CN100548313C - 细管高密度冷冻猪精液的方法及其产品 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种细管高密度冷冻保存猪精液的方法及其产品，属于动物繁殖技术领域。包括：鲜精的采集与检测、精液的预处理、精液的冷冻、冻精的解冻、解冻精子的评价程序。通过冷冻稀释液稀释并预处理猪精子后，用0.25mL细管高密度超低温冷冻保存。解冻后精子活力稳定在0.5以上，平均活力0.58，最高达0.68。采用该项技术对猪精液进行冷冻保存，冻精解冻后用于猪体外受精，获得54.3%的卵裂率和48.5%的桑椹胚发育率；与采用猪新鲜精液取得的体外受精结果无异。1支0.25mL细管所含精子量可以满足生产中1个输精剂量。对于猪种质资源的保护及在猪上推广应用冷冻精液，具有巨大的应用潜力和市场开发前景。

Description

细管高密度冷冻猪精液的方法及其产品

一、技术领域

本发明涉及一种细管高密度冷冻保存猪精液的方法及其产品，属于动物繁殖技术领域。

二、技术背景

猪精液超低温冷冻保存的技术难度较大，长期以来一直是制约其进入生产实用化阶段的主要因素。该技术的突破，不仅可以解决猪精液长期保存的问题，而且有助于推广应用猪的人工授精技术，有利于我国乃至世界猪种质资源的保护，使精液的应用不受时间、地域的限制，便于种质交流和运输，从而可大大提高优良种公猪的利用率；此外，公猪冷冻精液可以在后裔测定或疾病检测后再开始大量供应，为稳定的遗传进展和严格的生物安全提供保障。因此，该项技术具有巨大的应用潜力和市场开发前景。

加快畜禽良种化工程是发展现代畜牧业的一个重要环节，其中良种畜禽的生产与供给是良种化工程的核心内容。人工授精技术是家畜繁育生产中最有成效的一项常规技术，已被广泛应用于奶牛生产。在其他动物养殖生产实践中，也得到推广和应用。猪是我国肉类消费的重要来源，约占总消费肉类的70％～80％；我国的猪种资源也十分丰富。利用冷冻精液进行人工授精是一项具有广泛潜力的繁殖技术。在养猪生产中，可以有效提高种公猪的利用率，节省饲养公猪的费用；有利于品种布局，充分发挥优良瘦肉型公猪的作用，加快商品瘦肉型猪生产步伐，从公猪遗传品质方面可迅速加快品种改良。

目前，在国内外养猪生产中，存在的主要问题之一是猪冷冻精液技术水平较低、受胎率低，严重制约着猪种改良和种质资源保存。在牛上，用冻精进行人工授精已可达到鲜精输精或本交的效果，并在世界范围内得到广泛的应用。由于猪精子对冷休克特别敏感，与常规液态保存精液相比，解冻后精子复苏率低、异常精子多、受胎率低；不同种公猪的冻精解冻后的活力与受精能力也有明显的个体差异；冷冻保存剂量大。造成了猪精液冷冻保存研究相对滞后，依然缺少类似于牛精液冷冻那样的成熟方法。迄今为止，在猪的人工授精中，应用鲜精和常温液态保存精液估计仍占全世界猪人工授精比例的99％，虽然猪颗粒或大管冻精在1975年就有商业应用，但因受胎率普遍较低，使得冻精应用占不到1％的比例，且这个比例在许多年里并无大的变化。

由于普遍存在的猪冻精解冻后精子存活率低、活力不足、产生获能样变化缩短了存活时间，从而造成输精后的受精率低和产仔数少等问题，即使加大输精剂量也达不到理想的应用效果，严重限制了猪冻精的生产应用，迫切需要建立一种技术上先进、可靠，程序上稳定、实用的猪精液冷冻保存方法。

三、发明内容

技术问题：

本发明的目的是针对尚缺乏猪精液冷冻实用化方法的现实，提供一种细管高密度冷冻保存猪精液的方法及其产品。用0.25mL细管冷冻猪精液，采用低成本、高效率的冷冻稀释液，冷冻保存高密度猪精子，取得稳定的、高质量的冷冻结果。

技术方案：

细管高密度冷冻保存猪精液的方法，包括：

1)鲜精的采集与检测

采用手握法室温下收集猪富含精子段精液，于洁净的烧杯中经四层纱布过滤后检查各项指标：活力＞0.7，畸形率＜18％，质膜完整率＞70％的精液用于冷冻保存；

2)精液的预处理

(1)精液的预平衡：用常温保存液ZO液或S液，按体积比1∶1稀释精液，室温避光静置1小时；

表1.常温保存液配方g/100mL

(2)精液的离心：静置后，把精液分装到15mL离心管中，以2400×g离心3min，去除上清，用作后面的冷冻处理；

3)精液的冷冻

(1)冷冻稀释I液的配制：葡萄糖1.5g，乳糖3g，甘氨酸0.8g，卵黄24mL，加三蒸水至100mL，现配现用；

(2)冷冻稀释液II的配制：取配好的冷冻稀释I液，加入甘油，使甘油的质量比浓度为9％，置于普通冰箱冷藏室平衡；

(3)冷冻保存：向离心、去上清处理的精子中加入1～4mL冷冻稀释I液，混匀，使重新悬浮的精子密度达(1.5～6)×10⁹个/mL，置于5℃水浴中平衡1小时；同时把做好标识的0.25mL细管也于5℃平衡1小时获得等温细管；平衡结束后，稀释I液稀释过的精液中再加入冷冻稀释II液稀释，I液：II液体积比为2∶1，充分混匀，再在5℃平衡1小时，在平衡时间还剩15min时，从液氮罐舀出液氮放到泡沫塑料盒中，液氮面上3cm处有支架，加盖平衡；将精液抽入等温细管中，装管后，用聚乙烯醇粉末封口，封好的细管在5℃继续平衡15min；最后，把细管均匀铺放在泡沫盒中液氮面上3cm处支架上，加盖平衡10min后细管直接投入液氮冷冻。

冻精的解冻方法为：

从液氮中取出细管，迅速投入37℃水浴中，30秒钟后剪去细管两端封口，回收至2mL等温ZO液中，轻轻混匀，备用；

解冻后精子的保存液，在ZO液的基础上添加40％精浆和20％卵黄，放置室温保存2小时。所用精浆制备方法为：鲜精经800×g离心10min，取上清再经2400×g离心10min，收集上清经0.22μm滤器过滤或添加青霉素、链霉素各100IU/mL，4℃冰箱保存备用。

有益效果：

本成果针对目前尚缺乏猪精液冷冻实用化方法的现实，提供了一种优化的、实用化冷冻猪精液方法。其主要优点和有益效果如下：

1.具有稳定、高质量的冷冻结果：冻精解冻后精子活力稳定在0.5以上，最高达0.68；用该冻精进行猪体外受精，取得54.3％的卵裂率和48.5％的桑椹胚发育率，与使用鲜精取得的体外受精结果相当(53.6％的卵裂率和47.4％的桑椹胚发育率)；冷冻保存程序的重复性好。

2.生产实用性好：用0.25mL细管冷冻猪精液，采用低成本、高效率的冷冻稀释液，冷冻保存高密度(1×10⁹个/mL和4×10⁹个/mL)猪精子，使1支细管的冻精量满足1个输精剂量，方便冻精的生产应用。

3.具有配套的冻精解冻后保存液：猪冻精解冻后保存于添加40％精浆和20％卵黄的ZO液中，可于室温放置2小时仍保持原有的活力，4小时精子活力仍在0.4以上；极大地方便了生产中的输精操作。

4.质量评价指标更为科学：除了传统的活力检查外，采用体外受精实验和核的完整性评价冻精质量，客观地概括了受精能力和受精卵发育能力。

5.广阔的应用前景：该成果的推广应用可使猪精液的使用不受时间、地域的限制，便于交流和运输；可大大提高优良种公猪的利用率；公猪冷冻精液可以在后裔测定或疾病检测后再开始大量供应，为稳定的遗传进展和严格的生物安全提供保障。以此成果为依托，可加速其它精子技术(如性控精液、转基因精子)的发展。

四、附图说明

图1：猪精液冷冻所用0.25mL细管

图2：TG复合染色(1.有顶体反应活精子；2.有顶体反应死精子；3.无顶体反应活精子；4.无顶体反应死精子)

图3：用冻精生产的体外受精胚胎(1.2-细胞胚；2.4-～8-细胞胚；3.16-细胞胚；4.桑椹胚)

五、具体实施方式

猪细管高密度冻精的生产、评价实施方式如下：

1.猪精液采集与检查：

常规法采集猪精液，经四层纱布过滤后检查各项指标，活力＞0.7、畸形率＜18％、质膜完整率＞70％的精液用于冷冻保存。

2.精液的预处理

1)精液的预平衡：用常温保存液(ZO液或S液，表1)1∶1(v/v)稀释精液，室温(16～28℃)避光静置1小时。

表1.常温保存液配方(g/100mL)

2)精液的离心：静置后，把精液分装到15mL离心管中，以2400×g离心3min，去除上清，用作后面的冷冻处理。

3.精液的冷冻

1)冷冻稀释I液的配制：葡萄糖1.5g，乳糖3g，甘氨酸0.8g，卵黄24mL，加三蒸水至100mL，需现配现用。

2)冷冻稀释液II的配制：取配好的冷冻稀释I液，加入甘油，使甘油的浓度为9％，置于普通冰箱冷藏室(4～5℃)平衡。

3)冷冻保存：向离心、去上清处理的精子中加入1～4mL(用15mL离心管)冷冻稀释I液，混匀，使重新悬浮的精子密度达(1.5～6)×10⁹个/mL，置于5℃水浴中平衡1小时；同时把做好标识的0.25mL细管也于5℃平衡。1小时平衡结束后，加入半量冷冻稀释II液稀释(I液∶II液为2∶1，v/v)，充分混匀，再在5℃平衡1小时，此2次稀释后应使精子密度为(1～4)×10⁹个/mL。在平衡时间还剩15min时，从液氮罐舀出液氮放到合适深度的泡沫塑料盒中，液氮面上3cm处有支架，加盖平衡。将精液抽入等温细管中，装管后，有聚乙烯醇粉末封口。封好的细管在5℃继续平衡15min。最后，把细管均匀铺放在泡沫盒中液氮面上3cm处支架上，加盖平衡10min后直接投入液氮。

4.冻精的解冻

从液氮中取出细管，迅速投入37℃水浴中，30秒钟后剪去细管两端封口，回收至2mL等温ZO液中，轻轻混匀，备用。

猪冻精解冻后存活时间明显比鲜精短，极大地影响了精子的受精能力，过短的存活时间也会增加输精难度、降低受胎率。为此本技术改进了解冻后精子的保存液，在ZO液的基础上添加40％精浆(制备方法：鲜精经800×g离心10min，取上清再经2400×g离心10min，收集上清经0.22μm滤器过滤或添加青霉素、链霉素各100IU/mL，4℃冰箱保存备用)和20％卵黄，解冻后放置室温保存2小时，精子仍保持原有的活力；4小时精子活力保持在0.4以上。

5.精子质量评价

(一)评价方法及指标

鲜精或冻精解冻后，均进行活力、顶体完整性、质膜完整性、体外受精卵裂率和桑椹胚发育率以及核完整性等指标的鉴定，综合评价其质量。具体操作如下：

1)活力检测

把解冻后待检精子样本稀释到1×10⁷个/mL，取5μl精液滴在温热的载玻片上，迅速盖上盖玻片，放在相差显微镜下计数，至少计数200个精子，计算精子活力＝直线运动的精子数/计数总精子数。

2)顶体完整性

采用活率和顶体完整性复合染色，评价活精子的顶体状态。具体操作如下：

(1)主要溶液的配制

台盼兰液：用不含牛血清白蛋白(BSA)的等渗液配成1％浓度，37℃预热后使用，临用前配制。

Orth’s液：6.8％重铬钾液与甲醛液以4∶1的比例合混合而成，重铬酸钾液最迟要在用前1d配制，Orth’s液在用前配制。

(2)染色步骤

向待检精液中加入等量的1％台盼兰液，37℃水浴孵育15min；涂片于预热的玻片上，37℃风干，用水充分漂洗后于室温下备用。Orth’s液固定45min，水洗、风干后浸入80％酒精中数秒，再在室温下用姬姆萨液染色90min，充分水洗后风干、封片，镜检

(3)着色类型

有顶体反应活精子：核后帽部不着色或淡青色，顶体不着色或部分紫红色

有顶体反应死精子：核后帽部暗青色，顶体部不着色或部分暗红色

无顶体反应活精子：核后帽部不着色或淡青色，顶体部紫红色

无顶休反应死精子：核后帽部暗青色，顶体部暗紫红色

(4)检测

在1000×油镜下检查，每个标本计数100～200个精子头部。

3)质膜完整性

用低渗肿胀实验(HOST)测定精子样本的弯尾率，即为质膜完整率。把精子样本稀释为1×10⁶个/mL，取500μl加入1mL低渗液(0.73g二水柠檬酸钠和1.35g果糖，溶于100mL三蒸水，渗透压为150mOsm/kg)中，37℃水浴孵育60min。取5μl精液滴于预热载玻片上，加盖玻片后置于相差显微镜下计数，至少数100个精子。

4)体外受精卵裂率与胚胎发育率

将解冻精子经常规离心、洗涤后作体外获能处理，体外获能精子与体外成熟卵子共孵育6小时，取出假定受精卵放入NCSU-23培养液中，于38.5℃、5％CO₂气相和饱和湿度条件下培养，检查记录卵裂情况和胚胎发育情况，计算卵裂率和胚胎发育率。

NCSU-23的配制：分别称量NaCl 0.6354g，KCl 0.0356g，MgSO₄·7H₂O 0.0293g，CaCl₂ 0.0187g，K₂HPO₄ 0.0162g，NaHCO₃ 0.2106g，葡萄糖0.1000g，谷氨酰氨0.0146g，牛磺酸0.0876g，亚牛磺酸0.0546g，BSA(Fraction V)0.4000g，苯酚红0.0010g，溶解于三蒸水中，然后定容至100mL(pH7.2～7.4)，过滤除菌，4℃保存备用。

5)核完整性

采用精子染色质离散实验(SCD)，只有DNA完整的才会产生特征性晕环，含有DNA碎片的不产生晕环。具体步骤如下：

(1)细胞裂解液的配制

0.4M Tris-HCl，2M NaCl，1％ SDS，0.05M EDTA，pH7.5

(2)制片

磨砂载玻片：磨时以免在载玻片面上形成粗纹痕迹，在处理过程中凝胶脱落。也可以用96孔板裁成合适大小的薄板，用于铺胶。

制胶板：第1层凝胶，将上述磨好的载玻片，磨砂面向上，预热40℃左右；将预热45℃的100uL 0.65％正常熔点琼脂糖(NMA)的无Ca²⁺、Mg²⁺磷酸盐缓冲液(PBS)滴在载玻片上，迅速盖上1号盖玻片，再置于4℃下10min使NMA凝固。第2层凝胶，把精子浓度调至(5～10)×10⁶个/mL，在37℃和1％的低熔点琼脂糖(LMA)混合，使LMA最终浓度为0.7％。取50μl滴于第1层凝胶上，立即盖上第2个盖玻片，置4℃冰箱4min。

细胞裂解：把盖薄片轻轻拿去，室温下将凝胶水平浸入新配制的10mL细胞裂解液中25min，接着用去离子水洗涤5min，然后用70％、90％、100％的酒精脱水，各2min，最后染色。

(3)观察

用40×显微镜观察，每个载玻片至少计数500个精子。

(二)猪精液冷冻评价结果(表2)

采用0.25mL细管对猪精子进行高密度冷冻保存，解冻后精子活力稳定在0.5以上，平均活力0.58，最高达0.68。采用该项技术对猪精液进行冷冻保存，冻精解冻后用于猪体外受精，获得54.3％的卵裂率和48.5％的桑椹胚发育率；与采用猪新鲜精液取得的体外受精结果(53.6％的卵裂率和47.4％的桑椹胚发育率)无异。1支0.25mL细管所含精子量可以满足生产中1个输精剂量。

表2.猪精液冷冻所获各项参数指标

Claims (2)

1、细管高密度冷冻猪精液的方法，包括：

1)鲜精的采集与检测

采用手握法室温下收集猪富含精子段精液，于洁净的烧杯中经四层纱布过滤后检查各项指标：活力＞0.7，畸形率＜18％，质膜完整率＞70％的精液用于冷冻保存；

2)精液的预处理

(1)精液的预平衡：用常温保存液ZO液或S液，按体积比1∶1稀释精液，室温避光静置1小时；

表1.常温保存液配方g/100mL

(2)精液的离心：静置后，把精液分装到15mL离心管中，以2400×g离心3min，去除上清，用作后面的冷冻处理；

3)精液的冷冻

(1)冷冻稀释I液的配制：葡萄糖1.5g，乳糖3g，甘氨酸0.8g，卵黄24mL，加三蒸水至100mL，现配现用；

(2)冷冻稀释液II的配制：取配好的冷冻稀释I液，加入甘油，使甘油的质量比浓度为9％，置于普通冰箱冷藏室平衡；

(3)冷冻保存：向离心、去上清处理的精子中加入1～4mL冷冻稀释I液，混匀，使重新悬浮的精子密度达1.5×10⁹个/mL～6×10⁹个/mL，置于5℃水浴中平衡1小时；同时把做好标识的0.25mL细管也于5℃平衡1小时获得等温细管；平衡结束后，稀释I液稀释过的精液中再加入冷冻稀释II液稀释，I液：II液体积比为2∶1，充分混匀，再在5℃平衡1小时，在平衡时间还剩15min时，从液氮罐舀出液氮放到泡沫塑料盒中，泡沫塑料盒中液氮面上3cm处有支架，加盖平衡；将精液抽入等温细管中，装管后，用聚乙烯醇粉末封口，封好的细管在5℃继续平衡15min；最后，把细管均匀铺放在泡沫盒中液氮面上3cm处支架上，加盖平衡10min后细管直接投入液氮冷冻；

其冻精的解冻方法为：

从液氮中取出细管，迅速投入37℃水浴中，30秒钟后剪去细管两端封口，回收至2mL等温Z0液中，轻轻混匀，备用；

解冻后精子的保存液，在ZO液的基础上添加40％精浆和20％卵黄，放置室温保存2小时；

在ZO液的基础上添加的精浆制备方法为：鲜精经800×g离心10min，取上清再经2400×g离心10min，收集上清经0.22μm滤器过滤或添加青霉素、链霉素各100IU/mL，4℃冰箱保存备用。

2、权利要求1所述细管高密度冷冻猪精液的方法所获得的0.25mL细管冷冻猪精液产品。

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