
본 발명의 이해를 돕기 위한 실시예에 대한 실험결과는 평균값土표준편차 (SD) 또는 표준오차 (SE)로 나타냈다. 통계학적 분석은 생존 확인 데이터를 제외하고 Student's t— test 를 사용하여 수행하였다. p 값 < 0.05는 통계학적으로 유의한 차이가 있는 것으로 보았다. 실시예 1. mPlkl RNA가 탑재된 수지상세포 백신의 제조 실시예 1-1. 마우스 Plkl의 클로닝
GL26 tumor cell 로부터 cDNA 를 중합효소 연쇄반웅 (polymerase chain reaction, PCR) 증폭을 위한 마우스 Plkl 주형으로 사용하였다. PCR 조건은 하기와 같다: 94°C에서 2 분; 94°C에서 15 초， 60°C에서 30 초, 및 72°C에서 1 분의 30 사이클; 72°C에서 10 분. 마우스 Plkl 에 대한 프라이머는 5'-ccc aagctt {Hind IE) ATG AAT GCA GCG GCC AAA GCT G- 3' (정방향 프라이머) 및 5 '-eg gaattc (EcoR I) CTA GGA GGC CTT GAG GCG GTT G-3' (역방향 프라이머)였다. PCR 산물을 pcDNA3.1 백터 (Invitrogen, Grand island, NY, USA)에 클로닝하였다. 클로닝된 유전자를 염기서열 분석을 통해 확인하였다. 실시예 1-2. 골수 -유래 수지상세포 배양
수지상세포를 획득하기 위해 C57BL/6 생쥐의 경골 및 대퇴골의 골수로부터 골수세포를 채취한 후， 저장성 완층액 (hypotonic buffer, 9.84 g/L NH4C1, 1 g/L KHC03, 및 0.1 mM EDTA)을 이용하여 적혈구를 제거하였다. CT26 종양 모델의 백신화를 위한 Balb/c 생쥐로부터 수지상세포를 준비하였다. 상기 세포를 무혈청 RPMI-1640 배지로 2 회 세척한 후 10 ng/mL 설치류 유래 과립구 대식세포 콜로니 자극인자 (granulocyte— macrophage colony—stimulating factor , GM-CSF , e— bioscience, San Diego, CA, USA) 및 10 ng/mL 설치류 유래 재조합 인터루킨 -4(recombinant murine interleukin-4, Iᄂ一 4， eᅳ bioscience)을 함유하는 완전 RPMI-1640 에서 5X106 cells/well 농도로 배양하였다.
48 시간 후 , 비부유착성 세포 (nonadherent eel Is)를 제거하고， GM-CSF 및
IL-4 을 포함하는 완전 배지를 보충하였다. 배양 6 일째， 비부유착성 및 루즈하게 부유착하는 세포 (수지상세포)를 모아
전기충격법 (electroporation)에 사용하였다. 실시예 1-3. 수지상세포 내로 Plkl mRNA 전기층격
마우스 Plkl/pcDNA3.1 플라스미드를 Seal 로 절단하고， 절단된 DNA 는 mMessage mMachine T7 Ultra KitCAmbion, Austin, TX, USA)에 의해 인 비트로 트랜스크립션 (IVT)을 수행하기 위한 주형으로 사용되었다. 이때 mRNA 농도 및 질은 분광광도측정법 및 아가로스젤 전기영동법으로 측정하였다. RNA 샘플을 분주 (aliquot)하여 _70°C에 저장하였다. 배양 6 일 후， 수지상세포를 Opt i -MEM 배지에 2.5X107 cells/mL 농도가 되도록 현탁액을 만들고， 세포 현탁액 200 ^를 2-隱 큐벳에 넣고 20 g의 RNA 를 첨가하였다. 세포 현탁액을 일렉트로포레이터 (ElectroSquarePorator, ECM 830, BTX, San Diego, CA, USA)에 넣고， 300V 전류를 500 us 동안 주었다. RNA 가 전이된 세포를 즉시 큐벳에서 제거하고 GM-CSF, IL-4 및 LPS(1 /g/mL: Sigma, Saint Louis, M0, USA)을 함유하는 완전 배지를 넣어 24 시간 동안 수지상세포가 완전히 성숙하게 하였다. 수지상세포의 전기층격법에 의한 전이 효율을 FACS 분석을 통해 EGFP RNA로 측정하였다. 실시예 2. huPlkl RNA가 탑재된 수지상세포 백신의 제조 실시예 2-1. 인간 Plkl의 클로닝 HeLa tumor cell 로부터 cDNA 를 중합효소 연쇄반웅 (polymerase chain reaction, PCR) 증폭을 위한 인간 Plkl 주형으로 사용하였다. PCR 조건은 하기와 같다: 94°C에서 2 분; 94°C에서 15 초， 60°C에서 30 초， 및 72°C에서 1분의 30사이클; 72°C에서 10분. 인간 Plkl에 대한 프라이머는 5'-ATG AGT GCT GCA GTG ACT TCA GGG M-3' (정방향 프라이머) 및 5'-TTA GGA GGC CTT GAG ACG GTT GCT-3' (역방향 프라이머)였다. PCR 산물을 pcDNA3.1 T0P0 백터 (Invitrogen, Grand island, NY, USA)에 클로닝하였다. 클로닝된 유전자를 염기서열 분석을 통해 확인하였다. 실시예 2-2. CD14+단핵세포 -유래 사람 수지상세포 배양
시험관내에서 사람 수지상세포를 획득하기 위해 CD14+ 단핵세포로부터 미성숙한 수지상세포를 humidified 37 °C, 5% C02 인큐베이터에서 6 일 동안 3 일 간격으로 10% fetal bovine serum, 100ng/m£ IL-4 IL-4, Genzyme Cambridge, MA, USA)가 첨가된 RPMI 1640 미디엄에서 배양하였다. 실시예 2-3. 사람수지상세포 내로 Plkl mRNA전기충격
인간 Plkl/pcDNA3.1 T0P0 플라스미드를 Pvul 로 절단하고， 절단된 DNA 는 mMessage mMachine T7 Ultra KitCAmbion, Austin, TX, USA)에 의해 인 비트로 트랜스크립션 (IVT)을 수행하기 위한 주형으로 사용되었다. 시험관 내 전사과정은 pcDNA3.1 Plkl linerized DNA 를 주형으로 하여 Ambion 사의 mMessage mMachine T7 Ultra machine kit 를 이용하였다. T7 RNA polymerase, ribonucleotide mix, transcription mix, 주형 DNA 를 흔합하여 37 °C에서 2 시간 동안 반웅 시킨 후 poly A polymerase 로 37 °C에서 30 분간 A tailing 시켰다. A tailing 까지 마친 흔합액에 Dnase 를 이용하여 주형 DNA 를 제거하고 페놀 /클로로포름 (phenol /chloroform) 추출법과 에탄올 침전법으로 Plkl RNA 가 각각의 종양항원 RNA 만을 회수하였다. 회수된 RNA는 nanodrop spectrophotometry (ND-1000, USA)올 이용하여 농도를 측정하였다. 종양항원 RNA 의 사람 수지상세포로의 전이방법은 사람 미성숙 수지상세포를 Opti-MEM 배지 (Gibco BRL. USA)로 2 번 세척한 다음 200 ul 에 현탁한 후 1X106 수지상세포 당 종양항원 RNA 40 ug 을 흔합하여 전기층격장치 (BTX, USA)를 이용하여 300 V, 500 usee 조건으로 사람 미성숙 수지상세포에 전이 후 1 ug/ml 의 LPS 와 200 unit/ml 의 TNF_alpha 를 포함하는 수지상세포 배지에서 18 시간 이상 완전히 성숙하게 하였다. 수지상세포의 전기층격법에 의한 전이 효율을 FACS분석을 통해 EGFP RNA로 측정하였다. 실시예 3. Plkl의 발현
마우스 종양 세포 라인，인간 종양 세포 라인， 및 마우스 정상 조직을 외과용 매스로 곱게 갈아 작은 조각으로 제조하고， 이를 cocktail inhi b i tor (pr omega, Madison, WI)을 함유하는 세포용해 (cell lysis) 완층액에 현탁하였다. 현탁액을 Precellys 24 lyser(Bertin Technologies, Cedex, France)을 사용하여 균질화하였다. 암세포를 같은 완층액에 용해하였다. 단백질 농도를 비신코닌산 어세이 (bicinchoninic acid assay, Pierce, Rockford, IL, USA)로 측정하였다. 총 단백질 (50 을 > 폴리아크릴아마이드 겔 상에 분리하여 놓고， 니트로셀를로오스 멤브레인 (Schleicher & Schuell, Dassel , Germany) 상에 블랏팅한 후 항- Plkl 항체 (Cell signaling technology, Danvers, MA, USA)와 함께 배양하였다. 증강 화학발광 (enhanced chemi luminescence, ECL) 염색기법 (Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany)으로 밴드를 가시화하였다.
마우스 종양 세포 라인,인간 종양 세포 라인， 및 마우스 정상 조직에서 Plkl 의 발현을 웨스턴 블랏팅으로 측정한 결과， 도 la에 도시한 바와 같이 마우스 종양 세포는 B16F10CH— 2b; 악성혹색종)， EL4(H-2b; 림프종)， MC-38(H-2b; 대장암)， GL26(H-2b; 신경교종)， Renaca(H-2d; 신장암)， 및 CT26(H-2d; 대장암)에서 마우스 Plk-1을 강하게 발현시켰으나， YAC-l(H-2a; 림프종)에서는 약하게 발현시킴을 확인하였다. 도 lb 에 도시한 바와 같이 인간 Plkl 도 각각 다른 기관에서 유래되는 인간 종양 세포 라인에 해당하는 SK0V3C난소암), MCF7유방암)， T98G (교모세포종)， L0V0 (대장암)， SK-MEL5혹색종)， K562(백혈병)， 및 HeLa (자궁경부암)에서 발현됨을 확인하였다. 도 lc 에 도시한 바와 같이， 마우스 Plkl 은 C57BL/6 마우스 정상 조식 (H-2b)의 뇌， 림프절， 골수， 폐， 간， 신장, 및 내장에서 발현되지 아니하나， 비장에서는 약하게 발현됨을 확인하였다. 이러한 결과로부터 Plkl 단백질은 대부분의 종양 세포 라인에서 강하게 발현됨을 확인할 수 있었다. 실시예 4. CD4+ 및 CD8+ T 림프구의 분리
CD4+ 및 CD8+ T 림프구 면역반웅 측정을 위해， 비장림프구 (splenocyte)를 CD4- 또는 CD8-에 특이적인 모노클로날 항체와 컨쥬게이션된 마그네틱 비드 (magnetic antibody cell sorter [MACS]； Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)와 4°C에서 15 분간 반웅시켰다. 배양 후， 세포를 2mM EDTA 를 함유하는 PBS 로 세척하고 MACS 마그네틱 분리 컬럼을 통과시켰다. 분리 후 각 T 림프구의 순도는 FACS 분석결과 > 90%이었다.
또한， MACS system 에 의한사람 림프구 및 단핵구 세포 분리를 위해 밀도 구배 후， MACS System (Miltenyi Biotec, Germany)을 사용하여 제조사의 매뉴얼에 따라， 마그네틱 마이크로비드 (Miltenyi Biotec, Germany)에 결합된 항 -CD14, 항 -CD4, 및 항 -CD8 항체를 사용하여 CD14+ 단핵세포， CD4+ T 및 CD8+ T 림프구들을 분리하였다. 분리 후 각 T 림프구의 순도는 flow cytometric analysis 분석결과 > 95%이었다. 실시예 5. ELISPQT 어세이 (Enzyme-linked I隱 unoSpot assay) EL I SPOT 키트는 BD Bioscience(Qume Drive, San Jose, CA, USA)에서 구입하여 사용하였으며， 제조업체의 설명서에 따라 실험하였다. 비장림프구 (5X104 cells/well)를 항-마우스 IFN-γ 항체로 코팅된 96-웰 플레이트에 씨딩하였다. mPlklRNA/DCs, mSuvRNA/DCs, CEARNA/DCs 및 DCs 를 표적세포로 넣었다. 플레이트를 37°C에서 20 시간 동안 배양하였다. 세포를 제거하고， 플레이트를 세척완층액으로 3 회 세척하였다. 그 다음 비오틴 표지된 항-마우스 IFN-γ 항체를 세포에 첨가하고, 실온에서 2 시간 동안 배양하였다. 3 회 세척 후 스트렙타비딘—호을스래디쉬 퍼옥시다아제 (streptavidin-horseradish peroxidase)를 각 웰에 첨가하고， 실온에서 1 시간 동안 배양하였다. 세척 후 발색성 기재 (3-아미노 -9-에틸 카바졸 [AEC])를 각 웰에 첨가하였다. 스팟이 생긴 후 증류수로 반웅을 종결 (quench)하고， 플레이트를 암실에서 하룻밤 동안 건조시켰다. IFN- γ - producing T cells 에 해당하는 스팟의 수를 자동 AID-ELISP0T— 리더 (Strassberg, Germany)를 사용하여 측정하였다.
도 2a 및 도 2b 에 도시한 바와 같이， mPlkl RNA/DCs 및 mSuv RNA/DCs 백신접종은 생체외에서 Plkl- 및 Suv-특이 IFN-γ -producing T cells 를 유도할 수 있다. 그러나 도 2b 및 도 2c 에 도시한 바와 같이， mPlkl-특이 T 림프구는 부적절한 표적으로써 mSuvRNA/DC 및 CEARNA/DC 에 현저하게 반응하지 않음을 보여준다. 이러한 결과는 mPlkl-특이 면역 반웅은 mPlklRNA/DC 백신접종에 의해 유도됨을 나타낸다.
또한 마우스와 인간 Plkl 사이의 교차반웅성 (cross-reactivity)를 조사하기 위해， mPlklRNA/DCs 및 미탑재된 DCs 로 백신접종된 마우스에서 비장림프구를 생체외 IFN— Y-ELISP0T 어세이에서 huPlklRNA/DC 및 mPlklRNA/DC 로 자극시킨다. 도 3 에 나타난 바와 같이, mPlkl-특이 T 림프구는 mPlkl 과 유사한 수준에서 huPlkl 을 인지할 수 있었다. 이러한 결과는 마우스 및 인간 Plkl 의 아미노산의 높은 상동성으로 인한 것으로， 인간 PlklRNA/DC 도 생체외에서 효과적인 Plkl-특이 면역반웅을 유도할 수 있음을 보여준다. 실시예 6. 세포독성 분석 표준 51Cr-방출 분석을 수행하였다. 비장림프구를 각 마우스로부터 추출하여， 생체 외에서 4% 파라포름알데하이드 -고정 MC-38 세포로 5 일 동안 재활성화시킨 후 작동세포로 사용하였다. 5¾) C02, 37°C에서 1 시간 동안 1X106세포당 100 mCi [51Cr]-소듐 크로메이트로 표지된 MC-38, GL26, mPlklRNA/DCs, CEARNA/DCs, DCs, YAC-1, CT26, 및 정상 비장림프구를 표적세포로 사용하였다. 51Cr-표지된 표적세포를 37°C에서 4 시간 동안 작동세포와 함께 배양하였다. 각 웰의 상등액 100 ^를 수거하여, 감마 카운터로 방사능을 측정하였다. 특이적 세포용해 (lysis)율 =100X [(실험 방출-자발적 방출) /(최대 방출-자발적 방출)] . 상기 자발적 방출 및 최대 방출은 각각 배지 및 2%트리톤 X100의 존재 하에서 방사능을 측정하였다. Plkl-발현 표적 및 Plkl-비발현 표적에서 mPlklRNA/DC 로 백신접종된 비장림프구의 세포독성을 평가하였다. 도 4a 내지 도 4d 에서는 H-2b ha lotype matched(H-2b) Plkl-발현 표적 (MC-38, B16F10, GL26, mPlklRNA/DCs)에서 세포독성 활성을 보여 주었다. 그러나, 도 4e 내지 도 4g 에서는 Plkl-비발현 표적 (DCs, CEARNA/DCs) 및 H-2b haplotype mismatched(H-2d)에서 세포독성 활성이 나타나지 않았다. 도 4h 및 도 4i 에 도시한 바와 같이, NK cells 에 의해 표적화된 YAC-1 및 정상 비장림프구는 현저한 용해 반웅이 일어나지 않음을 확인하였다. 이러한 결과는 mPlkl-특이 면역 반웅은 mPlklRNA/DC 백신접종에 의해 유도됨을 나타낸다. 실시예 7. 수지상세포 백신접종 및 종양 모델
MC-38 종양 모델을 제조하기 위해， C57BL/6 마우스 (6-8 주령)에 MC- 38 세포 (2X105 eel Is)를 백신접종 하였다. MC— 38 세포 접종 2 일 후， 마우스에 대해 1X106 cells mPlklRNA/DCs, MC38TL/DCs, mSuvRNA/DCs , 또는 DC 를 3 주 동안 1 주에 1 회씩 백신접종 하였다. B16F10 종양 모델을 제조하기 위해， C57BL/6 마우스 (6-8 주령 )에 B16F10 세포 (2X105 eel Is)를 백신접종 하였다. B16F10 세포 접종 1 일 후， 마우스에 대해 IX 106 cells mPlklRNA/DCs, mSuvRNA/DCs , B16F10TL/DCs, 또는 DCs 를 3 주 동안 1 주에 1 회씩 백신접종 하였다. CT26 종양 모델을 제조하기 위해， Balb/c 마우스 (6-8주령)에 CT26세포 (2X105 cells)를 백신접종 하였다. CT26 세포 접종 후 1 일 후， 마우스에 1X106 cells mPlklRNA/DCs, mSuvRNA/DCs , 또는 DCs 를 3 주 동안 1 주에 1 회 백신접종 하였다. 이종 (xenogenic) 인간 Plkl 의 효과를 검증하기 위해, 1X106 cells huPlklRNA/DCs, 및 DCs 에 7일 간격으로 3차례 MC-38-bearing mice에 백신접종 하였다. Survivin은 양성대조군으로 이용되는 종양항원으로 알려져 있다. RNA 없이 전이과정을 거친 DCs 는 음성 대조군으로 이용되었다. 종양 성장의 감소는 음성대조군과 비교하였다.
종양 면역치료를 위한 표적 종양항원으로써 Plkl 을 증명하고자， 다양한 종양 모델에서 관찰되는 mPlklRNA/DCs 백신접종과 mSurRNA/DCs 백신접종을 비교함으로써 항암 효과를 확인할 수 있었다. 도 5a 내지 도 5c 에 도시한 바와 같이， mPlklRNA/DCs 로 백신접종된 마우스는 종양 접종 20 일 후 C57BL/6 마우스의 MC—38 및 B16F10 종양 모델에서 치료 효과를 보여주었고， mPlklRNA/DCs 백신접종은 Balb/c 마우스의 C26 종양 모델에서 종양 성장 저해를 보여주었다. mPlklRNA/DCs 의 백신접종에 의한 종양 성장 저해 효과는 mSurRNA/DCs 의 백신접종과 동둥한 효과를 나타내었다. 이러한 결과로부터 Plkl 이 일반적인 종양항원 (universal tumor antigen)으로 알려져 있는 survivin과 같은 종양항원으로 사용될 수 있음을 확인하였다. 또한， 인간 Plkl 에 의한 항암효과를 평가하기 위해, 인간
PlklRNAs 가 탑재된 DCs 를 MC-38-bearing mice 에 백신접종 하였다. 도 6 에 도시한 바와 같이， huPlklRNA/DCs 로 백신접종된 마우스는 mPlklRNA/DCs 와 유사하게 종양 성장의 현저한 감소를 보였다. 이러한 결과는 마우스 및 인간 Plkl 의 아미노산의 높은 상동성으로 인한 것으로， 인간 PlklRNA/DC 도 생체내에서 효과적인 Plkl-특이 면역반웅을 유도할 수 있음을 보여준다. 실시예 8. 생체 내에서의 T 림프구 아군의 부재 어떤 타입의 T 림프구가 MC-38 종양 모델에 있어서의 항암 효과에 관계된 것인지 알아보기 위하여, 항 -CD4 모노클로날 항체 (GK1.5; eBioscience) 및 항— CD8 모노클로날 항체 (2.43: a gift from Prof. Byoung S. Kwon in Ulsan University, Ulsan, Korea)는 CD4+ 및 CD8+ T 림프구의 제거를 위해 사용되었다. C57BL/6마우스는 2X105 MC-38 cells 접종 0， 7, 14 일 후 정제된 항-마우스 CD4 또는 CD8 항체 또는 lgG 100 /g을 복강내 주사하였고， 항체 접종 2 일 후 mPlklRNA/DC 를 파하 주사 하였다. CD4 및 CD8 에 특이적인 항체를 사용하여 FACS 분석을 하여 처리 동안 CD4+ 및 CD8+ 이 소멸 ( >95%)되었음을 증명하였다. 대조군으로 종양 항원이 없는 수지상세포를 정상 종양 성장을 위해 백신접종 하였다.
Plkl 를 발현하는 mRNA 는 항원으로 이용되므로， CD4+ 및 CD8+ T 림프구의 면역반웅을 관찰하였다. CD4+ 및 CD8+ T 림프구는 mPlklRNA/DCs 및 미탑재된 DCs 로 백신접종된 마우스의 비장림프구로부터 분리한 후， mPlklRNA/DC 로 자극하였다. 도 7 에 도시한 바와 같이 , CD4+ 및 CD8+ T 림프구 모두 mPlklRNA/DCs 백신접종에 의해 IFN-γ -producing T cells 의 높은 빈도를 나타남으로써， 생체외에서 효과적인 Plkl-특이 면역반응을 유도할 수 있음을 알 수 있다.
도 8 에 도시한 바와 같이， CD8+ T 림프구가 소멸되었을 때 mPlklRNA/DCs 백신접종에 의한 종양 성장 억제능에 큰 영향을 미친 반면， CD4+ T 림프구가 제거된 경우는 그러지 아니하였다. 이러한 결과로부터 CD8+ T 림프구가 생체내 항암 면역에 보다 주요 효과기세포 (effector cells)임을 확인하였다. 실시예 9. 시험관내 Plkl특이 사람 세포 독성 T림프구의 유도 시험관 내 Plkl 특이 세포독성 T 세포 (CTLs)를 유도하고자， 실시예
2-3 과 동일한 방법으로 huPlk-1 RNA 항원을 펄싱한 후, 성숙된 수지상 세포를 Plkl 항원 자극 세포로 사용하였으며, 더이상 수지상세포의 성장의 방지를 위하여 40 Gy 로 방사능 조사하였다. 또한， 시험관 내 Plk-1 특이 세포 독성 T 세포 (CTLs) 유도시 사용되어질 반웅세포를 획득하기 위해， 말초혈액단핵세포의 CD14 미포함 분획은 CD8+ 및 CD4+ T 세포들의 생성을 위한 원료로 사용되었으며， 실시예 4에서와 같이 MACS system을 이용하여 CD8+ T 세포와 CD4+ T 세포를 분리하였다. 시험관 내 T helper l(Thl) 세포를 획득하기 위하여， CD4+ T 세포들을 편극화 조건하 에서 4 일 동안 플레이트에 연결된 항 -CD3 항체 (0KT3, 2 ug/mL) 및 항 -CD28 항체 (2ug/mL)로 자극하였다. Thl 조건은 IL_12(5 ng/mL) 및 anti-IL-4 mAb(5 ug/mL)를 포함한다. 이로부터 4 일 후， Thl CD4+ T 세포들을 수확하였으며， 세포의 특성을 파악하기 위해 항 -사람 CD40L 항체 및 항- 사람 CXCR3 항체에 형광물질이 부착된 항체로 염색하여 Thl CD4+ T 세포로의 편극화를 확인하였다. 정제된 CD8+: Thl 편극화 CD4 의 비율은 2:1 로 10) fetal bovine serum(Gibco-BRL) , 2mM 1-glutamine, 및 1% penici 11 in-streptomycin(Cambrex)7> 첨가된 RPMI 1640 미디엄에서 24—웰 플레이트에서， 각각 2.0X106/웰 및 1.0X105/웰의 최종 농도로 Plkl RNA 전이 성숙 수지상 세포와 함께 배양되었다. 배양 7 일 째 세포들은 수확되어 재자극되었다. Plkl RNA 전이 성숙 수지상세포는 1.0X105 cells/웰의 밀도로 플레이트에 놓여지고 수확된 T 세포들은 1.0X106 cells/웰의 밀도로 첨가되었다. 배양 8 일 째부터 3 일에 한번씩 20 U/mL IL-2(Endogen)를 부가하였다. 3 번의 재자극 후， Plkl 특이적 면역반웅을 측정하였다. 이를 위해， 사람 수지상세포에 huPlkl RNA 를 감작하거나 감작하지 않는 표적세포를 이용하였으며， Plk-1 특이적인 CTLs 임을 증명하기 위한 관계 없는 항원으로 CEA RNA 를 감작한 수지상세포를 표적세포로 사용하여 인간 T 림프구와 24 시간 동안 배양 후 IFN-Y- ELISP0T어세이를 실시하였다.
그 결과 도 9 에 나타난 바와 같이， 6 명의 건강한 자원자 (hl~h6)를 실험대상으로 하여 4 명의 자원자에서 CEARNA/DC 표적세포군에서는 대조군으로 사용한 DCs 표적세포군과 비슷한 정도의 IFN-γ의 빈도를 확인할 수 있었고， huPlklRNA/DCs 표적세포군에서 I FN- γ -producing T cells 의 높은 빈도를 나타냄을 확인하였다. 이는 Plkl 특이 CTLs 가 시험관내에서 유도되었음을 보여준다.
또한， 세포들을 MHC class I blocking 항체 (W6/32)로 30 분 동안 미리 배양하였고, Plkl 에 대한 면역반응이 CD8+ T 림프구에 특이적인 반웅임을 증명하기 위해서 MHC class I blocking 항체 (W6/32)를 이용하여 CD4+ T 림프구에 특이적인 반웅을 관찰하였다. 도 10에 나타난 바와 같이， 4 명의 건강한 자원자 (hl~h4)를 실험대상으로 하여 확인한 결과, CD8+ T 림프구는 huPlklRNA/DCs 가 CTL 반웅을 유도하여 I FN- γ -producing T cells 의 빈도 중 세명의 사람에서 70-90%, 한명의 사람에서 약 50%의 빈도를 나타냄으로써， 생체외에서 효과적인 Plkl-특이 면역반응을 유도할 수 있음을 보여준다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며， 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있올 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims

【청구의 범위】
【청구항 1】
폴로 -유사 키나아제 KPolo-like kinase 1) 유래의 서열번호 1 또는 서열번호 3 의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 또는 이들과 기능적으로 동등한 특성을 갖는 변이체를 포함하고， MHC 클래스 I 항원 또는 Π 항원과 결합하여 세포독성 T 림프구에 의해 인식되는 종양항원.
【청구항 2]
제 1항에 있어서,
폴로 -유사 키나아제 1 은 마우스 또는 인간 유래인것을 특징으로 하는 종양항원.
【청구항 3】
제 1항에 있어서，
서열번호 2 또는 서열번호 4 의 염기서열로 이루어진 유전자로부터 코딩되는 것을 특징으로 하는 종양항원.
【청구항 4】
제 1 항에 따른 종양 항원 단백질을 코딩하는 서열번호 2 또는 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 종양항원 유전자.
【청구항 5】
제 4항에 있어서，
상기 유전자는 DNA 또는 RNA 형태인 것을 특징으로 하는 종양항원 유전자.
【청구항 6]
제 1항의 종양항원을 유효성분으로 포함하는 종양 예방 또는 치료용 조성물.
【청구항 7]
제 6 항에 있어서，
상기 종양은 폴로 -유사 키나아제 1 을 발현하는 것을 특징으로 하는 조성물 .
【청구항 8]
제 6 항에 있어서 ,
상기 종양은 악성혹색종 , 림프종， 대장암， 신경교종， 신장암， 난소암， 유방암， 교모세포종， 백혈병， 및 자궁경부암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물 .
【청구항 9]
유효량의 제 1 항의 종양항원올 투여 하는 것을 포함하는 종양 예방 또는 치료방법 .
【청구항 10]
MHC 클래스 I 항원 또는 Π 항원 및 제 1 항의 종양항원 간의 복합체가 항원-제시능을 갖는 세포의 표면에 제시된， 항원 -제시 세포 .
【청구항 11】
제 10 항에 있어서，
항원-제시능을 갖는 세포가 수지상 세포， 단핵세포， CD4 T 세포， B 세포， 및 γ δ T(ga隱 a delta T) 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 항원 -제시 세포 .
【청구항 12】
제 11 항에 있어서，
CD4 Τ 세포， Β 세포， 및 γ δ Τ 세포는 미 경험 (naive) 상태， 활성화 상태， 또는 증폭 (expansion)된 상태인 것을 특징으로 하는 항원 -제시 세포 .
【청구항 13]
항원-제시능을 갖는 세포에 제 1 항의 종양항원을 코딩하는 유전자를 도입하는 단계를 포함하는 , MHC 클래스 I 항원 또는 Π 항원 및 상기 종양항원 간의 복합체가 제시 된 항원 -제시 세포의 제조방법 .
【청구항 14]
제 10 항의 항원 -제시 세포를 포함하는， 종양 예방 또는 치료용 조성물 .
【청구항 15】
유효량의 제 10 항의 항원 -제시 세포를 투여하는 것을 포함하는 종양 예방 또는 치료방법 .
【청구항 16]
제 10 항의 항원 -제시 세포에 제시되는， MHC 클래스 I 항원 또는 Π 항원 및 제 1 항의 종양항원 간의 복합체를 특이 적으로 인식하는 세포독성 T 림프구 .
【청구항 17]
제 16 항에 있어서，
세포독성 T 림프구는 CD4 T 세포 또는 CD8 T 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 림프구 .
【청구항 18]
제 16 항의 세포독성 T 림프구를 포함하는 종양 예방 또는 치료용 조성물 .
【청구항 19]
유효량의 제 16 항의 세포독성 T 림프구를 투여하는 것을 포함하는 종양 예방 또는 치료방법 .
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