CN103299987A

CN103299987A - 一种猪精液常温保存的稀释液及其制备方法

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Publication number: CN103299987A
Application number: CN2013102077573A
Authority: CN
Inventors: 胡建宏; 刘玉; 苏泽智; 洪洁赟; 王春伟; 李青旺; 杨公社
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2013-05-29
Filing date: 2013-05-29
Publication date: 2013-09-18

Abstract

本发明公开了一种用于猪精液常温保存的稀释液，制得的该用于猪精液常温保存的稀释液为水溶液，每100mL水溶液中含有下列物质：葡萄糖：2.75g，EDTA-Na2：0.235g，柠檬酸三钠：0.69g，柠檬酸：0.29g，碳酸氢钠：0.1g，Tris：0.565g，庆大霉素：4万IU，牛血清白蛋白：0.4g。本发明的用于猪精液常温保存的稀释液，现用现配，最好是在精液稀释前至少2h进行配制。pH为7.05±0.05、渗透压为300mOsm。稀释液的保存效果良好且可靠，能够为猪人工授精提供高质量的优质常温保存精液，具有十分广阔的市场应用前景。

Description

一种猪精液常温保存的稀释液及其制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及动物精液的常温保存稀释液，特别涉及一种猪精液常温保存的稀释液及其制备方法。

背景技术

随着猪的人工授精技术在集约化养猪场中的推广与应用，精液保存技术越来越受到重视，并日益显示出其在降低公猪饲养量和饲养成本、加快猪群品种改良、减少疾病传播等多方面的优势。与冷冻精液相比，常规液态保存精液具有繁殖成绩好（受胎率、分娩率和窝产仔数高）、所需费用低、操作程序简单等优点，从精液的保存效果考虑，后者更有利于猪的繁殖，能产生更大的经济效益。因此，猪的人工授精主要采用常温保存的精液。

猪精液常温保存是将采集的精液保存在具有一定变动范围的室温下，利用一定范围的酸性环境抑制精子的活动，减少其自身的能量消耗，使精子保持在可逆的状态而不丧失其受精能力。在精液常温保存中，精液的保存效果受保存温度、pH、渗透压、稀释倍数、活性氧等多方面因素的影响，稀释液不仅能为精子提供代谢所需的能量，调整pH和渗透压，还可以抑制精液中微生物的繁殖，起到保护精子的作用。因此，稀释液是影响猪精液常温保存效果的关键因素。

牛血清白蛋白（英文别名：BSA），在酶切反应缓冲液中加入BSA，通过提高溶液中蛋白质的浓度，对酶起保护作用，同时也是一种蛋白类保护剂。相关研究表明，BSA可有效地延长精液保存时间的同时，能提高保存后精子的受精能力。国外有关研究认为，BSA可以通过多种途径对精子起到保护作用，一是去除精子膜中的部分胆固醇和锌，调整精子膜的脂肪水平，从而改变了精子膜的稳定性；二是克服冷却过程中产生的溶血磷脂和自由脂肪酸造成的Ca²⁺易进入胞内的性质；三是中和精子和细菌代谢副产物，起一定缓冲作用和抗氧化作用；四是弥补稀释造成的精清中蛋白类运动激活物的下降，维持精子的运动；五是减少稀释造成的精子头部带相反电性电荷所引起的头对头凝集。BSA在牛羊精液保存中应用较多，并且取得了较好的效果。但是在猪精液常温保存中的系统研究及最适添加浓度还未见报道。

另外，目前国内外猪精液稀释保存配方种类很多，大多存在应用效果不一、成本过高的缺点，给生产场和基层品种改良站及专业户带来很多不便。因此，深入系统地研究影响猪精液常温保存的因素，研发适合我国猪精液保存的稀释液，对我国猪的人授精技术的发展具有非常深远的影响。

发明内容

针对目前我国猪精液稀释粉常温保存时间较短、保存效果较差的缺陷，本发明的目的在于，提供一种猪精液常温保存的稀释液及其制备方法，以探索BSA在猪精液常温稀释液中的最适添加浓度。

为了实现以上目的，本发明采取如下技术方案：

一种用于猪精液常温保存的稀释液，其特征在于，制得的该用于猪精液常温保存的稀释液为水溶液，每100mL水溶液中含有下列物质：

葡萄糖：2.75g，EDTA-Na2：0.235g，柠檬酸三钠：0.69g，柠檬酸：0.29g，碳酸氢钠：0.1g，Tris：0.565g，庆大霉素：4万IU，牛血清白蛋白：0.4g。

上述用于猪精液常温保存的稀释液，应现用现配，最好是在精液稀释前至少2h进行配制。

上述用于猪精液常温保存的稀释液的制备方法，其特征在于，包括下列步骤：

1）按配方称取葡萄糖、EDTA-Na2、柠檬酸三钠、柠檬酸、碳酸氢钠、Tris、牛血清白蛋白、庆大霉素备用；

2）将葡萄糖、EDTA-Na2、柠檬酸三钠、柠檬酸、碳酸氢钠、Tris、牛血清白蛋白用100mL双蒸水配制成水溶液；

3）待水溶液中的各成分充分溶解后，用0.22μm的滤器进行过滤，除菌。

使用前，加入配方量的庆大霉素，得到用于猪精液常温保存的稀释液。

本发明制备的用于猪精液常温保存的稀释液，pH为7.05±0.05、渗透压为300mOsm。稀释液的保存效果良好且可靠，能够为猪人工授精提供高质量的优质常温保存精液，具有十分广阔的市场应用前景。

附图说明

图1是不同浓度的BSA对精液中T-AOC的影响

图2是不同浓度的BSA对精液中MDA浓度的影响

下面结合附图和发明人给的具体试验和使用方法，对本发明作进一步的详细说明。

具体实施方式

在以下的实施例中，猪精液常温保存的稀释液需现用现配。

试验例：杜洛克猪精液常温保存

（一）猪精液常温保存的稀释液配制

本实施例给出的用于猪精液常温保存的稀释液为水溶液，每100mL水溶液中含有下列物质：

为了确定BSA在猪精液常温保存稀释液中的最适添加浓度，本试验设置了以下方案：

1、对照组：基础液Modena。

为了描述方便，用于猪精液常温保存的稀释液中的葡萄糖、EDTA-Na2、柠檬酸三钠、柠檬酸、碳酸氢钠、Tris和庆大霉素组成的溶液称为基础液Modena。

2、试验组：本组共6个处理组，在基础液Modena中分别添加1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L和6g/L的BSA。

用电子分析天平准确称取葡萄糖：2.75g，EDTA-Na2：0.235g，柠檬酸三钠：0.69g，柠檬酸：0.29g，碳酸氢钠：0.1g，Tris：0.565g。

将上述组分（葡萄糖、EDTA-Na2、柠檬酸三钠、柠檬酸、碳酸氢钠和Tris）溶解于50mL双蒸水中，用磁力搅拌器搅拌均匀后，再加入50mL双蒸水，配制成100mL溶液；

然后在100mL溶液中加入BSA0～0.6g，用0.22μm的滤器进行过滤除菌；使用前2h再加入庆大霉素4万IU；即制成猪精液常温保存的稀释液备用。

（二）精液的采集

用手握法采精，收集中段浓缩部分，经过滤后保存于保温杯中带回实验室。立即在37.5℃下镜检，观察精子活率，并用分光光度计在550nm处进行比色，计算精子密度。选择色泽和气味正常，精子活率在0.8以上，密度为3×10⁸～5×10⁸个/mL的精液用于常温保存。

（三）精液稀释

1、调节猪精液常温保存的稀释液的温度与精液温度一致（两者温差在1℃以内），注意必须以精液的温度为标准来调节猪精液常温保存的稀释液的温度，不可逆向操作。

2、将猪精液常温保存的稀释液沿容器壁缓慢加入精液中，不可逆向操作，轻轻搅匀或摇匀。

3、根据生产要求确定稀释倍数，如需做高倍稀释，先进行1：1低倍稀释，1min后再将余下的猪精液常温保存的稀释液缓慢加入。

4、稀释完毕后用四层毛巾包裹缓慢降温，室温放置2h后检查活率，精子活率前后没有明显降低，连同毛巾一起放入17℃恒温保存箱中保存。

（四）猪常温精液品质评定

每隔24h从恒温箱中取出常温保存的精液，在37℃的温度下评定精液质量，主要测定指标如下：

1、精子活率。用移液枪吸取10μL置于载玻片上，盖上盖玻片后立即在400倍光学显微镜下观察。每个样品随机观察3个视野，检测视野中直线前进运动的精子数占总精子数的比例，求其平均值作为精子活率（见表1）。

2、有效保存时间。有效保存时间为精子活率不低于0.50的保存时间（见表1）。

3、顶体完整率。采用FITC标记的花生凝集素染色后用荧光显微镜检测精子顶体的完整性。用移液枪吸取30μL精液涂片，自然干燥后，室温下用甲醇固定10min，然后在每个精液涂片上分别滴上FITC-PNA染液，于37℃、黑暗潮湿环境下孵育2h。之后用PBS液冲洗，自然干燥后滴加增光剂，盖上盖玻片，再用石蜡油封片。用荧光显微镜检查精子的顶体状况，并用数码相机拍照（见表2）。

4、利用低渗膨胀试验（HOST）检查精子质膜的完整性。用移液枪吸取精液样品与低渗溶液混合，在37℃下孵育30min后，取15μL精液样品于血细胞计数板上，在400倍倒置显微镜下，观察不同部位的5个视野，根据精子是否呈现卷尾来判断质膜的完整性（见表3）。

5、测定第3天和第7天稀释精液中的总抗氧化能力（T-AOC）和丙二醛（MDA）含量，测定方法按照试剂盒说明书进行（见图1和2）。

（六）评定结果

应用本发明的猪精液常温保存的稀释液以及保存方法，其保存效果的评定结果如下：

表1：不同浓度BSA对猪精子活率的影响

注：同行数据肩标不同小写字母表示差异显著（P<0.05），下同。

表2：不同浓度BSA对猪精子顶体完整率的影响(%)

保存时间（d）

1g/LBSA

2g/LBSA

3g/LBSA

4g/LBSA

5g/LBSA

6g/LBSA

对照

1

90.35±3.23^a

88.93±2.86^b

92.35±1.76^a

91.33±2.12^a

90.34±2.25^a

93.22±1.85^a

91.00±2.33^a

2

84.69±1.46^b

88.32±2.78^a

89.55±2.77^a

89.34±3.12^a

85.57±1.40^b

87.45±0.78^a

86.13±0.51^b

3

81.63±1.75^b

85.13±1.68^a

84.13±1.79^b

88.06±1.60^a

85.40±0.53^a

86.80±0.75^a

82.34±2.15^b

4

78.17±2.13^b

79.60±2.25^b

83.73±2.46^a

84.80±2.11^a

81.90±1.42^a

84.31±2.45^a

78.43±1.55^b

5

77.47±2.84^b

76.80±3.27^b

82.67±2.40^a

83.67±3.06^a

78.23±0.68^b

82.10±1.61^a

78.20±1.93^b

6

77.04±1.57^a

75.10±1.00^a

79.63±2.14^a

80.90±3.56^a

74.33±2.52^b

79.00±2.65^a

76.03±1.05^a

7

76.50±1.80^a

72.50±1.80^b

73.13±3.92^b

77.57±2.38^a

72.46±2.33^b

77.87±0.96^a

75.60±0.64^a

表3：不同浓度BSA对猪精子质膜完整率的影响(%)

保存时间（d）

1g/LBSA

2g/LBSA

3g/LBSA

4g/LBSA

5g/LBSA

6g/LBSA

对照

1

66.73±3.86^c

71.07±1.45^c

78.67±0.57^a

81.07±1.45^a

75.07±1.83^b

68.86±3.24^c

65.07±1.83^d

2

60.27±3.04^c

67.57±5.74^b

75.33±0.58^a

78.00±3.00^a

69.67±3.05^b

63.67±1.15^c

61.67±2.88^c

3

54.67±1.53^c

64.67±2.08^b

69.52±1.50^a

68.67±3.51^a

66.33±2.08^a

63.28±2.89^b

50.33±1.00^d

4

43.67±1.53^b

46.00±3.00^b

58.67±1.53^a

60.67±5.13^a

55.00±2.20^a

50.00±4.58^a

40.56±2.39^c

5

40.37±0.81^c

44.20±1.06^b

55.23±1.56^a

57.56±2.11^a

53.27±1.41^a

45.07±2.80^b

38.35±1.12^c

6

38.00±2.33^c

43.57±2.58^b

54.27±0.83^a

53.80±2.55^a

48.00±2.97^b

43.20±2.46^b

35.50±0.66^c

7

31.72±2.65^c

38.98±2.38^b

47.87±2.70^a

49.43±4.55^a

45.60±2.30^a

39.60±1.18^b

30.27±1.60^c

如表1和表3所示，Modena基础液中添加3g/L～5g/L的BSA能显著提高精子活率和质膜完整率，延长精子有效保存时间（P<0.05），其中4g/L效果最好。

如表2所示，Modena基础液中添加BSA时对精子顶体作用不明显，总体上精子顶体完整率试验组与对照组之间差异不显著（P>0.05）。

如图1所示，Modena中添加BSA时，试验组精液的T-AOC与对照组之间差异不显著（P>0.05）。

如图2所示，Modena基础液中添加3g/L～5g/L的BSA能显著提降低精液中MDA的含量（P<0.05）。

通过以上结果可以得出，Modena基础液中添加3g/L～5g/L的BSA能显著延长猪精子有效保存时间，提高精子活率和质膜完整率，降低MDA的含量（P<0.05），但对顶体完整性和T-AOC影响不大（P>0.05），其中添加4g/L的BSA效果最好，精子有效保存时间为7.5d。经过7d保存后，精子活率、质膜完整率、顶体完整率分别为0.54、49%和78%，T-AOC和MDA的含量分别为1.03U/mL和17.51nmol/mL。因此，Modena基础液＋4g/L BSA是一种良好的猪精液常温保存稀释液。

Claims

1.一种用于猪精液常温保存的稀释液，其特征在于，制得的该用于猪精液常温保存的稀释液为水溶液，每100mL水溶液中含有下列物质：

葡萄糖：2.75g，EDTA-Na2：0.235g，柠檬酸三钠：0.69g，柠檬酸：0.29g，碳酸氢钠：0.1g，Tris：0.565g，庆大霉素：4万IU，牛血清白蛋白：0.3g～0.5g。

2.如权利要求1所述的用于猪精液常温保存的稀释液，其特征在于，所述的牛血清白蛋白为0.4g。

3.权利要求1或2所述的用于猪精液常温保存的稀释液的制备方法，其特征在于，包括下列步骤：

3）待水溶液中的各成分充分溶解后，用0.22μm的滤器进行过滤，除菌。使用前，加入配方量的庆大霉素，得到用于猪精液常温保存的稀释液。