CN103039434A - 一种用于驴精液冷冻保存的鸭蛋卵黄抗冻剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提出了一种用于驴精液冷冻保存的鸭蛋卵黄抗冻剂及其制备方法，每100mL抗冻剂中包括下列组分：Tris 3～4g、葡萄糖1～2.5g、柠檬酸1.5～3.0g、甘油5～10mL、卵黄10～30mL、青霉素45～55万IU、链霉素4.5～5.5万IU、余量为蒸馏水，解决了现有技术中母畜繁殖周期长、人工授精受胎率低，驴的冷冻精液生产操作程度复杂，难度大的问题。

Description

一种用于驴精液冷冻保存的鸭蛋卵黄抗冻剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是指一种用于驴精液冷冻保存的鸭蛋卵黄抗冻剂及其制备方法。

背景技术

精液冷冻保存与人工授精技术相结合，在现代畜牧业生产中发挥着巨大的作用，能大量减少公畜的饲养数量，降低生产成本，提高优秀种公畜的利用率，为畜牧业带来巨大的经济效益。现阶段，驴繁殖主要采用本交方式，个别技术好的畜牧改良员有时也将采出的精液（鲜精）不稀释或低倍稀释（1∶2～4），立即给发情母驴输精，它适用于母驴季节性发情较明显，而且数量较多的地区。与本交相比，效率可提高5－20倍。但由于我国驴品种较多，养殖区分布较广，多在山区或交通不便区域，且饲养方式多以散户居多，母驴分布不集中，鲜精或低倍稀释的精液人工授精技术推广面积较少。此外，由于驴鲜精体外保存时间极短，几小时后活力近乎丧失，这使得驴的鲜精人工授精技术受到时间、地点的极大限制。因此，畜牧生产中迫切需要保存时间更长、携带更为方便的优质公驴精液来改良全社会的驴生产群体。

精液保存分为常温（15℃～25℃）保存、低温保存（0℃～5℃）和冷冻（－79℃～－196℃）保存三种方法。常温保存技术研究开展的最早，相对比较成熟，但在常温下，一方面微生物生长迅速会影响精液质量，另一方面常温保存时精子活力下降较快。低温保存技术相对冷冻保存而言操作简单方便，成本低，但低温保存技术需要既能提供营养又能保护精子的非渗透性低温保护剂及稀释液。冷冻保存是指将精液经过特殊处理后置于液氮或干冰中，可保存该物种种质资源数年甚至数十年，切实发挥良种公畜的遗传资源。但由于不同公畜精子的生物学特性不同，其冷冻保存效果也存在很大的差别。如牛精液的冷冻保存技术比较成熟，尤其牛精液细管法程序生产已经普及；但羊精子冻后普遍存在情期受胎率不稳定、受胎率低、重复率低等诸多问题；而猪的精子因含脂量较高，脱水比较困难，冷冻-解冻后精子存在超微结构受到损伤（如精子膜、顶体和精子核泡化、损伤或破裂）、在雌性生殖道内寿命缩短和受精率低等问题，因而猪精液冷冻保存还一直处于试验阶段。目前国内外关于驴精液冷冻保存的研究很少，主要原因是：一方面是驴的繁殖率低，妊娠期长；第二，由于不同的驴个体间其精液品质有明显的差异，且驴精子本身对低温打击特别敏感，在冷冻解冻过程中极易损伤，因而冷藏和冷冻后的精液极大地降低了受胎率；第三，由于驴发情时间长，人工授精的时机掌握不准确造成其妊娠率低；最后，公驴每次平均射精量多达70ml，密度较稀，且精清中的电解质成分会促进精子早衰。因而，驴的冷冻精液生产操作程度复杂，难度大，严重制约着冷冻精液的应用。

驴为马属动物，分布其广，遍及亚、非、拉各大洲。我国的德州驴，体格高大，结构匀称，中外驰名，是改良小型驴种及作为种间杂交的一个理想品种。因此生产中亟需进行德州驴精液的冷冻保存研究。

发明内容

本发明提出一种用于驴精液冷冻保存的鸭蛋卵黄抗冻剂，解决了现有技术中母畜繁殖周期长、人工授精受胎率低，驴的冷冻精液生产操作程度复杂，难度大的问题。

本发明的技术方案是这样实现的：

一种用于驴精液冷冻保存的鸭蛋卵黄抗冻剂，每100mL抗冻剂中包括下列组分：

Tris 3～4g、葡萄糖1～2.5g、柠檬酸1.5～3.0g、甘油5～10mL、卵黄10～30mL、青霉素45～55万IU、链霉素4.5～5.5万IU、余量为蒸馏水。

作为优选的技术方案，一种用于驴精液冷冻保存的鸭蛋卵黄抗冻剂，每100mL抗冻剂中包括下列组分：

Tris 3.5g、葡萄糖1.5g、柠檬酸2.0g、甘油7mL、卵黄20mL、青霉素50万IU、链霉素5万IU、余量为蒸馏水。

本发明提出又一种制备用于驴精液冷冻保存的鸭蛋卵黄抗冻剂的方法，包括步骤：

1）按照每100mL抗冻剂中包含Tris 3～4g、葡萄糖1～2.5g、柠檬酸1.5～3.0g、甘油5～10mL、卵黄10～30mL、青霉素45～55万IU、链霉素4.5～5.5万IU、余量为蒸馏水，称取各组分，备用；

2）将上述称取的Tris、葡萄糖、柠檬酸用蒸馏水配置成基础液；

3）向上述配置成的基础液中添加步骤1）中称取的青霉素钠和硫酸链霉素配置成Ⅰ液；

4）将所述Ⅰ液整pH为7.1～7.8，然后进行过滤灭菌，放入3～5℃冰箱中备用；

5）使用前取所述Ⅰ液，向其中加入步骤1）中称取的卵黄，配置成Ⅱ液，即得所述用于驴精液冷冻保存的鸭蛋卵黄抗冻剂。

作为优选的技术方案，按照每100mL抗冻剂中包含Tris 3～4g、葡萄糖1～2.5g、柠檬酸1.5～3.0g、甘油5～10mL、卵黄10～30mL、青霉素45～55万IU、链霉素4.5～5.5万IU、余量为蒸馏水，称取各组分，备用。

由于采用了上述技术方案，一种用于驴精液冷冻保存的鸭蛋卵黄抗冻剂及其制备方法，每100mL抗冻剂中包括下列组分：Tris 3～4g、葡萄糖1～2.5g、柠檬酸1.5～3.0g、甘油5～10mL、卵黄10～30mL、青霉素45～55万IU、链霉素4.5～5.5万IU、余量为蒸馏水，解决了现有技术中母畜繁殖周期长、人工授精受胎率低，驴的冷冻精液生产操作程度复杂，难度大的问题。

具体实验：

卵黄的取用

鸭蛋应来源于无疫病的鸭场，且所使用鸭蛋须新鲜、完整、干净，取用卵黄前先用75%酒精棉球对蛋壳表面进行消毒，待酒精挥发尽后用蛋清分离器取出完整的卵黄；也可在鸭蛋腰中线处敲开一裂纹，将鸭蛋一分两半，利用二个蛋壳交替倾倒的方法，除去蛋清，留下卵黄；然后用灭菌的注射器穿过卵黄膜抽取卵黄。

驴冷冻精液抗冻剂的制备方法

用电子分析天平准确称取Tris 3.5g、葡萄糖2g、柠檬酸2.0g将其溶解于50mL蒸馏水中，用磁力搅拌器搅拌均匀后，配置成100mL基础液。在基础液中添加5万IU的青霉素钠、硫酸链霉素，配置成Ⅰ液；用精密pH计调整pH为7.3，然后用0.22μm的滤膜进行过滤除菌，放入4℃冰箱中备用。在进行驴精液冷冻前，取360mL Ⅰ液加入80mL卵黄，用封口膜封好口后，上下颠倒混匀，于4℃冰箱中过夜，分层。第二天，吸去表层杂质，将抗冻剂中层倒入烧杯中，弃去下层沉淀。稀释液经4000rpm/min离心3次，每次30min，去除离心后的稀释液表层杂质及底层沉淀，取中层倒入盐水瓶或蓝口瓶中，加入20mL甘油，用磁力搅拌器充分搅拌均匀后，配置成Ⅱ液，置于4℃冰箱中待用。Ⅰ液配好后，可在4℃冰箱中存放约10天。Ⅱ液现用现配，在4℃冰箱中存放时间不宜超过24h。

实验例以德州驴精液冷冻保存进行说明。

（一）抗冻剂的配制

用电子分析天平准确称取Tris 3.36g、葡萄糖1.53g、柠檬酸1.88g，将其溶解于50mL蒸馏水中，用磁力搅拌器搅拌均匀后，配置成100mL基础液。在基础液中添加5万IU的青霉素钠、硫酸链霉素，配置成Ⅰ液；用精密pH计调整pH为7.5，然后用0.22μm的滤膜进行过滤除菌，放入4℃冰箱中备用。在进行驴精液冷冻前，取360mL Ⅰ液加入80mL卵黄，用封口膜封好口后，上下颠倒混匀，于4℃冰箱中过夜，分层。第二天，吸去表层杂质，将抗冻剂中层倒入烧杯中，弃去下层沉淀。稀释液经4000rpm/min离心3次，每次30min，去除离心后的稀释液表层杂质及底层沉淀，取中层倒入盐水瓶或蓝口瓶中，加入25.4mL甘油，用磁力搅拌器充分搅拌均匀后，配置成Ⅱ液，置于4℃冰箱中待用。Ⅰ液配好后，可在4℃冰箱中存放约10天。Ⅱ液现用现配，在4℃冰箱中存放时间不宜超过24h。

（二）精液的采集

利用假阴道法采集公驴精液，采集精液用8层无菌纱布过滤后，立即在配有38℃恒温装置的相差显微镜上镜检，评定精子活力，并用精子密度仪测量精子密度。所采集的精液为乳白色或灰白色，无异味，精子形态正常，密度正常，且在1亿/ml以上，活力在0.7以上的方可用于制作细管冷冻精液。

（三）精液冷冻

将用含有甘油的Ⅱ液稀释的精液快速装管（0.5ml）细管，封口完毕后在4℃冰箱或恒温箱中平衡3-4h。

平衡完毕后，将细管码放在冷冻架上，码放时应注意细管摆放方向，使棉塞封口段靠近操作者。每架上放上一根类似于细管的标记物，一头驴用一个标记物，便于识别。如同一架上有不同驴的细管精液，要分开码放，两头驴之间要隔开一些距离，以免混淆。待冷冻仪温度降到约4℃后，将码放好的细管移入冷冻仪中，按照预先设定好的冷冻温度曲线，自动完成冷冻过程。

（四）细管冻精的解冻及冻后活率鉴定

预先将恒温水浴锅中的水温加热至38℃，用镊子将一支超低温冷冻的细管从液氮中迅速取出后，投入38℃水浴中摇晃约30s，待完全溶解后立即取出，用纱布擦干水珠，再用细管剪先剪去超声波封口端，再剪去棉塞端，将细管内的精液全部置于一小试管内，摇匀，取一滴于载玻片上，并盖上盖玻片，在配有38℃恒温装置的相差显微镜上镜检，评定精液质量标准。

（五）冷冻精液品质鉴定

1.精子顶体完整性检测。采用FITC标记的花生凝集素染色后，用荧光显微镜检测冷冻-解冻后的精子顶体的完整性。取30μL解冻后的细管精液涂片，之后自然风干。自然干燥后的抹片在20-22℃的甲醇中浸泡10min，固定。然后在每个风干后的抹片上滴上含有100mg/mL的FITC标记的花生凝集素的染液，放置在37℃的暗湿盒中染色30min。之后，用PBS冲洗，风干抹片后，滴加抗荧光淬灭剂，盖上盖玻片，用无色指甲油封片后，在荧光显微镜下检查精子顶体的状况。

2.精子DNA完整性检测。利用吖啶橙（AO）染色后，用荧光显微镜检测冷冻-解冻后的精子DNA的完整性。用TNE缓冲液将解冻后的精液稀释至适宜浓度，之后，取200μL稀释后的精液立即加入400μL去垢剂。30s后，加入1.2mLAO染料染色。染色后，取15μL精液滴加到载玻片上，盖上盖玻片，在荧光显微镜下观察。根据精子头部颜色判定精子DNA是完整或是降解。

3.精子线粒体活性检测。利用罗丹明123（R123）与碘化丙啶（PI）染色后，用荧光显微镜检测冷冻-解冻后的精子线粒体活性。用PBS将解冻后的精液稀释至适宜浓度，取1mL稀释后的精液加入1.5mL离心管中，向其中加入3μL罗丹明123。将离心管放置在37℃的暗湿盒中20min，之后，加入10μL碘化丙啶，置于37℃的暗湿盒中孵育10min。之后，精液经600×g离心6min。离心后，去上清，用1mLPBS重悬下层精子团块。取10μL重悬后的精液滴在载玻片上，再滴加10μL抗荧光淬灭剂。将玻片置于荧光显微镜下观察。根据精子显示颜色，判断精子线粒体活性。

4.精子质膜完整性检测。利用低渗膨胀实验（HOST）检测精子质膜的完整性。取50μL解冻后的精液加入1mL的低渗溶液中。混匀后，置于37℃孵育60min，之后，取15μL精液样品滴加在载玻片上，加上盖玻片后，根据精子尾部是否卷曲，判断精子质膜是否完整。

（六）人工授精试验

将上述研制的冷冻精液解冻后人工输入发情母驴体内，配妊率为54.8%，达到了鲜精配种效果。

（七）评定结果

应用本发明的抗冻剂以及精液的冷冻-解冻方法，其评定结果如下：

1.冷冻-解冻后精子的活率达到40%以上；

2.精子的顶体完整率达到84%以上；

3.每剂细管中有效精子数不少于3000万个；

4.有活性线粒体的精子达到13%以上；

5.精子的质膜完整率达到38%以上。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明的制备方法的工艺流程示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

如图1所示，一种用于驴精液冷冻保存的鸭蛋卵黄抗冻剂，每100mL抗冻剂中包括下列组分：

Tris 3～4g、葡萄糖1～2.5g、柠檬酸1.5～3.0g、甘油5～10mL、卵黄10～30mL、青霉素45～55万IU、链霉素4.5～5.5万IU、余量为蒸馏水。

一种用于驴精液冷冻保存的鸭蛋卵黄抗冻剂，每100mL抗冻剂中包括下列组分：

Tris 3.5g、葡萄糖1.5g、柠檬酸2.0g、甘油7mL、卵黄20mL、青霉素50万IU、链霉素5万IU、余量为蒸馏水。

一种制备用于驴精液冷冻保存的鸭蛋卵黄抗冻剂的方法，包括步骤：

1）按照每100mL抗冻剂中包含Tris 3～4g、葡萄糖1～2.5g、柠檬酸1.5～3.0g、甘油5～10mL、卵黄10～30mL、青霉素45～55万IU、链霉素4.5～5.5万IU、余量为蒸馏水，称取各组分，备用；

2）将上述称取的Tris、葡萄糖、柠檬酸用蒸馏水配置成基础液；

3）向上述配置成的基础液中添加步骤1）中称取的青霉素钠和硫酸链霉素配置成Ⅰ液；

4）将所述Ⅰ液整pH为7.1～7.8，然后进行过滤灭菌，放入3～5℃冰箱中备用；

5）使用前取所述Ⅰ液，向其中加入步骤1）中称取的卵黄，配置成Ⅱ液，即得所述用于驴精液冷冻保存的鸭蛋卵黄抗冻剂。

按照每100mL抗冻剂中包含Tris 3～4g、葡萄糖1～2.5g、柠檬酸1.5～3.0g、甘油5～10mL、卵黄10～30mL、青霉素45～55万IU、链霉素4.5～5.5万IU、余量为蒸馏水，称取各组分，备用。

实施例一

1）按照每100mL抗冻剂中包含Tris 3g、葡萄糖1g、柠檬酸1.5g、甘油5mL、卵黄10mL、青霉素45万IU、链霉素4.5万IU、余量为蒸馏水，称取各组分，备用；

2）将上述称取的Tris、葡萄糖、柠檬酸用蒸馏水配置成基础液；

3）向上述配置成的基础液中添加步骤1）中称取的青霉素钠和硫酸链霉素配置成Ⅰ液；

4）将所述Ⅰ液整pH为7.1，然后进行过滤灭菌，放入3℃冰箱中备用；

5）使用前取所述Ⅰ液，向其中加入步骤1）中称取的卵黄，配置成Ⅱ液，即得所述用于驴精液冷冻保存的鸭蛋卵黄抗冻剂。

实施例二

1）按照每100mL抗冻剂中包含Tris 3.5g、葡萄糖1.5g、柠檬酸2.0g、甘油7mL、卵黄20mL、青霉素50万IU、链霉素5万IU、余量为蒸馏水，称取各组分，备用；

2）将上述称取的Tris、葡萄糖、柠檬酸用蒸馏水配置成基础液；

3）向上述配置成的基础液中添加步骤1）中称取的青霉素钠和硫酸链霉素配置成Ⅰ液；

4）将所述Ⅰ液整pH为7.5，然后进行过滤灭菌，放入4℃冰箱中备用；

5）使用前取所述Ⅰ液，向其中加入步骤1）中称取的卵黄，配置成Ⅱ液，即得所述用于驴精液冷冻保存的鸭蛋卵黄抗冻剂。

实施例三

1）按照每100mL抗冻剂中包含Tris 4g、葡萄糖2.5g、柠檬酸3.0g、甘油10mL、卵黄30mL、青霉素55万IU、链霉素5.5万IU、余量为蒸馏水，称取各组分，备用；

2）将上述称取的Tris、葡萄糖、柠檬酸用蒸馏水配置成基础液；

3）向上述配置成的基础液中添加步骤1）中称取的青霉素钠和硫酸链霉素配置成Ⅰ液；

4）将所述Ⅰ液整pH为7.8，然后进行过滤灭菌，放入5℃冰箱中备用；

5）使用前取所述Ⅰ液，向其中加入步骤1）中称取的卵黄，配置成Ⅱ液，即得所述用于驴精液冷冻保存的鸭蛋卵黄抗冻剂。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种用于驴精液冷冻保存的鸭蛋卵黄抗冻剂，其特征在于，每100mL抗冻剂中包括下列组分：

Tris 3～4g、葡萄糖1～2.5g、柠檬酸1.5～3.0g、甘油5～10mL、卵黄10～30mL、青霉素45～55万IU、链霉素4.5～5.5万IU、余量为蒸馏水。

2.如权利要求1所述的一种用于驴精液冷冻保存的鸭蛋卵黄抗冻剂，其特征在于，每100mL抗冻剂中包括下列组分：

Tris 3.5g、葡萄糖1.5g、柠檬酸2.0g、甘油7mL、卵黄20mL、青霉素50万IU、链霉素5万IU、余量为蒸馏水。

3.一种制备如权利要求1所述的用于驴精液冷冻保存的鸭蛋卵黄抗冻剂的方法，其特征在于，包括步骤：

1）按照每100mL抗冻剂中包含Tris 3～4g、葡萄糖1～2.5g、柠檬酸1.5～3.0g、甘油5～10mL、卵黄10～30mL、青霉素45～55万IU、链霉素4.5～5.5万IU、余量为蒸馏水，称取各组分，备用；

2）将上述称取的Tris、葡萄糖、柠檬酸用蒸馏水配置成基础液；

3）向上述配置成的基础液中添加步骤1）中称取的青霉素钠和硫酸链霉素配置成Ⅰ液；

4）将所述Ⅰ液整pH为7.1～7.8，然后进行过滤灭菌，放入3～5℃冰箱中备用；

5）使用前取所述Ⅰ液，向其中加入步骤1）中称取的卵黄，配置成Ⅱ液，即得所述用于驴精液冷冻保存的鸭蛋卵黄抗冻剂。

4.如权利要求3所述的一种制备用于驴精液冷冻保存的鸭蛋卵黄抗冻剂的方法，其特征在于：按照每100mL抗冻剂中包含Tris 3～4g、葡萄糖1～2.5g、柠檬酸1.5～3.0g、甘油5～10mL、卵黄10～30mL、青霉素45～55万IU、链霉素4.5～5.5万IU、余量为蒸馏水，称取各组分，备用。

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