CN101322489A - 一种鹿x/y精子分离冷冻精液及其生产方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种鹿X/Y精子分离冷冻精液及其生产方法和应用。本发明提供了一种鹿X/Y精子分离冷冻精液，包括冷冻平衡液A，含12％甘油冷冻保护剂冷冻平衡液B和鹿X或Y精子分离冷冻精液。本发明使用TALP液保护鹿的鲜精，并且应用鹿X、Y精子DNA含量的差异，通过流式细胞方式分离X和Y精子，然后制成性别控制冷冻精液，其冷冻保存条件为－90℃处理60分钟。本发明得到的冷冻精液用于以人工授精方式或胚胎移植方式控制鹿产犊的性别，分离效率高，性别控制准确率可达88％以上，适用于产业化生产和养殖，从而大幅度提高鹿的养殖效应。

Description

一种鹿X/Y精子分离冷冻精液及其生产方法和应用
技术领域
本发明涉及一种哺乳动物X/Y精子分离技术，特别涉及一种鹿X/Y精子分离冷冻精液及其生产方法和应用。
背景技术
以家畜为主的冷冻精液、人工受精和体外受精技术广泛应用于生产繁育和生殖生物学研究。在正常情况下，鹿的子代繁育公母各占50％，但是在生产实际中，为了提高鹿的养殖效应，对于特定品系需要更多繁育母鹿(育种和扩群)或公鹿(商品鹿茸生产)，于是就需要通过分离精子来控制鹿的子代性别。此外，分离后的精子在授精前通常需要冷冻保存，而各个物种的不同，其对于pH值、冷冻缓冲液及冷冻处理方法的要求也不同，这对冷冻条件及其缓冲液提出了较高的要求。
CN1232231C公开了一种家畜X/Y精子分离的方法，该方法需要使用磷酸缓冲溶液洗涤精液，通过流式细胞分离机分离，其速度为3000个/秒。然而，使用该方法分离鹿的X/Y精子时，其分离速度、分离准确率、缓冲液使用、冷冻保存后的精子活力等方面仍有较大提高空间。
CN101112392A公开了一种底剂量家畜精液及其生产方法，该方法通过使用冷冻平衡液A(Tris-A)和添加了甘油的冷冻平衡液B(Tris-B)来处理多种家畜精液，通过多种动物精液生理特性研究，发现特定异种动物精子间的受精促进效果。该方法需要添加异种家畜的精液，使用该方法单独处理鹿的精子时，所得到的鹿精子的数量和活力均不能达到理想产业化应用的水平。
发明内容
本发明的目的是提供鹿X/Y精子分离冷冻精液及其生产及方法和应用，可以将鹿X/Y精子分离，并实现产业化生产和应用，从而控制鹿的子代性别。
本发明提供了一种鹿X/Y精子分离冷冻精液，包括冷冻平衡液A、冷冻平衡液B和鹿X或Y精子分离冷冻精液，其含量如下：
冷冻平衡液A   Tris-A 50％
冷冻平衡液B  含20％甘油冷冻保护剂的Tris-B 50％，其中：
鹿X或Y精子分离冷冻精液浓度为200-400万精子/0.25mL。
上述冷冻平衡液A，pH 6.8，由以下组分组成：
Tris三羟甲基氨基甲烷            291.7mM
柠檬酸                          95.1mM
果糖                            70.2mM
卵黄                            20％
超纯水；
并且，所述冷冻平衡液B，pH6.8，由以下组分组成：
Tris三羟甲基氨基甲烷           291.7mM
柠檬酸                         95.1mM
果糖                           70.2mM
卵黄                           20％
甘油                           20％
超纯水。
本发明还提供了上述的鹿X/Y精子分离冷冻精液的生产方法，包括下述步骤：
1)从健康的公鹿采集新鲜精液2-5mL(总精子数25-50亿个)，由于鹿的鲜精非常容易失去活力，因此需用TALP液保护。为抑制精液中细菌增殖用TALP液等倍稀释并添加适量抗生素(庆大霉素Gentamicin：0.8mg/mL，林可-奇霉素Linco-spectin：0.3mg/mL)，在18-20℃条件下保温，供X/Y精子分离使用。每份新鲜精液在该条件下可使用6-8小时；
2)使用精子密度-活力仪检测新鲜精液的浓度和活力，只有活力在80％以上的样品可用于分离处理。根据精液浓度折合体积取4亿精子离心去除精浆，添加10μg/mL Hochest 33342在24℃温水浴中染色30分钟；
3)鹿X/Y精子分离的DNA差异设定为2.8-3.0％，根据鹿XY精子DNA含量差别设定流式细胞分离机参数(第一相区初取精子喷流总数的70％/第二相区原精液死精率15％＝X/Y单性精子分离取率40％)，通过流式细胞分离机分离X和Y精子，使X/Y精子分离速度控制在4000-5000个/秒，X或Y精子分离纯度达到85-95％；
4)根据分离精子累计显示，取分离的X或Y精子2亿，下机后以2000转/5分钟进行离心处理，用冷冻平衡液A稀释到最终设计浓度的2倍，在4-5℃条件下放置60分钟；
5)冷冻平衡液A平衡后，添加等量的含20％甘油冷冻保护剂的冷冻平衡液B，在4℃冰箱平衡60分钟；
6)把分离X或Y精液在4℃条件下装入冷冻管，制成鹿X/Y精子分离冷冻精液。
7)因为冷冻保护液的效果不同，进一步将步骤6)制得的鹿X/Y精子分离冷冻精液装入0.25mL冷冻管，置入-90℃的氮蒸汽中处理60分钟，然后把精液管投入液化氮中保存。
上述鹿X/Y精子分离冷冻精液用于常规人工授精或手术人工授精方法，每只受体一次可输入200-400万分离精子，按照生产需要定向繁育公犊或母犊；或者，通过鹿X/Y精子分离冷冻精液生产性控胚胎，再进行胚胎移植加快优良个体的繁育速度。
本发明应用鹿X、Y精子DNA含量的差异，通过流式细胞方式分离X和Y精子，然后制成性别控制冷冻精液，以人工授精方式根据生产需要来控制鹿产犊的性别。本发明的方法通过添加TALP液来保护鹿的鲜精，有效的保护了其精子活力。其X/Y精子的分离速度可达4000-5000个/秒，分离效率高，使用本发明的产品人工授精的受胎率能够达到产业化应用的水平，其产犊的性别控制准确率可达88％以上。本发明的产品和方法能够适用于产业化生产和养殖，从而大幅度提高鹿的养殖效应。
具体实施方式
下面将结合具体实施方案对本发明的方法做更详细的说明。本领域技术人员应当理解，下述实施例均用于对本发明所要求保护的范围进行实例性的描述，以此概括本发明的各参数的相对范围，因而不能将之理解为对本发明的一种具体限制。
实施例1
鹿Y冷冻精液的制作和人工授精控制产犊性别：
1)从一只健康的马鹿(钻石1号)麻醉后，以电刺激法采集4mL、总精子数为40亿的新鲜精液，经检测，该精子活力为83％。由于鹿的鲜精非常容易失去活力，因此需用TALP液保护。使用TALP液等倍稀释并添加抗生素(庆大霉素Gentamicin：0.8mg/mL，林可-奇霉素Linco-spectin：0.3mg/mL)后在18-20℃条件下保温。使用精子密度-活力仪检测新鲜精液的浓度和活力，经检测，该精液的活力为85％，运回实验室供X/Y精子分离使用6小时。
2)根据精液浓度折合体积取4×2亿精子(供2台精子分离机使用)离心去除精浆，添加10μg/mL Hochest 33342在24℃温水浴中染色30分钟。
3)鹿X/Y精子分离的DNA差异设定为2.8-3.0％，根据鹿X、Y精子DNA含量差别设定精子流式细胞分离机(美国XY公司的SX-MoFlo流式细胞分离机)参数(第一相区初取精子喷流总数的70％/第二相区原精液死精率15％＝X/Y单性精子分离取率40％)，通过流式细胞分离机分离X和Y精子，使X/Y精子分离速度控制在4000-5000个/秒，Y精子分离纯度达到85-95％。
4)根据分离精子累计显示，取分离的Y精子2亿，下机后以2000转/5分钟进行离心处理，用显微镜-电脑精子记数法检测分离精子浓度，用Tris-A(冷冻平衡液A)稀释到最终设计浓度的2倍，在4-5℃条件下放置60分钟；其中，Tris-A(冷冻平衡液A)pH 6.8，由以下组分组成：
Tris三羟甲基氨基甲烷          291.7mM
柠檬酸                        95.1mM
果糖                          70.2mM
卵黄                          20％
超纯水。
5)Tris-A平衡后，添加等量的含20％甘油冷冻保护剂的Tris-B(冷冻平衡液B)，在4℃冰箱平衡60分钟；其中，Tris-B(冷冻平衡液B)，pH6.8，由以下组分组成：
Tris三羟甲基氨基甲烷          291.7mM
柠檬酸                        95.1mM
果糖                          70.2mM
卵黄                          20％
甘油                          20％
超纯水。
6)分离Y精液在4℃条件下装入0.25mL冷冻管，制成含200万精子的鹿性控冷冻精液；该样品供2台分离机使用6小时，制作鹿Y精子分离冷冻精液68支。
7)因冷冻保护液的效果不同，将装入0.25mL冷冻管的分离精液置入-90℃的氮蒸汽中处理60分钟；然后把冷冻管投入液化氮中保存。
该鹿Y精子分离冷冻精液以手术人工授精方法(每只受体一次可使用200万精子)，授精处理母鹿68只，受胎38只，产犊35只(流产3只)，其中公犊32只，性控准确率为92％。
实施例2
鹿X冷冻精液的制作和人工授精控制产犊性别：
1)从一只健康的马鹿(钻石3号)麻醉后，以电刺激法采集3mL、总精子数为24亿的新鲜精液，经检测，精子活力为80％。由于鹿的鲜精非常容易失去活力，因此需用TALP液保护。用TALP液等倍稀释并添加抗生素(庆大霉素Gentamicin：0.8mg/mL，林可-奇霉素Linco-spectin：0.3mg/mL)后在18-20℃条件下保温。使用精子密度-活力仪检测新鲜精液的浓度和活力，经检测，该精液的活力为85％，运回实验室供X/Y精子分离使用4小时。
2)根据精液浓度折合体积取4×2亿精子(供2台精子分离机使用)离心去除精浆，添加10μg/mLHochest33342在24℃温水浴中染色30分钟。
3)鹿X/Y精子分离的DNA差异设定为2.8-3.0％，根据鹿XY精子DNA含量差别设定精子流式细胞分离机(美国XY公司的SX-MoFlo流式细胞分离机)参数(第一相区初取精子喷流总数的70％/第二相区原精液死精率15％＝X/Y单性精子分离取率40％)，通过流式细胞分离机分离X和Y精子，使X/Y精子分离速度控制在4000-5000个/秒，X精子分离纯度达到85-95％。
4)根据分离精子累计显示，取分离的X精子按2亿，下机后以2000转/5分钟进行离心处理，用显微镜-电脑精子记数法检测分离精子浓度，用Tris-A(冷冻平衡液A)稀释到最终设计浓度的2倍，在4-5℃条件下放置60分钟；其中，Tris-A(冷冻平衡液A)pH 6.8，由以下组分组成：
Tris三羟甲基氨基甲烷           291.7mM
柠檬酸                         95.1mM
果糖                           70.2mM
卵黄                           20％
超纯水。
5)Tris-A平衡后，添加等量的含12-20％甘油冷冻保护剂的Tris-B(冷冻平衡液B)，在4℃冰箱平衡60分钟；其中，Tris-B(冷冻平衡液B)，pH6.8，由以下组分组成：
Tris三羟甲基氨基甲烷         291.7mM
柠檬酸                       95.1mM
果糖                         70.2mM
卵黄                         20％
甘油                         20％
超纯水。
6)分离X精液在4℃条件下装入0.25mL冷冻管，制成含400万精子的鹿性控冷冻精液；该样品供2台分离机使用3小时，制作鹿X精子分离冷冻精液28支。
7)因冷冻保护液的效果不同，将装入0.25mL冷冻管的分离精液置入-90℃的氮蒸汽中处理60分钟，然后把冷冻管投入液化氮中保存。
该鹿X精子分离冷冻精液以手术人工授精方法(每只受体一次可使用400万精子)，授精处理母鹿28只，受胎18只，产犊17只(流产1只)，其中母犊15只，性控准确率为88％。
此外，也可以通过鹿X/Y分离冷冻精液生产性控胚胎，再进行胚胎移植加快优良个体的繁育速度。
本发明应用鹿X、Y精子DNA含量的差异，通过流式细胞方式分离X和Y精子，然后制成性别控制冷冻精液，以人工授精方式根据生产需要来控制鹿产犊的性别。本发明的方法分离效率高，所得到的产品其产犊的性别控制准确率可达88％以上。本发明的产品和方法能够适用于产业化生产和养殖，从而大幅度提高鹿的养殖效应。

Claims (8)

1.一种鹿X/Y精子分离冷冻精液，包括冷冻平衡液A、冷冻平衡液B和鹿X或Y精子分离冷冻精液，其含量如下：
冷冻平衡液A   Tris-A 50％
冷冻平衡液B  含20％甘油冷冻保护剂的Tris-B 50％，其中：
鹿X或Y精子分离冷冻精液浓度为200-400万精子/0.25mL。
2.根据权利要求1所述的鹿X/Y精子分离冷冻精液，其特征在于：所述冷冻平衡液A，pH 6.8，由以下组分组成：
Tris三羟甲基氨基甲烷     291.7mM
柠檬酸                   95.1mM
果糖                     70.2mM
卵黄                     20％
超纯水；
并且，所述冷冻平衡液B，pH6.8，由以下组分组成：
Tris三羟甲基氨基甲烷     291.7mM
柠檬酸                   95.1mM
果糖                     70.2mM
卵黄                     20％
甘油                     20％
超纯水。
3.根据权利要求2所述的鹿X/Y精子分离冷冻精液的生产方法，包括下述步骤：
1)采集公鹿新鲜精液2-5mL(总精子数25-50亿个)，用TALP液等倍稀释并添加抗生素，在18-20℃条件下保温；
2)检测新鲜精液的浓度和活力，只有活力在80％以上的样品可用于分离处理，根据精液浓度折合体积取4亿精子离心去除精浆，添加10μg/mL Hochest33342在24℃温水浴中染色30分钟；
3)鹿X/Y精子分离的DNA差异设定为2.8-3.0％，根据鹿X、Y精子DNA含量差别设定流式细胞分离机参数，通过流式细胞分离机分离X和Y精子，使X/Y精子分离速度控制在4000-5000个/秒；
4)取分离的X或Y精子2亿，下机后以2000转/5分钟进行离心处理，用冷冻平衡液A稀释到最终设计浓度的2倍，在4-5℃条件下放置60分钟；
5)冷冻平衡液A平衡后，添加等量的含20％甘油冷冻保护剂的冷冻平衡液B，在4℃冰箱平衡60分钟；
6)把分离X或Y精液在4℃条件下装入冷冻管，制成鹿X/Y精子分离冷冻精液。
4.根据权利要求3的所述的生产方法，其特征在于：所述抗生素为庆大霉素0.8mg/mL，林可-奇霉素0.3mg/mL。
5.根据权利要求3的所述的生产方法，其特征在于：所述精子分离机参数为第一相区初取精子喷流总数的70％/第二相区原精液死精率15％＝X/Y单性精子分离取率40％。
6.根据权利要求3的所述的生产方法，进一步包括如下步骤：将步骤6)制得的鹿X/Y精子分离冷冻精液装入0.25mL冷冻管，置入-90℃的氮蒸汽中处理60分钟，然后把精液管投入液化氮中保存。
7.根据权利要求2的所述的鹿X/Y精子分离冷冻精液用于人工授精或生产性控胚胎再进行胚胎移植。
8.根据权利要求6所述的鹿X/Y精子分离冷冻精液用于人工授精或生产性控胚胎再进行胚胎移植，其特征在于：所述鹿X/Y分离冷冻精液人工授精剂量为200-400万精子/只或次。
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TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20090227

Address after: Hohhot City, the Inner Mongolia Autonomous Region county and Shengle economic Park Mengniu science and Technology Building 6 layer encoding post: 011517

Applicant after: Inner Mongolia Mengniu Dairy Industry (Group) Co., Ltd.

Address before: The Inner Mongolia Autonomous Region Hohhot city Helingeer Shengle economic Park encoding: 011517

Applicant before: Inner Mongolia Mengniu Dairy Industry (Group) Co., Ltd.

ASS Succession or assignment of patent right

Owner name: NEI MENGGU MENGNIU BREEDING BIOISYSTECH CO., LTD.

Free format text: FORMER OWNER: NEI MENGGU MENGNIU MILK( GROUP ) CO., LTD.

Effective date: 20090227

C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
C56 Change in the name or address of the patentee

Owner name: INNER MONGOLIA SEXING REPRODUCTIVE BIOTECHNOLOGY C

Free format text: FORMER NAME: INNER MONGOLIA MENGNIU BREEDING BIOTECHNOLOGY CO., LTD.

CP01 Change in the name or title of a patent holder

Address after: 011517 and the Inner Mongolia Autonomous Region County of Hohhot city Shengle Economic Zone Mengniu science and Technology Building 6 layer

Patentee after: Saikexing Reproductive Biotechnology CO., Ltd.

Address before: 011517 and the Inner Mongolia Autonomous Region County of Hohhot city Shengle Economic Zone Mengniu science and Technology Building 6 layer

Patentee before: Inner Mongolia Mengniu Dairy Industry (Group) Co., Ltd.

C56 Change in the name or address of the patentee

Owner name: INNER MONGOLIA SKXING REPRODUCTIVE BIOTECHNOLOGY (

Free format text: FORMER NAME: INNER MONGOLIA SEXING REPRODUCTIVE BIOTECHNOLOGY CO., LTD.

CP03 Change of name, title or address

Address after: 011517 the Inner Mongolia Autonomous Region Helingeer County of Hohhot city Shengle economic Park gathering service area management committee building 4 New South Building Room 4422

Patentee after: Inner Mongolia saikexing reproductive biotechnology (Group) Limited by Share Ltd

Address before: 011517 and the Inner Mongolia Autonomous Region County of Hohhot city Shengle Economic Zone Mengniu science and Technology Building 6 layer

Patentee before: Saikexing Reproductive Biotechnology CO., Ltd.