ES2292619T3

ES2292619T3 - Composiciones y metodos para inducir respuestas citologicas especificas de la celula t.

Info

Publication number: ES2292619T3
Application number: ES01968626T
Authority: ES
Inventors: Antonella Vitiello; Rita Maccario; Daniela Montagna
Original assignee: Ortho McNeil Pharmaceutical Inc
Current assignee: Janssen Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2000-09-15
Filing date: 2001-09-06
Publication date: 2008-03-16
Anticipated expiration: 2021-09-06
Also published as: WO2002022648A2; DK1326961T3; WO2002022648A3; JP2004512030A; EP1326961A4; EP1326961A2; DE60130130D1; DE60130130T2; PT1326961E; CA2422454A1; AU2001288863A1; CY1107802T1; US20020119121A1; ATE371017T1; EP1326961B1

Abstract

Un método ex vivo para inducir células T CD8+ selectivas para una célula patológicamente aberrante, que comprende: la puesta en contacto de una célula apoptótica patológicamente aberrante con una mezcla que tiene al menos células dendríticas (DC), células T CD4+ y linfocitos T CD8+; el cultivo de dicha célula apoptótica patológicamente aberrante con dicha mezcla durante un tiempo suficiente para generar linfocitos T (TL) CD8+ con especificidad antigénica para dicha célula patológicamente aberrante; en el cual se añade IL-7 a la mezcla o al cultivo de la célula apoptótica patológicamente aberrante y la mezcla; el cultivo de dichos TL CD8+ con especificidad antigénica para dicha célula patológicamente aberrante durante o más generaciones; y el aislamiento de TL CD8+ de memoria, caracterizándose dichos TL CD8+ de memoria por tener la capacidad de producir TL CD8+ con especificidad antigénica para, y actividad citolítica contra, dicha célula patológicamente aberrante.

Description

Composiciones y métodos para inducir respuestas citológicas específicas de la célula T.

Antecedentes de la invención

Esta invención se refiere de manera general a enfermedades y condiciones que están mediadas por células patológicamente aberrantes, tales como enfermedades autoinmunes, enfermedades infecciosas, alergia y enfermedades proliferativas tales como el cáncer y, más específicamente, a métodos para preparar células inmunes que pueden ser utilizadas para tratar el cáncer y otras enfermedades de proliferación celular.

El cáncer es una de las causas principales de muerte en los Estados Unidos. Cada año, más de medio millón de norteamericanos mueren de cáncer y más de un millón son diagnosticados por vez primera de la enfermedad. Los tumores cancerosos se presentan cuando una célula escapa de sus mecanismos reguladores del crecimiento normales y prolifera de forma incontrolada. Las células tumorales pueden metastizar a lugares secundarios si el tratamiento del tumor primario no es completo o no se inicia antes de una progresión sustancial de la enfermedad. La mortalidad relacionada con el cáncer puede ser disminuida mediante prevención, detección temprana y terapias rigurosas.

Un obstáculo en el tratamiento del cáncer es la falta relativa de agentes que puedan ser dirigidos selectivamente hacia el cáncer, a la vez que evitan el tejido normal. Por ejemplo, la terapia con radiación y la cirugía, que son generalmente tratamientos localizados, pueden producir un daño sustancial al tejido normal en el campo de tratamiento, teniendo como resultado la formación de cicatrices y, en casos graves, la pérdida de la función del tejido normal. La quimioterapia, que es generalmente administrada sistémicamente, puede producir un daño sustancial a órganos tales como la médula ósea, las mucosas, la piel y el intestino delgado. Otras terapias contra el cáncer incluyen anticuerpos dirigidos hacia proteínas de la superficie de las células tumorales y anticuerpos conjugados a agentes citotóxicos. Los anticuerpos terapéuticos son dirigidos hacia las células tumorales por el reconocimiento de proteínas de la superficie celular específicas del tumor. La producción de anticuerpos que se unen, o suministran toxinas, a un tumor particular requiere por tanto la identificación de una proteína diana y el hecho de que la proteína esté expuesta en la superficie celular. La eficacia y los efectos colaterales de las terapias con anticuerpos varían, y algunos anticuerpos terapéuticos pueden producir graves respuestas alérgicas en los individuos.

Se están desarrollando otras terapias que implican la utilización del sistema inmune del organismo para luchar contra el cáncer. Un procedimiento de inmunoterapia está dirigido a estimular indirectamente el sistema inmune del paciente con cáncer utilizando agentes tales como vacunas y citoquinas. Un procedimiento inmunoterapéutico más directo es incrementar la inmunidad antitumoral del paciente mediante la administración de células inmunes que ataquen al tumor. Este último método, referido como inmunoterapia adoptiva, ha sido utilizado con varios grados de éxito para tratar pacientes que padecían diferentes cánceres, incluyendo enfermedades malignas del cerebro, riñón, piel y sangre. No se ha observado de manera reproducible una regresión duradera del cáncer después de un tratamiento mediante inmunoterapia adoptiva.

Un método de inmunoterapia adoptiva implica la utilización de linfocitos T citotóxicos (CTLs) específicos para el tumor. Los CTLs son una variedad especializada de linfocitos T CD8^{+} que son capaces de reconocer un antígeno en la superficie de una célula en asociación con moléculas de clase I del Complejo Principal de Histocompatibilidad (MHC) y destruir posteriormente la célula. La función de los CTLs en el sistema inmune es reconocer y eliminar células infectadas, células tumorales y células foráneas. Para la inmunoterapia adoptiva, puede generarse una población de CTLs antitumorales derivados del paciente, o de un donante, utilizando métodos de cultivo ex vivo.

Se han descrito métodos, con éxito variable, para la producción ex vivo de CTLs antitumorales utilizando péptidos derivados de antígenos asociados al tumor y la administración posterior de los CTLs a un paciente con cáncer. Sin embargo, tales procedimientos para generar CTLs están limitados a los casos en los cuales se conoce un antígeno específico del tumor y es procesado apropiadamente para producir péptidos que son presentados por las células presentadoras de antígeno. Otro inconveniente de los CTLs inducidos por un péptido ex vivo es la imposibilidad de predecir si los CTLs resultantes conservarán la capacidad de reconocer el antígeno correspondiente en la superficie de las células tumorales debido a que la afinidad de los CTLs generados contra el péptido puede que no sea suficiente para reconocer el antígeno procesado endógenamente. Por tanto, la especificidad deseada o la eficacia necesaria para el uso terapéutico de los CTLs producidos ex vivo han sido generalmente difíciles de conseguir. Otro problema con los CTLs producidos ex vivo ha sido la dificultad de mantener los CTLs in vitro durante más de 2 ó 3 ciclos de reestimulación. Además, este método está limitado adicionalmente por la generación de CTLs que reconocen solamente un antígeno en la célula tumoral diana.

Por tanto, existe la necesidad de generar y mantener CTLs selectivos en cultivo para inmunoterapia adoptiva. La presente invención satisface esta necesidad y proporciona además ventajas relacionadas.

Resumen de la invención

La invención proporciona un método ex vivo para inducir linfocitos T (TL) CD8^{+} selectivos para una célula patológicamente aberrante, que comprende:

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(a): la puesta en contacto de dicha célula patológicamente aberrante con una primera mezcla que tiene al menos células dendríticas (DC) y células T CD4^{+} aisladas durante un tiempo suficiente para

(b): producir DCs presentadoras del antígeno de las células patológicamente aberrantes; la adición de TL CD8^{+} para producir una segunda mezcla;

(c): el cultivo de dicha segunda mezcla durante un tiempo suficiente para generar TL CD8^{+}

(d): que tengan especificidad antigénica para dicha célula patológicamente aberrante; el cultivo de dichos TL CD8^{+} con especificidad antigénica para dicha

(e): célula patológicamente aberrante durante dos o más generaciones; y el aislamiento de TL de memoria CD8^{+}, caracterizándose dichos TL de memoria CD8^{+} por tener la capacidad de producir TL CD8^{+} con especificidad antigénica para dicha célula patológicamente aberrante.

La invención proporciona además un método ex vivo para inducir células T CD8^{+} selectivas para una célula patológicamente aberrante, que comprende: la puesta en contacto de una célula apoptótica patológicamente aberrante con una mezcla que contenga al menos células dendríticas (DC), células T CD4^{+} y linfocitos T CD8^{+}; el cultivo de dicha célula apoptótica patológicamente aberrante con dicha mezcla durante un tiempo suficiente para generar linfocitos T (TL) CD8^{+} con especificidad antigénica para dicha célula patológicamente aberrante; en el que se añade IL-7 a la mezcla o al cultivo de la célula apoptótica patológicamente aberrante y la mezcla; el cultivo de dichos TL CD8^{+} con especificidad antigénica para dicha célula patológicamente aberrante durante dos o más generaciones; y el aislamiento de TL con memoria CD8^{+}, caracterizándose dichos TL con memoria CD8^{+} por tener la capacidad de producir TL CD8^{+} con especificidad antigénica para, y actividad citolítica contra, dicha célula patológicamente aberrante; en el que se añade IL-7 en al menos una de la etapa (a), la etapa (b) o la etapa (c).

Breve descripción de las figuras

Figura 1

Panel A, Panel B, Panel C y Panel D

Muestra la actividad citotóxica de células CD8 inducida por células dendríticas inmaduras y por células dendríticas tratadas con LPS, TNF o CD40L, y la actividad citotóxica de células CD8 inducida por células dendríticas inmaduras o por células dendríticas tratadas con CD40L en presencia de IL-12, IL-7 o IL-12 e IL-7.

Figura 2

Panel A, Panel B, Panel C y Panel D

Muestra las actividades citolíticas de líneas de CTL específicos para LB derivadas de PBMCs procedentes de receptores de un trasplante de médula ósea, células de médula ósea de donantes de un trasplante de médula ósea y de PBMCs procedentes de donantes de un trasplante de médula ósea. En los Paneles A-D están representados cuatro pares de donante/receptor.

Figura 3

Muestra que el número de CTL aumenta después de cada estimulación in vitro con LBs.

Figura 4

Panel A y Panel B

Muestra que las líneas de CTL específicos para LB son CD8^{+}, restringidas por la clase I.

Figura 5

Panel A y Panel B

Muestra que la lisis de LB mediada por CTL es dependiente de perforina.

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Descripción detallada de la invención

Esta invención está dirigida a métodos para la producción de células T CD8^{+} para ser utilizadas en el tratamiento de un individuo que tenga una enfermedad mediada por una célula patológicamente aberrante. Se proporcionan métodos, según se definió anteriormente, para la producción ex vivo de linfocitos T (TL) CD8^{+} que tengan especificidad antigénica, y/o actividad citolítica selectiva, para una célula patológicamente aberrante tal como una célula tumoral, un lisado celular, una fracción celular, un componente celular, o una vesícula, o una célula B, una célula productora de una sustancia que medie una enfermedad o una condición, o una célula que se ha vuelto anormal debido a los efectos de un agente infeccioso. Además, una célula puede ser considerada anormal porque produce proteínas anormales o proteínas que aunque son normales bajo ciertas circunstancias, están implicadas en la inducción o progresión de la enfermedad. Los linfocitos T CD8^{+} que tienen actividad citolítica contra una célula diana, tal como una célula patológicamente aberrante, son referidos CTL. Una ventaja de este método es que pueden generarse CTLs selectivos para una célula patológicamente aberrante completa, eliminando la necesidad de identificar un antígeno específico del tumor o un antígeno relacionado con la enfermedad. Este método elimina también factores desconocidos asociados con el procesamiento y la presentación de antígenos peptídicos. Otra ventaja del método es que los CTLs generados contra una célula diana completa pueden proporcionar una respuesta poliespecífica frente a una diana patológica. Además, la inducción de CTLs utilizando la célula completa permite la selección de los CTLs que están presentes en el repertorio de células T CD8^{+} de cada individuo. De hecho, se sabe que, en algunos pacientes, algunas especificidades de los CTL pueden estar ausentes debido a tolerancia. Además, la producción de CTLs contra la célula tumoral completa permite la inducción de CTLs específicos para mutaciones individuales que hayan tenido lugar en la célula diana.

La invención proporciona también métodos para generar CTLs CD8^{+}, y su TL CD8^{+} específico para un antígeno precursor, que pueden ser mantenidos in vitro durante periodos de tiempo más largos, lo cual es una característica de las células de memoria CD8^{+}. Las células de memoria CD8^{+} son progenitoras para la expansión de CTLs que, cuando son administrados terapéuticamente, pueden proporcionar al paciente inmunidad de larga duración frente a una célula diana patológicamente aberrante selectiva. Las células de memoria CD8^{+} se refieren a una célula CD8^{+} que tiene la capacidad de proliferar in vitro durante al menos cinco ciclos de estimulación, manteniendo su especificidad antigénica. La estimulación puede ser mantenida por el antígeno o por un medio no específico incluyendo, por ejemplo, mitógenos o anticuerpos dirigidos contra el receptor de la célula T o por moléculas coestimuladoras, o mediante procedimientos bien conocidos por expertos en la técnica.

Los CTLs selectivos y los TL CD8^{+} específicos para un antígeno, que reconocen células patológicamente aberrantes, son útiles para procedimientos de inmunoterapia adoptiva para el tratamiento del cáncer, así como de otras enfermedades en las cuales la eliminación de células anormales o patológicamente aberrantes puede proporcionar un tratamiento eficaz. Los CTLs que destruyen selectivamente una célula patológicamente aberrante son útiles para tratar enfermedades, ya que la eliminación de las células enfermas puede reducir los síntomas asociados con la presencia o la proliferación indeseable de células patológicamente aberrantes. La producción de CTLs selectivos para células patológicamente aberrantes para ser utilizados en inmunoterapia adoptiva incrementará las opciones de tratamiento disponibles para reducir los síntomas de, o sanar, condiciones en las cuales la destrucción o la reducción de células patológicamente aberrantes proporcionaría un beneficio.

Se describe en la presente la producción ex vivo de CTLs con actividad citolítica selectiva hacia células tumorales. Los CTLs selectivos para un tumor son preparados incubando células T CD8^{+} y células dendríticas de sangre periférica de un donante con células tumorales apoptóticas aisladas de un individuo con leucemia mieloide aguda (AML) que recibirá los CTLs producidos en un tratamiento de inmunoterapia adoptiva. Las células dendríticas y las células apoptóticas patológicamente aberrantes son incubadas juntas durante un tiempo suficiente para que las células dendríticas presenten los antígenos de la célula patológicamente aberrante. TL CD8^{+} aislados del donante son añadidos a la mezcla de células dendríticas y células apoptóticas patológicamente aberrantes en presencia de IL-7 e IL-12, y las poblaciones son incubadas durante un tiempo suficiente para producir TL CD8^{+} específicos para el antígeno y CTLs selectivos. Los CTLs selectivos para el tumor resultantes pueden ser administrados al receptor de la médula ósea para tratar o reducir la gravedad de la enfermedad.

En una realización, la invención está dirigida a la producción ex vivo de células T de memoria CD8^{+} a partir de las cuales una población de CTLs selectivos para una célula tumoral pueden ser expandidos. Las poblaciones de células T de memoria CD8^{+} preparadas utilizando el método de la invención pueden sobrevivir de manera reproducible estimulaciones repetidas in vitro con el antígeno. El método implica el cultivo de una mezcla de células dendríticas, TL CD8^{+} y células T CD4^{+} con células tumorales diana en presencia de IL-7. La población de células CD8^{+} resultante contiene TL CD8^{+} específicos del antígeno, CTLs selectivos para la célula tumoral y, después de dos o más generaciones, contiene TL de memoria CD8^{+} que pueden ser expandidos ex vivo durante cinco o más generaciones.

Los CTLs antitumorales generados utilizando los métodos de la invención pueden ser utilizados para tratar a un individuo que tenga cáncer. Por ejemplo, puede utilizarse inmunoterapia adoptiva para introducir inmunidad antitumoral en un paciente con un cáncer hematopoyético que tenga una recaída del cáncer después de recibir un trasplante de médula ósea. Los CTLs antitumorales pueden ser generados a partir de TL CD8^{+}, células dendríticas y células T CD4^{+} del donante de la médula ósea combinadas con las células tumorales del paciente. En este caso, en el que las células tumorales del receptor del BMT son idénticas en cuanto al HLA a las células TL CD8^{+} y a las células T CD4^{+} y a las células dendríticas del donante de médula ósea, los TL CD8^{+} del donante sin estimulación previa (naïve) presentan una respuesta inmune primaria frente a antígenos no principales del HLA. Utilizando los métodos de la invención, la producción de TL de memoria CD8^{+} permite el mantenimiento de larga duración de estas respuestas primarias inducidas ex vivo.

Por ejemplo, se encontró que CTLs antitumorales producidos utilizando los métodos de la invención eran inducidos a partir de la sangre periférica y la médula ósea del donante de la médula ósea, así como a partir de la sangre periférica del receptor de la médula ósea, seis meses después del procedimiento de inmunoterapia adoptiva. La producción de CTLs selectivos para un tumor que tengan memoria inmunológica mejorará la probabilidad de que pueda proporcionarse inmunidad protectora de larga duración mediante el tratamiento de terapia adoptiva.

Según se utiliza en la presente, el término "célula patológicamente aberrante" se refiere a una célula que está alterada respecto a la normalidad debido a cambios en la fisiología o en el fenotipo asociados con una enfermedad o con una condición anormal de una célula o tejido de mamífero. Una célula patológicamente aberrante puede ser distinguida de una célula normal debido a una alteración que ha tenido lugar y que produce una enfermedad o una condición anormal, o que es el resultado de una enfermedad o una condición anormal. A partir de estas células patológicamente aberrantes pueden producirse preparaciones subcelulares tales como lisados celulares, fracciones celulares, componentes o vesículas celulares, utilizando técnicas estándar conocidas en el oficio tales como ruptura química y física, centrifugación, separación en gradiente y cromatografía. Tales preparaciones subcelulares son útiles en los métodos de la presente invención y pueden sustituir a las preparaciones de células completas de células patológicamente
aberrantes.

Las células patológicamente aberrantes incluyen células que tienen una pérdida de la regulación o del control de una función celular. La perdida del control de una función celular puede dar lugar a cambios celulares que distinguen a una célula patológicamente aberrante de una célula normal. Ejemplos de funciones celulares son la proliferación y la diferenciación. La pérdida del control de la proliferación puede tener como resultado cambios celulares que producen una condición anormal en una célula o un tejido. Por ejemplo, las células cancerosas son anormales y proliferan de manera no regulada, lo que tiene como resultado la destrucción tisular. Según se utiliza en la presente, el término "célula tumoral" se refiere a una célula cancerosa. Ejemplos específicos de cánceres incluyen cáncer de próstata, mama, pulmón, ovario, útero, cerebro y piel. De manera similar, la proliferación de las células que median enfermedades autoinmunes está regulada de manera aberrante, lo que tiene como resultado, por ejemplo, la proliferación continuada y la activación de mecanismos inmunes con la destrucción de las células y tejidos del huésped. Las enfermedades autoinmunes incluyen, por ejemplo, artritis reumatoide, diabetes y esclerosis múltiple.

Las células patológicamente aberrantes incluyen, por ejemplo, células que producen sustancias capaces de mediar una enfermedad o condición. Un ejemplo de tales células patológicamente aberrantes son las células B que producen un anticuerpo IgE responsable de la aparición de síntomas alérgicos. Las células patológicamente aberrantes incluyen también células y tipos celulares específicos encontrados en órganos específicos del organismo, independientemente de que el órgano sea vital o no vital. Por ejemplo, un órgano puede estar compuesto por varios tipos celulares diferentes tales como epiteliales, miocitos y/o fibroblastos. Uno o más de estos tipos celulares pueden ser patológicamente aberrantes y como tales pueden ser la diana de los TL CD8^{+} y los CTL producidos por los métodos de la presente invención.

La pérdida de la regulación o del control de funciones celulares puede ocurrir también debido a la infección de una célula por un agente patológico. El término "agente patológico" se refiere a un agente infeccioso que produce una enfermedad. Ejemplos de agentes patológicos incluyen virus, bacterias, hongos, amebas y parásitos. Ejemplos específicos de enfermedades infecciosas incluyen enfermedades producidas por virus ADN o ARN, enfermedades bacterianas y enfermedades parasitarias.

El término "apoptosis" se refiere al proceso de muerte celular programada. La muerte celular programada es un proceso regulado en el cual una célula responde una señal fisiológica específica o a una señal específica relacionada con el desarrollo y experimenta una serie programada de acontecimientos que dan lugar a su muerte y eliminación del organismo. Ejemplos de los acontecimientos celulares que caracterizan la apoptosis son la contracción celular, la degradación mitocondrial con la liberación de citocromo c, la formación de burbujas en la superficie celular, la degradación de la cromatina y la exposición de fosfatidilserina sobre la superficie de la membrana plasmática. La apoptosis es distinta de la necrosis o muerte celular que resulta de una lesión, la cual se caracteriza por un hinchamiento total de la célula y de los orgánulos, con la subsiguiente pérdida temprana de la integridad de la membrana seguido por la lisis de la célula y los orgánulos. La necrosis, a diferencia de la apoptosis, está acompañada por una respuesta inflamatoria in vivo.

El término "células T CD4^{+}" se refiere a linfocitos que producen la proteína CD4 y que son capaces de interaccionar con células dendríticas para inducir la presentación del antígeno por, o la maduración de, las células dendríticas. Tales células T CD4^{+} incluyen, pero no se limitan a, células aisladas de fuentes naturales tales como sangre, líneas celulares crecidas en cultivo y clones de células T CD4^{+}.

El término "selectiva", cuando es utilizado en relación a una célula T citolítica CD8^{+}, tiene la intención de significar un linfocito T citolítico (CTL) CD8^{+} que reconoce preferencialmente, y tiene actividad citolítica hacia, una célula diana patológicamente aberrante particular, en comparación con una célula no diana. Un CTL selectivo puede distinguir, o puede hacerse que distinga, una célula patológicamente aberrante diana de una población de células no diana y sustancialmente no reacciona de manera cruzada con las células no diana. Cuando se utiliza con relación a la reactividad inmune o a la especificidad antigénica, el término "selectiva" tiene la intención de significar el hecho de que un receptor de células T de un CTL o de un TL CD8^{+} se une preferencialmente a un antígeno diana particular. Un CTL que presente reactividad inmune selectiva no reacciona de manera cruzada sustancialmente con los antígenos no diana y puede distinguir una célula patológicamente aberrante que presente el antígeno diana de una célula normal o no diana.

El término "ex vivo", cuando es utilizado con relación a una célula, quiere indicar una célula fuera del organismo. Por tanto, un método de cultivo celular ex vivo implica la recogida de células de un individuo. Los métodos de cultivo ex vivo son aplicables a una célula recogida de cualquier tejido u órgano de un individuo. Las condiciones del cultivo celular de los cultivos ex vivo incluyen una variedad de composiciones. Las células pueden estar en una mezcla heterogénea o pueden ser células aisladas. El medio puede ser un medio de cultivo celular definido o no definido o puede contener factores añadidos. El medio puede contener factores que incrementen el potencial terapéutico de las células. Por ejemplo, pueden utilizarse factores para estimular el crecimiento, la viabilidad o la diferenciación. Los factores añadidos pueden incluir otras células, factores proteicos y reactivos químicos.

El término "tiempo suficiente" quiere indicar un periodo de tiempo que permita que una célula T CD8^{+} sea inducida. El proceso de inducción de células T CD8^{+} incluye al menos el procesamiento y la presentación de un antígeno por las células dendríticas, el reconocimiento del antígeno por las células T CD8^{+} y la activación de la actividad citolítica. Un tiempo suficiente que permita la finalización de este proceso puede ser un periodo de tiempo corto o largo, ya que diferencias en las diferentes poblaciones celulares de los métodos tendrán como resultado diferencias en las velocidades de captación del antígeno. Factores que pueden afectar al tiempo suficiente para la inducción de células T CD8^{+} pueden ser, por ejemplo, los tipos de células en un cultivo, la pureza de los diferentes tipos células, las concentraciones de los tipos celulares y el hecho de que las células dendríticas sean inmaduras o estén presentando antígeno en el momento del cultivo. Un tiempo suficiente puede tener lugar instantáneamente, en minutos, horas, días o semanas, dependiendo de la composición de la mezcla de reacción. Por ejemplo, cuando se añade una célula T CD8^{+} a una mezcla de reacción que contiene células dendríticas maduras preparadas que están presentando un antígeno, la estimulación de las células T CD8^{+} tendrá lugar en un periodo de tiempo relativamente corto, ya que la etapa de captación y procesamiento del antígeno por las células dendríticas ha tenido ya lugar, en comparación con un caso en el que se añada a la mezcla de reacción una célula T CD8^{+} que contenga células dendríticas inmaduras y células diana patológicamente aberrantes u otro(s) antígeno(s) diana.

Según se utiliza en la presente, el término "aislada" se refiere a una célula que está separada de uno o más componentes con los cuales está asociada en la naturaleza. Una célula aislada incluye también una célula purificada a partir de componentes tisulares no celulares tales como las fibras del tejido conectivo. Una célula aislada puede ser, por ejemplo, una célula primaria, ya sea recién purificada a partir de componentes tisulares no celulares, o bien cultivada durante una o más generaciones. Un ejemplo de una célula aislada es una célula que ha sido separada de la sangre, tal como una célula de una preparación de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs).

El término "sustancialmente", cuando es utilizado en relación a una célula aislada, tiene la intención de significar que una célula representa el 90-99% de una población celular purificada. Por ejemplo, una célula sustancialmente aislada puede ser un 90-95% pura, un 95% pura, un 95-99% pura, o puede ser tan pura como un 99% o
mayor.

El término "sustancialmente purificado", cuando es utilizado con relación a un ligando de CD40 (CD40L) o a IL-12, tiene la intención de significar que las proteínas están sustancialmente libres de otros componentes con los que están asociadas de forma natural. Por ejemplo, las proteínas CD40L e IL-12 se encuentran normalmente con otras proteínas en las células. Estas proteínas pueden actuar como contaminantes no deseados cuando se utilizan CD40L o IL-12 para tratar células cultivadas.

El término "célula de leucemia de células no B", se refiere a cualquier tipo celular que no sea una célula de leucemia de células B o una célula de leucemia de células pre-B. Una célula de leucemia de células no B incluye una célula B normal no cancerosa e incluye también una célula B de un cáncer diferente de leucemia tal como una célula de linfoma de células B. Las células de leucemia de células no B incluyen otros tipos de células de leucemia tales como células de leucemia de células T. Las células de leucemia de células no B pueden ser cualquier tipo de células cancerosas que no sean una célula de leucemia de células B o una célula de leucemia de células pre-B, y pueden ser células no cancerosas de cualquier tipo, incluyendo células que sean patológicamente aberrantes debido a una condición o enfermedad no cancerosa.

Según se utiliza en la presente, el término "antígeno" quiere significar una molécula que puede ser procesada y presentada por una célula presentadora de antígenos y reconocida posteriormente por un receptor de células T. Tal molécula puede ser, por ejemplo, un polipéptido.

El término "diana", cuando es utilizado en relación a la reactividad inmune de una célula T CD8^{+}, es cualquier antígeno predeterminado. Un antígeno predeterminado puede ser, por ejemplo, una célula o un polipéptido.

Según se utiliza en la presente, el término "sin activación previa" (naïve), cuando es utilizado en relación a una célula T CD8^{+}, quiere significar que una célula T CD8^{+} no ha visto a una célula diana particular o a un antígeno diana particular in vivo. Por tanto, una célula T CD8^{+} sin activación previa (naïve) debe ser expuesta a una célula diana o antígeno particular ex vivo con el fin de que sea capaz de actividad CTL selectiva para la célula o antígeno diana particular.

Según se utiliza en la presente, el término "in situ", cuando es utilizado en relación a la actividad de CTL selectivos quiere significar que los CTLs selectivos pueden destruir una célula diana patológicamente aberrante en una estructura intacta del organismo. Por ejemplo, un CTL selectivo puede destruir una célula diana en una población heterogénea de células. Específicamente, un CTL selectivo puede eliminar una célula patológicamente aberrante, tal como una célula tumoral, de un tejido tal como sangre o médula ósea.

Según se utiliza en la presente, el término "tratamiento" quiere significar la reducción de la gravedad o la prevención de una condición patológica mediada por una célula patológicamente aberrante. La reducción de la gravedad incluye, por ejemplo, una detención o disminución de los síntomas clínicos, de indicadores fisiológicos, de marcadores bioquímicos o de indicadores metabólicos. La prevención de una enfermedad incluye, por ejemplo, el impedir la aparición de la enfermedad o el restablecimiento de un individuo enfermo hasta su estado de salud anterior a la enfermedad.

Según se utiliza en la presente, el término "cantidad eficaz" quiere significar una cantidad de células T CD8^{+} citolíticas requerida para llevar a cabo una disminución del grado, el nivel o la tasa de propagación de una condición patológica cuando es administrada a un individuo. La dosificación de una preparación de CTL requerida para que sea terapéuticamente eficaz dependerá de, por ejemplo, la condición patológica a tratar y del nivel de abundancia y densidad de los antígenos diana, así como del peso y la condición del individuo y de terapias previas o simultáneas. La cantidad apropiada considerada como dosis eficaz para una aplicación particular de CTLs selectivos proporcionados por el método puede ser determinada por los expertos en la técnica, utilizando las directrices proporcionadas en la presente. Por ejemplo, la cantidad para ser administrada puede ser extrapolada de ensayos de citotoxicidad in vitro o in vivo según se describe más adelante. Una persona experta en la técnica reconocerá que la condición del paciente necesita ser monitorizada a lo largo del curso de la terapia y que la cantidad de la composición que es administrada puede ser ajustada de acuerdo con la respuesta del individuo a la terapia.

La invención proporciona un método para inducir la actividad citolítica de células T CD8^{+} específicas para una célula patológicamente aberrante ex vivo. El método consiste en poner en contacto una célula apoptótica patológicamente aberrante con una mezcla que tenga al menos células dendríticas (DC), células T CD4^{+} y células T CD8^{+}, y cultivar dicha célula apoptótica patológicamente aberrante con dicha mezcla durante un tiempo suficiente para generar células T citolíticas (CTL) CD8^{+} que tengan actividad citolítica selectiva hacia dicha célula patológicamente
aberrante.

La invención proporciona además un método ex vivo para inducir células T CD8^{+} específicas para una célula patológicamente aberrante que es una célula de leucemia de células no B.

Los métodos de la invención pueden ser utilizados para generar una población de CTLs selectivos para cualquier célula apoptótica patológicamente aberrante o para cualquier célula patológicamente aberrante de leucemia de células no B, preferiblemente cuando la eliminación de la célula patológicamente aberrante puede proporcionar beneficio a un individuo. Tales beneficios pueden incluir la reducción de la gravedad de la enfermedad, de los síntomas de la enfermedad, de la progresión de la enfermedad o de la velocidad de progresión de la enfermedad. Tipos particulares de células patológicamente aberrantes incluyen, por ejemplo, aquellas células que están reguladas de manera anormal en comparación con una célula normal. Las células patológicamente aberrantes pueden ser células que han cambiado desde la normalidad debido a una enfermedad, o pueden ser células alteradas que produzcan una enfermedad por su presencia, o bien células que produzcan factores que causan una enfermedad. Por tanto, los métodos de la invención son aplicables a células patológicamente aberrantes que median enfermedades tales como el cáncer, enfermedades autoinmunes, enfermedades infecciosas y alergias.

Mediante mención específica de las categorías de condiciones patológicas anteriores, los expertos en la técnica comprenderán que tales términos incluyen todas las clases y tipos de estas condiciones patológicas. Por ejemplo, el término cáncer quiere incluir todos los cánceres conocidos, ya sean caracterizados como malignos, benignos, de tejido blando o tumor sólido. Como ejemplo, en la Tabla 1 siguiente se proporciona una lista no exhaustiva de cánceres conocidos. De manera similar, y por analogía a las clases y tipos de cánceres mostrados en la Tabla 1, los términos enfermedades infecciosas y enfermedades autoinmunes tienen la intención de incluir todas las clases y tipos de estas condiciones patológicas. Los expertos en la técnica están familiarizados con las diferentes clases y tipos de enfermedades infecciosas y autoinmunes y con las alergias.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1

1

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Los métodos de la invención son aplicables a la producción de células CTL que son selectivas para células patológicamente aberrantes que están reguladas de manera aberrante. Las células reguladas de manera aberrante incluyen, por ejemplo, células que presentan una proliferación celular incontrolada así como células que presentan una disfunción en fases específicas del ciclo celular, dando lugar a características proliferativas o fenotipos morfológicos alterados. Ejemplos específicos de tipos celulares regulados de manera aberrante incluyen células neoplásicas tales como células cancerosas e hiperplásicas características de la hiperplasia tisular. Otro ejemplo específico incluye células inmunes que resultan activadas de manera aberrante o que no pueden disminuir de manera regulada después de la estimulación. Tales células inmunes reguladas de manera aberrantes median enfermedades autoinmunes. Las células reguladas de manera aberrante incluyen también células que son disfuncionales desde el punto de vista bioquímico o fisiológico. Otros tipos de regulación aberrante de la función o proliferación celular son conocidos por los expertos en la técnica y son igualmente células patológicamente aberrantes aplicables a los métodos para producir CTLs de la invención.

La células patológicamente aberrantes incluyen células reguladas de manera aberrante tales como las descritas anteriormente e incluyen adicionalmente, por ejemplo, células que están infectadas por un agente patológico tal como un agente infeccioso. Agentes infecciosos que convierten una célula en anormal incluyen, por ejemplo, aquellos agentes que requieren la maquinaria de la célula huésped para sobrevivir o propagarse. Por ejemplo, los virus infectan células y producen cáncer. Dentro de tales agentes infecciosos están incluidos los virus ADN, los virus ARN y los parásitos. Ejemplos específicos de virus ADN incluyen adenovirus y parvovirus. Ejemplos específicos de virus ARN incluyen los virus de la poliomielitis, de la gripe y los retrovirus. Los virus que mutan rápidamente son aplicables a los métodos de la invención. La utilización de una célula patológicamente aberrante como una fuente de antígeno puede proporcionar células CTL que son específicas para múltiples epítopos en una célula infectada con un virus que muta rápidamente. En comparación con una población de CTL que reconoce selectivamente un antígeno diana, una población de CTL selectivos para múltiples antígenos diana puede incrementar la probabilidad de que sea destruida una célula conteniendo un virus. Los parásitos que utilizan la maquinaria de la célula huésped eucariótica para su supervivencia o propagación incluyen, por ejemplo, tripanosomas. Las células infectadas por este y otros agentes conocidos en la técnica, que utilizan la maquinaria de la célula huésped, son convertidas en anormales ya que tienen comprometida su función celular normal, lo cual puede manifestarse como cambios morfológicos y bioquímicos. Por tanto, los CTLs generados por los métodos de la invención pueden ser vectorizados hacia estas células.

Las células patológicamente aberrantes incluyen células que son anormales debido a cambios en las proteínas, tales como cambios en la regulación de la expresión normal de proteínas. Los cambios de la expresión de proteínas incluyen una expresión incrementada de una proteína, la expresión de una proteína foránea, la expresión de una proteína que no se expresa normalmente en un tipo de célula particular en un estadio particular, y la expresión de una proteína mutante. Las células patológicamente aberrantes que han cambiado la expresión normal de una proteína pueden tener también antígenos en la superficie celular que son distintos de los de las células normales. Las células patológicamente aberrantes incluyen también células que están produciendo una proteína que causa una enfermedad o condición, tales como células B que producen anticuerpos IgE específicos para un alergeno, u otros tipos de anticuerpos que pueden mediar otras enfermedades o condiciones.

Las células patológicamente aberrantes que son células de leucemia de células no B, incluyendo las células de leucemia de células no pre-B, pueden ser células B que son patológicamente aberrantes debido a una enfermedad o condición distinta de la leucemia. Por ejemplo, una célula de leucemia de células no B puede ser un tipo diferente de célula de cáncer de células B, tal como una célula de linfoma de células B. Las células de leucemia de células no B pueden ser células de leucemia de un tipo distinto de células de leucemia de células B o de células pre-B. Por ejemplo, una célula de leucemia de células no B puede ser una célula de leucemia de células T. Una célula de leucemia de células B puede ser una célula B o una célula pre-B que no exprese CD40. Tal célula es incapaz de responder a CD40L.

Todas las clasificaciones anteriores de células aberrantes y anormales y de tipos celulares, presentan características fisiológicas y fenotipos indeseables que pueden dan lugar a un crecimiento celular no deseado y a complicaciones no deseadas. Por tanto, estas células reguladas de manera aberrante o anormales presentarán diferencias en la síntesis o expresión de antígenos en comparación con las células normales. Estas diferencias pueden ser distinguidas por los CTLs que son selectivos para las células diana patológicamente aberrantes generados por los métodos de la invención.

De acuerdo con los métodos de la invención, una población de células T CD8^{+} es inducida para que genere linfocitos T citolíticos (CTLs) que son selectivos para una célula patológicamente aberrante. Una célula que es reconocida selectivamente por un CTL será destruida ya sea por citotoxicidad directa o por la inducción de apoptosis. Los CTLs son TL CD8^{+} que reconocen un antígeno en forma de fragmentos polipeptídicos acomplejados con moléculas de clase I del MHC. La unión de un antígeno a un receptor de células T (TCR) acomplejado en la superficie de un TL CD8^{+} es un acontecimiento implicado en el inicio de cambios intracelulares que dan lugar a la diferenciación de los TL CD8^{+} para convertirse en linfocitos T citolíticos (CTLs). Los CTLs presentan actividad citolítica hacia células que presentan un antígeno diana que puede unirse a un TCR.

Para producir CTLs que sean selectivos para una célula patológicamente aberrante, los TL CD8^{+} son estimulados por una célula patológicamente aberrante en presencia de células o factores que aumentan el proceso de estimulación de los CTLs. Por tanto, la estimulación es la exposición de células T CD8^{+} para que se conviertan en CTLs activos que reconozcan selectivamente y lisen células patológicamente aberrantes que expresen el antígeno inductor. Un requisito para la inducción de CTLs es la presentación del antígeno por una célula presentadora de antígenos. Casi todas las células nucleadas expresan moléculas de Clase I del MHC, pero pueden no ser capaces de estimular a las células T CD8^{+} ya que para una estimulación eficaz son necesarios correceptores, moléculas coestimuladoras y otros factores adicionales. Por tanto, la utilización de una célula presentadora de antígenos profesional, que pueda expresar todos los factores requeridos para la estimulación, puede incrementar la eficacia de la estimulación de CTL en una mezcla de células cultivadas ex vivo para estimular CTLs selectivos para una célula patológicamente aberrante.

Las células dendríticas son células presentadoras de antígeno profesionales (un término bien conocido y utilizado comúnmente por los expertos en la técnica) que pueden procesar y presentar antígenos eficazmente e inducir potentemente respuestas citolíticas en los TL CD8^{+}. La presentación de antígenos por las células dendríticas puede tener lugar después de la fagocitosis por las células dendríticas de una célula apoptótica. Por tanto, en combinación con una célula dendrítica, una célula patológicamente aberrante que sea apoptótica, o que experimentará apoptosis, puede ser utilizada como célula diana en los métodos de la invención.

Una célula que realice la función de una célula dendrítica puede sustituir a una célula dendrítica en los métodos de la invención. Tal sustituta de una célula dendrítica podría ser, por ejemplo, una célula que presente antígenos o moléculas coestimuladoras debido a la expresión de una proteína recombinante. La expresión de proteínas recombinantes para producir tales células presentadoras de antígeno artificiales es bien conocida en la técnica y los expertos podrán determinar una proteína recombinante para su expresión en una célula presentadora de antígeno artificial con el fin de ser utilizada en los métodos de la invención.

Los métodos de la invención utilizan por tanto al menos un TL CD8^{+}, una célula dendrítica y una célula patológicamente aberrante que es apoptótica, o que experimentará apoptosis, para la inducción de CTLs selectivos para la célula diana patológicamente aberrante. Otras células y factores añadidos a esta mezcla pueden aumentar la eficacia de estimulación o el nivel de respuesta CTL de las células T CD8^{+} iniciales. Por ejemplo, la inclusión de células T CD4^{+} en la mezcla de inducción de CTLs puede proporcionar factores adicionales requeridos para la estimulación y la producción eficaz de un CTL de memoria CD8^{+}.

Las células T CD4^{+} proporcionan células T cooperadoras que facilitan la respuesta de los TL CD8^{+} a antígenos celulares. In vivo, esta cooperación de las células T es el resultado de la activación de las células dendríticas por células T CD4^{+} y puede estar mediada por la interacción CD40-CD40L. Varios factores pueden sustituir a la función proporcionada por una célula T CD4^{+} en la incubación de una mezcla de células para estimular a una célula T CD8^{+}.

Por ejemplo, se describe en la presente que el Ligando de CD40 (CD40L), un factor presentado por una célula T CD4^{+} a una célula dendrítica que estimula la maduración de la célula dendrítica, se encontró que era suficiente para estimular la inducción por las células dendríticas de una respuesta CTL. La función de CD40L puede ser sustituida por una molécula, tal como un anticuerpo hacia CD40, que sea capaz de unirse a, y activar, CD40 de manera similar a la de CD40L. Además, se encontró que la interleuquina-12 (IL-12), un factor que puede ser producido por una célula dendrítica madura, sustituía también a CD40L.

Por tanto, se describe en la presente que la adición de CD40 e IL-12 puede sustituir a al menos una función de una célula T CD4^{+}, aunque estos factores puede que no funcionen eficazmente en la inducción de la producción de TL CD8^{+} de memoria. Además, se encontró que la interleuquina-7 (IL-7) incrementaba adicionalmente el nivel de respuesta CTL. Por tanto, la invención comprende la adición de una cantidad eficaz de IL-7 a la incubación de una mezcla de células reunidas para la producción de CTLs selectivos para una célula patológicamente aberrante con el fin de incrementar la eficacia de la producción de CTLs. La utilización de factores tales como los mencionados anteriormente será discutida con más detalle posteriormente.

El método de la invención proporciona mezclas de poblaciones de células que pueden generar un CTL selectivo para una célula patológicamente aberrante. Las mezclas de células contienen poblaciones de al menos células CD8^{+}, células dendríticas y células patológicamente aberrantes que pueden estar combinadas con otros componentes, incluyendo células T CD4^{+}.

Las preparaciones de L CD8^{+}, células dendríticas, células patológicamente aberrantes y células CD4^{+} pueden contener muchos tipos de células inmunológicas diferentes. Por tanto, las mezclas de células reunidas con el fin de inducir un CTL selectivo para una célula patológicamente aberrante pueden contener tipos celulares distintos de los tipos celulares referenciados.

Una célula para ser utilizada en los métodos de la invención puede ser una población heterogénea de células, una célula aislada o una célula sustancialmente aislada. Una población heterogénea de células puede ser una mezcla de células que exista de forma natural y que contenga muchos tipos de células inmunológicas, tal como la médula ósea. Una célula aislada puede ser una célula de una población fraccionada, tal como una célula en una preparación de células mononucleares de sangre periférica (PBMC), o puede ser una población de células que haya sido enriquecida, o disminuida, en un tipo de célula particular. Una célula sustancialmente aislada puede ser una célula que esté sustancialmente libre de otros tipos celulares, tal como una célula que esté purificada.

Por tanto, las mezclas de células de la invención pueden contener una variedad de células, incluyendo las células referenciadas y células no referenciadas. La mezcla de células puede ser producida utilizando una variedad de preparaciones celulares. Por tanto, alterando las poblaciones celulares es posible optimizar una mezcla celular para una estimulación eficaz de CD8^{+} y la producción de CTL.

Las poblaciones celulares contenidas en una mezcla de inducción de CTL pueden ser alteradas de varias formas, tal como mediante la preparación de una célula de pureza incrementada o disminuida y mediante el tratamiento de un tipo celular particular en cultivo para estimular un resultado obtenible particular. Por ejemplo, una célula puede ser tratada con un factor que estimule la expansión celular hasta una densidad o número particular, la diferenciación celular, la diferenciación de un linaje celular específico, la apoptosis o cualquier condición o fenotipo celular obtenibles deseados. Las condiciones que estimulan el crecimiento o la diferenciación pueden incluir factores proteicos o reactivos químicos en el medio de crecimiento de las células cultivadas. Estos factores y reactivos pueden ser componentes de una mezcla bruta, pueden estar aislados o pueden estar sustancialmente aislados. Ejemplos de factores incluyen mezclas brutas tales como suero, proteínas existentes en la naturaleza, proteínas parcialmente purificadas y proteínas sustancialmente aisladas.

Las preparaciones de poblaciones celulares en una mezcla pueden influir sobre la eficacia de la estimulación o de la producción de CTL. Por ejemplo, los TL CD8^{+} y las células dendríticas pueden ser preparados simultáneamente en un único cultivo de PBMCs. Específicamente, PBMCs recogidas de un individuo pueden ser primeramente disminuidas en células T CD4^{+} utilizando métodos conocidos, según se discute más adelante. Una finalidad de la disminución de células T CD4^{+} es estimular el crecimiento de TL CD8^{+} impidiendo que las células T CD4^{+}, que crecen generalmente más rápido que los TL CD8^{+}, superen en crecimiento a la población de células CD8^{+}. Las PBMCs disminuidas en células T CD4^{+} pueden ser posteriormente combinadas con una célula patológicamente aberrante. Después de incubar la mezcla de PBMC durante un tiempo suficiente que permita el reconocimiento del antígeno presentado por los TL CD8^{+}, se generan CTLs selectivos para una célula patológicamente aberrante.

Una ventaja de la utilización de una población celular para obtener más de un tipo celular con el fin de producir una mezcla de células para la producción de CTLs, es que no se requiere el aislamiento y el cultivo de poblaciones celulares adicionales. Además, utilizando células de un único donante, se sabe que los tipos celulares son idénticos respecto al HLA, y no se requiere por tanto la necesidad de considerar la igualdad de HLA entre las poblaciones celulares del donante y del receptor. La utilización de una mezcla celular conteniendo tipos de células de un sólo origen es ventajosa en el caso de que sea difícil de obtener una fuente de células, o para obtener una muestra de células con cantidad suficiente.

Aunque la utilización de una mezcla de TL CD8^{+}, células T CD4^{+} y células dendríticas obtenidas de una única fuente proporciona una ventaja, una mezcla de células puede ser alterada para incrementar la eficacia de la producción de CTLs. Con el fin de incrementar la eficacia de la estimulación de TL CD8^{+}, por ejemplo, las poblaciones de células pueden ser aisladas individualmente y tratadas en cultivo. Métodos para aislar células T CD4^{+} y TL CD8^{+}, células dendríticas y células patológicamente aberrantes se describen con detalle más adelante. Cada uno de los tipos celulares de los métodos de la invención puede ser tratado en cultivo para incrementar su contribución particular a la eficacia global de una mezcla de poblaciones celulares para inducir la estimulación o generación de CD8^{+}.

Pueden añadirse factores que estimulen o aumenten la inducción de CTL selectivos contra una célula diana patológicamente aberrante a un cultivo de una mezcla de poblaciones celulares o a una población celular específica cultivada independientemente antes de la preparación de la mezcla celular. Los factores que pueden ser útiles en los métodos de la invención son citoquinas, factores de crecimiento, factores de diferenciación, proteínas implicadas en el mantenimiento de la viabilidad celular y factores estimulantes de la apoptosis.

Ejemplos de citoquinas que, además de IL-7, pueden estar presentes en un cultivo celular ex vivo de los métodos descritos en la presente incluyen, por ejemplo, GM-CSF e interleuquinas tales como IL-2 e IL-12. Ejemplos de factores de crecimiento que pueden estar presentes en un cultivo celular ex vivo incluyen, por ejemplo, aquellas proteínas que producen o contribuyen al crecimiento celular de un tipo celular particular empleado en los métodos de la invención. Ejemplos específicos de factores de crecimiento son el factor de crecimiento de fibroblastos, el factor de crecimiento derivado de plaquetas y el factor de crecimiento transformante \beta. Ejemplos de factores de diferenciación son aquellas proteínas que contribuyen a, o aumentan, el proceso de diferenciación celular en un tipo celular particular del método. Un ejemplo específico de un factor de diferenciación es el factor derivado de suero. Ejemplos de factores que contribuyen al mantenimiento de la viabilidad celular incluyen la hormona de crecimiento y el interferón alfa. Ejemplos específicos de factores utilizados para inducir la apoptosis se proporcionan con detalle más adelante.

Los factores para ser utilizados en el cultivo celular pueden ser preparados o aislados a partir de fuentes naturales o bien producidos mediante métodos recombinantes. Factores específicos tales como las citoquinas IL-7 e IL-12 pueden ser, por ejemplo, proporcionados por una célula natural o proporcionados en forma sustancialmente purificada, tal como al ser aislados después de la producción mediante métodos recombinantes. La producción de proteínas mediante métodos recombinantes, la detección de proteínas específicas en las células y el aislamiento de proteínas por métodos bioquímicos son bien conocidos en la técnica. Muchos factores pueden ser obtenidos de fuentes comerciales. Células nodrizas ("feeder") pueden también suministrar proteínas a las células cultivadas en formas unidas a la membrana o secretadas. Ejemplos de células que proporcionan tales factores son células nodrizas irradiadas tales como células irradiadas que no pueden proliferar. Un ejemplo específico de una célula nodriza es un monocito irradiado que se adhiere a la superficie del cultivo de tejidos y presenta o secreta factores que promueven la estimulación de TL CD8^{+}.

Las concentraciones de los factores utilizados en el método de producción de CTLs selectivos pueden variar dependiendo de los tipos celulares particulares presentes en la mezcla, de las características de una célula particular, del tiempo de incubación, de la pureza de las proteínas y del grado de aislamiento de las células. Las características de los tipos celulares particulares pueden variar de individuo a individuo, teniendo como resultado diferentes niveles de crecimiento o de diferenciación bajo condiciones de cultivo idénticas. La concentración de los factores puede ser ajustada para acabar con las diferencias en el comportamiento celular debidas a cualquiera de estas diferencias entre las poblaciones celulares utilizadas con el fin de generar CTLs selectivos para una célula patológicamente aberrante. Por ejemplo, la concentración de un factor de crecimiento en un medio de cultivo celular puede ser incrementada con el fin de promover una velocidad de crecimiento más rápida de una célula particular.

Los factores pueden tener una o más funciones celulares. Por ejemplo, un factor que estimule el crecimiento de un tipo celular puede estimular también la diferenciación en otro tipo celular. El efecto de un factor particular sobre un tipo celular particular puede ser determinado mediante métodos conocidos en la técnica. Tales métodos incluyen, por ejemplo, la determinación del número de células, de la viabilidad y del fenotipo. Ejemplos específicos de factores que pueden ser añadidos al medio de cultivo de varias células, incluyendo células dendríticas y mezclas de células dendríticas, se describen con más detalle más adelante.

Por ejemplo, los monocitos pueden ser tratados bajo condiciones que estimulen una diferenciación celular hacia células dendríticas. Los monocitos presentes en, o recogidos de, PBMCs pueden ser inducidos para que se diferencien en células dendríticas mediante la adición de GM-CSF e IL-4 durante un tiempo suficiente.

Las células dendríticas pueden ser tratadas en cultivo para incrementar la eficacia de captación de un antígeno. Las células dendríticas inmaduras captan eficazmente las células patológicamente aberrantes mediante fagocitosis, y procesan los antígenos, pero presentan los antígenos menos eficazmente, mientras que las células dendríticas maduras captan y procesan los antígenos menos eficazmente a la vez que presentan los antígenos más eficazmente. Por tanto, es ventajoso presentar una célula patológicamente aberrante a una célula dendrítica inmadura antes de la maduración de la célula dendrítica. Preparando una mezcla de una célula dendrítica inmadura y una célula patológicamente aberrante y permitiendo que tenga lugar la captación del antígeno antes de introducir en las células dendríticas factores de maduración, puede incrementarse la eficacia de la estimulación de TL CD8^{+}.

Las células dendríticas utilizadas en los métodos de la invención pueden ser células dendríticas inmaduras o maduras. Los factores que inducen la maduración de células dendríticas incluyen, por ejemplo, TNF-\alpha, LPS y CD40L. La presencia de una célula T CD4^{+} puede proporcionar también un factor de maduración de células dendríticas. Por tanto, puede ser ventajoso cultivar una célula dendrítica y una célula patológicamente aberrante en ausencia de un T CD4^{+}, o de otro factor de maduración, durante un tiempo suficiente para permitir que la célula dendrítica procese el antígeno. La célula dendrítica que ha procesado el antígeno puede ser posteriormente mezclada con células y factores que estimulen la presentación del antígeno además de las células y factores adicionales requeridos para la producción de CTLs. Mediante la preparación en primer lugar de células dendríticas que hayan sido incubadas bajo condiciones que optimicen la presentación del antígeno, puede incrementarse la eficacia de la estimulación de TL CD8^{+}.

La invención proporciona un método para inducir TL CD8^{+} ex vivo. El método comprende: la puesta en contacto de una célula apoptótica patológicamente aberrante con una mezcla que tenga al menos células dendríticas (DC), células T CD4^{+} y linfocitos T CD8^{+}; el cultivo de dicha célula apoptótica patológicamente aberrante con dicha mezcla durante un tiempo suficiente para generar linfocitos T (TL) CD8^{+} con especificidad antigénica para dicha célula patológicamente aberrante; en el que se añade IL-7 a la mezcla o al cultivo de la célula apoptótica patológicamente aberrante y la mezcla; el cultivo de dichos TL CD8^{+} con especificidad antigénica para dicha célula patológicamente aberrante durante dos o más generaciones; y el aislamiento de TL CD8^{+} de memoria, caracterizándose dichos TL CD8^{+} de memoria por tener la capacidad de producir TL CD8^{+} con especificidad antigénica para, y actividad citolítica contra, dicha célula patológicamente aberrante.

Un ejemplo de una mezcla de células preparada para la producción de CTLs selectivos para una célula patológicamente aberrante es según sigue. Por ejemplo, una preparación de PBMCs puede ser fraccionada para producir varias poblaciones celulares. Las poblaciones celulares pueden ser aisladas o sustancialmente aisladas. Específicamente, pueden recogerse monocitos de las PBMCs y ser inducidos para que se diferencien en células dendríticas por la adición de GM-CSF e IL-4 durante un tiempo suficiente. Esta población de células dendríticas inmaduras puede ser combinada con las células apoptóticas patológicamente aberrantes durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la captación y el procesamiento de los antígenos de las células patológicamente aberrantes. La eliminación de células T CD4^{+} de las PBMCs puede proporcionar una población de células T CD4^{+} y una población de PBMCs disminuida en CD4^{+}.

Las tres poblaciones celulares resultantes pueden ser posteriormente cultivadas individualmente. Las células T CD4^{+} pueden ser tratadas, por ejemplo, mediante radiación para hacer que no se dividan y devueltas posteriormente a las PBMCs disminuidas en CD4^{+}. Esta población de PBMC puede ser combinada con la población de células dendríticas que ha sido incubada con las células patológicamente aberrantes y con IL-7. La célula patológicamente aberrante puede ser, por ejemplo, una célula tumoral. La mezcla de células puede ser posteriormente incubada durante un tiempo suficiente para permitir la producción de CTL selectivos contra la célula patológicamente aberrante. La población de células puede ser, por ejemplo, almacenada, aislada posteriormente o utilizada para tratar a un individuo.

Un método para incrementar la eficacia de la estimulación de TL CD8^{+} implica el enriquecimiento de una población de células T CD4^{+} con células T CD4^{+} que reconozcan un antígeno peptídico específico asociado con moléculas de Clase II del MHC. En una población de células T CD4^{+} utilizada en los métodos de la invención, solamente una pequeña fracción de las células será específica para el antígeno derivado de la célula patológicamente aberrante y presentado en las células dendríticas en la mezcla de poblaciones celulares preparada para generar CTLs selectivos para una célula patológicamente aberrante. Para incrementar el número de células T CD4^{+} específicas para un antígeno en la población total de células T CD4^{+}, puede utilizarse un método de enriquecimiento en células T CD4^{+}. Por ejemplo, puede incrementarse una población de células T CD4^{+} utilizando un inmunógeno, tal como el toxoide tetánico. Una población de células T CD4^{+} de un individuo que haya sido inmunizado previamente contra el toxoide tetánico puede ser obtenida, cultivada ex vivo y tratada con el toxoide tetánico para tener como resultado una población enriquecida de células T CD4^{+} restringidas por moléculas de Clase II del MHC que pueden proporcionar más eficazmente la señal de maduración a las células dendríticas inmaduras. Puede obtenerse una célula T CD4^{+} clonada que sea específica para un antígeno restringido por moléculas de Clase II del MHC, expandirse y almacenarse para uso repetido. Las personas expertas en la técnica sabrán como obtener una línea celular clonal, expandir células y preparar células para un almacenamiento de larga duración.

La producción de CTLs en una mezcla cultivada ex vivo tiene lugar durante la incubación en un periodo de tiempo suficiente para que los TL CD8^{+} reconozcan el antígeno presentado y desencadenen la conversión en CTLs. Por ejemplo, la inducción de CTLs selectivos a partir de una mezcla de células que conste al menos de células dendríticas, células apoptóticas patológicamente aberrantes, células T CD4^{+} y TL CD8^{+}, puede tener lugar en un periodo de tiempo de 6 a 40 horas aproximadamente, preferiblemente en 20 horas aproximadamente. Los periodos de tiempo suficientes para llevar a cabo la inducción de CTL a partir de una mezcla de células pueden ser modulados mediante el ajuste de varios factores incluyendo, por ejemplo, la cantidad de antígeno o de moléculas coestimuladoras presentada a una célula dendrítica en una mezcla de una población de tipos celulares.

Los expertos en la técnica sabrán qué factores, composiciones o concentraciones celulares, por ejemplo, pueden ser utilizados para conseguir un tiempo de incubación deseado. Además, los expertos en la técnica sabrán o podrán determinar qué factores, composiciones o concentraciones celulares, por ejemplo, pueden ser ajustados para aumentar o disminuir el periodo de tiempo suficiente para estimular los TL CD8^{+} y convertirlos en CTLs maduros selectivos para una célula diana patológicamente aberrante.

Por ejemplo, para determinar el tiempo de incubación requerido para que se produzcan los CTLs, pueden retirarse células del cultivo a varios puntos de tiempo, por ejemplo a los 5, 15, 30 y 45 minutos y a intervalos de una hora durante uno o más días o semanas, y analizarlas para determinar la actividad CTL o la producción de interferón gamma después del reconocimiento del antígeno diana. Las células patológicamente aberrantes que presenten el antígeno diana serán destruidas por los CTLs selectivos, ya sea por lisis o por la inducción de apoptosis en las células diana. La actividad CTL puede ser medida mediante métodos bien conocidos en la técnica. Los métodos para medir la actividad citotóxica se describen con detalle más adelante y en los ejemplos.

Factores específicos que pueden ser utilizados adicionalmente en los métodos de la invención incluyen IL-12 y CD40L. La concentración de IL-7, un factor requerido por los métodos de la presente invención, utilizada en una mezcla cultivada ex vivo de al menos células dendríticas, células apoptóticas patológicamente aberrantes y TL CD8^{+}, con o sin células T CD4^{+}, puede ser, por ejemplo, 1-30 ng/ml, 30-65 ng/ml o 65-100 ng/ml. La concentración de IL-12 en una mezcla cultivada ex vivo de células dendríticas, células apoptóticas patológicamente aberrantes y TL CD8^{+} puede ser, por ejemplo, 1-30 pg/ml, 30-65 pg/ml o 65-100 pg/ml. La cantidad eficaz de CD40L presentado como proteína de la superficie celular en una célula natural o en una célula recombinante que exprese CD40L para utilización en una mezcla cultivada ex vivo de células dendríticas, células apoptóticas patológicamente aberrantes y TL CD8^{+}, puede ser determinada por los expertos en la técnica. Los expertos en la técnica sabrán que el nivel de expresión de CD40L en células recombinantes puede ser modulado, y que las células con CD40L pueden ser valoradas en una mezcla de reacción para determinar la concentración eficaz de células que ha de ser añadida. Los expertos en la técnica serán capaces de extrapolar a partir de tal concentración eficaz de células con el fin de determinar una cantidad eficaz de proteína CD40L aislada o sustancialmente aislada para inducir CTLs selectivos para una célula patológicamente aberrante utilizando los métodos de la invención.

Para ser utilizada en los métodos de la invención, una célula puede ser irradiada. Puede ser ventajoso irradiar una célula particular antes de la producción de la mezcla celular para inducir CTLs selectivos para una célula patológicamente aberrante, cuando no se desee el crecimiento de la célula particular durante el periodo de inducción. Por ejemplo, una célula tal como una célula dendrítica, una célula T CD4^{+} y una célula patológicamente aberrante pueden ser irradiadas debido a que el crecimiento o la expansión de estos tipos celulares puede no ser deseado, ya que un número incrementado de células puede no ser necesario para que tenga lugar el proceso de inducción, y la expansión de tipos celulares que crezcan a velocidades más rápidas que una célula T CD8^{+} podría proporcionar una contaminación innecesaria de la población de CTLs generada.

Según se discutió previamente, las células para ser utilizadas en los métodos de la invención pueden ser una mezcla de células o una célula aislada. La preparación de TL CD8^{+} y células T CD4^{+}, células dendríticas y células patológicamente aberrantes puede incluir el aislamiento de una célula. Una célula para ser utilizada en los métodos de la invención puede ser aislada mediante varios métodos bien conocidos en la técnica tales como, por ejemplo, centrifugación en gradiente de densidad, elutriación centrífuga, selección de células activadas por fluorescencia, separación de células por inmunoafinidad y selección magnética (Schindhelm y Nordon, Ex vivo Cell Therapy (1999) Capítulo 11, Academic Press, San Diego).

La centrifugación en gradiente de densidad está basada en la migración de las células de una densidad particular cuando son centrifugadas en una solución de densidad variable. Las células tienden a acumularse en una banda en la zona del gradiente en la cual la densidad celular y la densidad del medio son iguales. Ejemplos de métodos de centrifugación en gradiente de densidad incluyen la carga de células en gradientes preparados con reactivos tales como Ficoll, Ficoll-Hypaque y Percoll.

La elutriación centrífuga es un método basado en las diferencias relativas de la velocidad de sedimentación celular que ha sido bien desarrollado para separar células sanguíneas. La selección de células activadas por fluorescencia (FACS) es un método de separación celular selectivo mediante el cual células marcadas con moléculas marcadoras fluorescentes son analizadas individualmente y seleccionadas sobre la base de las propiedades de dispersión de la luz y de la fluorescencia.

La separación de células por inmunoafinidad esta basada en la interacción de las células con un sustrato, tal como un anticuerpo monoclonal, una lectina u otro dominio de unión, que está inmovilizado en un material con una baja afinidad celular intrínseca. Las células se fijan selectivamente al sustrato a través de la unión de moléculas en la superficie celular al sustrato unido al soporte de fase sólida. Las células capturadas son desprendidas utilizando la tensión de cizallamiento o agentes químicos que rompen la interacción entre la célula y el sustrato.

La selección magnética es un método de separación celular en el cual las células son marcadas con un sustrato de afinidad que contiene un material paramagnético o ferromagnético. Las células marcadas magnéticamente pueden ser extraídas de una población celular mediante captura con un campo magnético, o las células marcadas pueden ser recuperadas por la retirada del campo magnético. Las "Dynabeads" son un ejemplo específico de medio de separación de células magnéticas que está disponible comercialmente.

Ejemplos de métodos específicos para el aislamiento de TL CD8^{+} son los métodos de selección de células magnéticas negativos tales como la eliminación de células CD4^{+}, CD14^{+}, CD19^{+} o CD56^{+}, utilizando esferas revestidas con anticuerpos hacia proteínas de la superficie celular presentes en las células que van a ser eliminadas, o los métodos de selección de células magnéticas positivos, tal como la selección positiva de CD8 con esferas magnéticas revestidas con anticuerpos hacia CD8.

Un ejemplo de un método para aislar células dendríticas es recoger PBMC, tal como mediante centrifugación en un gradiente de densidad con Ficoll-Hypaque y el cultivo de las mismas bajo condiciones que estimulen la diferenciación de células dendríticas, según se describió anteriormente. Las células dendríticas pueden ser aisladas además de las PBMC mediante otros métodos conocidos, tal como mediante la eliminación de otros tipos celulares, incluyendo las células positivas para CD2, CD19 y CD56.

Métodos específicos para aislar células T CD4^{+} son, por ejemplo, la separación negativa de células magnéticas para reducir o eliminar los TL CD8^{+} de una población celular, y la separación positiva de células magnéticas para obtener una población enriquecida de células T CD4^{+}.

El método para aislar una célula patológicamente aberrante estará determinado por el tipo celular y por la pureza deseada de la preparación. Los expertos en la técnica conocerán qué métodos, incluyendo los métodos anteriormente descritos, son aplicables para el aislamiento de una célula patológicamente aberrante particular.

Las poblaciones de TL CD8^{+} y células T CD4^{+}, células dendríticas y células patológicamente aberrantes utilizadas en el método de la invención pueden ser obtenidas de múltiples fuentes. Por ejemplo, las células pueden ser obtenidas de un individuo que padezca una condición patológica para ser tratada utilizando un CTL, o de un individuo que sea sustancialmente histocompatible con el individuo receptor. Tal individuo puede ser, por ejemplo, un hermano con idéntico HLA, o un pariente con igual HLA o un individuo no relacionado con igual HLA. Los métodos para tipificar los antígenos de histocompatibilidad son bien conocidos en la técnica. Utilizando tales métodos de tipificación de antígenos, los expertos en la técnica sabrán o podrán determinar qué nivel de similitud de antígenos es necesario para que una célula sea inmunológicamente compatible con un individuo receptor. Las diferencias tolerables entre la célula de un donante y de un receptor pueden variar con los diferentes tejidos y son conocidas o pueden ser fácilmente determinadas por los expertos en la técnica. Los métodos para determinar la compatibilidad de antígenos para un trasplante son bien conocidos por los expertos en la técnica.

Un célula para ser utilizada en los métodos de la invención puede ser obtenida de una variedad de tejidos u órganos de un individuo. Los expertos en la técnica sabrán cómo determinar qué fuente de un tipo celular particular es la más adecuada para la preparación de CTLs selectivos para una célula patológicamente aberrante. Puede ser posible recoger una célula de más de una fuente en un individuo, tal como de más de un tejido. Los expertos en la técnica serán capaces de determinar qué fuente específica de una célula particular es la preferida, teniendo en cuenta el número de células necesario y la accesibilidad del tipo celular en el organismo del individuo. Por ejemplo, un tipo celular particular puede ser más abundante en un tejido en comparación con otro tejido, o un tejido particular puede ser más accesible para recoger células. Un ejemplo es que un tejido tal como la sangre es más accesible que un tejido tal como la médula ósea, ya que las células sanguíneas pueden ser extraídas de un individuo mediante un procedimiento relativamente no invasivo.

Los TL CD8^{+} y las células T CD4^{+} pueden ser obtenidas, por ejemplo, de la sangre, de la médula ósea o de otro tejido de un individuo tal como un individuo histocompatible o un receptor de CTL. Los TL CD8^{+} preferidos del método son TL CD8^{+} que tienen igual HLA que el receptor de los CTLs selectivos. Las células T CD4^{+} pueden ser autólogas respecto a las CD8^{+,} o bien pueden ser heterólogas. Una célula T CD4^{+} para ser utilizada en los métodos de la invención es alorreactiva con una célula dendrítica o comparten la Clase II del MHC.

Las células dendríticas, o los monocitos capaces de diferenciarse en células dendríticas, pueden ser obtenidos de varios tejidos de un individuo para su utilización en los métodos de la invención. Por ejemplo, las células dendríticas o los monocitos pueden ser obtenidos de la sangre, de la médula ósea o de otro tejido de un individuo.

Una célula patológicamente aberrante para ser utilizada en los métodos de la invención puede ser obtenida de muchas fuentes. Una fuente es un individuo que recibirá inmunoterapia adoptiva utilizando CTLs generados por los métodos de la invención. Una célula patológicamente aberrante puede ser una célula de una población homogénea o heterogénea de células, o bien puede ser una célula aislada. Las células patológicamente aberrantes incluyen células extraídas de un individuo, tal como de un tumor o de otro tejido u órgano enfermo. El método de inducción de CTLs selectivos para células patológicamente aberrantes es aplicable a células, a poblaciones celulares homogéneas o heterogéneas, a células de fuentes naturales tales como tejidos y órganos, a células cultivadas, a células cultivadas que hayan sido alteradas tal como mediante infección por un agente patológico o por transducción con ácidos nucleicos. Además, puede utilizarse una amplia variedad de antígenos incluyendo, pero sin limitarse a, lisados celulares, vesículas, fracciones celulares o componentes celulares, una proteína o una mezcla de péptidos eluidos de la célula aberrante.

Las células patológicamente aberrantes de la invención pueden ser células apoptóticas patológicamente aberrantes. Las células apoptóticas patológicamente aberrantes pueden estar presentes en una población de células patológicamente aberrantes, pueden ser aisladas de una población de células patológicamente aberrantes o pueden ser inducidas en células patológicamente aberrantes mediante varios métodos. La inducción de la apoptosis ha sido llevada a cabo de una variedad de formas, dependiendo del tipo celular (para una revisión ver McConkey y col. (1996) Molecular Aspects of Medicine 17:1).

La apoptosis puede ser desencadenada por la unión de activadores de la muerte celular tales como TNF, linfotoxina y ligando de Fas a los dominios extracelulares de receptores que son proteínas integrantes de la membrana. La activación del receptor de muerte celular da lugar a la transmisión de una señal al citoplasma que tiene como resultado la activación de los enzimas caspasa, y una cascada de acontecimientos de señalización que culminan en la muerte de la célula. Los expertos en la técnica sabrán qué reactivos inducen la apoptosis en un tipo o tipos celulares particulares. Ejemplos de reactivos que han sido utilizados para inducir la apoptosis en una o más líneas celulares incluyen actinomicina D, afidicolina, A23187, cafeína, camptotecina, cicloheximida, dexametasona, doxorrubicina, 5-fluorouracilo, hidroxiurea, estaurosporina, taxol, timidina y vinblastina (página web de Oncogene Research Products).

Varios métodos bien conocidos en la técnica pueden ser utilizados para detectar células apoptóticas. Tales métodos incluyen microscopía óptica y electrónica para detectar los cambios morfológicos que tienen lugar durante la apoptosis, citometría de flujo o centrifugación en gradiente de densidad para detectar la contracción celular característica y la granularidad incrementada, determinación de la integridad de la membrana utilizando colorantes tales como Azul Trypan, bromuro de etidio y Naranja de Acridina, medida de la fragmentación característica, no aleatoria, del ADN utilizando técnicas que incluyen análisis en gel de agarosa, marcaje de los extremos de ADN in vitro e in situ, análisis mediante PCR, "ensayos cometa" y sistemas de ELISA, la detección de la actividad de una caspasa procedente de la familia de caspasas de los enzimas proteasas que son activados durante la apoptosis, la detección de una proteína de unión a fosfatidilserina tal como anexina V, la medida de la actividad transglutaminasa tisular y la medida del flujo de iones de calcio (Promega Notes 69: technically speaking-detecting apoptosis).

Las células apoptóticas pueden ser separadas de las células no apoptóticas utilizando métodos de separación celular tales como los descritos anteriormente. Por tanto, una célula apoptótica patológicamente aberrante puede estar presente en una población de células patológicamente aberrantes que contiene de forma natural células apoptóticas, o bien en células inducidas para que contengan células apoptóticas, y puede ser aislada de tales fuentes para ser utilizada en los métodos de la invención.

Los métodos de la invención tienen como resultado la producción de CTLs selectivos para una célula patológicamente aberrante. Un CTL puede ser una población heterogénea de células, una célula aislada o una célula sustancialmente aislada. Una población de CTLs puede contener CTLs que sean selectivos para uno o más antígenos de una célula diana patológicamente aberrante. La purificación de un CTL que sea específico para una célula patológicamente aberrante puede ser llevada a cabo seleccionando un CTL que presente actividad citolítita contra la célula o antígeno diana. Los métodos para seleccionar un CTL específico para una diana y los ensayos para medir la actividad citolítica de los CTLs son bien conocidos en la técnica. Una población seleccionada de CTL puede ser purificada utilizando métodos bien conocidos en la técnica, incluyendo los métodos de separación anteriormente descritos. Una población heterogénea o aislada de CTL producida mediante los métodos de la invención, puede ser caracterizada in vitro con el fin de determinar la eficacia de una preparación de CTL particular para destruir células diana patológicamente aberrantes.

Un ejemplo de un ensayo de la actividad citolítica es un ensayo de liberación de cromo-51 (^{51}Cr). En este método, que está descrito con más detalle en el Ejemplo II, la actividad mediada por los CTLs es determinada midiendo la lisis de células diana marcadas con ^{51}Cr cultivadas. Otro ensayo para medir la función de los CTLs es un ensayo de proliferación de células diana. Un ensayo de proliferación de células diana mide la capacidad de un CTL para inhibir la proliferación de células diana in vitro. Brevemente, se recogen las células diana de una fuente apropiada incluyendo, por ejemplo, líneas celulares y células primarias aisladas de un individuo, y se suspenden en un medio de crecimiento para conseguir una concentración de 10^{4} células viables/ml aproximadamente para cada muestra a analizar. Sin embargo, la cantidad y la concentración de células diana pueden ser ajustadas de acuerdo con la disponibilidad de células diana. Se añaden a la muestra CTLs a una concentración de 10^{6} células viables/ml aproximadamente, o bien pueden sembrarse diferentes proporciones de CTL respecto a las células diana para determinar la proliferación de las células diana a diferentes concentraciones de CTL. La proporción de células efectoras respecto a células diana puede estar entre 500:1 a 0,1:1 aproximadamente. Las células son incubadas típicamente durante 1 a 24 horas aproximadamente.

Puede ser deseable el tener control sobre la duración de la vida de un CTL generado utilizando los métodos de la invención. Un método para controlar la viabilidad de una célula es introducir un gen suicida que metabolice un compuesto captado por la célula para que produzca una toxina que destruya la célula. Por ejemplo, la introducción del gen de la timidina quinasa en un CTL puede hacer que el CTL sea susceptible a la destrucción por la adición de ganciclovir. Utilizando este método, un CTL que exprese timidina quinasa puede ser eliminado si el CTL o la actividad citolítica selectiva contra la diana asociada no se necesitan o no se desean. La utilización del gen de la timidina quinasa y del sustrato suicida ganciclovir es bien conocida en la técnica. Los métodos para transportar un vector que contenga el gen de la timidina quinasa a la célula son bien conocidos en la técnica.

Pueden generarse también CTLs CD8^{+} de memoria selectivos para una célula patológicamente aberrante utilizando los métodos de la invención. Un CTL CD8^{+} de memoria selectivo para una célula patológicamente aberrante puede ser obtenido cultivando CTL con actividad citolítica selectiva hacia una célula patológicamente aberrante durante dos o más generaciones. Un CTL CD8^{+} de memoria tiene la capacidad de responder al antígeno más eficazmente que un TL CD8^{+} sin activación previa ("naïve"), y puede ser reestimulado con antígeno en un cultivo ex vivo. Un CTL CD8^{+} de memoria puede ser distinguido de un CTL en un cultivo ex vivo, ya que el CTL CD8^{+} de memoria tiene capacidad para experimentar múltiples reestimulaciones, típicamente al menos cinco reestimulaciones. El aislamiento de un TL CD8^{+} de memoria selectivo para una célula patológicamente aberrante puede ser conseguido mediante métodos bien conocidos en la técnica, incluyendo los métodos anteriormente descritos.

Un CTL que sea selectivo para un antígeno diana de una célula patológicamente aberrante es útil para las mismas aplicaciones terapéuticas que un CTL selectivo para una célula patológicamente aberrante, ya que el resultado del reconocimiento del antígeno diana es la lisis de la célula por el CTL selectivo para el antígeno diana. Por tanto, los CTLs selectivos para un antígeno diana generados en un cultivo ex vivo pueden ser útiles para inmunoterapia adoptiva.

Según se discutió previamente, la utilización de CTLs específicos para antígenos diana que sean antígenos peptídicos no ha tenido un éxito predecible. Este procedimiento podría ser mejorado por la inclusión de un factor que pudiera incrementar la probabilidad de producir un CTL selectivo para un antígeno diana. Los métodos de la invención proporcionan la ventaja de una eficacia incrementada en la producción de CTL mediante la utilización de IL-7 en una mezcla de células en cultivo ex vivo. La utilización de IL-7, según se proporciona en los métodos de la invención, incrementa la eficacia de la producción de una respuesta CTL hacia células diana e incrementa de este modo la probabilidad de que se produzca un CTL selectivo para un antígeno diana.

La invención proporciona un método para inducir TL CD8^{+} selectivos para uno o más antígenos diana ex vivo. El método consiste en la puesta en contacto de dichos uno más antígenos diana con una mezcla que tenga al menos células dendríticas (DC), células T CD4^{+}, TL CD8^{+} e IL-7, y el cultivo de dichos uno más antígenos diana con dicha mezcla durante un tiempo suficiente para generar linfocitos T citolíticos (CTL) CD8^{+} con inmunorreactividad selectiva hacia dichos uno más antígenos diana.

Se describe también en la presente un método para identificar un antígeno selectivo de una célula patológicamente aberrante. Los CTLs que han sido generados contra la célula patológicamente aberrante o sus productos, utilizando los métodos de la invención, pueden ser utilizados para identificar el antígeno que reconocen. Esto puede ser conseguido utilizando procedimientos conocidos por los expertos en la técnica. Uno de tales métodos consiste en purificar el MHC de Clase I de la célula patológicamente aberrante y liberar los péptidos asociados con el mismo. La mezcla de péptidos es posteriormente separada en fracciones y analizada para determinar la fracción que contiene el péptido antigénico. Se determina posteriormente la secuencia del péptido utilizando técnicas disponibles (tal como las técnicas de Argonex, Charlottesville, VA, que están disponibles comercialmente; y Hunt y col., Science (1992) 255:5049). El material limitante para la utilización de estas técnicas es el TL CD8^{+} específico para el antígeno, el cual es proporcionado utilizando los métodos de la presente invención.

Otro método descrito consiste en: (a) el tratamiento de una célula patológicamente aberrante con un agente mutágeno para producir una población mutante de células patológicamente aberrantes; (b) la puesta en contacto de dicha población mutante de células patológicamente aberrantes con un CTL selectivo para dicha célula patológicamente aberrante con el fin de identificar una célula patológicamente aberrante mutante que haya perdido su reactividad con dicho CTL; (c) la introducción de una población expresable de ácidos nucleicos que codifiquen polipéptidos de una célula patológicamente aberrante en dicha célula mutante con el fin de producir una población de células mutantes que expresen dichos polipéptidos y (d) la identificación de una célula mutante que exprese un polipéptido de una célula patológicamente aberrante que restaure la reactividad con dicho CTL selectivo para dicha célula patológicamente aberrante.

Puede utilizarse una población de CTLs selectivos para una célula patológicamente aberrante o para un antígeno diana con el fin de identificar un antígeno selectivo para la célula patológicamente aberrante. Las poblaciones de CTLs utilizadas para identificar antígenos selectivos pueden presentar, por ejemplo, reactividad poliespecífica o monoespecífica hacia la célula patológicamente aberrante. El método para identificar un antígeno de una célula patológicamente aberrante o un antígeno diana desconocido, implica la obtención de una población de células diana patológicamente aberrantes que hayan sido mutadas de tal manera que no esté ya presente un antígeno reconocido por un CTL selectivo para una célula patológicamente aberrante, la introducción de una biblioteca de ADNc en las células patológicamente aberrantes deficientes en el antígeno y la selección de una célula patológicamente aberrante que exprese un ADNc que restaure la capacidad de un CTL para reconocer la célula patológicamente aberrante. Posteriormente se rescata el ADNc de la célula y se secuencia para determinar la identidad del antígeno diana.

La mutagénesis de una población de células patológicamente aberrantes puede ser realizada utilizando métodos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, las células pueden ser mutadas mediante métodos tales como irradiación o tratamiento con mutágenos químicos, tal como metanosulfonato de etilo. Una célula mutada que conserve aún la Clase I y la maquinaria de procesamiento de antígenos, y no sea reconocida por un CTL selectivo para la célula patológicamente aberrante, puede ser identificada ya que no será lisada por el CTL. La introducción de una biblioteca de ADNc en las células en las que se ha eliminado el antígeno puede ser llevada a cabo por métodos bien conocidos en la técnica, tales como transfección utilizando reactivos químicos y electroporación. Una célula transducida que puede ser reconocida por un CTL contiene un ADNc que codifica una proteína que es reconocida por el CTL. La identificación de una célula en la que se ha restaurado el antígeno puede ser llevada a cabo sometiendo a selección una población de células transducidas utilizando la actividad funcional de los CTLs selectivos para la célula patológicamente aberrante. Posteriormente se lleva a cabo el rescate y la secuenciación del ADNc utilizando métodos bien conocidos en la técnica.

Se describe además un método para identificar un antígeno selectivo para una célula patológicamente aberrante. El método consiste en: (a) la puesta en contacto de uno o más antígenos sospechosos de ser selectivos para una célula patológicamente aberrante con un CTL selectivo para una célula patológicamente aberrante que exprese dichos uno o más antígenos y (b) la determinación de la inmunorreactividad de dicho CTL selectivo para una célula patológicamente aberrante que expresa dichos uno o más antígenos hacia dichos uno o más antígenos, en el que un CTL con inmunorreactividad selectiva para dichos uno o más antígenos caracteriza dichos uno o más antígenos inmunorreactivos como selectivos para dicha célula patológicamente aberrante.

Puede utilizarse también una población de CTLs selectivos para una célula patológicamente aberrante o para uno o más antígenos diana generados utilizando los métodos de la invención, para identificar o corroborar la selectividad de uno o más antígenos diana sospechosos de ser selectivos para una célula patológicamente aberrante y, por tanto, estar asociados con una enfermedad o condición particular. Brevemente, el método implica la selección de uno o más antígenos diana con una población de CTL o con un clon de CTL selectivos para una célula patológicamente aberrante que exprese los uno o más antígenos sospechosos. La inmunorreactividad selectiva de los CTLs hacia el antígeno sospechoso indica o confirma la selectividad del antígeno para la célula patológicamente aberrante. De manera similar, los antígenos sospechosos pueden ser seleccionados mediante la expresión primeramente de los antígenos en una célula huésped y la determinación posterior de la actividad citolítica de los CTLs hacia las células que expresen los antígenos sospechosos. Una actividad citolítica selectiva indica o confirma la selectividad de los uno o más antígenos para la célula patológicamente aberrante. La células que expresan uno o más de los antígenos sospechosos pueden ser, por ejemplo, células que existen en la naturaleza o células modificadas con ácidos nucleicos expresables que codifican el antígeno diana sospechoso. Los métodos para modificar células con ácidos nucleicos e identificar la expresión de polipéptidos en las células son bien conocidos en la técnica.

Un antígeno identificado utilizando el método anterior puede ser utilizado como diana para el desarrollo de agentes terapéuticos. Por ejemplo, bibliotecas de compuestos y péptidos de molécula pequeña pueden ser sometidas a selección para identificar moléculas que se unan específicamente a un antígeno, o bien pueden producirse anticuerpos terapéuticos específicos hacia el antígeno. Un antígeno identificado utilizando este método puede ser utilizado también para el desarrollo de métodos de diagnóstico.

Los CTLs selectivos para una célula patológicamente aberrante generados utilizando los métodos de la invención, son aplicables en el tratamiento de condiciones o enfermedades humanas en las que está implicada la célula patológicamente aberrante. Los CTLs en los que se ha determinado que tienen actividad citolítica selectiva en ensayos funcionales in vitro o in situ, tales como los descritos anteriormente, es probable que tengan actividad citolítica selectiva en un individuo, ya que un CTL reconocerá la célula o el antígeno diana en una población heterogénea. Por tanto, se proporcionan en la invención métodos para tratar a un individuo con un CTL, incluyendo un CTL de memoria, selectivo para una célula patológicamente aberrante o para un antígeno diana, generado utilizando los métodos de la invención.

Se describe también un método para tratar a un paciente que tenga una enfermedad mediada por una célula patológicamente aberrante. El método consiste en la administración de una cantidad eficaz de un CTL CD8^{+} que tenga actividad citolítica selectiva hacia dicha célula patológicamente aberrante; siendo producido dicho CTL CD8^{+} con actividad citolítica selectiva hacia dicha célula patológicamente aberrante utilizando los métodos de la invención.

Se describe además un método para tratar a un paciente que tenga una enfermedad mediada por una célula patológicamente aberrante de leucemia de células no B. El método consiste en la administración de una cantidad eficaz de un CTL CD8^{+} con actividad citolítica selectiva hacia dicha célula patológicamente aberrante de leucemia de células no B, siendo producido dicho CTL CD8^{+} con actividad citolítica selectiva hacia dicha célula patológicamente aberrante de leucemia de células no B mediante los métodos de la invención.

Se describe además un método para tratar a un paciente que tenga una enfermedad mediada por una célula patológicamente aberrante. El método consiste en la administración de una cantidad eficaz de un CTL CD8^{+} con inmunorreactividad selectiva hacia uno o más antígenos diana asociados con dicha célula patológicamente aberrante, siendo producido dicho CTL CD8^{+} con inmunorreactividad selectiva mediante los métodos de la invención.

Según se describió previamente, existen muchos tipos de células patológicamente aberrantes, todas las cuales se distinguen de las células normales. Las células patológicamente aberrantes pueden tratadas con un CTL porque un CTL selectivo para una célula patológicamente aberrante puede reconocer selectivamente y destruir esa célula dentro de una población de células normales. Por tanto, la utilización de CTLs que están dirigidos selectivamente hacia células patológicamente aberrantes es aplicable para el tratamiento de individuos en los cuales la destrucción de tales células puede reducir la gravedad de la enfermedad o disminuir la velocidad de progresión de la enfermedad.

Los expertos en la técnica sabrán cómo determinar si el tratamiento con CTLs selectivos para una célula patológicamente aberrante es beneficioso para una condición patológica particular, y sabrán cómo determinar la presencia de una célula patológicamente aberrante en un individuo que tenga una condición patológica. Los expertos en la técnica podrán determinar si las células patológicamente aberrantes de una enfermedad pueden ser eliminadas sin causar efectos no deseados en un individuo. Por ejemplo, es ventajoso eliminar una célula tumoral que no tenga una función beneficiosa en el organismo. Sin embargo, la eliminación de una célula que esté enferma pero que desempeñe no obstante una función en el organismo, tal como una célula esencial de un órgano, no es generalmente deseada. Sin embargo, existen ciertos órganos no vitales y células de órganos vitales o no vitales que pueden se eliminados sin afectar a la supervivencia del individuo, incluyendo por ejemplo, pero sin limitarse a, la próstata, el ovario, la mama, el tiroides, el timo, tipos celulares seleccionados de órganos vitales y no vitales o células B que sintetizan IgE. En este caso, pueden utilizarse CTLs que reconozcan un autoantígeno que sea compartido por una célula enferma y una célula o tejido u órgano normal.

La cantidad de CTLs eficaz para tratar una condición patológica es una cantidad requerida para producir una disminución de la población de células diana o la disminución de la velocidad de incremento de la población de células diana. La dosis terapéuticamente eficaz dependerá de, por ejemplo, la condición patológica caracterizada por la célula patológicamente aberrante que va a ser tratada, la vía y la forma de administración, el peso y la condición del individuo y terapias previas o simultáneas. Por ejemplo, células patológicamente aberrantes que estén localizadas en una región del organismo de un individuo pueden ser tratadas eficazmente mediante la inyección de CTLs en ese lugar particular.

La dosis inyectada puede variar dependiendo del tamaño de la población de células patológicamente aberrantes, de tal manera que una población de células relativamente grande puede requerir una dosis relativamente grande de CTLs. El peso de un individuo puede hacer que la dosificación de CTLs sea administrada por vía sistémica tal como, por ejemplo, infusión intravenosa. Por ejemplo, para el tratamiento de un individuo con cáncer hematopoyético en el que las células patológicamente aberrantes están circulando en la sangre, la dosis eficaz estará determinada, al menos en parte, por el peso corporal del individuo, de tal manera que la concentración de CTLs administrados sea aproximadamente la misma para individuos con bajo peso corporal, tales como niños, y para individuos con mayor peso corporal, tales como adultos.

La dosis eficaz apropiada para una aplicación particular de los métodos puede ser determinada por los expertos en la técnica utilizando las directrices proporcionadas en la presente. Por ejemplo, la cantidad puede ser extrapolada de ensayos in vitro o in vivo según se describió previamente. Una persona con experiencia en la técnica reconocerá que la condición del paciente puede ser monitorizada a lo largo del curso de la terapia y que la cantidad de la preparación de CTL que es administrada puede ser por consiguiente ajustada.

La cantidad eficaz de CTLs selectivos para una célula patológicamente aberrante que va a ser administrada puede ser determinada por los expertos en la técnica, que sabrán cómo realizar ensayos para determinar la eficacia de una dosis de CTLs utilizada para tratar una enfermedad o condición particular. Los expertos en la técnica pueden determinar también si los CTLs selectivos para una célula patológicamente aberrante pueden ser administrados más eficazmente como una única dosis o como dosis múltiples.

Una preparación de CTLs puede ser administrada sistémicamente, tal como mediante infusión intravenosa, o bien puede ser administrada localmente en el lugar de la condición patológica, tal como mediante inyección. Los lugares apropiados para la administración de una preparación de CTLs son conocidos, o pueden ser determinados, por los expertos en la técnica dependiendo de las indicaciones clínicas del individuo que esté siendo tratado.

Un CTL selectivo para una célula patológicamente aberrante puede ser administrado como una suspensión junto con un medio farmacéuticamente aceptable. Tal medio farmacéuticamente aceptable puede ser, por ejemplo, una solución salina tamponada. Los medios farmacéuticamente aceptables pueden ser estériles o estar sustancialmente libres de partículas y organismos contaminantes. Los expertos en la técnica sabrán o será capaces de determinar medios farmacéuticamente aceptables para que los CTLs sean utilizados en diferentes modos de administración.

Una condición patológica puede ser tratada con un CTL, un CTL de memoria o una combinación de un CTL y un CTL de memoria que sean selectivos para una célula patológicamente aberrante. El CTL y el CTL de memoria pueden ser administrados simultáneamente o en ocasiones separadas. La administración de un CTL de memoria puede proporcionar la ventaja de inmunidad de larga duración frente a una célula patológicamente aberrante y puede prevenir de este modo una recaída de la enfermedad. Los expertos en la técnica sabrán o podrán determinar qué tipo de CTL utilizar para el tratamiento eficaz de una enfermedad o condición particular.

Los métodos descritos para tratar una condición patológica caracterizada por el crecimiento de células aberrantes pueden ser adicionalmente puestos en práctica junto con otras terapias. Por ejemplo, para el tratamiento del cáncer, los métodos de la invención pueden ser puestos en práctica antes, durante o después de los tratamientos convencionales contra el cáncer tales como cirugía, quimioterapia, incluyendo la administración de citoquinas y factores de crecimiento, radiación u otros métodos conocidos en la técnica. De manera similar, para el tratamiento de condiciones patológicas, incluyendo enfermedades infecciosas, los métodos de la invención pueden ser puestos en práctica antes, durante o después de los tratamientos convencionales, tales como la administración de antibióticos, contra los agentes infecciosos u otros métodos conocidos en la técnica. El tratamiento de las condiciones patológicas de las enfermedades autoinmunes puede ser también llevado a cabo combinando los métodos de eliminación de células CTL selectivas de la invención con tratamientos convencionales para las enfermedades autoinmunes particulares. Los tratamientos convencionales incluyen, por ejemplo, quimioterapia, terapia con esteroides, terapia con insulina y otros factores de crecimiento y terapia con citoquinas, inmunidad pasiva, inhibidores de la unión al receptor de células T y vacunación contra el receptor de células T. Puede ser ventajoso tratar a un individuo que reciba CTLs selectivos para una célula patológicamente aberrante con un inmunoestimulante. Los expertos en la técnica serán capaces de determinar el inmunoestimulante particular y el tiempo y el modo de administración apropiados de un inmunoestimulante.

Los métodos descritos en la presente pueden ser administrados junto con estos u otros métodos conocidos en la técnica y a varios tiempos antes, durante o después del inicio de los tratamientos convencionales. Para una descripción de los tratamientos de condiciones patológicas caracterizadas por el crecimiento de células aberrantes ver, por ejemplo, The Merck Manual, Decimosexta Edición (Berkow, R., Editor) Rahway, NJ.

De manera similar, pueden emplearse adicionalmente otros métodos de terapia celular bien conocidos en la técnica junto con los CTLs selectivos generados por los métodos de la invención. Tales otros métodos incluyen, por ejemplo, terapia de sustitución celular para la regeneración o reconstitución de tejidos y componentes celulares de los mismos, y terapia celular utilizando células genéticamente modificadas para la producción de una proteína o una macromolécula terapéutica. Ejemplos específicos de terapia de sustitución celular incluyen la terapia con células madre y células progenitoras hematopoyéticas, que puede ser utilizada, por ejemplo, para reconstituir las células de la médula ósea extirpada en pacientes con cáncer, y la terapia con células madre y progenitoras neuronales para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson. La terapia celular para la producción de una proteína terapéutica incluye, por ejemplo, el trasplante de una variedad de tipos celulares y progenitores de los mismos genéticamente modificados para producir, por ejemplo, insulina, otras citoquinas, factores de crecimiento y enzimas. Tales terapias celulares genéticas son aplicables a, por ejemplo, el tratamiento de la diabetes, del cáncer. Otros varios ejemplos de terapia de sustitución celular y de terapia celular genética son bien conocidos en la técnica y son aplicables de manera similar para ser utilizados junto con los CTLs selectivos producidos por los métodos de la invención.

La administración de CTLs selectivos para una célula patológicamente aberrante puede ser simultánea con, o suministrada en administraciones alternas con, la terapia convencional, incluyendo administraciones múltiples. La administración simultánea puede ser, por ejemplo, junta en la misma formulación o en diferentes formulaciones suministradas al mismo tiempo aproximadamente o secuencialmente de forma inmediata. Las administraciones alternas pueden ser, por ejemplo, el suministro de una preparación de CTL y el tratamiento terapéutico convencional en administraciones separadas temporalmente. Según se describió previamente, las administraciones separadas temporalmente de CTLs selectivos y la terapia convencional pueden utilizar de manera similar diferentes modos y vías de administración.

Se describe también en la presente la preparación de células dendríticas maduras. Las células dendríticas maduras producidas mediante los métodos de esta invención pueden ser posteriormente utilizadas para vacunación, incluyendo la administración en combinación con la transferencia adoptiva de CTLs. Este método comprende la preparación de células dendríticas inmaduras, según se describe en la presente, sometiendo las mismas a un pulso con un antígeno (tal como células apoptóticas, vesículas, lisados celulares, fracciones o componentes celulares, proteínas o péptidos) y un epítopo de células T cooperadoras e incubando estas células dendríticas con células T cooperadoras específicas para el epítopo cooperador asociado con el MHC de Clase II de la célula dendrítica.

Los ejemplos siguientes están destinados a ilustrar, pero no a limitar, la presente invención.

Ejemplo 1 Condiciones para la activación de la actividad citotóxica CD8^{+} por células dendríticas

Este ejemplo muestra que la estimulación de células dendríticas (DC) con CD40L o con IL-2 induce actividad CTL en TL CD8^{+} in vitro, y que la IL-7 aumenta esta respuesta.

Con el fin de determinar las condiciones óptimas para la inducción in vitro de CTLs humanos, se utilizaron DC HLA-A2 para activar linfocitos T CD8^{+} purificados (TL CD8^{+}). La respuesta a un antígeno del MHC de Clase I fue investigada, ya que la elevada frecuencia de precursores de TL CD8^{+} específicos para antígenos del MHC de Clase I permite la detección de una respuesta CTL después de solamente un ciclo de estimulación in vitro. A continuación se describe la preparación de DC HLA-A2 y de TL CD8^{+}.

Los TL CD8^{+} fueron aislados de PBMC de donantes de sangre sanos negativos para HLA-A2. Las células CD8^{+} positivas fueron recuperadas después de la selección positiva con Dynabeads y Detachabead (Dynal, Lake Success, NY) y almacenadas congeladas antes de su utilización. Después de la descongelación, se eliminaron además las células CD4^{+}, CD14^{+}, CD19^{+} y CD56^{+} con Dynabeads. El análisis con un clasificador de células activadas por fluorescencia (FACS) mostró que esta población celular era >99% CD8^{+}. Las DC fueron generadas a partir de monocitos de sangre periférica esencialmente según está descrito por F. Sallusto y A. Lanzavecchia, J. Exp. Med. (1992) 176:1693-1702. PBMC positivas para HLA-A2 de donantes de sangre sanos fueron aisladas mediante centrifugación en gradiente de densidad con Ficoll-Hypaque y suspendidas a una concentración de 4 x 10^{6}/ml en medio RPMI-FCS. De esta suspensión, se sembraron alícuotas de 15 ml en placas de cultivo de tejidos de 150 mm. Después de 90 minutos a 37ºC, las células no adherentes fueron desechadas y las placas fueron lavadas cinco veces con PBS e incubadas posteriormente a 37ºC durante 30 minutos en presencia de PBS que contenía un 2% de FCS y un 2% de EDTA. Las células adherentes fueron desprendidas mediante pipeteo seguido por rascado. En la suspensión celular se eliminaron luego además las células positivas para CD2, CD19 y CD56^{+} con Dynabeads (Dynal AS, Oslo, Noruega) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Esta población celular (<0,5% de CD3^{+} y >90% de CD14^{+}) fue sembrada en placas de seis pocillos (1,5 x 10^{6} células/pocillo) en RPMI-FCS en presencia de 500 U/ml de IL-4 humana recombinante (Genzyme, Boston, MA) y 800 U/ml de factor estimulante de colonias de granulocitos-monocitos recombinante humano, GM-CSF (Pharmingen, San Diego, CA).

La inducción de CTL específicos para HLA-A2 fue realizada en células cultivadas en RPMI 1640 suplementado con L-glutamina 2 mM, 50 \mug/ml de gentamicina, un 1% de aminoácidos no esenciales, piruvato de sodio 1 mM y un 5% de suero humano agrupado (RPMI-HS). Las DC (10^{4} células/pocillo) y las células CD8^{+} (10^{8} células/pocillo), preparadas según se describió anteriormente, fueron cultivadas en placas de 96 pocillos de fondo plano en un volumen final de 200 \mul. Las células fueron incubadas durante seis días a 37ºC antes de realizar el ensayo de actividad CTL.

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La actividad citotóxica de los CTLs fue medida cuantitativamente mediante un ensayo de liberación de ^{51}Cr utilizando células diana JY (A2^{+}) y 221 (A2^{-}) marcadas con ^{51}Cr. El ensayo fue realizado dividiendo la placa de cultivo de 96 pocillos en dos grupos de placas replicadas (96 pocillos, fondo en U). Para cada grupo, una placa contenía 15 \mul y la otra placa contenía 75 \mul del cultivo original. Un grupo recibió células diana 221 marcadas con ^{51}Cr (10^{4} células/pocillo), mientras que el otro grupo recibió células diana JY marcadas con ^{51}Cr (10^{4} células/pocillo). Con el fin de disminuir cualquier actividad citotóxica no específica del antígeno debida a la actividad NK, todos los pocillos recibieron 2 x 10^{5} células K562. Después de seis horas a 37ºC, se midió el contenido de ^{51}Cr en 100 \mul de sobrenadante, y se calculó el porcentaje de lisis específica según la fórmula: porcentaje de lisis = 100 x (liberación experimental - liberación espontánea)/(liberación máxima - liberación espontánea). Para comparar correctamente la eficacia de las diferentes condiciones ensayadas, los datos son expresados como unidades líticas (UL) 30/10^{6} células iniciales. Se define una UL como el número de células iniciales requerido para conseguir un 30% de lisis de 10^{4} células diana en un ensayo de seis horas. La actividad CTL específica es obtenida restando las UL obtenidas con las células 221 de las UL obtenidas con las células JY. El periodo de exposición o incubación de los CTLs con las células diana puede variar dependiendo de si se desean resultados cuantitativos o cualitativos. De manera general, el periodo de exposición está entre 30 minutos y seis horas aproximadamente, preferiblemente el periodo está entre dos y cinco horas aproximadamente y más preferiblemente el periodo está entre tres y cuatro horas aproximadamente. K562, una línea celular humana sensible a las células destructoras naturales (NK); 3A4-721.221, una línea celular transformada con el virus de Epstein-Barr (EBV) que ha sido mutagenizada y seleccionada para que sea Clase I negativa, y JY, una línea celular homozigota HLA-A2 transformada con EBV, fueron cultivadas en medio RPMI 1640 (Gibco, Grand Island, NJ) que contenía un 10% de suero de ternera fetal (FCS; Sigma, St. Louis, MO), L-glutamina 4 mM, un 1% de aminoácidos no esenciales, piruvato de sodio 1 mM, 2-mercaptoetanol 5 x 10^{-5} M y 50 \mug/ml de gentamicina (todos de Gibco, Grand Island, NJ) (RPMI-FCS).

Para determinar si diferentes señales de maduración de DC producían la activación de CD8^{+}, las DC fueron desafiadas con lipopolisacárido (LPS), factor de necrosis tumoral-\alpha (TNF-\alpha) o CD40L y se determinó la capacidad de las DC tratadas para inducir actividad CTL en células CD8^{+} purificadas mediante el ensayo de liberación de ^{51}Cr, según se ha descrito. Las DC preparadas según se describió anteriormente fueron tratadas con TNF-\alpha (20 ng/ml), LPS (20 ng/ml) o con ningún aditivo (DC inmaduras). Después de una incubación de 40 horas a 37ºC, las DC fueron recogidas y sembradas. Las DC fueron desafiadas con CD40L en el momento del cultivo con las células CD8^{+} mediante la adición de células transfectadas con CD40L irradiadas (25.000 rads) (Cella y col., J. Exp. Med. 184:747-752 (1996)) a las DC inmaduras.

En la Figura 1 se muestran los resultados de cuatro experimentos representativos. La actividad citotóxica inducida por DC inmaduras (inm-DC), DC tratadas con LPS (LPS-DC), DC tratadas con TNF-\alpha (TNF-DC) o DC tratadas con CD40L (CD40L-DC) indicaba que únicamente las DC tratadas con CD40L eran capaces de inducir actividad citotóxica a partir de células T CD8^{+} purificadas (Figura 1A). Se detectó actividad CTL en tres de las cuatro poblaciones de células CD8^{+} analizadas.

Con el fin de determinar si las diferencias observadas entre las DC tratadas con LPS, TNF-\alpha o CD40L en la inducción de actividad CTL a partir de células T CD8^{+} eran debidas a diferencias en la capacidad de los monocitos para procesar y presentar el antígeno, se examinaron DC inmaduras y DC maduras, los niveles de expresión de moléculas de Clase I, transportadores TAP, PA28 (un regulador de inmunoproteasomas) e inmunoproteasomas, mediante citometría de flujo (FACScan, Becton Dickinson, Milano, Italia) e inmunoprecipitación con anticuerpos adecuados. Después del tratamiento con GM-CSF e IL-4 según se describió anteriormente, las DC inmaduras resultantes mostraban una expresión incrementada de moléculas de Clase I, de transportadores TAP, de PA28 y de inmunoproteasomas de cuatro a cinco veces en comparación con los monocitos no tratados. El nivel de expresión de las moléculas de Clase I fue además incrementado dos veces tras el tratamiento con LPS, CD40L o TNF-\alpha. Los niveles de expresión de las moléculas de Clase I en las DC maduras no fueron afectados por los diferentes tratamientos, indicando que las diferencias observadas entre las DC tratadas con LPS, TNF-\alpha o CD40L en la inducción de la actividad CTL a partir de células T CD8^{+}, no eran el resultado de diferencias en la capacidad para procesar y presentar el antígeno.

Se sabe que la citoquina IL-12 tiene una función importante en el desarrollo y la función de los CTLs (Trinchieri, Ann. Rev. Immunol. (1995) 13:251-76). Se llevó a cabo un estudio para determinar si la inducción de citotoxicidad por CD40L-DC podía ser sustituida por IL-12 y/o incrementada por otras linfoquinas (Figura 1). Se midió la actividad citotóxica inducida por inm-DC o CD40L-DC en presencia de IL-12 (Figura 1B), IL-7 (Figura 1C) o IL-12 más IL-7 (Figura 1D). La adición de IL-4 o IL-6 no tuvo ningún efecto sobre la actividad citotóxica. La adición de IL-12 a DC inmaduras fue capaz de sustituir a CD40L en dos de las cuatro poblaciones de células CD8^{+} purificadas. La IL-7 no tuvo ningún efecto sobre las DC inmaduras, pero incrementó alrededor de tres veces la actividad citotóxica inducida por DC tratadas con CD40L y por DC inmaduras tratadas con IL-12. Además, en presencia de IL-7, se detectó actividad citotóxica en las cuatro poblaciones de CD8^{+}. Por tanto, el tratamiento que tuvo como resultado la inducción más consistente de una respuesta citotóxica en todos los donantes de CD8^{+}, y en todos los sistemas ensayados, fue la combinación de CD40L-DC e IL-7. Los sistemas ensayados incluían la respuesta CTL contra el superantígeno TSST, contra el péptido de la matriz restringido por A2 derivado del virus de la gripe A y contra el péptido de tirosinasa restringido por A2.

Ejemplo 2 Inducción de líneas de CTL CD8^{+} específicos para LB

Este ejemplo muestra que la actividad CTL CD8^{+} es inducida en respuesta a leucemioblastos (LB) específicos y demuestra el desarrollo de líneas de células CTL CD8^{+}.

La observación de que CD40L e IL-12 en combinación con IL-7 estimulaban eficazmente la actividad CTL de TL CD8^{+} inducida por DC, proporcionó la base para desarrollar un procedimiento para inducir CTL específicos de LB. Debido a la baja cantidad de sangre disponible procedente de donantes y receptores de BMT, los procedimientos previamente descritos fueron modificados según sigue. Brevemente, las DC se prepararon mediante la adición de IL-4 y GM-CSF directamente a PBMC adherentes aisladas de donantes de BMT inmediatamente después de que las células no adherentes fueran eliminadas. Después de un periodo de cultivo de siete días, las DC expresaban un patrón de antígenos de activación similar a un fenotipo descrito para DC en reposo activadas por manipulación mecánica (Gallucci y col., Nature Medicine (1999) 5:1249-1255). Los TL CD8^{+} fueron obtenidos mediante la eliminación negativa de células CD4^{+}.

Los estudios descritos en este ejemplo y en los ejemplos posteriores incluían cuatro pacientes pediátricos con leucemia mieloide aguda (AML), que recibieron trasplantes alogénicos de médula ósea (BMT), y sus donantes. Ninguno de los receptores de BMT experimentó recaída. El seguimiento varió de 23 a 28 meses después del trasplante. Tres pacientes (MR, GA y PM) recibieron BMT de un hermano con idéntico HLA, mientras que el paciente EV recibió BMT de un donante no emparentado de igual HLA. Los receptores de BMT fueron evaluados para determinar la actividad citotóxica específica de LB durante seis meses después del trasplante, cuando había cesado ya la terapia inmunosupresora. El consejo de revisión institucional del Department of Pediatrics Science, IRCCS Policlinico San Mateo, aprobó el protocolo.

En un estudio inicial, se indujeron CTL específicos de LB mediante la estimulación de TL CD8^{+} (CD4^{+} < 1%) utilizando LB más DC junto con IL-7 e IL-12. Se observó que los TL CD8^{+} procedentes de dos donantes de BMT (MR-don y GA-don) contenían CTLs específicos de LB después de una segunda estimulación, pero estos cultivos eran difíciles de mantener debido a que eran poco propensos a expandirse (datos no mostrados).

Para solucionar el problema de la falta de expansión de las líneas de CTL específicos para LB, se añadieron células autólogas irradiadas enriquecidas en CD4^{+} a la incubación de estimulación de los TL CD8^{+}. Este procedimiento fue utilizado para generar líneas de CTL específicos para leucemia a partir de TL CD8^{+} derivados de sangre periférica o de médula ósea de cuatro donantes de BMT (MR-don, GA-don, EV-don y PM-don). El medio utilizado fue RPMI-HS suplementado con 10 ng/ml de IL-7 y 10 pg/ml de IL-12. Se añadieron células CD8^{+} (0,5 a 1 x 10^{6} células/ml) a placas de 48 pocillos y se cocultivaron con LB del receptor de BMT irradiados (20.000 rads) (5 x 10^{5} células/ml), linfocitos CD4^{+} autólogos de los CD8^{+} irradiados (3.000 rads) (3 a 5 x 10^{5} células/ml) y DC autólogas de los CD8^{+} (2 x 10^{5} células/ml) en un volumen final de 1 ml.

Después de siete días, los cultivos fueron reestimulados con LB del receptor de BMT irradiados (20.000 rads) (5 x 10^{5} células/ml) y células nodriza adherentes irradiadas (3.000 rads) (Vitiello y col., J. Clin. Invest. 95:351-349 (1995)). Dos días después, se añadieron a los cultivos 25 U/ml de interleuquina-2 recombinante (rIL-2). Se utilizó el mismo protocolo para cada ciclo sucesivo de estimulación. Los LB fueron preparados a partir de aspirados de médula ósea heparinizados (>90% de LB) de los pacientes en el momento de su diagnóstico.

Los cultivos fueron analizados para determinar la actividad citolítica siete días después de cada reestimulación posterior contra los LB del receptor en una proporción de efector respecto a diana (E:T) de 5:1 (Figura 2). Se determinó la actividad citolítica de las líneas de CTL específicos para LB derivadas de PBMC del receptor de BMT (\Box), de PBMC del donante de BMT (\ding{110}) y de PBMC del donante de BMT 200. Las estimulaciones del cultivo celular realizadas a intervalos de siete días están representadas por II, III, IV y V en la Figura 2. La actividad citolítica de CTLs descongelados dirigidos contra LB, crioconservados después de la cuarta reestimulación, está representada como IVa. La Figura 2 (A-D), se refiere a los pares de donante/receptor MR, GA, EV, PM, respectivamente.

Este estudio reveló que no se observaba actividad citolítica después de la estimulación primaria. Sin embargo, después de la segunda estimulación (de 14 a 16 días después del cultivo inicial), se observó citotoxicidad específica de LB en todos los cultivos analizados y se mantuvo o aumentó después de una reestimulación adicional. Se observó la misma cinética y la misma magnitud de activación de CTL cuando las células CD8^{+} fueron obtenidas a partir de PBMC de los cuatro receptores de BMT (MR, GA, EV y PM) seis meses después del trasplante, cuando los sistemas hematopoyético e inmune eran originarios del donante. La capacidad citotóxica de las líneas de CTL específicos para LB no fue afectada por la crioconservación.

Se examinó la capacidad de los CTLs dirigidos contra LB para expandirse en cultivo en presencia de DC, células diana, IL-12 e IL-7, según se describió anteriormente. La Figura 3 muestra resultados representativos de la expansión celular de CTLs dirigidos contra LB derivados de PBMC del receptor EV de BMT (\ding{115}) o del donante EV de BMT (\ding{110}). Los datos representan un cálculo teórico basado en los niveles de expansión de los CTLs. Los niveles de expansión de los CTLs fueron calculados según sigue. Nivel de expansión = número total de células después de la reestimulación/número de células reestimuladas. El número inicial de células respondedoras enriquecidas en CD8^{+} fue de 10^{6}. Después de una estimulación repetida, los CTLs demostraron un incremento progresivo de la citotoxicidad y una expansión variable pero continua del número absoluto de células cultivadas. Estas células se expandieron en un rango de nueve a veinte veces en comparación con las células sembradas en el comienzo de los cultivos.

A la vista del uso potencial de las líneas de CTLs específicos para LB para inmunoterapia adoptiva, las líneas celulares fueron ensayadas frente a células no leucémicas obtenidas de pacientes antes del trasplante como control in vitro de la reacción injerto contra huésped (GVHR). Las células diana autólogas utilizadas fueron células del receptor de médula ósea (BMRC) y células T estimuladas con un mitógeno (T-PHA). Las BMRC no leucémicas fueron obtenidas antes del procedimiento de BMT y después de demostrar la remisión hematológica completa. Las líneas celulares T-PHA fueron establecidas para cada paciente mediante la estimulación de PBMC pre-trasplante crioconservadas con PHA y pases seriados en RPMI-FCS suplementado con 100 U/ml de rIL-2 (Cetus, Emeryville, CA). La mayoría de los cultivos no mostraron reactividad o bien mostraron una reactividad baja (<10% de lisis) a la proporción de efector respecto a diana (proporción E:T) más elevada analizada (hasta 40:1) contra las células BMR no leucémicas o contra T-PHA.

Para excluir la reactividad de las líneas de CTL contra antígenos del receptor, se evaluó la frecuencia de precursores de CTL (CTLp) dirigidos hacia células no leucémicas del receptor, pre-trasplante, del paciente EV mediante un ensayo de dilución limitante (LDA) según se ha descrito previamente (Montagna y col., J. Clin. Immunol. (1996) 16:107-114). El donante del paciente era un donante no emparentado con el mismo HLA. De los cuatro pares donante-receptor, este par tenía el máximo riesgo de GVHD ya que los otros tres pares eran hermanos con idéntico HLA. El análisis de la frecuencia de CTLp fue realizado para: (i) PBMC del donante antes de cualquier activación in vitro, (ii) células efectoras CD8^{+} obtenidas del donante, recuperadas después de la cuarta estimulación con células LB y (iii) células efectoras CD8^{+} obtenidas del receptor seis meses después del BMT, recuperadas después de la cuarta estimulación con células LB. Los resultados de la Tabla 2 demuestran que después de cuatro ciclos de estimulación con LB in vitro, la frecuencia de CTLp contra las células no leucémicas pre-trasplante del receptor no se incrementaba en comparación con la frecuencia obtenida a partir de las PBMC del donante antes de la estimulación con células LB.

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TABLA 2

3

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Ejemplo 3 Caracterización de las líneas de CTLs específicos para LB

Este ejemplo muestra el análisis fenotípico de las líneas de CTLs específicos para LB.

El análisis fenotípico de las líneas celulares de CTLs específicos para LB se llevó a cabo en el momento de cada ensayo de citotoxicidad. Resultados representativos obtenidos de los cultivos primarios y después de la cuarta estimulación están presentados en la Tabla 3. En los cultivos primarios, cuando la citotoxicidad dirigida contra LB era indetectable, los linfocitos CD3^{+} y/o CD8^{+} variaban entre el 32% y el 79%, mientras que estaba presente una proporción considerable de linfocitos CD56^{+} (oscilaban entre el 20% y el 66%). Después de la cuarta estimulación, la gran mayoría de las células efectoras eran linfocitos CD3^{+} y CD8^{+}, mientras que la proporción de células CD56^{+} disminuía hasta menos de un 20%. Y lo que es más interesante, las células CD4^{+} aumentaban también desde menos de un 1% antes de la estimulación hasta alrededor del 10% en el cuarto ciclo de estimulación.

TABLA 3

4

Ejemplo 4 Las líneas de CTLs específicos para LB son CD8^{+} restringidas por la clase I

Este ejemplo muestra que actividad citolítica de los CTLs estaba restringida a células CD8^{+} y al antígeno HLA de Clase I. Con el fin de determinar qué poblaciones de células T estaban mediando la lisis de las células de leucemia, los ensayos citotóxicos se llevaron a cabo en presencia de anticuerpos bloqueantes. Las células diana fueron incubadas con anticuerpos monoclonales (mAb) anti-HLA de Clase I o de Clase II (25 \mug/ml), y las células efectoras fueron incubadas con mAb específicos para CD4^{+} y CD8^{+} durante 30 minutos a 4ºC. La misma concentración de cada mAb fue añadida a los cultivos después de cuatro horas aproximadamente desde el comienzo del ensayo de citotoxicidad.

Después de tres estimulaciones in vitro, las líneas de CTL, obtenidas de PBMC de receptores de BMT (PBMC rec) y de células de médula ósea (BM don) o de PBMC (PBMC don) de donantes de BMT, fueron analizadas para determinar la actividad CTL, a una proporción E:T de 10:1, contra células diana LB en presencia de sólo medio (\Box) y de mAbs anti-HLA de Clase I (\ding{110}), anti-HLA de Clase II 200, anti-CD8^{+} 201 y anti-CD4^{+} (\trama) (Figura 4). Se muestran experimentos representativos de las líneas de CTLs específicos para LB derivadas de los pares de donante/receptor EV (Figura 4A) y PM (Figura 4B).

En todos los casos, la lisis reactiva de LB fue inhibida por los mAbs anti-HLA de Clase I y anti-CD8^{+}, pero no por los mAbs anti-HLA de Clase II y anti-CD4^{+}, indicando que las células CD8^{+} eran responsables de la citolisis. Después de una estimulación repetida, las células CD4^{+} contenidas en las líneas de CTLs específicos para LB variaban entre el 5% y el 12%. Por tanto, se llevaron a cabo experimentos de eliminación de células CD4^{+} antes de los ensayos de citotoxicidad con el fin de excluir la implicación de esta subpoblación en la mediación de la actividad citolítica. Estos resultados demostraron que la actividad citotóxica dirigida contra LB no se vio afectada por la eliminación de las células efectoras CD4^{+}.

Ejemplo 5 La lisis de LB mediada por CTLs es dependiente de perforina

Este ejemplo muestra que la citotoxicidad dirigida hacia LB es inhibida por concanamicina A y cloruro de estroncio.

La actividad citolítica de un CTL se refiere a la secreción del contenido de los gránulos secretores en el entorno inmediato de la célula diana a la cual se une. Los gránulos contienen perforinas, varios enzimas lisosómicos y proteínas de unión a calcio que destruyen la célula diana. Para identificar el mecanismo responsable de la lisis de la diana en la actividad citotóxica dirigida contra LB, se analizó la función de la ruta de exocitosis de los gránulos utilizando concanamicina A (CMA), un inhibidor de la H^{+}-ATPasa de tipo vacuolar, o bien cloruro de estroncio (SrCl_{2}), que produce desgranulación y liberación del contenido de los gránulos de las células efectoras.

Las células efectoras fueron tratadas con concanamicina A (CMA) (Sigma, Milano, Italia) a concentraciones de 1, 10 y 100 nM/l durante dos horas, o con SrCl_{2} (Sigma) a concentraciones de 5, 25 y 50 mM/l durante 18 horas, lavadas dos veces e incubadas posteriormente con LB del receptor marcados con ^{51}Cr durante ocho horas a proporciones E:T de 20:1, 10:1 y 5:1. En la Figura 5 se muestran los resultados de estudios llevados a cabo con una proporción E:T de 5:1, demostrando el efecto de CMA (Figura 5A) y de SrCl_{2} (Figura 5B) sobre la actividad citotóxica mostrada por CTLs dirigidos contra LB obtenidos de las PBMC del receptor PM (\ding{110}), de las BMC del donante de PM (\ding{115}) y de las PBMC del donante de PM (\medbullet) después de tres estimulaciones.

Por tanto, la citotoxicidad dirigida contra LB fue inhibida por el tratamiento con CMA o SrCl_{2} (inhibición media = 87%, Figura 5). Como estos reactivos bloquean selectivamente la lisis de diana basada en perforina, se concluyó que la lisis de las células diana es dependiente de perforina.

Claims

1. Un método ex vivo para inducir células T CD8^{+} selectivas para una célula patológicamente aberrante, que comprende: la puesta en contacto de una célula apoptótica patológicamente aberrante con una mezcla que tiene al menos células dendríticas (DC), células T CD4^{+} y linfocitos T CD8^{+}; el cultivo de dicha célula apoptótica patológicamente aberrante con dicha mezcla durante un tiempo suficiente para generar linfocitos T (TL) CD8^{+} con especificidad antigénica para dicha célula patológicamente aberrante; en el cual se añade IL-7 a la mezcla o al cultivo de la célula apoptótica patológicamente aberrante y la mezcla; el cultivo de dichos TL CD8^{+} con especificidad antigénica para dicha célula patológicamente aberrante durante o más generaciones; y el aislamiento de TL CD8^{+} de memoria, caracterizándose dichos TL CD8^{+} de memoria por tener la capacidad de producir TL CD8^{+} con especificidad antigénica para, y actividad citolítica contra, dicha célula patológicamente aberrante.

2. El método de la Reivindicación 1, en el que dicha célula patológicamente aberrante comprende además una célula seleccionada de un grupo que consta de una célula tumoral, una célula infectada con un agente patológico, una vesícula, una célula de un órgano no vital, una célula B, lisados celulares, fracciones celulares, componentes celulares y células productoras de una sustancia que medie una enfermedad o condición.

3. El método de la Reivindicación 1, en el que dichos TL CD8^{+} comprenden además TL CD8^{+} sin activación previa (naïve).

4. El método de la Reivindicación 1, en el que dichas DCs comprenden además DCs sustancialmente aisladas.

5. El método de la Reivindicación 1, en el que dichas células T CD4^{+} comprenden además células T CD4^{+} sustancialmente aisladas.

6. El método de la Reivindicación 1, en el que dichos TL CD8^{+} comprenden además TL CD8^{+} sustancialmente aislados.

7. El método de la Reivindicación 1, en el que dicha célula patológicamente aberrante es una célula de leucemia de células no B.

8. El método de la Reivindicación 7, en el que dicha célula patológicamente aberrante de leucemia de células no B es una célula de linfoma de células B.

9. El método de la Reivindicación 7, en el que dicha célula patológicamente aberrante de leucemia de células no B es una célula de leucemia de células T.

10. Un método ex vivo para inducir linfocitos T (TL) CD8^{+} selectivos para una célula patológicamente aberrante, que comprende:

(a): la puesta en contacto de dicha célula patológicamente aberrante con una primera mezcla que tiene al menos células dendríticas (DC) y células T CD4^{+} aisladas, durante un tiempo suficiente para producir DCs que presenten el antígeno de la célula patológicamente aberrante;

(b): la adición de TL CD8^{+} para producir una segunda mezcla;

(c): el cultivo de dicha segunda mezcla durante un tiempo suficiente para generar TL CD8^{+} con especificidad antigénica para dicha célula patológicamente aberrante;

(d): el cultivo de dichos TL CD8^{+} con especificidad antigénica para dicha célula patológicamente aberrante durante dos o más generaciones; y

(e): el aislamiento de TL CD8^{+} de memoria, caracterizándose dichos TL CD8^{+} de memoria por tener la capacidad de producir TL CD8^{+} con especificidad antigénica para dicha célula patológicamente aberrante;

en el que se añade IL-7 en al menos una de la etapa (a), la etapa (b) o la etapa (c).

11. El método de la Reivindicación 10, en el que dicha célula patológicamente aberrante comprende además una célula tumoral, una vesícula, un lisado celular, una fracción celular, un componente celular, una célula de un órgano vital o no vital, una célula B, células productoras de una sustancia que medie una enfermedad o condición, o una célula infectada con un agente patológico.

12. El método de la Reivindicación 10, en el que dichos TL CD8^{+} comprenden además TL CD8^{+} sin activación previa (naïve).