KR102358620B1

KR102358620B1 - 면역 치료를 위한 단백질 또는 단백질 단편의 유용성 예측 방법

Info

Publication number: KR102358620B1
Application number: KR1020187032652A
Authority: KR
Inventors: 마티아스 보르메어; 우구르 사힌; 바르바라 쉬뢰르스; 마르틴 뢰버; 세바스티안 뵈겔
Original assignee: 비온테크 에스이; 트론-트란슬라셔날레 온콜로기 안 데어 유니버시태츠메디진 데어 요하네스 구텐베르크-유니버시태트 마인츠 게마인뉘치게 게엠베하
Priority date: 2016-05-13
Filing date: 2017-05-10
Publication date: 2022-02-07
Also published as: SI3455625T1; MA43794B1; RU2018137721A; PL3455625T3; BR112018073221A2; EP3455625A1; US20190178871A1; WO2017194170A1; CN109073637A; LT3792628T; DK3455625T3; IL262680A; EP3792628B1; ES2826480T3; JP2022081492A; KR20190008218A; FI3792628T3; EP3792628A3; MX2022007902A; EP3455625B1

Abstract

본 발명은 백신 접종과 같은 면역 치료에 유용한 T 세포 에피토프 등의 펩티드 또는 폴리펩티드를 예측하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 종양-관련 항원 또는 에피토프, 특히 종양-관련 신생 항원 또는 네오에피토프와 같은 펩티드 또는 폴리펩티드가 면역원성인지, 특히, 백신 접종과 같은 면역 치료에 유용할지를 예측하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 특히 환자의 종양에 특이적인 백신을 제공하는 데 사용될 수 있으며, 따라서 맞춤형 암 백신을 제공하는 데 사용될 수 있다.

Description

면역 치료를 위한 단백질 또는 단백질 단편의 유용성 예측 방법

면역계의 진화는 2 가지 유형의 방어: 선천성 면역 및 적응성 면역에 기초한 매우 효과적인 네트워크의 척추 동물을 만들었다. 병원체와 관련된 일반적인 분자 패턴을 인식하는 불변 수용체에 의존하는 진화론적 선천성 면역계와 달리, 적응성 면역은 B 세포 (B 림프구) 및 T 세포 (T 림프구)상의 고도로 특이적인 항원 수용체 및 클론 선택을 기반으로 한다. B 세포는 항체의 분비에 의해 체액성 면역 반응을 일으키는 한편, T 세포는 인식된 세포의 파괴를 유도하는 세포성 면역 반응을 매개한다.

T 세포는 인간과 동물의 세포-매개된 면역에서 중심적인 역할을 한다. 특정 항원의 인식 및 결합은 T 세포의 표면상에 발현되는 T 세포 수용체에 의해 매개된다. T 세포의 T 세포 수용체 (TCR)는 주요 조직적합성 복합체(major histocompatibility complex; MHC) 분자에 결합되고 표적 세포의 표면상에 제시되는 면역원성 펩티드 (에피토프)와 상호 작용할 수 있다. TCR의 특이적 결합은 T 세포 내에서 신호 캐스케이드를 유발하여 성숙 이펙터 T 세포로의 증식 및 분화를 유도한다. 광대하고 다양한 항원들을 타겟팅할 수 있으려면, T 세포 수용체는 매우 다양할 필요가 있다.

항원-특이적 면역 치료는 전염성 질환 또는 악성 질환을 제어하기 위하여 환자 내에서 특이적 면역 반응을 증강시키거나 유도하는 것을 목표로 한다. 증가하는 수의 병원체-관련 및 종양-관련 항원을 동정함으로써, 면역 치료에 적합한 표적을 광범위하게 수집하였다. 이들 항원으로부터 유래된 면역원성 펩티드 (에피토프)를 제시하는 세포는 능동 또는 수동 면역화 전략에 의해 특이적으로 표적화될 수 있다. 능동 면역화는 질환 세포를 특이적으로 인식하고 죽일 수 있는, 항원-특이적 T 세포를 환자 내에서 유도하고 확장시키는 경향이 있다. 대조적으로, 수동 면역화는 시험관 내(in vitro) 확장되고 선택적 유전적으로 조작되는, T 세포의 입양 전달(adoptive transfer)에 의존한다 (입양 T 세포 요법; ACT).

종양 백신은 능동 면역화에 의해 내인성 종양 특이적 면역 반응을 유도하는 것을 목표로 한다. 환자에게 전달된 DC의 펄스에 의해 생체 내(in vivo) 또는 시험관 내 직접적으로 적용될 수 있는 전체 질환 세포(whole diseased cells), 단백질, 펩티드 또는 RNA, DNA 또는 바이러스 벡터와 같은 면역화 벡터를 비롯하여, 여러 가지 상이한 항원 포맷이 종양 백신 접종에 사용될 수 있다.

ACT 기반 면역 치료는 낮은 전구체 빈도에서 임상적으로 관련된 세포수까지 생체 외(ex vivo) 확장 후, 비면역 수용자에게 또는 자가(autologous) 숙주에게 전달된 이전에 감작된 T 세포를 이용한 수동 면역화의 형태로 광범위하게 정의될 수 있다. ACT의 한계를 극복하는 접근법은, 단시간의 생체 외 배양 후 환자에게 재주입하는 중에 한정된 특이성을 갖는 종양-반응성 TCR을 발현하도록 재프로그램된 자가 T 세포를 입양 전달하는 것이다.

여러 병원체-관련 및 종양-관련 항원의 발견은 항원-특이적 면역 치료 개념의 기초를 제공하였다. 종양-관련 항원(tumor-associated antigens, TAA)은 유전적 불안정성으로 인하여 종양 세포상에서 발현되는 특이한 단백질로, 정상 세포에서의 발현은 없거나 제한된다. 이들 TAA는 면역계에 의하여 악성 세포를 특이적으로 인식할 수 있다.

암은 게놈 돌연변이 및 후성적 변화(epigenetic changes)의 축적으로 인해 발생할 수 있으며, 그 중 일부는 원인이 될 수 있다. 종양-관련 항원 외에도, 인간의 암은 평균 100-120 개의 비동의적 돌연변이(non-synonymous mutations)를 가지고 있으며, 그 중 다수는 백신의 표적이 될 수 있다. 종양에서의 돌연변이 95% 이상은 고유하고 환자 특이적이다. 종양 특이적 T 세포 에피토프를 초래할 수 있는, 단백질을 변화시키는 체세포 돌연변이의 수는 30 내지 400의 범위이다.

돌연변이는 암 면역 치료에 있어서 이상적인 표적으로 간주된다. 어떠한 건강한 조직에서도 발현이 엄격히 결여된 네오에피토프는 안전한 것으로 예측되며 중추 내성 메커니즘(central tolerance mechanisms)을 우회할 수 있을 것으로 기대된다. 본 발명자들은 최근에 개개의 돌연변이의 스펙트럼을 표적화하는 맞춤형 면역 치료 접근법을 제안한 바 있다 (Castle, J. C., et al., Cancer Res 72, 1081 (2012)).

면역 치료 접근법에 있어서 매력적인 표적 구조의 수가 증가하고 있음에도 불구하고, 면역 치료를 위한 적합한 에피토프의 정의는 여전히 어렵다. 따라서, 에피토프, 특히 네오에피토프가 효과적인 면역을 유도할지, 그리고 그에 따라 면역 치료에 유용할지 여부를 예측하는 모델이 요구되고 있다.

여기서 본 발명자들은 면역원성 항원 및 에피토프가 특정 세포 이하의 구획(subcellular compartments)에서 강력하게 나타남을 보여준다.

종양 항원, 특히 돌연변이된 종양 항원에 대한 면역 반응은 종양 세포 자체에 의해 영향을 받는 것이 아니라, 종양 세포로부터 방출된 종양 항원을 수용하는 항원 제시 세포, 특히 수지상 세포에 의해 영향을 받는 것으로 알려져 있다. 또한, 효과적인 면역 반응을 달성하기 위하여, 항원 제시 세포에 의해 포획된, 방출된 종양 항원은 CD4 면역 반응 유도의 경우 MHC 클래스 II에 의해 (외인성 제시), 또는 CD8 면역 반응 유도의 경우 MHC 클래스 I에 의해 (교차 제시) 프로세싱 및 제시되어야 한다는 것도 알려져 있다. 후자의 면역 반응의 경우, 동일한 항원 제시 세포에 전달된 동일하거나 상이한 종양 항원에 대한 CD4 면역 반응의 존재가 필요하다 (Bennett et al., J. Exp. Med. 186, 65-70 (1997)).

특정한 이론에 구애됨이 없이, 종양 세포와 같은 질환 세포에서의 항원의 세포 위치(cellular localization)는 항원이 항원 제시 세포에 의해 포획 및 제시될지 여부를 결정하는 것으로 여겨진다. 종양 세포와 같은 질환 세포로부터 방출된 엑소좀은 mRNA, 단백질 및 MHC 펩티드 복합체를 함유하고 있어, 이들 성분을 항원 제시 세포로 전달할 수 있다. 엑소좀은 함입(invagination)에 의해 생성되므로, 그에 따라 식작용 막 분자(endocytic membrane molecules) 이외에도 시토졸 성분을 주로 포함한다. 따라서, 단백질과 같은 시토졸 성분은 엑소좀 내에 농축되어 있고 항원 제시 세포로 전달될 수 있다고 믿어진다. 또한, 엑소좀은 mRNA를 생산적으로 전달할 수 있는데, 이 mRNA는 RNA를 포획하는 세포 내에서 번역될 수 있다. 따라서, 특정 이론에 구애됨이 없이, 엑소좀에 포함되는 펩티드 또는 폴리펩티드, 특히 시토졸 펩티드 또는 단백질, 또는 펩티드 또는 폴리펩티드의 코딩 RNA가 본 발명에 따른 엑소좀에 포함되는 것인 펩티드 또는 폴리펩티드는, 엑소좀이 항원 제시 세포에 의해 포획되어 상기 펩티드 및 단백질이 (경우에 따라 코딩 RNA의 번역 후) 항원 제시 세포에 의해 제시되기 때문에, 면역 치료에 특히 유용하다고 믿어진다. 따라서, 엑소좀은 펩티드, 단백질 또는 RNA를 항원 제시 세포로 운반하는 소포(vesicle)이며, 프로테아제 및 리보뉴클레아제에 의한 분해로부터 상기 펩티드, 단백질 또는 RNA를 보호한다. 대안적으로, 펩티드 및 단백질이 항원 제시 세포에 의하여 수용체 의존성 메커니즘을 통해 항체와 같은 다른 분자와의 복합체로서 포획되는 것도 가능하다.

발명의 개요

일 측면에서, 본 발명은 면역 치료을 위하여 질환 세포에 의해 발현된 단백질 또는 그의 단편의 유용성을 예측하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 단백질 또는 그를 코딩하는 핵산, 또는 상기 단백질의 단편의 분포 또는 위치를 확인하는 단계를 포함한다.

일 구체예에서, 상기 방법은 단백질 또는 그를 코딩하는 핵산, 또는 상기 단백질의 단편이 생체 내 시토졸 및/또는 엑소좀 내에 위치하거나 풍부하게 존재하는지 여부를 확인하는 단계를 포함한다.

일 구체예에서, 시토졸 및/또는 엑소좀 내에서의 단백질 또는 그를 코딩하는 핵산, 또는 상기 단백질의 단편의 위치 또는 풍부한 존재는 상기 단백질 또는 그의 단편이 면역 치료에 유용함을 나타낸다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 면역 치료를 위하여 질환 세포에 의해 발현된 단백질 또는 그의 단편의 유용성을 예측하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 단백질 또는 그의 단편이 항원 제시 세포, 바람직하게는 프로페셔널 항원 제시 세포에 의해 교차 제시되는지 여부를 확인하는 단계를 포함한다.

일 구체예에서, 항원 제시 세포에 의한 단백질 또는 그의 단편의 교차 제시는 상기 단백질 또는 그의 단편이 면역 치료에 유용함을 나타낸다.

일 구체예에서, 단백질 또는 그의 단편이 항원 제시 세포에 의해 교차 제시되는지 여부를 확인하는 단계는 단백질 또는 그를 코딩하는 핵산, 또는 상기 단백질의 단편이 생체 내 시토졸 및/또는 엑소좀 내에 위치하거나 풍부하게 존재하는지 여부를 확인하는 단계를 포함한다.

일 구체예에서, 시토졸 및/또는 엑소좀 내에서의 단백질 또는 그를 코딩하는 핵산, 또는 상기 단백질의 단편의 위치 또는 풍부한 존재는 상기 단백질 또는 그의 단편이 항원 제시 세포에 의해 교차 제시됨을 나타낸다.

일 구체예에서, 단백질 또는 그의 단편이 항원 제시 세포에 의해 교차 제시되는지 여부를 확인하는 단계는 상기 단백질 또는 그의 단편에 대한 기존의 항체 반응을 확인하는 단계를 포함한다.

일 구체예에서, 단백질 또는 그의 단편에 대한 기존의 항체 반응은 상기 단백질 또는 그의 단편이 항원 제시 세포에 의해 교차 제시됨을 나타낸다.

일 구체예에서, 단백질 또는 그의 단편이 항원 제시 세포에 의해 교차 제시되는지 여부를 확인하는 단계는 상기 단백질 또는 그의 단편이 F 액틴에 결합하는지 여부를 확인하는 단계를 포함한다.

일 구체예에서, F 액틴에 대한 단백질 또는 그의 단편의 결합은 상기 단백질 또는 그의 단편이 항원 제시 세포에 의해 교차 제시됨을 나타낸다.

일 구체예에서, 단백질 또는 그의 단편이 항원 제시 세포에 의해 교차 제시되는지 여부를 확인하는 단계는 상기 단백질 또는 그의 단편이 RNA에 결합하는지 여부를 확인하는 단계를 포함한다.

일 구체예에서, RNA에 대한 단백질 또는 그의 단편의 결합은 상기 단백질 또는 그의 단편이 항원 제시 세포에 의해 교차 제시됨을 나타낸다.

본 발명의 모든 측면의 일 구체예에서, 단백질 단편은 MHC 펩티드 복합체로서 엑소좀 내에, 바람직하게는 엑소좀의 표면에 존재한다.

본 발명의 모든 측면의 일 구체예에서, 시토졸 내에서의 단백질 또는 그를 코딩하는 핵산, 또는 상기 단백질의 단편의 위치 또는 풍부한 존재는 MHC I 경로에서의 단백질, 바람직하게는 질환 세포의 단백질의 프로세싱 및 제시를 나타낸다. 일 구체예에서, MHC I 경로에서의 단백질의 프로세싱 및 제시는 CD8+ T 세포로 하여금 MHC I과 단백질 단편에 의해 형성된 복합체를 인식하도록 한다.

본 발명의 모든 측면의 일 구체예에서, 엑소좀 내에서의 단백질 또는 그를 코딩하는 핵산, 또는 상기 단백질의 단편의 위치 또는 풍부한 존재는 항원 제시 세포, 바람직하게는 프로페셔널 항원 제시 세포에서의 단백질 또는 그를 코딩하는 핵산, 또는 상기 단백질의 단편의 축적을 나타낸다. 일 구체예에서, 항원 제시 세포에서의 단백질 또는 그를 코딩하는 핵산, 또는 상기 단백질의 단편의 축적은, 바람직하게는 항원 제시 세포의 MHC I 및/또는 MHC II 경로에서의 단백질의 프로세싱 및 제시를 나타낸다. 일 구체예에서, MHC I 경로에서의 단백질의 프로세싱 및 제시는 CD8+ T 세포로 하여금 MHC I과 단백질 단편에 의해 형성된 복합체를 인식하도록 한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 면역 치료를 위하여 질환 세포에 의해 발현된 단백질 또는 그의 단편의 유용성을 예측하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 다음 단계들:

(a) 단백질 또는 그의 단편에 대한 기존의 항체 반응을 확인하는 단계,

(b) 단백질 또는 그의 단편이 F 액틴에 결합하는지 여부를 확인하는 단계, 및/또는

(c) 단백질 또는 그의 단편이 RNA에 결합하는지 여부를 확인하는 단계

중 하나 이상의 확인하는 단계를 포함한다.

일 구체예에서, 단백질 또는 그의 단편에 대한 기존의 항체 반응은 상기 단백질 또는 그의 단편이 면역 치료에 유용함을 나타낸다.

일 구체예에서, F 액틴에 대한 단백질 또는 그의 단편의 결합은 상기 단백질 또는 그의 단편이 면역 치료에 유용함을 나타낸다.

일 구체예에서, RNA에 대한 단백질 또는 그의 단편의 결합은 상기 단백질 또는 그의 단편이 면역 치료에 유용함을 나타낸다.

본 발명의 모든 측면의 일 구체예에서, 단백질 또는 그의 단편은 질환 특이적 아미노산 변형을 포함한다. 일 구체예에서, 아미노산 변형은 질환 특이적 체세포 돌연변이로 인한 것이다.

본 발명의 모든 측면의 일 구체예에서, 질환은 암이고 면역 치료는 항암 면역 치료이다.

본 발명의 모든 측면의 일 구체예에서, 단백질 단편은 MHC 결합 펩티드 또는 잠재적 MHC 결합 펩티드이다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 질환 특이적 아미노산 변형을 면역 치료에서의 이들의 유용성에 대하여 선택 및/또는 순위화하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 다음 단계들:

(i) 질환 세포에 의해 발현된 단백질을 동정하는 단계로서 상기 단백질 각각은 적어도 하나의 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 것인 단계, 및

(ii) (i)에 따라 동정된 단백질 또는 그를 코딩하는 핵산, 또는 상기 단백질의 단편의 분포 또는 위치를 확인하는 단계, 및

(iii) (i)에 따라 동정된 적어도 하나의 추가적인 단백질에 대하여 (ii)를 반복하는 단계

를 포함한다.

일 구체예에서, 단계 (ii)는 단백질 또는 그를 코딩하는 핵산, 또는 상기 단백질의 단편이 생체 내 시토졸 및/또는 엑소좀 내에 위치하거나 풍부하게 존재하는지 여부를 확인하는 단계를 포함한다.

일 구체예에서, 시토졸 및/또는 엑소좀 내에서의 단백질 또는 그를 코딩하는 핵산, 또는 상기 단백질의 단편의 위치 또는 풍부한 존재는 상기 질환 특이적 아미노산 변형이 면역 치료에 유용함을 나타낸다.

(ii) (i)에 따라 동정된 단백질 또는 상기 단백질의 단편이 항원 제시 세포, 바람직하게는 프로페셔널 항원 제시 세포에 의해 교차 제시되는지 여부를 확인하는 단계, 및

를 포함한다.

일 구체예에서, 항원 제시 세포에 의한 단백질 또는 그의 단편의 교차 제시는 상기 질환 특이적 아미노산 변형이 면역 치료에 유용함을 나타낸다.

(ii) (i)에 따라 동정된 단백질 또는 상기 단백질의 단편을 확인하는 단계로서, 다음:

중 하나 이상의 확인하는 단계, 및

를 포함한다.

일 구체예에서, 단백질 또는 그의 단편에 대한 기존의 항체 반응은 질환 특이적 아미노산 변형이 면역 치료에 유용함을 나타낸다.

일 구체예에서, F 액틴에 대한 단백질 또는 그의 단편의 결합은 상기 질환 특이적 아미노산 변형이 면역 치료에 유용함을 나타낸다.

일 구체예에서, RNA에 대한 단백질 또는 그의 단편의 결합은 상기 질환 특이적 아미노산 변형이 면역 치료에 유용함을 나타낸다.

본 발명의 모든 측면의 일 구체예에서, 질환 특이적 아미노산 변형은 MHC 결합 펩티드 또는 잠재적 MHC 결합 펩티드인 단백질 단편으로 구성된다.

본 발명의 모든 측면의 일 구체예에서, 상기 방법은 백신을 제조하는 데 사용된다. 일 구체예에서, 백신은 면역 치료에 유용한 것으로 예측되는 하나 이상의 단백질 또는 그의 단편, 또는 하나 이상의 질환 특이적 아미노산 변형으로부터 유래된다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 백신을 제공하는 방법에 관한 것으로서,

상기 방법은 본원에 기재된 임의의 측면의 방법에 의하여 면역 치료에 유용한 것으로 예측되는 하나 이상의 단백질 또는 그의 단편, 또는 하나 이상의 질환 특이적 아미노산 변형을 동정하는 단계를 포함한다. 일 구체예에서, 상기 방법은 면역 치료에 유용한 것으로 예측되는 하나 이상의 단백질 또는 그의 단편, 또는 하나 이상의 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드, 또는 상기 펩티드 또는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 백신을 제공하는 단계를 더 포함한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 임의의 측면의 방법에 따라 제조된 백신에 관한 것이다.

본 발명의 모든 측면의 일 구체예에서, 면역 치료를 위하여 질환 세포에 의해 발현된 단백질 또는 그의 단편의 유용성의 표시는 투여시 상기 단백질 또는 그의 단편이 (경우에 따라 코딩하는 핵산의 형태로) 면역원성이 될 것이라는 것을 나타낸다.

본 발명의 모든 측면의 일 구체예에서, 본원에 기재된 단백질 단편은 MHC 결합 펩티드 또는 잠재적 MHC 결합 펩티드이다 (예컨대, MHC 결합 예측은 상기 단백질 단편이 MHC에 결합할 것이라는 것을 나타낸다). 일 구체예에서, MHC 결합 펩티드는 변형된 단백질의 단편인 변형된 펩티드이다.

일 구체예에서, 단백질 또는 펩티드의 아미노산 변형은 하나 이상의 단백질-코딩 영역에서 비동의적 돌연변이를 동정함으로써 동정된다.

일 구체예에서, 아미노산 변형은 하나 이상의 세포들, 예컨대 하나 이상의 암 세포들 및 경우에 따라 하나 이상의 비암성(non-cancerous) 세포들의 게놈 또는 트랜스크립톰(transcriptome)을 부분적으로 또는 완전히 시퀀싱하고 하나 이상의 단백질-코딩 영역에서 돌연변이를 동정함으로써 동정된다. 일 구체예에서, 상기 돌연변이는 체세포 돌연변이이다. 일 구체예에서, 상기 돌연변이는 암 돌연변이이다.

일 구체예에서, 특히 암 환자와 같은 환자를 위한 맞춤형 백신을 제공하기 위하여, 변형(들)이 상기 환자에 존재하며 본 발명의 방법이 상기 환자에 대해 수행된다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 방법을 사용하여 수득 가능한 백신을 제공한다. 이러한 백신의 바람직한 구체예들이 본원에 기재되어 있다.

본 발명에 따라 제공된 백신은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있고, 경우에 따라 하나 이상의 보조제(adjuvants), 안정화제 등을 포함할 수 있다. 백신은 치료 백신 또는 예방 백신의 형태일 수 있다.

또 다른 측면은 환자에게 본 발명에 따라 제공되는 백신을 투여하는 것을 포함하는, 환자 내에서 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것이다.

또 다른 측면은 다음 단계들:

(a) 본 발명에 따른 방법을 사용하여 백신과 같은 본원에 기재된 면역 치료제를 제공하는 단계; 및

(b) 환자에게 상기 면역 치료제를 투여하는 단계

를 포함하는, 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다.

또 다른 측면은 환자에게 백신과 같은 본원에 기재된 면역 치료제를 투여하는 것을 포함하는, 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다.

일 구체예에서, 환자는 암 환자이고 백신은 항암 백신, 예컨대 투여시 암 특이적 네오에피토프를 제공하는 백신이다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 치료 방법, 특히 암의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 본원에 기재된 백신을 제공한다.

본원에 기재된 암의 치료는 외과적 절제 및/또는 방사선 치료 및/또는 전통적인 화학 요법과 조합될 수 있다.

본 발명의 기타 특징 및 이점은 이하의 상세한 설명 및 청구범위로부터 명백해질 것이다.

발명의 상세한 설명

이하에 본 발명을 상세히 설명하고 있지만, 본 발명은 본원에 기재된 특정 방법론, 프로토콜 및 시약에 한정되는 것이 아니고 다양할 수 있음을 이해하여야 한다. 또한, 본원에서 사용된 용어들은 특정 구체예를 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위를 한정하려는 의도로 해석되어서는 아니되며 본 발명의 범위는 청구범위에 의해서만 한정되는 것으로 이해되어야 한다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 통상의 기술자에게 흔히 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.

이하에서, 본 발명의 구성 요소를 설명할 것이다. 이들 구성 요소는 특정 구체예와 함께 열거되지만, 이들은 임의의 방식 및 임의의 횟수로 조합되어 부가적인 구체예를 생성할 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 다양하게 설명된 실시예 및 바람직한 구체예들은 본 발명을 단지 명시적으로 설명된 구체예들만으로 한정하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 설명은 명시적으로 설명된 구체예들과 임의의 수의 개시된 및/또는 바람직한 구성 요소들을 조합하는 구체예들를 뒷받침하고 포괄하는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본 출원에서 설명된 모든 구성 요소들의 임의의 순열 및 조합 역시, 문맥상 달리 지시되지 않는 한, 본 출원의 설명에 의해 개시된 것으로 간주되어야 한다.

바람직하게는, 본원에서 사용된 용어들은 문헌 “A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)”, H.G.W . Leuenberger , B. Nagel, 및 H. K

lbl , Eds ., (1995) Helvetica Chimica Acta , CH-4010 Basel , Switzerland에서 설명된 바와 같이 정의된다.

본 발명을 실시하는 데 있어서는 달리 지시되지 않는 한, 이 기술분야의 문헌 (cf., 예컨대, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd Edition, J. Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989)에서 설명되는 생화학, 세포생물학, 면역학 및 재조합 DNA 기술의 통상적인 방법을 사용할 것이다.

이하의 상세한 설명 및 청구범위 전반에 걸쳐, 문맥상 달리 요구하지 않는 한, “포함하다(comprise)”라는 단어 및 “포함하다(comprises)” 및 “포함하는(comprising)”과 같은 변형은 명시된 구성원, 정수 또는 단계 또는 구성원, 정수 또는 단계의 그룹을 포괄하는 것을 암시하며, 비록 일부 구체예에서는 다른 구성원, 정수 또는 단계 또는 구성원, 정수 또는 단계의 그룹을 배제할 수도 있지만, 그러한 다른 구성원, 정수 또는 단계 또는 구성원, 정수 또는 단계의 그룹이 배제되는 것을 암시하는 것은 아니며, 즉 본 발명의 청구 대상은 명시된 구성원, 정수 또는 단계 또는 구성원, 정수 또는 단계의 그룹을 포괄하는 것으로 구성된다. 본 발명을 설명함에 있어서 문맥상 (특히 청구범위의 문맥상) 사용된 단어 “a” 및 “an” 및 “the” 및 유사한 참조 용어들은 본원에서 달리 지시되거나 문맥상 분명하게 모순되지 않는 한, 단수 및 복수를 모두 아우르는 것으로 해석되어야 한다. 본원에서 값을 범위로 인용하는 것은 단지 해당 범위 내에 속하는 각각의 분리된 값들을 개별적으로 손쉽게 칭하기 위한 것이다. 본원에서 달리 지시되지 않는 한, 각각의 분리된 값들은 본원에서 개별적으로 인용된 것처럼 본 명세서에 통합된다.

본원에서 설명된 모든 방법들은 본원에서 달리 지시되거나 문맥상 분명하게 모순되지 않는 한, 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 본원에서 제공된 임의의 그리고 모든 예시 또는 예시적 언어 (예컨대, “와 같은”)의 사용은 단지 본 발명을 보다 잘 설명하기 위한 것이며, 달리 청구된 본 발명의 범위를 한정하지 않는다. 본 명세서 내의 어떠한 언어도 본 발명의 실시에 필수적인 임의의 청구되지 않은 구성 요소를 지시하는 것으로 해석되어서는 안 된다.

본 명세서의 전반에 걸쳐서 여러 문헌들이 인용되었다. 본원의 앞에 또는 뒤에 인용된 각 문현들 (모든 특허, 특허 출원, 과학 간행물, 제조사의 설명서, 지침서 등)은, 모두 그 내용 전체가 본원에 참조로서 통합된다. 이들 중 어느 것도 선행 발명임을 이유로, 본 발명이 그러한 개시 내용에 선행한다고 하지 못함을 인정하는 것으로 해석되어서는 안 된다

본 발명은 질환 세포에 존재하는 단백질 또는 단백질 단편을 질환 세포에 대한 라벨 및 질환 세포를 표적화하는 데 이용함으로써 질환, 특히 암 질환의 면역 치료를 그리고 있다. 특히, 질환 세포는 MHC와 관련하여 질환 세포의 표면에 제시된 단백질의 단편을 표적화함으로써 표적화될 수 있다. 본 발명에 따른 면역 치료는 능동 및/또는 수동 면역 치료 접근법에 의해 영향 받는다.

구체적으로, 본 발명은 면역 치료를 위한 적합한 단백질 또는 그의 단편을 정의하는 것을 목표로 한다. 적합한 단백질이 동정되면, 이 단백질 또는 그의 단편 (경우에 따라 더 큰 폴리펩티드의 일부) 또는 단백질 또는 단편을 코딩하는 핵산 (경우에 따라 더 큰 폴리펩티드의 일부)은, 특히 적절한 수용체 (예컨대 T 세포 수용체 또는 인공 T 세포 수용체)를 통해 단백질 또는 그의 단편을 (특히 MHC와 관련하여 제시될 때) 인식하는 적절한 이펙터 세포, 예컨대 T 세포를 유도 및/또는 활성화함으로써 단백질 또는 그의 단편에 대한 면역 반응을 증강시키거나 유도하기 위하여 백신으로 사용될 수 있다. 택일적으로 또는 부가적으로, 적절한 수용체 (예컨대, T 세포 수용체 또는 인공 T 세포 수용체)를 통해 단백질 또는 그의 단편을 (특히 MHC와 관련하여 제시될 때) 인식하는 이펙터 세포, 예컨대 T 세포가 투여될 수 있다. 특정 이론에 구애받지 않으면서, 본 발명에 따라 면역 치료에 유용한 것으로 예측되는 단백질 또는 그의 단편은 항원 제시 세포에 의해 포획되고 항원 제시 세포에 의해, 특히 교차 제시에 의해 제시되어, 궁극적으로 상기 단백질 또는 그의 단편을 발현하는 질환 세포에 대한 효과적인 면역 반응을 일으킬 가능성이 높다고 믿어진다.

본 발명에 따라 면역 치료에 유용하거나 적합한 것으로 정의된 단백질은 또한 본원에서 “항원”으로도 지칭된다. 본 발명에 따라 면역 치료에 유용하거나 적합한 것으로 정의된 단백질 단편은 또한 본원에서 “에피토프”로도 지칭된다.

본 발명에 따른 면역 치료 접근법은 다음을 이용한 면역화를 포함한다:

i) (나이브 또는 변형된) 단백질 또는 펩티드, ii) 단백질 또는 펩티드를 코딩하는 핵산, iii) 단백질 또는 펩티드를 코딩하는 재조합 세포, iv) 단백질 또는 펩티드를 코딩하는 재조합 바이러스 및 v) (나이브 또는 변형된) 단백질 또는 펩티드로 펄스되거나 단백질 또는 펩티드를 코딩하는 핵산으로 트랜스팩션된 항원 제시 세포.

또한, 본 발명에 따른 면역 치료 접근법은 다음의 전달을 포함한다:

vi) 단백질 또는 펩티드를 인식하는 T 세포 수용체 및 vii) 특히 MHC와 관련하여 제시될 때, 단백질 또는 펩티드를 인식하는 수용체를 코딩하는 이펙터 세포 (예컨대, T 세포).

본 발명에 따른 바람직한 단백질 및 단편은 질환 특이적 방식으로 발현되며, 예컨대 이들은 질환-관련 항원 또는 에피토프이고 (예컨대, 단백질 또는 단백질을 발현하는 세포의 존재가 질환에 대해 특징적임) 및/또는 하나 이상의 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하며, 예컨대 이들은 질환-관련 신생 항원 또는 네오에피토프이다. 바람직하게는, 질환 특이적 아미노산 변형은 하나 이상의 질환 특이적 체세포 돌연변이에 기인한다. 특히 바람직한 일 구체예에서, 질환 특이적 아미노산 변형은 암 특이적 아미노산 변형이고 질환 특이적 체세포 돌연변이는 암 특이적 체세포 돌연변이이다. 따라서, 본 발명에 따르면, 백신은 바람직하게는 환자의 질환 특이적 아미노산 변형/질환 특이적 체세포 돌연변이를 특징으로 하며, 바람직하게는 투여시 하나 이상의 돌연변이에 기초한 네오에피토프를 제공한다. 따라서, 백신은 하나 이상의 돌연변이에 기초한 네오에피토프를 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드, 또는 상기 펩티드 또는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 질환 특이적 아미노산 변형은 질환 특이적 체세포 돌연변이를, 예컨대 질환 조직 또는 하나 이상의 질환 세포의 DNA 및/또는 RNA를 시퀀싱하여 동정함으로써 동정된다.

본 발명에 따르면, 질환 특이적 아미노산 변형을 동정하는 단계 및/또는 질환 특이적 체세포 돌연변이를 동정하는 단계는, 면역 치료을 위하여 질환 세포에 의해 발현된 단백질 또는 그의 단편의 유용성을 예측하는 본 발명의 방법 전에 또는 후에 수행될 수 있다. 본 발명의 바람직한 일 구체예에서, 질환 특이적 아미노산 변형 및/또는 질환 특이적 체세포 돌연변이는 환자의 질환 검체에서 먼저 결정되고, 이어서 본 발명의 방법에 따라, 하나 이상의 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 단백질 또는 하나 이상의 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 그의 단편의 면역 치료에 대한 유용성이 예측된다. 일단 동정되면, 질환 특이적 아미노산 변형 (각각 하나 이상의 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 단백질 또는 하나 이상의 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 그의 단편)은 또한 본 발명의 방법에 따른 면역 치료에서의 이들의 유용성에 대하여 선택 및/또는 순위화될 수 있다.

용어 “엑소좀(exosomes)”은 혈액, 소변 및 세포 배양물의 배양된 배지를 비롯한 생물학적 체액에 존재하는 세포-유래 소포에 관한 것이다. 엑소좀은 다소포체(multivesicular bodies)가 원형질막과 융합될 때 세포로부터 방출되거나 원형질막으로부터 직접 방출된다. 엑소좀은 단백질 및 RNA를 비롯하여, 기원 세포의 다양한 분자 구성 요소를 함유한다. 엑소좀 단백질의 조성은 기원 세포 및 조직에 따라 다양하지만, 대부분의 엑소좀은 진화적으로 보존된, 공통의 단백질 분자 집합을 함유하고 있다. 엑소좀은 막 소포 수송을 통해 하나의 세포에서 다른 세포로 분자를 전달함으로써 면역계, 예컨대 수지상 세포 및 B 세포에 영향을 미칠 수 있고, 병원체 및 종양에 대한 적응성 면역 반응을 매개하는 데 기능적 역할을 수행할 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 “시토졸(cytosol)”은 세포의 막-결합된 하부구조 내에 있지 않은, 세포질의 일부를 지칭한다.

본 발명에 따르면, 용어 “펩티드”는 펩티드 결합에 의해 공유 결합된 2 개 이상, 바람직하게는 3 개 이상, 바람직하게는 4 개 이상, 바람직하게는 6 개 이상, 바람직하게는 8 개 이상, 바람직하게는 10 개 이상, 바람직하게는 13 개 이상, 바람직하게는 16 개 이상, 바람직하게는 21 개 이상 및 바람직하게는 최대 8, 10, 20, 30, 40 또는 50 개, 특히 100 개의 아미노산을 포함하는 물질을 지칭한다. 용어 “폴리펩티드” 또는 “단백질”은 큰 펩티드, 바람직하게는 100 개 이상의 아미노산 잔기를 갖는 펩티드를 지칭하지만, 일반적으로 용어 “펩티드”, “폴리펩티드” 및 “단백질”은 동의어이며 본원에서 상호 교환적으로 사용된다.

본 발명에 따르면, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질과 관련하여 용어 “변형(modification)”은 야생형 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질의 서열과 같은 모체 서열과 비교하여 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 내의 서열 변화에 관한 것이다. 상기 용어는 아미노산 삽입 변이체, 아미노산 첨가 변이체, 아미노산 결실 변이체 및 아미노산 치환 변이체를 포함하며, 바람직하게는 아미노산 치환 변이체를 포함한다. 본 발명에 따른 이들 모든 서열 변화는 잠재적으로 새로운 에피토프를 생성할 수 있다.

아미노산 삽입 변이체는 특정 아미노산 서열에서 단일 또는 2 개 이상의 아미노산의 삽입을 포함한다.

아미노산 첨가 변이체는 하나 이상의 아미노산, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5 개 이상의 아미노산의 아미노- 및/또는 카복시-말단 융합체를 포함한다.

아미노산 결실 변이체는 서열로부터 하나 이상의 아미노산, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5 개 이상의 아미노산의 제거를 특징으로 한다.

아미노산 치환 변이체는 서열에서 적어도 하나의 잔기가 제거되고 다른 잔기가 그 자리에 삽입되는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따르면, 변형 또는 변형된 펩티드는 변형을 포함하는 단백질로부터 유래될 수 있다.

용어 “유래된(derived)”은 본 발명에 따라 특정 개체(entity), 특히 특정 펩티드 서열이 그것이 유래된 대상 내에 존재하는 것을 의미한다. 아미노산 서열, 특히 특정 서열 영역의 경우, “유래된”은 관련 아미노산 서열이 그것이 존재하는 아미노산 서열로부터 유래된 것을 의미한다.

본 발명에 따르면, 본원에 기재된 단백질은 바람직하게는 하나 이상의 질환 특이적 아미노산 변형을 포함한다. 일 구체예에서, 이들 하나 이상의 질환 특이적 아미노산 변형은 단백질의 에피토프 또는 잠재적 에피토프 내에 위치한다. 따라서, 본원에 기재된 바람직한 단백질은 바람직하게는 하나 이상의 네오에피토프를 포함하는 신생 항원이다. 유사하게, 본원에 기재된 바람직한 단백질 단편은 하나 이상의 질환 특이적 아미노산 변형을 포함하는 단백질의 단편이며, 여기서 바람직하게는 하나 이상의 질환 특이적 아미노산 변형은 단백질 단편 내에 위치한다. 따라서, 본원에 기재된 바람직한 단백질 단편은 네오에피토프이다.

본 발명에 따르면, 용어 “신생 항원(neo-antigen)”은 모체 펩티드 또는 단백질과 비교하여 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하는 펩티드 또는 단백질에 관한 것이다. 예를 들어, 신생 항원은 종양-관련 신생 항원일 수 있으며, 여기서 용어 “종양-관련 신생 항원”은 종양 특이적 돌연변이로 인한 아미노산 변형을 포함하는 펩티드 또는 단백질을 포함한다.

본 발명에 따르면, 용어 “질환 특이적 돌연변이”는 질환 세포의 핵산에는 존재하지만 상응하는 정상 세포, 즉 질환이 없는 세포의 핵산에는 존재하지 않는 체세포 돌연변이에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, 용어 “종양 특이적 돌연변이” 또는 “암 특이적 돌연변이”는 종양 또는 암 세포의 핵산에는 존재하지만 상응하는 정상 세포, 즉 비종양성 또는 비암성 세포의 핵산에는 존재하지 않는 체세포 돌연변이에 관한 것이다. 용어 “종양 특이적 돌연변이”와 “종양 돌연변이” 및 용어 “암 특이적 돌연변이” 및 “암 돌연변이”는 본원에서 상호 교환적으로 사용된다.

용어 “면역 반응”은 예컨대 박테리아 또는 바이러스와 같은 면역원성 생물체, 세포 또는 물질에 대한 면역계의 반응에 관한 것이다. 용어 “면역 반응”은 선천성 면역 반응 및 적응성 면역 반응을 포함한다. 바람직하게는, 면역 반응은 면역 세포의 활성화, 시토카인 생합성의 유도 및/또는 항체 생산과 관련이 있다.

본원에 기재된 조성물에 의해 유도된 면역 반응은 수지상 세포 및/또는 대식세포와 같은 항원 제시 세포의 활성화 단계, 상기 항원 제시 세포에 의한 항원 또는 그의 단편의 제시 단계 및 상기 제시로 인한 세포 독성 T 세포의 활성화 단계를 포함하는 것이 바람직하다.

“면역 반응의 유도(inducing an immune response)”는 유도 전에 면역 반응이 없었다는 것을 의미할 수 있지만, 유도 전에 일정 수준의 면역 반응이 있었고 유도 후 상기 면역 반응이 증강되었다는 것을 의미할 수도 있다. 따라서, “면역 반응의 유도”는 또한 “면역 반응의 증강”의 의미도 포함한다. 바람직하게는, 대상체에서 면역 반응이 유도된 후, 상기 대상체는 암 질환과 같은 질환의 발병으로부터 보호되거나 또는 면역 반응의 유도에 의해 그 질환 증상이 완화된다. 예를 들어, 종양-발현 항원에 대한 면역 반응은 암 질환에 걸린 환자 또는 암 질환에 걸릴 위험이 있는 대상체에서 유도될 수 있다. 이 경우, 면역 반응의 유도는 대상체의 질환 증상이 완화되는 것, 대상체에서 전이가 일어나지 않는 것, 또는 암 질환에 걸릴 위험이 있는 대상체가 암 질환에 걸리지 않는 것을 의미할 수 있다.

용어 “세포성 면역 반응” 및 “세포성 반응” 또는 이와 유사한 용어들은 “헬퍼(helpers)” 또는 “킬러(killers)” 역할을 하는 T 세포 또는 T 림프구를 수반하는 클래스 I 또는 클래스 II MHC로 항원을 제시하는 것을 특징으로 하는 세포에 지향된(directed) 면역 반응을 지칭한다. 헬퍼 T 세포 (CD4⁺ T 세포라고도 함)는 면역 반응을 조절하는 중추적 역할을 하고 킬러 세포 (세포 독성 T 세포, 세포 용해성 T 세포, CD8⁺ T 세포 또는 CTLs라고도 함)는 암 세포와 같은 질환 세포를 죽이고, 더 많은 질환 세포의 생산을 방지한다. 바람직한 구체예들에서, 본 발명은 하나 이상의 질환-관련 항원을 발현하고 바람직하게는 클래스 I MHC로 그러한 질환-관련 항원을 제시하는 질환 세포에 대한 항-질환 CTL 반응, 특히 하나 이상의 종양-발현 항원을 발현하고 바람직하게는 클래스 I MHC로 그러한 종양-발현 항원을 제시하는 종양 세포에 대한 항-종양 CTL 반응의 자극을 수반한다.

본 발명에 따르면, 용어 “항원” 또는 “면역원(immunogen)”은 면역 반응의 표적이 되는 및/또는 면역 반응을 이끌어내는 임의의 물질, 바람직하게는 펩티드 또는 단백질을 포괄한다. 특히, “항원”은 항체 또는 T 림프구 (T 세포)와 특이적으로 반응하는 임의의 물질에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 용어 “항원”은 T 세포 에피토프와 같은 적어도 하나의 에피토프를 포함하는 임의의 분자를 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 문맥상, 항원은 경우에 따라 프로세싱 후, 바람직하게는 항원 또는 항원을 발현하는 세포에 특이적인 면역 반응을 유도하는 분자이다. 본 발명에 따르면, 면역 반응의 후보인 임의의 적합한 항원이 사용될 수 있으며, 여기서 면역 반응은 바람직하게는 세포성 면역 반응이다. 본 발명의 구체예의 문맥상, 항원은 세포, 바람직하게는 항원 제시 세포에 의해 MHC 분자와 관련하여 제시되어, 항원에 대한 면역 반응을 일으키는 것이 바람직하다. 항원은 자연 발생 항원에 해당하거나 또는 이로부터 유래된 생성물인 것이 바람직하다. 이러한 자연 발생 항원은 알레르겐(allergens), 바이러스, 박테리아, 균류(fungi), 기생충 및 기타 감염원을 포함하거나 이로부터 유래될 수 있고, 또한 병원체 또는 항원은 종양 항원일 수도 있다. 본 발명에 따르면, 항원은 자연 발생 생성물, 예컨대 바이러스 단백질, 또는 그의 일부에 해당할 수 있다. 바람직한 구체예들에서, 항원은 표면 폴리펩티드, 즉 세포, 병원체, 박테리아, 바이러스, 균류, 기생충, 알레르겐 또는 종양의 표면에 자연적으로 디스플레이된 폴리펩티드이다. 항원은 세포, 병원체, 박테리아, 바이러스, 균류, 기생충, 알레르겐 또는 종양에 대한 면역 반응을 이끌어낼 수 있다.

용어 “질환-관련 항원”은 질환과 관련된 임의의 항원을 지칭하는 가장 넓은 의미로 사용된다. 질환-관련 항원은 숙주의 면역계를 자극하여 상기 질환에 대한 세포성 항원-특이적 면역 반응 및/또는 체액성 항체 반응을 일으키는 에피토프를 함유하는 분자이다. 따라서, 질환-관련 항원은 치료 목적으로 사용될 수 있다. 질환-관련 항원은 바람직하게는 미생물, 일반적으로 미생물 항원에 의한 감염과 관련되거나, 또는 암, 일반적으로 종양과 관련된다.

용어 “병원체(pathogen)”는 생물체, 바람직하게는 척추 동물에서 질환을 일으킬 수 있는 병원성 생물학적 물질을 지칭한다. 병원체는 박테리아, 단세포 진핵 생물 (원생 동물(protozoa)), 균류 및 바이러스와 같은 미생물을 포함한다.

용어 “에피토프”, “항원 펩티드”, “항원 에피토프”, “면역원성 펩티드” 및 “MHC 결합 펩티드”는 본원에서 상호 교환적으로 사용되고, 항원과 같은 분자 내의 항원 결정기(antigenic determinant)를 지칭하며, 즉 특히 MHC 분자와 관련하여 제시될 때 면역계에 의해 인식되는, 예컨대 T 세포에 의해 인식되는 면역학적으로 활성인 화합물의 일부 또는 단편을 지칭한다.

단백질의 에피토프는 바람직하게는 상기 단백질의 연속 또는 불연속적인 부분을 포함하고, 바람직하게는 길이가 5 내지 100 개, 바람직하게는 5 내지 50 개, 더 바람직하게는 8 내지 30 개, 가장 바람직하게는 10 내지 25 개의 아미노산이며, 예컨대 상기 에피토프는 바람직하게는 길이가 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25 개의 아미노산일 수 있다. 본 발명에 따르면, 에피토프는 MHC 분자, 예컨대 세포 표면의 MHC 분자에 결합할 수 있으며, 이에 따라 “MHC 결합 펩티드” 또는 “항원 펩티드”가 될 수 있다.

“주요 조직적합성 복합체(major histocompatibility complex)” 및 약어 “MHC”는 MHC 클래스 I 및 MHC 클래스 II 분자를 포함하며, 모든 척추 동물 내 존재하는 유전자의 복합체에 관한 것이다. MHC 단백질 또는 분자는 면역 반응에서 림프구와 항원 제시 세포 또는 질환 세포 사이의 신호 전달에 중요하며, 여기서 MHC 단백질 또는 분자는 펩티드를 결합시켜 T 세포 수용체에 의한 인식을 위해 이들을 제시한다. MHC에 의해 코딩된 단백질은 세포의 표면에서 발현되고, 자가 항원(self-antigens) (세포 자체로부터의 펩티드 단편) 및 비자가 항원(non-self-antigens) (예컨대, 침입 미생물의 단편) 둘 모두를 T 세포에 디스플레이한다. 그러한 면역원성 부분은 MHC 클래스 I 또는 클래스 II 분자에 결합하는 것이 바람직하다. 본원에서 사용된 바와 같이, 면역원성 부분은 당해 기술분야에 공지된 임의의 분석을 사용하여 상기 결합이 검출 가능한 경우, MHC 클래스 I 또는 클래스 II 분자에 “결합” 한다고 한다. 용어 “MHC 결합 펩티드”는 MHC 클래스 I 및/또는 MHC 클래스 II 분자에 결합하는 펩티드에 관한 것이다. 클래스 I MHC/펩티드 복합체의 경우, 결합 펩티드는 보다 길거나 짧은 펩티드가 효과적일 수 있지만 일반적으로 길이가 8-10 개의 아미노산이다. 클래스 II MHC/펩티드 복합체의 경우, 결합 펩티드는 일반적으로 길이가 10-25 개의 아미노산이고, 특히 13-18 개의 아미노산이며, 더 길고 짧은 펩티드가 효과적일 수 있다. 본 발명의 모든 측면의 바람직한 일 구체예에서, MHC 분자는 HLA 분자이다.

펩티드가 부가적인 서열을 포함하는 보다 큰 개체, 예컨대 백신 서열 또는 폴리펩티드의 일부인 경우, 및 프로세싱 후, 특히 절단 후 제시되는 경우, 프로세싱에 의해 생성된 상기 펩티드는 MHC 분자, 특히 클래스 I MHC 분자에 결합하기에 적합한 길이를 가지며, 바람직하게는 길이가 7-30 개의 아미노산, 예컨대 7-20 개의 아미노산이고, 더 바람직하게는 7-12 아미노산, 더 바람직하게는 8-11 개의 아미노산, 특히 9 또는 10 개의 아미노산이다. 바람직하게는, 프로세싱 후 제시되는 펩티드의 서열은 백신 접종에 사용된 항원 또는 폴리펩티드의 아미노산 서열로부터 유래되며, 즉 그 서열은 항원 또는 폴리펩티드의 단편과 실질적으로 일치하고 바람직하게는 완전히 동일하다.

따라서, 일 구체예에서 MHC 결합 펩티드는 항원의 단편과 실질적으로 일치하고 바람직하게는 완전히 동일한 서열을 포함한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 “네오에피토프(neo-epitopes)”는 정상 비질환성 (예컨대, 비암성) 세포 또는 생식 세포와 같은 레퍼런스에는 존재하지 않지만 질환 세포 (예컨대, 암 세포)에서는 발견되는 에피토프를 지칭한다. 이는 특히, 정상 비질환성 세포 또는 생식 세포에서는 대응하는 에피토프가 발견되지만, 질환 세포에서는 하나 이상의 돌연변이로 인해 에피토프의 서열이 변화되어 네오에피토프가 초래되는 상황을 포함한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 “T 세포 에피토프”는 T 세포 수용체에 의해 인식되는 형태로 MHC 분자에 결합하는 펩티드를 지칭한다. 일반적으로, T 세포 에피토프는 항원 제시 세포의 표면에서 제시된다.

본 발명에 따른 T 세포 에피토프는 바람직하게는 항원, 또는 항원의 발현을 특징으로 하는, 바람직하게는 질환 세포, 특히 암 세포와 같은 항원의 제시를 특징으로 하는 세포에 대한 면역 반응, 바람직하게는 세포성 반응을 자극할 수 있는 항원의 일부 또는 단편에 관한 것이다. 바람직하게는, T 세포 에피토프는 클래스 I MHC로 항원을 제시하는 것을 특징으로 하는 세포에 대한 세포성 반응을 자극할 수 있고, 바람직하게는 항원-반응성 세포 독성 T 림프구 (CTL)를 자극할 수 있다.

일 구체예에서, 본 발명에 따른 백신은 표적 생물체의 백신 접종에 적합한 에피토프를 포함한다. 통상의 기술자는 면역 생물학 및 백진 접종의 원리 중 하나가, 질환에 대한 면역 보호 반응(immonoprotective reaction)이 생물체를 백신으로 면역화시킴으로써 생성된다는 사실에 기초한다는 것을 알게 될 것이며, 이는 치료하고자 하는 질환과 관련하여 면역학적으로 연관이 있다. 본 발명에 따르면, 항원은 자가 항원 및 비자가 항원으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 비자가 항원은 바람직하게는 박테리아 항원, 바이러스 항원, 균류 항원, 알레르겐 또는 기생충 항원이다. 항원은 표적 생물체에서 면역 반응을 이끌어낼 수 있는 에피토프를 포함하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 에피토프는 박테리아, 바이러스, 균류, 기생충, 알레르겐 또는 종양에 대한 면역 반응을 이끌어낼 수 있다.

일부 구체예에서, 비자가 항원은 박테리아 항원이다. 일부 구체예에서, 항원은 조류, 어류, 및 가축을 포함하는 포유류를 비롯한 동물을 감염시키는 박테리아에 대한 면역 반응을 이끌어낸다. 바람직하게는, 면역 반응을 이끌어내는 박테리아는 병원성 박테리아이다.

일부 구체예에서, 비자가 항원은 바이러스 항원이다. 예를 들어, 바이러스 항원은 바이러스 표면 단백질, 예컨대 캡시드 폴리펩티드 또는 스파이크 폴리펩티드로부터의 펩티드일 수 있다. 일부 구체예에서, 항원은 조류, 어류, 및 가축을 포함하는 포유류를 비롯한 동물을 감염시키는 바이러스에 대한 면역 반응을 이끌어낸다. 바람직하게는, 면역 반응을 이끌어내는 바이러스는 병원성 바이러스이다.

일부 구체예에서, 비자가 항원은 균류로부터의 폴리펩티드 또는 단백질이다. 일부 구체예에서, 항원은 조류, 어류, 및 가축을 포함하는 포유류를 비롯한 동물을 감염시키는 균류에 대한 면역 반응을 이끌어낸다. 바람직하게는, 면역 반응을 이끌어내는 균류는 병원성 균류이다.

일부 구체예에서, 비자가 항원은 단세포 진핵 생물 기생충으로부터의 폴리펩티드 또는 단백질이다. 일부 구체예에서, 항원은 단세포 진핵 생물 기생충, 바람직하게는 병원성 단세포 진핵 생물 기생충에 대한 면역 반응을 이끌어낸다. 병원성 단세포 진핵 세포 기생충은 예컨대, 플라스모듐(Plasmodium) 속 (예컨대, P. falciparum, P. vivax, P. malariae 또는 P. ovale), 리슈마니아(Leishmania) 속, 또는 트리파노소마(Trypanosoma) 속 (예컨대, T. cruzi 또는 T. brucei)일 수 있다..

일부 구체예에서, 비자가 항원은 알레르기성 폴리펩티드 또는 알레르기성 단백질이다. 알레르기성 단백질 또는 알레르기성 폴리펩티드는 감감작요법(hypo-sensitization)으로도 알려져 있는, 알레르겐 면역 치료에 적합하다.

일부 구체예에서, 항원은 자가 항원, 특히 종양 항원이다. 종양 항원 및 이들의 결정은 통상의 기술자에게 공지되어 있다.

본 발명의 문맥상, 용어 “종양 항원” 또는 “종양-관련 항원”은 정상 조건하에서 제한된 수의 조직 및/또는 기관에서 또는 특정 발달 단계에서 특이적으로 발현되는 단백질에 관한 것이며, 예를 들어, 종양 항원은 정상 조건하에서 위 조직, 바람직하게는 위 점막, 생식 기관, 예컨대 고환, 영양막 조직, 예컨대 태반, 또는 생식 세포에서 특이적으로 발현될 수 있고, 하나 이상의 종양 또는 암 조직에서 발현되거나 비정상적으로 발현된다. 이러한 맥락에서, “제한된 수”는 바람직하게는 3 이하, 더 바람직하게는 2 이하를 의미한다. 본 발명의 문맥상, 종양 항원은 예를 들어, 분화 항원, 바람직하게는 세포 유형 특이적 분화 항원, 즉 정상 조건하에서 특정 분화 단계에서 특정 세포 유형으로 특이적으로 발현되는 단백질, 암/고환 항원, 즉 고환 및 때로는 태반에서 특이적으로 발현되는 단백질, 및 생식 계열 특이적 항원을 포함한다. 본 발명의 문맥상, 종양 항원은 바람직하게는 암 세포의 세포 표면과 결합하고, 바람직하게는 정상 조직에서 발현되지 않거나 거의 발현되지 않는다. 바람직하게는, 종양 항원 또는 종양 항원의 비정상적인 발현은 암 세포를 동정한다. 본 발명의 문맥상, 대상체, 예컨대 암 질환을 앓고 있는 환자 내에서 암 세포에 의해 발현되는 종양 항원은 바람직하게는 상기 대상체 내의 자가 단백질(self-protein)이다. 바람직한 구체예들에서, 본 발명의 문맥상, 종양 항원은 정상 조건하에서 비필수적인 조직 또는 기관, 즉 면역계에 의해 손상될 경우 대상체의 죽음을 초래하지 않는 조직 또는 기관에서, 또는 면역계에 의해 접근할 수 없거나 거의 접근할 수 없는 신체의 기관 또는 구조물에서 특이적으로 발현된다. 바람직하게는, 종양 항원의 아미노산 서열은 정상 조직에서 발현되는 종양 항원과 암 조직에서 발현되는 종양 항원 사이에서 동일하다.

본 발명에 유용할 수 있는 종양 항원의 예시로는 p53, ART-4, BAGE, 베타-카테닌/m, Bcr-abL CAMEL, CAP-1, CASP-8, CDC27/m, CDK4/m, CEA, 클라우딘 패밀리의 세포 표면 단백질 (예컨대, CLAUDIN-6, CLAUDIN-18.2 및 CLAUDIN-12), c-MYC, CT, Cyp-B, DAM, ELF2M, ETV6-AML1, G250, GAGE, GnT-V, Gap100, HAGE, HER-2/neu, HPV-E7, HPV-E6, HAST-2, hTERT (또는 hTRT), LAGE, LDLR/FUT, MAGE-A (바람직하게는, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11 또는 MAGE-A12), MAGE-B, MAGE-C, MART-1/Melan-A, MC1R, Myosin/m, MUC1, MUM-1, -2, -3, NA88-A, NF1, NY-ESO-1, NY-BR-1, p190 마이너 BCR-abL, Pm1/RARa, PRAME, 프로테이나제 3, PSA, PSM, RAGE, RU1 또는 RU2, SAGE, SART-1 또는 SART-3, SCGB3A2, SCP1, SCP2, SCP3, SSX, SURVIVIN, TEL/AML1, TPI/m, TRP-1, TRP-2, TRP-2/INT2, TPTE 및 WT가 있다. 특히 바람직한 종양 항원은 CLAUDIN-18.2 (CLDN18.2) 및 CLAUDIN-6 (CLDN6)을 포함한다.

용어 “면역원성(immunogenicity)”은 바람직하게는 암에 대한 치료와 같은 치료 요법과 관련된 면역 반응을 유도하는 상대적 효능에 관한 것이다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 “면역원성”은 면역원성을 갖는 특성에 관한 것이다. 예를 들어, 용어 “면역원성 변형(immunogenic modification)”은 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질과 관련하여 사용될 때, 상기 변형에 의해 야기된 및/또는 상기 변형에 지향된 면역 반응을 유도하는 상기 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질의 효능에 관한 것이다. 바람직하게는, 변형되지 않은 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질은 면역 반응을 유도하지 않거나, 상이한 면역 반응을 유도하거나, 또는 상이한 수준, 바람직하게는 더 낮은 수준의 면역 반응을 유도한다.

본 발명에 따르면, 용어 “면역원성(immunogenicity)” 또는 “면역원성(immunogenic)”은 바람직하게는 생물학적으로 연관된 면역 반응, 특히 백신 접종에 유용한 면역 반응을 유도하는 상대적 효능에 관한 것이다. 따라서, 바람직한 일 구체예에서, 아미노산 변형 또는 변형된 펩티드는 그것이 대상체에서 표적 변형에 대한 면역 반응을 유도하는 경우 면역원성이며, 상기 면역 반응은 치료 또는 예방 목적에 유익할 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 “면역 치료에 대한 단백질 또는 그의 단편의 유용성 예측”은 단백질 또는 그의 하나 이상의 단편, 예컨대 에피토프, 특히 T 세포 에피토프가 면역 반응을 유도하거나 면역 반응을 표적화하는 데 유용할 것인지를 예측하는 것을 지칭한다. 예를 들어, 질환-관련 항원과 같은 단백질이 면역 치료에 유용하다고 예측된 경우, 상기 단백질의 에피토프가 본원에 기재된 바와 같이 백신 접종에 사용되거나, 또는 상기 단백질의 에피토프를 표적화하는 이펙터 세포가 투여될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따라 면역 치료에 대한 유용성이 예측되는 단백질은 환자의 질환 세포에서 발현된다.

본 발명에 따르면, T 세포 에피토프는 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함하는 폴리펩티드 및/또는 백신 서열과 같은 보다 큰 개체의 일부로서 백신 내에 존재할 수 있다. 제시된 펩티드 또는 T 세포 에피토프는 적합한 프로세싱 후에 생성된다. 또한, T 세포 에피토프는 TCR 인식 또는 MHC에 대한 결합에 필수적이지 않은 하나 이상의 잔기에서 변형될 수 있다. 이러한 변형된 T 세포 에피토프는 면역학적으로 동등한 것으로 간주될 수 있다. 바람직하게는, T 세포 에피토프는 MHC에 의해 제시되고 T 세포 수용체에 의해 인식될 때 적절한 공자극 신호(co-stimulatory signals)의 존재하에서, 펩티드/MHC-복합체를 특이적으로 인식하는 T 세포 수용체를 지니는 T 세포의 클론 확장(clonal expansion)을 유도할 수 있다. 바람직하게는, T 세포 에피토프는 항원 단편의 아미노산 서열과 실질적으로 일치하는 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 상기 항원 단편은 MHC 클래스 I 및/또는 클래스 II 제시된 펩티드이다.

“항원 프로세싱” 또는 “프로세싱”은 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질이 상기 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질의 단편인 프로세싱 산물로 분해되는 것 (예컨대, 폴리펩티드의 펩티드로의 분해), 및 세포, 바람직하게는 항원 제시 세포에 의해 특이적 T 세포에 제시되기 위하여 이들 단편의 하나 이상이 (예컨대, 결합을 통해) MHC 분자와 결합하는 것을 지칭한다.

클래스 II-제한된 항원은 주로 식작용 경로(endocytic pathway)를 통해 항원 제시 세포로 들어가는 외인성 단백질로부터 유래되며 엔도솜 구획에서 프로세싱된다. 대조적으로, 클래스 I-제한된 이펙터 CTL에 의해 인식되는 항원은 일반적으로 내인성으로 합성된 단백질로부터 유래된다. 따라서, 외인성 단백질은 표적 세포의 세포질에 직접 도입되지 않으면 클래스 I-제한된 이펙터 CTL에 대한 항원 결정기를 제공할 수 없다.

용어 “교차 제시(cross-presentation)”는 항원 제시 세포가 세포외 항원을 포획, 프로세싱 및 MHC 클래스 I 분자로 CD8 T 세포 (세포 독성 T 세포)에 제시하는 능력에 관한 것이다. 교차 프라이밍(cross-priming)은 이 프로세스에 의한 나이브 세포 독성 CD8+ T 세포의 자극을 묘사한다. 교차 제시가 가능한 항원 제시 세포는 주로 수지상 세포이지만, 대식세포, B 림프구 및 동모양혈관 내피 세포(sinusoidal endothelial cells) 역시 가능한 것으로 나타났다.

교차 프라이밍은 바이러스 단백질 및 종양 항원에서 발생하는 것으로 나타났다. 이는 교차 프라이밍이 프로페셔널 APC를 감염시키지 않는 조직-트로픽 바이러스를 검출하고 이에 반응할 수 있는 메커니즘을 면역계에 제공할 수 있다는 제안을 이끌어냈다. 이러한 메커니즘이 없는 경우, 바이러스는 프로페셔널 APC를 회피함으로써 면역 감시(immunosurveillance)를 벗어날 수 있다. 또한, 이 메커니즘은 새로 발생하는 종양 세포에 의해 발현되는 신생 항원의 조사 수단을 면역계에 제공한다. 외인성 외래 항원과 마찬가지로, 외인성 자가 항원도 클래스 I-제시 경로에 들어갈 수 있다.

“항원 제시 세포(antigen presenting cells)” (APC)는 이들의 세포 표면에 MHC 분자와 관련하여 단백질 항원의 펩티드 단편을 제시하는 세포이다. 일부 APC는 항원 특이적 T 세포를 활성화시킬 수 있다.

프로페셔널 항원 제시 세포는 식균 작용 또는 수용체-매개된 엔도시토시스에 의하여 항원을 내재화한 후, 이들의 막 상에 클래스 II MHC 분자에 결합된 항원 단편을 디스플레이하는 데 매우 효과적이다. T 세포는 항원 제시 세포의 막 상에서 항원-클래스 II MHC 분자 복합체를 인식하고 상호 작용한다. 이어서, 항원 제시 세포에 의해 부가적인 공자극 신호가 생성되어, T 세포의 활성화를 유도한다. 공자극 분자의 발현은 프로페셔널 항원 제시 세포의 특징을 규정한다.

프로페셔널 항원 제시 세포의 주요 유형은 항원 제시의 범위가 가장 넓고 아마도 가장 중요한 항원 제시 세포인 수지상 세포, 대식세포, B 세포 및 특정 활성화된 상피 세포이다. 수지상 세포 (DCs)는 말초 조직에 포획된 항원을 MHC 클래스 II 및 I 항원 제시 경로 모두를 통해 T 세포에 제시하는 백혈구 집단이다. 수지상 세포가 면역 반응의 강력한 유도자이고 이들 세포의 활성화가 항종양 면역의 유도에 중요한 단계라는 것은 잘 알려져 있다. 수지상 세포는 편의상 “미숙” 및 “성숙” 세포로 분류되며, 이는 두 가지 잘 특성화된 표현형을 구별하는 간단한 방법으로 사용될 수 있다. 그러나, 이 명명법은 분화의 가능한 모든 중간 단계를 배제하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 미숙 수지상 세포는 항원 흡수(uptake) 및 프로세싱 능력이 높은 항원 제시 세포로서 특징지어지며, 이는 Fcγ수용체 및 만노스 수용체의 고발현과 연관성이 있다. 성숙 표현형은 일반적으로 이들 마커를 낮은 수준으로 발현하지만, 클래스 I 및 클래스 II MHC, 부착 분자(adhesion molecules) (예컨대, CD54 및 CD11) 및 공자극 분자 (예컨대, CD40, CD80, CD86 및 4-1 BB)와 같은 T 세포 활성화를 담당하는 세포 표면 분자는 고발현한다는 것을 특징으로 한다. 수지상 세포 성숙은 이러한 항원 제시 수지상 세포가 T 세포 프라이밍을 유도하는 수지상 세포 활성화의 상태를 지칭하는 반면, 미숙 수지상 세포에 의한 제시는 내성(tolerance)을 초래한다. 수지상 세포 성숙은 선천성 수용체 (박테리아 DNA, 바이러스 RNA, 내독소 등), 전염증성 시토카인 (TNF, IL-1, IFNs), CD40L에 의한 수지상 세포 표면의 CD40 결찰(ligation), 및 스트레스성 세포사를 겪는 세포로부터 방출된 물질에 의해 검출되는 미생물 특징을 갖는 생체 분자에 의해 주로 야기된다. 수지상 세포는 골수 세포를 시토카인, 예컨대 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자 (GM-CSF) 및 종양 괴사 인자 알파와 함께 시험관 내 배양함으로써 유래될 수 있다.

비프로페셔널 항원 제시 세포는 나이브 T 세포와의 상호 작용에 필요한 MHC 클래스 II 단백질을 구조적으로 발현하지 않으며; 이들은 오직 IFNγ와 같은 특정 시토카인에 의한 비프로페셔널 항원 제시 세포의 자극시에만 발현된다.

“항원의 제시를 특징으로 하는 세포” 또는 “항원을 제시하는 세포” 또는 이와 유사한 표현들은 질환 세포, 예컨대 암 세포와 같은 세포를 의미하거나, 항원 또는 예컨대 항원의 프로세싱에 의해 상기 항원으로부터 유래된 단편을, MHC 분자, 특히 MHC 클래스 I 분자와 관련하여 제시하는 항원 제시 세포를 의미한다. 유사하게, 용어 “항원의 제시를 특징으로 하는 질환”은 항원을, 특히 클래스 I MHC로 제시하는 것을 특징으로 하는 세포를 수반하는 질환을 의미한다. 세포에 의한 항원의 제시는 항원을 코딩하는 RNA와 같은 핵산으로 세포를 트랜스펙션함으로써 이루어질 수 있다.

“제시된 항원의 단편” 또는 이와 유사한 표현들은 예컨대 항원 제시 세포에 직접 첨가될 때, 단편이 MHC 클래스 I 또는 클래스 II, 바람직하게는 MHC 클래스 I에 의해 제시될 수 있음을 의미한다. 일 구체예에서, 단편은 항원을 발현하는 세포에 의해 자연적으로 제시되는 단편이다.

“표적 세포(target cell)”는 세포성 면역 반응과 같은 면역 반응의 표적이 되는 세포를 의미한다. 표적 세포는 항원, 즉 항원으로부터 유래된 펩티드 단편을 제시하는 세포를 포함하고, 암 세포와 같은 바람직하지 못한 임의의 세포를 포함한다. 바람직한 구체예들에서, 표적 세포는 본원에 기재된 바와 같이 항원을 발현하고, 바람직하게는 클래스 I MHC로 상기 항원을 제시하는 세포이다.

용어 “일부(portion)”는 부분(fraction)을 지칭한다. 아미노산 서열 또는 단백질과 같은 특정 구조물과 관련하여, 용어 그의 “부분”은 상기 구조물의 연속 또는 불연속적인 부분을 가리킬 수 있다. 바람직하게는, 아미노산 서열의 일부는 상기 아미노산 서열의 아미노산 중 적어도 1%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 바람직하게는 적어도 40%, 바람직하게는 적어도 50%, 더 바람직하게는 적어도 60%, 더 바람직하게는 적어도 70%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 80%, 및 가장 바람직하게는 적어도 90%를 포함한다. 바람직하게는, 상기 일부가 불연속적인 부분인 경우, 상기 불연속적인 부분은 구조물의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 그 이상의 부분으로 구성되며, 각 부분은 상기 구조물의 연속적인 요소이다. 예를 들어, 아미노산 서열의 불연속적인 부분은 상기 아미노산 서열의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 그 이상, 바람직하게는 4 이하의 부분으로 구성될 수 있으며, 여기서 각 부분은 아미노산 서열 중 바람직하게는 5 이상의 연속적인 아미노산, 10 이상의 연속적인 아미노산, 바람직하게는 20 이상의 연속적인 아미노산, 바람직하게는 30 이상의 연속적인 아미노산을 포함한다.

용어 “부분(part)” 및 “단편(fragment)”은 본원에서 상호 교환적으로 사용되며 연속적인 요소를 지칭한다. 예를 들어, 아미노산 서열 또는 단백질과 같은 구조물의 부분은 상기 구조물의 연속적인 요소를 지칭한다. 구조물의 일부, 부분 또는 단편은 바람직하게는 상기 구조물의 하나 이상의 기능적 특성들을 포함한다. 예를 들어, 에피토프, 펩티드 또는 단백질의 일부, 부분 또는 단편은 바람직하게는 그것이 유래된 에피토프, 펩티드 또는 단백질과 면역학적으로 동등하다. 본 발명의 문맥상, 아미노산 서열과 같은 구조물의 “부분”은 바람직하게는 전체 구조물 또는 아미노산 서열 중 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50% 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 94%, 적어도 96%, 적어도 98%, 적어도 99%를 포함하고, 바람직하게는 이로 구성된다.

본 발명의 문맥상, 용어 “이펙터 세포(effector cell)”, “면역 이펙터 세포(immune effector cell)” 또는 “면역 반응성 세포(immunoreactive cell)”는 면역 반응 중에 이펙터 기능을 발휘하는 세포에 관한 것이다. “면역 반응성 세포”는 바람직하게는 항원 또는 항원이나 그의 펩티드 단편 (예컨대, T 세포 에피토프)의 제시를 특징으로 하는 세포를 결합시킬 수 있고 면역 반응을 매개할 수 있다. 예를 들어, 이러한 세포는 시토카인 및/또는 케모카인을 분비하고, 항체를 분비하고, 암 세포를 인식하고, 경우에 따라 이러한 세포를 제거한다. 예를 들어, 면역 반응성 세포는 T 세포 (세포 독성 T 세포, 헬퍼 T 세포, 종양 침윤 T 세포), B 세포, 자연 살해 세포, 호중구, 대식세포 및 수지상 세포를 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 문맥상, 면역 반응성 세포는 T 세포, 바람직하게는 CD4⁺ 및/또는 CD8⁺ T 세포이다.

바람직하게는, “면역 반응성 세포”는 특히 MHC 분자와 관련하여, 예컨대 항원 제시 세포 또는 질환 세포 (예컨대, 암 세포)의 표면에서 제시되는 경우, 어느 정도의 특이성으로 항원 또는 그의 펩티드 단편을 인식한다. 바람직하게는, 상기 인식은 항원 또는 그의 펩티드 단편을 인식하는 세포가 반응성(responsive) 또는 반응성(reactive)이 되도록 한다. 세포가 MHC 클래스 II 분자와 관련하여 항원 또는 그의 펩티드 단편을 인식하는 수용체를 갖는 헬퍼 T 세포 (CD4⁺ T 세포)인 경우, 이러한 반응성(responsive) 또는 반응성(reactive)은 시토카인의 방출 및/또는 CD8⁺ 림프구 (CTLs) 및/또는 B 세포의 활성화를 수반할 수 있다. 세포가 CTL인 경우, 이러한 반응성(responsiveness) 또는 반응성(reactivity)은 MHC 클래스 I 분자와 관련하여 제시되는 세포, 즉 클래스 I MHC로 항원을 제시하는 것을 특징으로 하는 세포를, 예컨대 세포 사멸(apoptosis) 또는 퍼포린-매개된 세포 용해를 통해 제거하는 것을 수반할 수 있다. 본 발명에 따르면, CTL 반응성(responsiveness)은 지속적인 칼슘 플럭스, 세포 분열, IFN-γ 및 TNF-α와 같은 시토카인의 생성, CD44 및 CD69와 같은 활성화 마커의 상향 조절, 및 항원 발현 표적 세포의 특이적인 세포 용해성 살해를 포함할 수 있다. CTL 반응성은 또한 CTL 반응성을 정확하게 나타내는 인공 리포터를 사용하여 확인될 수도 있다. 또한, 항원 또는 항원 단편을 인식하고 반응성(responsive) 또는 반응성(reactive)인 이러한 CTL은 본원에서 “항원-반응성 CTL”로도 지칭된다. 세포가 B 세포인 경우, 이러한 반응성은 면역 글로불린의 방출을 수반할 수 있다.

용어 “T 세포” 및 “T 림프구”는 본원에서 상호 교환적으로 사용되며, 세포 용해성 T 세포를 포함하는 세포 독성 T 세포 (CTLs, CD8+ T 세포) 및 T 헬퍼 세포 (CD4+ T 세포)를 포함한다.

T 세포는 림프구로 알려진 백혈구 군에 속하며, 세포-매개된 면역에서 중심적인 역할을 한다. 이들은 T 세포 수용체 (TCR)로 불리는 이들 세포 표면의 특별한 수용체의 존재에 의해 다른 림프구 유형들, 예컨대 B 세포 및 자연 살해 세포와 구별될 수 있다. 흉선은 T 세포의 성숙을 담당하는 주요 기관이다. T 세포의 몇몇 상이한 서브세트가 발견된 바 있으며, 각각은 별개의 기능을 갖는다.

T 헬퍼 세포는 다른 기능들 중에서도 B 세포의 혈장 세포로의 성숙 및 세포 독성 T 세포와 대식세포의 활성화를 비롯하여, 면역학적 프로세스에서 다른 백혈구들을 돕는다. 또한, 이들 세포는 이들의 표면에 CD4 단백질을 발현하기 때문에 CD4+ T 세포로도 알려져 있다. 헬퍼 T 세포는 항원 제시 세포 (APCs)의 표면에 발현되는 MHC 클래스 II 분자에 의해 펩티드 항원과 함께 제시될 때 활성화된다. 일단 활성화되면, 이들은 신속히 분열하여 활성 면역 반응을 조절하거나 돕는, 시토카인이라고 하는 작은 단백질을 분비한다.

세포 독성 T 세포는 바이러스 감염 세포와 종양 세포를 파괴하며, 또한 이식 거부에도 연루된다. 또한, 이들 세포는 이들의 표면에 CD8 당단백질을 발현하기 때문에 CD8+ T 세포로도 알려져 있다. 이들 세포는 신체의 거의 모든 세포 표면에 존재하는, MHC 클래스 I과 연관된 항원에 결합함으로써 이들의 표적을 인식한다.

대다수의 T 세포는 여러 단백질의 복합체로 존재하는 T 세포 수용체 (TCR)를 갖는다. 실제 T 세포 수용체는 독립적인 T 세포 수용체 알파 및 베타 (TCRα 및 TCRβ유전자로부터 생성되어 α- 및 β사슬이라고 불리는 두 개의 별개의 펩티드 사슬로 구성된다. γδT 세포 (감마 델타 T 세포)는 이들의 표면에 뚜렷한 T 세포 수용체 (TCR)를 가지고 있는 T 세포의 작은 서브세트를 나타낸다. 그러나, γδT 세포에서, TCR은 하나의 γ사슬 및 하나의 δ사슬로 구성된다. 이 T 세포 그룹은 αβT 세포보다 훨씬 드물다 (총 T 세포의 2%).

본 발명에 따르면, 용어 “항원 수용체”는 임의의 특이성, 예컨대 T 세포와 같은 이펙터 세포상에 대한 단일클론 항체의 특이성을 부여한 조작된 수용체뿐만 아니라 T 세포 수용체와 같은 자연 발생 수용체를 포함한다. 이러한 방식으로, 많은 양의 항원-특이적 T 세포가 입양 세포 전달을 위해 생성될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 항원 수용체는 T 세포 상에, 예컨대 T 세포 자신의 T 세포 수용체 대신 또는 이에 더하여 존재할 수 있다. 이러한 T 세포는 표적 세포의 인식을 위한 항원의 프로세싱 및 제시를 필수적으로 요구하지 않고, 대신 바람직하게는 표적 세포상에 존재하는 임의의 항원을 특이적으로 인식할 수 있다. 바람직하게는, 상기 항원 수용체는 세포의 표면에 발현된다. 본 발명의 목적을 위하여, 본원에서 사용된 용어 “T 세포”는 조작된 항원 수용체를 포함하는 T 세포를 포함한다. 구체적으로, 본 발명에 따르면, 용어 “항원 수용체”는 표적 세포, 예컨대 암 세포상의 표적 구조 (예컨대, 항원)를 (예컨대, 항원 결합 부위 또는 항원 결합 도메인을 표적 세포의 표면에 발현된 항원에 결합시킴으로써) 인식, 즉 결합하고 세포 표면의 상기 항원 수용체를 발현하는 T 세포와 같은 이펙터 세포상에 대한 특이성을 부여할 수 있는, 단일 분자 또는 분자 복합체를 포함하는 인공 수용체를 포함한다. 바람직하게는, 항원 수용체에 의한 표적 구조의 인식은 상기 항원 수용체를 발현하는 이펙터 세포의 활성화를 초래한다. 본 발명에 따르면, “항원 수용체”는 “키메라 항원 수용체 (CAR)”, “키메라 T 세포 수용체” 또는 “인공 T 세포 수용체”일 수 있다.

본 발명에 따르면, 항원은 항원 결합 부위를 형성할 수 있는 임의의 항원 인식 도메인 (본원에서 간단히 “도메인”으로도 지칭됨)을 통해, 예컨대 동일하거나 상이한 펩티드 사슬상에 존재할 수 있는 T 세포 수용체 및 항체의 항원 결합 부분을 통해 항원 수용체에 의해 인식될 수 있다. 일 구체예에서, 항원 결합 부위를 형성하는 두 개의 도메인은 면역 글로불린으로부터 유래된다. 또 다른 구체예에서, 항원 결합 부위를 형성하는 두 개의 도메인은 T 세포 수용체로부터 유래된다. 항체 가변 도메인, 예컨대 단일클론 항체로부터 유래된 단일 사슬 가변 단편 (scFv) 및 T 세포 수용체 가변 도메인, 특히 TCR 알파 및 베타 단일 사슬이 특히 바람직하다. 실제로, 주어진 표적을 높은 친화도로 결합시키는 거의 모든 것이 항원 인식 도메인으로 사용될 수 있다.

T 세포의 활성화에서 제1 신호는 T 세포 수용체가 다른 세포상의 MHC에 의해 제시되는 짧은 펩티드에 결합함으로써 제공된다. 이는 그 펩티드에 특이적인 TCR을 갖는 T 세포만이 활성화되도록 한다. 파트너 세포는 대체로 항원 제시 세포, 예컨대 프로페셔널 항원 제시 세포이며, 나이브 반응의 경우 대체로 수지상 세포지만, B 세포 및 대식세포도 중요한 APC일 수 있다.

본 발명에 따르면, 분자는 표적에 대하여 상당한 친화도를 갖는 경우 상기 소정의 표적에 결합할 수 있으며 표준 분석에서 상기 소정의 표적에 결합한다. “친화도(affinity)” 또는 “결합 친화도(binding affinity)”는 종종 평형 해리 상수(equilibrium dissociation constant; K_D)로 측정된다. 분자는 표적에 대하여 상당한 친화도가 없는 경우 상기 소정의 표적에 (실질적으로) 결합할 수 없으며 표준 분석에서 상기 소정의 표적에 결합하지 않는다.

세포 독성 T 림프구는 생체 내에서 항원 제시 세포에 항원 또는 그의 펩티드 단편을 혼입함으로써 생체 내에서 생성될 수 있다. 항원 또는 그의 펩티드 단편은 단백질, DNA (예컨대, 벡터 내에서) 또는 RNA로 나타낼 수 있다. 항원은 MHC 분자에 대한 펩티드 파트너를 생산하도록 프로세싱될 수 있는 반면, 그의 단편은 추가적인 프로세싱을 필요로 하지 않고 제시될 수 있다. 특히 후자는, 이들이 MHC 분자에 결합할 수 있는 경우 그러하다. 일반적으로, 환자에게 피내 주사에 의한 투여가 가능하다. 그러나, 주사는 림프절 내로 결절 내(intranodally) 수행될 수도 있다 (Maloy et al. (2001), Proc Natl Acad Sci USA 98:3299-303). 생성되는 세포는 관심 대상 복합체를 나타내며 자가 세포 독성 T 림프구에 의해 인식된 후 증식한다.

CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 특이적 활성화는 다양한 방법으로 검출될 수 있다. 특이적 T 세포 활성화를 검출하는 방법은 T 세포의 증식, 시토카인 (예컨대, 림포카인)의 생성, 또는 세포 용해 활성의 발생을 검출하는 것을 포함한다. CD4+ T 세포의 경우, 특이적 T 세포 활성화를 검출하는 바람직한 방법은 T 세포의 증식을 검출하는 것이다. CD8+ T 세포의 경우, 특이적 T 세포 활성화를 검출하는 바람직한 방법은 세포 용해 활성의 발생을 검출하는 것이다.

용어 “면역학적으로 동등한(immunologically equivalent)”은 면역학적으로 동등한 아미노산 서열 등의 면역학적으로 동등한 분자가, 예컨대 체액성 및/또는 세포성 면역 반응의 유도, 유도된 면역 반응의 강도 및/또는 지속 시간, 또는 유도된 면역 반응의 특이성과 같은 면역학적 효과의 유형에 대하여, 동일하거나 본질적으로 동일한 면역학적 성질을 나타내는 것 및/또는 동일하거나 본질적으로 동일한 면역학적 효과를 발휘하는 것을 의미한다. 본 발명의 문맥상, 용어 “면역학적으로 동등한”은 바람직하게는 면역화에 사용되는 펩티드의 성질 또는 면역학적 효과에 대해 사용된다. 예를 들어, 아미노산 서열이 대상체의 면역계에 노출될 때 레퍼런스 아미노산 서열과 반응하는 특이성을 갖는 면역 반응을 유도한다면, 상기 아미노산 서열은 레퍼런스 아미노산 서열과 면역학적으로 동등하다.

본 발명의 문맥상, 용어 “면역 이펙터 기능(immune effector functions)”은 예를 들어 종양 세포의 살해 또는 종양 성장의 억제 및/또는 종양 전파 및 전이의 억제를 비롯한 종양 발달의 억제를 초래하는, 면역계의 성분에 의해 매개된 임의의 기능을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 문맥상, 면역 이펙터 기능은 T 세포 매개된 이펙터 기능이다. 이러한 기능은 헬퍼 T 세포 (CD4⁺ T 세포)의 경우 MHC 클래스 II 분자와 관련하여 T 세포 수용체에 의한 항원 또는 항원 단편의 인식, 시토카인의 방출 및/또는 CD8⁺ 림프구 (CTLs) 및/또는 B 세포의 활성화, 그리고 CTL의 경우 MHC 클래스 I 분자와 관련하여 T 세포 수용체에 의한 항원 또는 항원 단편의 인식, MHC 클래스 I 분자와 관련하여 제시된 세포, 즉 클래스 I MHC로의 항원의 제시를 특징으로 하는 세포의 예컨대 세포 사멸 또는 퍼포린-매개된 세포 용해를 통한 제거, IFN-γ 및 TNF-α 와 같은 시토카인의 생성 및 항원 발현 표적 세포의 특이적 세포 용해성 살해를 포함한다.

일반적으로, 본 발명에 따르면, 질환 세포에 의해 발현되는 단백질은 면역 치료에서의 이들의 유용성과 관련하여 평가된다. 면역 치료에 대하여 예측되는 유용성을 갖는 단백질은, 단백질 또는 그의 하나 이상의 펩티드 단편, 특히 단백질의 하나 이상의 (잠재적) MHC 결합 펩티드를 포함하는 백신을 제공하는 데 사용될 수 있다.

본 발명에 따르면, 용어 “분포(distribution)”는 위치 상태를 지칭한다. 특히, 용어 “분포 또는 위치의 확인”은 위치 상태의 결정 또는 예측, 예컨대 펩티드, 단백질, 또는 핵산이 생체 내 시토졸 및/또는 엑소좀 내에 위치하거나 풍부하게 존재하는지 여부의 결정 또는 예측과 같이, 펩티드, 단백질 또는 핵산의 세포질 내 위치 또는 풍부한 존재의 결정 또는 예측을 포함한다.

“예측하다(predict)”, “예측하는(predicting)” 또는 “예측(prediction)”과 같은 용어는 가능성을 알아내는 것에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, 면역 치료를 위하여 질환 세포에 의해 발현된 단백질 또는 그의 단편의 유용성의 예측은 다음: (i) 단백질 또는 그를 코딩하는 핵산, 또는 상기 단백질의 단편의 분포 또는 위치를 확인하는 단계, 예컨대 단백질 또는 그를 코딩하는 핵산, 또는 상기 단백질의 단편이 생체 내 시토졸 및/또는 엑소좀 내에 위치하거나 풍부하게 존재하는지 여부를 확인하는 단계, (ii) 단백질 또는 그의 단편이 항원 제시 세포, 바람직하게는 프로페셔널 항원 제시 세포에 의해 교차 제시되는지 여부를 확인하는 단계, (iii) 단백질 또는 그의 단편에 대한 기존의 항체 반응을 확인하는 단계, (iv) 단백질 또는 그의 단편이 F 액틴에 결합하는지 여부를 확인하는 단계, (v) 단백질 또는 그의 단편이 RNA에 결합하는지 여부를 확인하는 단계 중 하나 이상을 포함할 수 있다.

일 구체예에서, 단백질 또는 그를 코딩하는 핵산, 또는 상기 단백질의 단편이 생체 내 엑소좀 내에 위치하거나 풍부하게 존재하는지 여부를 확인하는 단계는 세포외액의 샘플을 수득하고, 예컨대 분별 원심분리(differential centrifugation)에 의해 엑소좀을 단리하고, 예컨대 겔 전기 영동에 의해 단백질 또는 핵산을 단리하고, 그리고 예컨대 질량 분석, ELISA, 유동 세포 분석, 항체 분석 또는 웨스턴 블로팅을 통해 상기 단백질 또는 그의 단편을 동정하거나 예컨대 마이크로어레이, RNA 시퀀싱 또는 RT-PCR을 통해 상기 단백질을 코딩하는 핵산을 동정함으로써 수행될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 단백질 또는 그를 코딩하는 핵산, 또는 상기 단백질의 단편이 생체 내 엑소좀 내에 위치하거나 풍부하게 존재하는지 여부를 확인하는 단계는, 예를 들어 ExoCarta와 같은, 상기 섹션에 기재된 실험으로부터 데이터를 수집한 데이터베이스로부터 정보를 추출함으로써 수행된다 (Keerthikumar, S, et al., J. Mol. Biol. 428, 688(2016)).

일 구체예에서, 기존의 항체 반응을 확인하는 단계는 SEREX를 사용하여 수행될 수 있다. SEREX는 재조합 발현 클로닝에 의한 항원의 혈청학적 동정(serological identification of antigens by recombinant expression cloning)을 의미하고, 종양-유래 cDNA 형질 도입된 파지 라이브러리를 인식하기 위해 환자 혈청의 항체를 스크리닝함으로써 종양 항원을 동정하는 방법이다. 이 기술은 환자의 다양한 잠재적 항원을 발현하기 위하여 파지 디스플레이 라이브러리를 사용한다. 항원은 2차원 표면으로 전달되어 특이적 클론에 대한 이들의 매핑을 허용한다. 상기 표면은 자가 환자 혈청과 함께 배양된다. 면역 반응성 클론을 위치시키고, 배양하고, 시퀀싱한다 (Sahin, U, et al., PNAS 92, 11810 (1995)).

본 발명은 또한 단백질 서열을 MHC 결합을 위한 적절한 단편으로 절단하는 것 및 하나 이상의 MHC 분자에 대한 상기 단편의 결합 스코어를 확인하는 것을 포함할 수 있다. 아웃풋은 순위화될 수 있으며 펩티드 목록과 예측 스코어로 구성되어, 결합 가능성을 나타낼 수 있다. 일반적으로, 본 발명에 따른 단백질은 이들이 하나 이상의 (잠재적) MHC 결합 펩티드를 함유하는 경우 면역 치료에 특히 유용하다.

본 발명의 방법은 암 환자와 같은 환자, 예컨대 암 환자와 같은 환자의 종양 검체에 대해 수행될 수 있다.

본 발명에 따르면, 본원에 기재된 단백질 또는 단백질 단편은 바람직하게는 적어도 하나의 아미노산 변형을 함유한다. 본 발명에 따라 면역 치료에 대한 유용성이 결정되는 아미노산 변형 또는 본 발명에 따라 예측된 이들의 면역원성에 따라 선택 및/또는 순위화되는 아미노산 변형은, 세포의 핵산 내 돌연변이로부터 초래될 수 있다. 이러한 돌연변이는 공지된 시퀀싱 기술에 의해 동정될 수 있다.

일 구체예에서, 돌연변이는 종양 검체의 게놈, 엑솜 및/또는 트랜스크립톰과 비종양성 검체의 게놈, 엑솜 및/또는 트랜스크립톰 사이의 서열 차이를 동정함으로써 결정될 수 있는, 암 환자의 종양 검체에서의 암 특이적 체세포 돌연변이이다.

본 발명에 따르면, 종양 검체는 종양 또는 암 세포를 함유하거나 함유할 것으로 예상되는 환자로부터 유래된 신체 샘플과 같은 임의의 샘플에 관한 것이다. 신체 샘플(bodily sample)은 혈액과 같은 임의의 조직 샘플, 원발성 종양 또는 종양 전이로부터 수득된 조직 샘플, 또는 종양 또는 암 세포를 함유하는 임의의 다른 샘플일 수 있다. 바람직하게는, 신체 샘플은 혈액이고 암 특이적 체세포 돌연변이 또는 서열 차이는 상기 혈액에 함유된 하나 이상의 순환 종양 세포(circulating tumor cells; CTCs)에서 결정된다. 또 다른 구체예에서, 종양 검체는 순환 종양 세포 (CTCs)와 같은 하나 이상의 단리된 종양 또는 암 세포, 또는 순환 종양 세포 (CTCs)와 같은 하나 이상의 단리된 종양 또는 암 세포를 함유하는 샘플에 관한 것이다.

비종양성 검체는 환자 또는 바람직하게는 상기 환자와 동일한 종의 다른 개체, 바람직하게는 종양 또는 암 세포를 함유하지 않거나 함유하지 않을 것으로 예상되는 건강한 개체로부터 유래된 신체 샘플과 같은 임의의 샘플에 관한 것이다. 신체 샘플은 혈액 또는 비종양성 조직으로부터의 샘플과 같은 임의의 조직 샘플일 수 있다.

본 발명은 환자의 암 돌연변이 시그니처(signature)를 결정하는 것을 포함할 수 있다. 용어 “암 돌연변이 시그니처(cancer mutation signature)”는 환자의 하나 이상의 암 세포에 존재하는 모든 암 돌연변이를 지칭하는 것일 수 있거나, 또는 환자의 하나 이상의 암 세포에 존재하는 암 돌연변이의 일부만을 지칭하는 것일 수 있다. 따라서, 본 발명은 환자의 하나 이상의 암 세포에 존재하는 모든 암 특이적 돌연변이의 동정을 포함하거나, 또는 환자의 하나 이상의 암 세포에 존재하는 암 특이적 돌연변이의 일부만의 동정을 포함할 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 방법은 본 발명의 방법에 포함되는 충분한 수의 변형 또는 변형된 단백질을 제공하는 다수의 돌연변이의 동정을 제공한다.

바람직하게는, 본 발명에 따라 동정된 돌연변이는 비동의적 돌연변이(non-synonymous mutations), 바람직하게는 종양 또는 암 세포에서 발현된 단백질의 비동의적 돌연변이이다.

일 구체예에서, 암 특이적 체세포 돌연변이 또는 서열 차이는 종양 검체의 게놈, 바람직하게는 전체 게놈에서 결정된다. 따라서, 본 발명은 게놈, 바람직하게는 하나 이상의 암 세포의 전체 게놈의 암 돌연변이 시그니처를 동정하는 것을 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 암 환자의 종양 검체에서 암 특이적 체세포 돌연변이를 동정하는 단계는 게놈-와이드 암 돌연변이 프로파일을 동정하는 단계를 포함한다.

일 구체예에서, 암 특이적 체세포 돌연변이 또는 서열 차이는 종양 검체의 엑솜, 바람직하게는 전체 엑솜에서 결정된다. 따라서, 본 발명은 엑솜, 바람직하게는 하나 이상의 암 세포의 전체 엑솜의 암 돌연변이 시그니처를 동정하는 것을 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 암 환자의 종양 검체에서 암 특이적 체세포 돌연변이를 동정하는 단계는 엑솜-와이드 암 돌연변이 프로파일을 동정하는 단계를 포함한다.

일 구체예에서, 암 특이적 체세포 돌연변이 또는 서열 차이는 종양 검체의 트랜스크립톰, 바람직하게는 전체 트랜스크립톰에서 결정된다. 따라서, 본 발명은 트랜스크립톰, 바람직하게는 하나 이상의 암 세포의 전체 트랜스크립톰의 암 돌연변이 시그니처를 동정하는 것을 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 암 환자의 종양 검체에서 암 특이적 체세포 돌연변이를 동정하는 단계는 트랜스크립톰-와이드 암 돌연변이 프로파일을 동정하는 단계를 포함한다.

일 구체예에서, 암 특이적 체세포 돌연변이를 동정하는 단계 또는 서열 차이를 동정하는 단계는 하나 이상의, 바람직하게는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 그 이상의 암 세포의 단실 세포 시퀀싱을 포함한다. 따라서, 본 발명은 상기 하나 이상의 암 세포의 암 돌연변이 시그니처를 동정하는 것을 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 암 세포는 순환 종양 세포이다. 순환 종양 세포와 같은 암 세포는 단일 세포 시퀀싱 전에 단리될 수 있다.

일 구체예에서, 암 특이적 체세포 돌연변이를 동정하는 단계 또는 서열 차이를 동정하는 단계는 차세대 시퀀싱 (NGS)을 사용하는 것을 포함한다.

일 구체예에서, 암 특이적 체세포 돌연변이를 동정하는 단계 또는 서열 차이를 동정하는 단계는 종양 검체의 게놈 DNA 및/또는 RNA를 시퀀싱하는 단계를 포함한다.

암 특이적 체세포 돌연변이 또는 서열 차이를 밝히기 위하여, 종양 검체로부터 수득한 서열 정보를, 바람직하게는 환자 또는 다른 개체로부터 수득할 수 있는 생식 세포와 같은 정상 비암성 세포의 핵산 (예컨대, DNA 또는 RNA) 시퀀싱으로부터 수득한 서열 정보 등의 레퍼런스와 비교한다. 일 구체예에서, 정상 게놈 생식 계열 DNA는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMCs)로부터 수득된다.

용어 “게놈(genome)”은 생물체 또는 세포의 염색체 내 유전 정보의 총량에 관한 것이다.

용어 “엑솜(exome)”은 발현된 유전자의 코딩 부분인 엑손에 의해 형성된 생물체의 게놈의 일부를 지칭한다. 엑솜은 단백질 및 기타 기능적 유전자 산물의 합성에 사용되는 유전자 청사진을 제공한다. 이는 게놈의 가장 기능적으로 연관된 부분이므로, 생물체의 표현형에 기여할 가능성이 가장 높다. 인간 게놈의 엑솜은 전체 게놈의 1.5%를 차지하는 것으로 평가된다 (Ng, PC et al., PLoS Gen., 4(8): 1 -15, 2008).

용어 “트랜스크립톰(transcriptome)”은 하나의 세포 또는 세포 집단에서 생산되는 mRNA, rRNA, tRNA 및 다른 비코딩 RNA를 비롯한 모든 RNA 분자의 세트에 관한 것이다. 본 발명의 문맥상, 트랜스크립톰은 하나의 세포, 세포 집단, 바람직하게는 암 세포의 집단, 또는 특정 시점에서 주어진 개체의 모든 세포에서 생성되는 모든 RNA 분자의 세트를 의미한다.

본 발명에 따르면, “핵산”은 바람직하게는 데옥시리보핵산 (DNA) 또는 리보핵산 (RNA), 더 바람직하게는 RNA, 가장 바람직하게는 시험관 내 전사된 RNA (IVT RNA) 또는 합성 RNA이다. 본 발명에 따르면, 핵산은 게놈 DNA, cDNA, mRNA, 재조합적으로 생산된 분자 및 화학적으로 합성된 분자를 포함한다. 본 발명에 따르면, 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥 및 선형 또는 공유적으로 순환 폐쇄된(circularly closed) 분자로서 존재할 수 있다. 본 발명에 따르면, 핵산은 단리될 수 있다. 본 발명에 따라서, 용어 “단리된 핵산(isolated nucleic acid)”은 핵산이 (i) 시험관 내, 예컨대 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 통해 증폭되었거나, (ii) 클로닝에 의해 재조합적으로 생산되었거나, (iii) 예컨대, 겔 전기 영동에 의한 절단 및 분리에 의해 정제되었거나, 또는 (iv) 예컨대, 화학적 합성에 의해 합성되었음을 의미한다. 핵산은 특히 DNA 템플릿으로부터 시험관 내 전사에 의해 제조될 수 있는 RNA의 형태로, 세포 내로의 도입, 즉 세포의 트랜스펙션을 위해 사용될 수 있다. RNA는 또한 안정화 서열, 캡핑 및 폴리아데닐화에 의해 적용 전에 변형될 수 있다.

용어 “유전 물질(genetic material)”은 단리된 핵산, 즉 DNA 또는 RNA, 이중 나선의 한 섹션, 염색체의 한 섹션, 또는 생물체 또는 세포의 전체 게놈, 특히 그의 엑솜 또는 트랜스크립톰을 지칭한다.

용어 “돌연변이(mutation)”는 레퍼런스와 비교하여 핵산 서열에서의 변화 또는 차이 (뉴클레오티드 치환, 첨가 또는 결실)를 지칭한다. “체세포 돌연변이(somatic mutation)”는 생식 세포 (정자 및 난자)를 제외한 신체의 임의의 세포에서 발생할 수 있으므로, 자식에게 전달되지 않는다. 이들 변화는 (항상 그런 것은 아니지만) 암 또는 기타 질환을 유발할 수 있다. 바람직하게는, 돌연변이는 비동의적 돌연변이이다. 용어 “비동의적 돌연변이(non-synonymous mutation)”는 번역 산물에서 아미노산 변화, 예컨대 아미노산 치환을 초래하는 돌연변이, 바람직하게는 뉴클레오티드 치환을 지칭한다.

본 발명에 따르면, 용어 “돌연변이”는 점돌연변이, 인델(Indels), 융합(fusions), 염색체파열(chromothripsis) 및 RNA 편집(edits)을 포함한다.

본 발명에 따르면, 용어 “인델(Indel)”은 공동화(colocalized) 삽입 및 결실, 및 뉴클레오티드에서의 순증가 또는 순감소를 초래하는 돌연변이로서 정의되는 특수한 돌연변이 클래스를 설명한다. 게놈의 코딩 영역에서, 인델의 길이가 3의 배수가 아닌 경우, 이들은 프레임 시프트 돌연변이를 일으킨다. 인델은 점돌연변이와 대조될 수 있는데; 인델은 서열의 뉴클레오티드를 삽입 또는 결실하고, 점돌연변이는 뉴클레오티드 중 하나를 대체하는 치환의 형태이다.

융합(fusions)은 이전에 분리된 2 개의 유전자로부터 형성된 하이브리드 유전자를 생성할 수 있다. 이는 전좌(translocation), 사이 결실(interstitial deletion), 또는 염색체 역위(chromosomal inversion)의 결과로서 발생할 수 있다. 종종, 융합 유전자는 온코진(oncogenes)이다. 온코진 융합 유전자는 2 개의 융합 파트너와는 상이하거나 새로운 기능을 갖는 유전자 산물을 유도할 수 있다. 대안적으로, 프로토-온코진(proto-oncogene)은 강력한 프로모터에 융합됨으로써, 온코진 기능이 상류 융합 파트너의 강력한 프로모터에 의해 야기되는 상향 조절에 의해 기능하도록 설정된다. 온코진 융합 전사체는 또한 트랜스-스플라이싱 또는 번역초과(read-through) 이벤트에 의해서도 유도될 수 있다.

본 발명에 따르면, 용어 “염색체파열(chromothripsis)”은 한 번의 파괴적인 이벤트를 통해 게놈의 특정 영역이 산산조각난 후 함께 봉합되는 유전 현상을 지칭한다.

본 발명에 따르면, 용어 “RNA 편집(RNA edit)” 또는 “RNA 편집(RNA editing)”은 RNA 분자의 정보 내용이 기본 구성의 화학적 변화를 통해 변경되는 분자적 프로세스를 지칭한다. RNA 편집은 시티딘 (C)에서 우리딘 (U) 및 아데노신 (A)에서 이노신 (I) 탈아민화와 같은 뉴클레오티드 변형뿐만 아니라, 비템플릿(non-templated) 핵산 첨가 및 삽입도 포함한다. mRNA에서의 RNA 편집은 코딩된 단백질의 아미노산 서열을 효과적으로 변화시키므로, 이는 게놈 DNA 서열에 의해 예측된 것과 상이하다.

용어 “암 돌연변이 시그니처(cancer mutation signature)”는 비암성 레퍼런스 세포와 비교할 때 암 세포에 존재하는 돌연변이의 세트를 지칭한다.

본 발명에 따르면, “레퍼런스”는 종양 검체로부터의 결과를 연관 및 비교하는 데 사용될 수 있다. 일반적으로 “레퍼런스”는 환자 또는 하나 이상의 상이한 개체, 바람직하게는 건강한 개체, 특히 동일한 종의 개체로부터 수득된, 하나 이상의 정상 검체, 특히 암 질환에 영향을 받지 않은 검체에 기초하여 수득될 수 있다. “레퍼런스”는 충분히 많은 수의 정상 검체를 시험함으로써 실험적으로 결정될 수 있다.

돌연변이를 결정하기 위한 임의의 적합한 시퀀싱 방법이 본 발명에 따라 사용될 수 있으며, 차세대 시퀀싱 (Next Generation Sequencing; NGS) 기술이 바람직하다. 3 세대 시퀀싱 방법은 향후 상기 방법의 시퀀싱 단계를 가속화하기 위하여 NGS 기술을 대체할 수 있다. 명확한 설명을 위하여: 본 발명의 문맥상, 용어 “차세대 시퀀싱” 또는 “NGS”는 Sanger 화학으로 알려진 “종래의” 시퀀싱 방법과는 달리, 전체 게놈을 작은 조각으로 분해하여 전체 게놈을 따라 핵산 템플릿을 무작위로 리딩하는 모든 새로운 고효율(high throughput) 시퀀싱 기술을 의미한다. 이러한 NGS 기술 (대규모 병렬 시퀀싱 기술(massively parallel sequencing technologies)이라고도 함)은 전체 게놈, 엑솜, 트랜스크립톰 (게놈의 모든 전사된 서열) 또는 메틸롬(methylome) (게놈의 모든 메틸화된 서열)의 핵산 서열 정보를 매우 짧은 시간 내, 예컨대 1-2 주 내, 바람직하게는 1-7 일 내 또는 가장 바람직하게는 24 시간 이내에 전달할 수 있고, 이론상으로는, 단일 세포 시퀀싱 접근법을 가능하게 한다. 상업적으로 입수 가능하거나 문헌에 언급된 여러 NGS 플랫폼이 본 발명과 관련하여 사용될 수 있으며, 예컨대 문헌 Zhang et al. 2011: The impact of next-generation sequencing on genomics . J. Genet Genomics 38 (3), 95-109; 또는 Voelkerding et al. 2009: Next generation sequencing: From basic research to diagnostics. Clinical chemistry 55, 641-658에 상세히 설명되어 있다. 이러한 NGS 기술/플랫폼의 비제한적인 예시들은 다음과 같다

1) 예컨대, Roche-관련 회사 454 Life Sciences (Branford, Connecticut)의 GS-FLX 454 Genome Sequencer^TM에서 실시되고, 문헌 Ronaghi et al. 1998: A sequencing method based on real-time pyrophosphate". Science 281 (5375), 363-365에 처음으로 설명된 파이로 시퀀싱 (pyrosequencing)으로 알려진, 시퀀싱-바이-합성(sequencing-by-synthesis) 기술. 이 기술은 단일 가닥 DNA 결합 비드를 에멀젼 PCR 증폭을 위해 오일로 둘러싸인 PCR 반응물을 함유하는 수성 미셀로 격렬한 볼텍싱에 의해 캡슐화하는 에멀젼 PCR을 사용한다. 파이로시퀀싱 프로세스 중, 뉴클레오티드 혼입 동안 포스페이트 분자로부터 방출된 빛은 폴리머라제가 DNA 가닥을 합성함에 따라 기록된다.

2) 가역성 염료-터미네이터를 기반으로 하는 Solexa (현재 Illumina Inc., San Diego, California의 일부)에 의해 개발되고, 예컨대 Illumina/Solexa Genome Analyzer ^TM 및 Illumina HiSeq 2000 Genome Analyzer^TM에서 실시된 시퀀싱-바이-합성 접근법. 이 기술에서, 4 종의 뉴클레오티드 모두가 DNA 폴리머라제와 함께 유동-세포 채널 내 올리고-프라이밍된 클러스터 단편에 동시에 첨가된다. 브릿지 증폭은 시퀀싱을 위해 형광 표지된 4 종의 뉴클레오티드 모두와 함께 클러스터 가닥을 연장시킨다.

3) 예컨대, Applied Biosystems (현재 Life Technologies Corporation, Carlsbad, California)의 SOLid^TM 플랫폼에서 실시된 시퀀싱-바이-결찰(sequencing-by-ligation) 접근법. 이 기술에서, 고정된 길이의 모든 가능한 올리고 뉴클레오티드의 풀은 시퀀싱된 위치에 따라 표지된다. 올리고 뉴클레오티드는 어닐링 및 결찰되고; 일치하는 서열에 대한 DNA 리가아제에 의한 우선적인 결찰은 그 위치에서 뉴클레오티드의 신호 정보를 제공한다. 시퀀싱 전, DNA는 에멀젼 PCR에 의해 증폭된다. 각각 동일한 DNA 분자의 카피만을 함유하는 생성된 비드는, 유리 슬라이드 상에 부착된다. 두 번째 예시로서, Dover Systems (Salem, New Hampshire)의 Polonator^TM G.007 플랫폼 또한 무작위로 배열된, 비드 기반의, 에멀젼 PCR을 사용함으로써 시퀀싱-바이-결찰 접근법을 사용하여 병렬 시퀀싱을 위한 DNA 단편을 증폭한다.

4) 예컨대, Pacific Biosciences (Menlo Park, California)의 PacBio RS 시스템 또는 Helicos Biosciences (Cambridge, Massachusetts)의 HeliScope^TM 플랫폼에서 실시된 것과 같은 단일 분자 시퀀싱(single-molecule sequencing) 기술. 이 기술의 눈에 띄는 특징은 증폭 없이 단일 DNA 또는 RNA 분자를 시퀀싱하는 능력으로, Single-Molecule Real Time (SMRT) DNA 시퀀싱으로 정의된다. 예를 들어, HeliScope는 고감도의 형광 검출 시스템을 사용하여, 각 뉴클레오티드가 함성됨에 따라, 각 뉴클레오티드를 직접 검출한다. 형광 공명 에너지 전달 (fluorescence resonance energy transfer; FRET)에 기반한 유사한 접근법이 Visigen Biotechnology (Houston, Texas)에서 개발된 바 있다. 기타 형광-기반 단일 분자 기술들은 미국 Genomics (GeneEngine^TM) 및 Genovoxx (AnyGene^TM)에서 개발되었다.

5) 복제 중 단일 가닥 상의 폴리머라제 분자의 움직임을 모니터링하기 위해 예컨대 칩 상에 배열된 다양한 나노구조물이 사용되는, 단일 분자 시퀀싱을 위한 나노 기술. 나노 기술에 기반한 접근법의 비제한적 예시로는 Oxford Nanopore Technologies (Oxford, UK)의 GridON^TM 플랫폼, Nabsys (Providence, Rhode Island)에서 개발된 하이브리드화-보조 나노-포어 시퀀싱 (HANS^TM) 플랫폼, 및 조합 프로브-앵커 결찰 (cPAL^TM)이라고 불리는 DNA 나노볼 (DNB) 기술을 이용한 전매 리가아제-기반 DNA 시퀀싱 플랫폼이 있다.

6) 예컨대, LightSpeed Genomics (Sunnyvale, California) 및 Halcyon Molecular (Redwood City, California)에서 개발된, 단일 분자 시퀀싱을 위한 전자 현미경 기반 기술.

7) DNA의 중합 과정에서 방출된 수소 이온의 검출에 기반한 이온 반도체 시퀀싱. 예를 들어, Ion Torrent Systems (San Francisco, California)은 미세-가공된(micro-machined) 웰의 고밀도 어레이를 사용하여 대규모 병렬식으로 이 생화학적 프로세스를 수행한다. 각 웰은 상이한 DNA 템플릿을 가지고 있다. 웰 밑에는 이온-민감성 층이 있고 그 밑에는 전매 Ion 센서가 있다.

바람직하게는, DNA 및 RNA 제제는 NGS의 출발 물질로서 작용한다. 이러한 핵산은 생물학적 물질과 같은 샘플로부터, 예컨대 신선한, 급속-냉동된(flash-frozen) 또는 포르말린-고정 파라핀 포매된(formalin-fixed paraffin embedded; FFPE) 종양 조직으로부터, 또는 갓 단리된 세포로부터, 또는 환자의 말초 혈액에 존재하는 CTCs로부터 쉽게 수득될 수 있다. 정상 비-돌연변이 게놈 DNA 또는 RNA는 정상 체세포 조직으로부터 추출될 수 있지만, 본 발명의 문맥상, 생식 세포가 바람직하다. 생식 계열 DNA 또는 RNA는 비-혈액학적 악성 종양 환자의 말초 혈액 단핵 세포 (PBMCs)로부터 추출될 수 있다. FFPE 조직 또는 갓 단리된 단일 세포로부터 추출된 핵산은 매우 단편화되었지만, 이들은 NGS 적용에 적합하다.

엑솜 시퀀싱을 위한 몇몇 표적화된 NGS 방법은 문헌에 기재되어 있으며 (예컨대, Teer 및 Mullikin 2010: Human Mol Genet 19 (2), R145-51 참조), 이들 모두는 본 발명과 관련하여 사용될 수 있다. 이들 방법 중 다수는 (예컨대, 게놈 포획(capture), 게놈 파티셔닝(partitioning), 게놈 풍부화(enrichment) 등으로 기재됨) 하이브리드화 기술을 사용하고, 어레이-기반 (예컨대, Hodges et al. 2007: Nat. Genet. 39, 1522-1527) 및 액체-기반 (예컨대, Choi et al. 2009: Proc . Natl. Acad . Sci USA 106, 19096-19101) 하이브리드화 접근법을 포함한다. DNA 샘플 제조 및 후속적인 엑솜 포획을 위한 시판 키트 또한 입수 가능하다: 예를 들어, Illumina Inc. (San Diego, California)은 TruSeq^TM DNA Sample Preparation Kit 및 Exome Enrichment Kit TruSeq^TM Exome Enrichment Kit를 제공한다.

예컨대, 종양 샘플의 서열을 생식 계열 샘플의 서열과 같은 레퍼런스 샘플의 서열과 비교할 때, 암 특이적 체세포 돌연변이 또는 서열 차이를 검출함에 있어서 위양성 결과의 수를 줄이기 위하여, 이들 샘플 유형 중 하나 또는 둘 모두를 반복하여 서열을 결정하는 것이 바람직하다. 따라서, 생식 계열 샘플의 서열과 같은 레퍼런스 샘플의 서열은 2 회, 3 회 또는 그 이상으로 결정되는 것이 바람직하다. 대안적으로 또는 부가적으로, 종양 샘플의 서열은 2 회, 3 회 또는 그 이상으로 결정된다. 또한, 생식 계열 샘플과 같은 레퍼런스 샘플 및/또는 종양 샘플의 RNA의 서열을 적어도 1 회 결정하고 게놈 DNA의 서열을 적어도 1 회 결정함으로써, 상기 생식 계열 샘플의 서열과 같은 레퍼런스 샘플의 서열 및/또는 상기 종양 샘플의 서열을 2 회 이상 결정할 수 있다. 예를 들어, 생식 계열 샘플과 같은 레퍼런스 샘플의 복제물들 간의 변이를 결정함으로써, 위양성 체세포 돌연변이의 예상 비율 (FDR)을 통계학적 정량법으로 평가할 수 있다. 샘플의 기술적 반복은 동일한 결과를 생성하여야 하며 이 “동일 vs. 동일 비교”에서 검출되는 모든 돌연변이는 위양성이다. 특히, 레퍼런스 샘플에 대한 종양 샘플에서 체세포 돌연변이 검출에 대한 오발견율(false discovery rate)을 결정하기 위하여, 레퍼런스 샘플의 기술적 반복을 레퍼런스로서 사용하여 위양성의 수를 평가할 수 있다. 또한, 다양한 품질 관련 메트릭스 (예컨대, 커버리지 또는 SNP 품질)를 기계 학습 접근법을 사용하여 단일 품질 스코어로 통합할 수도 있다. 주어진 체세포 변이에 대하여, 초과 품질 스코어를 갖는 다른 모든 변이를 계수하여, 데이터세트의 모든 변이를 순위화할 수 있다.

본 발명의 문맥상, 용어 “RNA”는 적어도 하나의 리보뉴클레오티드 잔기를 포함하고 바람직하게는 리보뉴클레오티드 잔기로 완전히 구성되거나 실질적으로 구성된 분자에 관한 것이다. “리보뉴클레오티드”는 β-D-리보푸라노실기의 2'-위치에 히드록시기를 갖는 뉴클레오티드에 관한 것이다. 용어 “RNA”는 이중 가닥 RNA, 단일 가닥 RNA, 단리된 RNA (예컨대, 부분적으로 또는 완전히 정제된 RNA), 본질적으로 순수한 RNA, 합성 RNA, 및 재조합적으로 생성된 RNA (예컨대 하나 이상의 뉴클레오티드의 삽입, 결실, 치환 및/또는 변경에 의해 자연 발생 RNA와 상이한 변형 RNA)를 포함한다. 이러한 변경은 RNA의 말단(들) 또는 내부에, 예컨대 RNA의 하나 이상의 뉴클레오티드에 비뉴클레오티드 물질를 첨가하는 것을 포함할 수 있다. 또한, RNA 분자 내 뉴클레오티드는 비표준 뉴클레오티드, 예컨대 비-자연 발생 뉴클레오티드 또는 화학적으로 합성된 뉴클레오티드 또는 데옥시뉴클레오티드를 포함할 수도 있다. 이들 변경된 RNA는 유사체 또는 자연 발생 RNA의 유사체라고 지칭될 수 있다.

본 발명에 따르면, 용어 “RNA”는 “mRNA”를 포함하며 바람직하게는 “mRNA”에 관한 것이다. 용어 “mRNA”는 “메신저-RNA(messenger-RNA)”를 의미하며, DNA 템플릿을 사용하여 생성되고 펩티드 또는 폴리펩티드를 코딩하는 “전사체(transcript)”에 관한 것이다. 일반적으로, mRNA는 5'-UTR, 단백질 코딩 영역, 3'-UTR 및 경우에 따라 폴리(A) 꼬리를 포함한다. mRNA는 세포와 시험관 내에서 오직 제한된 반감기만을 갖는다. 본 발명의 문맥상, mRNA는 DNA 템플릿으로부터 시험관 내 전사에 의해 생성될 수 있다. 시험관 내 전사 방법론은 통상의 기술자에게 알려져 있다. 예를 들어, 상업적으로 입수 가능한 다양한 시험관 내 전사 키트가 존재한다.

본 발명에 따르면, RNA의 안정성 및 번역 효율은 필요에 따라 변형될 수 있다. 예를 들어, RNA는 RNA의 안정화 효과를 갖는 및/또는 번역 효율를 증가시키는 하나 이상의 변형에 의하여, 안정화될 수 있고 그의 번역이 증가할 수 있다. 이러한 변형은, 예컨대 본원에 참조 문헌으로 통합된 PCT/EP2006/009448에 기재되어 있다. 본 발명에 따라 사용된 RNA의 발현을 증가시키기 위하여, 코딩 영역 내에서, 즉 발현된 펩티드 또는 단백질을 코딩하는 서열 내에서, 바람직하게는 발현된 펩티드 또는 단백질의 서열 변경 없이 이를 변형시켜, mRNA 안정성을 증가시키고 코돈 최적화를 수행하기 위하여 GC-함량을 증가시키고, 이로써 세포 내 번역을 증강시킨다.

본 발명에서 사용된 RNA와 관련하여, 용어 “변형(modification)”은 상기 RNA에 자연적으로 존재하지 않는 RNA의 임의의 변형을 포함한다.

본 발명의 일 구체예에서, 본 발명에 따라 사용된 RNA는 캡핑되지 않은 5'-트리포스페이트를 갖지 않는다. 이러한 캡핑되지 않은 5'-트리포스페이트의 제거는 RNA를 포스파타제로 처리함으로써 달성될 수 있다.

본 발명에 따르면, RNA는 그의 안정성을 증가시키고 및/또는 세포 독성을 감소시키기 위하여 변형된 리보뉴클레오티드를 가질 수 있다. 예를 들어, 일 구체예에서, 본 발명에 따라 사용된 RNA에서 5-메틸시티딘은 부분적으로 또는 완전히, 바람직하게는 완전히 시티딘으로 치환된다. 대안적으로 또는 부가적으로, 일 구체예에서, 본 발명에 따라 사용된 RNA에서 슈도우리딘은 부분적으로 또는 완전히, 바람직하게는 완전히 우리딘으로 치환된다.

일 구체예에서, 용어 “변형(modification)”은 RNA에 5'-캡 또는 5'-캡 유사체를 제공하는 것에 관한 것이다. 용어 “5'-캡”은 mRNA 분자의 5'-말단에서 발견되는 캡 구조물을 지칭하며 일반적으로 흔치 않은 5'에서 5'로의 트리포스페이트 결합을 통해 mRNA에 연결된 구아노신 뉴클레오티드로 구성된다. 일 구체예에서, 이 구아노신은 7-위치에서 메틸화된다. 용어 “통상적인 5'-캡”은 자연 발생적인 RNA 5'-캡, 바람직하게는 7-메틸구아노신 캡 (m⁷G)을 지칭한다. 본 발명의 문맥상, 용어 “5'-캡”은 RNA 캡 구조물을 닮은 5'-캡 유사체를 포함하며, 바람직하게는 생체 내 및/또는 세포 내에서 부착된 경우 RNA를 안정화시키고 및/또는 RNA의 번역을 증강시키는 능력을 갖도록 변형된다.

RNA에 5'-캡 또는 5'-캡 유사체를 제공하는 것은 상기 5'-캡 또는 5'-캡 유사체의 존재하에서 DNA 템플릿의 시험관 내 전사에 의해 달성될 수 있으며, 여기서 상기 5'-캡은 생성된 RNA 가닥에 공동전사로(co-transcriptionally) 혼입되거나, RNA는 예컨대 시험관 내 전사에 의해 생성될 수 있고, 5'-캡은 캡핑 효소들, 예컨대 백시니아 바이러스의 캡핑 효소들을 사용하여 전사 후(post-transcriptionally) RNA에 부착될 수 있다.

RNA는 추가적인 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에서 사용된 RNA의 추가적인 변형은 자연 발생 폴리(A) 꼬리의 연장 또는 절단(truncation), 또는 5'- 또는 3'- 비번역 영역 (UTR)의 변경, 예컨대 상기 RNA의 코딩 영역과 관련이 없는 UTR의 도입일 수 있으며, 예를 들어, 글로빈 유전자 (예컨대, 알파2-글로빈, 알파1-글로빈, 베타-글로빈, 바람직하게는 베타-글로빈, 더 바람직하게는 인간 베타-글로빈)로부터 유래된 3'-UTR의 하나 이상의 카피, 바람직하게는 2 개의 카피의 삽입 또는 기존의 3'-UTR과의 교환일 수 있다.

언마스킹된(unmasked) 폴리-A 서열을 갖는 RNA는 마스킹된(masked) 폴리-A 서열을 갖는 RNA에 비해 더 효과적으로 번역된다. 용어 “폴리(A) 꼬리(tail)” 또는 “폴리-A 서열”은 일반적으로 RNA 분자의 3'-말단에 위치하는 아데닐 (A) 잔기의 서열에 관한 것이며, “언마스킹된 폴리-A 서열”은 RNA 분자의 3' 말단에서의 폴리-A 서열이 폴리-A 서열의 A로 끝나고, 폴리-A 서열의 3' 말단, 즉 하류에 위치한 A 이외의 뉴클레오티드가 뒤따르지 않는다는 것을 의미한다. 또한, 약 120 염기쌍의 긴 폴리-A 서열은 RNA의 최적의 전사 안정성 및 번역 효율을 초래한다.

따라서, 본 발명에 따라 사용된 RNA의 안정성 및/또는 발현을 증가시키기 위하여, 바람직하게는 길이가 10 내지 500 개, 더 바람직하게는 30 내지 300 개, 더욱 더 바람직하게는 65 내지 200 및 특히 100 내지 150 개의 아데노신 잔기인 폴리-A 서열과 함께 존재하도록 변형될 수 있다. 특히 바람직한 일 구체예에서, 폴리-A 서열은 길이가 약 120 개의 아데노신 잔기이다. 본 발명에 따라 사용된 RNA의 안정성 및/또는 발현을 더 증가시키기 위하여, 폴리-A 서열은 언마스킹될 수 있다.

또한, RNA 분자의 3'-비번역 영역에 3'-비번역 영역 (UTR)을 혼입시키면 번역 효율이 증강될 수 있다. 시너지 효과는 이러한 3'-비번역 영역을 2 개 이상 혼입시킴으로써 달성될 수 있다. 3'-비번역 영역은 이들이 도입되는 RNA와 동종 또는 이종일 수 있다. 특정한 일 구체예에서, 3'-비번역 영역은 인간 β글로빈 유전자로부터 유래된다.

전술한 변형의 조합, 즉 폴리-A 서열의 혼입, 폴리-A 서열의 언마스킹 및 하나 이상의 3'-비번역 영역의 혼입은 RNA의 안정성 및 번역 효율의 증가에 시너지 영향을 미친다.

용어 RNA의 “안정성”은 RNA의 “반감기”에 관한 것이다. “반감기”는 분자의 활성, 양 또는 수의 절반을 제거하는 데 필요한 시간에 관한 것이다. 본 발명의 문맥상, RNA의 반감기는 상기 RNA의 안정성의 지표이다. RNA의 반감기는 RNA의 “발현 지속 시간”에 영향을 미칠 수 있다. 반감기가 긴 RNA는 장시간 동안 발현될 것으로 예상할 수 있다.

물론, 본 발명에 따라, RNA의 안정성 및/또는 번역 효율을 감소시키는 것을 목적하는 경우, 전술한 바와 같이 RNA의 안정성 및/또는 번역 효율을 증가시키는 요소들의 기능을 방해하도록 RNA를 변형시키는 것이 가능하다.

용어 “발현(expression)”은 가장 일반적인 의미로 본 발명에서 사용되었으며, RNA 및/또는 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질을 예컨대 전사 및/또는 번역에 의해 생산하는 것을 포함한다. RNA와 관련하여, 용어 “발현” 또는 “번역”은 특히 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질의 생산에 관한 것이다. 이는 또한 핵산의 부분적인 발현도 포함한다. 또한, 발현은 일시적이거나 안정적일 수 있다.

본 발명에 따르면, 용어 발현은 또한 “비정상적인 발현(aberrant expression)” 또는 “이상 발현(abnormal expression)”도 포함한다. 본 발명에 따르면, “비정상적인 발현” 또는 “이상 발현”은 발현이 레퍼런스, 예컨대 대상체 내에 특정 단백질 (예컨대, 종양 항원)의 비정상적 또는 이상 발현과 관련된 질환이 없는 상태인 레퍼런스와 비교하여 변경된, 바람직하게는 증가된 것을 의미한다. 발현의 증가는 적어도 10%, 특히 적어도 20%, 적어도 50% 또는 적어도 100%, 또는 그 이상의 증가를 지칭한다. 일 구체예에서, 발현은 질환 조직에서만 발견되는 반면, 건강한 조직에서의 발현은 억제된다.

용어 “특이적으로 발현된(specifically expressed)”은 단백질이 본질적으로 특정 조직 또는 기관에서만 발현되는 것을 의미한다. 예를 들어, 위 점막에서 특이적으로 발현된 종양 항원은, 상기 단백질이 위 점막에서 일차적으로 발현되고 다른 조직에서 발현되지 않거나 또는 다른 조직 또는 기관 유형에서는 유의한 정도로 발현되지 않은 것을 의미한다. 따라서, 위 점막의 세포에서 독점적으로 발현되고 임의의 다른 조직, 예컨대 고환에서는 훨씬 낮은 정도로 발현된 단백질은 위 점막의 세포에서 특이적으로 발현되는 것이다. 일부 구체예에서, 종양 항원은 또한 정상 조건하에서 하나 이상의 조직 유형 또는 기관에서, 예컨대 2 또는 3 개의 조직 유형 또는 기관에서, 그러나 바람직하게는 3 개 이하의 상이한 조직 또는 기관 유형에서 특이적으로 발현될 수 있다. 이 경우, 종양 항원은 이들 기관에서 특이적으로 발현되는 것이다. 예를 들어, 종양 항원이 정상 조건하에서 바람직하게는 폐 및 위에서 거의 같은 정도로 발현되는 경우, 상기 종양 항원은 폐 및 위에서 특이적으로 발현되는 것이다.

본 발명의 문맥상, 용어 “전사(transcription)”는 DNA 서열 내의 유전자 코드가 RNA로 전사되는 프로세스에 관한 것이다. 이어서, RNA는 단백질로 번역될 수 있다. 본 발명에 따르면, 용어 “전사”는 “시험관 내 전사”를 포함하며, 여기서 용어 “시험관 내 전사”는 RNA, 특히 mRNA가 무세포계에서, 바람직하게는 적절한 세포 추출물을 사용하여 시험관 내 합성되는 프로세스에 관한 것이다. 바람직하게는, 클로닝 벡터는 전사체를 생성하는 데 적용된다. 이들 클로닝 벡터는 일반적으로 전사 벡터로 지정되고, 본 발명에 따라 용어 “벡터”에 포괄된다. 본 발명에 따르면, 본 발명에서 사용된 RNA는 바람직하게는 시험관 내 전사된 RNA (IVT-RNA)이고, 적절한 DNA 템플릿의 시험관 내 전사에 의해 수득될 수 있다. 전사를 조절하기 위한 프로모터는 임의의 RNA 폴리머라제에 대한 임의의 프로모터일 수 있다. RNA 폴리머라제의 특정 예시로는 T7, T3 및 SP6 RNA 폴리머라제가 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 시험관 내 전사는 T7 또는 SP6 프로모터에 의해 조절된다. 시험관 내 전사를 위한 DNA 템플릿은 핵산, 특히 cDNA를 클로닝하고, 이를 시험관 내 전사를 위하여 적절한 벡터 내로 도입함으로써 수득할 수 있다. cDNA는 RNA의 역전사에 의해 수득될 수 있다.

본 발명에 따른 용어 “번역(translation)”은 세포의 리보솜 내 프로세스에 관한 것으로, 메신저 RNA의 한 가닥이 아미노산 서열의 조립을 지시하여 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질을 만든다.

본 발명에 따르면, 핵산과 기능적으로 연결될 수 있는 발현 조절 서열(expression control sequences) 또는 조절 서열(regulatory sequences)은 상기 핵산과 동종 또는 이종일 수 있다. 코딩 서열 및 조절 서열은, 이들이 함께 공유적으로 결합된 경우 함께 “기능적으로” 연결되어, 상기 코딩 서열의 전사 또는 번역이 상기 조절 서열의 영향하에 있거나 조절하에 있게 된다. 코딩 서열이, 조절 서열과 코딩 서열의 기능적 결합을 갖는 기능성 단백질로 번역되는 경우, 조절 서열의 유도는 코딩 서열에서의 리딩 프레임 시프트를 일으키지 않거나 목적하는 단백질 또는 펩티드로 번역되는 코딩 서열의 불능을 일으키지 않고 코딩 서열의 전사를 유도한다.

본 발명에 따르면, 용어 “발현 조절 서열(expression control sequences)” 또는 “조절 서열(regulatory sequences)”은 핵산의 전사 또는 유래된 RNA의 번역을 조절하는 프로모터, 리보솜-결합 서열 및 기타 조절 요소들을 포함한다. 본 발명의 특정 구체예들에서, 조절 서열은 조절될 수 있다. 조절 서열의 정확한 구조는 종 또는 세포 유형에 따라 다양할 수 있지만, 일반적으로 TATA-박스, 캡핑-서열, CAAT-서열 등과 같은 전사 또는 번역의 개시에 관여하는 5'-비전사 및 5'- 및 3'- 비번역 서열을 포함한다. 특히, 5'-비전사 조절 서열은 기능적으로 결합된 유전자의 전사 조절을 위한 프로모터 서열을 포함하는 프로모터 영역을 포함한다. 조절 서열은 또한 인핸서 서열 또는 상류에 활성자 서열을 포함할 수 있다.

바람직하게는, 본 발명에 따르면, 세포에서 발현되는 RNA는 상기 세포 내로 도입된다. 본 발명의 방법의 일 구체예에서, 세포 내로 도입되는 RNA는 적절한 DNA 템플릿의 시험관 내 전사에 의해 수득된다.

본 발명에 따르면, “…를 발현할 수 있는 RNA” 및 “…를 코딩하는 RNA”와 같은 용어는 본원에서 상호 교환적으로 사용되며, 특정 펩티드 또는 폴리펩티드와 관련하여 RNA가 적절한 환경, 바람직하게는 세포 내에 존재하는 경우 상기 펩티드 또는 폴리펩티드를 생산하도록 발현될 수 있다는 것을 의미한다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 RNA는 세포 번역 기계(cellular translation machinery)와 상호 작용하여 그것이 발현할 수 있는 펩티드 또는 폴리펩티드를 제공할 수 있다.

“전달(transferring)”, “도입(introducing)” 또는 “트랜스펙션(transfecting)”과 같은 용어는 본원에서 상호 교환적으로 사용되며, 핵산, 특히 외인성 또는 이종 핵산, 특히 RNA를 세포 내로 도입하는 것에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 세포는 기관, 조직 및/또는 생물체의 일부를 형성할 수 있다. 본 발명에 따르면, 핵산의 투여는 네이키드 핵산으로서 또는 투여 시약과의 조합으로서 달성된다. 바람직하게는, 핵산의 투여는 네이키드 핵산의 형태로 이루어진다. 바람직하게는, RNA는 RNase 억제제와 같은 안정화 물질과 조합하여 투여된다. 본 발명은 또한 핵산을 세포 내로 반복 도입하여 발현을 장기간 동안 지속되도록 하는 것을 구상한다.

세포는 RNA가 결합될 수 있는, 예컨대 RNA와 복합체를 형성하거나 RNA가 봉입 또는 캡슐화된 소포를 형성함으로써 결합될 수 있는 임의의 담체로 트랜스펙션되어, 네이키드 RNA에 비하여 RNA의 안정성을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 유용한 담체는 양이온성 지질, 리포좀, 특히 양이온성 리포좀, 및 미셀, 및 나노입자와 같은 지질-함유 담체를 포함한다. 양이온성 지질은 음으로 하전된 핵산과 복합체를 형성할 수 있다. 임의의 양이온성 지질은 본 발명에 따라 사용될 수 있다.

바람직하게는, 펩티드 또는 폴리펩티드를 코딩하는 RNA의 세포, 특히 생체 내 존재하는 세포 내로의 도입은 상기 세포 내 펩티드 또는 폴리펩티드의 발현을 초래한다. 특정 구체예에서, 특정 세포에 대한 핵산의 표적화가 바람직하다. 이러한 구체예에서, 핵산을 세포에 투여하기 위해 적용되는 담체 (예컨대, 레트로바이러스 또는 리포좀)는 표적화 분자를 나타낸다. 예를 들어, 표적 세포 상의 표면 막 단백질에 특이적인 항체 또는 표적 세포 상의 수용체에 대한 리간드와 같은 분자는 핵산 담체에 혼입되거나 그에 결합될 수 있다. 핵산이 리포좀에 의해 투여되는 경우, 엔도시토시스와 연관된 표면 막 단백질에 결합하는 단백질은 표적화 및/또는 포획(uptake)을 가능하게 하기 위하여 리포좀 제제에 혼입될 수 있다. 이러한 단백질은 특정 세포 유형에 특이적인 그의 단편의 캡시드 단백질, 내재화된 단백질에 대한 항체, 세포 내 위치를 표적화하는 단백질 등을 포괄한다.

용어 “세포” 또는 “숙주 세포”는 바람직하게는 온전한(intact) 세포, 즉 효소, 세포소기관 또는 유전 물질과 같은 그의 정상적인 세포 내 성분들을 방출한 바 없는 온전한 막을 갖는 세포이다. 온전한 세포는 바람직하게는 생존(viable) 세포, 즉 그의 정상적인 대사 기능을 수행할 수 있는 살아 있는 세포이다. 바람직하게는, 상기 용어는 본 발명에 따라 외인성 핵산으로 형질 전환 또는 트랜스펙션될 수 있는 임의의 세포에 관한 것이다. 용어 “세포”는 본 발명에 따라 원핵 세포 (예컨대, E. coli) 또는 진핵 세포 (예컨대, 수지상 세포, B 세포, CHO 세포, COS 세포, K562 세포, HEK293 세포, HELA 세포, 효모 세포 및 곤충 세포)를 포함한다. 외인성 핵산은 세포 내부에서 (i) 자체적으로 자유롭게 분산되거나, (ii) 재조합 벡터에 혼입되거나, 또는 (iii) 숙주 세포 게놈 또는 미토콘드리아 DNA에 통합된 상태로 발견될 수 있다. 인간, 마우스, 햄스터, 돼지, 염소 및 영장류의 세포와 같은 포유류 세포가 특히 바람직하다. 세포는 다수의 조직 유형에서 유래될 수 있으며, 일차 세포 및 세포주를 포함한다. 특정 예시로는 케라티노사이트(keratinocytes), 말초 혈액 백혈구, 골수 줄기 세포 및 배아 줄기 세포가 있다. 또 다른 구체예에서, 세포는 항원 제시 세포, 특히 수지상 세포, 단핵구 또는 대식세포이다.

핵산 분자를 포함하는 세포는 바람직하게는 상기 핵산에 의해 코딩되는 펩티드 또는 폴리펩티드를 발현한다.

용어 “클론 확장(clonal expansion)”은 특정 개체가 증식되는 프로세스를 지칭한다. 본 발명의 문맥상, 상기 용어는 바람직하게는 림프구가 항원에 의해 자극되어 증식하고, 상기 항원을 인식하는 특이적 림프구가 증폭되는, 면역학적 반응과 관련하여 사용된다. 바람직하게는, 클론 확장은 림프구의 분화를 유도한다.

“감소하는(reducing)” 또는 “억제하는(inhibiting)”과 같은 용어는 전체적인 감소, 바람직하게는 5% 이상, 10% 이상, 20% 이상, 더 바람직하게는 50% 이상, 및 가장 바람직하게는 75% 이상 수준의 감소를 일으키는 능력에 관한 것이다. 용어 “억제하는” 또는 이와 유사한 문구들은 완전한 또는 본질적으로 완전한 억제, 즉 0으로의 또는 본질적으로 0으로의 감소를 포함한다.

“증가하는(increasing)”, “증강시키는(enhancing)”, “촉진하는(promoting)” 또는 “연장시키는(prolonging)”과 같은 용어는 바람직하게는 약 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 30%, 바람직하게는 적어도 40%, 바람직하게는 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 100%, 바람직하게는 적어도 200%, 및 특히 적어도 300%로의 증가, 증강, 촉진 또는 연장에 관한 것이다. 이들 용어는 또한 0 또는 측정 불가하거나 검출 불가한 수준에서 0 이상의 수준 또는 측정 가능하거나 검출 가능한 수준까지의 증가, 증강, 촉진 또는 연장에 관한 것이다.

본 발명은 바람직하게는 본 발명의 방법에 의한 면역 치료에 유용한 것으로 예측된 아미노산 변형 또는 변형된 단백질 또는 단백질 단편에 기초하여 설계된 암 백신과 같은 백신을 제공한다.

본 발명에 따르면, 용어 “백신”은 투여시 암 세포와 같은 질환 세포 또는 병원체를 인식하고 공격하는 면역 반응, 특히 세포성 면역 반응을 유도하는 약학 제제 (약학 조성물) 또는 제품에 관한 것이다. 백신은 질환을 예방 또는 치료하는 데 사용될 수 있다. 용어 “맞춤형 암 백신(personalized cancer vaccine)” 또는 “개별 암 백신(individualized cancer vaccine)”은 특정 암 환자에 관한 것이며, 암 백신이 개별적인 암 환자의 필요 또는 특수 상황에 알맞게 조정된 것을 의미한다.

일 구체예에서, 본 발명에 따라 제공된 백신은 본 발명의 방법에 따라 면역 치료에 유용한 것으로 예측된 하나 이상의 아미노산 변형 또는 하나 이상의 변형된 펩티드를 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드, 또는 상기 펩티드 또는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 바람직하게는 RNA를 포함할 수 있다.

본 발명에 따라 제공된 암 백신은 환자에 투여될 때 바람직하게는 환자의 종양과 같은 환자의 질환 세포에 특이적인 T 세포를 자극, 프라이밍 및/또는 확장시키는 데 적합한 하나 이상의 T 세포 에피토프를 제공한다. T 세포는 바람직하게는 T 세포 에피토프가 유래된 항원을 발현하는 세포에 대하여 지향된다. 본원에 기재된 백신은 바람직하게는 클래스 ⅠMHC로의 하나 이상의 종양 관련 신생 항원의 제시를 특징으로 하는 암 질환에 대한 세포성 반응, 바람직하게는 세포 독성 T 세포 활성을 유도 또는 촉진할 수 있다. 암 특이적 돌연변이를 표적화하는 백신은 환자의 종양에 특이적일 것이다.

본 발명에 따라 제공된 백신은 환자에 투여될 때 바람직하게는 T 세포 에피토프를 하나 이상, 예컨대 2 개 이상, 5 개 이상, 10 개 이상, 15 개 이상, 20 개 이상, 25 개 이상, 30 개 이상 및 바람직하게는 최대 60 개, 최대 55 개, 최대 50 개, 최대 45 개, 최대 40 개, 최대 35 개, 최대 30 개의 T 세포 에피토프를 제공하는 백신에 관한 것이며, 이는 본 발명에 따라 면역원성인 것으로 예측된 아미노산 변형 또는 변형된 펩티드를 포괄한다. 이러한 T 세포 에피토프는 또한 본원에서 “네오에피토프”로 지칭된다. 환자의 세포, 특히 항원 제시 세포에 의한 이들 에피토프의 제시는 바람직하게는 MHC에 결합될 때 에피토프를 표적화하는 T 세포를 유도하고, 이로써 환자의 종양, 바람직하게는 종양 전이뿐만 아니라 원발성 종양도 표적화하고, T 세포 에피토프가 유래된 항원을 발현하며, 상기 동일한 에피토프를 종양 세포의 표면에 제시한다.

본 발명의 방법은 암 백신 접종을 위하여 동정된 아미노산 변형 또는 변형된 펩티드의 유용성을 결정하는 추가적인 단계를 포함할 수 있다. 따라서, 추가적인 단계는 다음 단계들: (i) 변형이 공지 또는 예측된 MHC 제시된 에피토프 내에 위치하는지 여부를 평가하는 단계, (ii) 변형이 MHC 제시된 에피토프 내에 위치하는지 여부를 시험관 내 및/또는 인실리코(in silico) 시험하는 단계, 예컨대 변형이 MHC 제시된 에피토프로 프로세싱 및/또는 제시되는 펩티드 서열의 일부인지 여부를 시험하는 단계, 및 (iii) 구상된 변형된 에피토프(특히 이들이 천연 서열 컨텍스트로 존재할 때, 예컨대 자연 발생 단백질에서 상기 에피토프 또한 인접하고 있는 아미노산 서열에 인접한 경우, 및 항원 제시 세포에서 발현될 때)가, T 세포, 예컨대 원하는 특이성을 갖는 환자의 T 세포를 자극할 수 있는지 여부를 시험관 내 시험하는 단계 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 이러한 인접 서열(flanking sequences)은 각각 3 개 이상, 5 개 이상, 10 개 이상, 15 개 이상, 20 개 이상, 및 바람직하게는 최대 50 개, 최대 45 개, 최대 40 개, 최대 35 개 또는 최대 30 개의 아미노산을 포함할 수 있으며, N-말단 및/또는 C-말단에서 에피토프 서열에 인접할 수 있다.

본 발명에 따라 결정된 변형된 펩티드는 암 백신 접종을 위한 에피토프로서 이들의 유용성에 대해 순위화될 수 있다. 따라서, 일 측면에서, 본 발명은 동정된 변형된 펩티드를, 제공되는 각 백신에서의 이들의 유용성에 대해 분석 및 선택하는 수동 또는 컴퓨터-기반 분석 프로세스를 포함한다. 바람직한 일 구체예에서, 상기 분석 프로세스는 컴퓨터를 이용한 알고리즘-기반 프로세스이다. 바람직하게는, 상기 분석 프로세스는 이들이 면역원성일 가능성에 대한 예측에 따라 에피토프를 결정 및/또는 순위화하는 것을 포함한다.

본 발명에 따라 동정되고 본 발명의 백신에 의해 제공된 네오에피토프는 바람직하게는 상기 상기 네오에피토프를 포함하는 폴리펩티드, 예컨대 폴리에피토프 폴리펩티드의 형태, 또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 특히 RNA의 형태로 존재한다. 또한, 네오에피토프는 백신 서열의 형태로 폴리펩티드에 존재할 수 있으며, 즉 이들의 천연 서열 컨텍스트로, 예컨대 자연 발생 단백질에서 상기 에피토프 또한 인접하고 있는 아미노산 서열에 인접한 상태로 존재할 수 있다. 이러한 인접 서열은 각 5 개 이상, 10 개 이상, 15 개 이상, 20 개 이상, 및 바람직하게는 최대 50 개, 최대 45 개, 최대 40 개, 최대 35 개 또는 최대 30 개의 아미노산을 포함할 수 있으며, N-말단 및/또는 C-말단에서 에피토프 서열에 인접할 수 있다. 따라서, 백신 서열은 20 개 이상, 25 개 이상, 30 개 이상, 35 개 이상, 40 개 이상, 및 바람직하게는 최대 50 개, 최대 45 개, 최대 40 개, 최대 35 개 또는 최대 30 개의 아미노산을 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 네오에피토프 및/또는 백신 서열은 폴리펩티드 머리에서 꼬리까지(head-to-tail) 일렬로 배열된다.

일 구체예에서, 네오에피토프 및/또는 백신 서열은 링커, 특히 중성 링커에 의해 이격되어(spaced) 있다. 본 발명에 따른 용어 “링커(linker)”는 에피토프 또는 백신 서열과 같은 2 개의 펩티드 도메인들 사이에 첨가되어 상기 펩티드 도메인들을 연결하는 펩티드에 관한 것이다. 링커 서열에 관련하여 특별한 제한은 없다. 그러나, 링커 서열은 2 개의 펩티드 도메인들 사이의 입체 장애(steric hindrance)를 감소시키고, 잘 번역되며, 에피토프의 프로세싱을 지지 또는 가능하게 하는 것이 바람직하다. 또한, 링커는 면역원성 서열 요소를 갖지 않거나 거의 갖지 않아야한다. 링커는 바람직하게는 원치 않는 면역 반응을 일으킬 수 있는, 인접(adjacent) 네오에피토프들 사이의 정션 결합(junction suture)으로부터 발생하는 것들과 유사한 비내인성(non-endogenous) 네오에피토프를 생성하지 않아야 한다. 따라서, 폴리에피토프 백신은 바람직하게는 원치 않는 MHC 결합 정션 에피토프의 수를 감소시킬 수 있는 링커 서열을 함유하여야 한다. 문헌 Hoyt et al. ( EMBO J. 25(8), 1720-9, 2006) 및 Zhang et al. (J. Biol . Chem ., 279(10), 8635-41, 2004)은 글리신이 풍부한(glycine-rich) 서열이 프로테아좀 프로세싱을 손상시키므로, 글리신이 풍부한 링커 서열의 사용이 프로테아좀에 의해 프로세싱될 수 있는 링커 함유 펩티드의 수를 최소화시킨다는 것을 보여주었다. 또한, 글리신은 MHC 결합 그루브 위치에서 강력한 결합을 억제하는 것으로 관찰되었다 (Abastado et al., J. Immunol . 151(7), 3569-75, 1993). 문헌 Schlessinger et al. (Proteins, 61(1), 115-26, 2005)은 아미노산 서열에 포함된 아미노산 글리신 및 세린이 프로테아좀에 의해 보다 효과적으로 번역 및 프로세싱되는 보다 유연한 단백질을 야기하여, 코딩된 네오에피토프에 대한 더 나은 접근을 가능하게 한다는 것을 밝혀냈다. 링커는 각각 3 개 이상, 6 개 이상, 9 개 이상, 10 개 이상, 15 개 이상, 20 개 이상, 및 바람직하게는 최대 50 개, 최대 45 개, 최대 40 개, 최대 35 개 또는 최대 30 개의 아미노산을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 링커는 글리신 및/또는 세린 아미노산이 풍부하다. 바람직하게는, 링커의 아미노산의 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%가 글리신 및/또는 세린이다. 바람직한 일 구체예에서, 링커는 실질적으로 아미노산 글리신 및 세린으로 구성된다. 일 구체예에서, 링커는 아미노산 서열 (GGS)_a(GSS)_b(GGG)_c(SSG)_d(GSG)_e를 포함하고, 여기서 a, b, c, d 및 e는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20 중에서 독립적으로 선택되는 숫자이고, 여기서 a + b + c + d + e는 0이 아니며, 바람직하게는 2 이상, 3 이상, 4 이상 또는 5 이상이다. 일 구체예에서, 링커는 실시예에 기재된 링커 서열, 예컨대 서열 GGSGGGGSG를 비롯하여 본원에 기재된 바와 같은 서열을 포함한다.

특히 바람직한 일 구체예에서, 본 발명에 따른 하나 이상의 네오에피토프가 혼입된 폴리펩티드, 예컨대 폴리에피토프 폴리펩티드는 환자의 세포, 예컨대 항원 제시 세포에서 발현되어 상기 폴리펩티드를 생산할 수 있는 핵산, 바람직하게는 RNA, 예컨대 시험관 내 전사된 RNA 또는 합성 RNA의 형태로 환자에게 투여된다. 본 발명은 또한 본 발명의 목적을 위하여, 용어 “폴리에피토프 폴리펩티드(polyepitopic polypeptide)”로 이루어지는 하나 이상의 멀티에피토프 폴리펩티드(multiepitopic polypeptides)를, 바람직하게는 환자의 세포, 예컨대 항원 제시 세포에서 발현되어 상기 하나 이상의 폴리펩티드를 생산할 수 있는 핵산, 바람직하게는 RNA, 예컨대 시험관 내 전사된 RNA 또는 합성 RNA의 형태로 투여하는 것을 구상한다. 하나 이상의 멀티에피토프 폴리펩티드를 투여하는 경우, 상이한 멀티에피토프 폴리펩티드에 의해 제공되는 네오에피토프는 상이하거나 부분적으로 중복될 수 있다. 일단 환자의 세포, 예컨대 항원 제시 세포에 존재하면, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 본 발명에 따라 동정된 네오에피토프를 생산하도록 프로세싱된다. 본 발명에 따라 제공된 백신의 투여는, 바람직하게는 MHC 제시된, 에피토프가 유래된 항원을 발현하는 세포에 대한 CD8+ 헬퍼 T 세포 반응을 이끌어낼 수 있는 MHC 클래스 I-제시된 에피토프를 제공한다. 또한, 본 발명에 따라 제공된 백신의 투여는, MHC 제시된, 에피토프가 유래된 항원을 발현하는 세포에 대한 CD4+ T 세포 반응을 이끌어낼 수 있는 MHC 클래스 II-제시된 에피토프를 제공할 수도 있다. 또한, 본 발명에 따라 제공된 백신의 투여는, 암 특이적 체세포 돌연변이를 함유하지는 않지만 암 세포에 의해 발현되고 바람직하게는 암 세포에 대한 면역 반응, 바람직하게는 암 특이적 면역 반응을 유도하는 하나 이상의 에피토프뿐만 아니라, 하나 이상의 네오에피토프 (공지된 네오에피토프 및 본 발명에 따라 동정된 네오에피토프를 포함함)를 제공할 수 있다.

본 발명에 따라 제공된 백신은 재조합 백신일 수 있다.

본 발명의 문맥상, 용어 “재조합(recombinant)”은 “유전 공학을 통해 제조된 것”을 의미한다. 바람직하게는, 본 발명의 문맥상, 재조합 폴리펩티드와 같은 “재조합 개체(recombinant entity)”는 자연 발생적이지 않고, 바람직하게는 자연적으로 조합되지 않는 아미노산 또는 핵산 서열과 같은 개체들을 조합한 결과이다. 예를 들어, 본 발명의 문맥상 재조합 폴리펩티드는, 상이한 단백질로부터 유래되거나 또는 예컨대 펩티드 결합 또는 적절한 링커에 의해 함께 융합된 동일한 단백질의 상이한 부분으로부터 유래된, 네오에피토프 또는 백신 서열과 같은 몇몇 아미노산 서열을 함유할 수 있다.

본원에서 사용된 용어 “자연 발생적인(naturally occurring)”은 대상체가 자연에서 발견될 수 있다는 사실을 지칭한다. 예를 들어, 생물체 (바이러스 포함) 내에 존재하고 자연의 공급원으로부터 단리될 수 있으며, 실험실 내에서 인간에 의해 의도적으로 변형된 바 없는 펩티드 또는 핵산은 자연 발생적이다.

본원에 기재된 제제 및 조성물은 질환, 예컨대 항원을 발현하고 그의 단편을 제시하는 질환 세포의 존재를 특징으로 하는 질환을 갖는 대상체를 치료하는 데 사용될 수 있다. 질환은 암 질환인 것이 특히 바람직하다. 또한, 본원에 기재된 제제 및 조성물은 본원에 기재된 질환을 예방하기 위한 면역화 또는 백신 접종에도 사용될 수 있다.

용어 “질환(disease)”은 개인의 신체에 영향을 미치는 비정상적인 상태를 지칭한다. 질환은 종종 특정 증상 및 징후와 관련된 건강 상태로 해석된다. 질환은 전염성 질환과 같이 외부 원인에 기인한 요인에 의해 야기될 수 있고, 또는 자가 면역 질환과 같이 내부 기능 장애(internal dysfunctions)에 의해 야기될 수 있다. 인간의 경우, “질환”은 종종 더 광범위하게 사용되어, 괴로움을 당한 개인에게 통증, 기능 장애, 고통, 사회적 문제 또는 죽음을 야기하거나, 상기 개인과 접촉하는 사람들에게 유사한 문제들을 야기하는 임의의 상태를 지칭한다. 보다 넓은 의미에서, 이는 때때로 상해, 장애, 이상, 증후군, 감염, 격리 증상, 비정상적인 행동 및 구조와 기능의 비정형적인 변형들을 포함하지만, 다른 문맥상에서 및 다른 목적을 위하여는, 이들을 구별 가능한 범주로 고려할 수 있다. 다수의 질환을 앓으면서 생활하는 것이 개인의 삶에 대한 관점과 개인의 성격을 바꿀 수 있기 때문에, 질환은 일반적으로 개인에게 신체적으로뿐만 아니라 정서적으로도 영향을 미친다.

용어 “정상(normal)”은 건강한 대상체 또는 조직의 건강한 상태 또는 조건, 즉 비병리학적 조건을 지칭하며, 여기서 “건강한”은 바람직하게는 비암성(non-cancerous)을 의미한다.

용어 “항원과 관련된 질환” 또는 “항원을 수반하는 질환”은 항원에 연루된 임의의 질환, 예컨대 항원 또는 항원을 발현하는 세포의 존재를 특징으로 하는 질환을 지칭한다. 항원과 관련된 질환은 전염성 질환, 자가 면역 질환, 또는 암 질환 또는 단순히 암일 수 있다. 전술한 바와 같이, 항원은 종양-관련 항원, 바이러스 항원 또는 박테리아 항원과 같은 질환-관련 항원일 수 있다.

본 발명에 따르면, “항원을 발현하는 세포를 수반하는 질환”은 질환 조직 또는 기관의 세포에서 항원의 발현이 검출된다는 것을 의미한다. 질환 조직 또는 기관의 세포에서의 발현은 건강한 조직 또는 기관에서의 상태에 비하여 증가될 수 있다. 증가는 적어도 10%, 특히 적어도 20%, 적어도 50%, 적어도 100%, 적어도 200%, 적어도 500%, 적어도 1000%, 적어도 10000% 또는 그 이상 증가하는 것을 지칭한다. 일 구체예에서, 발현은 질환 조직에서만 발견되는 한편, 건강한 조직에서의 발현은 억제된다. 본 발명에 따르면, 항원을 발현하는 세포를 수반하거나 이에 관련된 질환은 암 질환을 포함한다.

용어 “전염성 질환(infectious disease)”은 개인에서 개인, 또는 생물체에서 생물체로 전염될 수 있는 임의의 질환을 지칭하며, 미생물 제제에 의해 유발된다 (예컨대, 일반적인 감기). 전염성 질환은 당해 기술분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, 각각 바이러스, 박테리아 및 기생충에 의해 유발되는 바이러스 질환, 박테리아 질환 또는 기생충 질환을 포함한다. 이와 관련하여, 전염성 질환은 예컨대 간염, 성병 (예컨대, 클라미디아 또는 임질), 결핵, HIV/후천성 면역 결핍증 (AIDS), 디프테리아, B형 간염, C형 간염, 콜레라, 중증 급성 호흡기 증후군 (SARS), 조류 독감 및 인플루엔자일 수 있다.

용어 “자가 면역 질환(autoimmune disease)”은 신체가 자신의 조직의 일부 구성에 대하여 면역원성 (즉, 면역계) 반응을 일으키는 임의의 질환을 지칭한다. 다시 말해서, 면역계는 신체 내의 일부 조직 또는 시스템을 자신의 것으로 인식하는 능력을 상실하고, 마치 외래의 것인 것처럼 표적화하고 공격한다. 자가 면역 질환은 주로 하나의 기관이 영향을 받는 것들 (예컨대, 용혈성 빈혈 및 항-면역성 갑상선염)과, 자가 면역 질환 프로세스가 많은 조직을 통해 확산되는 것들 (예컨대, 전신 홍반성 루프스)로 분류될 수 있다. 예를 들어, 다발성 경화증은 뇌 및 척수의 신경 섬유를 둘러싸고있는 시스(sheaths)를 공격하는 T 세포에 의해 야기되는 것으로 여겨진다. 이는 조정 능력의 상실, 쇠약 및 시력 저하를 초래한다. 자가 면역 질환은 당해 기술분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, 하시모토 갑상선염, 그레이브스병, 루프스, 다발성 경화증, 류마티스성 관절염, 용혈성 빈혈, 항-면역성 갑상선염, 전신성 홍반성 루프스, 셀리악병, 크론병, 대장염, 당뇨병, 피부경화증, 건선 등을 포함한다.

용어 “암 질환” 또는 “암”은 일반적으로 조절되지 않는 세포 성장을 특징으로 하는 개인의 생리학적 상태를 지칭하거나 이를 설명한다. 암의 예시로는 암종, 림프종, 아세포종, 육종 및 백혈병이 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 더 구체적으로, 이러한 암의 예시로는 골암, 혈액암, 폐암, 간암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문암, 위암, 대장암, 유방암, 전립선암, 자궁암, 성기 및 생식기관 암종, 호지킨병, 식도암, 소장암, 내분비계암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 방광암, 신장암, 신세포암, 신우암, 중추 신경계 (CNS) 신생물, 신경외배엽 암(neuroectodermal cancer), 척추 축 종양(spinal axis tumors), 신경교종, 수막종 및 뇌하수체선종이 있다. 본 발명에 따라서, 용어 “암”은 또한 암 전이도 포함한다.

본 발명에 따르면, 용어 “종양” 또는 “종양 질환”은 바람직하게는 종창(swelling) 또는 병변(lesion)을 형성하는 세포 (신생 세포, 종양 발생 세포 또는 종양 세포라고 불림)의 비정상적인 성장을 지칭한다. “종양 세포”란 급속한, 조절되지 않는 세포 증식에 의해 성장하고, 새로운 성장을 개시하는 자극이 중단된 후에도 지속적으로 성장하는 비정상적인 세포를 의미한다. 종양은 정상 조직과의 기능적 연계 및 구조적 조직화가 부분적으로 또는 완전히 결여되어 있으며 대체로 양성, 전악성 또는 악성일 수 있는 뚜렷한 조직의 덩어리를 형성한다.

본 발명의 목적을 위하여, 용어 “암” 및 “암 질환”은 용어 “종양” 및 “종양 질환”과 상호 교환적으로 사용된다.

“전이(metastasis)”란 암세포가 그의 원래 부위에서 신체의 다른 부분으로 확산되는 것을 의미한다. 전이의 형성은 매우 복잡한 프로세스이며, 원발성 종양으로부터의 악성 세포의 탈착, 세포외 기질의 침입, 내피 기저막의 침투에 의한 체강 및 혈관으로의 유입, 및 이어서, 혈액에 의해 운반된 후 표적 기관으로의 침윤에 의존한다. 마지막으로, 새로운 종양, 즉 2차 종양 또는 전이 종양의 표적 부위에서의 성장은 혈관 신생(angiogenesis)에 의존한다. 종양 전이는 원발성 종양의 제거 후에도, 종양 세포 또는 성분이 남아있을 수 있고 전이 잠재능을 발달시키기 때문에 종종 발생한다. 일 구체예에서, 본 발명에 따른 용어 “전이”는 원발성 종양 및 부위 림프절 시스템으로부터 멀리 떨어진 전이에 관한 것인 “원격 전이(distant metastasis)”에 관한 것이다.

2차 또는 전이 종양의 세포는 원래의 종양의 세포와 유사하다. 예를 들어, 이는 난소암이 간으로 전이된 경우, 2차 종양은 비정상적인 간세포가 아닌 비정상적인 난소 세포로 구성된다는 것을 의미한다. 상기 간에서의 종양은 따라서 간암이 아니라 전이 난소암으로 불린다.

용어 “순환 종양 세포(circulating tumor cells)” 또는 “CTCs”는 원발성 종양 또는 종양 전이로부터 탈착되어 혈류를 순환하는 세포에 관한 것이다. CTCs는 상이한 조직에서 추가적인 종양의 후속적인 성장 (전이)을 위한 씨앗을 구성할 수 있다. 순환 종양 세포는 전이성 질환이 있는 환자의 전혈 mL 당 1-10 CTC 순의 빈도로 발견된다. CTC를 단리하기 위한 연구 방법들이 개발되었다. 당해 기술분야에 CTCs를 단리하기 위한 여러 연구 방법들, 예컨대 상피 세포가 정상 혈액 세포에서는 결여되어 있는 세포 부착 단백질 EpCAM을 공통적으로 발현한다는 사실을 이용하는 기술이 기재되어 있다. 면역 자성 비드-기반 포획법(immunomagnetic bead-based capture)은 자성 입자와 컨쥬게이션된 EpCAM에 대한 항체로 혈액 검체를 처리한 후, 태그된 세포를 자기장에서 분리하는 것을 수반한다. 이어서, 단리된 세포를 흔한 백혈구 마커 CD45 및 다른 상피 마커 시토케라틴(cytokeratin)에 대한 항체로 염색하여, 오염된 백혈구로부터 드문 CTC를 구별한다. 이 견고하고 반자동화된 접근법은 CTCs를 약 1 CTC/mL의 평균 수율 및 0.1%의 순도로 동정한다 (Allard et al., 2004: Clin Cancer Res 10, 6897-6904). CTC를 단리하기 위한 두 번째 방법은 EpCAM에 대한 항체로 코팅함으로써 기능성이 부여된 80,000 개의 마이크로포스트가 내장된 챔버를 통해 전혈을 흐르게 하는 것을 수반하는 마이크로 유체-기반(microfluidic-based) CTC 포획 장치를 사용한다. 이어서, CTCs를 전립선암에서의 PSA 또는 유방암에서의 HER2와 같은 조직 특이적 마커 또는 시토케라틴에 대한 2차 항체로 염색하고, 3차원 좌표를 따라 다중 평면에서 마이크로포스트를 자동 스캐닝함으로써 시각화한다. CTC-칩은 환자 내 시토케라틴-양성 순환 종양 세포를 50 cells/ml의 중간 수율 및 1-80%의 순도로 동정할 수 있다 (Nagrath et al., 2007: Nature 450, 1235-1239). CTCs를 단리하기 위한 또 다른 가능성은 혈액 튜브에서 CTC를 포획, 동정 및 계수하는 Veridex, LLC (Raritan, NJ)의 CellSearch^TM Circulating Tumor Cell (CTC) Test를 사용하는 것이다. 상기 CellSearch^TM 시스템은 면역 자성 라벨링 및 자동화된 디지털 현미경 검사의 조합에 기반한, 전혈에서의 CTC의 측정에 대하여 미국 식품의약국 (FDA) 승인된 방법론이다. 문헌에 기재된 CTCs를 단리하기 위한 기타 방법들은 모두 본 발명과 함께 사용될 수 있다.

재발(relapse 또는 recurrence)은 사람이 과거에 영향을 받았던 질환에 의해 이들이 다시 영향을 받게 될 때 발생한다. 예를 들어, 환자가 종양 질환을 앓고, 상기 질환에 대하여 성공적인 치료를 받은 바 있는데 다시 상기 질환이 발병한다면, 상기 새로 발병한 질환은 재발로 간주될 수 있다. 그러나, 본 발명에 따르면, 종양 질환의 재발은 원래의 종양 질환 부위에서 발생할 수 있지만 반드시 그런 것은 아니다. 따라서, 예를 들어, 환자가 난소암을 앓고 성공적인 치료를 받은 바 있는 경우, 재발은 난소와 상이한 부위에서의 난소암의 발생 또는 종양의 발생일 수 있다. 또한, 종양의 재발은 원래의 종양의 부위에서뿐만 아니라 원래의 종양의 부위와 상이한 부위에서 종양이 발생하는 상황을 포함한다. 바람직하게는, 환자가 치료를 받은 원래의 종양은 원발성 종양이고 원래의 종양의 부위와 상이한 부위에서의 종양은 2차 종양 또는 전이 종양이다.

용어 “면역 치료(immunotherapy)”는 면역 반응을 유도, 증강 또는 억제함으로써 질환 또는 상태를 치료하는 것에 관한 것이다. 면역 반응을 이끌어내거나 증폭하도록 설계된 면역 치료는 활성화 면역 요법으로 분류되는 한편, 면역 반응을 감소시키거나 억제하는 면역 치료는 억제 면역 요법으로 분류된다. 용어 “면역 치료”는 항원 면역화 즉 항원 백신 접종, 또는 종양 면역화 즉 종양 백신 접종을 포함한다. 또한 용어 “면역 치료”는 면역 반응의 조작에 관한 것이기 때문에, 류마티스성 관절염, 알레르기, 당뇨병 또는 다발성 경화증과 같은 자가 면역 질환과 관련하여, 부적절한 면역 반응은 보다 적절한 면역 반응으로 조정한다.

용어 “면역화(immunization)” 또는 “백신 접종(vaccination)”은 예컨대 치료적 또는 예방적 이유로 면역 반응을 유도할 목적으로 개인에게 항원을 투여하는 프로세스를 설명한다.

용어 “치료 요법(therapeutic treatment)” 또는 단순히 “치료(treatment)”는 건강 상태를 향상시키고 및/또는 개인의 수명을 연장 (증가)시키는 임의의 치료에 관한 것이다. 상기 치료는 개인의 질환을 없애고, 개인의 질환의 발달을 저지 또는 지연시키고, 개인의 질환의 발달을 억제 또는 지연시키고, 개인의 증상의 빈도 또는 중증도를 감소시키고, 및/또는 현재 질환을 앓고 있거나 이전에 앓은 바 있는 개인의 재발을 감소시킬 수 있다.

용어 “예방적 치료(prophylactic treatment)” 또는 “예방적 치료(preventive treatment)”는 개인에서 질환이 발생하는 것을 방지하고자 하는 임의의 치료에 관한 것이다. 용어 “예방적 치료(prophylactic treatment)” 또는 “예방적 치료(preventive treatment)”는 본원에서 상호 교환적으로 사용된다.

용어 “보호하다(protect)”, “방지하다(prevent)”, “예방적(prophylactic)”, “예방적(preventive)” 또는 “보호적(protective)”은 개인에서의 질환, 예컨대 종양 발생 및/또는 전파의 예방 및/또는 치료에 관한 것이다. 예를 들어, 예컨대 본원에 기재된 조성물을 투여함으로써, 면역 치료의 예방적 투여는 수용하는 개체를 종양의 발달로부터 보호할 수 있다. 예를 들어, 예컨대 본원에 기재된 조성물을 투여함으로써, 면역 치료의 치료적 투여는 질환의 발달을 멈추게 할 수 있으며, 예컨대 종양의 진행/성장을 억제시킨다. 이는 종양 진행/성장의 감속, 특히 종양 진행의 붕괴, 바람직하게 종양의 제거를 유도하는 종양 진행의 붕괴를 포함한다. 면역 치료의 치료적 투여는 개체를, 예컨대 기존 종양의 전파 또는 전이로부터 보호할 수 있다.

용어 “개인(individual)” 또는 “대상체(subject)”는 척추 동물, 특히 포유류에 관한 것이다. 예를 들어, 본 발명의 문맥상, 포유류는 인간, 비인간 영장류, 가축 포유류 (예컨대, 개, 고양이, 양, 소, 염소, 돼지, 말 등), 실험 동물 (예컨대, 마우스, 래트, 토끼, 기니 피그 등) 뿐만 아니라 우리 안의 동물 (예컨대, 동물원의 동물)을 말한다. 용어 “대상체”는 또한 포유류가 아닌 척추 동물, 예컨대 조류 (특히 닭, 오리, 거위, 칠면조와 같은 가축화된 조류) 및 어류 (특히 연어 또는 메기와 같은 양식 어류)에 관한 것이기도 하다. 본원에서 사용된 용어 “동물(animal)”은 또한 인간도 포함한다. 바람직하게는, 용어 “환자(patient)”는 질환을 앓고 있는 개인에 관한 것이다.

본원에 기재된 제제는 임의의 적합한 약학 조성물의 형태로 투여될 수 있다. 용어 “약학 조성물(pharmaceutical composition)”은 치료상 효과적인 제제 또는 그의 염을, 바람직하게는 완충제, 방부제 및 등장화제(tonicity modifiers)와 같은 약학 부형제와 함께 포함하는 제형에 관한 것이다. 상기 약학 조성물은 개체에 상기 약학 조성물을 투여함으로써 질환 또는 장애의 중증도를 치료, 예방 또는 감소시키는 데 유용하다. 약학 조성물은 또한 약학 제형으로 당해 기술분야에 알려져 있다. 약학 조성물은 국소 투여 또는 전신 투여될 수 있다.

용어 “전신 투여(systemic administration)”는 치료상 효과적인 제제가 상당한 양으로 개인의 신체 내 광범위하게 분포되고 생물학적 효과를 발생시키도록 상기 제제를 투여하는 것을 지칭한다. 본 발명에 따르면, 투여는 비경구 투여에 의한 것이 바람직하다.

용어 “비경구 투여(parenteral administration)”는 치료상 효과적인 제제가 장을 통과하지 못하도록 상기 제제를 투여하는 것을 지칭한다. 용어 “비경구 투여”는 정맥 내 투여, 피하 투여, 피내 투여 또는 동맥 내 투여를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

특히 바람직한 일 구체예에서, 본 발명에 따른 조성물은 골격근과 같은 근육 조직에 투여된다. 따라서, 근육 내 주사와 같은 근육 내 투여는 바람직한 투여 경로이다.

투여는 다양한 방법으로 이루어질 수 있다. 일 구체예에서, 본 발명에 따른 조성물은 주사에 의해 투여된다. 바람직한 일 구체예에서, 주사는 니들을 통해 이루어진다. 니들-프리 주사는 대안으로서 사용될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 적어도 하나의 아쥬반트를 포함할 수 있다. 용어 “아쥬반트(adjuvant)”는 개인에게 항원 또는 항원 펩티드와 함께 투여될 때 면역 반응을 연장 또는 증진 또는 촉진시키는 화합물에 관한 것이다. 아쥬반트는 항원 표면의 증가, 체내 항원 잔류의 연장, 항원 방출의 지연, 대식세포에 대한 항원의 표적화, 항원의 포획 증가, 항원 프로세싱의 증진, 시토카인 방출의 자극, B 세포, 대식세포, 수지상 세포, T 세포와 같은 면역 세포의 자극 및 활성화, 및 면역 세포의 비특이적 활성화를 비롯한, 하나 이상의 메커니즘에 의해 생물학적 활성을 발휘한다고 가정한다. 아쥬반트는 오일 에멀젼 (예컨대, 프로인트 아쥬반트), 미네랄 화합물 (예컨대, 명반), 박테리아 산물 (예컨대, 보르데텔라 페르투시스 독소) 또는 면역-자극 복합체와 같은 화합물들의 이질 그룹을 포함한다. 아쥬반트의 예시로는 사포닌, 불완전 프로인트 아쥬반트, 완전 프로인트 아쥬반트, 토코페롤 또는 명반이 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 일반적으로 “약학적 유효량” 및 “약학적으로 허용 가능한 제제”로 적용된다.

용어 “약학적 유효량(pharmaceutically effective amount)”은 단독으로 또는 추가 복용량과 함께 목적하는 반응 또는 목적하는 효과를 달성하는 양을 지칭한다. 특정 질환을 치료하는 경우, 목적하는 반응은 바람직하게는 질환의 경과를 억제하는 것에 관한 것이다. 이는 질환의 진행을 늦추고, 특히, 질환의 진행을 방해하거나 역전시키는 것을 포함한다. 질환의 치료에서 목적하는 반응은 또한 상기 질환 또는 상기 상태의 발병 지연 또는 발병 예방일 수도 있다. 본원에 기재된 조성물의 유효량은 치료하고자 하는 상태, 질환의 중증도, 환자의 개별적인 파라미터들 (예컨대, 연령, 생리학적 상태, 크기 및 체중), 치료 기간, 동반하는 치료 유형 (존재하는 경우), 특정 투여 경로 및 유사 요인들에 의존한다. 따라서, 따라서, 본원에 기재된 조성물의 투여량은 이러한 다양한 파라미터들에 따라 달라질 수 있다. 환자의 반응이 초기 복용량으로 불충분한 경우, 더 많은 복용량 (또는 상이한, 보다 국소적인 투여 경로에 의해 달성되는 효과적으로 더 높은 복용량)을 사용할 수 있다.

용어 “약학적으로 허용 가능한”은 약학 조성물의 활성 성분의 작용과 상호 작용하지 않는 물질의 무독성을 지칭한다.

본 발명의 약학 조성물은 염, 완충제, 보존제, 담체 및 경우에 따라 기타 치료적 제제를 함유할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 약학 조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 및/또는 부형제를 포함한다.

용어 “부형제(excipient)”는 결합제, 윤활제, 증점제, 표면 활성제, 방부제, 유화제, 완충제, 방향제 또는 착색제와 같은 활성 성분이 아닌 약학 조성물 내의 모든 물질을 나타내고자 한다.

용어 “희석제(diluent)”는 희석 제제 및/또는 감점(thinning) 제제에 관한 것이다. 또한, 용어 “희석제”는 임의의 하나 이상의 유체, 액체 또는 고체 현탁액 및/또는 혼합 매체를 포함한다.

용어 “담체(carrier)”는 인간에게 투여하는 데 적합한, 하나 이상의 상용성 고체 또는 액체 충전제 또는 희석제에 관한 것이다. 용어 “담체”는 활성 성분의 적용을 용이하게 하기 위한, 활성 성분과 결합된 천연 또는 합성 유기 또는 무기 성분에 관한 것이다. 바람직하게는, 담체 성분은 물 또는 오일과 같은 무균 액체이며, 예컨대 땅콩 기름, 콩기름, 참기름, 해바라기유 등과 같은 광유, 동물 또는 식물에서 유래된 것들을 포함한다. 염용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세린 용액 또한 수성 담체 화합물로서 사용될 수 있다.

치료적 사용을 위한 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제는 제약 분야에서 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 문헌 Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R Gennaro edit. 1985)에 기재되어 있다. 적합한 담체의 예시로는 예컨대 탄산 마그네슘, 스테아린산 마그네슘, 활석, 당류, 락토스, 펙틴, 덱스트린, 전분, 젤라틴, 트래거캔스(tragacanth), 메틸셀룰로스, 나트륨 카복시메틸셀룰로스, 저융점 왁스, 코코아 버터 등이 있다. 적합한 희석제의 예시로는 에탄올, 글리세롤 및 물이 있다.

약학 담체, 부형제 또는 희석제는 의도된 투여 경로 및 표준 제약 관행과 관련하여 선택될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 담체(들), 부형제(들) 또는 희석제(들), 임의의 적합한 결합제(들), 윤활제(들), 현탁화 제제(들), 코팅 제제(들), 및/또는 가용화제(들)을 포함할 수 있다. 적합한 결합제의 예시로는 전분, 젤라틴, 천연 설탕, 예컨대 글루코스, 무수 락토스, 프리-플로우 락토스, 베타-락토스, 옥수수 감미료, 천연 또는 합성 검, 예컨대 아카시아, 트래거캔스 또는 알긴산 나트륨, 카복시메틸 셀룰로스 및 폴리에틸렌 글리콜이 있다. 적합한 윤활제의 예시로는 올레산 나트륨, 스테아르산 나트륨, 스테아르산 마그네슘, 벤조산 나트륨, 아세트산 나트륨, 염화 나트륨 등이 있다. 방부제, 안정화제, 염료 및 심지어 방향제조차도 약학 조성물에 제공될 수 있다. 방부제의 예시로는 벤조산 나트륨, 소르브산 및 p-히드록시벤조산의 에스테르가 있다. 항산화제 및 현탁화 제제 또한 사용될 수 있다.

일 구체예에서, 조성물은 수성 조성물이다. 수성 조성물은 경우에 따라 용질, 예컨대 염을 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 조성물은 동결-건조 조성물의 형태로 존재한다. 동결-건조 조성물은 각 수성 조성물을 동결-건조시킴으로써 얻을 수 있다.

본원에서 제공된 제제 및 조성물은 단독으로 또는 수술, 방사선 조사, 화학 요법 및/또는 골수 이식 (자가, 동질, 동종 또는 비관계) 등의 다른 치료 요법들과 조합하여 사용될 수 있다.

본 발명은 도면과 실시예에 의해 상세히 설명되고 묘사되나, 이들은 설명의 목적으로만 사용될 뿐 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다. 설명 및 실시예에 기반하여, 통상의 기술자는 본 발명에 마찬가지로 포함된 추가적인 구체예들에 접근 가능하다.

도면
도 1. 공개된 에피토프의 단백질은 랜덤 펩티드 (프로테옴)에 비하면 엑소좀 및 시토졸에서 상당히 풍부하게 존재한다.
도 2. 공개된 에피토프의 유전자는 랜덤 펩티드에 비하여 SEREX 데이터베이스에서 훨씬 더 자주 발견된다.

실시예

본원에서 사용된 기술 및 방법은 본원에 기재되어 있거나, 또는 그 자체로 공지된, 예컨대 문헌 Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y에 기재된 바와 같은 방법으로 수행된다. 키트 및 시약의 사용을 비롯한 모든 방법은 특별히 명시되지 않은 한, 제조사의 지침에 따라 수행된다.

실시예 1: 공개된 에피토프를 함유하는 단백질의 위치

문헌을 MHC 클래스 I-제한된 돌연변이된 네오에피토프 (“공개된 에피토프”, n=129)를 동정하기 위해 스크리닝하였고, 이들의 위치를 단백질 코딩 유전자 (“프로테옴”, n=500)의 랜덤 샘플과 비교하였다 (도 1). 각 유전자의 위치를 유전자 온톨로지 데이터베이스 (http://www.ebi.ac.uk/QuickGO/)를 통해 결정하였다. 또한, 엑소좀 내 존재를 ExoCarta 데이터베이스 (http://www.exocarta.org/)를 통해 시험하였다. 도 1에 나타난 바와 같이, 네오에피토프 함유 유전자는 대조군 유전자에 비하여 시토졸뿐만 아니라 엑소좀에서도 상당히 풍부하게 존재하였다 (fisher 정확 검정; p<0.0001).

제2 단계에서, SEREX 데이터베이스 (V. Jongeneel, Cancer Immunity, Vol. 1, p.3 (30 March 2001))에 공개된 에피토프로부터의 유전자의 존재를 랜덤 대조 유전자와 비교하였다 (도 2). SEREX 데이터베이스는 자가 항체에 의해 인식되는 것으로 나타난 단백질을 나열한다. 공개된 에피토프의 유전자는 랜덤 펩티드에 비하여 SEREX 데이터베이스에서 훨씬 더 자주 발견되었다 (fisher 정확 검정; p<0.0001).

도 1 및 2에 나타난 결과는, 면역 치료에 있어서 엑소좀, 시토졸 또는 자가 항체 데이터베이스 내 돌연변이된 유전자의 존재가 관련 돌연변이된 항원을 예측하는 데 유용한 파라미터임을 보여준다.

SEQUENCE LISTING <110> BioNTech RNA Pharmaceuticals GmbH et al. <120> METHODS FOR PREDICTING THE USEFULNESS OF PROTEINS OR PROTEIN FRAGMENTS FOR IMMUNOTHERAPY <130> 674-157 PCT2 <150> PCT/EP2016/060897 <151> 2016-05-13 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <220> <221> REPEAT <222> (1)..(3) <223> Portion of sequence repeated a times, wherein a is independently a number selected from 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, or 20 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(15) <223> a + b + c + d + e are different from 0 and preferably are 2 or more, 3 or more, 4 or more or 5 or more <220> <221> REPEAT <222> (4)..(6) <223> Portion of sequence repeated b times, wherein b is independently a number selected from 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, or 20 <220> <221> REPEAT <222> (7)..(9) <223> Portion of sequence repeated c times, wherein c is independently a number selected from 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, or 20 <220> <221> REPEAT <222> (10)..(12) <223> Portion of sequence repeated d times, wherein d is independently a number selected from 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, or 20 <220> <221> REPEAT <222> (13)..(15) <223> Portion of sequence repeated e times, wherein e is independently a number selected from 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, or 20 <400> 1 Gly Gly Ser Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 2 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5

Claims

암 면역 치료를 위하여 질환 세포에 의해 발현된 단백질 또는 그의 단편의 유용성을 예측하는 방법으로서, 단백질 또는 상기 단백질의 단편의 분포 또는 위치를 확인하는 단계를 포함하고,
상기 단백질 또는 상기 단편은 하나 이상의 암-특이적 아미노산 변형을 포함하는 암-관련된 신생항원 (neoantigen) 또는 네오에피토프 (neoepitope)를 포함하고,
상기 방법은 상기 단백질 또는 상기 단편이 생체 내 시토졸 및/또는 엑소좀 내에 위치하거나 풍부하게 존재하는지 여부를 확인하는 단계를 포함하고,
시토졸 및/또는 엑소좀 내에서의 상기 단백질 또는 상기 단편의 위치 또는 풍부한 존재는 상기 단백질 또는 상기 단편이 면역 치료에 유용함을 나타내는 것인 방법.
제1항에 있어서, 단백질 단편은 MHC 펩티드 복합체로서 엑소좀 내에, 또는 엑소좀의 표면에 존재하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 시토졸 내에서의 상기 단백질 또는 상기 단편의 위치 또는 풍부한 존재는 MHC I 경로에서의 상기 단백질의 프로세싱 및 제시를 나타내는 것인 방법.
제3항에 있어서, MHC I 경로에서의 상기 단백질의 프로세싱 및 제시는 CD8+ T 세포로 하여금 MHC I과 단백질 단편에 의해 형성된 복합체를 인식하도록 하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 엑소좀 내에서의 상기 단백질 또는 상기 단편의 위치 또는 풍부한 존재는 항원 제시 세포, 또는 프로페셔널 항원 제시 세포에서의 상기 단백질 또는 상기 단편의 축적을 나타내는 것인 방법.
제5항에 있어서, 항원 제시 세포에서의 상기 단백질 또는 상기 단편의 축적은, MHC I 및/또는 MHC II 경로에서의, 또는 상기 항원 제시 세포의 MHC I 및/또는 MHC II 경로에서의 상기 단백질의 프로세싱 및 제시를 나타내는 것인 방법.
제6항에 있어서, MHC I 경로에서의 상기 단백질의 프로세싱 및 제시는 CD8+ T 세포로 하여금 MHC I과 단백질 단편에 의해 형성된 복합체를 인식하도록 하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 아미노산 변형은 암 특이적 체세포 돌연변이로 인한 것인 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 있어서, 단백질 단편은 MHC 결합 펩티드 또는 잠재적 MHC 결합 펩티드인 것인 방법.
암-특이적 아미노산 변형을 암 면역 치료에서의 이들의 유용성에 대하여 선택 및/또는 순위화하는 방법으로서, 다음 단계들:
(i) 암 세포에 의해 발현된 단백질을 동정하는 단계로서 상기 단백질 각각은 적어도 하나의 암-특이적 아미노산 변형을 포함하는 것인 단계, 및
(ii) (i)에 따라 동정된 단백질 또는 상기 단백질의 단편의 분포 또는 위치를 확인하는 단계, 및
(iii) (i)에 따라 동정된 적어도 하나의 추가적인 단백질에 대하여 (ii)를 반복하는 단계
를 포함하는 것인 방법.
제10항에 있어서, 단계 (ii)는 상기 단백질 또는 상기 단편이 생체 내 시토졸 및/또는 엑소좀 내에 위치하거나 풍부하게 존재하는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는 것인 방법.
제11항에 있어서, 시토졸 및/또는 엑소좀 내에서의 상기 단백질 또는 상기 단편의 위치 또는 풍부한 존재는 상기 암-특이적 아미노산 변형이 암 면역 치료에 유용함을 나타내는 것인 방법.
제10항 내지 제12항 중 어느 하나의 항에 있어서, 암-특이적 아미노산 변형은 MHC 결합 펩티드 또는 잠재적 MHC 결합 펩티드인 단백질 단편으로 구성되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 백신을 제조하는 데 사용되는 것인 방법.
제14항에 있어서, 백신은 암 면역 치료에 유용한 것으로 예측되는 하나 이상의 단백질 또는 그의 단편, 또는 하나 이상의 암-특이적 아미노산 변형으로부터 유래된 것인 방법.
백신을 제공하는 방법으로서,
제1항에 기재된 방법에 의하여 면역 치료에 유용한 것으로 예측되는 하나 이상의 단백질 또는 그의 단편을 동정하는 단계를 포함하고,
제1항에 기재된 방법에 의하여 면역 치료에 유용한 것으로 예측되는 하나 이상의 단백질 또는 그의 단편을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드, 또는 상기 펩티드 또는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 백신을 제공하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
제16항에 기재된 방법에 따라 제조된 백신.
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