CN104278078A - 一种大菱鲆胚胎发育期原始生殖细胞(PGCs)的定位标记方法 - Google Patents

一种大菱鲆胚胎发育期原始生殖细胞(PGCs)的定位标记方法 Download PDF

Info

Publication number
CN104278078A
CN104278078A CN201310274379.0A CN201310274379A CN104278078A CN 104278078 A CN104278078 A CN 104278078A CN 201310274379 A CN201310274379 A CN 201310274379A CN 104278078 A CN104278078 A CN 104278078A
Authority
CN
China
Prior art keywords
pbst
pgcs
embryo
wash
washing
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201310274379.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104278078B (zh
Inventor
刘清华
李军
林帆
徐世宏
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Oceanology of CAS
Original Assignee
Institute of Oceanology of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Oceanology of CAS filed Critical Institute of Oceanology of CAS
Priority to CN201310274379.0A priority Critical patent/CN104278078B/zh
Publication of CN104278078A publication Critical patent/CN104278078A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104278078B publication Critical patent/CN104278078B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6841—In situ hybridisation

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及PGCs的定位标记方法，具体的说是一种大菱鲆胚胎发育期原始生殖细胞（PGCs）的定位标记方法。采集大菱鲆各个阶段胚胎样品固定，固定后用50%甲酰胺于-20-40℃保存，待用；将上述保存各个阶段胚胎样品去卵膜之后用不同浓度的1×PBST—甲醇洗脱液依次进行梯度脱水处理后于-20℃至-40℃保存；将上述脱水处理后各个阶段胚胎样品采用梯度甲醇复水，再用1×PBST缓冲液洗涤，洗脱后于60-65℃预杂交1-2h；预杂交后在含有大菱鲆RNA探针的杂交液中于60-65℃下杂交过夜；杂交后洗涤，抗体孵育显色，进而定位标记。本发明提供了一种更加便利实用的样品保存方法，解决了传统胚胎整体原位杂交经甲醇脱水保存后导致去卵膜卵黄困难的问题，同时省去蛋白酶K消化步骤，简化了操作步骤。

Description

一种大菱鲆胚胎发育期原始生殖细胞(PGCs)的定位标记方法
技术领域
本发明涉及PGCs的定位标记方法，具体的说是一种大菱鲆胚胎发育期原始生殖细胞（PGCs）的定位标记方法。
背景技术
大菱鲆是我国北方最重要的海水养殖经济品种之一，然而近十几年来，由于产业发展过快，出现了种质资源退化，病害不断增多，养殖效益下降的趋势。因此有必要对其种质资源进行保护。尽管精子冷冻保存技术相对成熟，然而鱼类胚胎冷冻保存研究一直未有突破，这也是国际种质资源保存的一个难点问题。PGCs冷冻保存为种质资源保护提供了新的突破口。然而目前海水鱼PGCs在胚胎发育过程中的位置和数量仍不清楚，极大的限制了PGCs冷冻保存技术的发展。胚胎整体原位杂交可以跟踪胚胎发育过程中PGCs的迁移就数量变动，但这一技术主要在淡水鱼中易去卵膜的鱼中应用，传统的胚胎整体原位杂交前取样及保存方式并不适用于海水鱼胚胎样品，同时步骤繁琐。因此，建立大菱鲆胚胎发育过程中PGCs的定位标记方法，对于大菱鲆PGCs的分离冷冻及海水鱼种质资源保存具有重要的意义。
发明内容
本发明目的在于提供一种大菱鲆胚胎发育期原始生殖细胞（PGCs）的定位标记方法。
为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
一种大菱鲆胚胎发育期原始生殖细胞（PGCs）的定位标记方法，
1）采集大菱鲆各个阶段胚胎样品固定，固定后用50%甲酰胺于-20-40℃保存，待用；
2）将上述保存各个阶段胚胎样品去卵膜之后用不同浓度的1×PBST—甲醇洗脱液依次进行梯度脱水处理后于-20℃至-40℃保存；
3）将上述脱水处理后各个阶段胚胎样品采用梯度甲醇复水，再用1×PBST缓冲液洗涤，洗脱后于60-65℃预杂交1-2h；
4）预杂交后在含有大菱鲆RNA探针的杂交液中于60-65℃下杂交过夜；杂交后洗涤，抗体孵育显色，进而定位标记。
进一步的说，所述步骤1）将各个阶段胚胎分别用1×PBST(DEPC处理)多次洗涤，每次5-10min；洗涤后利用含4%（质量浓度）多聚甲醛的1×PBST(DEPC处理)溶液并于4-8℃固定16-24h；固定处理后于含50%甲酰胺的1×PBST(DEPC处理)溶液中-20至-40℃下可长期保存。
进一步的说，所述步骤2）将固定处理后的各个阶段的胚胎分别于1×PBST(DEPC处理)溶液中进行去掉卵黄；再将吸取去膜及卵黄各个阶段的胚胎用1×PBST(DEPC处理)多次洗涤，每次5-10min；洗涤后依次经25%甲醇的1×PBST缓冲液、50%甲醇的1×PBST缓冲液、75%甲醇的1×PBST缓冲液、100%甲醇进行梯度脱水，每个梯度5-10min，于100%甲醇溶液-20至-40℃下保存。
进一步的说，将步骤3）梯度脱水的各个阶段胚胎组分分别采用梯度甲醇复水洗涤，每个梯度洗涤5-10min；再以1×PBST缓冲液洗涤5-10min，洗脱后60-65℃预杂交1-2h。所述梯度甲醇复水分别为含75%甲醇的1×PBST、含50%甲醇的1×PBST、含25%甲醇的1×PBST。
进一步的说所述步骤4）用预杂交液稀释的探针于75-85℃变性10-15min，变性后加入至各个阶段预杂交后的胚胎样中在60-65℃杂交16-24h，杂交后经洗脱液进行洗涤，洗脱处理后用封闭试剂封闭处理1-2h，而后经抗体孵育再经显色处理，进而定位标记；
所述探针为，VF：5’-GCTGCTGACTTCCTCAAGACGG-3’；
VR：5’-TTTGCTTGGAACACATTTATTAGTC-3’。
所述杂交后经含50%去离子甲酰胺的2×SSCT缓冲液，于60-65℃下经多次洗涤，每次30min；洗涤后由2×SSCT缓冲液，于60-65℃下，洗涤15-30min；洗涤后再由0.2×SSCT，于60-65℃下多次洗涤，每次30min；最后经1×PBST缓冲液，室温下多次洗涤，每次5-10min。
所述经抗体孵育，孵育后用1×PBST多次洗涤，每次5-10min；洗涤之后加入1×BCIP/NBT（NTMT溶液稀释）避光显色处理，进而定位标记。
本发明具有如下优点：
1.模式生物如斑马鱼胚胎的卵膜与胚盘空隙大，卵膜的去处非常便利，同时能在实验室长期产卵随时取样。取样固定之后用可直接剥卵壳然后梯度甲醇脱水于-20℃保存；而海水鱼的卵壳与胚盘间隙很小，卵膜的去除不便利，同时是分批产卵，而且多数在养殖场里进行无法随时取样，采用传统的步骤显然是不合适的，因此需要一种合适的保存方法。有研究人员传统采用梯度甲醇脱水保存，然后再进行剥膜，但梯度甲醇保存后的胚胎在解剖镜下为黑色不透明状妨碍了后续的剥卵壳去卵黄操作，只适用于胚胎发育后期。本发明每个发育阶段仅取1ml胚胎样品固定16-24小时后，然后直接置于含50%甲酰胺的1×PBST(DEPC处理)可在-20℃长期保存，大大方便了样品的采集保存过程，同时保存的胚胎仍为透明状态，便于后续剥卵操作。
2.本发明中将含50%甲酰胺的1×PBST保存的胚胎取出之后再进行剥膜，然后梯度甲醇脱水并在-20℃处理48h以上。该步骤处理后可以提高胚胎的通透性便于后续杂交操作，而且也可以长期保存。
3.本发明复水后仅用1×PBST洗涤3次，无须蛋白酶K处理，使操作步骤更加简便；同时室温抗体孵育2h无须4℃过夜缩短了实验周期；
4.本发明定位标记方法，便利实用，同时省去蛋白酶K消化步骤，简化了操作步骤，能够指示大菱鲆胚胎发育过程中PGCs的数量和位置的方法。
5.本发明提供了一种更加便利实用的样品保存方法，解决了传统胚胎整体原位杂交经甲醇脱水保存后导致去卵膜卵黄困难的问题，同时省去蛋白酶K消化步骤，简化了操作步骤。本发明能很好地对大菱鲆胚胎发育过程中的PGCs进行定位标记，为分离冷冻大菱鲆PGCs提供了基础，对于大菱鲆种质资源保存具有重要意义。
附图说明
图1a-h为本发明实施例提供的对大菱鲆早期发育原始生殖细胞的定位标记图。
具体实施方式
实施例1
1）采集各个阶段胚胎样品各1ml分别置于15ml离心管，再分别用1×PBST(DEPC处理)缓冲液洗涤2次，每次5min；
2）洗涤后利用13ml含4%（质量比）多聚甲醛的1×PBST(DEPC处理)溶液4℃固定24h；
3）而后再用10ml含50%（体积比）甲酰胺的1×PBST(DEPC处理)溶液-20℃保存（可长期保存）。
4）固定后取30个不同发育阶段的胚胎于1×PBST(DEPC处理)中在解剖镜下用镊子去膜，并去掉卵黄；
5）分别吸取去膜及卵黄的不同发育阶段的胚胎于1.5ml离心管，用1×PBST(DEPC处理)洗涤3次，每次5min；洗涤处理后在经含25%（体积比）甲醇的1*PBST，含50%（体积比）甲醇的1×PBST，含75%（体积比）甲醇的1×PBST的梯度甲醇各处理5min，经梯度甲醇洗脱后再由100%的甲醇处理2次，每次5min，最后将完全脱水的胚胎置于100%的甲醇于-20℃保存（可长期保存）。
6）将上述经梯度洗脱的去膜及卵黄的不同发育阶段的胚胎经梯度甲醇复水处理，而后在分别经1×PBST洗涤3次，每次5min，洗脱后在60℃下预杂交1h。其中经各梯度甲醇复水处理各5min，梯度甲醇复水分别为含75%的甲醇的1×PBST，含50%甲醇的1×PBST，含25%甲醇的1×PBST。
7）用预杂交液稀释探针至1ng/μl，80℃下变性10min后每管胚胎中加入100μl含探针的杂交液（其中每管中30-50个胚胎），60℃杂交16h。
8)杂交后经含50%去离子甲酰胺的2×SSCT缓冲液，65℃，洗涤2次，每次30min；洗涤后由2×SSCT缓冲液，65℃，洗涤15min；洗涤后再由0.2×SSCT，65℃，洗涤2次，每次30min；最后经1×PBST缓冲液，室温，洗涤3次每次5min。
9)上述洗涤后各试管中加入2%（质量体积比g(洗涤液)/ml（封闭试剂））的封闭试剂，室温下封闭处理1h;其中封闭试剂为山羊血清)处理后各试管中加入抗体，室温下抗体孵育2h，其中抗体为Anti-Digoxigenin-AP，Fab fragments碱性磷酸酶偶联的抗地高辛抗体（所述抗体用2%封闭试剂进行稀释，具体为抗体：2%封闭试剂=1:1000），室温1-2h；
10)经抗体孵育后用1×PBST洗涤6次，每次10min；洗涤后再用NTMT（显色缓冲液）溶液平衡10min；
11)平衡处理后加入1×BCIP/NBT溶液（即底物显色溶液：用NTMT（显色缓冲液）将50×NBT/BCIP母液稀释成1×BCIP/NBT），12-24h避光显色；
12)终止显色：达到理想色度后，用1×PBST洗涤3次，每次5min，结束显色反应；最后经50%甘油，拍照（参见图1）。
由上述图1可知，胚胎样品经过4%多聚甲醛固定后，能够长期保存于含50%甲酰胺的1×PBST（DEPC处理）中，该方法取样方便，同时胚胎形态完整，便于后续原位杂交操作；本方法改良了传统胚胎原位杂交样品保存及实验方法，杂交显色后，样品形态完整，化学标记明显，能够准确的标记各个阶段的大菱鲆PGCs。

Claims (8)

1.一种大菱鲆胚胎发育期原始生殖细胞（PGCs）的定位标记方法，其特征在于：
1）采集大菱鲆各个阶段胚胎样品固定，固定后用50%甲酰胺于-20-40℃保存，待用；
2）将上述保存各个阶段胚胎样品去卵膜之后用不同浓度的1×PBST—甲醇洗脱液依次进行梯度脱水处理后于-20℃至-40℃保存；
3）将上述脱水处理后各个阶段胚胎样品采用梯度甲醇复水，再用1×PBST缓冲液洗涤，洗脱后于60-65℃预杂交1-2h；
4）预杂交后在含有大菱鲆RNA探针的杂交液中于60-65℃下杂交过夜；杂交后洗涤，抗体孵育显色，进而定位标记。
2.按权利要求1所述的大菱鲆胚胎发育期原始生殖细胞（PGCs）的定位标记方法，其特征在于：所述步骤1）将各个阶段胚胎分别用1×PBST(DEPC处理)多次洗涤，每次5-10min；洗涤后利用含4%（质量浓度）多聚甲醛的1×PBST(DEPC处理)溶液并于4-8℃固定16-24h；固定处理后于含50%甲酰胺的1×PBST(DEPC处理)溶液中-20至-40℃下可长期保存。
3.按权利要求1所述的大菱鲆胚胎发育期原始生殖细胞（PGCs）的定位标记方法，其特征在于：所述步骤2）将固定处理后的各个阶段的胚胎分别于1×PBST(DEPC处理)溶液中进行去掉卵黄；再将吸取去膜及卵黄各个阶段的胚胎用1×PBST(DEPC处理)多次洗涤，每次5-10min；洗涤后依次经25%甲醇的1×PBST缓冲液、50%甲醇的1×PBST缓冲液、75%甲醇的1×PBST缓冲液、100%甲醇进行梯度脱水，每个梯度5-10min，于100%甲醇溶液-20至-40℃下保存。
4.按权利要求1所述的大菱鲆胚胎发育期原始生殖细胞（PGCs）的定位标记方法，其特征在于：将步骤3）梯度脱水的各个阶段胚胎组分分别采用梯度甲醇复水洗涤，每个梯度洗涤5-10min；再以1×PBST缓冲液洗涤5-10min，洗脱后60-65℃预杂交1-2h。
5.按权利要求4所述的大菱鲆胚胎发育期原始生殖细胞（PGCs）的定位标记方法，其特征在于：所述梯度甲醇复水分别为含75%甲醇的1×PBST、含50%甲醇的1×PBST、含25%甲醇的1×PBST。
6.按权利要求1所述的大菱鲆胚胎发育期原始生殖细胞（PGCs）的定位标记方法，其特征在于：所述步骤4）用预杂交液稀释的探针于75-85℃变性10-15min，变性后加入至各个阶段预杂交后的胚胎样中在60-65℃杂交16-24h，杂交后经洗脱液进行洗涤，洗脱处理后用封闭试剂封闭处理1-2h，而后经抗体孵育再经显色处理，进而定位标记；
所述探针为，VF：5’-GCTGCTGACTTCCTCAAGACGG-3’；
VR：5’-TTTGCTTGGAACACATTTATTAGTC-3’。
7.按权利要求1或6所述的大菱鲆胚胎发育期原始生殖细胞（PGCs）的定位标记方法，其特征在于：所述杂交后经含50%去离子甲酰胺的2×SSCT缓冲液，于60-65℃下经多次洗涤，每次30min；洗涤后由2×SSCT缓冲液，于60-65℃下，洗涤15-30min；洗涤后再由0.2×SSCT，于60-65℃下多次洗涤，每次30min；最后经1×PBST缓冲液，室温下多次洗涤，每次5-10min。
8.按权利要求6所述的大菱鲆胚胎发育期原始生殖细胞（PGCs）的定位标记方法，其特征在于：所述经抗体孵育，孵育后用1×PBST多次洗涤，每次5-10min；洗涤之后加入1×NBT/BCIP（NTMT溶液稀释）避光显色处理，进而定位标记。
CN201310274379.0A 2013-07-02 2013-07-02 一种大菱鲆胚胎发育期原始生殖细胞（PGCs）的定位标记方法 Active CN104278078B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201310274379.0A CN104278078B (zh) 2013-07-02 2013-07-02 一种大菱鲆胚胎发育期原始生殖细胞（PGCs）的定位标记方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201310274379.0A CN104278078B (zh) 2013-07-02 2013-07-02 一种大菱鲆胚胎发育期原始生殖细胞（PGCs）的定位标记方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104278078A true CN104278078A (zh) 2015-01-14
CN104278078B CN104278078B (zh) 2016-04-13

Family

ID=52253420

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201310274379.0A Active CN104278078B (zh) 2013-07-02 2013-07-02 一种大菱鲆胚胎发育期原始生殖细胞（PGCs）的定位标记方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104278078B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104878102A (zh) * 2015-05-29 2015-09-02 中国科学院海洋研究所 一种牙鲆原始生殖细胞早期追踪、定位方法
CN108330195A (zh) * 2018-01-25 2018-07-27 浙江海洋大学 大菱鲆生精上皮不同发育时期生殖细胞及体细胞的标记方法及应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006012302A2 (en) * 2004-06-28 2006-02-02 Exagen Diagnostics, Inc. Methods for rna fluorescence in situ hybridization
CN101831433A (zh) * 2009-05-22 2010-09-15 山东省科学院生物研究所 斑马鱼p-选择素基因及其编码蛋白与应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006012302A2 (en) * 2004-06-28 2006-02-02 Exagen Diagnostics, Inc. Methods for rna fluorescence in situ hybridization
CN101831433A (zh) * 2009-05-22 2010-09-15 山东省科学院生物研究所 斑马鱼p-选择素基因及其编码蛋白与应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
E.CABRITA ETAL: "ffect of different treatments on the chorion permeability to DMSO of turbot embryos(Scophthalmus maximus)", 《AQUACULTURE》, vol. 211, 1 May 2003 (2003-05-01), pages 593 - 604 *
V.ROBLES ETAL: "Studies on chorion hardening inhibition and dechorionization in turbot embryos", 《AQUACULTURE》, vol. 262, 8 February 2007 (2007-02-08), pages 535 - 540, XP005868587, DOI: doi:10.1016/j.aquaculture.2006.10.034 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104878102A (zh) * 2015-05-29 2015-09-02 中国科学院海洋研究所 一种牙鲆原始生殖细胞早期追踪、定位方法
CN108330195A (zh) * 2018-01-25 2018-07-27 浙江海洋大学 大菱鲆生精上皮不同发育时期生殖细胞及体细胞的标记方法及应用
CN108330195B (zh) * 2018-01-25 2021-06-25 浙江海洋大学 大菱鲆生精上皮不同发育时期生殖细胞及体细胞的标记方法及应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN104278078B (zh) 2016-04-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103630421B (zh) 一种芍药成熟种胚的石蜡切片制作方法
CN101650273B (zh) 一种海洋贝类卵细胞石蜡切片方法
CN107917832A (zh) 鱼类卵巢组织石蜡切片的制作方法
CN102787166B (zh) 一种梅花染色体的荧光原位杂交方法
CN102147337B (zh) 一种海洋贝类d形幼虫的石蜡切片方法
CN103525119B (zh) 一种软骨染色液、骨骼染色方法以及利用该方法制备胚胎骨骼标本的方法
CN104878102A (zh) 一种牙鲆原始生殖细胞早期追踪、定位方法
CN104278078B (zh) 一种大菱鲆胚胎发育期原始生殖细胞（PGCs）的定位标记方法
MX2014008839A (es) Anticongelante de yema de huevo de pato para la crioconservacion de semen de burro y el metodo de preparacion del mismo.
CN112014192A (zh) 一种用于黔北麻羊卵巢组织石蜡切片的he染色方法
CN111257089A (zh) 一种优化的蝴蝶兰不同花部组织石蜡切片的制作方法
Yu et al. Amphioxus whole-mount in situ hybridization
CN103305614B (zh) 一种紫薇属植物染色体的原位杂交方法
CN103004653B (zh) 一种三倍体石斑鱼的制备方法
CN104568556A (zh) 一种纤毛虫的染色方法
CN103868779A (zh) 甜菜胚珠切割透明制片方法
CN104977194A (zh) 一种添加石墨烯加速样本处理的方法
CN108332989A (zh) 一种高淀粉含量谷物籽粒剖析及内部结构观察的方法
CN103852368A (zh) 黄瓜花粉半薄切片mtg-dapi双染色观察线粒体dna
CN101825532A (zh) 一种鱼类胚胎染色体制片方法
CN103674662B (zh) 鱼类初期胚胎发育的dapi染色方法
CN105648065A (zh) 一种适于牙鲆性腺冰冻切片mRNA原位杂交的方法
CN103230397B (zh) 特非那定在制备斑马鱼心功能损伤模型中的应用
CN105594689A (zh) 香菇浸制标本制作与保存方法
CN105624304A (zh) 一种牙鲆幼鱼性腺mRNA原位杂交的方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant