CN111487399B - 一种蛋白分子标记在鱼类生殖细胞发育研究中的应用 - Google Patents

一种蛋白分子标记在鱼类生殖细胞发育研究中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种蛋白分子标记在鱼类生殖细胞发育研究中的应用，所述蛋白分子为Anti‑RNA polymerase Ⅱ CTD repeat YSPTSPS(phospho S5)，所述应用包括采用蛋白分子作为标记分子对不同发育状态鱼类进行免疫荧光定位分析。本发明首次将免疫探针应用于鱼类生殖细胞发育研究中，综合解析了不同鱼类生殖细胞发育的细胞相特征，为判断鱼类生殖细胞发育状态提供了重要分子标记，为鱼类遗传育种提供了新的发育功能检测策略。

Description

一种蛋白分子标记在鱼类生殖细胞发育研究中的应用
技术领域
本发明属于鱼类细胞标记方法技术领域，特别涉及一种蛋白分子标记在鱼类生殖细胞发育研究中的应用。
背景技术
生殖细胞发育的功能分子标记有助于研究实验对象的生殖机理及育性，在哺乳动物和临床医学领域研究比较广泛，我国学者已经从单细胞水平系统阐述了人类精子发生过程中基因表达调控网络和细胞命运转变路径，人类生殖细胞发育的功能分子标记已经得到广泛应用。在鱼类中得以鉴定分析的生殖细胞标记基因也日益增多，包括vasa，nanos，dnd，dazl，sdf1和cxcr等，但它们表达多集中在原生殖细胞(Primordial germ cells，PGCs)。在鱼类雄性生殖细胞发育过程中，生殖细胞的发育过程包括PGCs，精原细胞，初级精母细胞，次级精母细胞，精子细胞和精子。所以，仅限于利用上述分子标记来探测鱼类生殖细胞的发育过程远远不够。因此，有必要探索更多不同的分子标记来研究鱼类生殖发育过程。
目前，初级精母细胞及后续发育过程中的相关功能分子标记的报道较少，结合生殖细胞染色体免疫荧光定位(FISH)分析的研究也仅限于人，斑马鱼，植物等模式生物细胞水平的研究，而在鱼类细胞中很少研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种蛋白分子标记在鱼类生殖细胞发育研究中的应用，旨在解决现有技术中对于鱼类生殖细胞发育状态存在技术空白的技术问题。
为解决上述技术问题，本发明采取如下技术方案：
一种蛋白分子标记在鱼类生殖细胞发育研究中的应用，所述蛋白分子为Anti-RNApolymeraseⅡCTD repeat YSPTSPS(phospho S5)，所述应用包括采用蛋白分子作为标记分子对不同发育状态鱼类进行免疫荧光定位分析。
本发明利用的功能分子标记为Anti-RNA polymeraseⅡCTD repeat YSPTSPS(phospho S5)抗体(RNA Pol II CTD(S5))，根据研究发现，它是RNA聚合酶II中最大亚基的羧基末端结构域，该结构的特殊之处就在于其肽链的组成是S1S2P3T4S5P6S7为重复单位的高度保守的重复序列，其通过发生磷酸化和去磷酸化的循环反应影响RNA聚合酶II对mRNA的5’帽子和3’末端的加工及基因外显子的识别剪切过程，所以其标记显示为基因转录活跃状态。
本发明采用RNA Pol II CTD(S5)蛋白分子作为标记分子对不同发育状态鱼类精巢组织进行常规蛋白组织化学检测，以及对相应生殖细胞染色体进行免疫荧光定位分析，可定位检测到与基因转录活性状态相关的细胞相特征，且与生殖细胞的发育状态密切相关，将其作为生殖细胞发育功能分子标记进行开发，有利于填补对于鱼类生殖细胞发育状态的技术空白。
进一步地，所述不同发育状态鱼类为不同发育时期的鲫鲤品系杂交鱼类及其原始亲本。
进一步地，所述鲫鲤品系杂交鱼类及原始亲本分别为红鲫、杂交鱼鲫鲤F1或异源四倍体鲫鲤中至少一种。
进一步地，所述免疫荧光定位分析包括以下步骤：
S1.制备鱼性腺染色体；
S2.在低温下，加入500μL 4％多聚甲醛固定相关细胞及染色体20min，使用1×PBS重复清洗3次，每次5min；
S3.常温下，在200μL 0.5％Triton-x-100溶液中通透30min，使用1×PBS重复清洗3次，每次5min；
S4.置于50μL 3％牛血清白蛋白溶液中，在37℃下孵育60min；
S5.加入一抗CTD稀释液50μL，在湿盒中孵育，4℃下过夜，然后使用1×PBS重复清洗3次，每次10min；
S6.加入二抗稀释液50μL，在37℃下孵育60min，然后在避光条件下，使用1×PBS重复清洗3次，每次10min；
S7.加DAPI染液30μL，封片后在荧光显微镜下观察。
进一步地，步骤S1中，所述制备鱼性腺染色体的方法为：选取90～100mm3实验鱼精巢组织用弯剪剪碎，带2mL生理盐水吸入离心管，轻轻吹打50次以上，再吸入8mL生理盐水混悬，静置3分钟后，吸取上清液转入另一离心管，在转速1000rpm下离心5min，弃上清；加入10mL 0.075MKcl，低渗3小时，卡诺氏固定液固定3次。
进一步地，步骤S5中，所述一抗CTD稀释液为蛋白分子RNA Pol II CTD(S5)的稀释液，所述一抗CTD稀释液的稀释比例为1:50～1000。
进一步地，步骤S6中，所述二抗稀释液的稀释比例为1:50～200。
本发明提供的蛋白分子标记在鱼类生殖细胞发育研究中的应用的有益效果在于：
本发明首次将蛋白分子应用于鱼类生殖细胞发育研究中，综合解析了不同鱼类生殖细胞发育的细胞相特征，为判断鱼类生殖细胞发育状态提供了重要分子标记，为鱼类遗传育种提供了新的发育功能检测策略。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为RNA Pol II CTD(S5)在原始亲本红鲫中的免疫组化显色结果示意图。
图2为图1的局部放大图。
图3为RNA Pol II CTD(S5)在杂交鱼鲫鲤F1中的免疫组化显色结果示意图。
图4为图3的局部放大图。
图5为RNA Pol II CTD(S5)在异源四倍体鲫鲤中的免疫组化显色结果示意图。
图6为图5的局部放大图。
图7为RNA Pol II CTD(S5)蛋白分子在原始亲本红鲫体细胞中染色体蛋白荧光分析结果示意图。
图8为RNA Pol II CTD(S5)蛋白分子在原始亲本红鲫生殖细胞中染色体蛋白荧光分析结果示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
请参阅图1～8，本发明提供一种蛋白分子标记在鱼类生殖细胞发育研究中的应用，蛋白分子为Anti-RNA polymeraseⅡCTD repeat YSPTSPS(phospho S5)，应用包括采用蛋白分子作为标记分子对不同发育状态鱼类进行免疫荧光定位分析。
需要说明的是，本发明利用的功能分子标记为Anti-RNA polymeraseⅡCTDrepeat YSPTSPS(phospho S5)抗体(RNA PolⅡCTD(S5))，根据研究发现，它是RNA聚合酶Ⅱ中最大亚基的羧基末端结构域，该结构的特殊之处就在于其肽链的组成是Y1S2P3T4S5P6S7为重复单位的高度保守的重复序列，其通过发生磷酸化和去磷酸化的循环反应影响RNA聚合酶Ⅱ对mRNA的5’帽子和3’末端的加工及基因外显子的识别剪切过程，所以其标记显示为基因转录活跃状态。
本发明采用RNA Pol II CTD(S5)蛋白分子作为分子标记对不同发育状态鱼类精巢组织进行常规蛋白组织化学检测，以及对相应生殖细胞染色体进行免疫荧光定位分析，可定位检测到与基因转录活性状态相关的细胞相特征，且与生殖细胞的发育状态密切相关，将其作为生殖细胞发育功能分子标记进行开发，有利于填补对于鱼类生殖细胞发育状态的技术空白。
作为本发明的进一步优选，不同发育状态鱼类为不同发育时期的鲫鲤品系杂交鱼类及其原始亲本。
作为本发明的进一步优选，鲫鲤品系杂交鱼类和原始亲本分别为红鲫、杂交鱼鲫鲤F1或异源四倍体鲫鲤中至少一种。
作为本发明的进一步优选，免疫荧光定位分析包括以下步骤：
S1.制备鱼性腺染色体；
S2.在低温下，加入500μL 4％多聚甲醛固定相关细胞及染色体20min，使用1×PBS重复清洗3次，每次5min；
S3.常温下，在200μL 0.5％Triton-x-100溶液中通透30min，使用1×PBS重复清洗3次，每次5min；
S4.置于50μL 3％牛血清白蛋白溶液中，在37℃下孵育60min；
S5.加入一抗CTD稀释液50μL，在湿盒中孵育，4℃下过夜，然后使用1×PBS重复清洗3次，每次10min；
S6.加入二抗稀释液50μL，在37℃下孵育60min，然后在避光条件下，使用1×PBS重复清洗3次，每次10min；
S7.加DAPI染液30μL，封片后在荧光显微镜下观察。
需要说明的是，本发明先用多聚甲醛固定相关细胞及染色体，保持细胞形态，然后用磷酸缓冲液清洗样品多次，去除多余液体，避免其影响后续实验；用Triton-x-100溶液处理样品，使其细胞通透，便于后续过程中一抗结合到相关蛋白上；此外，为防止内源性非特异性蛋白抗原的结合，造成背景着色减弱，本发明的样品还经过牛血清白蛋白处理。
需要说明的是，本发明的一抗与抗原蛋白在低温湿润处孵育，便于保持蛋白活性，且通过依次加入一抗、二抗稀释液，使一抗二抗特异性结合，便于实验现象检测；特别是在二抗结合过程中，在避光条件下进行，避免二抗见光淬灭；本发明还采用荧光染色，便于后续显微拍摄。
本发明对相应生殖细胞染色体进行适应于鱼类的免疫荧光定位分析，检测到鱼类生殖细胞发育阶段相关的染色体免疫荧光定位信号的细胞相特征。
作为本发明的进一步优选，步骤S1中，所述制备鱼性腺染色体的方法为：选取90～100mm3实验鱼精巢组织用弯剪剪碎，带2mL生理盐水吸入离心管，轻轻吹打50次以上，再吸入8mL生理盐水混悬，静置3分钟后，吸取上清液转入另一离心管，在转速1000rpm下离心5min，弃上清；加入10mL0.075MKcl,低渗3小时，卡诺氏固定液固定3次。
作为本发明的进一步优选，步骤S5中，一抗CTD稀释液的稀释比例为1:50～1000。
需要说明的是，步骤S5中，一抗CTD稀释液为为蛋白分子Anti-RNA polymeraseⅡCTD repeat YSPTSPS(phospho S5)的稀释液。
作为本发明的进一步优选，步骤S6中，二抗稀释液的稀释比例为1:50～200。
为了说明本发明所述的技术方案，以下结合具体附图及实施例进行详细说明。
实施例1不同发育状态鱼类的蛋白组织化学检测
本实施例选用购自Abcam公司的蛋白分子Anti-RNA polymeraseⅡCTD repeatYSPTSPS(phospho S5)，后续简称为RNA Pol II CTD(S5)，对不同发育状态鱼类的精巢组织进行蛋白组织化学检测。
本实施例研究对象采用原始亲本红鲫、杂交鲫鲤F1和异源四倍体鲫鲤，其中，原始亲本红鲫选用两性可育的1年龄自然种红鲫，异源四倍体鲫鲤选用两性可育的1年龄人工选育杂交种异源四倍体鲫鲤，杂交鲫鲤F1选用具备可育潜能但暂未跨越生殖障碍的1年龄人工杂交种鲫鲤F1，杂交鲫鲤和异源四倍体鲫鲤的具体产生过程如下：
以红鲫(Carassius auratus red var.，2n＝100)作为母本，用鲤(Cyprinuscarpio L.，2n＝100)为父本进行属间杂交，产生的不同倍性的后代中，获得了鲫鲤F1和F2都是染色体数目为100的二倍体杂交鱼，在此基础上通过部分可育的F2产生不减数分裂的配子自交产生异源四倍体鲫鲤(Allotetraploid hybrids，简称4nAT)，4nAT能够稳定产生二倍体配子形成稳定的后代。
本实施例提供一种鱼类精巢组织蛋白组织化学检测方法，包括以下步骤：
(1)用Bouin氏液或Smith氏液固定样品18h，然后清洗多次；其中，Bouin氏液固定的样品直接使用70％酒精清洗多次即可；或Smith氏液固定的样品先用清水冲洗多次，然后使用70％酒精清洗；
使用70％、80％、95％和100％酒精梯度脱水，其中，使用95％和100％的酒精重复脱水两次，各级酒精脱水时间为50min；加入100％酒精和二甲苯的混合溶液反应35min，再加入二甲苯进行处理20min，直至样品细胞组织呈透明；其中，混合溶液中100％酒精和二甲苯的质量比为1:1；准备蜡杯，事先熔蜡后放入温箱，保持温度为55～60℃，然后将上述透明的样品置于二甲苯与石蜡的混合液中处理25min后，放入蜡杯中透蜡处理50min；将透蜡后的样品放入加热后处于熔融状态的石蜡中，待其冷却凝固后，修切和固着蜡块，然后在洁净的载玻片上涂抹薄层蛋白甘油，将蜡片置于45℃温水中展平，捞至玻片上铺正，将载玻片置于37℃条件下烘3天。
(2)脱蜡和水化：将切片放置在60℃条件下烘烤120min，然后置于二甲苯溶液中浸泡40min，依次经过100％无水乙醇冲洗5min，90％乙醇冲洗5min，70％乙醇冲洗5min，蒸馏水冲洗5min，1×PBS冲洗5min。
(3)抗原修复：将经过脱蜡水化处理后的切片放入盛有0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液中，保持pH为6，然后置于进行加热使缓冲液温度为96℃～98℃并持续10分钟，后自然冷却至室温，依次经过1×PBS清洗5min，蒸馏水冲洗5min。
(4)向上述切片中加入内源性过氧化物酶阻断剂50μL，室温孵育10min，使用1×PBS冲洗3min，重复3次。
(5)然后滴加一抗CTD稀释液，稀释比例为1:500，置于4℃湿盒中过夜，然后在37℃条件下复温30min，最后使用1×PBS冲洗3min，重复3次；其中一抗CTD为上述蛋白分子RNAPol II CTD(S5)的稀释液。
(6)然后滴加反应增强液50μL，室温孵育20min，使用1×PBS冲洗3min，重复3次。
(7)滴加增强酶标山羊抗小鼠/兔IgG聚合物50μL，室温孵育20min，使用1×PBS冲洗3min，重复3次。
(8)DAB显色：滴加DAB工作液50μL，室温反应10min后，使用自来水冲洗5min；其中，DAB工作液为DAB溶液：DAB底物液＝50μL:1μL。
(9)复染：加入苏木素反应2min，使用1×PBS冲洗3min，重复3次。
(10)分化：使用1％盐酸酒精分化3s，然后使用自来水冲洗5min。
(11)脱水和透明：依次使用70％、80％、90％、100％酒精梯度脱水，每级酒精脱水5min，然后置于二甲苯浸泡10min，重复2次。
(12)最后加中性树脂进行封片，自然晾干后显微镜观察。
图1～图2为RNA Pol II CTD(S5)在原始亲本红鲫中的免疫组化显色结果示意图。
由图1～2可知，一年龄红鲫精巢已经发育成熟，产生了大量精子，区域性可见少量成团的处于减数第一次分裂前期双线期初级精母细胞相以及生精小管外周上皮附近的精原细胞中呈RNA Pol II CTD(S5)抗体特异性阳性染色，其他早期初级精母细胞、次级精母细胞、精子细胞、精子区域呈阴性染色。
图3～图4为RNA Pol II CTD(S5)在杂交鱼鲫鲤F1中的免疫组化显色结果示意图。
由图3～4可知，具备可育潜能但暂未跨越生殖障碍的1年龄人工杂交种鲫鲤F1精巢中无发育成熟的精子，布满了减数分裂停滞的早期初级精母细胞，区域性的分裂紊乱的初级精母细胞，及少量早期精原细胞和凋亡细胞。其中，携带减数分裂紊乱特征的初级精母细胞细胞团以及生精小管外周上皮附近的精原细胞中呈RNA Pol II CTD(S5)抗体特异性阳性染色。
图5～图6为RNA Pol II CTD(S5)在异源四倍体鲫鲤中的免疫组化显色结果示意图。
由图5～6可知，两性可育的1年龄人工选育杂交种异源四倍体鲫鲤精巢已经达到性成熟，基本由成熟的精子及呈抗体阳性反应的双线期或者终变期的初级精母细胞相组成，少量精原细胞也呈抗体阳性反应。
实施例2不同发育状态鱼类的免疫荧光定位分析
本实施例选用购自Abcam公司的蛋白分子Anti-RNA polymeraseⅡCTD repeatYSPTSPS(phospho S5)，后续简称为RNA Pol II CTD(S5)，对不同鱼类生殖细胞染色体进行免疫荧光定位分析。
本实施例研究对象采用原始亲本红鲫、杂交鲫鲤F1和异源四倍体鲫鲤，其中，原始亲本红鲫选用两性可育的1年龄自然种红鲫，异源四倍体鲫鲤选用两性可育的1年龄人工选育杂交种异源四倍体鲫鲤，杂交鲫鲤F1选用具备可育潜能但暂未跨越生殖障碍的1年龄人工杂交种鲫鲤F1，杂交鲫鲤和异源四倍体鲫鲤的具体产生过程参照实施例1。
本实施例提供一种鱼类生殖细胞染色体免疫荧光定位分析方法，包括以下步骤：
S1.制片：用多聚甲醛溶液固定样品过夜，使用甲醇梯度脱水，之后以石蜡包埋，将包埋好的鱼性腺染色体样品进行组织切片，切片厚度为4～5μm，切片后在水中展好，烘干后冷藏。
S2.在低温下，加入500μL 4％多聚甲醛固定相关细胞及染色体20min，使用1×PBS重复清洗3次，每次5min。
S3.常温下，在200μL 0.5％Triton-x-100溶液中通透30min，使用1×PBS重复清洗3次，每次5min。
S4.置于50μL 3％牛血清白蛋白溶液中，在37℃下孵育60min。
S5.加入一抗CTD稀释液50μL，稀释比例为1:100，在湿盒中孵育，4℃下过夜，然后使用1×PBS重复清洗3次，每次10min；其中，一抗CTD稀释液为蛋白分子RNA Pol II CTD(S5)的稀释液。
S6.加入二抗稀释液50μL，稀释比例为1:100，在37℃下孵育60min，然后在避光条件下，使用1×PBS重复清洗3次，每次10min。
S7.加DAPI染液30μL，封片后在荧光显微镜下观察。
在实验过程中发现，制作好的生殖细胞悬液的储存方式和滴片时的处理方式对实验的结果有着重要的影响。在其他实验条件保持相对稳定的前提下，设置时间梯度并改变储存方式进行了对比实验，具体实验结果见表1。
表1
Figure BDA0002427269470000101
由表1可知，以细胞悬液的方式储存于-20℃做出来的实验效果好。当存放时间越久，染色体形态也会发生改变，影响实验结果，所以，需要勤换存储液，以此来保护染色体的形态和其有的蛋白活性。滴片需现滴现用，不能以滴在玻片上的形式储存。在实验过程中还发现，由于蛋白质在加热条件下易失活的特点，在冰冻玻片上滴片后，不能用酒精灯烤片，应静置于常温，让其自然风干。
根据对原始亲本红鲫体细胞和生殖细胞进行染色体免疫荧光检测，得到表2中所示的结果。
表2
Figure BDA0002427269470000111
由表2可知，与免疫组织化学检测显色结果一致，原始亲本红鲫生殖细胞分裂相中都能检测到规律性的定位信号，而红鲫体细胞信号数较生殖细胞数明显较多，且在数目上呈现一定的规律性。体细胞间期分裂相主要呈现28个信号，也有一部分为21个信号，分裂中期分裂相主要呈现10个信号，也有一部分为4个信号。生殖细胞双线期分裂相信号的明显分布较其它生殖细胞较多，主要呈现8个信号，随着减数分裂进行，信号逐渐减少，精子细胞和精子中无相关信号。
图7为RNA Pol II CTD(S5)蛋白分子在原始亲本红鲫体细胞中染色体蛋白荧光分析结果示意图，包括图7-A、图7-B、图7-C、图7-D、图7-E、图7-F。
图7-A、图7-B、图7-C均为间期体细胞，可分别检测到28、38、76个信号点；图7-D开始进入分裂期，信号点为21个；图7-E和图7-F为分裂中期，信号数下降，分别为10个和4个。
图8为RNA Pol II CTD(S5)蛋白分子在原始亲本红鲫生殖细胞中染色体蛋白荧光分析结果示意图，包括图8-G、图8-H、图8-I。
图8-G为减Ⅰ双线期分裂相，可检测得到其上有8个信号，图8-H为减Ⅰ中期分裂相，信号数下降到4；图8-I后续细胞相信号逐渐减少到无，偶尔能检测到减Ⅰ末期细胞中剩1个信号。
上述信号与染色体上转录活性区有关，在减数分裂相上的定位与蛋白组织化学定位结果一致，能定位处于减数第一次分裂双线期初级精母细胞，为鉴定生殖细胞发育状态提供了重要分子标记。
本发明提供的鱼类生殖细胞发育分子的标记方法，首次将免疫探针应用于鱼类生殖细胞发育研究中，采用RNA Pol II CTD(S5)蛋白分子作为分子标记对不同发育状态鱼类精巢组织进行常规免疫组织化学检测，定位标记了处于减数第一次分裂双线期初级精母细胞及生精小管外周上皮附近的精原细胞；对相应生殖细胞染色体进行适应于鱼类的免疫荧光定位分析，检测到鱼类生殖细胞发育阶段相关的染色体免疫荧光定位信号的细胞相特征，综合解析了不同鱼类生殖细胞发育的细胞相特征，为判断鱼类生殖细胞发育状态提供了重要分子标记，为鱼类遗传育种提供了新的发育功能检测策略。
需要说明的是，在本文中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，由于文字表达的有限性，而客观上存在无限的具体结构，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进、润饰或变化，也可以将上述技术特征以适当的方式进行组合；这些改进润饰、变化或组合，或未经改进将发明的构思和技术方案直接应用于其它场合的，均应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种蛋白分子标记在鱼类生殖细胞发育研究中的应用，其特征在于，所述蛋白分子为Anti-RNA polymerase Ⅱ CTD repeat YSPTSPS（phospho S5），所述蛋白分子是RNA聚合酶Ⅱ中最大亚基的羧基末端结构域，所述应用包括采用蛋白分子作为标记分子对不同发育状态鱼类生殖细胞染色体进行免疫荧光定位分析；
其中，所述不同发育状态鱼类为不同发育时期的鲫鲤品系杂交鱼类及其原始亲本。
2.如权利要求1所述蛋白分子标记在鱼类生殖细胞发育研究中的应用，其特征在于，所述鲫鲤品系杂交鱼类及原始亲本分别为红鲫、杂交鱼鲫鲤F1或异源四倍体鲫鲤中至少一种。
3.如权利要求1所述蛋白分子标记在鱼类生殖细胞发育研究中的应用，其特征在于，所述免疫荧光定位分析包括以下步骤：
S1.制备鱼性腺染色体；
S2.在低温下，加入500µL 4%多聚甲醛固定相关细胞及染色体20min，使用1×PBS重复清洗3次，每次5min；
S3.常温下，在200µL 0.5%Triton-x-100溶液中通透30min，使用1×PBS重复清洗3次，每次5min；
S4.置于50µL 3%牛血清白蛋白溶液中，在37℃下孵育60min；
S5.加入一抗CTD稀释液50µL，在湿盒中孵育，4℃下过夜，然后使用1×PBS重复清洗3次，每次10min；
S6.加入二抗稀释液50µL，在37℃下孵育60min，然后在避光条件下，使用1×PBS重复清洗3次，每次10min；
S7.加DAPI染液30µL，封片后在荧光显微镜下观察。
4.如权利要求3所述蛋白分子标记在鱼类生殖细胞发育研究中的应用，其特征在于，步骤S1中，所述制备鱼性腺染色体的方法为：选取90~100mm3实验鱼精巢组织用弯剪剪碎，带2mL生理盐水吸入离心管，轻轻吹打50次以上，再吸入8mL生理盐水混悬，静置3分钟后，吸取上清液转入另一离心管，在转速1000rpm下离心5min，弃上清；加入10mL 0.075MKcl，低渗3小时，卡诺氏固定液固定3次。
5.如权利要求3所述蛋白分子标记在鱼类生殖细胞发育研究中的应用，其特征在于，步骤S5中，所述一抗CTD稀释液的稀释比例为1:50~1000。
6.如权利要求3所述蛋白分子标记在鱼类生殖细胞发育研究中的应用，其特征在于，步骤S6中，所述二抗稀释液的稀释比例为1:50~200。
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