CN108330195B - 大菱鲆生精上皮不同发育时期生殖细胞及体细胞的标记方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了大菱鲆生精上皮不同发育时期生殖细胞及体细胞的标记方法及应用，从大菱鲆精巢cDNA中扩增Amh/Sox9/Gsdf片段，经克隆并择优后提取质粒，以限制性内切酶线性化质粒，回收质粒后制备探针，将样品处理后进行固定、脱水、包埋，切片后进行荧光原位杂交，最后进行细胞核染色，封片后观察拍照。有益效果为：本发明方法巧妙地将大菱鲆几个关键发育时期的精细胞及Sertoli细胞区分开，标记方法简单易行，精确度较高；大菱鲆生精上皮不同发育时期生殖细胞及体细胞的标记方法可以应用于其他海洋生物的生精上皮细胞区分及标记，为今后鱼类的精子发生及生精上皮内环境研究提供有效方法和科学依据。
Description
技术领域
本发明涉及鱼类细胞标记方法领域，尤其是涉及大菱鲆生精上皮不同发育时期生殖细胞及体细胞的标记方法及应用。
技术背景
精子发生(Spermatogenesis)是指生殖细胞从精原细胞(Spermatogonia)发育为成熟的精子(Spermatozoa)的过程。生精上皮是精子发生的唯一场所，包括生殖细胞(germcell)和体细胞(Sertoli cell)。哺乳动物的整个精子发生过程都在Sertoli细胞的孵育下完成。鱼类的精细胞在由Sertoli包裹组成的囊状结构(精小囊Spermatogenic Cysts)中发育、成熟。因此，生精上皮的生殖细胞和体细胞的数量和功能直接决定了个体产生精子的质和量。
遗憾的是，有关大菱鲆在内的海洋鱼类生精上皮的研究还十分有限，尚缺乏关键发育阶段生殖细胞及体细胞的有效分子标记。给大菱鲆的精子发生研究带来诸多不便，阻碍了对大菱鲆及其他鱼类生殖生物学相关方面的研究。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种大菱鲆生精上皮不同发育时期生殖细胞及体细胞的标记方法，本标记方法可以巧妙地将几个关键发育时期的精细胞及Sertoli细胞区分开，可以捕捉精细胞变态的各个动态时期，填补大菱鲆精细胞变态阶段划分的研究空白，而且操作简单，精确度较高。
本发明的目的之二在于提供一种大菱鲆生精上皮不同发育时期生殖细胞及体细胞的标记方法的应用，本标记方法可以应用于其他海洋生物的生精上皮细胞区分及标记，为今后鱼类的精子发生及生精上皮内环境研究提供有效依据和科学方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
大菱鲆生精上皮不同发育时期生殖细胞及体细胞的标记方法，包括：
探针的制备：用于鉴定大菱鲆生精上皮不同发育时期不同细胞类型的基因原位杂交探针如表1所示，从大菱鲆精巢cDNA中扩增Amh/Sox9/Gsdf片段，0.98-1.05％琼脂糖电泳胶回收，亚克隆并连接到PGEM-T easy载体，转化大肠杆菌感受态，挑选阳性克隆并测序，挑取含选择正确插入方向的单克隆，中量提取质粒；
表1.Amh/Sox9/Gsdf RNA探针合成引物
采用限制性内切酶(NcoI、SpeI)分别线性化质粒，利用PCR产物回收纯化试剂盒纯化线性化的片段并用DEPC处理水溶解，并采用核酸定量仪定量；用T7和SP6RNA转录酶分别合成反义和正义探针，反应各物质及其含量如表2所示；
表2.反义探针、正义探针反应的物质及其含量
混匀后，于36-37℃孵育100-120分钟；加入2μLDnase I，36-37℃孵育15-18分钟；加入2μL0.18-0.20mol/LEDTA溶液，EDTA溶液的pH为7.9-8.0；加入3μL4.0-4.2mol/LLiCl溶液及75-80μL预冷的100％酒精，于-20～-25℃放置2-2.5小时；1-4℃、12000-12500rpm离心10-15分钟，70％酒精洗涤2-3次；空气干燥，用20μLDEPC处理水溶解，并定量；用预杂交缓冲液稀释至100ng/μL并于-20～-30℃保存；
切片的制备：杂交前实验所用器皿，离心管，试剂均采用0.1％DEPC处理，并高压消毒；用3-4％多聚甲醛溶液固定样品过夜，将多聚甲醛溶解于pH为7.4的磷酸缓冲液中即得多聚甲醛溶液，之后使用梯度甲醇脱水，之后以石蜡包埋，将包埋好的性腺样品进行组织切片，切片厚度为4-5μm，切片用蒸馏水展好之后，36-37℃烘干过夜，将烘干的片子置于1-4℃冰箱保存；
荧光原位杂交：
a.切片常规脱蜡复水：二甲苯3*5min；100％乙醇2*5min；95％、70％、50％乙醇各5min；4％PFA-PBS固定15min；1×PBST洗涤3*5min；0.2MHCl处理10min；1×PBST洗涤3*5min；蛋白酶K10μg/mL，37℃消化10min；1×PBST洗涤3*5min；
b.预杂交：65℃预杂交液中1-2小时；
c.杂交：探针用预杂交液稀释至1-2ng/μL，80℃变性10min，每张片子100-200μL杂交液，封口膜分好置于湿盒内65℃过夜，湿盒中含有2*SSCT/50％去离子甲酰胺作为保湿剂；
d.杂交后洗涤：65℃温度下，以2×SSCT/50％去离子甲酰胺洗涤2*30min，然后以2×SSCT洗涤15min，以0.2×SSCT洗涤2*30min；室温下以1×PBST洗涤3*5min；
e.封闭：室温下以2％封闭液封闭1-2h；
f.抗体：室温下以2％封闭液按1:500稀释抗体，稀释2h；
g.洗涤：1×PBST洗涤5*10min；1×PBS洗涤5*10min；
h.孵育：室温下将荧光放大剂按1:150稀释，孵育1h；
i.洗涤：1×PBST洗涤5*10min；
j.重复e、f、g操作步骤；
k.染细胞核：加入1×PBS稀释的DAPI，避光显色；1×PBST洗涤3*5min终止显色；
l.封片后观察拍照。
本发明中的大菱鲆生精上皮不同发育时期生殖细胞及体细胞的标记方法可以应用于其他海洋生物的生精上皮细胞区分及标记，为其他海洋生物的生精上皮细胞区分及标记提供科学依据与技术参考。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
1)通过不同分子标记(Amh/Sox9/Gsdf)的组合使用，结合双色荧光原位杂交技术，巧妙地将几个关键发育时期的精细胞及Sertoli细胞区分开，可以捕捉精细胞变态的各个动态时期，填补大菱鲆精细胞变态阶段划分的研究空白，标记方法简单易行，精确度较高；
2)大菱鲆生精上皮不同发育时期生殖细胞及体细胞的标记方法可以应用于其他海洋生物的生精上皮细胞区分及标记，为今后鱼类的精子发生及生精上皮内环境研究提供有效依据和科学方法。
附图说明
图1是本发明中Amh/Sox9组合在Ⅱ期的双色荧光原位杂交结果示意图；
图2是本发明中Amh/Sox9组合在Ⅲ期的双色荧光原位杂交结果示意图；
图3是本发明中Amh/Sox9组合在Ⅳ期的双色荧光原位杂交结果示意图；
图4是本发明中Amh/Sox9组合在Ⅴ期的双色荧光原位杂交结果示意图；
图5是本发明中Amh/Sox9组合在Ⅵ期的双色荧光原位杂交结果示意图；
图6是本发明中Gsdf/Sox9组合在Ⅱ期的双色荧光原位杂交结果示意图；
图7是本发明中Gsdf/Sox9组合在Ⅳ期的双色荧光原位杂交结果示意图；
图8是本发明中图7中Part A的局部放大图；
图9是本发明中图7中Part B的局部放大图；
图10是本发明中图7中Part C的局部放大图。
附图标记：1.Sertoli细胞；2.精原细胞；3.精细胞Ⅶ和精子。
具体实施方式
下面通过附图和实施例对本发明方案作进一步说明：
实施例1：
大菱鲆生精上皮不同发育时期生殖细胞及体细胞的标记方法，包括：
1)探针的制备：从大菱鲆精巢cDNA中扩增Amh/Sox9/Gsdf片段，引物Amh正向序列：TCCACATTCTCACTCTCGAT，反向序列：AGAGTCTCACCATCTCCCTT；Sox9正向序列：GACTTTGGAGCCGTGGACAT，反向序列：TCACGGTCTGGACAGTTGTG；Gsdf正向序列：TGAAGAACCTGCAGCCTCTG，反向序列：TTACTCTTTGCTGGGCTGCTG；以0.98％琼脂糖电泳胶回收，亚克隆并连接到PGEM-T easy载体，转化大肠杆菌感受态，挑选阳性克隆并测序，挑取含选择正确插入方向的单克隆，中量提取质粒；采用限制性内切酶(NcoI、SpeI)分别线性化质粒，利用PCR产物回收纯化试剂盒纯化线性化的片段并用DEPC处理水溶解，并采用核酸定量仪定量；用T7和SP6RNA转录酶分别合成反义和正义探针，反义探针合成时反应各物质及其含量为：酶切质粒1μg、10×NTP mix2μL、10×Buffer2μL、RNase Inhibitor1μL、T72μL，以DEPC处理水加至20μL；正义探针合成时反应各物质及其含量为：酶切质粒1μg、10×NTPmix2μL、10×Buffer2μL、RNase Inhibitor1μL、SP6 2μL，以DEPC处理水加至20μL；混匀后，于36℃孵育100分钟；加入2μL DNase I，37℃孵育15分钟；加入2μL 0.18mol/L EDTA溶液，EDTA溶液的pH为7.9；加入3μL 4.0mol/LLiCl溶液及75μL预冷的100％酒精，于-20℃放置2小时；1-4℃、12000rpm离心10分钟，70％酒精洗涤2次；空气干燥，用20μL DEPC处理水溶解，并定量；用预杂交缓冲液稀释至100ng/μL并于-20℃保存；
2)切片的制备：杂交前实验所用器皿，离心管，试剂均采用0.1％DEPC处理，并高压消毒；用3％多聚甲醛溶液固定样品过夜，将多聚甲醛溶解于pH为7.4的磷酸缓冲液中即得多聚甲醛溶液，之后使用梯度甲醇脱水，之后以石蜡包埋，将包埋好的性腺样品进行组织切片，切片厚度为4μm，切片用蒸馏水展好之后，36℃烘干过夜，将烘干的片子置于1℃冰箱保存；
3)荧光原位杂交：二甲苯3*5min；100％乙醇2*5min；95％、70％、50％乙醇各5min；4％PFA-PBS固定15min；1×PBST洗涤3*5min；0.2MHCl处理10min；1×PBST洗涤3*5min；蛋白酶K10μg/mL，37℃消化10min；1×PBST洗涤3*5min；65℃预杂交液中1小时；探针用预杂交液稀释至1ng/μL，80℃变性10min，每张片子100-200μL杂交液，封口膜分好置于湿盒内65℃过夜，湿盒中含有2*SSCT/50％去离子甲酰胺作为保湿剂；65℃温度下，以2×SSCT/50％去离子甲酰胺洗涤2*30min，然后以2×SSCT洗涤15min，以0.2×SSCT洗涤2*30min；室温下以1×PBST洗涤3*5min；室温下以2％封闭液封闭1h；室温下以2％封闭液按1:500稀释抗体，稀释2h；1×PBST洗涤5*10min；1×PBS洗涤5*10min；室温下将荧光放大剂按1:150稀释，孵育1h；1×PBST洗涤5*10min；重复封闭、抗体稀释、洗涤操作后加入1×PBS稀释的DAPI，避光显色；1×PBST洗涤3*5min终止显色；最后经封片后观察拍照。
Amh/Sox9组合的双色荧光原位杂交结果特性在于：
在Ⅱ期精巢，Amh/Sox9特异性分布于精原细胞周围的Sertoli细胞；
在Ⅲ-Ⅵ期精巢中，Amh在细胞核浓缩基本完成的精细胞Ⅶ和精子上不表达，而Sox9在Sertoli细胞和各时期生殖细胞中都有分布。
Sox9/Gsdf组合的双色荧光原位杂交结果特性在于：
在Ⅱ期精巢，Sox9特异性分布于精原细胞周围的Sertoli细胞；在Ⅲ-Ⅵ期精巢中，Sox9在Sertoli细胞和各时期生殖细胞中都有分布。
在各时期精巢中，Gsdf仅特异性分布于精原细胞周围的Sertoli细胞。三种分子标记Amh/Sox9/Gsdf的特异性分布区域由大到小依次为Sox9＞Amh＞Gsdf。
实施例2：
大菱鲆生精上皮不同发育时期生殖细胞及体细胞的标记方法，包括：
探针的制备：用于鉴定大菱鲆生精上皮不同发育时期不同细胞类型的基因原位杂交探针如表1所示，从大菱鲆精巢cDNA中扩增Amh/Sox9/Gsdf片段，1.00％琼脂糖电泳胶回收，亚克隆并连接到PGEM-T easy载体，转化大肠杆菌感受态，挑选阳性克隆并测序，挑取含选择正确插入方向的单克隆，中量提取质粒；
采用限制性内切酶(NcoI、SpeI)分别线性化质粒，利用PCR产物回收纯化试剂盒纯化线性化的片段并用DEPC处理水溶解，并采用核酸定量仪定量；用T7和SP6RNA转录酶分别合成反义和正义探针，反应各物质及其含量如表2所示；
混匀后，于36℃孵育100分钟；加入2μLDnase I，36℃孵育16分钟；加入2μL0.19mol/LEDTA溶液，EDTA溶液的pH为7.9；加入3μL4.1mol/LLiCl溶液及78μL预冷的100％酒精，于-22℃放置2小时；2℃、12000rpm离心10分钟，70％酒精洗涤3次；空气干燥，用20μLDEPC处理水溶解，并定量；用预杂交缓冲液稀释至100ng/μL并于-24℃保存；
切片的制备：杂交前实验所用器皿，离心管，试剂均采用0.1％DEPC处理，并高压消毒；用4％多聚甲醛溶液固定样品过夜，将多聚甲醛溶解于pH为7.4的磷酸缓冲液中即得多聚甲醛溶液，之后使用梯度甲醇脱水，之后以石蜡包埋，将包埋好的性腺样品进行组织切片，切片厚度为5μm，切片用蒸馏水展好之后，36℃烘干过夜，将烘干的片子置于2℃冰箱保存；
荧光原位杂交：
a.切片常规脱蜡复水：二甲苯3*5min；100％乙醇2*5min；95％、70％、50％乙醇各5min；4％PFA-PBS固定15min；1×PBST洗涤3*5min；0.2MHCl处理10min；1×PBST洗涤3*5min；蛋白酶K10μg/mL，37℃消化10min；1×PBST洗涤3*5min；
b.预杂交：65℃预杂交液中1.5小时；
c.杂交：探针用预杂交液稀释至1.5ng/μL，80℃变性10min，每张片子100-200μL杂交液，封口膜分好置于湿盒内65℃过夜，湿盒中含有2*SSCT/50％去离子甲酰胺作为保湿剂；
d.杂交后洗涤：65℃温度下，以2×SSCT/50％去离子甲酰胺洗涤2*30min，然后以2×SSCT洗涤15min，以0.2×SSCT洗涤2*30min；室温下以1×PBST洗涤3*5min；
e.封闭：室温下以2％封闭液封闭1-2h；
f.抗体：室温下以2％封闭液按1:500稀释抗体，稀释2h；
g.洗涤：1×PBST洗涤5*10min；1×PBS洗涤5*10min；
h.孵育：室温下将荧光放大剂按1:150稀释，孵育1h；
i.洗涤：1×PBST洗涤5*10min；
j.重复e、f、g操作步骤；
k.染细胞核：加入1×PBS稀释的DAPI，避光显色；1×PBST洗涤3*5min终止显色；
l.封片后观察拍照。
照片结果显示：
1)Amh/Sox9组合的双色荧光原位杂交结果特性在于：在Ⅱ期精巢，Amh/Sox9特异性分布于精原细胞周围的Sertoli细胞；在Ⅲ-Ⅵ期精巢中，Amh在细胞核浓缩基本完成的精细胞Ⅶ和精子上不表达，而Sox9在Sertoli细胞和各时期生殖细胞中都有分布；
2)Sox9/Gsdf组合的双色荧光原位杂交结果特性在于：在Ⅱ期精巢，Sox9特异性分布于精原细胞周围的Sertoli细胞；在Ⅲ-Ⅵ期精巢中，Sox9在Sertoli细胞和各时期生殖细胞中都有分布；在各时期精巢中，Gsdf仅特异性分布于精原细胞周围的Sertoli细胞；
3)三种分子标记Amh/Sox9/Gsdf的特异性分布区域由大到小依次为Sox9＞Amh＞Gsdf。
实施例3：
大菱鲆生精上皮不同发育时期生殖细胞及体细胞的标记方法，包括：探针的制备、切片的制备、荧光原位杂交，具体包括以下步骤：
探针的制备：用于鉴定大菱鲆生精上皮不同发育时期不同细胞类型的基因原位杂交探针如表1所示，从大菱鲆精巢cDNA中扩增Amh/Sox9/Gsdf片段，1.05％琼脂糖电泳胶回收，亚克隆并连接到PGEM-T easy载体，转化大肠杆菌感受态，挑选阳性克隆并测序，挑取含选择正确插入方向的单克隆，中量提取质粒；采用限制性内切酶(NcoI、SpeI)分别线性化质粒，利用PCR产物回收纯化试剂盒纯化线性化的片段并用DEPC处理水溶解，并采用核酸定量仪定量；用T7和SP6RNA转录酶分别合成反义和正义探针，反应各物质及其含量如表2所示；混匀后，于37℃孵育120分钟；加入2μLDNase I，37℃孵育18分钟；加入2μL0.20mol/L EDTA溶液，EDTA溶液的pH为8.0；加入3μL4.2mol/LLiCl溶液及80μL预冷的100％酒精，于-25℃放置2.5小时；4℃、12500rpm离心15分钟，70％酒精洗涤3次；空气干燥，用20μL DEPC处理水溶解，并定量；用预杂交缓冲液稀释至100ng/μL并于-30℃保存；
切片的制备：杂交前实验所用器皿，离心管，试剂均采用0.1％DEPC处理，并高压消毒；用4％多聚甲醛溶液固定样品过夜，将多聚甲醛溶解于pH为7.4的磷酸缓冲液中即得多聚甲醛溶液，之后使用梯度甲醇脱水，之后以石蜡包埋，将包埋好的性腺样品进行组织切片，切片厚度为5μm，切片用蒸馏水展好之后，37℃烘干过夜，将烘干的片子置于4℃冰箱保存；
荧光原位杂交，包括以下操作：
a.切片常规脱蜡复水：二甲苯3*5min；100％乙醇2*5min；95％、70％、50％乙醇各5min；4％PFA-PBS固定15min；1×PBST洗涤3*5min；0.2MHCl处理10min；1×PBST洗涤3*5min；蛋白酶K10μg/mL，37℃消化10min；1×PBST洗涤3*5min；
b.预杂交：65℃预杂交液中2小时；
c.杂交：探针用预杂交液稀释至2ng/μL，80℃变性10min，每张片子100-200μL杂交液，封口膜分好置于湿盒内65℃过夜，湿盒中含有2*SSCT/50％去离子甲酰胺作为保湿剂；
d.杂交后洗涤：65℃温度下，以2×SSCT/50％去离子甲酰胺洗涤2*30min，然后以2×SSCT洗涤15min，以0.2×SSCT洗涤2*30min；室温下以1×PBST洗涤3*5min；
e.封闭：室温下以2％封闭液封闭2h；
f.抗体：室温下以2％封闭液按1:500稀释抗体，稀释2h；
g.洗涤：1×PBST洗涤5*10min；1×PBS洗涤5*10min；
h.孵育：室温下将荧光放大剂按1:150稀释，孵育1h；
i.洗涤：1×PBST洗涤5*10min；
j.重复e、f、g操作步骤；
k.染细胞核：加入1×PBS稀释的DAPI，避光显色；1×PBST洗涤3*5min终止显色；
l.封片后观察拍照。
切片的制备步骤中，配制磷酸缓冲液的pH为7.4，将4.0g多聚甲醛、20mg4，6-二硝基-2-仲丁基苯酚、1.5mg4-羟基-3,5-二溴-苯甲醛溶解于96g磷酸缓冲溶液中溶解完全即得多聚甲醛溶液；多聚甲醛溶液可以使生殖细胞及体细胞中的物质尽量接近其活性状态时的形态结构和位置，可以防止细胞自溶与腐败，防止细胞内的酶对蛋白质进行分解，同时特殊配比的4，6-二硝基-2-仲丁基苯酚、4-羟基-3,5-二溴-苯甲醛多聚甲醛穿透力强劲，能够迅速而均匀地渗入到组织细胞中，而且不会引起细胞的明显收缩与膨胀，不产生变性，4，6-二硝基-2-仲丁基苯酚、4-羟基-3,5-二溴-苯甲醛多聚甲醛还可以产生协同作用，该协同作用会使4-羟基-3,5-二溴-苯甲醛多聚甲醛与细胞中糖类的部分羟基发生羟醛缩合反应，缩醛反应可以生成固定的交联键，4-羟基-3,5-二溴-苯甲醛多聚甲醛对糖类的固定与多聚甲醛对蛋白质的固定同时发挥作用，可以高效、迅速地固定组织细胞，防止糖类物质与蛋白质的变性与移动，稳定细胞的结构与化学成分，使其保存在原位，保存细胞器的空间位置关系，将细胞内的成分如蛋白质、脂质、糖类等变为不溶状态，避免这些成分溶解与流失，对细胞组织固定较为均匀，避免组织变硬变脆，使组织软硬适度，利于超薄切片，从而易于染色，增强成像清晰度与对比度，大大降低细胞收缩率，可以使细胞收缩率降低到0.2％以下，大大提高固定效果，提高鉴定的精确度与准确度。
Amh/Sox9组合的双色荧光原位杂交结果如图1-5所示，其特性在于：
在Ⅱ期精巢，Amh/Sox9特异性显色于精原细胞(2)周围的Sertoli细胞(1)；
在Ⅲ-Ⅵ期精巢中，Amh在细胞核浓缩基本完成的精细胞Ⅶ和精子(3)上不显色，而Sox9在Sertoli细胞(1)和各时期生殖细胞上都显色。
Sox9/Gsdf组合的双色荧光原位杂交结果如图6-10所示，其特性在于：
在Ⅱ期精巢，Sox9特异性显色于精原细胞(2)周围的Sertoli细胞(1)；
在Ⅲ-Ⅵ期精巢中，Sox9在Sertoli细胞(2)和各时期生殖细胞上都显色。
在各时期精巢中，Gsdf仅特异性显色于精原细胞周围的Sertoli细胞(2)。
三种分子标记Amh/Sox9/Gsdf的特异性显色区域由大到小依次为Sox9＞Amh＞Gsdf。Amh/Sox9/Gsdf的组合标记结果特征如表3：
表3.Amh/Sox9/Gsdf标记细胞类型
| 细胞类型 | Amh | Sox9 | Gsdf |
| Sertoli细胞 | √ | √ | |
| Sertoli细胞(精原细胞周围) | √ | √ | √ |
| 精原细胞 | √ | √ | |
| 精母细胞 | √ | √ | |
| 精细胞I-Ⅵ(变态早期) | √ | √ | |
| 精细胞Ⅶ(变态晚期) | √ | ||
| 精子 | √ |
其中，精原细胞与精母细胞可以通过光学显微镜下细胞直径大小进行直接区分，也可在以上所述的分子标记组合基础上，引入新的分子标记Vasa/Dnd对精原细胞进行进一步标记，但不影响本专利方法的正常运用。
本发明操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 浙江海洋大学
<120> 大菱鲆生精上皮不同发育时期生殖细胞及体细胞的标记方法及应用
<140> 2018100753413
<141> 2018-01-25
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tccacattct cactctcgat 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agagtctcac catctccctt 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gactttggag ccgtggacat 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tcacggtctg gacagttgtg 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tgaagaacct gcagcctctg 20
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ttactctttg ctgggctgct g 21
Claims (6)
1.大菱鲆生精上皮不同发育时期生殖细胞及sertoli细胞的标记方法，包括：探针的制备、切片的制备、荧光原位杂交，其特征在于：所述切片的制备步骤为：杂交前实验所用器皿，试剂均采用0.1%DEPC处理，并高压消毒；用多聚甲醛溶液固定样品过夜，使用梯度甲醇脱水，之后以石蜡包埋，将包埋好的性腺样品进行组织切片，切片厚度为4-5μm，切片用DEPC处理水展好，烘干过夜后冷藏；
所述切片的制备步骤中多聚甲醛溶液的浓度为3-4%，将多聚甲醛溶解于pH为7.4的磷酸缓冲液中即得；
所述探针的制备步骤为：从大菱鲆精巢cDNA中扩增Amh/Sox9/Gsdf片段，0.98-1.05%琼脂糖电泳胶回收，亚克隆并连接到PGEM-Teasy载体，转化大肠杆菌感受态，挑选阳性克隆并测序，挑取含选择正确插入方向的单克隆，中量提取质粒；采用限制性内切酶NcoI、SpeI分别线性化质粒，利用PCR产物回收纯化试剂盒纯化线性化的片段并用DEPC处理水溶解，并采用核酸定量仪定量；用T7和SP6 RNA转录酶分别合成反义和正义探针；
所述荧光原位杂交步骤为：将切片经脱蜡复水操作后置于65℃预杂交液中1-2小时，然后进行杂交，杂交结束后在65℃温度下，以2×SSCT/50%去离子甲酰胺洗涤2*30min，然后以2×SSCT洗涤15min，以0.2×SSCT洗涤2*30min；室温下以1×PBST洗涤3*5min；室温下以2%封闭液封闭1-2h；室温下以2%封闭液按1:500稀释抗体，稀释2小时；室温下1×PBST洗涤5*10min，1×PBS洗涤5*10min；室温下将荧光放大剂按1:150稀释，孵育1小时；1×PBST洗涤5*10min；然后重复进行封闭、稀释抗体、洗涤操作，最后进行细胞核染色，封片后观察拍照；
所述荧光原位杂交包括Amh/Sox9组合的双色荧光原位杂交和Sox9/Gsdf组合的双色荧光原位杂交；
所述Amh/Sox9组合的双色荧光原位杂交后，在Ⅱ期精巢，Amh/Sox9特异性显色于精原细胞和周围的Sertoli细胞；在Ⅲ-Ⅵ期精巢中，Amh在细胞核浓缩基本完成的变态晚期精细胞和精子上不显色，而Sox9在Sertoli细胞和各时期生殖细胞上都显色；
所述Sox9/Gsdf组合的双色荧光原位杂交后，在Ⅱ期精巢，Sox9特异性显色于精原细胞周围的Sertoli细胞；在Ⅲ-Ⅵ期精巢中，Sox9在Sertoli细胞和各时期生殖细胞上都显色；
在各时期精巢中，Gsdf仅特异性显色于精原细胞周围的Sertoli细胞。
2.根据权利要求1所述的大菱鲆生精上皮不同发育时期生殖细胞及sertoli细胞的标记方法，其特征在于：所述探针的制备步骤中，用于鉴定大菱鲆生精上皮不同发育时期不同细胞类型的基因原位杂交探针合成引物为：Amh正向序列：TCCACATTCTCACTCTCGAT，反向序列：AGAGTCTCACCATCTCCCTT；Sox9正向序列：GACTTTGGAGCCGTGGACAT，反向序列：TCACGGTCTGGACAGTTGTG；Gsdf正向序列：TGAAGAACCTGCAGCCTCTG，反向序列：TTACTCTTTGCTGGGCTGCTG。
3.根据权利要求1所述的大菱鲆生精上皮不同发育时期生殖细胞及sertoli细胞的标记方法，其特征在于：所述探针的制备步骤中，反义探针合成时反应各物质及其含量为：酶切质粒1μg、10×NTPmix 2μL、10×Buffer 2μL、RNase Inhibitor 1μL、T7 2μL，以DEPC处理水加至20μL；正义探针合成时反应各物质及其含量为：酶切质粒1μg、10×NTPmix 2μL、10×Buffer 2μL、RNase Inhibitor 1μL、SP6 2μL，以DEPC处理水加至20μL。
4.根据权利要求1所述的大菱鲆生精上皮不同发育时期生殖细胞及sertoli细胞的标记方法，其特征在于：所述探针的制备步骤中，将反义探针及正义探针合成时各物质混匀后，于36-37℃孵育100-120分钟；加入2μL DNase I，36-37℃孵育15-18分钟；加入2μL0.18-0.20mol/L EDTA溶液，EDTA溶液的pH为7.9-8.0；加入3μL 4.0-4.2mol/L LiCl溶液及75-80μL预冷的100%酒精，于-20～-25℃放置2-2.5小时；1-4℃、12000-12500rpm离心10-15分钟，70%酒精洗涤2-3次；空气干燥，用20μL DEPC处理水溶解，并定量；用预杂交缓冲液稀释至100ng/μL并于-20～-30℃保存。
5.根据权利要求1所述的大菱鲆生精上皮不同发育时期生殖细胞及sertoli细胞的标记方法，其特征在于：所述荧光原位杂交步骤中的杂交操作为：探针用预杂交液稀释至1-2ng/μL，80℃变性10min，每张片子100-200μL杂交液，封口膜分好置于湿盒内65℃过夜，湿盒中含有2*SSCT/50%去离子甲酰胺作为保湿剂。
6.根据权利要求1所述的大菱鲆生精上皮不同发育时期生殖细胞及sertoli细胞的标记方法，其特征在于：所述荧光原位杂交步骤中的染细胞核操作为：加入1×PBS稀释的DAPI，避光显色；1×PBST洗涤3*5min终止显色。
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|---|---|
| CN108330195A (zh) | 2018-07-27 |
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