MX2014008839A - Anticongelante de yema de huevo de pato para la crioconservacion de semen de burro y el metodo de preparacion del mismo. - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona un anticongelante de yema de huevo de pato para la crioconservación de semen de burro y el método de preparación del mismo, cada 100ml de anticongelante contiene los siguientes ingredientes: Tris 3~4 g, glucosa 1~2.5 g, ácido cítrico 1.5~3.0 g, glicerol 5~10 ml, yema de huevo 10~30 ml, penicilina 45~55x104 UI, estreptomicina 4.5~5.5x104 UI, el resto es agua destilada. Se resuelven los problemas existentes de una larga fase de reproducción, baja proporción de concepción artificial y una complicada y difícil producción y funcionamiento del semen de burro congelado.

Description

Anticongelante de yema de huevo de pato para la crioconservación de semen de burro y el método de preparación del mismo CAMPO TÉCNICO La presente invención se refiere al campo técnico biológico, especialmente se refiere a un anticongelante de yema de huevo de pato para la crioconservación de semen de burro y el método de preparación del mismo TÉCNICA ANTERIOR La combinación de la crioconservación de semen y la tecnología de inseminación artificial juega un papel de enorme importancia en la producción moderna de ganado, y puede disminuir significativamente el número de sementales de reproducción, reducir el costo de producción, mejorar la utilización de sementales de reproducción excelentes, y traer enormes beneficios económicos para el ganado. En esta etapa, la reproducción del burro principalmente adopta el modo de apareamiento natural, y varios técnicos con experiencia en ganado algunas veces extraen el semen (semen fresco) sin diluir o a baja dilución (1 :2-4), y después inmediatamente entregan el semen a la yegua en celo. Esto es adecuado para el área con celo estacional evidente y gran cantidad de yeguas. Comparado con el apareamiento natural, su eficacia se mejora de 5-20 veces. Pero en el país, hay muchas crías de burro y la distribución de las áreas de reproducción es amplia, y las áreas de reproducción están principalmente en montañas o regiones inaccesibles, y el modelo de alimentación es principalmente el modelo de alimentación individual y la distribución de yeguas hembras no está concentrada, y el área de promoción de la técnica de inseminación artificial de semen fresco o semen poco diluido es relativamente pequeña. Adicionalmente, debido al tiempo sumamente corto para conservar in vitro el semen de burro fresco y que la vitalidad del semen casi se perdería después de pocas horas, esto hace que la técnica de inseminación artificial de semen de burro fresco estuviera sumamente restringida por el tiempo y el lugar. Por lo tanto, hay una necesidad urgente de semen de burro de alta calidad con un tiempo de conservación más largo y conveniente para realizar la producción de ganado con el fin de mejorar la reproducción de la población de burro de toda la sociedad.

Los métodos de conservación de semen se dividen en tres clases de métodos: conservación a temperatura normal (15°C~25 °C, conservación a temperatura baja (0 °C~5 °C) y crioconservación (— 79°C 196 °C). La investigación de la técnica de conservación a temperatura normal se desarrolla primero y está relativamente madura. Pero a la temperatura normal, un aspecto es que el rápido crecimiento de microorganismos puede afectar la calidad del semen, otro aspecto es que la motilidad de la esperma disminuye rápidamente cuando se guarda a temperatura normal. El funcionamiento de la técnica de conservación a temperatura baja es simple y relativamente conveniente para la crioconservación, y el costo es inferior. Pero la técnica de conservación a temperatura baja requiere agentes de protección de temperaturas bajas no-permeables y diluyentes no sólo para proporcionar la nutrición sino además para proteger la esperma. La crioconservación se refiere a colocar la esperma en nitrógeno líquido o hielo seco después del tratamiento especial, que permite guardar los recursos genéticos de la especie durante varios años o incluso décadas, y desarrolla la viabilidad de los recursos genéticos del ganado macho de raza. Ya que las características biológicas de diferentes espermas de ganado macho son diferentes los efectos de la crioconservación son muy diferentes. Por ejemplo, la técnica de crioconservación está comparativamente madura, especialmente el procedimiento de producción del método del tubo delgado de esperma de ganado ya se ha popularizado; pero para la esperma de ovejas congelada popularmente existen problemas de inestabilidad de la tasa de concepción, tasa de concepción baja y tasa de repetición baja, etc. Aunque la crioconservación de la esperma de cerdo está aún en fase experimental debido al problema de que el contenido de grasa de la esperma de cerdo es alto, la deshidratación es difícil, la ultra-microestructura de la esperma se daña (por ejemplo, el burbujeo, daña y rompe la membrana de la esperma, el acrosoma y el núcleo de la esperma) después de congelación-descongelación, la vida de la esperma se acorta y la tasa de concepción es baja en el tracto reproductivo de la hembra. Ahora, la investigación con relación acerca de la crioconservación de la esperma de burro es menor en el área doméstica y en el extranjero, los motivos son fundamentalmente: en un aspecto, la velocidad de reproducción del burro es baja y la fase de gestación es larga; en segundo lugar, debido a la diferencia significativa de la calidad de la esperma de diferentes burros individuales, y la esperma del burro es particularmente sensible al ataque de bajas temperaturas y es sumamente fácil de dañar en el procedimiento de congelación-descongelación, por lo tanto, la tasa de concepción se reduce tremendamente después de que el semen se refrigera y se congela; en tercer lugar, debido a que el tiempo en celo del burro es largo, y el momento de la inseminación artificial es difícil de aprovechar con exactitud, lo que conduce a su baja tasa de concepción; por último, la cantidad de eyaculación del burro macho es hasta 70ml, su densidad es relativamente infrecuente, y los electrólitos en el semen pueden promover la senescencia de la esperma. Por lo tanto, la operación de producción de esperma de burro congelada es complicada y difícil, lo que limita la aplicación del semen congelado.

El burro es un animal equino, y se encuentra extensamente distribuido alrededor de Asia, África y América Latina. El burro de Dezhou en China, grande y fuerte, bien proporcionado físicamente, muy famoso en China y países extranjeros, es una variedad de burro de tipo pequeño mejorado y una variedad ideal para la hibridación de variedades cruzadas. Así, en la práctica hay una urgente necesidad de investigación de la crioconservación del semen de burro Dezhou.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona un anticongelante de yema de huevo de pato para la crioconservación de semen de burro, lo que resuelve los problemas existentes de fase de reproducción larga, baja proporción de concepción artificial y la complicada y difícil producción y funcionamiento del semen de burro congelado.

La solución técnica de la presente invención se realiza de la siguiente manera: Un anticongelante de yema de huevo de pato para la crioconservación de semen de burro, que contiene los siguientes ingredientes en cada 100ml de anticongelante: Tris 3~4 g, glucosa 1 ~2.5 g, ácido cítrico 1.5~3.0 g, glicerol 5~10 mi, yema de huevo 10~30 mi, penicilina 45~55*104 Ul, estreptomicina 4.5~5.5*104 Ul, el resto es agua destilada.

Como solución técnica referida, un anticongelante de yema de huevo de pato para la crioconservación de semen de burro, que contiene los siguientes ingredientes en cada 100ml de anticongelante: Tris 3.5 g, glucosa 1.5 g, ácido cítrico 2.0 g, glicerol 7 mi, yema de huevo 20 mi, penicilina 50* 104 Ul, estreptomicina 5*104 Ul, el resto es agua destilada.

La presente invención proporciona además un método para la preparación de un anticongelante de yema de huevo de pato para la crioconservación de semen de burro, que contiene las siguientes etapas: 1) pesar los ingredientes de acuerdo con la proporción de Tris 3—4 g, glucosa 1—2.5 g, ácido cítrico 1 .5—3.0 g, glicerol 5—10 mi, yema de huevo 10—30 mi, penicilina 45~55*104 Ul, estreptomicina 4.5— 5.5><104 Ul, el resto de agua destilada en cada 100ml de anticongelante, y después listo para usar; 2) preparar la solución básica de Tris, glucosa y ácido cítrico pesados con el agua destilada; 3) añadir a la resolución básica preparada, mencionada anteriormente, penicilina sódica y sulfato de estreptomicina pesados en la etapa 1 ) para preparar la solución I; 4) ajustar el valor de pH de dicha solución I a 7.1—7.8, filtrar para esterilizar, después poner en refrigeración a 3— 5°C, preparado para usar; 5) obtener dicha solución I antes de usar, añadir la yema de huevo de pato pesada en la etapa 1 ) para preparar la solución I, y después obtener dicho anticongelante de yema de huevo de pato para la crioconservación de semen de burro.

Como solución técnica preferida, pesar los ingredientes de acuerdo con la proporción de Tris 3—4 g, glucosa 1—2.5 g, ácido cítrico 1 .5—3.0 g, glicerol 5—10 mi, yema de huevo 10—30 mi, penicilina 45— 55x104 Ul, estreptomicina 4.5— 5.5x104 Ul, el resto de agua destilada en cada 100mi de anticongelante, y después listo para usar.

A causa de la adopción de la resolución técnica mencionada anteriormente, un anticongelante de yema de huevo de pato para la crioconservación de semen de burro y el método de preparación del mismo, cada 100ml de anticongelante contiene los siguientes ingredientes: Tris 3—4 g, glucosa 1—2.5 g, ácido cítrico 1 .5—3.0 g, glicerol 5~ 10 mi, yema de huevo 10~30 mi, penicilina 45~55x104 Ul, estreptomicina 4.5~5.5?104 Ul, el resto es agua destilada. Se resuelven los problemas existentes de fase de reproducción larga y baja proporción de concepción artificial y la complicada y difícil producción y funcionamiento del semen de burro congelado.

Experimentos detallados: Obtención de la yema de huevo El huevo de pato debe provenir de áreas de crianza de patos sin epidemias, y los huevos de pato usados deben ser frescos, integrales, limpios, por medio del uso de un algodón con alcohol 75% para esterilizar la superficie de la cáscara del huevo antes de obtener la yema de huevo, y después tomar la yema de huevo integral mediante el separador de claras de huevo hasta la volatilización de alcohol; además se puede golpear para hacer una grieta en la línea de la cintura del huevo de pato, separar la yema de huevo de pato en el medio, eliminar la clara del huevo, dejar la yema de huevo por medio del uso del método de alternancia entre las dos cáscaras de huevo; después penetrar la membrana de la yema de huevo y extraer la yema con jeringa estéril.

Método de preparación del anticongelante para el semen de burro congelado Pesar con precisión Tris 3.5g, glucosa 2g, ácido cítrico 2.0g con balanza analítica electrónica, disolviéndolos en 50ml de agua destilada, se agita bien distribuida con aparato de agitación magnética, y después preparar 100ml de solución básica. Añadir 5x104 Ul penicilina sódica, sulfato de estreptomicina para preparar la solución I; ajustar el valor de pH a 7.3 con medidor de pH preciso, y después filtración esterilizada con filtro de membrana de 0.22pm, y poner en refrigeración a 4°C, preparado para usar. Antes de congelar el semen de burro, tomar 360ml de la solución I y añadir 80ml de yema de huevo, sellar con membrana de sellado, y después b°ca abajo mezclar uniformemente, poner en refrigeración a 4°C durante la n°che, para estratificación. El segundo día, absorber las impurezas de la superficie, la capa media del anticongelante se vierte en un matraz, desechar la capa inferior de sedimentos. El diluyente se centrifuga tres veces a 4000rpm/min, 30min para cada vez, eliminar las impurezas de la superficie y el sedimento del fondo del diluyente centrifugado, poner la capa media en la botella de solución salina o botella de b°ca azul, y después añadir 20ml de glicerol, después de agitar totalmente con aparato de agitación magnética, para hacer la solución II, ponerlo en refrigeración a 4°C, preparado para usar. La solución I se puede almacenar en refrigeración a 4°C durante aproximadamente 10 días después de la preparación. La solución II se elabora cuando se necesita usar, y se puede almacenar en refrigeración a 4 °C durante no más de 24 hrs.

Ejemplo de experimento de demostración de crioconservación de semen de burro Dezhou (1) Preparación de anticongelante Pesar con precisión Tris 3.36g, glucosa 1.53g, ácido cítrico 1.88g en balanza analítica electrónica, disolviéndolos en 50ml de agua destilada, se agita bien distribuida con aparato de agitación magnética, y después preparar 00ml. Añadir solución básica con 5x104 Ul de penicilina sód¡ca> sulfato de estreptomicina para preparar la solución I; ajustar el valor de 7.5 con medidor de pH preciso, y después filtración esterilizada con filtro de membrana de 0.22µ?t?, y poner en refrigeración a 4°C, preparado para usar. Antes de congelar el semen de burro, tomar 360ml de la solución I y añadir 80ml de yema de huevo, sellar con membrana de sellado, y después b°ca abajo mezclar uniformemente, poner en refrigeración a 4°C durante la noche, para estratificación. El segundo día, absorber las impurezas de la superficie, la capa media del anticongelante se vierte en un matraz, desechar la capa inferior de sedimentos. El diluyente se centrifuga tres veces a 4000rpm/min, 30min para cada vez, eliminar las impurezas de la superficie y el sedimento del fondo del diluyente centrifugado, poner la capa media en la botella de solución salina o botella de boca azul, y después añadir 25.4ml de glicerol, después de agitar totalmente con aparato de agitación magnética, para hacer la solución II, ponerlo en refrigeración a 4°C, preparado para usar. La solución I se puede almacenar en refrigeración a 4°C durante aproximadamente 10 días después de la preparación. La solución II se elabora cuando se necesita usar, y se puede almacenar en refrigeración a 4 °C durante no más de 24 hrs. (2) Recolección de semen Recolección de semen de burro macho con el método de la vagina falsa, y después de filtrado con 8 capas de gasa estéril, el semen recogido se detecta mediante microscopio de contraste de fase con dispositivo de temperatura constante 38°C para evaluar la motilidad de la esperma, y después la densidad de la esperma se mide por metros densidad de esperma. El semen recolectado es blanco como la leche o blanco grisáceo, sin olor anormal, la forma de la esperma es normal, la densidad es normal y por encima de 100millones/ml, y la esperma con motilidad mayor que 0.7 se puede usar para hacer los tubos delgados de semen congelado. (3) Congelación de semen Añadir rápidamente el semen diluido con la solución II que contiene glicerol en el tubo delgado de 0.5ml, después de sellado, poner el tubo en refrigeración a 4°C o termostato y después equilibrarlo durante 3-4hrs.

Después de equilibrar, poner los tubos delgados en el anaquel congelado en alineación. La dirección de disposición de los tubos debe tenerse en cuenta cuando se disponen los tubos, poner la parte de sellado del tampón próxima al operador. Hay un marcador similar al tubo delgado que se coloca en cada anaquel, y cada burro usa una clase de marcador con el fin de que se reconozca convenientemente . Los tubos delgados de semen se deben colocar por separado cuando hay tubos delgados de semen de diferentes burros en el mismo anaquel, y dos clases de tubos delgados de semen de burro deben estar separadas por una cierta distancia con el fin de evitar la confusión. Mover los tubos delgados ordenados en el dispositivo de congelación después de que la temperatura del dispositivo de congelación es de aproximadamente 4°C, y después acabar el procedimiento de congelación de forma automática de acuerdo a la curva de temperatura de congelación predefinida. (4) Descongelación del semen congelado en los tubos delgados e identificación de la tasa de motilidad después de congelados Calentar previamente el agua en el baño de agua termostatado a 38°C, tomar un pedazo del tubo delgado supercongelado del nitrógeno líquido rápidamente con abrazaderas y después ponerlo en el baño de agua a 38°C con agitación durante aproximadamente 30s, sacarlo inmediatamente cuando se disuelva completamente, limpiar las gotas de agua con una gasa, y después cortar el extremo sellado ultrasónico con tijeras de tubo, y después cortar el extremo del tampón, colocar todo el semen del tubo delgado en un tubo de ensayo pequeño, agitar uniformemente. Tomar una gota y ponerla en el portaobjeto de vidrio, y cubrirla con el cubreobjeto, y detectar en el microscopio de contraste de fase con dispositivo termostático a 38°C, y después evaluar el estándar de calidad del semen. (5) Identificación de la calidad del semen congelado 1. Detección de la integridad del acrosoma del semen. Después de teñir mediante lectinas de cacahuete marcadas con FITC, se detecta la integridad del acrosoma del semen después de la congelación-descongelación mediante el microscopio de fluorescencia. Se obtienen 30ul de semen descongelado en el tubo delgado y después se hace un frotis, y después se seca de forma natural. Se remoja la lámina seca de forma natural en el alcohol metílico a 20-22°C durante 10min, se fija. Y después se deja caer el líquido de teñir que contiene 100 mg/ml de lectinas de cacahuate marcadas con FITC sobre la lámina, se col°can en la caja oscura y húmeda a 37°C para teñir durante 30min. Después, se lava con PBS, y después de secar la lámina, añadir el extintor antifluorescencia, cubrir con los cubreobjetos, sellar con aceite de uña incoloro, y detectar la condición del acrosoma del semen bajo el microscopio de fluorescencia. 2. La integridad del ADN de semen. Se detecta la integridad del ADN del semen teñido con naranja de acridina (AO), después de congelación-descongelación mediante el microscopio de fluorescencia. Diluir el semen descongelado a una concentración adecuada con amortiguador TNE, después, tomar 200µ? de semen diluido e inmediatamente después añadir 400µ? de detergente. Después de 30s, añadir 1.2 mi de la materia colorante AO para teñir. Después de teñido, tomar 15µ? de semen, después dejar caer sobre la lámina, cubrir con los cubreobjetos, observar bajo el microscopio de fluorescencia. Y después juzgar el ADN del semen integral o degradado de acuerdo al color de la cabeza del semen. 3. La detección de la actividad de las mitocondrias de semen. La actividad de las mitocondrias de semen se detecta después de teñido con rodamina123 R123) y yoduro de propidio (Pl), mediante el microscopio de fluorescencia. Diluir el semen descongelado a una concentración adecuada con PBS, tomar 1ml de semen diluido, añadir en un tubo de centrífuga de 1.5 mi, después añadir en el tubo con 3µ? de rodamina 123. Poner el tubo de centrífuga en la caja oscura y húmeda a 37°C durante 20min, después añadir 10µ? de yoduro de propidio, poner en la caja oscura y húmeda a 37°C para incubar 10min. Después, el semen se centrifuga a 600*g durante 6min. Después de centrifugado, el sobrenadante se elimina, el coágulo de semen en la capa inferior se resuspende en 1 mi de PBS. Tomar 10µ? de semen resuspendido, dejar caer sobre la lámina, añadir el extintor anti-fluorescencia. Colocar la lámina bajo el microscopio de fluorescencia y observar. Juzgar la actividad de las mitocondrias del semen según el color que muestra la esperma. 4. Detección de la integridad de la membrana plasmática de la esperma. Detectar la integridad de la membrana plasmática de la esperma a través de la prueba del hinchamiento por presión osmótica inferior (HOST). Tomar 50ul de semen descongelado, añadir 1 mi de la solución de presión osmótica inferior. Después de mezclar uniformemente, incubar durante 60min a 37°C, después, tomar 15ul de la muestra de semen y después dejar caer sobre la lámina, cubrir con los cubreobjetos, juzgar la integridad de la membrana plasmática de la esperma de acuerdo a si la cola de la esperma está rizada o no. (6) Experimento de inseminación artificial Introducir artificialmente el semen congelado preparado como se mencionó anteriormente en el cuerpo de la yegua en celo después de que el semen congelado se descongela, la tasa de concepción de hibridación es de 54.8%, lograr el efecto de hibridación del semen fresco. (7) Resultado de la evaluación.

Por medio del uso del anticongelante de la presente invención y el método de congelación-descongelación del semen, el resultado de la evaluación es el siguiente: La tasa de motilidad de la esperma congelada-descongelada alcanza más de 40%; La tasa de integridad del acrosoma de la esperma alcanza más de 84%; La cantidad de esperma eficaz no es menor que 30 millones; La esperma con mitocondria eficaz alcanza más que 13%; La tasa de integridad plasmática de la esperma alcanza más que 38%.

Descripción de las Figuras Con el fin de ilustrar las modalidades de la presente invención o las soluciones técnicas de la tecnología existente con mayor claridad, las siguientes figuras usadas en las modalidades o la descripción de la tecnología existente se explican simplemente. Obviamente, las siguientes figuras son sólo algunos ejemplos de la presente invención, para aquellas personas con experiencia ordinaria en la materia, pueden obtener otras figuras de acuerdo con estas figuras sin trabajo creativo.

La Figura 1 es el diagrama esquemático del proceso tecnológico del método de preparación de la presente invención.

Modalidades detalladas La solución técnica de las modalidades de la presente invención se describirá con claridad e integralmente junto con las figuras acompañantes de las modalidades de la presente invención, obviamente, las modalidades descritas son simplemente parte de las modalidades de la presente invención, no todas las modalidades. Basados en las modalidades de la presente invención, todas las otras modalidades obtenidas por las personas con experiencia ordinaria en la materia sin esfuerzo creativo están dentro del alcance de protección de la presente invención.

Como se muestra en la Figura 1 , un anticongelante de yema de huevo de pato para la crioconservación de semen de burro, que contiene los siguientes ingredientes en cada 100ml de anticongelante: Tris 3~4 g, glucosa 1 ~2.5 g, ácido cítrico 1.5~3.0 g, glicerol 5~ 10 mi, yema de huevo 10~30 mi, penicilina 45~55x104 Ul, estreptomicina 4.5~5.5*104 Ul, el resto es agua destilada.

Un anticongelante de yema de huevo de pato para la crioconservación de semen de burro, que contiene los siguientes ingredientes en cada 100ml de anticongelante: Tris 3.5 g, glucosa 1.5 g, ácido cítrico 2.0 g, glicerol 7 mi, yema de huevo 20 mi, penicilina 50x104 IU, estreptomicina 5^104 IU, el resto es agua destilada.

Un método de preparación de un anticongelante de yema de huevo de pato para la crioconservación de semen de burro, que contiene las siguientes etapas: 1) pesar los ingredientes de acuerdo con la proporción de Tris 3—4 g, glucosa 1 ~2.5 g, ácido cítrico 1.5~3.0 g, glicerol 5~ 10 mi, yema de huevo 10~30 mi, penicilina 45~55x104 Ul, estreptomicina 4.5~5.5*104 Ul, el resto de agua destilada en cada 100ml de anticongelante, y después listo para usar; 2) preparar la solución básica de Tris, glucosa y ácido cítrico pesados con el agua destilada; 3) añadir a la resolución básica preparada, mencionada anteriormente, penicilina sódica y sulfato de estreptomicina pesados en la etapa 1 ) para preparar la solución I; 4) ajustar el valor de pH de dicha solución I a 7.1—7.8, filtrar para esterilizar, después poner en refrigeración a 3~5°C, preparado para usar; 5) obtener dicha solución I antes de usar, añadir la yema de huevo pesada en la etapa 1 ) para preparar la solución I, y después obtener dicho anticongelante de yema de huevo de pato para la crioconservación de semen de burro.

Pesarlos ingredientes de acuerdo con la proporción de Tris 3~4 g, glucosa 1 ~2.5 g, ácido cítrico 1.5—3.0 g, glicerol 5~ 10 mi, yema de huevo 10~30 mi, penicilina 45~55*104 Ul, estreptomicina 4.5~5.5*1Q4 Ul, el resto de agua destilada en cada 100ml de anticongelante, y después listo para usar.

Ejemplo 1 1) Pesar los ingredientes de acuerdo con la proporción de Tris 3 g, glucosa 1.5 g, ácido cítrico 1.5 g, glicerol 5 mi, yema de huevo 10 mi, penicilina 45x104 IU, estreptomicina 4.5x104 IU, el resto de agua destilada en cada 100ml de anticongelante, y después listo para usar; 2) preparar la solución básica de Tris, glucosa y ácido cítrico pesados con el agua destilada; 3) añadir a la resolución básica preparada, mencionada anteriormente, penicilina sódica y sulfato de estreptomicina pesados en la etapa 1) para preparar la solución I; 4) ajustar el valor de pH de dicha solución I a 7.1 , filtrar para esterilizar, después poner en refrigeración a 3°C, preparado para usar; 5) obtener dicha solución I antes de usar, añadir la yema de huevo pesada en la etapa 1 ) para preparar la solución I, y después obtener dicho anticongelante de yema de huevo de pato para la crioconservación de semen de burro.

Ejemplo 2 1 ) Pesar los ingredientes de acuerdo con la proporción de Tris 3.5 g, glucosa 1.5 g, ácido cítrico 2.0 g, glicerol 7 mi, yema de huevo 20 mi, penicilina 50x104 Ul, estreptomicina 5x104 Ul, el resto de agua destilada en cada 100ml de anticongelante, y después listo para usar; 2) preparar la solución básica de Tris, glucosa y ácido cítrico pesados con el agua destilada; 3) añadir a la resolución básica preparada, mencionada anteriormente, penicilina sódica y sulfato de estreptomicina pesados en la etapa 1) para preparar la solución I; 4) ajustar el valor de pH de dicha solución I a 7.5, filtrar para esterilizar, después poner en refrigeración a 4°C, preparado para usar; 5) obtener dicha solución I antes de usar, añadir la yema de huevo pesada en la etapa 1 ) para preparar la solución I, y después obtener dicho anticongelante de yema de huevo de pato para la crioconservación de semen de burro.

EJEMPLO 3 1) Pesar los ingredientes de acuerdo con la proporción de Tris 4 g, glucosa 2.5 g, ácido cítrico 3.0 g, glicerol 10 mi, yema de huevo 30 mi, penicilina 55*104 Ul, estreptomicina 5.5*104 Ul, el resto de agua destilada en cada 100ml de anticongelante, y después listo para usar; 2) preparar la solución básica de Tris, glucosa y ácido cítrico pesados con el agua destilada; 3) añadir a la resolución básica preparada, mencionada anteriormente, penicilina sódica y sulfato de estreptomicina pesados en la etapa 1) para preparar la solución I; 4) ajustar el valor de pH de dicha solución I a 7.8, filtrar para esterilizar, después poner en refrigeración a 5°C, preparado para usar; 5) obtener dicha solución I antes de usar, añadir la yema de huevo pesada en la etapa 1) para preparar la solución I, y después obtener dicho anticongelante de yema de huevo de pato para la crioconservación de semen de burro.

Los mencionados anteriormente son simplemente los ejemplos preferidos, no para limitar la presente invención. Cualquiera de los cambios, sustituciones, modificaciones, etc., realizadas caen dentro del espíritu y los principios de la presente invención y se deben incluir en el alcance de protección de la presente invención.

Claims (4)

REIVINDICACIONES

1. Un anticongelante de yema de huevo de pato para la crioconservación de semen de burro, caracterizado porque, contiene los siguientes ingredientes por cada 100ml de anticongelante: Tris 3~4 g, glucosa 1 ~2.5 g, ácido cítrico 1.5~3.0 g, glicerol 5~10 mi, yema de huevo 10~30 mi, penicilina 45~55*104 Ul, estreptomicina 4.5~5.5*104 Ul, el resto es agua destilada.

2. Un anticongelante de yema de huevo de pato para la crioconservación de semen de burro de la reivindicación 1 , caracterizado porque contiene los siguientes ingredientes por cada 100ml de anticongelante: Tris 3.5 g, glucosa 1.5 g, ácido cítrico 2.0 g, glicerol 7 mi, yema de huevo 20 mi, penicilina 50x104 Ul, estreptomicina 5x104 Ul, el resto es agua destilada.

3. Un método para la preparación de un anticongelante de yema de huevo de pato para la crioconservación de semen de burro de la reivindicación 1 , caracterizado además porque, contiene las siguientes etapas: 1) pesar los ingredientes de acuerdo con la proporción de Tris 3~4 g, glucosa 1 ~2.5 g, ácido cítrico 1.5~3.0 g, glicerol 5~10 mi, yema de huevo 10~30 mi, penicilina 45~55*104 Ul, estreptomicina 4.5^5.5x104 Ul, el resto de agua destilada en cada 100ml de anticongelante, y después listo para usar; 2) preparar la solución básica de Tris, glucosa y ácido cítrico pesados con el agua destilada; 3) añadir a la resolución básica preparada, mencionada anteriormente, penicilina sódica y sulfato de estreptomicina pesados en la etapa 1) para preparar la solución I; 4) ajustar el valor de pH de dicha solución I a 7.1 ~7.8, filtrar para esterilizar, después poner en refrigeración a 3~5°C, y listo para usar; 5) obtener dicha solución I antes de usar, añadir la yema de huevo pesada en la etapa 1) para preparar la solución I , y después obtener dicho anticongelante de yema de huevo de pato para la crioconservación de semen de burro.

4. Un método de preparación de un anticongelante de yema de huevo de pato para la crioconservación de semen de burro de la reivindicación 3, caracterizado porque, se pesan los ingredientes de acuerdo con la proporción de Tris 3—4 g, glucosa 1~2.5 g, ácido cítrico 1.5~3.0 g, glicerol 5~10 mi, yema de huevo 10~30 mi, penicilina 45~55*104 Ul, estreptomicina 4.5~5.5*104 Ul, el resto de agua destilada en cada 100ml de anticongelante, y después listo para usar.