CN103518706B - 奶山羊冷冻精液稀释液及其制备方法和稀释方法、以及奶山羊冷冻精液细管冻精的制备方法 - Google Patents
奶山羊冷冻精液稀释液及其制备方法和稀释方法、以及奶山羊冷冻精液细管冻精的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及奶山羊冷冻精液稀释液及其制备方法和稀释方法、以及奶山羊冷冻精液细管冻精的制备方法。现有冷冻精液保存方法，精子受低温打击致使质膜结构改变，严重影响质膜的完整性及其复苏后的活率及受精能力。本发明对新鲜精液进行两步稀释、平衡及两步降温细管冷冻处理，其中，基础稀释液由Tris、柠檬酸、葡萄糖、海藻糖、Vc、GSH、BSA、ATP、复合抗生素、卵黄加水配成，冷冻稀释液由基础稀释液加甘油配成；利用稀释液对鲜精进行稀释和平衡后，分装于细管，储存于液氮中。本发明对奶山羊精液低温保存和冷冻保存具有良好效果，有效提高解冻后活率、顶体完整率及质膜完整性，降低畸形率，提高奶山羊冻精生产效率及冻精品质。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及奶山羊冷冻精液稀释液及其制备方法和稀释方法、以及奶山羊冷冻精液细管冻精的制备方法。
背景技术
奶山羊作为重要的奶畜资源，近些年来随着我国国民生活水平提高及饮食结构调整而倍受重视。奶山羊养殖主要集中在陕西、山东、河南、河北、云南等省份，然而羊奶的需求目前已经遍及东部沿海及南方港、澳、台等10多个省、市、自治区及直辖市，体现出一种供不应求的趋势，因此如何加快奶山羊品种改良，提高奶山羊良种繁育速度及建立规模化养殖管理体系成为目前工作的重中之重。精液冷冻保存与人工受精技术在现代化畜牧业生产中发挥着举足轻重的作用，应用冷冻精液进行人工授精可以不受时间、地域、品种及个体的限制，并且大量减少公畜的饲养数量，降低生产成本，提高优良种公畜的利用率，提高养殖业的经济效益。同时该技术对品种引进、杂交改良，以及提高繁殖性能、疾病控制及保护遗传多样性保护方面也具有重要的意义。我国在奶牛及肉牛上应用冷冻精液技术及人工授精技术已发展的较为完善，充分提高了养殖的经济效益，但在山羊精液冷冻保存及人工授精技术上尽管已经应用多年，但普遍冷冻精液解冻后，精子活率（0.3-0.5）难以提高受胎率（35%-50%）满足规模化生产需要。其原因是精子受低温打击致使精子质膜结构发生改变，严重影响质膜的完整性及其复苏后的精子的活率及受精能力。因此只有深入了解稀释液中各成分的用途与作用机理，选择适合羊精液的成分才能使其发挥有效作用。
发明内容
本发明的目的是提供奶山羊冷冻精液稀释液及其制备方法和稀释方法、以及奶山羊冷冻精液细管冻精的制备方法，能够有效改善精子在降温过程中所受到的损伤，保持精子完整性，减少精子在冷冻过程中所受到的伤害。
本发明所采用的技术方案是：
奶山羊冷冻精液基础稀释液的制备方法，其特征在于：
由以下步骤实现：
步骤一：按以下比例准备各组分：
三羟甲基-氨基甲烷 300-400 mM；
柠檬酸 100-130 mM；
葡萄糖 35-45 mM；
海藻糖 260-300 mM；
维生素C 4-6 g/L；
还原型谷胱甘肽 4-6 mM；
牛血清白蛋白 8-12 g/L；
三磷酸腺苷 0.7-1.5 mM；
步骤二：将上述组分与双蒸水按比例混匀后，0.2 um滤膜过滤，加入复合抗生素；
步骤三：按体积比15-25 %的比例，在步骤二得到的混合液中加入卵黄添加液，充分混匀，得到基础稀释液。
步骤二中，加入复合抗生素，即加入0.05~0.055 g/L的泰乐菌素、0.27~0.28 g/L的庆大霉素、0.16~0.18 g/L的林可霉素以及0.3~0.35 g/L的奇霉素。
步骤三中，卵黄添加液由以下步骤制得：
将新鲜无病原菌鸡蛋经过双氯苯双胍己烷浸泡后抽取卵黄液，以质量体积比为0.035%加入十二烷基磺酸钠，15╳103 g离心1 h，吸取上清液经0.45 μm滤膜过滤得到卵黄添加液。
所述的制备方法制得的奶山羊冷冻精液基础稀释液。
奶山羊冷冻精液冷冻稀释液的制备方法，其特征在于：
由以下步骤实现：
步骤一：按以下比例准备各组分：
三羟甲基-氨基甲烷 300-400 mM；
柠檬酸 100-130 mM；
葡萄糖 35-45 mM；
海藻糖 260-300 mM；
维生素C 4-6 g/L；
还原型谷胱甘肽 4-6 mM；
牛血清白蛋白 8-12 g/L；
三磷酸腺苷 0.7-1.5 mM；
步骤二：将上述组分与双蒸水按比例混匀后，0.2 um滤膜过滤，加入复合抗生素；
步骤三：按体积比15-25 %的比例，在步骤二得到的混合液中加入卵黄添加液，充分混匀，得到基础稀释液；
步骤四：基础稀释液配制好后，按甘油终体积浓度为12-16%的比例，加入甘油，得到冷冻稀释液。
步骤二中，加入复合抗生素，即加入0.05~0.055 g/L的泰乐菌素、0.27~0.28 g/L的庆大霉素、0.16~0.18 g/L的林可霉素以及0.3~0.35 g/L的奇霉素。
步骤三中，卵黄添加液由以下步骤制得：
将新鲜无病原菌鸡蛋经过双氯苯双胍己烷浸泡后抽取卵黄液，以质量体积比为0.035%加入十二烷基磺酸钠，15╳103 g离心1 h，吸取上清液经0.45 μm滤膜过滤得到卵黄添加液。
所述的制备方法制得的奶山羊冷冻精液冷冻稀释液。
奶山羊冷冻精液的稀释方法，其特征在于：
由以下步骤实现：
步骤一：制备基础稀释液：
（1）按以下比例准备各组分：
三羟甲基-氨基甲烷 300-400 mM；
柠檬酸 100-130 mM；
葡萄糖 35-45 mM；
海藻糖 260-300 mM；
维生素C 4-6 g/L；
还原型谷胱甘肽 4-6 mM；
牛血清白蛋白 8-12 g/L；
三磷酸腺苷 0.7-1.5 mM；
（2）将上述组分与双蒸水按比例混匀后，0.2 um滤膜过滤，加入复合抗生素，即加入0.05~0.055 g/L的泰乐菌素、0.27~0.28 g/L的庆大霉素、0.16~0.18 g/L的林可霉素以及0.3~0.35 g/L的奇霉素；
（3）按体积比15-25 %的比例，在步骤二得到的混合液中加入卵黄添加液，充分混匀，得到基础稀释液；
卵黄添加液由以下步骤制得：
将新鲜无病原菌鸡蛋经过双氯苯双胍己烷浸泡后抽取卵黄液，以质量体积比为0.035%加入十二烷基磺酸钠，15╳103 g离心1 h，吸取上清液经0.45 μm滤膜过滤得到卵黄添加液；
步骤二：制备冷冻稀释液：
基础稀释液配制好后，按甘油终体积浓度为12-16%的比例，加入甘油，得到冷冻稀释液；
步骤三：采用两步法稀释奶山羊精液并平衡：
（1）采集新鲜公羊精液，在37℃温度下对精子的表观活率、活率及密度进行质量评定：用带有刻度的集精杯计算每次采精体积；在显微镜100倍视野下观察鲜精的表观活率，分为0-5级，0级为没有波动，5级为快速漩涡状波动；在400倍视野下评定鲜精活率，将鲜精稀释1000倍后在血球计数板上计算精液密度；只有精液表观活率为5级，活率大于0.8且密度大于2.0×109 个/mL才能用于冷冻精液制作；
（2）等温加入基础稀释液，使稀释后精子密度为8×108 -10×108 个/mL，基础稀释液添加量为鲜精液的3-6倍，混匀后转移至冰箱冷藏室或4℃低温环境，1.5-2 h水浴冷却到0-4℃完成第一步稀释；
（3）在相同温度下以体积比1:1加入冷冻稀释液并混匀，此时混合精液密度为4×108 -5×108 个/mL，甘油浓度为6-8 %，完成第二步稀释，平衡时间2-6 h。
奶山羊冷冻精液细管冻精的制备方法，其特征在于：
由以下两步降温法实现：
步骤一：制备基础稀释液：
（1）按以下比例准备各组分：
三羟甲基-氨基甲烷 300-400 mM；
柠檬酸 100-130 mM；
葡萄糖 35-45 mM；
海藻糖 260-300 mM；
维生素C 4-6 g/L；
还原型谷胱甘肽 4-6 mM；
牛血清白蛋白 8-12 g/L；
三磷酸腺苷 0.7-1.5 mM；
（2）将上述组分与双蒸水按比例混匀后，0.2 um滤膜过滤，加入复合抗生素，即加入0.05~0.055 g/L的泰乐菌素、0.27~0.28 g/L的庆大霉素、0.16~0.18 g/L的林可霉素以及0.3~0.35 g/L的奇霉素；
（3）按体积比15-25 %的比例，在步骤二得到的混合液中加入卵黄添加液，充分混匀，得到基础稀释液；
卵黄添加液由以下步骤制得：
将新鲜无病原菌鸡蛋经过双氯苯双胍己烷浸泡后抽取卵黄液，以质量体积比为0.035%加入十二烷基磺酸钠，15╳103 g离心1 h，吸取上清液经0.45 μm滤膜过滤得到卵黄添加液；
步骤二：制备冷冻稀释液：
基础稀释液配制好后，按甘油终体积浓度为12-16%的比例，加入甘油，得到冷冻稀释液；
步骤三：采用两步法稀释奶山羊精液并平衡：
（1）采集新鲜公羊精液，在37℃温度下对精子的表观活率、活率及密度进行质量评定：用带有刻度的集精杯计算每次采精体积；在显微镜100倍视野下观察鲜精的表观活率，分为0-5级，0级为没有波动，5级为快速漩涡状波动；在400倍视野下评定鲜精活率，将鲜精稀释1000倍后在血球计数板上计算精液密度；只有精液表观活率为5级，活率大于0.8且密度大于2.0×109 个/mL才能用于冷冻精液制作；
（2）等温加入基础稀释液，使稀释后精子密度为8×108 -10×108 个/mL，基础稀释液添加量为鲜精液的3-6倍，混匀后转移至冰箱冷藏室或4℃低温环境，1.5-2 h水浴冷却到0-4℃完成第一步稀释；
（3）在相同温度下以体积比1:1加入冷冻稀释液并混匀，此时混合精液密度为4×108 -5×108 个/mL，甘油浓度为6-8 %，完成第二步稀释，平衡时间2-6 h；
步骤四：制备奶山羊冷冻精液细管冻精：
将稀释平衡后的精液在0-4℃温度下吸入0.25 mL细管中，用聚乙烯醇粉封口后，第一步降温即迅速将细管置于距离液氮表面4-5 cm的冷冻架上，熏蒸4-5 min，第二步降温即将细管投入到液氮中长期保存。
本发明具有以下优点：
本发明所涉及的奶山羊冷冻精液稀释液及其制备方法和稀释方法、以及奶山羊冷冻精液细管冻精的制备方法，对奶山羊精液低温保存和冷冻保存具有良好的效果，能有效提高解冻后精子活率、顶体完整率及质膜完整性，降低精子畸形率，提高奶山羊冻精生产效率及冻精品质。同时该细管冻精制作工艺操作简单，生产成本低，有效提高人工授精受胎率及体外授精效率，便于大规模推广应用。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行详细的说明。
（一）本发明涉及的奶山羊冷冻精液基础稀释液的制备方法，由以下步骤实现：
步骤一：按以下比例准备各组分：
三羟甲基-氨基甲烷（Tris） 300-400 mM；
柠檬酸 100-130 mM；
葡萄糖 35-45 mM；
海藻糖 260-300 mM；
维生素C（Vc） 4-6 g/L；
还原型谷胱甘肽（GSH） 4-6 mM；
牛血清白蛋白（BSA） 8-12 g/L；
三磷酸腺苷（ATP） 0.7-1.5 mM；
步骤二：将上述组分与双蒸水按比例混匀后，0.2 um滤膜过滤，加入复合抗生素；
步骤三：按体积比（vol:vol）15-25 %的比例，在步骤二得到的混合液中加入卵黄添加液，充分混匀，得到基础稀释液。
步骤二中，加入复合抗生素，即加入0.05~0.055 g/L的泰乐菌素、0.27~0.28 g/L的庆大霉素、0.16~0.18 g/L的林可霉素以及0.3~0.35 g/L的奇霉素。
步骤三中，卵黄添加液由以下步骤制得：
将新鲜无病原菌鸡蛋经过双氯苯双胍己烷（洗必泰）浸泡后抽取卵黄液，以质量体积比（wt:vol）为0.035%加入十二烷基磺酸钠（SDS），15╳103 g离心1 h，吸取上清液经0.45 μm滤膜过滤得到卵黄添加液。
（二）本发明所涉及的奶山羊冷冻精液冷冻稀释液的制备方法，由以下步骤实现：
步骤一：按以下比例准备各组分：
三羟甲基-氨基甲烷 300-400 mM；
柠檬酸 100-130 mM；
葡萄糖 35-45 mM；
海藻糖 260-300 mM；
维生素C 4-6 g/L；
还原型谷胱甘肽 4-6 mM；
牛血清白蛋白 8-12 g/L；
三磷酸腺苷 0.7-1.5 mM；
步骤二：将上述组分与双蒸水按比例混匀后，0.2 um滤膜过滤，加入复合抗生素；
步骤三：按体积比15-25 %的比例，在步骤二得到的混合液中加入卵黄添加液，充分混匀，得到基础稀释液；
步骤四：基础稀释液配制好后，按甘油终体积浓度（vol:vol）为12-16%的比例，加入甘油，得到冷冻稀释液。
步骤二中，加入复合抗生素，即加入0.05~0.055 g/L的泰乐菌素、0.27~0.28 g/L的庆大霉素、0.16~0.18 g/L的林可霉素以及0.3~0.35 g/L的奇霉素。
步骤三中，卵黄添加液由以下步骤制得：
将新鲜无病原菌鸡蛋经过双氯苯双胍己烷浸泡后抽取卵黄液，以质量体积比为0.035%加入十二烷基磺酸钠，15╳103 g离心1 h，吸取上清液经0.45 μm滤膜过滤得到卵黄添加液。
（三）本发明所涉及的奶山羊冷冻精液的稀释方法，由以下步骤实现：
步骤一：制备基础稀释液：
（1）按以下比例准备各组分：
三羟甲基-氨基甲烷 300-400 mM；
柠檬酸 100-130 mM；
葡萄糖 35-45 mM；
海藻糖 260-300 mM；
维生素C 4-6 g/L；
还原型谷胱甘肽 4-6 mM；
牛血清白蛋白 8-12 g/L；
三磷酸腺苷 0.7-1.5 mM；
（2）将上述组分与双蒸水按比例混匀后，0.2 um滤膜过滤，加入复合抗生素，即加入0.05~0.055 g/L的泰乐菌素、0.27~0.28 g/L的庆大霉素、0.16~0.18 g/L的林可霉素以及0.3~0.35 g/L的奇霉素；
（3）按体积比15-25 %的比例，在步骤二得到的混合液中加入卵黄添加液，充分混匀，得到基础稀释液；
卵黄添加液由以下步骤制得：
将新鲜无病原菌鸡蛋经过双氯苯双胍己烷浸泡后抽取卵黄液，以质量体积比为0.035%加入十二烷基磺酸钠，15╳103 g离心1 h，吸取上清液经0.45 μm滤膜过滤得到卵黄添加液；
步骤二：制备冷冻稀释液：
基础稀释液配制好后，按甘油终体积浓度为12-16%的比例，加入甘油，得到冷冻稀释液；
步骤三：采用两步法稀释奶山羊精液并平衡：
（1）采集新鲜公羊精液，在37℃温度下对精子的表观活率、活率及密度进行质量评定：用带有刻度的集精杯计算每次采精体积；在显微镜100倍视野下观察鲜精的表观活率，分为0-5级，0级为没有波动，5级为快速漩涡状波动；在400倍视野下评定鲜精活率，将鲜精稀释1000倍后在血球计数板上计算精液密度；只有精液表观活率为5级，活率大于0.8且密度大于2.0×109 个/mL才能用于冷冻精液制作；
（2）等温加入基础稀释液，使稀释后精子密度为8×108 -10×108 个/mL，基础稀释液添加量为鲜精液的3-6倍，混匀后转移至冰箱冷藏室或4℃低温环境，1.5-2 h水浴冷却到0-4℃完成第一步稀释；
（3）在相同温度下以体积比1:1加入冷冻稀释液并混匀，此时混合精液密度为4×108 -5×108 个/mL，甘油浓度为6-8 %，完成第二步稀释，平衡时间2-6 h。
（四）本发明所涉及的奶山羊冷冻精液细管冻精的制备方法，由以下两步降温法实现：
步骤一：制备基础稀释液：
（1）按以下比例准备各组分：
三羟甲基-氨基甲烷 300-400 mM；
柠檬酸 100-130 mM；
葡萄糖 35-45 mM；
海藻糖 260-300 mM；
维生素C 4-6 g/L；
还原型谷胱甘肽 4-6 mM；
牛血清白蛋白 8-12 g/L；
三磷酸腺苷 0.7-1.5 mM；
（2）将上述组分与双蒸水按比例混匀后，0.2 um滤膜过滤，加入复合抗生素，即加入0.05~0.055 g/L的泰乐菌素、0.27~0.28 g/L的庆大霉素、0.16~0.18 g/L的林可霉素以及0.3~0.35 g/L的奇霉素；
（3）按体积比15-25 %的比例，在步骤二得到的混合液中加入卵黄添加液，充分混匀，得到基础稀释液；
卵黄添加液由以下步骤制得：
将新鲜无病原菌鸡蛋经过双氯苯双胍己烷浸泡后抽取卵黄液，以质量体积比为0.035%加入十二烷基磺酸钠，15╳103 g离心1 h，吸取上清液经0.45 μm滤膜过滤得到卵黄添加液；
步骤二：制备冷冻稀释液：
基础稀释液配制好后，按甘油终体积浓度为12-16%的比例，加入甘油，得到冷冻稀释液；
步骤三：采用两步法稀释奶山羊精液并平衡：
（1）采集新鲜公羊精液，在37℃温度下对精子的表观活率、活率及密度进行质量评定：用带有刻度的集精杯计算每次采精体积；在显微镜100倍视野下观察鲜精的表观活率，分为0-5级，0级为没有波动，5级为快速漩涡状波动；在400倍视野下评定鲜精活率，将鲜精稀释1000倍后在血球计数板上计算精液密度；只有精液表观活率为5级，活率大于0.8且密度大于2.0×109 个/mL才能用于冷冻精液制作；
（2）等温加入基础稀释液，使稀释后精子密度为8×108 -10×108 个/mL，基础稀释液添加量为鲜精液的3-6倍，混匀后转移至冰箱冷藏室或4℃低温环境，1.5-2 h水浴冷却到0-4℃完成第一步稀释；
（3）在相同温度下以体积比1:1加入冷冻稀释液并混匀，此时混合精液密度为4×108 -5×108 个/mL，甘油浓度为6-8 %，完成第二步稀释，平衡时间2-6 h；
步骤四：制备奶山羊冷冻精液细管冻精：
将稀释平衡后的精液在0-4℃温度下吸入0.25 mL细管中，用聚乙烯醇粉封口后，第一步降温即迅速将细管置于距离液氮表面4-5 cm的冷冻架上，熏蒸4-5 min，第二步降温即将细管投入到液氮（-196℃）中长期保存。
以下为奶山羊冷冻精液细管冻精制备的具体实施例：
实施例1：
步骤一：制备基础稀释液：
（1）按以下比例准备各组分：
三羟甲基-氨基甲烷 300 mM；
柠檬酸 100 mM；
葡萄糖 35 mM；
海藻糖 260 mM；
维生素C 4 g/L；
还原型谷胱甘肽 4 mM；
牛血清白蛋白 8 g/L；
三磷酸腺苷 0.7 mM；
（2）将上述组分与双蒸水按比例混匀后，0.2 um滤膜过滤，加入复合抗生素，即加入0.05 g/L的泰乐菌素、0.27 g/L的庆大霉素、0.16 g/L的林可霉素以及0.3 g/L的奇霉素；
（3）按体积比15 %的比例，在步骤二得到的混合液中加入卵黄添加液，充分混匀，得到基础稀释液；
卵黄添加液由以下步骤制得：
将新鲜无病原菌鸡蛋经过双氯苯双胍己烷浸泡后抽取卵黄液，以质量体积比为0.035%加入十二烷基磺酸钠，15╳103 g离心1 h，吸取上清液经0.45 μm滤膜过滤得到卵黄添加液；
步骤二：制备冷冻稀释液：
基础稀释液配制好后，按甘油终体积浓度为12%的比例，加入甘油，得到冷冻稀释液；
步骤三：采用两步法稀释奶山羊精液并平衡：
（1）采集新鲜公羊精液，在37℃温度下对精子的表观活率、活率及密度进行质量评定：用带有刻度的集精杯计算每次采精体积；在显微镜100倍视野下观察鲜精的表观活率，分为0-5级，0级为没有波动，5级为快速漩涡状波动；在400倍视野下评定鲜精活率，将鲜精稀释1000倍后在血球计数板上计算精液密度；只有精液表观活率为5级，活率大于0.8且密度大于2.0×109 个/mL才能用于冷冻精液制作；
（2）等温加入基础稀释液，使稀释后精子密度为8×108 个/mL，基础稀释液添加量为鲜精液的3倍，混匀后转移至冰箱冷藏室或4℃低温环境，1.5 h水浴冷却到0℃完成第一步稀释；
（3）在相同温度下以体积比1:1加入冷冻稀释液并混匀，此时混合精液密度为4×108 个/mL，甘油浓度为6%，完成第二步稀释，平衡时间2 h；
步骤四：制备奶山羊冷冻精液细管冻精：
将稀释平衡后的精液在0℃温度下吸入0.25 mL细管中，用聚乙烯醇粉封口后，第一步降温即迅速将细管置于距离液氮表面4 cm的冷冻架上，熏蒸4 min，第二步降温即将细管投入到液氮中长期保存。
实施例2：
步骤一：制备基础稀释液：
（1）按以下比例准备各组分：
三羟甲基-氨基甲烷 350 mM；
柠檬酸 115 mM；
葡萄糖 40 mM；
海藻糖 280 mM；
维生素C 5 g/L；
还原型谷胱甘肽 5 mM；
牛血清白蛋白 10 g/L；
三磷酸腺苷 1.1 mM；
（2）将上述组分与双蒸水按比例混匀后，0.2 um滤膜过滤，加入复合抗生素，即加入0.30 g/L的泰乐菌素、0.27 g/L的庆大霉素、0.17 g/L的林可霉素以及0.30 g/L的奇霉素；
（3）按体积比20 %的比例，在步骤二得到的混合液中加入卵黄添加液，充分混匀，得到基础稀释液；
卵黄添加液由以下步骤制得：
将新鲜无病原菌鸡蛋经过双氯苯双胍己烷浸泡后抽取卵黄液，以质量体积比为0.035%加入十二烷基磺酸钠，15╳103 g离心1 h，吸取上清液经0.45 μm滤膜过滤得到卵黄添加液；
步骤二：制备冷冻稀释液：
基础稀释液配制好后，按甘油终体积浓度为14%的比例，加入甘油，得到冷冻稀释液；
步骤三：采用两步法稀释奶山羊精液并平衡：
（1）采集新鲜公羊精液，在37℃温度下对精子的表观活率、活率及密度进行质量评定：用带有刻度的集精杯计算每次采精体积；在显微镜100倍视野下观察鲜精的表观活率，分为0-5级，0级为没有波动，5级为快速漩涡状波动；在400倍视野下评定鲜精活率，将鲜精稀释1000倍后在血球计数板上计算精液密度；只有精液表观活率为5级，活率大于0.8且密度大于2.0×109 个/mL才能用于冷冻精液制作；
（2）等温加入基础稀释液，使稀释后精子密度为9×108 个/mL，基础稀释液添加量为鲜精液的4倍，混匀后转移至冰箱冷藏室或4℃低温环境，1.5 h水浴冷却到2℃完成第一步稀释；
（3）在相同温度下以体积比1:1加入冷冻稀释液并混匀，此时混合精液密度为4×108 个/mL，甘油浓度为7 %，完成第二步稀释，平衡时间4 h；
步骤四：制备奶山羊冷冻精液细管冻精：
将稀释平衡后的精液在2℃温度下吸入0.25 mL细管中，用聚乙烯醇粉封口后，第一步降温即迅速将细管置于距离液氮表面4 cm的冷冻架上，熏蒸4 min，第二步降温即将细管投入到液氮中长期保存。
实施例3：
步骤一：制备基础稀释液：
（1）按以下比例准备各组分：
三羟甲基-氨基甲烷 400 mM；
柠檬酸 130 mM；
葡萄糖 45 mM；
海藻糖 300 mM；
维生素C 6 g/L；
还原型谷胱甘肽 6 mM；
牛血清白蛋白 12 g/L；
三磷酸腺苷 1.5 mM；
（2）将上述组分与双蒸水按比例混匀后，0.2 um滤膜过滤，加入复合抗生素，即加入0.055 g/L的泰乐菌素、0.28 g/L的庆大霉素、0.18 g/L的林可霉素以及0.35 g/L的奇霉素；
（3）按体积比25 %的比例，在步骤二得到的混合液中加入卵黄添加液，充分混匀，得到基础稀释液；
卵黄添加液由以下步骤制得：
将新鲜无病原菌鸡蛋经过双氯苯双胍己烷浸泡后抽取卵黄液，以质量体积比为0.035%加入十二烷基磺酸钠，15╳103 g离心1 h，吸取上清液经0.45 μm滤膜过滤得到卵黄添加液；
步骤二：制备冷冻稀释液：
基础稀释液配制好后，按甘油终体积浓度为16%的比例，加入甘油，得到冷冻稀释液；
步骤三：采用两步法稀释奶山羊精液并平衡：
（1）采集新鲜公羊精液，在37℃温度下对精子的表观活率、活率及密度进行质量评定：用带有刻度的集精杯计算每次采精体积；在显微镜100倍视野下观察鲜精的表观活率，分为0-5级，0级为没有波动，5级为快速漩涡状波动；在400倍视野下评定鲜精活率，将鲜精稀释1000倍后在血球计数板上计算精液密度；只有精液表观活率为5级，活率大于0.8且密度大于2.0×109 个/mL才能用于冷冻精液制作；
（2）等温加入基础稀释液，使稀释后精子密度为10×108 个/mL，基础稀释液添加量为鲜精液的6倍，混匀后转移至冰箱冷藏室或4℃低温环境，2 h水浴冷却到4℃完成第一步稀释；
（3）在相同温度下以体积比1:1加入冷冻稀释液并混匀，此时混合精液密度为5×108 个/mL，甘油浓度为8 %，完成第二步稀释，平衡时间6 h；
步骤四：制备奶山羊冷冻精液细管冻精：
将稀释平衡后的精液在4℃温度下吸入0.25 mL细管中，用聚乙烯醇粉封口后，第一步降温即迅速将细管置于距离液氮表面5 cm的冷冻架上，熏蒸5 min，第二步降温即将细管投入到液氮中长期保存。
实施例4：
步骤一：制备基础稀释液：
（1）按以下比例准备各组分：
三羟甲基-氨基甲烷 375 mM；
柠檬酸 124 mM；
葡萄糖 41 mM；
海藻糖 281 mM；
维生素C 5 g/L；
还原型谷胱甘肽 5 mM；
牛血清白蛋白 10 g/L；
三磷酸腺苷 1.2 mM；
（2）将上述组分与双蒸水按比例混匀后，0.2 um滤膜过滤，加入复合抗生素，即加入0.052 g/L的泰乐菌素、0.28 g/L的庆大霉素、0.17 g/L的林可霉素以及0.33 g/L的奇霉素；
（3）按体积比20 %的比例，在步骤二得到的混合液中加入卵黄添加液，充分混匀，得到基础稀释液；
卵黄添加液由以下步骤制得：
将新鲜无病原菌鸡蛋经过双氯苯双胍己烷浸泡后抽取卵黄液，以质量体积比为0.035%加入十二烷基磺酸钠，15╳103 g离心1 h，吸取上清液经0.45 μm滤膜过滤得到卵黄添加液；
步骤二：制备冷冻稀释液：
基础稀释液配制好后，按甘油终体积浓度为12%的比例，加入甘油，得到冷冻稀释液；
步骤三：采用两步法稀释奶山羊精液并平衡：
（1）采集新鲜公羊精液，在37℃温度下对精子的表观活率、活率及密度进行质量评定：用带有刻度的集精杯计算每次采精体积；在显微镜100倍视野下观察鲜精的表观活率，分为0-5级，0级为没有波动，5级为快速漩涡状波动；在400倍视野下评定鲜精活率，将鲜精稀释1000倍后在血球计数板上计算精液密度；只有精液表观活率为5级，活率大于0.8且密度大于2.0×109 个/mL才能用于冷冻精液制作；
（2）等温加入基础稀释液，使稀释后精子密度为10×108 个/mL，基础稀释液添加量为鲜精液的3倍，混匀后转移至冰箱冷藏室或4℃低温环境，2 h水浴冷却到4℃完成第一步稀释；
（3）在相同温度下以体积比1:1加入冷冻稀释液并混匀，此时混合精液密度为5×108 个/mL，甘油浓度为6 %，完成第二步稀释，平衡时间3 h；
步骤四：制备奶山羊冷冻精液细管冻精：
将稀释平衡后的精液在4℃温度下吸入0.25 mL细管中，用聚乙烯醇粉封口后，第一步降温即迅速将细管置于距离液氮表面5 cm的冷冻架上，熏蒸5 min，第二步降温即将细管投入到液氮中长期保存。
有益效果说明：
采用假阴道法采集27只成年健康萨能奶山羊种公羊（1-4周岁）精液，在35-37℃下对精液的表观活率，活率及密度进行评定。利用上述两次稀释法及两次降温法制作成细管冻精。随机抽取每只个体3支细管冻精进行检测。结果表明所采集种公羊样品鲜精密度由1.9×109-2.8×109个/mL范围内变化，平均密度为2.5╳109 个/mL，每只种公羊表观活率均达到最高值，活率在0.75-0.85范围内变化，平均值为0.8。经解冻后结果显示，活率在0.45-0.65范围内变化，平均是为0.57，顶体完整率平均值为84%。数据结果见表一。
表一 本研究稀释液及细管制作工艺对山羊精液解冻后品质的影响
本发明所研制的稀释液配方对于奶山羊各个年龄阶段精液冷冻保存均具有良好的效果，能效提高解冻后精子活率、顶体完整率，降低精子畸形率，提高奶山羊冻精生产效率冻精品质。同时该细管冻精制作工艺操作简单，生产成本低，有效提高人工授精受胎率及体外授精效率，便于大规模推广应用。
Tris和柠檬酸具有无毒性、pH调节性及良好的缓冲稳定性，本发明稀释液中按比例添加的Tris和柠檬酸达到了很理想的效果。果糖及海藻糖具有提供营养以补充精子生存和运动所消耗的能量，维持精子高活性的作用，本发明特点在于加入一定比例的果糖及海藻糖能有效维护精子质膜完整性、降低精子顶体受损及保持精子具有冲击能力，从而提高精子活力。
Vc，GSH，BSA，ATP具有极强的抗氧化、抗衰老和防止细胞凋亡等特性，本发明按上述比例添加能有效降低有害物质活性氧自由基（ROS）的脂质过氧化反应，提高超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPX）活性大大提高精子膜脂流动性从而提高精子活力。复合抗生素的选择如泰乐菌素，庆大霉素，林可霉素及奇霉素可有效控制精液中细菌的菌落数量并对精子无毒害作用，从而维护精子较高成活率。
本发明选择卵黄作为低温保护剂可较好的保护精子在低温条件下所受冷打击，保护精子质膜完整性及顶体完整性。国内外有报道卵黄中的凝集酶（EYCE）具有磷脂酰肌醇A2活性可水解卵磷脂（PC）产生溶血卵磷脂（LPC），LPC对精子有一定毒性作用，可对质膜完整性造成损伤。但这种毒性强度取决于卵黄的质量，添加量及LPC的活性温度。本发明将新鲜无病原菌鸡蛋经过双氯苯双胍己烷（洗必泰）浸泡后抽取卵黄液，以质量体积比（wt:vol）为0.035%加入十二烷基磺酸钠（SDS），15×103 g离心1 h，吸取上清液经0.45 μm滤膜过滤得到卵黄添加液，按体积比15-25 %（vol:vol）的卵黄液添加至上述稀释液中充分混匀。经实验证明本发明卵黄液可大大降低LPC的生成从而极大减低对精子的毒性作用。
本发明的内容不限于实施例所列举，本领域普通技术人员通过阅读本发明说明书而对本发明技术方案采取的任何等效的变换，均为本发明的权利要求所涵盖。
Claims (6)
1.奶山羊冷冻精液基础稀释液的制备方法，其特征在于：
由以下步骤实现：
步骤一：按以下比例准备各组分：
三羟甲基-氨基甲烷 300-400 mM；
柠檬酸 100-130 mM；
葡萄糖 35-45 mM；
海藻糖 260-300 mM；
维生素C 4-6 g/L；
还原型谷胱甘肽 4-6 mM；
牛血清白蛋白 8-12 g/L；
三磷酸腺苷 0.7-1.5 mM；
步骤二：将上述组分与双蒸水按比例混匀后，0.2μm 滤膜过滤，加入复合抗生素；
步骤三：按体积比15-25 %的比例，在步骤二得到的混合液中加入卵黄添加液，充分混匀，得到基础稀释液；
步骤二中，加入复合抗生素，即加入0.05-0.055 g/L的泰乐菌素、0.27-0.28 g/L的庆大霉素、0.16-0.18 g/L的林可霉素以及0.3-0.35 g/L的奇霉素；
步骤三中，卵黄添加液由以下步骤制得：
将新鲜无病原菌鸡蛋经过双氯苯双胍己烷浸泡后抽取卵黄液，以质量体积比为0.035%加入十二烷基磺酸钠，15╳103 g离心1 h，吸取上清液经0.45μm滤膜过滤得到卵黄添加液。
2.根据权利要求1所述的制备方法制得的奶山羊冷冻精液基础稀释液。
3.奶山羊冷冻精液冷冻稀释液的制备方法，其特征在于：
由以下步骤实现：
步骤一：按以下比例准备各组分：
三羟甲基-氨基甲烷 300-400 mM；
柠檬酸 100-130 mM；
葡萄糖 35-45 mM；
海藻糖 260-300 mM；
维生素C 4-6 g/L；
还原型谷胱甘肽 4-6 mM；
牛血清白蛋白 8-12 g/L；
三磷酸腺苷 0.7-1.5 mM；
步骤二：将上述组分与双蒸水按比例混匀后，0.2μm 滤膜过滤，加入复合抗生素；
步骤三：按体积比15-25 %的比例，在步骤二得到的混合液中加入卵黄添加液，充分混匀，得到基础稀释液；
步骤四：基础稀释液配制好后，按甘油终体积浓度为12-16%的比例，加入甘油，得到冷冻稀释液；
步骤二中，加入复合抗生素，即加入0.05-0.055 g/L的泰乐菌素、0.27-0.28 g/L的庆大霉素、0.16-0.18 g/L的林可霉素以及0.3-0.35 g/L的奇霉素；
步骤三中，卵黄添加液由以下步骤制得：
将新鲜无病原菌鸡蛋经过双氯苯双胍己烷浸泡后抽取卵黄液，以质量体积比为0.035%加入十二烷基磺酸钠，15╳103 g离心1 h，吸取上清液经0.45μm滤膜过滤得到卵黄添加液。
4.根据权利要求3所述的制备方法制得的奶山羊冷冻精液冷冻稀释液。
5.奶山羊冷冻精液的稀释方法，其特征在于：
由以下步骤实现：
步骤一：制备基础稀释液：
（1）按以下比例准备各组分：
三羟甲基-氨基甲烷 300-400 mM；
柠檬酸 100-130 mM；
葡萄糖 35-45 mM；
海藻糖 260-300 mM；
维生素C 4-6 g/L；
还原型谷胱甘肽 4-6 mM；
牛血清白蛋白 8-12 g/L；
三磷酸腺苷 0.7-1.5 mM；
（2）将上述组分与双蒸水按比例混匀后，0.2μm 滤膜过滤，加入复合抗生素，即加入0.05-0.055 g/L的泰乐菌素、0.27-0.28 g/L的庆大霉素、0.16-0.18 g/L的林可霉素以及0.3-0.35 g/L的奇霉素；
（3）按体积比15-25 %的比例，在步骤二得到的混合液中加入卵黄添加液，充分混匀，得到基础稀释液；
卵黄添加液由以下步骤制得：
将新鲜无病原菌鸡蛋经过双氯苯双胍己烷浸泡后抽取卵黄液，以质量体积比为0.035%加入十二烷基磺酸钠，15╳103 g离心1 h，吸取上清液经0.45μm滤膜过滤得到卵黄添加液；
步骤二：制备冷冻稀释液：
基础稀释液配制好后，按甘油终体积浓度为12-16%的比例，加入甘油，得到冷冻稀释液；
步骤三：采用两步法稀释奶山羊精液并平衡：
（1）采集新鲜公羊精液，在37℃温度下对精子的表观活率、活率及密度进行质量评定：用带有刻度的集精杯计算每次采精体积；在显微镜100倍视野下观察鲜精的表观活率，分为0-5级，0级为没有波动，5级为快速漩涡状波动；在400倍视野下评定鲜精活率，将鲜精稀释1000倍后在血球计数板上计算精液密度；只有精液表观活率为5级，活率大于0.8且密度大于2.0×109 个/mL才能用于冷冻精液制作；
（2）等温加入基础稀释液，使稀释后精子密度为8×108 -10×108 个/mL，基础稀释液添加量为鲜精液的3-6倍，混匀后转移至冰箱冷藏室或4 ℃低温环境，1.5-2 h水浴冷却到0-4 ℃完成第一步稀释；
（3）在相同温度下以体积比1:1加入冷冻稀释液并混匀，此时混合精液密度为4×108 -5×108 个/mL，甘油浓度为6-8 %，完成第二步稀释，平衡时间2-6 h。
6.奶山羊冷冻精液细管冻精的制备方法，其特征在于：
由以下两步降温法实现：
步骤一：制备基础稀释液：
（1）按以下比例准备各组分：
三羟甲基-氨基甲烷 300-400 mM；
柠檬酸 100-130 mM；
葡萄糖 35-45 mM；
海藻糖 260-300 mM；
维生素C 4-6 g/L；
还原型谷胱甘肽 4-6 mM；
牛血清白蛋白 8-12 g/L；
三磷酸腺苷 0.7-1.5 mM；
（2）将上述组分与双蒸水按比例混匀后，0.2μm 滤膜过滤，加入复合抗生素，即加入0.05-0.055 g/L的泰乐菌素、0.27-0.28 g/L的庆大霉素、0.16-0.18 g/L的林可霉素以及0.3-0.35 g/L的奇霉素；
（3）按体积比15-25 %的比例，在步骤二得到的混合液中加入卵黄添加液，充分混匀，得到基础稀释液；
卵黄添加液由以下步骤制得：
将新鲜无病原菌鸡蛋经过双氯苯双胍己烷浸泡后抽取卵黄液，以质量体积比为0.035%加入十二烷基磺酸钠，15╳103 g离心1 h，吸取上清液经0.45μm滤膜过滤得到卵黄添加液；
步骤二：制备冷冻稀释液：
基础稀释液配制好后，按甘油终体积浓度为12-16%的比例，加入甘油，得到冷冻稀释液；
步骤三：采用两步法稀释奶山羊精液并平衡：
（1）采集新鲜公羊精液，在37℃温度下对精子的表观活率、活率及密度进行质量评定：用带有刻度的集精杯计算每次采精体积；在显微镜100倍视野下观察鲜精的表观活率，分为0-5级，0级为没有波动，5级为快速漩涡状波动；在400倍视野下评定鲜精活率，将鲜精稀释1000倍后在血球计数板上计算精液密度；只有精液表观活率为5级，活率大于0.8且密度大于2.0×109 个/mL才能用于冷冻精液制作；
（2）等温加入基础稀释液，使稀释后精子密度为8×108 -10×108 个/mL，基础稀释液添加量为鲜精液的3-6倍，混匀后转移至冰箱冷藏室或4℃低温环境，1.5-2 h水浴冷却到0-4℃完成第一步稀释；
（3）在相同温度下以体积比1:1加入冷冻稀释液并混匀，此时混合精液密度为4×108 -5×108 个/mL，甘油浓度为6-8 %，完成第二步稀释，平衡时间2-6 h；
步骤四：制备奶山羊冷冻精液细管冻精：
将稀释平衡后的精液在0-4℃温度下吸入0.25 mL细管中，用聚乙烯醇粉封口后，第一步降温即迅速将细管置于距离液氮表面4-5 cm的冷冻架上，熏蒸4-5 min，第二步降温即将细管投入到液氮中长期保存。
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