KR101396925B1

KR101396925B1 - 루코스포리디움 속 미생물 유래 결빙 방지 단백질을 이용한 생식 세포 또는 생체 조직의 동결 보존 방법

Info

Publication number: KR101396925B1
Application number: KR1020120129015A
Authority: KR
Inventors: 김대영; 황유진; 김민수; 김학준
Original assignee: 가천의과학대학교 산학협력단; 한국해양과학기술원
Priority date: 2011-11-14
Filing date: 2012-11-14
Publication date: 2014-05-20
Also published as: KR20130069378A

Abstract

본 발명은 루코스포리디움 속 미생물 유래 결빙방지 단백질 (Antifreeze protein, AFP)을 이용한 생식 세포 또는 생체 조직의 동결 보존 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 루코스포리디움 속 미생물 유래 AFP 단백질은 생식 세포 또는 생체 조직의 동결 시 생존력을 높여주는 우수한 효과를 가지고 있어, 생식 세포 또는 생체 조직의 동결 보존용 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

루코스포리디움 속 미생물 유래 결빙 방지 단백질을 이용한 생식 세포 또는 생체 조직의 동결 보존 방법 {Cryopreservation technique using antifreeze protein from Leucosporidium sp.}

본 발명은 루코스포리디움 속 미생물 유래 결빙방지 단백질 (Antifreeze protein, AFP)을 이용한 생식 세포 또는 생체 조직의 동결 보존 방법에 관한 것이다.

얼음 결합 단백질 (Ice-binding protein)이라 불리는 결빙방지 단백질 (Antifreeze protein, 이하 AFP)은 극지 및 혹한지에 서식하는 생물에서 합성된다 (Yu and Lu (2011) PLoS One 6: e20445). AFP는 얼음에 결합하여 얼음 결정의 성장을 억제함으로써, 생물이 냉해를 극복하여 생존할 수 있도록 하는 단백질이다. 이 단백질과 얼음은 수소결합을 통해 결합된다. AFP가 결합되지 않은 얼음의 경우 세포에 손상을 줄 수 있지만, AFP가 결합된 얼음에서는 세포에 손상을 입힐 얼음 결정이 생기지 않기 때문에 극한 저온에서 생물이 생존할 수 있게 된다. 따라서 AFP 결합 얼음 상태의 세포와 그렇지 않은 세포는 큰 차이를 보인다 (Garnham et al. (2011) Proc Natl Acad Sci U S A 108: 7363-7367). 일반적으로 얼음은 재결정화(recrystallization) 과정을 거치는데, 이때 형성되는 큰 얼음 결정에 의해 세포들이 손상되기도 한다. AFP의 주요 역할은 얼음의 결정 형성 및 재결정화를 억제하여 동결시킬 세포의 손상을 감소시키는 것이다 (Rubinsky et al. (2010) Neurosci Res 67: 256-259). AFP는 얼음 결정 형성을 억제시키기 때문에 물의 어는점과 녹는점에서 차이가 형성되는데 이 현상을 열적 이력(thermal hysteresis) 활성이라고 하며 AFP의 활성을 정량적으로 나타내는 지표가 된다. 열적 이력은 나노리터 오스모미터 (nanoliter osmometer)라는 장치로 측정할 수 있다 (Kristiansen et al. (2011) Insect Biochem Mol Biol 41: 109-117).

한편, 동결 보존 기술(cryopreservation technique)은 실험관 수정, 복제, 형질전환과 같은 배아기술(embryo technology)이 발달하면서 필요성이 대두되었다. 그러나 현재까지 개발된 다양한 동결 보존 기술은 세포 내 기관의 붕괴, 세포 내 골격 손상, 세포사, 배아의 생존 능력 감소를 이끄는 심각한 형태학적, 생화학적인 변화를 유발시켰다.

상기와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여 노력한 결과, 본 발명자는 극지에 서식하는 루코스포리디움 속 (Leucosporidium sp.) 미생물로부터 유래한 AFP 단백질을 이용하여 생체 세포 또는 생체 조직을 동결시키는 경우 생체 세포 또는 생체 조직의 생존력이 높아짐을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 루코스포리디움 속 미생물 유래 AFP 단백질을 포함하는 생식 세포 또는 생체 조직의 동결 보존용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 루코스포리디움 속 미생물 유래 AFP 단백질을 이용한 생식 세포 또는 생체 조직의 동결 보존 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 루코스포리디움 속 미생물 유래 AFP 단백질을 포함하는 생식 세포 또는 생체 조직의 동결 보존용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은, 루코스포리디움 속 미생물 유래 AFP 단백질을 이용한 생식 세포 또는 생체 조직의 동결 보존 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 루코스포리디움 속 미생물 유래 AFP 단백질은 생식 세포 또는 생체 조직의 동결 시 생존력을 높여주는 우수한 효과를 가지고 있어, 생식 세포 또는 생체 조직의 동결 보존용 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 Comet 분석법을 통하여 해동된 정자의 DNA 손상 정도를 확인한 도이다 (좌측 위: AFP 0μg/ml; 우측 위: AFP 0.01μg/ml; 좌측 아래: AFP 0.1μg/ml; 우측 아래: AFP 1μg/ml).
도 2는 SYBR14/PI 형광염색을 이용하여 해동된 정자의 원형질막 손상 정도를 확인한 도이다.
도 3은 FITC-PNA/PI 형광염색을 이용하여 해동된 정자의 원형질막 손상 정도를 확인한 도이다.
도 4는 정상 심장 판막 조직 및 보존제에 24시간 동안 보관한 심장 판막 조직의 H&E 염색 결과이다 (좌: 정상 심장 판막, 우: 보존제에 24시간 동안 보관한 심장 판막).
도 5는 정상 심장 판막 조직 및 보존제에 24시간 동안 보관한 심장 판막 조직의 TUNEL 염색 결과이다 (좌: 정상 심장 판막, 우: 보존제에 24시간 동안 보관한 심장 판막).

본 발명은 루코스포리디움 속 미생물 유래 결빙방지 단백질 (AFP)을 포함하는 생식 세포 또는 생체 조직의 동결 보존용 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 루코스포리디움 속 미생물 유래 AFP 단백질은 한국 해양 연구원 부설 극지 연구소(Korea Ocean Polar Research Institute, KOPRI)가 북극 스발바드 군도의 호수 얼음을 채집한 후 평판배지에서 순수 분리하고 ITS1(ribosomal internal transcribed spacer 1), ITS2 및 5.8S 유전자 분석결과(Connell et al. (2008) Microb Ecol 56, 448-459)에 따라 루코스포리디움 속 AY30으로 명명한 효모에서 유래한 것으로, 바람직하게는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. 상기 "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 1로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다.

본 발명의 AFP 단백질은 이의 천연형 아미노산 서열을 갖는 단백질뿐만 아니라 이의 아미노산 서열 변이체가 또한 본 발명의 범위에 포함된다. AFP 단백질의 변이체란 AFP 천연 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 단백질을 의미한다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다 (H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다. 경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아세틸화(acetylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파렌실화(farnesylation) 등으로 수식(modification)될 수도 있다.

상기 동결 보존용 조성물은 모데나 B (Modena B) 배지를 희석제로 더 포함할 수 있으며, 바람직하게는 글루코오스, EDTA, 시트르산 나트륨, 탄산수소나트륨, 트리스, 시트르산, 시스테인, BSA, 카나마이신 설페이트 등을 포함하는 변형된 모데나 B (modified Modena B) 배지를 희석제로 더 포함할 수 있다.

본 발명에서 생식 세포는 생식체(gamete) 즉, 정자 또는 난자의 선조체를 포함하며, 이에 한정하지 않지만, 예를 들어 원식생식세포(primordial germ cell), 배아생식세포(embryonic germ cell), 정소생식세포(testicular germ cell), 정원줄기세포(spermatogonial stem cell) 및 생식선줄기세포(germline stem cell)를 포함하며, 바람직하게는 정자이다. 또한, 본 발명에서 생체 조직은 그 기원에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 루코스포리디움 속 미생물 유래 AFP 단백질은 생식 세포 또는 생체 조직의 동결 시 생존력을 높여주는 우수한 효과를 가지고 있다.

또한, 본 발명은

(a) 인간을 제외한 동물의 정액을 채취하는 단계;

(b) 상기 채취된 정액을 희석제를 사용하여 희석하는 단계;

(c) 상기 희석된 정액을 원심분리하여 상층액을 제거하고 정자 침전물을 수득하는 단계; 및

(d) 상기 정자 침전물을 희석한 후, 루코스포리디움 속 미생물 유래 결빙 방지 단백질 (AFP)을 첨가하고 냉각하여 동결된 정자를 수득하는 단계;를 포함하는, 루코스포리디움 속 미생물 유래 AFP 단백질을 이용한 생식 세포 또는 생체 조직의 동결 보존 방법을 제공한다.

상기 (b) 단계의 희석제는 이에 제한되지 않으나 기본 희석제인 변형된 모데나 B (modified-Modena B) 배지, 냉각 희석제인 LEY 희석제 (extender) 및 동결 희석제인 LEYGO 희석제로 구성된 것이 바람직하다.

상기 변형된 모데나 B 배지는 이에 제한되지 않으나 글루코오스, EDTA, 시트르산 나트륨, 탄산수소나트륨, 트리스, 시트르산, 시스테인, BSA 및 카나마이신 설페이트로 구성된 것이 바람직하다.

상기 (d) 단계의 냉각은 이에 제한되지 않으나 생식 세포 또는 생체 조직의 안전한 동결을 위하여 액체 질소 증기로 1차 냉각 후, 액체 질소로 2차 냉각하는 것이 바람직하다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정 되는 것은 아니다.

실시예 1. 정액 채취 및 동결

미니피그의 정액을 채취 (강원대학교)하여 정자가 다량 포함된 분획을 50mL의 플라스틱 원심관에 받았으며, 채취된 정자가 급격한 온도 변화를 받지 않도록 하기 위하여 아이스박스에 밀봉된 상태로 운반하였다.

상기 미니피그의 정액을 희석하기 위하여 기본 희석제로 modified-Modena B, 냉각 희석제로 LEY extender, 동결 희석제로 LEYGO extender를 사용하였으며, 보다 구체적인 희석제의 조성은 modified-Modena B(20ml: Glucose 6g, EDTA 0.45g, Sodium citrate 1.38g, Sodium bicarbonate 0.2g, Tris 1g, Citric acid 0.5g, Cystein 0.01g, BSA 0.8g, Kanamycin sulfate 0.06g; pH 7), LEY extender(80% 310mM b-lactose(v/v), 20% Egg yolk(v/v); Kanamycin sulfate(100mg/ml)), 및 LEYGO extender(89.5% LEY extender(v/v), 9% Glycerol(v/v), 1.5% OEP(v/v), 100mM Trehalose(w/v), Various concentration of AFP 0mM, 0.1mM, 0.01mM, 0.001mM)로 구성된다. 상기 희석제를 이용하여 정액을 희석한 후, 17℃에서 2040RPM으로 10분간 원심 분리하여 상층액을 제거하였다. 수득된 정자 침전물을 modified Modena B 50ml로 다시 희석한 후 원심 분리하여 상층액을 제거하고, 다시 modified Modena B 20ml로 희석한 후 원심 분리하여 상층액을 제거하였다. 최종 정자 침전물은 1.5x10⁹ sperm/ml의 농도가 되도록 LEY extender로 희석시키고 조심스럽게 흔들어 섞은 후 얼음물에서 1시간 동안 정치시켜 급격한 온도 변화에 의한 손상을 감소시켰다. 여기에 루코스포리디움 속 AY30 유래 AFP 단백질을 첨가한 LEYGO extender를 첨가하여 1.0x10⁹ sperm/ml의 최종 농도가 되게 한 후, 액체 질소 증기로 1차 냉각 후 액체 질소로 2차 냉각하였다.

실험예 1. 해동된 정자의 운동성 측정

상기 실시예 1에서 루코스포리디움 속 미생물 유래 AFP 단백질의 첨가가 동결된 세포에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 동결된 정자를 해동하여 정자의 운동성을 측정하였다. 먼저, 온수조의 온도를 50℃, modified Modena B의 온도를 37℃로 조절한 뒤, 동결된 정자가 들어 있는 스트로우를 50℃의 온수조에서 5초간 녹인 후, 37℃의 modified Modena B에 희석시켰다. 이를 원심분리를 이용해 상층액을 제거하는 방법으로 세정하였으며, 20 micron 두께의 standard count chamber 슬라이드에 3 mL씩 떨어뜨렸다. 이를 100x 현미경을 통해 관찰하였으며, HELOS (Hamilton Thorne, Beverly, MA, USA)를 통해 10곳 이상의 지점을 관찰하여 통계를 구하였다. 정자의 운동성은 CASA(computer-assisted analysis of sperm motility)를 통해 곡선속도(VCL), 선속도(VSL), 평균속도(VAP), 선형성계수(LIN), 밀도(DANCE), 평균밀도(MeanDANCE) 등을 측정하여 계산하였다. 그 결과를 표 1에 나타내었다.

분류	Motility(%)	Progressive(%)	VAP(μm/s)	VSL(μm/s)	VCL(μm/s)	ALH (μm)
Fresh	80.4±2.5^c	71.2±2.2^c	54.48±1.88^c	33.84±1.15^bc	100.62±4.67^a	6.20±0.23^b
Control	68.2±2.4^a	61.7±2.3^a	64.97±3.25^b	42.97±2.69^a	100.78±2.38^a	5.62±0.30^a
AFP(0.01mg/ml)	74.6±2.6^d	68.0±3.2^c	58.16±1.51^ac	33.78±0.75^bc	99.92±3.51^a	6.40±0.21^b
AFP(0.1mg/ml)	67.8±3.9^a	61.4±4.4^a	60.86±5.51^ab	37.44±6.23^ab	99.58±4.92^a	6.08±0.35^ab
AFP(1mg/ml)	47.0±1.6^b	40.6±1.7^b	52.42±1.06^c	28.06±0.67^c	91.54±3.20^b	6.42±0.24^b
p- Value	p < 0.001	p < 0.001	p < 0.001	p < 0.001	p < 0.01	p < 0.001

표 1에 나타낸 바와 같이, 루코스포리디움 속 미생물 유래 AFP 단백질을 배지에 첨가하여 동결 보존할 경우, 해동된 정자의 운동성이 크게 증가함을 확인하였다.

실험예 2. 해동된 정자의 DNA 손상 정도 측정

상기 실시예 1에서 루코스포리디움 속 미생물 유래 AFP 단백질의 첨가가 동결된 세포의 DNA 손상에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 상기 실험예 1과 동일한 방법으로 해동된 정자를 Comet 분석법을 통해 DNA 손상 정도를 확인하였다. 보다 구체적으로, 상기 실험예 1에서 수득한 해동된 정자 샘플을 4℃에서 2시간 동안 2% 1-머캅토에탄올 용액에서 배양한 후, 원심분리(400 x g, 5분)하여 Ca² ⁺-, Mg² ⁺-프리 PBS (phosphate buffered saline)에 재부유시켰다. 상기 정자 샘플을 0.7 아가로오스로 희석하여 슬라이드에 코팅한 뒤, 슬라이드를 CometAssay Lysis solution(Trevigen, Maryland, USA)에 담가 4℃에서 2시간 동안 처리한 후, RNase와 proteinase K 용액에 4시간 동안 처리하여 RNA와 단백질을 제거하였다. 이를 알칼리 용액 (NaOH, 200mM EDTA; pH13)으로 30분 동안 처리한 뒤, 용해된 슬라이드를 12V, 300mA로 1시간 동안 전기영동 하였다. 그 후 SYBR green 형광 염색제로 5분 동안 반응시켜 형광현미경으로 슬라이드를 관찰하였다. 그 결과를 도 1 및 표 2에 나타내었다.

분류	Tail DNA (%)	Tail Length (μm)	Olive Moment
Control	7.1±8.1^ab	2.2±2.4	0.75±0.87^ab
AFP(0.01mg/ml)	6.5±7.5^a	1.9±1.5	0.59±0.63^a
AFP(0.1mg/ml)	11.6±7.5^ab	2.5±1.4	1.04±0.72^ab
AFP(1mg/ml)	13.4±9.6^b	3.0±1.8	1.29±0.92^b
p-Value	0.0235	0.324	0.0313

도 1 및 표 2에 나타낸 바와 같이, 루코스포리디움 속 미생물 유래 AFP 단백질을 배지에 첨가하여 동결 보존할 경우, 해동된 정자의 DNA 손상 정도가 크게 감소함을 확인하였다.

실험예 3. 해동된 정자의 원형질막 손상 정도 측정

상기 실시예 1에서 루코스포리디움 속 미생물 유래 AFP 단백질의 첨가가 동결된 세포의 원형질막 손상에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다. 먼저, 상기 실시예 1에서 수득한 해동된 정자 샘플을 BTS extender로 희석한 뒤 1 x 10⁶ spermatozoa/mL의 농도로 맞추었다. 상기 정자 샘플을 500 μl씩 분주한 후, SYBR14와 PI를 각각 100 nM과 12 μM이 최종 농도가 되도록 섞어주었다. 그 후 FC 500 series cytometer (Beckman Coulter, Inc., Miami, FL, USA)를 이용하여 유세포 분석을 수행하였으며, CXP program (Beckman Coulter, Inc.)을 사용하여 유세포 자료를 분석하였다. 그 결과를 도 2 및 표 3에 나타내었다.

분류	Dead (PI+ SYBR-)	Dying (PI+ SYBR+)	Live (PI- SYBR+)
Control	51.9 ± 5.5^a	9.3 ± 5.0^ab	38.8 ± 0.8^c
AFP(0.01mg/ml)	45.2 ± 7.6^a	18.4 ± 7.3^a	36.4 ± 0.9^d
AFP(0.1mg/ml)	47.8 ± 19.0^a	18.8 ± 19.3^a	33.4 ± 0.7^a
AFP(1mg/ml)	72.0 ± 0.9^b	0.46 ± 0.1^b	27.5 ± 0.9^b
p-Value	p < 0.001	p < 0.001	p < 0.001

도 2 및 표 3에 나타낸 바와 같이, 루코스포리디움 속 미생물 유래 AFP 단백질을 배지에 첨가하여 동결 보존할 경우, 해동된 정자의 원형질막 손상 정도가 크게 감소함을 확인하였다.

실험예 4. 해동된 정자의 첨체 손상 정도 측정

상기 실시예 1에서 루코스포리디움 속 미생물 유래 AFP 단백질의 첨가가 동결된 세포의 첨체 손상에 미치는 영향을 확인하기 위하여, Fluorescein isothiocyanate (FITC-PNA; Lectin from Arachis hypogaea, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)/ PI 형광염색기법을 수행하였다. 먼저, 상기 실시예 1에서 수득한 해동된 정자 샘플을 1 x 10⁶ spermatozoa/mL의 농도로 500 μl 분주한 후, FITC-PNA (50 μg/mL) 10 μl와 PI (750μM)를 섞고, 37 ℃에서 5분 동안 배양 후 유세포분석을 수행하였다. 그 결과를 도 3 및 표 4에 나타내었다.

분류	Acrosomal membrane
분류	PI+/PNA- (%)	PI+/ PNA+ (%)	PI-/ PNA- (%)	PI-/ PNA+ (%)
Control	23.1 ± 3.9^b	42.49 ± 3.5^c	22.9 ± 0.5^c	11.4 ± 0.4^c
AFP(0.01mg/ml)	17.9 ± 0.8^a	51.9 ± 1.1^d	21.0 ± 0.4^d	9.2 ± 0.6^d
AFP(0.1mg/ml)	20.8 ± 1.1^ab	46.6 ± 0.9^a	21.9 ± 0.5^a	10.6 ± 0.3^a
AFP(1mg/ml)	27.7 ± 0.6^c	33.9 ± 0.8^b	30.8 ± 0.5^b	7.5 ± 0.2^b
p-Value	p < 0.001	p < 0.001	p < 0.001	p < 0.001

도 3 및 표 4에 나타낸 바와 같이, 루코스포리디움 속 미생물 유래 AFP 단백질을 배지에 첨가하여 동결 보존할 경우, 해동된 정자의 첨체 손상 정도가 크게 감소함을 확인하였다.

실험예 5. 개의 심장 판막 조직 보존에 미치는 영향 검증

상기 실시예 1에서 제조한 희석제에 개의 심장 판막 조직을 보존하였을 때 조직에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 실험견을 안락사한 후, 정상 판막 조직을 분리하고, 이를 보존제 (희석제)에 24시간 동안 보관한 후, H&E 염색 및 TUNEL 염색을 수행하였다. 그 결과를 각각 도 4 및 도 5에 나타내었다.

도 4 및 도 5에 나타낸 바와 같이, 정상 심장 판막과 보존제에서 24시간 동안 보관한 심장 판막은 조직 병리학적 소견상 두 집단은 큰 차이를 보이지 않았다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 루코스포리디움 속 미생물 유래 결빙 방지 단백질(Antifreeze protein, AFP)을 포함하는, 생식 세포 또는 생체 조직의 동결 보존용 조성물.
삭제
제 1항에 있어서, 상기 조성물은 희석제로 모데나 B (Modena B) 배지를 포함하는 것을 특징으로 하는, 동결 보존용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 생식 세포는 원식생식세포(primordial germ cell), 배아생식세포(embryonic germ cell), 정소생식세포(testicular germ cell), 정원줄기세포(spermatogonial stem cell) 및 생식선줄기세포(germline stem cell)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 동결 보존용 조성물.
제 4항에 있어서, 상기 생식 세포는 정자인 것을 특징으로 하는, 동결 보존용 조성물.
(a) 인간을 제외한 동물의 정액을 채취하는 단계;
(b) 상기 채취된 정액을 희석제를 사용하여 희석하는 단계;
(c) 상기 희석된 정액을 원심분리하여 상층액을 제거하고 정자 침전물을 수득하는 단계; 및
(d) 상기 정자 침전물을 희석한 후, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 루코스포리디움 속 미생물 유래 결빙 방지 단백질(AFP)을 첨가하고 냉각하여 동결된 정자를 수득하는 단계;를 포함하는, 루코스포리디움 속 미생물 유래 AFP 단백질을 이용한 생식 세포 또는 생체 조직의 동결 보존 방법.
삭제
삭제
제 6항에 있어서 상기 (d) 단계의 냉각은 액체 질소 증기로 1차 냉각 후, 액체 질소로 2차 냉각하는 것을 특징으로 하는, 생식 세포 또는 생체 조직의 동결 보존 방법.