JP2004512030A - 特異的細胞溶解性ｔ細胞応答を誘導するための組成物および方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、病理学的に異常な細胞に対し選択的なＣＤ８^＋　Ｔリンパ球のエクスビボでの誘導方法を提供する。該方法は、アポトーシス性の病理学的に異常な細胞を、少なくとも樹状細胞（ＤＣ）、ＣＤ４^＋　Ｔ細胞およびＣＤ８^＋　Ｔリンパ球を有する混合物と接触させること、ならびに、病理学的に異常な細胞に対する抗原特異性および／もしくは選択的細胞溶解活性を有するＣＤ８^＋　Ｔリンパ球（ＴＬ）を生成するのに十分な時間の間、アポトーシス性の病理学的に異常な細胞を該混合物とともに培養することよりなる。本発明はさらに、１種もしくはそれ以上の標的抗原に対し選択的なＣＤ８^＋　ＴＬのエクスビボの誘導方法を提供する。該方法は、１種もしくはそれ以上の標的抗原を、少なくとも樹状細胞（ＤＣ）、ＣＤ４^＋　Ｔ細胞、ＣＤ８^＋　ＴＬおよびＩＬ−７を有する混合物と接触させること、ならびに、１種もしくはそれ以上の標的抗原に対する選択的免疫反応性を有するＣＤ８^＋　ＴＬを生成するのに十分な時間の間、前記１種もしくはそれ以上の標的抗原を該混合物とともに培養することよりなる。本発明はさらに、病理学的に異常な細胞により媒介される疾患を有する患者の治療方法を提供する。該方法は、有効量の、病理学的に異常な細胞に対する抗原特異性および／もしくは選択的細胞溶解活性を有する、本発明の方法により産生されるＣＤ８^＋　ＴＬを投与することよりなる。

Description

【０００１】
（関連出願の交差引用）
本出願は２０００年９月１５日に出願された米国仮出願番号第６０／２３３，００９号明細書の利益を主張する。
【０００２】
（発明の背景）
本発明は全般として、自己免疫障害、感染性疾患、アレルギーおよび癌のような増殖性疾患のような病理学的に異常な細胞により媒介される疾患および病状に、また、より具体的には、癌および他の細胞増殖性障害を治療するのに使用することができる免疫細胞の調製方法に関する。
【０００３】
癌は米国での死亡の第一の原因の１つである。毎年、５０万人を超える米国人が癌で死亡し、また、１００万人以上が該疾患で新たに診断されている。癌性腫瘍は、細胞がその正常な成長調節機構を免れそして制御されない様式で増殖する場合に生じる。腫瘍細胞は、原発性腫瘍の治療が完全でないかもしくは該疾患の実質的進行前に開始されないかのいずれかの場合に二次的部位に転移する可能性がある。癌に関係した死亡率は、予防、早期検出および厳しい治療により減少させることができる。
【０００４】
癌の治療に対する障害は、正常組織を容赦しつつ癌に選択的に標的を定めることができる作用物質の相対的欠如である。例えば、一般に限局された治療である放射線治療および外科手術は、治療領域中の正常組織に対するかなりの損傷を引き起こして瘢痕形成および重症の症例では正常組織の機能の喪失をもたらす可能性がある。一般に全身に投与される化学療法は、骨髄、粘膜、皮膚および小腸のような器官に対するかなりの損傷を引き起こす可能性がある。他の癌療法は、腫瘍細胞表面タンパク質に向けられた抗体、および細胞傷害性作用物質に結合された抗体を包含する。治療的抗体は腫瘍特異的細胞表面タンパク質の認識により腫瘍細胞に標的を向けられる。特定の腫瘍に結合するかもしくはトキシンを送達する抗体の産生は、従って、タンパク質標的が同定されること、および細胞表面上に該タンパク質が露出されることを必要とする。抗体治療の有効性および副作用は変動し、そしていくつかの治療的抗体は個体中で重大なアレルギー応答を引き起こす可能性がある。
【０００５】
癌と闘うための身体の免疫系の使用を必要とする他の療法が開発中である。免疫療法の一アプローチは、ワクチンおよびサイトカインのような作用物質を使用して癌患者の免疫系を間接的に刺激することを目標とする。より直接的な免疫療法の一アプローチは、腫瘍を攻撃する免疫細胞を投与することにより患者の抗腫瘍免疫を増大させることである。養子免疫療法と称される後者の方法は、脳、腎、皮膚および血液の悪性病変を包含する数種の癌に罹っている患者を治療するために、変動するの程度の成功を伴い使用されている。養子免疫療法治療後の長期の癌の退縮は、再現可能に観察されていない。
【０００６】
養子免疫療法の一方法は腫瘍特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を使用することを必要とする。ＣＴＬは、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）のクラスＩ分子とともに細胞の表面上の抗原を認識すること、およびその後該細胞を破壊することが可能であるＣＤ８^＋　Ｔリンパ球の特化された一変形である。免疫系におけるＣＴＬの役割は、感染した細胞、腫瘍細胞および外来細胞を認識かつ排除することである。養子免疫療法のために、患者もしくはドナー由来の抗腫瘍ＣＴＬの一集団を、エクスビボ培養法を使用して生成させることができる。
【０００７】
腫瘍関連抗原由来のペプチドを使用するエクスビボでの抗腫瘍ＣＴＬの生成方法、およびその後の癌患者へのＣＴＬの投与方法が、変動する成功を伴い報告されている。しかしながら、ＣＴＬを生成させるためのこうしたアプローチは、腫瘍特異的抗原が既知でありかつ抗原提示細胞により提示されるペプチドを生成させるように適切にプロセシングされる場合に限定される。エクスビボでペプチドに誘導されるＣＴＬに対する別の欠点は、生じるＣＴＬが腫瘍細胞表面上の対応する抗原を認識する能力を保持することができるかどうかの予測不能性である。ペプチドに対し生成されたＣＴＬの親和性が、内在性にプロセシングされた抗原を認識するのに十分でないかもしれないからである。従って、エクスビボで生成されたＣＴＬの治療的使用に必要とされる所望の特異性もしくは有効性は、一般に達成するのが困難であった。エクスビボで生成されたＣＴＬでの別の問題は、２もしくは３回以上の再刺激の間のインビトロでのＣＴＬの維持における困難であった。さらに、この方法は、標的腫瘍細胞上のただ１種の抗原を認識するＣＴＬを生成することによりさらに制限される。
【０００８】
従って、養子免疫療法のために培養物中で選択的ＣＴＬを生成および維持することの必要性が存在する。本発明はこの必要性を満足し、そして関係する利点を同様に提供する。
【０００９】
（発明の要約）
本発明は、病理学的に異常な細胞に対し選択的なＣＤ８^＋　Ｔリンパ球のエクスビボでの誘導方法を提供する。該方法は、アポトーシス性の病理学的に異常な細胞を、少なくとも樹状細胞（ＤＣ）、ＣＤ４^＋　Ｔ細胞およびＣＤ８^＋　Ｔリンパ球を有する混合物と接触させること、ならびに、病理学的に異常な細胞に対する抗原特異性および／もしくは細胞溶解活性を有するＣＤ８^＋　Ｔリンパ球（ＴＬ）を生成させるのに十分な時間の間、アポトーシス性の病理学的に異常な細胞を該混合物とともに培養することよりなる。
【００１０】
本発明はさらに、１種もしくはそれ以上の標的抗原に対し選択的なＣＤ８^＋　Ｔリンパ球のエクスビボでの誘導方法を提供する。該方法は、１種もしくはそれ以上の標的抗原を、少なくとも樹状細胞（ＤＣ）、ＣＤ４^＋　Ｔ細胞、ＣＤ８^＋　Ｔ細胞およびＩＬ−７を有する混合物と接触させること、ならびに１種もしくはそれ以上の標的抗原に対する抗原特異性および／もしくは選択的免疫反応性を有するＣＤ８^＋　Ｔリンパ球（ＴＬ）を生成させるのに十分な時間の間、前記１種もしくはそれ以上の標的抗原を該混合物とともに培養することよりなる。
【００１１】
本発明はさらに、病理学的に異常な細胞により媒介される疾患を有する患者の治療方法を提供する。該方法は、有効量の、本発明の方法により産生されるＣＤ８^＋　Ｔリンパ球を投与することよりなり、ここでＣＤ８^＋　Ｔリンパ球は病理学的に異常な細胞に対する抗原特異性および／もしくは細胞溶解活性を有する。
【００１２】
（発明の詳細な記述）
本発明は、病理学的に異常な細胞により媒介される疾患を有する個体の治療における使用のためのＣＤ８^＋　Ｔ細胞の生成方法に向けられる。腫瘍細胞、細胞ライセート、細胞画分、細胞成分、または小胞、またはＢ細胞、疾患もしくは病状を媒介する物質を産生する細胞、または感染性病原体の影響により異常にされた細胞のような病理学的に異常な細胞に対する抗原特異性および／もしくはそれに対し選択的な細胞溶解活性を有するＣＤ８^＋　Ｔリンパ球（ＴＬ）のエクスビボ産生方法が提供される。加えて、細胞は、それが、異常なタンパク質、もしくはある種の環境下で正常にもかかわらず疾患の誘導もしくは進行に関与するタンパク質を産生するために異常とみなすことができる。病理学的に異常な細胞のような標的細胞に対する細胞溶解活性を有するＣＤ８^＋　Ｔリンパ球はＣＴＬと称される。本方法の一利点は、特定の腫瘍もしくは疾患に関係した抗原を同定する必要性を排除して、病理学的に異常な細胞全体に対し選択的なＣＴＬを生成させることができることである。本方法はまた、ペプチド抗原のプロセシングおよび提示に関連する未知の因子も排除する。該方法の別の利点は、全標的細胞に対し生成されるＣＴＬが病理学的標的に対する多特異的応答を提供する可能性があることである。さらに、全細胞を使用するＣＴＬの誘導は、各個体のＣＤ８^＋　Ｔ細胞レパートリー中に存在するＣＴＬの選択を見込む。事実、数例の患者において、いくつかのＣＴＬ特異性が寛容により存在しないかもしれないことが既知である。さらに、全腫瘍細胞に対するＣＴＬを生成させることは、標的細胞中で起こった個々の突然変異に特異的なＣＴＬの誘導を見込む。
【００１３】
本発明はまた、ＣＤ８^＋　ＣＴＬ、および、ＣＤ８^＋　記憶細胞の特徴であるより長い時間の期間の間インビトロで維持することができるそれらの前駆細胞の抗原特異的ＣＤ８^＋　ＴＬの生成方法も提供する。ＣＤ８^＋　記憶細胞は、治療的に投与される場合に選択的に標的を定められた病理学的に異常な細胞に対する長期の免疫を患者に提供することができるＣＴＬの拡張のための前駆細胞である。ＣＤ８＋　記憶細胞は、その抗原特異性を維持して最低５回の刺激の間インビトロで増殖する能力を有するＣＤ８＋　細胞を指す。刺激は、抗原により、あるいは例えば有糸分裂促進剤またはＴ細胞受容体もしくは共刺激分子に対し向けられた抗体を包含する非特異的手段により、または当業者に公知の手順により維持することができる。
【００１４】
病理学的に異常な細胞を認識する選択的ＣＴＬおよび抗原特異的ＣＤ８^＋　ＴＬは、癌、ならびに異常な（ａｂｎｏｒｍａｌ）もしくは病理学的に異常な（ａｂｅｒｒａｎｔ）細胞の排除が有効な治療を提供する可能性がある他の疾患の治療への養子免疫療法アプローチに有用である。病理学的に異常な細胞を選択的に破壊するＣＴＬは、疾患に罹った細胞の排除が病理学的に異常な細胞の存在もしくは不必要な増殖に関連する症状を減少させる可能性があるために、疾患を治療するために有用である。養子免疫療法における使用のための病理学的に異常な細胞に対し選択的なＣＴＬの生成は、病理学的に異常な細胞の破壊もしくは減少が利益を提供するとみられる病状の症状を低減させる、もしくはそれらを治癒させるために利用可能な治療の選択肢を増大させることができる。
【００１５】
一態様において、本発明は腫瘍細胞に対する選択的細胞溶解活性をもつＣＴＬのエクスビボ生成に向けられる。腫瘍選択的なＣＴＬは、ドナーの末梢血からのＣＤ８^＋　Ｔ細胞および樹状細胞を、養子免疫療法治療において生成物のＣＴＬを受領することができる急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を有する個体から単離されたアポトーシス性の腫瘍細胞とともにインキュベートすることにより調製する。樹状細胞およびアポトーシス性の病理学的に異常な細胞を、樹状細胞が該病理学的に異常な細胞の抗原を提示するように十分な時間の間一緒にインキュベートする。ドナーからの単離されたＣＤ８^＋　ＴＬをＩＬ−７およびＩＬ−１２の存在下に樹状細胞およびアポトーシス性の病理学的に異常な細胞の混合物に添加し、そして該集団を抗原特異的ＣＤ８^＋　ＴＬおよび選択的ＣＴＬを産生させるのに十分な時間の間インキュベートする。生じる腫瘍選択的なＣＴＬは、疾患を治療もしくはその重症度を低下させるために骨髄レシピエントに投与することができる。
【００１６】
別の態様において、本発明は、腫瘍細胞に対し選択的なＣＴＬの集団をそれから拡張させることができるＣＤ８^＋　記憶Ｔ細胞のエクスビボ生成に向けられる。本発明の方法を使用して調製されるＣＤ８^＋　記憶Ｔ細胞集団は、抗原での反復されるインビトロ刺激を再現可能に生き残ることができる。該方法は、樹状細胞、ＣＤ８^＋　ＴＬおよびＣＤ４^＋　Ｔ細胞の混合物をＩＬ−７の存在下に標的腫瘍細胞とともに培養することを必要とする。生じるＣＤ８^＋　細胞集団は、抗原特異的なＣＤ８^＋　ＴＬ、腫瘍細胞に対し選択的なＣＴＬを含有し、そして２もしくはそれ以上の世代後に、５もしくはそれ以上の世代の間エクスビボで拡張させることができるＣＤ８^＋　記憶ＴＬを含有する。
【００１７】
本発明の方法を使用して生成される抗腫瘍ＣＴＬは癌を有する個体を治療するのに利用することができる。例えば、養子免疫療法を使用して、骨髄移植片を受領した後に癌の再発を有する造血癌を伴う患者に抗腫瘍免疫を導入することができる。抗腫瘍ＣＴＬは、患者からの腫瘍細胞と組合せられた骨髄ドナーのＣＤ８^＋　ＴＬ、樹状細胞およびＣＤ４＋　Ｔ細胞から生成させることができる。ＢＭＴレシピエントの腫瘍細胞が骨髄ドナーのＣＤ８^＋　ＴＬおよびＣＤ４^＋　Ｔ細胞および樹状細胞に同一のＨＬＡであるこの場合には、ナイーブ（ｎａｉｖｅ）ドナーのＣＤ８^＋　ＴＬは非主要ＨＬＡ抗原に対する一次免疫応答を表す。本発明の方法を使用して、ＣＤ８^＋　記憶ＴＬの生成は、これらのエクスビボで誘導された一次応答の長期の維持を見込む。
【００１８】
例えば、本発明の方法を使用して生成された抗腫瘍ＣＴＬは、養子免疫療法処置の６ヶ月後に、骨髄ドナーの末梢血および骨髄、ならびに骨髄レシピエントの末梢血から誘導されることが見出された。免疫学的記憶を有する腫瘍選択的ＣＴＬの生成は、養子療法治療により長期の保護免疫を提供することができる確率を向上させることができる。
【００１９】
本明細書で使用されるところの「病理学的に異常な細胞」という用語は、哺乳動物細胞もしくは組織の疾患もしくは異常な状態に関連する生理学もしくは表現型の変化により正常から変えられている細胞を指す。病理学的に異常な細胞は、疾患もしくは異常な状態を引き起こす、または疾患もしくは異常な状態の結果である起こっている変化により、正常細胞と区別することができる。これらの病理学的に異常な細胞から、化学的および物理的破壊、遠心分離、勾配分離ならびにクロマトグラフィーのような当該技術分野で既知の標準的技術を使用して、細胞ライセート、細胞画分、細胞成分もしくは小胞のような非細胞調製物を作成することができる。こうした非細胞調節物は本発明の方法で有用であり、そして病理学的に異常な細胞の全細胞調製物の代わりに用いることができる。
【００２０】
病理学的に異常な細胞は細胞機能の調節もしくは制御の喪失を有する細胞を包含する。細胞機能の制御の喪失は、病理学的に異常な細胞を正常と区別する細胞変化につながる可能性がある。細胞機能の例は増殖および分化である。増殖の制御の喪失は、細胞もしくは組織の異常な状態を引き起こす細胞変化をもたらす可能性がある。例えば、癌細胞は異常でありそして調節されない様式で増殖し、それは組織破壊をもたらす。本明細書で使用されるところの「腫瘍細胞」という用語は癌細胞を指す。癌の特定の例は、前立腺、乳房、肺、卵巣、子宮、脳および皮膚の癌を包含する。同様に、自己免疫疾患を媒介する細胞の増殖は異常に調節され、それは例えば宿主の細胞および組織の破壊を伴う免疫機構の継続された増殖および活性化をもたらす。自己免疫疾患は例えば慢性関節リウマチ、糖尿病および多発性硬化症を包含する。
【００２１】
病理学的に異常な細胞は、例えば、疾患もしくは病状を媒介することが可能な物質を産生する細胞を包含する。こうした病理学的に異常な細胞の一例は、アレルギー症状の出現の原因であるＩｇＥ抗体を産生するＢ細胞である。病理学的に異常な細胞はまた、身体の特定の器官（該器官が生体（ｖｉｔａｌ）臓器であるにしろ非生体臓器であるにしろ）で見出される細胞および特定の細胞型も包含する。例えば、ある器官は上皮、筋細胞および／もしくは線維芽細胞のようないくつかの異なる細胞型より構成されるかもしれない。これらの細胞型の１種もしくはそれ以上が病理学的に異常であるかもしれず、そして、であるから、本発明の方法により産生されるＣＤ８^＋　ＴＬおよびＣＴＬにより標的とされる可能性がある。
【００２２】
細胞機能の調節もしくは制御の喪失はまた、病理学的病原体による細胞の感染によっても起こる可能性がある。「病理学的病原体」という用語は疾患を引き起こす感染性病原体を指す。病理学的病原体の例は、ウイルス、細菌、真菌、アメーバおよび寄生虫を包含する。感染性疾患の特定の例は、ＤＮＡもしくはＲＮＡウイルス性疾患、細菌性疾患および寄生虫疾患を包含する。
【００２３】
「アポトーシス」という用語はプログラムされた細胞死の過程を指す。プログラムされた細胞死は、細胞が特定の生理学的もしくは発達シグナルに応答しそしてその死および生物体からの除去につながるプログラムされた一連の事象を受ける、調節された一過程である。アポトーシスを特徴づける細胞事象の例は、細胞の収縮、チトクロームｃの放出を伴うミトコンドリアの機能停止、細胞表面の小胞形成（ｂｌｅｂｂｉｎｇ）、クロマチン分解、および原形質膜の表面上でのホスファチジルセリンの露出である。アポトーシスは、壊死、もしくは傷害から生じる細胞死（膜の完全性のその後の早期の喪失、次いで細胞およびオルガネラの溶解を伴う細胞およびオルガネラ全体の腫脹を特徴とする）とは異なる。壊死は、アポトーシスと異なり、インビボでの炎症応答により付随される。
【００２４】
「ＣＤ４^＋　Ｔ細胞」という用語は、ＣＤ４タンパク質を産生しそして樹状細胞と相互作用して樹状細胞による抗原提示もしくはその成熟を誘導することが可能であるリンパ球を指す。こうしたＣＤ４^＋　Ｔ細胞は、限定されるものでないが血液のような天然の供給源から単離された細胞、培養物中で成長された細胞系およびＣＤ４^＋　Ｔ細胞クローンを挙げることができる。
【００２５】
「選択的」という用語は、ＣＤ８^＋　細胞溶解性Ｔ細胞に関して使用される場合に、非標的細胞に比較して特定の病理学的に異常な標的細胞を優先的に認識しかつそれに対する細胞溶解活性を有するＣＤ８^＋　細胞溶解性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を意味することを意図している。選択的ＣＴＬは、非標的細胞の一集団から標的の病理学的に異常な細胞を区別することができるか、もしくは区別するようにされることができ、そして非標的細胞と実質的に交差反応しない。免疫反応性もしくは抗原特異性に関して使用される場合の「選択的」という用語は、ＣＴＬもしくはＣＤ８^＋　ＴＬのＴ細胞受容体が特定の標的抗原に優先的に結合することを意味することを意図している。選択的免疫反応性を表すＣＴＬは非標的抗原と実質的に交差反応せず、そして標的抗原を表す病理学的に異常な細胞を正常のもしくは非標的細胞と区別することができる。
【００２６】
「エクスビボ」という用語は、細胞に関して使用される場合に、身体の外側の細胞を意味することを意図している。従って、エクスビボ細胞培養法は個体から細胞を収穫することを必要とする。エクスビボ培養法は個体のいかなる組織もしくは器官から収穫された細胞にも応用可能である。エクスビボ培養物の細胞培養条件は多様な組成を包含する。細胞は不均質な混合物中であることができるか、もしくは単離された細胞であることができる。培地は非合成もしくは合成細胞培地であることができるか、または添加された因子を含有することができる。培地は細胞の治療的潜在能力を高める因子を含有することができる。例えば、成長、生存率もしくは分化を促進する因子を使用することができる。添加される因子は他の細胞、タンパク質因子および化学的試薬を包含することができる。
【００２７】
「十分な時間」という用語は、ＣＤ８^＋　Ｔ細胞が誘導されることを可能にする時間の期間を意味することを意図している。ＣＤ８^＋　Ｔ細胞誘導過程は、少なくとも樹状細胞による抗原のプロセシングおよび提示、ＣＤ８^＋　Ｔ細胞による抗原の認識、ならびに細胞溶解活性の活性化を包含する。この過程の完了を見込む十分な時間は短いもしくは長い時間の期間であることができる。該方法の多様な細胞集団における差異が抗原取り込みの速度の差異をもたらすことができるからである。ＣＤ８^＋　Ｔ細胞の誘導のための十分な時間に影響を及ぼす可能性のある因子は、例えば、培養物中の細胞の型、多様な細胞型の純度、細胞型の濃度、および樹状細胞が未熟であるかもしくは培養のある時点で抗原を提示しているかどうか、である可能性がある。十分な時間は、反応混合物の組成に依存して、即座に、数分、数時間、数日もしくは数週間以内に起こることができる。例えば、ＣＤ８^＋　Ｔ細胞を、抗原を提示する調製された成熟樹状細胞を含有する反応混合物に添加する場合、ＣＤ８^＋　Ｔ細胞のプライミングは比較的短い時間の期間中で起こることができる。樹状細胞の抗原の取り込みおよびプロセシングの段階は、ＣＤ８^＋　Ｔ細胞を未熟樹状細胞および標的の病理学的に異常な細胞または他の抗原（１種もしくは複数）を含有する反応混合物に添加する場合に比較して、既に起こっているからである。
【００２８】
本明細書で使用されるところの「単離された」という用語は、それが天然で会合されている１種もしくはそれ以上の成分から分離されている細胞を指す。単離された細胞はまた、結合組織線維のような非細胞性組織成分から精製された細胞も包含する。単離された細胞は、例えば、非細胞性組織成分から新たに精製されたか、または１もしくはそれ以上の世代の間培養されたかのいずれかの初代細胞であることができる。単離された細胞の一例は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の調製物中の細胞のような血液から分離された細胞である。
【００２９】
「実質的に」という用語は、単離された細胞に関して使用される場合に、１種の細胞が精製された細胞集団の９０〜９９％に相当することを意味することを意図している。例えば、実質的に単離された細胞は、９０〜９５％純粋、９５％純粋、９５〜９９％純粋であることができるか、または９９％もしくはそれ以上純粋のようであることができる。
【００３０】
「実質的に精製された」という用語は、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）もしくはＩＬ−１２に関して使用される場合に、該タンパク質が、それらが天然に会合される他の成分を実質的に含まないことを意味することを意図している。例えば、ＣＤ４０ＬおよびＩＬ−１２タンパク質は通常、細胞中で他のタンパク質とともに見出される。これらのタンパク質は、培養された細胞を処理するのにＣＤ４０ＬもしくはＩＬ−１２を使用する場合には不必要な汚染物質として作用するかもしれない。
【００３１】
「非Ｂ細胞白血病細胞」という用語は、Ｂ細胞白血病細胞もしくはプレＢ細胞白血病細胞でないいずれかの細胞型を指す。非Ｂ細胞白血病細胞は正常の非癌性Ｂ細胞を包含し、そしてまたＢ細胞リンパ腫細胞のような非白血病癌のＢ細胞も包含する。非Ｂ細胞白血病細胞はＴ細胞白血病細胞のような他の型の白血病細胞を包含する。非Ｂ細胞白血病細胞はＢ細胞もしくはプレＢ細胞白血病細胞でないいずれかの型の癌細胞であることができ、また、非癌性の病状もしくは疾患により病理学的に異常である細胞を包含するいずれかの型の非癌細胞であることができる。
【００３２】
本明細書で使用されるところの「抗原」という用語は、抗原提示細胞によりプロセシングかつ提示されそしてその後Ｔ細胞受容体により認識される可能性のある分子を意味することを意図している。こうした分子は例えばポリペプチドであることができる。
【００３３】
「標的」という用語は、ＣＤ８^＋　Ｔ細胞の免疫反応性に関して使用される場合は、いずれかの予め決められた抗原である。予め決められた抗原は、例えば細胞もしくはポリペプチドであることができる。
【００３４】
本明細書で使用されるところの「ナイーブ」という用語は、ＣＤ８^＋　Ｔ細胞に関して使用される場合に、ＣＤ８^＋　Ｔ細胞がインビボで特定の標的細胞もしくは抗原のいずれかに遭遇していないことを意味することを意図している。従って、ナイーブＣＤ８^＋　Ｔ細胞は、それが特定の標的細胞もしくは抗原に対し選択的なＣＴＬ活性が可能であるために、エクスビボで特定の標的細胞もしくは抗原に曝露されなければならない。
【００３５】
本明細書で使用されるところの「インシトゥ」という用語は、選択的ＣＴＬ活性に関して使用される場合に、選択的ＣＴＬが身体の無傷の構造中の標的の病理学的に異常な細胞を破壊することができることを意味することを意図している。例えば、選択的ＣＴＬは細胞の不均質な集団中の標的細胞を破壊することができる。とりわけ、選択的ＣＴＬは腫瘍細胞のような病理学的に異常な細胞を、血液もしくは骨髄のような組織から排除することができる。
【００３６】
本明細書で使用されるところの「治療すること」という用語は、病理学的に異常な細胞により媒介される病理学的状態の重症度の低減もしくは予防を意味することを意図している。重症度の低減は、例えば、臨床症状、生理学的指標、生化学的マーカーもしくは代謝指標の停止もしくは減少を包含する。疾患の予防は、例えば、疾患の発生を排除すること、もしくは疾患にかかった個体を疾患前のそれらの健康状態に復帰させることを包含する。
【００３７】
本明細書で使用されるところの「有効量」という用語は、個体に投与される場合に病理学的状態の程度、量もしくは拡大の速度の減少を遂げるのに必要とされるＣＤ８^＋　細胞溶解性Ｔ細胞の量を意味することを意図している。治療上有効であるために必要とされるＣＴＬ調製物の投薬量は、例えば、治療されるべき病理学的状態ならびに標的抗原の豊富さのレベルおよび密度、ならびに個体の体重および病状、ならびに以前のもしくは同時の治療に依存することができる。該方法により提供される選択的ＣＴＬの特定の適用についての有効用量とみなされる適切な量は、本明細書に提供される手引きを使用して当業者により決定されることができる。例えば、投与のための量は、下述されるところのインビトロもしくはインビボ細胞傷害性アッセイから外挿することができる。当業者は、患者の病状を治療の経過を通じてモニターする必要があること、および投与される組成物の量を治療に対する個体の応答に従って調節することができることを認識するであろう。
【００３８】
本発明は、病理学的に異常な細胞に特異的なＣＤ８^＋　Ｔ細胞の細胞溶解活性のエクスビボでの誘導方法を提供する。該方法は、アポトーシス性の病理学的に異常な細胞を、少なくとも樹状細胞（ＤＣ）、ＣＤ４^＋　Ｔ細胞およびＣＤ８^＋　Ｔ細胞を有する混合物と接触させること、ならびに前記病理学的に異常な細胞に対する選択的細胞溶解活性を有するＣＤ８^＋　細胞溶解性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を生成させるのに十分な時間の間、前記アポトーシス性の病理学的に異常な細胞を前記混合物とともに培養することよりなる。
【００３９】
本発明はさらに、非Ｂ細胞白血病細胞である病理学的に異常な細胞に対し特異的なＣＤ８^＋　Ｔ細胞の誘導方法を提供する。
【００４０】
本発明の方法は、好ましくは病理学的に異常な細胞の排除が個体に対し利益を提供する可能性がある場合に、いずれかのアポトーシス性の病理学的に異常な細胞もしくは非Ｂ細胞白血病の病理学的に異常な細胞に対し選択的なＣＴＬの集団を生成させるために使用することができる。こうした利益は、疾患の重症度、疾患の症状、疾患の進行もしくは疾患の進行速度を低下させることを包含する可能性がある。特定の型病理学的に異常な細胞は、例えば、正常細胞に比較して異常に調節される細胞を包含する。病理学的に異常な細胞は、疾患により正常から変化されている細胞であることができるか、またはそれらの存在により疾患を引き起こす変えられた細胞、もしくは疾患を引き起こす因子を産生する細胞であることができる。従って、本発明の方法は、癌、自己免疫障害、感染性疾患およびアレルギーのような疾患を媒介する病理学的に異常な細胞に応用可能である。
【００４１】
病理学的状態の上の範疇の特定の言及により、当業者はこうした用語がこれらの病理学的状態の全部の分類および型を包含することを理解するであろう。例えば、癌という用語は、悪性、良性、軟部組織もしくは充実性の腫瘍として特徴づけられようと、全部の既知の癌を包含することを意図している。例示により、既知の癌の非網羅的一覧を下に表１に提供する。同様に、ならびに表１に示される癌の分類および型への類似により、感染性疾患および自己免疫性疾患という用語は、これらの病理学的状態の全部の分類および型を包含することを意図している。当業者は多様な分類および型の感染性および自己免疫性疾患ならびにアレルギーに馴染みがある。
【００４２】
【表１】

【００４３】
本発明の方法は、異常に調節される病理学的に異常な細胞に対し選択的であるＣＴＬ細胞を産生させることに応用可能である。異常に調節される細胞は、例えば、制御されない細胞増殖を表す細胞、ならびに細胞周期の特定の期で機能不全を表して変えられた増殖の特徴もしくは形態学的表現型につながる細胞を包含する。異常に調節される細胞型の特定の例は、癌のような腫瘍細胞および組織過形成の特徴である過形成細胞を包含する。別の特定の例は、刺激後に異常に活性化されたようになるかもしくはダウンレギュレートすることに失敗する免疫細胞を包含する。こうした異常に調節される免疫細胞は自己免疫疾患を媒介する。異常に調節される細胞はまた、生化学的もしくは生理学的に機能不全である細胞も包含する。細胞の機能もしくは増殖の他の型の異常な調節は当業者に既知であり、そして、本発明のＣＴＬの生成方法に応用可能な同様に病理学的に異常な細胞である。
【００４４】
病理学的に異常な細胞は、上述されたもののような異常に調節される細胞を包含し、そして加えて、例えば感染性病原体のような病理学的病原体に感染した細胞を包含する。細胞を異常にする感染性病原体は、例えば、生存もしくは繁殖のために宿主細胞の機械装置を必要とする病原体を包含する。例えば、ウイルスは細胞を感染させそして癌を引き起こす。ＤＮＡウイルス、ＲＮＡウイルスおよび寄生虫がこうした感染性病原体内に包含される。ＤＮＡウイルスの特定の例はアデノウイルスおよびパルボウイルスを包含する。ＲＮＡウイルスの特定の例は急性灰白髄炎、インフルエンザおよびレトロウイルスを包含する。迅速に突然変異するウイルスは本発明の方法に応用可能である。抗原の供給源としての病理学的に異常な細胞の使用は、迅速に突然変異するウイルスに感染した細胞上の複数のエピトープに対し特異的であるＣＴＬ細胞を提供する可能性がある。１標的抗原を選択的に認識するＣＴＬ集団に比較して、複数の標的抗原に対し選択的なＣＴＬ集団は、ウイルスを含有する細胞が破壊されることができる確率を増大させる可能性がある。生存もしくは繁殖のために真核生物宿主細胞の機械装置を利用する寄生虫は例えばトリパノソーマを包含する。これらおよび宿主細胞の機械装置を利用する当該技術分野で既知の他の病原体により感染した細胞は異常にされる。それらは正常な細胞機能が損なわれており、それは形態学的および生化学的変化に現れる可能性があるからである。であるから、本発明の方法により生成されるＣＴＬはこれらの細胞を標的とすることができる。
【００４５】
病理学的に異常な細胞は、正常なタンパク質発現の調節における変化のような、タンパク質の変化により異常である細胞を包含する。タンパク質発現の変化は、タンパク質の増大された発現、外来タンパク質の発現、特定の段階の特定の細胞型中での通常は発現されないタンパク質の発現、および突然変異体タンパク質の発現を包含する。正常から変えられたタンパク質発現を有する病理学的に異常な細胞はまた、正常細胞のものと異なる細胞表面抗原も有する可能性がある。病理学的に異常な細胞はまた、あるアレルゲンに対し特異的なＩｇＥ抗体、または他の疾患もしくは病状を媒介する可能性がある他の型の抗体を作成するＢ細胞のような、疾患もしくは病状を引き起こすタンパク質を作成している細胞も包含する。
【００４６】
非プレＢ細胞白血病細胞を包含する非Ｂ細胞白血病細胞である病理学的に異常な細胞は、白血病以外の疾患もしくは病状により病理学的に異常であるＢ細胞であることができる。例えば、非Ｂ細胞白血病細胞はＢ細胞リンパ腫細胞のような異なる型のＢ細胞癌細胞であることができる。非Ｂ細胞白血病細胞は、Ｂ細胞もしくはプレＢ細胞白血病細胞以外の型の白血病細胞であることができる。例えば、非Ｂ細胞白血病細胞はＴ細胞白血病細胞であることができる。Ｂ細胞白血病細胞はＣＤ４０を発現していないＢ細胞もしくはプレＢ細胞であることができる。こうした細胞はＣＤ４０Ｌに応答することが不可能である。
【００４７】
上の異常な（ａｂｅｒｒａｎｔ）および異常な（ａｂｎｏｒｍａｌ）細胞の分類および細胞型の全部は、不必要な細胞の成長および合併症につながる可能性のある望ましくない生理学的特徴および表現型を表す。であるから、これらの異常に調節されるもしくは異常な細胞は、正常細胞に比較して抗原の合成もしくは発現において差異を表すことができる。これらの差異は、本発明の方法により生成される標的の病理学的に異常な細胞に対し選択的であるＣＴＬにより区別することができる。
【００４８】
本発明の方法によれば、ＣＤ８^＋　Ｔ細胞の一集団が、病理学的に異常な細胞に対し選択的である細胞溶解性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を生成させるよう誘導される。ＣＴＬにより選択的に認識される細胞が、直接の細胞傷害性もしくはアポトーシスの誘導のいずれかにより破壊されることができる。ＣＴＬは、ＭＨＣクラスＩ分子と複合体形成されるポリペプチドフラグメントの形態の抗原を認識する成熟ＣＤ８^＋　ＴＬである。ＣＤ８^＋　ＴＬの表面上で複合体形成されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）への抗原の結合は、細胞内変化の開始に関与する一事象であり、これがＣＤ８^＋　ＴＬの細胞溶解性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）への分化につながる。ＣＴＬは、ＴＣＲにより結合されることができる標的抗原を表示する細胞に対する細胞溶解活性を表す。
【００４９】
病理学的に異常な細胞に対し選択的であるＣＴＬを生成させるために、ＣＤ８^＋　ＴＬを、ＣＴＬプライミング過程を増加する細胞もしくは因子の存在下に病理学的に異常な細胞によりプライミングする。従って、プライミングは、誘導抗原を発現する病理学的に異常な細胞を選択的に認識かつ溶解する活性のＣＴＬになるためのＣＤ８^＋　Ｔ細胞の曝露である。ＣＴＬの誘導のための一要件は抗原提示細胞による抗原の提示である。ほとんど全部の有核細胞がＭＨＣクラスＩを発現するが、しかしＣＤ８^＋　Ｔ細胞をプライミングすることが可能でないかもしれない。付加的な補助受容体、共刺激分子および他の因子が効率的なプライミングに必要であるからである。従って、プライミングのための必要とされる因子の全部を発現することができる専門の抗原提示細胞の使用は、病理学的に異常な細胞に対し選択的なＣＴＬをプライミングするためのエクスビボで培養された細胞の混合物中でのＣＴＬプライミングの効率を増大させる可能性がある。
【００５０】
樹状細胞は、抗原を効率的にプロセシングしかつ提示しそしてＣＤ８^＋　ＴＬの細胞溶解応答を強力に誘導することができる、専門の抗原提示細胞（当業者に公知かつ彼らにより普遍的に使用される用語）である。樹状細胞による抗原の提示はアポトーシス細胞の樹状細胞の貪食作用後に起こることができる。従って、樹状細胞とともに、アポトーシス性であるかもしくはアポトーシスを受けることができる病理学的に異常な細胞を、本発明の方法における標的細胞として使用することができる。
【００５１】
樹状細胞の機能を果たす細胞を、本発明の方法で樹状細胞の代わりに用いることができる。樹状細胞のこうした置換物は、例えば、組換えタンパク質の発現により抗原もしくは共刺激分子を与える細胞であることができる。こうした人工的抗原提示細胞を産生させるための組換えタンパク質の発現は当該技術分野で公知であり、そして当業者は、本発明の方法での使用のための人工的抗原提示細胞中での発現のための組換えタンパク質を決定することができる。
【００５２】
本発明の方法は、従って、少なくともＣＤ８^＋　ＴＬ、樹状細胞および病理学的に異常な細胞（アポトーシス性であるかもしくはアポトーシスを受けることができる）を、標的の病理学的に異常な細胞に対し選択的なＣＴＬの誘導のために利用する。この混合物に添加される他の細胞および因子は、当初のＣＤ８^＋　Ｔ細胞のプライミングの効率もしくはＣＴＬ応答のレベルを増加することができる。例えば、ＣＴＬ誘導混合物中へのＣＤ４^＋　Ｔ細胞の包含は、ＣＤ８^＋　記憶ＣＴＬの効率的なプライミングおよび産生に必要とされる付加的な因子を提供することができる。
【００５３】
ＣＤ４^＋　Ｔ細胞は、細胞抗原に対するＣＤ８^＋　ＴＬの応答を可能にするＴ細胞の援助（ｈｅｌｐ）を提供する。インビボにおいて、このＴ細胞の援助はＣＤ４^＋　Ｔ細胞による樹状細胞の活性化から生じ、そしてＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌの相互作用により媒介される可能性がある。いくつかの因子を、ＣＤ８^＋　Ｔ細胞のプライミングのための細胞の混合物のインキュベーションにおいてＣＤ４^＋　Ｔ細胞により提供される機能の代わりに用いることができる。
【００５４】
例えば、本発明のエクスビボの方法において、樹状細胞の成熟を促進する、ＣＤ４^＋　Ｔ細胞により樹状細胞に提示される因子ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）が、ＣＴＬ応答の樹状細胞の誘導を促進するのに十分であることが見出された。ＣＤ４０Ｌの機能は、ＣＤ４０Ｌのものに類似の様式でＣＤ４０に結合しかつ活性化することが可能であるＣＤ４０抗体のような分子により置換することができる。さらに、成熟樹状細胞により産生されることができる因子インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）もまたＣＤ４０Ｌの代わりに用いられることが見出された。
【００５５】
従って、本発明の方法において、ＣＤ４０ＬおよびＩＬ−１２の添加を、ＣＤ４^＋　Ｔ細胞の最低１種の機能の代わりに用いることができるが、とは言え、これらの因子は、ＣＤ８^＋　記憶ＴＬの産生を誘導するために効果的に機能しないかもしれない。加えて、インターロイキン−７（ＩＬ−７）がＣＴＬ応答のレベルをさらに増大させることが見出された。従って、ＣＴＬ産生の効率を増大させるための、病理学的に異常な細胞に対し選択的なＣＴＬの生成のために集成された細胞の混合物のインキュベーションに、有効量のＩＬ−７を添加することが、有利である可能性がある。上で挙げられたもののような因子の使用は下により詳細に論考されるであろう。
【００５６】
本発明の方法は、病理学的に異常な細胞に対し選択的なＣＴＬを生成させることができる細胞の集団の混合物を提供する。細胞の混合物は、ＣＤ４^＋　Ｔ細胞を包含する他の成分と組合せることができる、最小のＣＤ８^＋　細胞、樹状細胞および病理学的に異常な細胞の集団を含有する。
【００５７】
ＣＤ８^＋　Ｌ、樹状細胞、病理学的に異常な細胞およびＣＤ４^＋　細胞の調製物は、多くの多様な免疫学的細胞型を含有することができる。従って、病理学的に異常な細胞に対し選択的なＣＴＬを誘導するために集成された細胞混合物は、引用される細胞型以外の細胞型を含有することができる。
【００５８】
本発明の方法での使用のための細胞は、細胞の不均質な集団、単離された細胞もしくは実質的に単離された細胞であることができる。細胞の不均質な集団は、骨髄のような多くの免疫学的細胞型を含有する細胞の天然に存在する混合物であることができる。単離された細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の調製物中の細胞のような分画された集団中の細胞であることができるか、または特定の細胞型が濃縮もしくは枯渇された細胞の集団であることができる。実質的に単離された細胞は、精製されている細胞のような他の細胞型を実質的に含まない細胞であることができる。
【００５９】
従って、本発明の細胞混合物は、引用されるおよび引用されない細胞を包含する多様な細胞を含有することができる。細胞混合物は多様な細胞調製物を使用して集成することができる。従って、細胞集団を変えることにより、効率的なＣＤ８^＋のプライミングおよびＣＴＬの生成について細胞混合物を至適化することが可能である。
【００６０】
ＣＴＬ誘導混合物中に含有される細胞集団は、増大されたもしくは減少された純度の細胞を調製すること、および特定の得ることができる結果を促進するように培養物中の特定の細胞型を処理することによるような、いくつかの方法で変えることができる。例えば、細胞を、特定の密度もしくは数への細胞の拡張、細胞の分化、特定の細胞系統の分化、アポトーシス、またはいずれかの所望の得ることができる細胞の状態もしくは表現型を促進する因子で処理することができる。成長もしくは分化を促進する条件は、培養された細胞の成長培地中にタンパク質因子もしくは化学的試薬を包含することができる。これらの因子および試薬は粗混合物の成分であることができるか、単離することができるかもしくは実質的に単離することができる。因子の例は、血清、天然に存在するタンパク質、部分的に精製されたタンパク質および実質的に単離されたタンパク質のような粗混合物を包含する。
【００６１】
混合物中の細胞集団の調製物はＣＴＬのプライミングもしくは生成の効率を遂げることができる。例えば、ＣＤ８^＋　ＴＬおよび樹状細胞の双方を、ＰＢＭＣの単一培養物中で同時に調製することができる。とりわけ、個体から収穫されたＰＢＭＣは、下に論考されるところの既知の方法を使用してＣＤ４^＋　Ｔ細胞を最初に枯渇させることができる。ＣＤ４^＋　Ｔ細胞枯渇の一目的は、一般にＣＤ８^＋　ＴＬより速く成長するＣＤ４^＋　Ｔ細胞がＣＤ８^＋　細胞集団を駆逐するほど成長することを予防することにより、ＣＤ８^＋　ＴＬの成長を促進することである。枯渇されたＰＢＭＣをその後、病理学的に異常な細胞と組合せることができる。ＰＢＭＣ混合物を、ＣＤ８^＋　ＴＬによる提示された抗原の認識を可能にする十分な時間の間インキュベートした後に、病理学的に異常な細胞に対し選択的なＣＴＬが生成される。
【００６２】
ＣＴＬ生成のために細胞の混合物を集成するための１種以上の細胞型を得るための一細胞集団を使用することの一利点は、付加的な細胞集団の単離および培養が必要とされないことである。加えて、単一ドナーからの細胞を使用することにより、細胞型がＨＬＡが同一であり、そしてドナーおよびレシピエントの細胞集団のＨＬＡ適合を考慮する必要性が従って必要とされないことが既知である。単一の供給源からの細胞型を含有する細胞混合物の使用は、細胞の供給源を得ることもしくは十分な量の細胞サンプルを得ることが困難である場合に有利である。
【００６３】
単一の供給源から得られたＣＤ８＋　ＴＬ、ＣＤ４＋　Ｔ細胞および樹状細胞の混合物の使用が便宜を提供するとは言え、細胞混合物をＣＴＬ生成の効率を増大させるように変えることができる。ＣＤ８^＋　ＴＬのプライミングの効率を増大させるために、例えば細胞の集団を個別に単離しそして培養物中で処理することができる。ＣＤ４^＋　Ｔ細胞およびＣＤ８^＋　ＴＬ、樹状細胞、ならびに病理学的に異常な細胞の単離方法は、下に詳細に記述される。本発明の方法の細胞型のそれぞれは、ＣＤ８^＋のプライミングもしくは生成を誘導するための細胞集団の混合物の、全体的有効性へのそれらの特定の寄与を高めるように培養物中で処理することができる。
【００６４】
標的の病理学的に異常な細胞に対する選択的ＣＴＬの誘導を促進もしくは増加する因子を、細胞集団の混合物の培養物、もしくは細胞集団を集成する前に独立に培養された特定の細胞集団に添加することができる。本発明の方法で有用である可能性のある因子は、サイトカイン、増殖因子、分化因子、細胞の生存率の維持に関与するタンパク質、およびアポトーシスを促進する因子である。
【００６５】
本発明の方法のエクスビボ細胞培養物中に存在することができるサイトカインの例は、例えばＧＭ−ＣＳＦ、ならびにＩＬ−２、ＩＬ−７およびＩＬ−１２のようなインターロイキンを包含する。エクスビボ細胞培養物中に存在することができる増殖因子の例は、例えば本発明の方法で使用される特定の細胞型の細胞の成長を引き起こすもしくはそれに寄与するタンパク質を包含する。増殖因子の特定の例は、線維芽細胞増殖因子、血小板由来増殖因子およびトランスフォーミング増殖因子βである。分化因子の例は、該方法の特定の細胞型中での細胞の分化の過程に寄与するもしくはそれを増加するタンパク質である。分化因子の特定の一例は血清由来因子である。細胞の生存率の維持に寄与する因子の例は、成長ホルモンおよびインターフェロンαを包含する。アポトーシスを誘導させるために使用される因子の特定の例は下に詳細に提供される。
【００６６】
細胞培養物中での使用のための因子は、天然の供給源から調製もしくは単離、または組換え法により製造することができる。サイトカインＩＬ−７およびＩＬ−１２のような特定の因子は、例えば天然の細胞により提供されることができるか、もしくは組換え法による産生後に単離されるような実質的に精製された形態で提供されることができる。組換え法によるタンパク質産生、細胞中での特定のタンパク質の検出、および生化学的方法によるタンパク質の単離は、当該技術分野で公知である。多くの因子は商業的供給源により得ることができる。フィーダー（ｆｅｅｄｅｒ）細胞もまた、タンパク質を膜に結合されたもしくは分泌された形態で培養される細胞に供給することができる。こうした因子を提供する細胞の例は、増殖することができない照射された細胞のような照射されたフィーダー細胞である。フィーダー細胞の特定の一例は、組織培養物表面に接着しそしてＣＤ８＋　ＴＬのプライミングを促進する因子を与えるかもしくは分泌する照射された単球である。
【００６７】
選択的ＣＴＬの生成方法で使用される因子の濃度は、混合物中に存在する特定の細胞型、特定の細胞の特徴、インキュベーション時間、タンパク質の純度、および細胞の単離の程度に依存して変動する可能性がある。特定の細胞型の特徴は個体間で異なるかもしれず、同一の培養条件下で異なる成長もしくは分化速度をもたらす。因子の濃度は、病理学的に異常な細胞に対し選択的なＣＴＬを生成させるために使用される細胞集団間でのこれらの差異のいずれかによる細胞挙動の差異を説明するように調節することができる。例えば、細胞培地中の増殖因子の濃度を、特定の細胞のより速い成長速度を促進するように増大させることができる。
【００６８】
因子は１種もしくはそれ以上の細胞機能を有する可能性がある。例えば、ある細胞型中での成長を促進する因子はまた別の細胞型中で分化を促進するかもしれない。特定の細胞型に対する特定の因子の影響は当該技術分野で既知の方法により決定することができる。こうした方法は例えば細胞の数、生存率および表現型のアッセイを包含する。樹状細胞および樹状細胞混合物を包含する多様な細胞の培地に添加することができる因子の特定の例は、下により詳細に記述される。
【００６９】
例えば、単球は樹状細胞への効率的な分化を促進する条件下で処理することができる。ＰＢＭＣ中に存在するもしくはそれから収集された単球は、十分な時間の間、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４を添加することにより、樹状細胞に分化するように誘導することができる。
【００７０】
樹状細胞は、抗原の取り込みの効率を増大させるように培養物中で処理することができる。未熟樹状細胞は貪食作用により病理学的に異常な細胞を効率的に取り込むが、しかし抗原をプロセシングし、しかし抗原をより少なく効率的に提示する一方、成熟樹状細胞は、より少なく効率的に抗原を取り込みかつプロセシングする一方で抗原をより効率的に提示する。従って、樹状細胞の成熟前に未熟樹状細胞に病理学的に異常な細胞を与えることが有利である。未熟樹状細胞および病理学的に異常な細胞の混合物を調製すること、ならびに樹状細胞に成熟因子を導入する前に抗原取り込みを起こさせることにより、ＣＤ８＋　ＴＬのプライミングの効率を増大させることができる。
【００７１】
本発明の方法で使用される樹状細胞は未熟もしくは成熟樹状細胞であることができる。樹状細胞の成熟を誘導する因子は例えばＴＮＦ−α、ＬＰＳおよびＣＤ４０Ｌを包含する。ＣＤ４＋　Ｔ細胞の存在もまた樹状細胞成熟因子を提供する可能性がある。従って、樹状細胞に抗原をプロセシングさせるために、十分な時間の間、ＣＤ４＋　Ｔもしくは他の成熟因子の非存在下で樹状細胞および病理学的に異常な細胞を培養することが有利である可能性がある。抗原をプロセシングさせる樹状細胞をその後、ＣＴＬの生成に必要とされる付加的な細胞および因子に加えて、抗原提示を促進する細胞および因子と混合することができる。抗原提示を至適化する条件下でインキュベートされた樹状細胞を最初に調製することにより、ＣＤ８^＋　ＴＬのプライミングの効率を増大させることができる。
【００７２】
本発明はエクスビボでのＣＤ８^＋　ＴＬの誘導方法を提供する。該方法は：（ａ）前記病理学的に異常な細胞を、病理学的に異常な細胞の抗原を提示する樹状細胞（ＤＣ）を生じさせるのに十分な時間の間、少なくともＤＣおよび単離されたＣＤ４^＋　Ｔ細胞を有する第一の混合物と接触させること；（ｂ）ＣＤ８^＋　ＴＬを添加して第二の混合物を生じさせること、ならびに（ｃ）前記病理学的に異常な細胞に対する選択的な細胞溶解活性を有するＣＤ８^＋　細胞溶解性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を生成させるのに十分な時間の間、前記第二の混合物を培養することよりなる。
【００７３】
病理学的に異常な細胞に対し選択的なＣＴＬの産生のために集成される細胞混合物の一例は以下のとおりである。例えば、ＰＢＭＣの一調製物を分画していくつかの細胞集団を生じさせることができる。細胞集団は単離もしくは実質的に単離することができる。とりわけ、単球は、ＰＢＭＣから収集しそしてＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４を十分な時間の間添加することにより樹状細胞に分化するように誘導することができる。この未熟樹状細胞集団を、病理学的に異常な細胞の抗原の取り込みおよびプロセシングを見込むのに十分な時間の期間の間、アポトーシス性の病理学的に異常な細胞と組合せることができる。ＰＢＭＣからのＣＤ４^＋　Ｔ細胞の枯渇は、ＣＤ４^＋　Ｔ細胞集団およびＣＤ４^＋を枯渇されたＰＢＭＣ集団の双方を提供することができる。
【００７４】
生じる３種の細胞集団はその後個別に培養することができる。ＣＤ４^＋　Ｔ細胞を、例えばそれらを非分裂性にする放射により処理しそしてその後ＣＤ４^＋が枯渇されたＰＢＭＣに戻すことができる。このＰＢＭＣ集団を、病理学的に異常な細胞およびＩＬ−７とともにインキュベートされた樹状細胞集団と組合せることができる。病理学的に異常な細胞は例えば腫瘍細胞であることができる。細胞の混合物をその後、病理学的に異常な細胞に対する選択的なＣＴＬ産生を可能にするのに十分な時間の間、インキュベートすることができる。細胞の集団は例えば保存することができるか、さらに単離することができるか、もしくは個体を治療するのに使用することができる。
【００７５】
ＣＤ８^＋　ＴＬのプライミングの効率の増大方法は、ＭＨＣクラスＩＩ分子と会合された特定のペプチド抗原を認識するＣＤ４^＋　Ｔ細胞でＣＤ４^＋　Ｔの集団を濃縮することを必要とする。本発明の方法で使用されるＣＤ４^＋　Ｔ細胞の集団において、細胞の小さな一画分のみが、病理学的に異常な細胞から生じられかつ病理学的に異常な細胞に対し選択的なＣＴＬを生成させるために集成された細胞集団の混合物中の樹状細胞上で提示される抗原に対し特異的であることができる。全ＣＤ４^＋　Ｔ細胞集団中の抗原特異的なＣＤ４^＋　Ｔ細胞の数を増大させるために、ＣＤ４^＋　Ｔ細胞の一濃縮方法を使用することができる。例えば、ＣＤ４^＋　Ｔ細胞集団を破傷風トキソイドのような免疫原を使用して増大させることができる。破傷風トキソイドに対して以前に免疫化された個体からのＣＤ４^＋　Ｔ細胞の一集団を得、エクスビボで培養し、そして未熟樹状細胞に成熟シグナルをより効果的に提供することができるＭＨＣクラスＩＩ拘束性ＣＤ４^＋　Ｔ細胞の濃縮された集団をもたらすように破傷風トキソイドで処理することができる。ＭＨＣクラスＩＩ拘束性抗原に対し特異的であるクローン化されたＣＤ４^＋　Ｔ細胞を得、拡張し、そして反復される使用のため保存することができる。当業者は、クローン細胞系を得、細胞を拡張しそして細胞を長期保存のため調製する方法を知っているであろう。
【００７６】
エクスビボの培養された混合物中でのＣＴＬの産生は、ＣＤ８^＋　ＴＬが提示された抗原を認識しそしてＣＴＬへの分化拘束を誘発するのに十分な時間の期間の間のインキュベーションの間に起こる。例えば、少なくとも樹状細胞、アポトーシス性の病理学的に異常な細胞、ＣＤ４^＋　Ｔ細胞およびＣＤ８^＋　ＴＬの細胞混合物からの選択的ＣＴＬの誘導は、約６ないし４０時間の時間の期間、好ましくは約２０時間で起こる可能性がある。細胞の混合物からのＣＴＬ誘導の分化拘束に十分な時間の期間は、例えば細胞型の集団の混合物中の樹状細胞に与えられる抗原もしくは共刺激分子の量を包含するいくつかの因子の調節により調節することができる。
【００７７】
当業者は、所望のインキュベーション時間を達成するのに例えばどの因子、細胞組成もしくは濃度を使用することができるかを知っているであろう。さらに、当業者は、ＣＤ８^＋　ＴＬをプライミングしかつ標的の病理学的に異常な細胞に対し選択的な成熟するＣＴＬにそれらを分化拘束するのに十分な時間の期間を増大もしくは減少させるかのいずれかのために、例えばどの因子、細胞組成もしくは濃度を調節することができるかを知っているであろうか、もしくは決定することができる。
【００７８】
例えば、産生されるべきＣＴＬに必要とされるインキュベーション時間を決定するために、細胞を多様な時点で、例えば５、１５、３０および４５分、ならびに１時間間隔で１もしくはそれ以上の日数もしくは週の間、培養物から除去し、そして標的抗原の認識後にＣＴＬ活性もしくはインターフェロンγ産生について試験することができる。標的抗原を表示する病理学的に異常な細胞は、標的細胞の溶解もしくはその中でのアポトーシスの誘導のいずれかにより、選択的ＣＴＬにより破壊されることができる。ＣＴＬ活性は当該技術分野で公知の方法により測定することができる。細胞傷害性の活性の測定方法は下および実施例に詳細に論考される。
【００７９】
本発明の方法で使用することができる特定の因子はＩＬ−７、ＩＬ−１２およびＣＤ４０Ｌを包含する。ＣＤ４^＋　Ｔ細胞を含むもしくは含まない、少なくとも樹状細胞、アポトーシス性の病理学的に異常な細胞およびＣＤ８^＋　ＴＬのエクスビボで培養された混合物中で使用されるＩＬ−７の濃度は、例えば１〜３０ｎｇ／ｍｌ、３０〜６５ｎｇ／ｍｌもしくは６５〜１００ｎｇ／ｍｌであることができる。樹状細胞、アポトーシス性の病理学的に異常な細胞およびＣＤ８^＋　ＴＬのエクスビボで培養された混合物中のＩＬ−１２の濃度は、例えば１〜３０ｐｇ／ｍｌ、３０〜６５ｐｇ／ｍｌもしくは６５〜１００ｐｇ／ｍｌであることができる。樹状細胞、アポトーシス性の病理学的に異常な細胞およびＣＤ８^＋　ＴＬのエクスビボで培養された混合物中での使用のためのＣＤ４０Ｌを発現する天然の細胞もしくは組換え細胞上に細胞表面タンパク質として提示されるＣＤ４０Ｌの有効量は、当業者により決定されることができる。当業者は、組換え細胞中でのＣＤ４０Ｌの発現のレベルを調節することができること、およびＣＤ４０Ｌ細胞を反応混合物中で力価測定して（ｔｉｔｒａｔｅｄ）添加されるべき細胞の有効濃度を決定することができることを知っているであろう。当業者は、細胞のこうした有効濃度から外挿して、本発明の方法を使用する病理学的に異常な細胞に対し選択的なＣＴＬを誘導するための単離されたもしくは実質的に単離されたＣＤ４０Ｌタンパク質の有効量を決定することが可能であろう。
【００８０】
本発明の方法での使用のために細胞を照射することができる。誘導期間の間の特定の細胞の成長が望ましくない場合に、病理学的に異常な細胞に対し選択的なＣＴＬを誘導するために細胞混合物を集成する前に、特定の細胞を照射することが有利である可能性がある。例えば、樹状細胞、ＣＤ４^＋　Ｔ細胞および病理学的に異常な細胞のような細胞を照射することができる。これらの細胞型の成長もしくは拡張は、増大された細胞数が誘導過程が起こるのに必要でないかもしれず、また、ＣＤ８^＋　Ｔ細胞より速い速度で成長する細胞型の拡張が生成されるＣＴＬ集団の不必要な汚染を提供する可能性があるために、望ましくないかもしれないからである。
【００８１】
既に論考されたとおり、本発明の方法での使用のための細胞は細胞混合物もしくは単離された細胞であることができる。ＣＤ８^＋　ＴＬおよびＣＤ４^＋　Ｔ細胞、樹状細胞ならびに病理学的に異常な細胞の調製は細胞の単離を包含することができる。本発明の方法での使用のための細胞は、例えば、密度遠心分離、遠心分離エリュトリエーション、蛍光標示式細胞分取、免疫親和性細胞分離および磁性分取（ｍａｇｎｅｔｉｃ　ｓｏｒｔｉｎｇ）（ＳｃｈｉｎｄｈｅｌｍとＮｏｒｄｏｎ，Ｅｘ　ｖｉｖｏ　Ｃｅｌｌ　Ｔｈｅｒａｐｙ，（１９９９）第１１章　アカデミック　プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）、サンディエゴ）のような当該技術分野で公知のいくつかの方法により単離することができる。
【００８２】
密度勾配遠心分離は、変動する密度の溶液中で遠心分離される場合の特定の密度の細胞の移動に基づく。細胞は、細胞密度および媒体の密度が等しい勾配の領域で一バンドに集まる傾向があることができる。密度勾配遠心分離法の例は、フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）、フィコール−ハイパーク（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ）およびパーコール（Ｐｅｒｃｏｌｌ）のような試薬を用いて調製された勾配上に細胞を負荷することを包含する。
【００８３】
遠心分離エリュトリエーションは、血液細胞を分離するために十分に開発された、細胞沈降速度の相対的差異に基づく方法である。蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）は、蛍光マーカー分子で標識された細胞が高散乱特性および蛍光に基づいて個別に分析されかつ分取される、選択的細胞分離方法である。
【００８４】
免疫親和性細胞分離は、低い固有の細胞親和性で物質に固定されるモノクローナル抗体、レクチンもしくは他の結合ドメインのような基質との細胞の相互作用に基づく。細胞は、固相支持体に結合された基質への細胞表面分子の結合により、基質に選択的に結合する。捕捉された細胞は、剪断応力、もしくは細胞と基質との間の相互作用を混乱させる化学的作用物質を使用して分離させる。
【００８５】
磁性分取は、細胞が常磁性もしくは強磁性物質を含有する親和性基質で標識される、細胞分離の一方法である。磁性で標識された細胞を磁場による捕捉により細胞集団から枯渇させることができるか、もしくは、標識された細胞を磁場の除去により回収することができる。ダイナビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）は商業的に入手可能である磁性細胞分離媒体の特定の一例である。
【００８６】
ＣＤ８^＋　ＴＬ単離の特定の方法の例は、枯渇されるべき細胞上に存在する細胞表面タンパク質に対する抗体で被覆されたビーズを使用するＣＤ４^＋、ＣＤ１４^＋、ＣＤ１９^＋もしくはＣＤ５６＋　細胞の枯渇のような陰性磁性細胞選択法、またはＣＤ８に対する抗体で被覆された磁性ビーズを用いるＣＤ８についての陽性選択のような陽性磁性細胞選択方法である。
【００８７】
樹状細胞の単離方法の一例は、フィコール−ハイパーク（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ）密度勾配遠心分離によるようなＰＢＭＣを収集すること、そして上述されたところの樹状細胞の分化を促進する条件下でそれらを培養することである。樹状細胞は、ＣＤ２−、ＣＤ１９−およびＣＤ５６−陽性細胞を包含する他の細胞型の枯渇のような他の既知の方法によりＰＢＭＣからさらに単離することができる。
【００８８】
ＣＤ４^＋　Ｔ細胞の特定の単離方法は、例えば、細胞集団からＣＤ８^＋　ＴＬを低下もしくは除去する陰性磁性細胞分離、およびＣＤ４^＋　Ｔ細胞の濃縮された集団を得るための陽性磁性細胞分離である。
【００８９】
病理学的に異常な細胞の単離方法は、細胞型および調製物の所望の純度により決定することができる。当業者は、上述された方法を包含するどの方法が特定の病理学的に異常な細胞の単離に応用可能であるかを知っているであろう。
【００９０】
本発明の方法で使用されるＣＤ８^＋　ＴＬおよびＣＤ４^＋　Ｔ細胞、樹状細胞ならびに病理学的に異常な細胞の集団は、複数の供給源から得ることができる。例えば、細胞はＣＴＬを使用して治療されるべき病理学的状態に悩まされる個体から、もしくはレシピエント個体に実質的に組織適合性である個体から得ることができる。こうした個体は、例えば、ＨＬＡが同一の同胞、もしくはＨＬＡが適合された親族、もしくはＨＬＡが適合された関係のない個体であってよい。組織適合性抗原の型分類方法は当該技術分野で公知である。こうした抗原型分類方法を使用して、当業者は、どのレベルの抗原類似性が、細胞がレシピエント個体と免疫学的に適合性であるために必要であるかを知っているであろうか、もしくは決定することができる。ドナー細胞とレシピエントとの間の寛容できる差異は多様な組織で異なる可能性があり、そして当業者により既知であるかもしくは容易に決定されることができる。移植抗原適合性の評価方法は当業者に公知である。
【００９１】
本発明の方法での使用のための細胞は、個体の多様な組織もしくは器官から得ることができる。当業者は、特定の細胞型のどの供給源が病理学的に異常な細胞に対し選択的なＣＴＬの調製に最も適しているかを決定する方法を知っているであろう。１種以上の組織のような、一個体の１種以上の供給源から細胞を収穫することが可能であるかもしれない。当業者は、必要とされる細胞の数および一個体の身体中での細胞型の到達可能性を考慮することにより、特定の細胞のどの特定の供給源が好ましいかを決定することが可能であろう。例えば、特定の一細胞型が一組織中で別の組織に比較してより豊富であるかもしれないか、もしくは、特定の一組織が細胞収穫のためにより到達可能であるかもしれない。一例は、血液細胞は比較的非侵襲的な処置により個体から除去することができるために、血液のような組織は骨髄のような組織よりもより到達可能であることである。
【００９２】
ＣＤ８^＋　ＴＬおよびＣＤ４^＋　Ｔ細胞は、例えば、組織適合性の個体もしくはＣＴＬレシピエントのような個体の血液、骨髄もしくは他の組織から得ることができる。該方法の好ましいＣＤ８^＋　ＴＬは、選択的ＣＴＬのレシピエントとＨＬＡが合致されるＣＤ８^＋　ＴＬである。ＣＤ４^＋　Ｔ細胞はＣＤ８^＋自己由来であることができるか、もしくは異種であることができる。本発明の方法での使用のためのＣＤ４^＋　Ｔ細胞は、樹状細胞に対し同種反応性（ａｌｌｏｒｅａｃｔｉｖｅ）であるか、もしくはＭＨＣクラスＩＩを共有する。
【００９３】
樹状細胞、もしくは樹状細胞に分化することが可能な単球は、本発明の方法での使用のために一個体の数種の組織から得ることができる。例えば、樹状細胞もしくは単球は、一個体からの血液、骨髄もしくは他の組織から得ることができる。
【００９４】
本発明の方法で使用されるべき病理学的に異常な細胞は多くの供給源から得ることができる。一供給源は、本発明の方法により生成されるＣＴＬを使用する養子免疫療法を受領することができる個体である。病理学的に異常な細胞は、細胞の均質もしくは不均質な集団からの細胞であることができるか、または単離された細胞であることができる。病理学的に異常な細胞は、腫瘍または他の疾患に罹っている組織もしくは器官からのような個体から取り出された細胞を包含する。病理学的に異常な細胞に対し選択的なＣＴＬの誘導方法は、細胞、均質および不均質な細胞集団、組織および器官のような天然の供給源からの細胞、培養された細胞、病理学的病原体による感染もしくは核酸での形質導入によるように変えられた培養された細胞に当てはまる。加えて、限定されるものでないが細胞ライセート、小胞、細胞画分もしくは細胞成分、異常な細胞から溶出されたタンパク質もしくはペプチドの混合物を挙げることができる広範な抗原を使用することができる。
【００９５】
本発明の病理学的に異常な細胞は、アポトーシス性の病理学的に異常な細胞であることができる。アポトーシス性の病理学的に異常な細胞は、病理学的に異常な細胞の集団中に存在することができるか、病理学的に異常な細胞の集団から単離することができるか、もしくはいくつかの方法により病理学的に異常な細胞中で誘導することができる。アポトーシスの誘導は細胞型に依存して多様な方法で達成されている（総説についてはＭｃＣｏｎｋｅｙら（１９９６）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ａｓｐｅｃｔｓ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　１７：１を参照されたい）。
【００９６】
アポトーシスは、内在性膜タンパク質である受容体の細胞外ドメインへのＴＮＦ、リンホトキシンおよびＦａｓリガンドのような細胞死活性化物質の結合により誘発されることができる。細胞死受容体の活性化は、カスパーゼ酵素の活性化をもたらす細胞質へのシグナルの伝達、およびついに細胞の死に達するシグナル伝達事象のカスケードにつながる。当業者は、どの試薬が特定の細胞型（１種もしくは複数）においてアポトーシスを誘導するかを知っているであろう。１種もしくはそれ以上の細胞系でアポトーシスを誘導するのに使用されている試薬の例は、アクチノマイシンＤ、アフィジコリン、Ａ２３１８７、カフェイン、カンプトテシン、シクロヘキシミド、デキサメサゾン、ドキソルビシン、５−フルオロウラシル、ヒドロキシ尿素、スタウロスポリン、タキソール、チミジンおよびビンブラスチンを包含する（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓウェブサイト）。
【００９７】
当該技術分野で公知のいくつかの方法を、アポトーシス細胞を検出するのに使用することができる。こうした方法は、アポトーシスの間に起こる形態学的変化を検出するための光学および電子顕微鏡検査、特徴的な細胞の収縮および増大された粒度を検出するためのフローサイトメトリーもしくは密度勾配遠心分離、トリパンブルー、臭化エチジウムおよびアクリジンオレンジのような色素を使用する膜の完全性の評価、アガロースゲル分析、インビトロおよびインシトゥＤＮＡ末端標識、ＰＣＲ分析、コメットアッセイおよびＥＬＩＳＡ系を包含する技術を使用する特徴的な非無作為的ＤＮＡ断片化の測定、アポトーシスの間に活性化されるプロテアーゼ酵素のカスパーゼファミリーからの一カスパーゼの活性の検出、アネキシンＶのようなホスファチジルセリン結合タンパク質の検出、組織トランスグルタミナーゼ活性の測定、ならびにカルシウムイオンの流入の測定（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｎｏｔｅｓ　６９：ｔｅｃｈｎｉｃａｌｌｙ　ｓｐｅａｋｉｎｇ−ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）を包含する。
【００９８】
アポトーシス細胞は上述されたもののような細胞分離方法を使用して非アポトーシス細胞から分離することができる。従って、アポトーシス性の病理学的に異常は、アポトーシス細胞を天然に含有する病理学的に異常な細胞の一集団もしくはアポトーシス細胞を含有するように誘導された細胞中に存在する可能性があり、そして本発明の方法での使用のためこうした供給源から単離することができる。
【００９９】
本発明の方法は病理学的に異常な細胞に対し選択的なＣＴＬの生成をもたらす。ＣＴＬは細胞の不均質な集団、単離された細胞もしくは実質的に単離された細胞であることができる。ＣＴＬ集団は標的の病理学的に異常な細胞上の１種もしくはそれ以上の抗原に対し選択的であるＣＴＬを含有する可能性がある。病理学的に異常な細胞に対し特異的であるＣＴＬの精製は、標的細胞もしくは抗原に対する細胞溶解活性を表すＣＴＬを選択することにより実施することができる。標的に対し特異的なＣＴＬの選択方法、およびＣＴＬの細胞溶解活性を測定するためのアッセイは当該技術分野で公知である。ＣＴＬの選択された一集団を、上述された分離方法を包含する当該技術分野で公知の方法を使用して精製することができる。本発明の方法により産生されるＣＴＬの不均質なもしくは単離された一集団は、標的の病理学的に異常な細胞の破壊における特定の一ＣＴＬ調製物の有効性を決定するためにインビトロで特徴づけすることができる。
【０１００】
細胞溶解活性のアッセイの一例はクロム−５１（^５１Ｃｒ）遊離アッセイである。実施例ＩＩでより詳細に記述されるこの方法において、ＣＴＬに媒介される活性を、培養された^５１Ｃｒ標識標的細胞の溶解を測定することにより決定する。ＣＴＬの機能を測定するための別のアッセイは標的細胞増殖アッセイである。標的細胞増殖アッセイは、インビトロでの標的細胞の増殖を阻害するＣＴＬの能力を測定する。簡潔には、標的細胞を、例えば細胞系および個体から単離された初代細胞を包含する適切な供給源から収集し、そして成長培地に懸濁して試験されるべき各サンプルについて１ｍｌあたり約１０^４個の生存可能な細胞の濃度を達成する。しかしながら、標的細胞の量および濃度は標的細胞の利用可能性に従って調節することができる。ＣＴＬを１ｍｌあたり約１０^６個の生存可能な細胞の濃度でサンプルに添加するか、もしくは標的細胞に対するＣＴＬの多様な比をプレート培養して、異なるＣＴＬ濃度での標的細胞の増殖を測定することができる。標的細胞に対するエフェクターの比は約５００：１ないし０．１：１の間であることができる。細胞は典型的には約１ないし２４時間インキュベートする。
【０１０１】
本発明の方法を使用して生成されるＣＴＬの寿命を超える対照を有することが望ましい可能性がある。細胞の生存率の一制御方法は、細胞を殺すトキシンを産生する細胞により取り込まれる化合物を代謝する自殺遺伝子を導入することである。例えば、ＣＴＬ中へのチミジンキナーゼ遺伝子の導入は、ガンシクロビルの添加による殺傷に対しＣＴＬを感受性にすることができる。この方法を使用して、チミジンキナーゼを発現するＣＴＬを、ＣＴＬもしくは関連する標的選択的な細胞溶解活性が必要とされないもしくは望ましい場合に排除することができる。チミジンキナーゼ遺伝子および自殺基質ガンシクロビルの使用は当該技術分野で公知である。細胞中へのチミジンキナーゼ遺伝子を含有するベクターの形質導入方法は当該技術分野で公知である。
【０１０２】
病理学的に異常な細胞に対し選択的なＣＤ８^＋　記憶ＣＴＬもまた本発明の方法を使用して生成させることができる。病理学的に異常な細胞に対し選択的なＣＤ８^＋　記憶ＣＴＬは、２もしくはそれ以上の世代の間、病理学的に異常なに対する選択的な細胞溶解活性を有するＣＴＬを培養することにより得ることができる。ＣＤ８＋　記憶ＣＴＬは、ナイーブＣＤ８＋　ＴＬより効率的に抗原に応答する能力を有し、そしてエクスビボ培養物中で抗原で再刺激することができる。ＣＤ８^＋　記憶ＣＴＬはエクスビボ培養物中でＣＴＬと区別することができる。ＣＤ８^＋　記憶ＣＴＬは複数の再刺激（典型的には少なくとも５回の再刺激）を受ける能力を有するからである。病理学的に異常な細胞に対し選択的な記憶ＣＤ８^＋　ＴＬの単離は、上述された方法を包含する当該技術分野で公知の方法により達成することができる。
【０１０３】
病理学的に異常な細胞の標的抗原に対し選択的であるＣＴＬは、病理学的に異常な細胞に対し選択的なＣＴＬと同一の治療的応用に有用である。標的抗原認識の結果が標的抗原に対し選択的なＣＴＬによる細胞の溶解であるからである。従って、エクスビボ培養物中で生成される標的抗原に対し選択的なＣＴＬは養子免疫療法に有用である可能性がある。
【０１０４】
既に論考されたとおり、ペプチド抗原である標的抗原に対し特異的なＣＴＬの使用は予測可能に成功裏でなかった。このアプローチは、標的抗原に対し選択的なＣＴＬを産生する確率を増大させる可能性がある因子の包含により改良される可能性がある。本発明の方法は、エクスビボ培養物中の細胞の混合物中でＩＬ−７を利用することにより、ＣＴＬ産生の増大された効率という利点を提供する。本発明の方法で提供されるところのＩＬ−７の使用は、標的細胞に対するＣＴＬ応答を生じさせる効率を増大させ、そして従って標的抗原に対し選択的なＣＴＬが産生されることができる確率を増大させる。
【０１０５】
本発明は、１種もしくはそれ以上の標的抗原に対し選択的なＣＤ８^＋　ＴＬのエクスビボの誘導方法を提供する。該方法は、前記１種もしくはそれ以上の標的抗原を、少なくとも樹状細胞（ＤＣ）、ＣＤ４^＋　Ｔ細胞、ＣＤ８^＋　ＴＬおよびＩＬ−７を有する混合物と接触させること、ならびに、前記１種もしくはそれ以上の標的抗原に対する選択的免疫反応性を有するＣＤ８^＋　細胞溶解性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を生成させるのに十分な時間の間、前記１種もしくはそれ以上の標的抗原を前記混合物とともに培養することよりなる。
【０１０６】
本発明は、病理学的に異常な細胞に対し選択的な抗原の同定方法を提供する。本発明の方法を使用して病理学的に異常な細胞もしくはその産物に対し生成されたＣＴＬを、それらが認識する抗原を同定するのに使用することができる。これは当業者に既知である手順を使用して達成することができる。１つのこうした方法は、病理学的に異常な細胞からクラスＩ　ＭＨＣを精製すること、およびそれと会合されたペプチドを遊離させることに存する。該ペプチド混合物をその後画分に分離し、そして分析して抗原ペプチドを含有する画分を決定する。その後、利用可能な技術（商業的に入手可能であるアルゴネックス（Ａｒｇｏｎｅｘ）、バージニア州シャーロットビル；およびＨｕｎｔら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９２）２５５：５０４９の技術のような）を使用してペプチド配列を決定する。これらの技術を利用するための制限する物質は、抗原特異的ＣＤ８^＋　ＴＬであり、それは本発明の方法を使用して提供される。
【０１０７】
別の方法は：（ａ）病理学的に異常な細胞を突然変異誘発剤で処理して病理学的に異常な細胞の突然変異体集団を生じさせること；（ｂ）病理学的に異常な細胞の前記突然変異体集団を前記病理学的に異常な細胞に対し選択的なＣＴＬと接触させて、前記ＣＴＬとの反応性を喪失した突然変異体の病理学的に異常な細胞を同定すること；（ｃ）前記突然変異体細胞中に、病理学的に異常な細胞のポリペプチドをコードする核酸の発現可能な集団を導入して前記ポリペプチドを発現する突然変異体細胞の集団を生じさせること；および（ｄ）前記病理学的に異常な細胞に対し反応性の前記ＣＴＬとの反応性を復帰する、病理学的に異常な細胞のポリペプチドを発現する突然変異体細胞を同定することよりなる。
【０１０８】
病理学的に異常な細胞もしくは標的抗原に対し選択的なＣＴＬの一集団を使用して、該病理学的に異常な細胞に対し選択的な抗原を同定することができる。選択的な抗原を同定するために使用されるＣＴＬの集団は、例えば該病理学的に異常な細胞に対する多特異性もしくは単一特異性の反応性を表す可能性がある。病理学的に異常な細胞の抗原もしくは未知の標的抗原の同定方法は、病理学的に異常な細胞に対し選択的なＣＴＬにより認識される抗原がもはや存在しないように突然変異誘発された標的の病理学的に異常な細胞の集団を得ること、抗原に欠陥のある病理学的に異常な細胞中にｃＤＮＡライブラリーを導入すること、および病理学的に異常な細胞を認識するＣＴＬの能力を復帰するｃＤＮＡを発現する病理学的に異常な細胞を選択することを必要とする。その後、ｃＤＮＡを細胞からレスキューし、そして配列決定して標的抗原の正体を決定する。
【０１０９】
病理学的に異常な細胞の一集団の突然変異誘発は当該技術分野で公知の方法を使用して実施することができる。例えば、細胞を照射もしくはメタンスルホン酸エチルのような化学的突然変異原での処理のような方法により突然変異させることができる。クラスＩおよび抗原をプロセシングする機械装置を未だ保持しかつ病理学的に異常な細胞に対し選択的なＣＴＬにより認識されない突然変異された細胞は、それがＣＴＬにより溶解されないことができるために同定することができる。抗原を欠失された細胞中へのｃＤＮＡライブラリーの導入は、化学的試薬を使用するトランスフェクションおよび電気穿孔法のような当該技術分野で公知の方法により実施することができる。ＣＴＬにより認識されることができる形質導入された細胞は、ＣＴＬにより認識されるタンパク質をコードするｃＤＮＡを含有する。抗原を復帰された細胞の同定は、病理学的に異常な細胞に対し選択的なＣＴＬの機能的活性を使用して形質導入された細胞集団をスクリーニングすることにより実施することができる。その後、ｃＤＮＡのレスキューおよび配列決定を、当該技術分野で公知の方法を使用して実施する。
【０１１０】
本発明は病理学的に異常な細胞に対し選択的な抗原の同定方法を提供する。該方法は：（ａ）病理学的に異常な細胞に対し選択的であることが疑わしい１種もしくはそれ以上の抗原を、前記１種もしくはそれ以上の抗原を発現する病理学的に異常な細胞に対し選択的なＣＴＬと接触させること、および（ｂ）前記１種もしくはそれ以上の抗原に対する、前記１種もしくはそれ以上の抗原を発現する病理学的に異常な細胞に対し選択的な前記ＣＴＬの免疫反応性を測定することよりなり、ここで、前記１種もしくはそれ以上の抗原に対する選択的免疫反応性を有するＣＴＬは、前記１種もしくはそれ以上の免疫反応性抗原を、前記病理学的に異常な細胞に対し選択的であるとして特徴づけする。
【０１１１】
病理学的に異常な細胞、または本発明の方法を使用して生成される１種もしくはそれ以上の標的抗原に対し選択的なＣＴＬの一集団はまた、病理学的に異常な細胞に対し選択的かつ従って特定の疾患もしくは病状と関連することが疑わしい、１種もしくはそれ以上の標的抗原の選択性を同定もしくは確証するのにも使用することができる。簡潔には、該方法は、疑わしい１種もしくはそれ以上の抗原を発現する病理学的に異常な細胞に対し選択的なＣＴＬ集団もしくはＣＴＬクローンを用いて１種もしくはそれ以上の標的抗原をスクリーニングすることを必要とする。疑わしい抗原に対するＣＴＬの選択的免疫反応性は、病理学的に異常な細胞に対する抗原の選択性を示すかもしくは確認する。同様に、疑わしい抗原は、最初に宿主細胞中で抗原を発現させること、およびその後該疑わしい抗原を発現する細胞に対するＣＴＬの細胞溶解活性を測定することによりスクリーニングすることができる。選択的な細胞溶解活性は、病理学的に異常な細胞に対する１種もしくはそれ以上の抗原の選択性を示すかもしくは確認する。１種もしくはそれ以上の疑わしい抗原を発現する細胞は、例えば、天然に存在する細胞、もしくは疑わしい標的抗原をコードする発現可能な核酸で改変された細胞であることができる。核酸での細胞の改変方法および細胞中でのポリペプチドの発現の同定方法は当該技術分野で公知である。
【０１１２】
上の方法を使用して同定された抗原は、治療薬の開発のための標的として使用することができる。例えば、小分子化合物およびペプチドのライブラリーをスクリーニングして、ある抗原に特異的に結合する分子を同定することができるか、もしくは、特定の治療的抗体を抗原に対して生じさせることができる。本方法を使用して同定された抗原はまた、診断法の開発にも使用することができる。
【０１１３】
本発明の方法を使用して生成される病理学的に異常な細胞に対し選択的なＣＴＬは、該病理学的に異常な細胞を伴うヒトの病状もしくは疾患の治療に応用可能である。上述されたもののようなインビトロもしくはインシトゥ機能性アッセイで選択的細胞溶解活性を有することが決定されるＣＴＬは、一個体中で選択的細胞溶解活性を有することがありそうである。ＣＴＬは不均質な集団中で標的細胞もしくは抗原を認識することができるからである。従って、本発明の方法を使用して生成される、病理学的に異常な細胞もしくは標的抗原に対し選択的な記憶ＣＴＬを包含するＣＴＬでの個体の治療方法が本発明で提供される。
【０１１４】
本発明は、病理学的に異常な細胞により媒介される疾患を有する患者の治療方法を提供する。該方法は、有効量の、前記病理学的に異常な細胞に対する選択的細胞溶解活性を有するＣＤ８^＋　ＣＴＬを投与することよりなり、前記病理学的に異常な細胞に対する選択的細胞溶解活性を有する前記ＣＤ８^＋　ＣＴＬは、本発明の方法を使用して産生される。
【０１１５】
本発明はさらに、病理学的に異常な非Ｂ細胞白血病細胞により媒介される疾患を有する患者の治療方法を提供する。該方法は、有効量の、前記病理学的に異常な非Ｂ細胞白血病細胞に対する選択的細胞溶解活性を有するＣＤ８^＋　ＣＴＬを投与することよりなり、前記病理学的に異常な非Ｂ細胞白血病細胞に対する選択的細胞溶解活性を有する前記ＣＤ８^＋　ＣＴＬは本発明の方法により産生される。
【０１１６】
本発明はさらに、病理学的に異常な細胞により媒介される疾患を有する患者の治療方法を提供する。該方法は、有効量の、前記病理学的に異常な細胞に関連する１種もしくはそれ以上の標的抗原に対する選択的免疫反応性を有するＣＤ８^＋　ＣＴＬを投与することよりなり、選択的免疫反応性を有する前記ＣＤ８^＋　ＣＴＬは本発明の方法により産生される。
【０１１７】
既に記述されたとおり、多くの型の病理学的に異常な細胞が存在し、その全部は正常細胞と区別される。病理学的に異常な細胞に対し選択的なＣＴＬは正常細胞の集団内のその細胞を選択的に認識かつ破壊することができるため、病理学的に異常な細胞はＣＴＬで治療することができる。従って、病理学的に異常な細胞を選択的に標的とするＣＴＬの使用は、こうした細胞の破壊が疾患の重症度を低下させるかもしくは疾患の進行の速度を遅らせることができる個体の治療に応用可能である。
【０１１８】
当業者は、病理学的に異常な細胞に対し選択的なＣＴＬでの治療が特定の病理学的状態に有益であるかどうかを決定する方法を知っているであろうし、また、病理学的状態を有する個体中での病理学的に異常な細胞の存在を決定する方法を知っているであろう。当業者は、疾患の病理学的に異常な細胞を、個体中で不必要な影響を引き起こすことなく排除することができるかどうかを決定することが可能であろう。例えば、身体中で有益な機能を供給しない腫瘍細胞を除去することが有利である。しかしながら、疾患に罹っているがしかしにもかかわらず器官の不可欠の細胞のような身体中である機能を提供する細胞を排除することは、一般に望ましくない。しかしながら、例えば、限定されるものでないが前立腺、卵巣、乳房、甲状腺、胸腺、生体および非生体臓器の選択された細胞型、もしくはＩｇＥを合成するＢ細胞を挙げることができる、個体の生存に影響を及ぼすことなく除去することができるある種の非生体臓器および生体もしくは非生体臓器からの細胞が存在する。この場合、疾患に罹っている細胞および正常な細胞もしくは組織もしくは器官により共有される自己抗原を認識するＣＴＬを使用することができる。
【０１１９】
病理学的状態を治療するのに有効なＣＴＬの量は、標的細胞集団の減少に影響を及ぼすもしくは標的細胞集団の増大の速度を遅らせるのに必要とされる量である。治療上有効な用量は、例えば、治療されるべき病理学的に異常な細胞を特徴とする病理学的状態、投与の経路および形態、個体の体重および病状、ならびに以前のもしくは同時の治療に依存することができる。例えば、個体の身体中の一領域に局在化される病理学的に異常な細胞は、その特定の部位でのＣＴＬの注入により効果的に治療されるかもしれない。
【０１２０】
注入される用量は、細胞の比較的大きな集団が比較的大用量のＣＴＬを必要とする可能性があるような、病理学的に異常な細胞の集団の大きさに依存して変動する可能性がある。個体の体重は例えば静脈内注入のような全身的経路により送達されるＣＴＬの投薬量を遂げることができる。例えば、病理学的に異常な細胞が血液中を循環している造血癌を伴う個体を治療するために、有効用量は、少なくとも部分的に、投与されるＣＴＬの濃度が小児のような低体重の個体および成体のようなより高体重の個体についてほぼ同一であるように、個体の体重により決定されるとみられる。
【０１２１】
該方法の特定の一応用についての適切な有効用量は、本明細書に提供される手引きを使用して当業者により決定することができる。例えば、該量は既に記述されたところのインビトロもしくはインビボアッセイから外挿することができる。当業者は、患者の病状を治療の経過の間中モニターすることができること、および投与されるＣＴＬ製剤の量を相応して調節することができることを認識するであろう。
【０１２２】
投与するための病理学的に異常な細胞に対し選択的なＣＴＬの有効量は、特定の疾患もしくは病状を治療するために使用されるある用量のＣＴＬの有効性を決定するための試験の実施方法を知っているであろう当業者により決定されることができる。当業者はまた、病理学的に異常な細胞に対し選択的なＣＴＬは、単一用量として最も効果的に投与することができるか、もしくは複数用量として最も効果的に投与することができるかどうかも決定することができる。
【０１２３】
ＣＴＬの製剤は静脈内注入（ｉｎｆｕｓｉｏｎ）によるように全身的に送達させることができるか、もしくは注入（ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）によるような病理学的状態の一部位で局所的に投与することができる。ＣＴＬ製剤の投与のための適切な部位は既知であるか、もしくは治療されている個体の臨床的適応症に依存して、当業者により決定されることができる。
【０１２４】
病理学的に異常な細胞に対し選択的なＣＴＬは、製薬学的に許容できる媒体と一緒に懸濁剤として投与することができる。こうした製薬学的に許容できる媒体は、例えば緩衝生理的食塩水溶液であることができる。製薬学的に許容できる媒体は、滅菌であるかもしくは汚染する粒子および生物体を実質的に含まないことができる。当業者は、多様な投与様式で使用されるべきＣＴＬのための製薬学的に許容できる媒体を知っているかもしくは決定することが可能であろう。
【０１２５】
病理学的状態は、病理学的に異常な細胞に対し選択的であるＣＴＬ、記憶ＣＴＬもしくはＣＴＬおよび記憶ＣＴＬの組合せ剤で治療することができる。ＣＴＬおよび記憶ＣＴＬは同時にもしくは別個の機会に投与することができる。記憶ＣＴＬの投与は、病理学的に異常な細胞に対する長期の免疫という利点を提供する可能性があり、そして従って疾患の再発を予防することができる。当業者は、特定の疾患もしくは病状の効果的な治療のためにどの型のＣＴＬを使用するかを知っているであろうか、もしくは決定することができる。
【０１２６】
異常な細胞の成長を特徴とする病理学的状態の治療方法は、付加的には、他の治療とともに実施することができる。例えば、癌を治療するために、本発明の方法は、外科手術、サイトカインおよび増殖因子の投与を包含する化学療法、放射もしくは当該技術分野で既知の他の方法のような慣習的な癌治療の前、間もしくは後に実施することができる。同様に、感染性疾患を包含する病理学的状態を治療するために、本発明の方法を、感染性病原体に対する抗生物質投与もしくは当該技術分野で既知の他の方法のような慣習的治療の前、間もしくは後に実施することができる。自己免疫障害の病理学的状態の治療もまた、本発明の選択的ＣＴＬ細胞排除方法を特定の自己免疫疾患のための慣習的治療と組合せることによっても達成することができる。慣習的な治療は、例えば、化学療法、ステロイド療法、インスリンならびに他の増殖因子およびサイトカイン療法、受動免疫、Ｔ細胞受容体結合の阻害剤およびＴ細胞受容体ワクチン接種を包含する。病理学的に異常な細胞に対し選択的なＣＴＬを受領する個体を免疫刺激剤で治療することが有利であるかもしれない。当業者は、特定の免疫刺激剤、ならびに免疫刺激剤の投与の適切な時間および様式を決定することが可能であろう。
【０１２７】
本発明の方法は、これらもしくは当該技術分野で既知の他の方法とともに、また、慣習的治療の開始の前、間もしくは後の多様な時点で投与することができる。異常な細胞の成長を特徴とする病理学的状態のための治療の記述については、例えば、Ｔｈｅ　Ｍｅｒｃｋ　Ｍａｎｕａｌ、第１６版（編者Ｂｅｒｋｏｗ，Ｒ．）ニュージャージー州ラーウェイ、１９９２を参照されたい。
【０１２８】
同様に、当該技術分野で公知の他の細胞治療の方法を、本発明の方法により生成される選択的ＣＴＬとともに付加的に使用することができる。こうした他の方法は、例えば、組織およびその細胞成分の再生もしくは再形成のための細胞置換療法、ならびに治療的タンパク質もしくは巨大分子の産生のための遺伝子的に改変された細胞を使用する細胞療法を包含する。細胞置換療法の特定の例は、例えば癌患者の除去された骨髄細胞を再形成するために使用することができる造血幹および前駆細胞療法、ならびにパーキンソン病の治療のための神経幹および前駆細胞療法を包含する。治療的タンパク質の産生のための細胞療法は、例えば、例えばインスリン、他のサイトカイン、増殖因子および酵素を産生するように遺伝子的に改変された多様な細胞型およびそれらの前駆細胞の移植を包含する。こうした遺伝子的細胞療法は例えば糖尿病、癌の治療に応用可能である。細胞置換および遺伝子的細胞療法の多様な他の例は当該技術分野で公知であり、そして本発明の方法により産生される選択的ＣＴＬとともにの使用に同様に応用可能である。
【０１２９】
複数投与を包含する慣習的療法と同時のもしくは交互投与で送達される、病理学的に異常な細胞に対し選択的なＣＴＬの投与。同時投与は、例えば、同一の製剤中で一緒に、もしくはほぼ同一の時刻もしくはすぐ続いて送達される異なる製剤中であることができる。交互投与は例えば時間的に別個の投与でＣＴＬ製剤および慣習的な治療的治療を送達することであることができる。既に記述されたとおり、選択的ＣＴＬおよび慣習的療法の時間的に別個の投与は、異なる送達様式および経路を同様に使用することができる。
【０１３０】
本発明の別の応用は成熟樹状細胞の調製である。本発明の方法により産生される成熟樹状細胞は、その後、ＣＴＬの養子的導入と組合せの投与を包含するワクチン接種に使用することができる。本発明の方法の本応用は、本明細書に記述されるところの未熟樹状細胞を調製すること、それらに抗原（アポトーシス細胞、小胞、細胞ライセート、細胞画分もしくは成分、タンパク質もしくはペプチドのような）およびＴヘルパーエピトープを適用すること、ならびにこれらの樹状細胞を、該樹状細胞のクラスＩＩ　ＭＨＣと会合されるヘルパーエピトープに特異的なヘルパーＴ細胞とともにインキュベートすることを含んで成る。
【０１３１】
本発明の多様な態様の活動に実質的に影響を及ぼさない改変もまた、本明細書に提供される本発明の定義内に包含されることが理解される。従って、以下の実施例は本発明を具体的に説明するがしかし制限しないことを意図している。
【０１３２】
実施例１
樹状細胞によるＣＤ８^＋　細胞傷害性の活性の活性化のための条件
本実施例は、ＣＤ４０ＬもしくはＩＬ−１２のいずれかでの樹状細胞（ＤＣ）の刺激がインビトロでＣＤ８^＋　ＴＬにおけるＣＴＬ活性を誘導すること、およびＩＬ−７がこの応答を増加することを示す。
【０１３３】
ヒトＣＴＬのインビトロ誘導のための至適条件を決定するため、ＨＬＡ−Ａ２　ＤＣを使用して、精製されたＣＤ８^＋　Ｔリンパ球（ＣＤ８^＋　ＴＬ）を活性化した。クラスＩ　ＭＨＣ抗原に対し特異的なＣＤ８^＋　ＴＬの高い前駆細胞頻度が１回のみのインビトロ刺激後にＣＴＬ応答の検出を見込むため、クラスＩ　ＭＨＣ抗原に対する応答を検討した。ＨＬＡ−Ａ２　ＤＣおよびＣＤ８^＋　ＴＬの調製を下述する。
【０１３４】
ＣＤ８^＋　ＴＬはＨＬＡ−Ａ２陰性の健康な血液ドナーのＰＢＭＣから単離した。ＣＤ８^＋　陽性細胞はダイナビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）およびデタッチャビーズ（Ｄｅｔａｃｈａｂｅａｄ）（ダイナル（Ｄｙｎａｌ）、ニューヨーク州レイクサクセス）での陽性選択後に回収し、そして使用前に凍結されて保存した。融解した後に、細胞をダイナビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）でＣＤ４^＋、ＣＤ１４^＋、ＣＤ１９^＋　およびＣＤ５６^＋　をさらに枯渇させた。蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）分析は、この細胞集団が＞９９％　ＣＤ８^＋　であったことを示した。ＤＣは、本質的にＦ．ＳａｌｌｕｓｔｏとＡ．Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９２）１７６：１６９３−１７０２により記述されたとおりに末梢血単球から生成させた。健康な血液ドナーからのＨＬＡ−Ａ２陽性のＰＢＭＣをフィコール−ハイパーク（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ）密度勾配遠心分離により単離し、そして４×１０^６個／ｍｌの濃度でＲＰＭＩ−ＦＣＳ培地に懸濁した。この懸濁物の１５ｍｌのアリコートを１５０ｍｍ組織培養皿でプレート培養した。３７℃で９０分後に非付着細胞を廃棄し、そしてプレートをＰＢＳで５回洗浄し、そしてその後、２％ＦＣＳおよび２％ＥＤＴＡを含有するＰＢＳの存在下に３７℃で３０分間インキュベートした。付着細胞を、ピペット操作（ｐｉｐｅｔｔｉｎｇ）次いで掻き取ることにより分離させた。その後、細胞懸濁物を、製造元の説明書に従ってダイナビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）（ダイナル　ＡＳ（Ｄｙｎａｌ　ＡＳ）、ノルウェー・オスロ）を用いてＣＤ２−、ＣＤ１９−およびＣＤ５６^＋　−陽性細胞をさらに枯渇させた。この細胞集団（＜０．５％　ＣＤ３^＋　かつ＞９０％　ＣＤ１４^＋）を、５００Ｕ／ｍｌのヒト組換えＩＬ−４（ジェンザイム（Ｇｅｎｚｙｍｅ）、マサチューセッツ州ボストン）および８００Ｕ／ｍｌのヒト組換え顆粒球−単球コロニー刺激因子ＧＭ−ＣＳＦ（ファーミンゲン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、カリフォルニア州サンディエゴ）の存在下、ＲＰＭＩ−ＦＣＳ中で６穴プレート（細胞１．５×１０^６個／ウェル）中でプレート培養した。
【０１３５】
ＨＬＡ−Ａ−２特異的ＣＴＬの誘導は、２ｍＭ　Ｌ−グルタミン、５０μｇ／ｍｌゲンタミシン　１％非必須アミノ酸、１ｍＭピルビン酸ナトリウムおよび５％のプールされたヒト血清で補充されたＲＰＭＩ　１６４０（ＲＰＭＩ−ＨＳ）中で培養された細胞で実施した。上述されたとおり調製されたＤＣ（細胞１０^４個／ウェル）およびＣＤ８^＋　細胞（細胞１０^５個／ウェル）を、２００μｌの最終容量中、９６穴平底プレート中で培養した。細胞はＣＴＬ活性アッセイ前に３７℃で６日間インキュベートした。
【０１３６】
ＣＴＬの細胞傷害性活性は、ＪＹ（Ａ２^＋）および２２１（Ａ２⁻）^５１Ｃｒ標識標的細胞を使用する^５１ＣＲ遊離アッセイにより定量的に測定した。該アッセイは、９６穴培養プレートを２組の複製プレート（９６穴Ｕ字型底）に分割することにより実施した。各組について、一方のプレートは１５μｌを含有し、および他方のプレートは７５μｌの元の培養物を含有した。一組は^５１Ｃｒ標識２２１標的細胞（細胞１０^４個／ウェル）を受領した一方、他の組は^５１Ｃｒ標識ＪＹ標的細胞（細胞１０^４個／ウェル）を受領した。ＮＫ活性によるいずれかの抗原非特異的細胞傷害性活性を減少させるために、全部のウェルが２×１０^５個のＫ５６２細胞を受領した。３７℃で６時間後に１００μｌの上清中の^５１Ｃｒ含量を測定し、そして特異的溶解のパーセントを、式：溶解パーセント＝１００×（実験的遊離−自発的遊離）／（最大遊離−自発的遊離）に従って計算した。試験された多様な条件の効率の適正な比較のために、データを溶解単位（ＬＵ）３０／１０^６個の投入（ｉｎｐｕｔ）細胞として表す。１ＬＵは６時間のアッセイで１０^４個の標的細胞の３０％溶解を達成するのに必要とされる投入細胞の数と定義する。特異的ＣＴＬ活性は、ＪＹ細胞から得られたＬＵから、２２１細胞から得られたＬＵを差し引くことにより得る。標的細胞とのＣＴＬの曝露もしくはインキュベーションの期間は、定量的結果が望ましいかもしくは定性的結果が望ましいかどうかに依存して変動することができる。一般には、曝露の時間は約３０分と６時間との間であり、好ましくは、該期間は約２ないし５時間の間であり、そしてより好ましくは、該期間は約３ないし４時間である。ヒトナチュラルキラー（ＮＫ）感受性細胞系Ｋ５６２；クラスＩ陰性であるように突然変異誘発されかつ選択されたエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）で形質転換された細胞系３Ａ４−７２１．２２１、およびＥＢＶで形質転換されたＨＬＡ−Ａ２ホモ接合性細胞系ＪＹを、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ；シグマ（Ｓｉｇｍａ）、ミズーリ州セントルイス）、４ｍＭ　Ｌ−グルタミン、１％非必須アミノ酸、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、５×１０^−５Ｍ　２−メルカプトエタノールおよび５０μｇ／ｍｌゲンタミシン（全部ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）、ニュージャージー州グランドアイランドから）を含有するＲＰＭＩ−１６４０培地（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）、ニュージャージー州グランドアイランド）（ＲＰＭＩ−ＦＣＳ）中で成長させた。
【０１３７】
多様なＤＣ成熟シグナルがＣＤ８^＋　活性化を遂げたかどうかを決定するために、ＤＣをリポ多糖（ＬＰＳ）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）もしくはＣＤ４０Ｌで攻撃し、そして、精製されたＣＤ８^＋　細胞中でのＣＴＬ活性を誘導する処理されたＤＣの能力を、記述されたところの^５１Ｃｒ遊離により測定した。上述されたとおり調製されたＤＣをＴＮＦ−α（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＬＰＳ（２０ｎｇ／ｍｌ）もしくは添加物なし（未熟ＤＣ）のいずれかで処理した。３７℃での４０時間のインキュベーション後にＤＣを収集しかつプレート培養した。照射された（２５，０００ラド）ＣＤ４０Ｌで形質転換された細胞（Ｃｅｌｌａら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８４：７４７−７５２（１９９６））を未熟ＤＣに添加することにより、ＣＤ８^＋　細胞とともにの培養の時点でＤＣをＣＤ４０Ｌで攻撃した。
【０１３８】
代表的実験からの結果を図１に示す。未熟ＤＣ（ｉｍｍ−ＤＣ）、ＬＰＳ処理されたＤＣ（ＬＰＳ−ＤＣ）、ＴＮＦ−αで処理されたＤＣ（ＴＮＦ−ＤＣ）もしくはＣＤ４０Ｌで処理されたＤＣ（ＣＤ４０Ｌ−ＤＣ）により誘導された細胞傷害性の活性は、ＣＤ４０Ｌで処理されたＣＤのみが、精製されたＣＤ８^＋　Ｔ細胞から細胞傷害性の活性を誘導することが可能であったことを示した（図１Ａ）。ＣＴＬ活性は４種の試験されたＣＤ８^＋　細胞集団の３種で検出された。
【０１３９】
ＣＤ８^＋　Ｔ細胞のＣＴＬ活性の誘導における、ＬＰＳ、ＴＮＦ−αもしくはＣＤ４０Ｌで処理されたＤＣ間で観察される差異が、単球、未熟ＤＣおよび成熟ＤＣの抗原のプロセシングおよび提示能力の差異によったかどうかを決定するために、クラスＩ分子、ＴＡＰトランスポーター、ＰＡ２８（イムノプロテアソーム調節物質）およびイムノプロテアソームの発現レベルを、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳｃａｎ、ベントン　ディッケンソン（Ｂｅｎｔｏｎ　Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）、イタリア・ミラノ）および適切な抗体との免疫沈降法により検査した。上述されたところのＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４での処理の後、生じる未熟ＤＣは、処理されない単球に比較して４ないし５倍のクラスＩ分子、ＴＡＰトランスポーター、ＰＡ２８およびイムノプロテアソームの増大された発現を表した。クラスＩ分子の発現のレベルは、ＬＰＳ、ＣＤ４０ＬもしくはＴＮＦ−αでの処理に際して２倍さらに増大した。成熟ＤＣにおけるクラスＩ分子の発現レベルは多様な処理により遂げられず、ＣＤ８^＋　Ｔ細胞のＣＴＬ活性の誘導におけるＬＰＳ、ＴＮＦαもしくはＣＤ４０Ｌで処理されたＤＣ間で観察された差異が、抗原のプロセシングおよび提示の能力の差異の結果でないことを示した。
【０１４０】
サイトカインＩＬ−２は、ＣＴＬの発生および機能において重要な役割を有することが既知である（Ｔｒｉｎｃｈｉｅｒｉ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９５）１３：２５１−７６）。ＣＤ４０Ｌ−ＤＣによる細胞傷害性の誘導がＩＬ−１２により置換されかつ／もしくは他のリンホカインにより増大される可能性があるかどうかを決定するための研究を実施した（図１）。ＩＬ−１２（図１Ｂ）、ＩＬ−７（図１Ｃ）もしくはＩＬ−１２およびＩＬ−７（図１Ｄ）の存在下でｉｍｍ−ＤＣもしくはＣＤ４０Ｌ−ＤＣにより誘導される細胞傷害性の活性を測定した。ＩＬ−４もしくはＩＬ−６の添加は細胞傷害性の活性に対する影響を有しなかった。未熟ＤＣへのＩＬ−１２の添加は、４種の精製されたＣＤ８^＋　細胞集団のうち２種でＣＤ４０Ｌの代わりに用いることが可能であった。ＩＬ−７は未熟ＤＣに対する影響を有しなかったが、しかし、ＣＤ４０Ｌで処理されたＤＣおよびＩＬ−１２で処理された未熟ＤＣにより誘導された細胞傷害性の活性をおよそ３倍高めた。さらに、ＩＬ−７の存在下で、細胞傷害性の活性は全４種のＣＤ８^＋集団で検出された。従って、全ＣＤ８^＋ドナーに対する、および試験された全部の系における細胞傷害性の応答の最も首尾一貫した誘導をもたらした処理は、ＣＤ４０Ｌ−ＤＣおよびＩＬ−７の組合せであった。試験された系は、スーパー抗原ＴＳＳＴ、インフルエンザＡ型ウイルス由来のＡ２拘束性マトリックスペプチド、およびＡ２拘束性チロシナーゼペプチドに対するＣＴＬの応答を包含した。
【０１４１】
実施例２
ＬＢ特異的ＣＤ８^＋　ＣＴＬ系統の誘導
本実施例は、ＣＤ８^＋　ＣＴＬの活性が特異的白血病性芽細胞（ＬＢ）に応答して誘導されることを示し、そしてＣＤ８^＋　ＣＴＬ細胞系の発生を立証する。
【０１４２】
ＩＬ−７と組合せのＣＤ４０ＬおよびＩＬ−１２がＣＤ８^＋　ＴＬのＤＣに誘導されるＣＴＬ活性を効果的に促進したという観察結果は、ＬＢ特異的ＣＴＬを誘導するための手順の開発のための基礎を提供した。ＢＭＴドナーおよびレシピエントからの利用可能な血液の少ない量のため、既に記述された手順を以下のとおり改変した。簡潔には、ＤＣを、非付着細胞を除去した直後に、ＢＭＴドナーから単離された付着性ＰＢＭＣにＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦを直接添加することにより準備した。７日の培養期間後に、ＤＣは、機械的操作により活性化される休止期（ｒｅｓｔｉｎｇ）ＤＣについて記述された（Ｇａｌｌｕｃｃｉら、Ｎａｔｕｒｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（１９９９）５：１２４９−１２５５）表現型に類似の活性化抗原のパターンを表した。ＣＤ８^＋　ＴＬをＣＤ４^＋　細胞の陰性枯渇により得た。
【０１４３】
本実施例および後の実施例に記述される研究は、同種異系の骨髄移植片（ＢＭＴ）を与えられた４例の小児急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）患者および彼らのドナーを包含した。ＢＭＴレシピエントのいずれも再発を経験しなかった。経過観察は移植後２３から２８ヶ月までの範囲にわたった。３例の患者（ＭＲ、ＧＡおよびＰＭ）はＨＬＡが同一の同胞からＢＭＴを受領した一方、患者ＥＶはＨＬＡが合致された関係のないドナーからＢＭＴを受領した。ＢＭＴレシピエントを、移植後６ヶ月間、ＬＢ特異的な細胞傷害性の活性について評価し、このときに免疫抑制療法を停止した。ＩＲＣＣＳ　Ｐｏｌｉｃｌｉｎｉｃｏ　Ｓａｎ　Ｍａｔｔｅｏ小児科の施設審査委員会が該プロトコルを承認した。
【０１４４】
初期研究において、ＬＢ特異的ＣＴＬは、ＩＬ−７およびＩＬ−１２と一緒にＬＢおよびＤＣを使用してＣＤ８^＋　ＴＬ（ＣＤ４^＋　＜１％）をプライミングすることにより誘導した。２名のＢＭＴドナー（ＭＲ−ｄｏｎおよびＧＡ−ｄｏｎ）からのＣＤ８^＋　ＴＬが第二の刺激後にＬＢ特異的ＣＴＬを含有したこと、しかしこれらの培養物は拡張するそれらの低い傾向により維持するのが困難であったことが観察された（データは示されない）。
【０１４５】
ＬＢ特異的ＣＴＬ系統の拡張の欠如の問題を克服するために、ＣＤ４^＋が濃縮された照射された自己細胞を、ＣＤ８^＋　ＴＬのプライミングのインキュベーションに添加した。このアプローチを使用して、４名のＢＭＴドナー（ＭＲ−ｄｏｎ、ＧＡ−ｄｏｎ、ＥＶ−ｄｏｎおよびＰＭ−ｄｏｎ）の末梢血もしくは骨髄のいずれか由来のＣＤ８^＋　ＴＬから白血病特異的ＣＴＬ系統を生成させた。使用された培地は１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７および１０ｐｇ／ｍｌのＩＬ−１２で補充されたＲＰＭＩ−ＨＳであった。ＣＤ８^＋　細胞（細胞０．５ないし１×１０^６個／ｍｌ）を４８穴プレートに添加し、そして、１ｍｌの最終容量中で、照射された（２０，０００ラド）ＢＭＴレシピエントのＬＢ（細胞５×１０^５個／ｍｌ）、照射された（３，０００ラド）ＣＤ８^＋が自己由来のＣＤ４^＋　リンパ球（細胞３ないし５×１０^５個／ｍｌ）およびＣＤ８^＋が自己由来のＤＣ（細胞２×１０^５個／ｍｌ）と共培養した。
【０１４６】
７日後に、照射された（２０，０００ラド）ＢＭＴレシピエントのＬＢ（細胞５×１０^５個／ｍｌ）および付着性の照射された（３０００ラド）フィーダー細胞（Ｖｉｔｉｅｌｌｏら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９５：３５１−３４９（１９９５））で培養物を再刺激した。２日後、２５Ｕ／ｍｌの組換えインターロイキン−２（ｒＩＬ−２）を培養物に添加した。同一のプロトコルを各連続する回の刺激に使用した。ＬＢは、彼らの診断の時点での患者からのヘパリン添加された骨髄吸引物（＞９０％　ＬＢ）から調製した。
【０１４７】
培養物を、５：１のエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比でのレシピエントＬＢに対する各その後の再刺激の７日後の細胞溶解活性について試験した（図２）。ＢＭＴレシピエントのＰＢＭＣ（□）、ＢＭＴドナーのＢＭＣ（■）およびＢＭＴドナーのＰＢＭＣ（■）由来のＬＢ特異的ＣＴＬ系統の細胞溶解活性を測定した。７日間隔で実施された細胞培養物の刺激を、図２中のＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶおよびＶにより表す。第四の再刺激後に低温保存された（ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖｅｄ）、融解されたＬＢに向けられたＣＴＬの細胞溶解活性をＩＶａとして表す。図２（Ａ−Ｄ）はそれぞれＭＲ、ＧＡ、ＥＶ、ＰＭのドナー／レシピエント対を指す。
【０１４８】
本研究は、細胞溶解活性が一次刺激後に観察されなかったことを示した。しかしながら、第二の刺激後（初期培養の１４ないし１６日後）に、ＬＢ特異的な細胞傷害性が、試験された全培養物中で観察され、そしてさらなる再刺激の後に維持もしくは増加された。ＣＴＬ活性化の同一の力学および大きさが、造血および免疫系がドナー起源のものであった場合に、移植後６ヶ月の４例のＢＭＴレシピエント（ＭＲ、ＧＡ、ＥＶおよびＰＭ）のＰＢＭＣからＣＤ８^＋　細胞を得た場合に観察された。ＬＢ特異的ＣＴＬ系統の細胞傷害性の能力は低温保存により影響を及ぼされなかった。
【０１４９】
上述されたところのＤＣ、標的細胞、ＩＬ−１２およびＩＬ−７の存在下の培養物中でのＬＢに向けられたＣＴＬの拡張する能力を検査した。図３は、ＢＭＴレシピエントＥＶ（▲）もしくはＢＭＴドナーＥＶ（■）のＰＢＭＣ由来のＬＢに向けられたＣＴＬの細胞拡張の代表的結果を示す。データはＣＴＬの拡張速度に基づく理論的計算を表す。ＣＴＬの拡張速度は以下のとおり計算した：拡張速度＝再刺激後の細胞の総数／再刺激された細胞の数。ＣＤ８^＋　が濃縮された応答体（ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）細胞の初期数は１０^６個であった。反復された刺激の後に、ＣＴＬは細胞傷害性の漸増的増大、および培養された細胞の絶対数の変動可能なしかし継続的な拡張を立証した。これらの細胞は、培養の開始時に接種された細胞に比較して９ないし２０倍の範囲で拡張された。
【０１５０】
養子免疫療法のためのＬＢ特異的ＣＴＬ系統の潜在的使用を鑑み、該細胞系を、体宿主性移植片反応（ＧＶＨＲ）のためのインビトロ対照として移植前に患者から得られた非白血病性細胞に対して試験した。使用された自己標的細胞は骨髄レシピエント細胞（ＢＭＲＣ）および有糸分裂促進剤で刺激されたＴ細胞（Ｔ−ＰＨＡ）であった。非白血病性ＢＭＲＣは、ＢＭＴ処置の前および完全な血液学的寛解の立証後に得た。Ｔ−ＰＨＡ細胞系は、低温保存された移植前ＰＢＭＣをＰＨＡで刺激すること、および１００Ｕ／ｍｌのｒＩＬ−２（シータス（Ｃｅｔｕｓ）、カリフォルニア州エメリービル）で補充されたＲＰＭＩ−ＦＣＳ中での連続的継代により、各患者について樹立した。培養物の大多数は、非白血病性ＢＭＲ細胞もしくはＴ−ＰＨＡに対して試験された最高のエフェクター対標的比（Ｅ：Ｔ比）（４０：１まで）で反応性を示さなかったかもしくは低い反応性（＜１０％の溶解）を示したかのいずれかであった。
【０１５１】
レシピエント抗原に対するＣＴＬ系統の反応性を排除するために、患者ＥＶの移植前の非白血病性レシピエント細胞に向けられたＣＴＬ前駆細胞（ＣＴＬｐ）の頻度を、既に記述された（Ｍｏｎｔａｇｎａら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９６）１６：１０７−１１４）ところの限界希釈アッセイ（ＬＤＡ）により評価した。該患者のドナーはＨＬＡが合致された関係のないドナーであった。４つのドナー−レシピエント対のうち、他の３対はＨＬＡが同一の同胞であったため、この対はＧＶＨＤの最高の危険にさらされた。ＣＴＬｐの頻度の分析を：（Ｉ）いかなるインビトロ活性化の前のドナーのＰＢＭＣ、（ｉｉ）ＬＢ細胞での第四の刺激後に回収された、ドナーから得られたＣＤ８^＋　エフェクター細胞、および（ｉｉｉ）ＬＢ細胞での第四の刺激後に回収された、ＢＭＴ６ヶ月後のレシピエントから得られたＣＤ８^＋　エフェクター細胞について実施した。表ＩＩの結果は、４回のインビトロのＬＢ刺激後に、レシピエントの移植前の非白血病性細胞に対するＣＴＬｐの頻度が、ＬＢ細胞での刺激前のドナーＰＢＭＣから得られた頻度に比較して増大しなかったことを立証する。
【０１５２】
【表２】

【０１５３】
実施例３
ＬＢ特異的ＣＴＬ系統の特徴づけ
本実施例はＬＢ特異的ＣＴＬ系統の表現型分析を示す。
【０１５４】
ＬＢ特異的ＣＴＬ細胞系の表現型分析を、各細胞傷害性アッセイの時点で実施した。初代培養物および第四の刺激後から得られた代表的な結果を表ＩＩＩに報告する。初代培養物中では、ＬＢに向けられた細胞傷害性の活性が検出不可能であった場合に、ＣＤ３^＋　および／もしくはＣＤ８^＋　リンパ球は３２％から７９％までの範囲にわたった一方、かなりの比率のＣＤ５６^＋　リンパ球（２０％から６６％までの範囲にわたる）が存在した。第四の刺激後に、エフェクター細胞の大多数はＣＤ３^＋　およびＣＤ８^＋　リンパ球であった一方、ＣＤ５６^＋　細胞の比率は２０％未満に減少した。興味深いことに、ＣＤ４^＋　細胞もまた、刺激前の１％未満から第４回の刺激により約１０％まで増大した。
【０１５５】
【表３】

【０１５６】
実施例４
ＬＢ特異的ＣＴＬ系統はＣＤ８^＋　クラスＩ拘束性である。
【０１５７】
本実施例は、ＣＴＬの細胞溶解活性がＣＤ８^＋　細胞およびＨＬＡクラスＩ抗原に拘束性（ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ）であったことを示す。どのＴ細胞集団が白血病細胞の溶解を媒介していたかを決定するために、細胞傷害性アッセイを封鎖抗体の存在下で実施した。標的細胞を、抗ＨＬＡクラスＩもしくはクラスＩＩモノクローナル抗体（ｍＡｂ）（２５μｇ／ｍｌ）とともにインキュベートし、また、エフェクター細胞はＣＤ４^＋　およびＣＤ８^＋に対し特異的なｍＡｂとともに４℃で３０分間インキュベートした。同一濃度の各ｍＡｂを、細胞傷害性アッセイの開始から約４時間後に培養物に添加した。
【０１５８】
３回のインビトロ刺激の後に、ＢＭＴレシピエントのＰＢＭＣ（ＰＢＭＣ　ｒｅｃ）およびＢＭＴドナーの骨髄細胞（ＢＭ　ｄｏｎ）もしくはＰＢＭＣ（ＰＢＭＣ　ｄｏｎ）から得られたＣＴＬ系統を、培地のみ（□）、抗ＨＬＡクラスＩ（■））、抗ＨＬＡクラスＩＩ（■）、抗ＣＤ８^＋（■）および抗ＣＤ４^＋（■）ｍＡｂの存在下にＬＢ標的細胞に対して１０：１のＥ／Ｔ比でＣＴＬ活性について試験した（図４）。ＥＶ（図４Ａ）およびＰＭ（図４Ｂ）のドナー／レシピエント対由来のＬＢ特異的ＣＴＬ系統の代表的実験を報告する。
【０１５９】
全部の場合で、ＬＢ反応性の溶解は、抗ＨＬＡクラスＩおよび抗ＣＤ８^＋　ｍＡｂにより阻害されたが、しかし抗ＨＬＡクラスＩＩおよび抗ＣＤ４^＋　ｍＡｂによりされず、ＣＤ８^＋　細胞が細胞溶解の原因であったことを示した。反復された刺激の後、ＬＢ特異的ＣＴＬ系統に含有されたＣＤ４^＋　細胞は５％と１２％との間の範囲にわたった。従って、ＣＤ４^＋　細胞の枯渇実験を、細胞溶解活性の媒介におけるこの亜集団の関与を排除するために、細胞傷害性アッセイの前に実施した。これらの結果は、ＬＢに向けられた細胞傷害性の活性がＣＤ４^＋　エフェクター細胞の枯渇により影響を及ぼされなかったことを立証した。
【０１６０】
実施例５
ＣＴＬに媒介されるＬＢの溶解はパーフォリン依存性である
本実施例は、ＬＢに向けられた細胞傷害性がコンカナマイシンＡおよび塩化ストロンチウムにより阻害されることを示す。
【０１６１】
ＣＴＬの細胞溶解活性は、それが結合する標的細胞の直近への分泌顆粒の内容物の分泌を指す。該顆粒はパーフォリン、多様なリソゾーム酵素および標的細胞を破壊するカルシウム結合タンパク質を含有する。ＬＢに向けられた細胞傷害性の活性における標的の溶解の原因である機構を同定するために、顆粒のエキソサイトーシス経路の役割を、液胞型Ｈ^＋−ＡＴＰアーゼの阻害剤コンカナマイシンＡ（ＣＭＡ）もしくは顆粒化およびエフェクター細胞から顆粒内容物の放出を引き起こす塩化ストロンチウム（ＳｒＣｌ_２）のいずれかを使用することにより分析した。
【０１６２】
エフェクター細胞を、１、１０および１００ｎＭ／Ｌの濃度のコンカナマイシンＡ（ＣＭＡ）（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、イタリア・ミラノ）で２時間、もしくは５、２５および５０ｍＭ／Ｌの濃度のＳｒＣｌ_２（シグマ（Ｓｉｇｍａ））で１８時間処理し、２回洗浄し、そしてその後、２０：１、１０：１および５：１のＥ：Ｔ比で８時間、^５１Ｃｒ標識レシピエントＬＢとともにインキュベートした。３回の刺激後の、レシピエントＰＭのＰＢＭＣ（■）、ドナーＰＭのＢＭＣ（▲）およびドナーＰＭのＰＢＭＣ（●）由来のＬＢに向けられたＣＴＬから表示される細胞傷害性の活性に対する、ＣＭＡ（図５Ａ）およびＳｒＣｌ_２（図５Ｂ）の影響を立証する、５：１のＥ：Ｔ比で実施された研究の結果を図５に示す。
【０１６３】
従って、ＬＢに向けられた細胞傷害性はＣＭＡもしくはＳｒＣｌ_２のいずれかでの処理により阻害された（平均の阻害＝８７％、図５）。これらの試薬は、パーフォリンに基づく標的の溶解を選択的に封鎖するため、標的細胞の溶解はパーフォリン依存性であると結論された。
【０１６４】
本出願を通じて、多様な刊行物をカッコ内で引用している。これらの刊行物の開示はそっくりそのまま、本発明が関する従来技術をより十分に記述するために、これにより本出願中で引用することにより組み込まれる。
【０１６５】
本発明は開示された態様に関して記述したとは言え、当業者は、詳述された特定の実験は本発明を単に具体的に説明することを容易に認識するであろう。多様な改変を、本発明の技術思想から離れることなく行うことができることが理解されるべきである。従って、本発明は下の請求の範囲によってのみ制限される。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ】
発明にかかる、ＩＬ−１２、ＩＬ−７、もしくはＩＬ−１２およびＩＬ−７の存在下の、未熟樹状細胞およびＬＰＳ、ＴＮＦもしくはＣＤ４０Ｌで処理された樹状細胞により誘導されるＣＤ８細胞の細胞傷害性の活性、ならびに未熟もしくはＣＤ４０Ｌで処理された樹状細胞により誘導されるＣＤ８細胞の細胞傷害性の活性を示す。
【図２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、２Ｄ】
発明にかかる、骨髄移植片レシピエントのＰＢＭＣ、骨髄移植片ドナーの骨髄細胞および骨髄移植片ドナーのＰＢＭＣ由来のＬＢ特異的ＣＴＬ系統の細胞溶解活性を示す。４例のドナー／レシピエント対を図Ａ−Ｄに表す。
【図３】
発明にかかる、ＣＴＬ数がＬＢでの各インビトロ刺激後に増大することを示す。
【図４Ａ、４Ｂ】
発明にかかる、ＬＢ特異的ＣＴＬ系統がクラスＩ拘束性ＣＤ８^＋であることを示す。
【図５Ａ、５Ｂ】
発明にかかる、ＣＴＬに媒介されるＬＢ溶解がパーフォリン依存性であることを示す。

Claims (66)

1. アポトーシス性の病理学的に異常な細胞を、少なくとも樹状細胞（ＤＣ）、ＣＤ４^＋　Ｔ細胞およびＣＤ８^＋　Ｔリンパ球を有する混合物と接触させること、ならびに、前記病理学的に異常な細胞に対する抗原特異性を有するＣＤ８^＋　Ｔリンパ球（ＴＬ）を生成させるのに十分な時間の間、前記アポトーシス性の病理学的に異常な細胞を前記混合物とともに培養することを含んで成る、病理学的に異常な細胞に対し選択的なＣＤ８^＋　Ｔ細胞のエクスビボでの誘導方法。
2. 前記病理学的に異常な細胞が、腫瘍細胞、病理学的病原体に感染した細胞、小胞、非重要臓器からの細胞、Ｂ細胞、細胞ライセート、細胞画分、細胞成分および疾患もしくは病状を媒介する物質を産生する細胞よりなる群から選択される細胞をさらに含んで成る、請求項１記載の方法。
3. 前記混合物、もしくはアポトーシス性の病理学的に異常な細胞の前記培養物および前記混合物への、ＩＬ−７の添加をさらに含んで成る、請求項１記載の方法。
4. 前記ＣＤ８^＋　ＴＬがナイーブＣＤ８^＋　ＴＬをさらに含んで成る、請求項１記載の方法。
5. 前記ＤＣが実質的に単離されたＤＣをさらに含んで成る、請求項１記載の方法。
6. 前記ＣＤ４^＋　Ｔ細胞が実質的に単離されたＣＤ４^＋　Ｔ細胞をさらに含んで成る、請求項１記載の方法。
7. 前記ＣＤ８^＋　ＴＬが実質的に単離されたＣＤ８^＋　ＴＬをさらに含んで成る、請求項１記載の方法。
8. 前記病理学的に異常な細胞に対する抗原特異性および細胞溶解活性を有する前記ＣＤ８^＋　ＴＬを単離することをさらに含んで成る、請求項１記載の方法。
9. ２もしくはそれ以上の世代の間、前記病理学的に異常な細胞に対する抗原特異性を有する前記ＣＤ８^＋　ＴＬを培養すること、ならびにＣＤ８^＋　記憶ＴＬを単離すること（前記ＣＤ８^＋　記憶ＴＬは前記病理学的に異常な細胞に対する抗原特異性および細胞溶解活性を有するＣＤ８^＋　ＴＬを産生する能力を有することを特徴とする）をさらに含んで成る、請求項１記載の方法。
10. 病理学的に異常な非Ｂ細胞白血病細胞を、少なくとも樹状細胞（ＤＣ）、ＣＤ４^＋　ＴＬおよびＣＤ８^＋　Ｔリンパ球を有する混合物と接触させること、ならびに、前記病理学的に異常な非Ｂ細胞白血病細胞を、前記病理学的に異常な非Ｂ細胞白血病細胞に対する抗原特異性を有するＣＤ８^＋　ＴＬを生成させるのに十分な時間の間、前記混合物とともに培養することを含んで成る、病理学的に異常な細胞に対し選択的なＣＤ８^＋　Ｔリンパ球（ＴＬ）のエクスビボでの誘導方法。
11. 前記病理学的に異常な非Ｂ細胞白血病細胞が、細胞ライセート、細胞画分、細胞成分もしくは小胞をさらに含んで成る、請求項１０記載の方法。
12. 前記混合物、もしくは病理学的に異常な非Ｂ細胞白血病細胞の前記培養物および前記混合物への、ＩＬ−７の添加をさらに含んで成る、請求項１０記載の方法。
13. 前記ＣＤ８^＋　ＴＬがナイーブＣＤ８^＋　ＴＬをさらに含んで成る、請求項１０記載の方法。
14. 前記ＤＣが実質的に単離されたＤＣをさらに含んで成る、請求項１０記載の方法。
15. 前記ＣＤ４^＋　Ｔ細胞が実質的に単離されたＣＤ４^＋　Ｔ細胞をさらに含んで成る、請求項１０記載の方法。
16. 前記ＣＤ８^＋　ＴＬが実質的に単離されたＣＤ８^＋　ＴＬをさらに含んで成る、請求項１０記載の方法。
17. 前記病理学的に異常な非Ｂ細胞白血病細胞に対する抗原特異性および細胞溶解活性を有する前記ＣＤ８^＋　ＴＬを単離することをさらに含んで成る、請求項１０記載の方法。
18. ２もしくはそれ以上の世代の間、前記病理学的に異常な細胞に対する抗原特異性を有する前記ＣＤ８^＋　ＴＬを培養すること、およびＣＤ８^＋　記憶ＴＬを単離すること（前記ＣＤ８^＋　記憶ＴＬは前記病理学的に異常な非Ｂ細胞白血病細胞に対する抗原特異性を有するＣＤ８^＋　ＴＬを産生する能力を有することを特徴とする）をさらに含んで成る、請求項１０記載の方法。
19. ａ）前記病理学的に異常な細胞を、病理学的に異常な細胞の抗原を提示する樹状細胞（ＤＣ）を産生させるのに十分な時間の間、少なくともＤＣおよび単離されたＣＤ４^＋　Ｔ細胞を有する第一の混合物と接触させること；
    ｂ）ＣＤ８^＋　ＴＬを添加して第二の混合物を生じさせること；ならびに
    ｃ）前記第二の混合物を、前記病理学的に異常な細胞に対する抗原特異性を有するＣＤ８^＋　ＴＬを生成させるのに十分な時間の間培養すること
    を含んで成る、病理学的に異常な細胞に対し選択的なＣＤ８^＋　Ｔリンパ球（ＴＬ）のエクスビボでの誘導方法。
20. 前記病理学的に異常な細胞が、腫瘍細胞、小胞、細胞ライセート、細胞画分、細胞成分、生体もしくは非生体臓器からの細胞、Ｂ細胞、疾患もしくは病状を媒介する物質を産生する細胞、または病理学的病原体に感染した細胞をさらに含んで成る、請求項１９記載の方法。
21. 段階（ａ）、段階（ｂ）もしくは段階（ｃ）へのＩＬ−７の添加をさらに含んで成る、請求項１９記載の方法。
22. 前記ＣＤ８^＋　ＴＬがナイーブＣＤ８^＋　ＴＬをさらに含んで成る、請求項１９記載の方法。
23. 前記ＤＣが実質的に単離されたＤＣをさらに含んで成る、請求項１９記載の方法。
24. 前記ＣＤ８^＋　ＴＬが実質的に単離されたＣＤ８^＋　ＴＬをさらに含んで成る、請求項１９記載の方法。
25. 前記病理学的に異常な細胞に対する抗原特異性および細胞溶解活性を有する前記ＣＤ８^＋　ＴＬを単離することをさらに含んで成る、請求項１９記載の方法。
26. ２もしくはそれ以上の世代の間、前記病理学的に異常な細胞に対する抗原特異性を有する前記ＣＤ８^＋　ＴＬを培養すること、およびＣＤ８^＋　記憶ＴＬを単離すること（前記ＣＤ８^＋　記憶ＴＬは前記病理学的に異常な細胞に対する抗原特異性を有するＣＤ８^＋　ＴＬを産生する能力を有することを特徴とする）をさらに含んで成る、請求項１９記載の方法。
27. アポトーシス性の病理学的に異常な細胞を、少なくとも樹状細胞（ＤＣ）、ＣＤ４０ＬもしくはＩＬ−１２およびＣＤ８^＋　ＴＬを有する混合物と接触させること、ならびに、前記病理学的に異常な細胞に対する抗原特異性を有するＣＤ８^＋　ＴＬを生成させるのに十分な時間の間、前記アポトーシス性の病理学的に異常な細胞を前記混合物とともに培養することを含んで成る、病理学的に異常な細胞に対し選択的なＣＤ８^＋　Ｔリンパ球（ＴＬ）のエクスビボでの誘導方法。
28. 前記病理学的に異常な細胞が、腫瘍細胞、小胞、細胞ライセート、細胞画分、細胞成分、生体もしくは非生体臓器からの細胞、Ｂ細胞、疾患もしくは病状を媒介する物質を産生する細胞、または病理学的病原体に感染した細胞をさらに含んで成る、請求項２７記載の方法。
29. 前記混合物、もしくはアポトーシス性の病理学的に異常な細胞の前記培養物および前記混合物への、ＩＬ−７の添加をさらに含んで成る、請求項２７記載の方法。
30. 前記ＣＤ８^＋　ＴＬがナイーブＣＤ８^＋　ＴＬをさらに含んで成る、請求項２７記載の方法。
31. 実質的に精製されたＣＤ４０ＬもしくはＣＤ４０の活性化を誘導する分子もしくはＩＬ−１２をさらに含んで成る、請求項２７記載の方法。
32. 前記病理学的に異常な細胞に対する抗原特異性および細胞溶解活性を有する前記ＣＤ８^＋　ＴＬを単離することをさらに含んで成る、請求項２７記載の方法。
33. 病理学的に異常な非Ｂ細胞白血病細胞を、少なくとも樹状細胞（ＤＣ）、ＣＤ４０ＬもしくはＩＬ−１２およびＣＤ８^＋　ＴＬを有する混合物と接触させること、ならびに、前記病理学的に異常な非Ｂ細胞白血病細胞に対する抗原特異性を有するＣＤ８^＋　ＴＬを生成させるのに十分な時間の間、前記病理学的に異常な非Ｂ細胞白血病細胞を前記混合物とともに培養することを含んで成る、病理学的に異常な細胞に対し選択的なＣＤ８^＋　Ｔリンパ球（ＴＬ）のエクスビボでの誘導方法。
34. 前記病理学的に異常な非Ｂ細胞白血病細胞が、細胞ライセート、細胞画分、細胞成分、小胞もしくは病理学的病原体に感染した細胞をさらに含んで成る、請求項３３記載の方法。
35. 前記混合物、もしくは病理学的に異常な非Ｂ細胞白血病細胞の前記培養物および前記混合物への、ＩＬ−７の添加をさらに含んで成る、請求項３３記載の方法。
36. 前記ＣＤ８^＋　ＴＬがナイーブＣＤ８^＋　ＴＬをさらに含んで成る、請求項３３記載の方法。
37. 実質的に精製されたＣＤ４０ＬもしくはＣＤ４０の活性化を誘導する分子もしくはＩＬ−１２をさらに含んで成る、請求項３３記載の方法。
38. 前記病理学的に異常な非Ｂ細胞白血病細胞に対する抗原特異性および細胞溶解活性を有する前記ＣＤ８^＋　ＴＬを単離することをさらに含んで成る、請求項３３記載の方法。
39. ａ）前記病理学的に異常な細胞を、病理学的に異常な細胞の抗原を提示するＤＣを産生させるのに十分な時間の間、少なくとも樹状細胞（ＤＣ）およびＩＬ−１２を有する第一の混合物と接触させること；
    ｂ）ＣＤ８^＋　Ｔ：を添加して第二の混合物を生じさせること；ならびに
    ｃ）前記病理学的に異常な細胞に対する抗原特異性を有するＣＤ８^＋　ＴＬを生成させるのに十分な時間の間、前記第二の混合物を培養すること
    を含んで成る、病理学的に異常な細胞に対し選択的なＣＤ８^＋　Ｔリンパ球（ＴＬ）のエクスビボでの誘導方法。
40. 前記病理学的に異常な細胞が、腫瘍細胞、小胞、細胞ライセート、細胞画分、細胞成分、生体もしくは非生体臓器からの細胞、疾患もしくは病状を媒介する物質を産生する細胞、または病理学的病原体に感染した細胞をさらに含んで成る、請求項３９記載の方法。
41. 段階（ａ）、段階（ｂ）もしくは段階（ｃ）へのＩＬ−７の添加をさらに含んで成る、請求項３９記載の方法。
42. 前記ＣＤ８^＋　ＴＬがナイーブＣＤ８^＋　ＴＬをさらに含んで成る、請求項３９記載の方法。
43. 実質的に精製されたＩＬ−１２をさらに含んで成る、請求項３９記載の方法。
44. 前記病理学的に異常な細胞に対する抗原特異性および細胞溶解活性を有する前記ＣＤ８^＋　ＴＬを単離することをさらに含んで成る、請求項３９記載の方法。
45. 前記１種もしくはそれ以上の標的抗原を、少なくとも樹状細胞（ＤＣ）、ＣＤ４^＋　Ｔ細胞、ＣＤ８^＋　ＴＬおよびＩＬ−７を有する混合物と接触させること、ならびに、前記１種もしくはそれ以上の標的抗原に対する選択的免疫反応性を有するＣＤ８^＋　ＴＬを生成させるのに十分な時間の間、前記１種もしくはそれ以上の標的抗原を前記混合物とともに培養することを含んで成る、１種もしくはそれ以上の標的抗原に対し選択的なＣＤ８^＋　Ｔリンパ球（ＴＬ）のエクスビボでの誘導方法。
46. 前記ＣＤ８^＋　ＴＬがナイーブＣＤ８^＋　ＴＬをさらに含んで成る、請求項４５記載の方法。
47. ＤＣ、ＣＤ４^＋　Ｔ細胞およびＣＤ８^＋　ＴＬよりなる群から選択される実質的に単離された細胞をさらに含んで成る、請求項４５記載の方法。
48. 前記１種もしくはそれ以上の標的抗原に対する選択的免疫反応性を有する前記ＣＤ８^＋　ＴＬを単離することをさらに含んで成る、請求項４５記載の方法。
49. ２もしくはそれ以上の世代の間、選択的免疫反応性を有する前記ＣＤ８^＋　ＴＬを培養すること、およびＣＤ８^＋　記憶ＴＬを単離すること（前記ＣＤ８^＋　記憶ＴＬは前記１種もしくはそれ以上の標的抗原に対する選択的免疫反応性を有するＣＤ８^＋　ＴＬを産生する能力を有することを特徴とする）をさらに含んで成る、請求項４５記載の方法。
50. 前記１種もしくはそれ以上の標的抗原を、少なくとも樹状細胞（ＤＣ）、ＣＤ４０ＬもしくはＩＬ−１２、ＣＤ８^＋　ＴＬおよびＩＬ−７を有する混合物と接触させること、ならびに、前記１種もしくはそれ以上の標的抗原に対する選択的免疫反応性を有するＣＤ８^＋　ＴＬを生成させるのに十分な時間の間、前記１種もしくはそれ以上の標的抗原を前記混合物とともに培養することを含んで成る、１種もしくはそれ以上の標的抗原に対し選択的なＣＤ８^＋　Ｔリンパ球（ＴＬ）のエクスビボでの誘導方法。
51. 前記ＣＤ８^＋　ＴＬがナイーブＣＤ８^＋　ＴＬをさらに含んで成る、請求項５０記載の方法。
52. 実質的に単離されたＤＣもしくはＣＤ８^＋　ＴＬをさらに含んで成る、請求項５０記載の方法。
53. 実質的に精製されたＣＤ４０ＬもしくはＣＤ４０の活性化を誘導する分子もしくはＩＬ−１２をさらに含んで成る、請求項５０記載の方法。
54. 前記１種もしくはそれ以上の標的抗原に対する選択的免疫反応性を有する前記ＣＤ８^＋　ＴＬを単離することをさらに含んで成る、請求項５０記載の方法。
55. ａ）病理学的に異常な細胞を突然変異誘発剤で処理して病理学的に異常な細胞の突然変異体集団を生じさせること；
    ｂ）病理学的に異常な細胞の前記突然変異体集団を、前記病理学的に異常な細胞に対し選択的な細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）と接触させて、前記ＣＴＬとの反応性を喪失した突然変異体の病理学的に異常な細胞を同定すること；
    ｃ）病理学的に異常な細胞のポリペプチドをコードする核酸の発現可能な集団を前記突然変異体細胞に導入して、前記ポリペプチドを発現する突然変異体細胞の集団を生じさせること；および
    ｄ）前記病理学的に異常な細胞に対し反応性の前記ＣＴＬとの反応性を復帰させる病理学的に異常な細胞のポリペプチドを発現する突然変異体細胞を同定すること
    を含んで成る、病理学的に異常な細胞に関連する抗原の同定方法。
56. 前記病理学的に異常な細胞のポリペプチドをコードする核酸を単離することをさらに含んで成る、請求項５５記載の方法。
57. （ａ）病理学的に異常な細胞に関連することが疑わしい１種もしくはそれ以上の抗原を、前記１種もしくはそれ以上の抗原を発現する病理学的に異常な細胞に対し選択的な細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）と接触させること；および
    （ｂ）前記１種もしくはそれ以上の抗原に対する、前記１種もしくはそれ以上の抗原を発現する病理学的に異常な細胞に対し選択的な前記ＣＴＬの免疫反応性を測定すること（ここで、前記１種もしくはそれ以上の抗原に対する選択的な免疫反応性を有するＣＴＬは、前記病理学的に異常な細胞と関連するとして前記１種もしくはそれ以上の免疫反応性の抗原を特徴づける）
    を含んで成る、病理学的に異常な細胞と関連する抗原の同定方法。
58. 有効量の、前記病理学的に異常な細胞に対する抗原特異性もしくは細胞溶解活性を有するＣＤ８^＋　Ｔリンパ球（ＴＬ）を投与すること（前記病理学的に異常な細胞に対する選択的細胞溶解活性を有する前記ＣＤ８^＋　ＴＬは請求項１記載の方法により産生される）を含んで成る、病理学的に異常な細胞により媒介される疾患を有する患者の治療方法。
59. 有効量の、前記病理学的に異常な細胞に対する抗原特異性もしくは細胞溶解活性を有するＣＤ８^＋　Ｔリンパ球（ＴＬ）を投与すること（前記病理学的に異常な細胞に対する選択的細胞溶解活性を有する前記ＣＤ８^＋　ＴＬは請求項１９記載の方法により産生される）を含んで成る、病理学的に異常な細胞により媒介される疾患を有する患者の治療方法。
60. 有効量の、前記病理学的に異常な細胞に対する抗原特異性もしくは細胞溶解活性を有するＣＤ８^＋　Ｔリンパ球（ＴＬ）を投与すること（前記病理学的に異常な細胞に対する選択的細胞溶解活性を有する前記ＣＤ８^＋　ＴＬは請求項２７記載の方法により産生される）を含んで成る、病理学的に異常な細胞により媒介される疾患を有する患者の治療方法。
61. 有効量の、前記病理学的に異常な細胞に対する抗原特異性もしくは細胞溶解活性を有するＣＤ８^＋　Ｔリンパ球（ＴＬ）を投与すること（前記病理学的に異常な細胞に対する選択的細胞溶解活性を有する前記ＣＤ８^＋　ＴＬは請求項３９記載の方法により産生される）を含んで成る、病理学的に異常な細胞により媒介される疾患を有する患者の治療方法。
62. 有効量の、前記病理学的に異常な非Ｂ細胞白血病細胞に対する細胞溶解活性を有するＣＤ８^＋　細胞溶解性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を投与すること（前記病理学的に異常な非Ｂ細胞白血病細胞に対する選択的細胞溶解活性を有する前記ＣＤ８^＋　ＣＴＬは請求項１０記載の方法により産生される）を含んで成る、病理学的に異常な非Ｂ細胞白血病細胞により媒介される疾患を有する患者の治療方法。
63. 有効量の、前記病理学的に異常な非Ｂ細胞白血病細胞に対する細胞溶解活性を有するＣＤ８^＋　細胞溶解性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を投与すること（前記病理学的に異常な非Ｂ細胞白血病細胞に対する選択的細胞溶解活性を有する前記ＣＤ８^＋　ＣＴＬは請求項３３記載の方法により産生される）を含んで成る、病理学的に異常な非Ｂ細胞白血病細胞により媒介される疾患を有する患者の治療方法。
64. 有効量の、前記病理学的に異常な細胞に関連する１種もしくはそれ以上の標的抗原に対する免疫反応性を有するＣＤ８^＋　細胞溶解性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を投与すること（免疫反応性を有する前記ＣＤ８^＋　ＣＴＬは請求項４５記載の方法により産生される）を含んで成る、病理学的に異常な細胞により媒介される疾患を有する患者の治療方法。
65. 有効量の、前記病理学的に異常な細胞に関連する１種もしくはそれ以上の標的抗原に対する免疫反応性を有するＣＤ８^＋　細胞溶解性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を投与すること（免疫反応性を有する前記ＣＤ８^＋　ＣＴＬは請求項５０記載の方法により産生される）を含んで成る、病理学的に異常な細胞により媒介される疾患を有する患者の治療方法。
66. ａ）未熟ＤＣを、ＤＣが抗原を取り込むのに十分な時間の期間の間、抗原と接触させること；ならびに
    ｂ）成熟ＤＣへのＤＣの成熟を誘導するのに十分な時間の期間の間、ＤＣおよび抗原をＣＤ４^＋　Ｔ細胞とともに培養すること
    を順序正しく連続的にもしくは同時に含んで成る、インビトロでの成熟樹状細胞（ＤＣ）の調製方法。

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