KR20000016268A - 가문비나무 모충 부동화 단백질, 유전자 및 이들을 사용하는방법 - Google Patents

가문비나무 모충 부동화 단백질, 유전자 및 이들을 사용하는방법 Download PDF

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마이클 지. 티신코
미트라 라하바드
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퀸즈 유니버시티 엣 킹스턴
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Abstract

한 부류의 열력, 부동화 단백질(THPs)은 가문비나무 모충 코리스토네우라 푸미페라나(C. fumiferana)를 포함하여 코리스토네우라 종(Choristoneura sp.)으로부터 단리되고 정제된다. 본 발명은 이들 부동화 단백질을 코딩시키는 핵산을 제공한다. 본 발명은 또한 이들 부동화 단백질에 반응하는 항체를 제공한다. 본 발명은 이들 부동화 단백질을 용액에 첨가함으로써 수용액의 빙점을 감소시키는 방법을 또한 포함한다.

Description

가문비나무 모충 부동화 단백질, 유전자 및 이들을 사용하는 방법
배경 기술
현대에는 냉장 및 특히 냉동은 생물학적인 물질을 저장하는데 일반화되고 바람직한 수단이 되었다. 냉장은 샘플의 일부 중요한 특성을 보존시키지만, 나머지 부분은 느리지만 상당한 비율로 계속해서 악화된다. 냉동 저장은 대부분의 이러한 악화를 멈추게 할 수 있지만, 냉동과 해동의 조합은 다른 중요한 특성을 파괴시키는 다른 변화를 야기시킨다.
현대의 세계에서는, 냉동 식품은 사람의 일상적인 음식물의 주된 버팀줄이 되었다. 수요하는 소비자의 기호에 충분한 고품질의 제품을 보장하기 위해, 특히 냉동 야채, 및 아이스크림과 같은 냉동 디저트가 식품 가공업자에 의해 광범위한 연구 대상이었다. 재결정화가 냉동 식품의 맛과 감촉에 실질적인 부정적 영향을 미칠 수 있다는 것이 현재 알려져 있다. 서리가 없는 냉동기의 출현은 이러한 상황을 악화시켰으며, 수송 동안 온도 변동과 보다 통상적으로 관련되었다. 영하 이외의 온도 또는 심지어 지속적인 냉동 온도에서 비교적 짧은 기간 후에, 많은 냉동 식품은 덜 바람직하게 되거나 악화되어 사람의 소모에 전체적으로 부적합하게 된다.
다양한 기술이 재결정화와 관련된 손상을 완화시키기 위해 수행되었지만, 제한된 성공만이 달성되었으며, 상당한 문제점을 남겼다. 종종, 냉동 식품의 처리 방법에 대한 변형은 이들의 품질, 색, 맛 및/또는 감촉에 현저한 영향을 미친다. 더욱이, 추가의 처리는 매우 비싸며 시간 소모가 많아서 비경제적인 기술이다. 유사한 어려움은 식료품에 첨가제를 혼입시키는 것과 관련되었다.
치료 약제, 혈장, 조직 배양에 사용하기 위한 포유류 세포 등과 같은 생물학에 있어서, 냉동은 광범위한 손상을 야기시킬 수 있다. 예를 들어, 냉동 공정 그 자체는 대부분의 진핵 세포를 죽이며, 심지어 한번의 냉동과 해동 주기에 제공된 세포는 크게 감소된 생존력을 나타낸다. 살아있는 세포의 감손된 기능은 기관 이식에 대한 결함 뿐만 아니라 조직 냉동 저장에 또한 유력하다. 유사하게는, 식물에 대한 동결 및 그 밖의 냉동 손상은 농업 분야에서 심각한 문제를 나타낸다. 결국, 약제는 요구되는 엄격한 온도 조건하에서 지속되지 않은 경우에 비효과적이거나, 심지어 위험하다.
단백질 중재 열력(TH)의 첫 번째 설명이 약 30년 전에 테네브리오 몰리터(Tenebrio molitor)[참고문헌: Grimstone,et al.,Philos. Trans. B253:343 (1968)]에 주지되어 있지만, 이들 열력 단백질(THP)을 정제시키기 위한 다수의 연구는 혈임파 활성을 설명하는데 충분한 TH를 갖는 순수한 분획을 수득하는데 실패하였다[참고문헌: Grimstone, et al., (1968); Patterson ＆ Duman, J.Exp. Zool. 210: 361(1979); Schneppenheim ＆ TheedeComp. Biochem. Physiol. 67B:561 (1980); Tomchaney,et al.,Biochemistry 21:716 (1982); Paterson Duman J.Exp. Zool. 219:381 (1982); and Horwath,et al.,Eur. J. Entomol. 93:419 (1996)]. 이들 단백질의 동종성은 입증되지 않았으며, 이들은 서로 아미노산 조성물 및 본원에 보고된 조성물에 있어서 차이를 보인다.
냉동 식품의 저장 및 생물의 생존력을 포함하여, 저온에서 유기 물질의 보존 특성을 개선시키는데 적합한 새로운 기술 및 조성물에 대한 요구가 여전히 존재한다. 이상적으로는, 이들 기술 및 조성물은 저렴하지만, 사람의 소비 또는 체내 치료 용도에 완전하게 안전하며 적합할 것이다. 제빙 처리에서와 같이, 빙점을 저하시키거나 비유기계에서 냉동을 억제하는데 적합한 신규한 기술 및 조성물에 대한 요건이 여전히 존재한다. 본 발명은 이들 및 그 밖의 요건을 충족시킨다.
발명의 요약
동부의 가문비나무 모충, 코리스토네우라(Choristoneura), 및 서부의 가문비나무 모충, 코리스토네우라 옥시덴탈리스(Christoneura occidentalis)는 북아메리카 삼림의 내한 해충이다. 동결에 대한 방어는 이들의 이들의 혈임파의 열력(TH) 활성인데, 이러한 활성은 곤충이 얼음 또는 얼음 빙정형성제의 존재하에 이들의 빙점을 낮춘다. 이러한 활성은 얼음을 함유하는 용액의 빙점과 용융점의 온도차(℃)로서 정량화된다. 가문비나무 해충의 유충로부터의 혈임파는 4℃ 보다 큰 빙점 강하를 나타낸다.
본 발명은 서열 번호: 1의 핵산과 같은 코리스토네우라 유충에서의 열력의 원인이 되는 단백질을 코딩시키는 핵산 분자를 제공한다. 본 발명은 단백질이 다음과 같이 정의될 수 있는 부동화 단백질을 코딩시키는 단리된 핵산을 또한 제공한다: 계산된 분자량이 7 내지 15kDa이며; 약 1mg/mL의 농도에서 열력 활성이 1.5℃이며; 서열 번호: 2 및 서열 번호: 3으로 구성된 군으로부터 선택된 이들의 항원 단편 또는 부동화 단백질에 대하여 배양된 항체에 특이적으로 결합되거나 서열 번호: 2 및 서열 번호: 3으로 구성된 군으로부터 선택된 부동화 단백질에 대한 아미노산 서열 동일성이 60% 이상인 부동화 단백질. 바람직한 구체예에서, 단리된 핵산은 계산된 분자량이 8 내지 12kDa인 단백질을 코딩시킨다. 바람직한 구체예에서, 핵산은 약 1mg/mL의 농도에서 열력 활성이 2℃ 보다 큰 단백질을 코딩시킨다. 바람직한 구체예에서, 핵산은 서열 번호: 2 및 서열 번호: 3으로 구성된 군으로부터 선택된 부동화 단백질에 80% 이상이 상동인 서열을 갖는 단백질을 코딩시킨다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 서열 번호: 2 및 서열 번호: 3에 나타난 서열을 갖는 단백질을 코딩시키는 핵산을 제공한다. 또 다른 구체예에서, 단리된 핵산은 곤충에서 발견된 부동화 단백질을 코딩시키며, 바람직한 구체예에서 곤충은 코리스토네우라 종이다. 본 발명은 엄격한 조건하에서 서열 번호: 1에 특이적으로 혼성되는 단리된 핵산을 또한 제공한다. 본 발명은 서열 번호: 2 및 서열 번호: 3으로 구성된 군으로부터 선택된 부동화 단백질에 대하여 유도된 항체에 특이적으로 결합하는 정제된 코리스토네우라 종의 부동화 단백질로부터 단리된 핵산을 또한 제공한다.
본 발명은 본 발명의 핵산으로부터 유도된 재조합 단백질을 포함하여 THP 단백질을 제공한다. THP 전구체 단백질(서열 번호: 2)은 가문비나무 모충 THP의 cDNA 및 상응하는 아미노산 서열을 나타내는 성숙한 THP 단백질(서열 번호: 3)을 발생시키기 위해 분열되는 N-말단 18 잔기 시그날 서열(서열 번호: 11)을 갖는다(도 2 참조). 전구체 단백질(서열 번호: 2)의 분자량은 약 11,000 달톤(daltons)이며, 성숙한 THP (서열 번호: 2)의 분자량은 약 9,060 달톤이다. 본 발명은 계산된 분자량이 7 내지 15kDa이며; 약 1mg/mL의 농도에서 열력 활성이 약 1.5℃ 보다 크며; 서열 번호: 2 및 서열 번호: 3으로 구성된 군으로부터 선택된 부동화 단백질로 배양된 항체에 특이적으로 결합하거나 서열 번호: 2 및 서열 번호: 3으로 구성된 군으로부터 선택된 부동화 단백질에 대한 아미노산 서열 동일성이 60% 이상인 단리된 부동화 단백질을 제공한다. 바람직한 구체예에서, 부동화 단백질은 곤충에서 발견될 수 있으며; 바람직한 구체예에서 곤충은 코리스토네우라 종이다. 바람직한 구체예에서, 부동화 단백질의 열력 활성은 약 1mg/mL의 농도에서 약 2℃ 보다 크다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 부동화 단백질은 서열 번호: 2 및 서열 번호: 3으로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명은 본 발명의 단백질에 대하여 배양된 항체 및 본 발명의 단백질에 결합하는 항체를 제공한다. 본 발명은 면역학적 반응성 조건하에서 서열 번호: 2 및 서열 번호: 3을 포함하는 부동화 단백질에 특이적으로 면역반응하는 항체를 제공한다. 본 발명은 면역학적 반응성 조건하에서 청구항 1의 핵산에 의해 코딩된 단백질을 포함하는 부동화 단백질에 특이적으로 면역반응하는 항체를 또한 제공한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 형질전환된 효모, 박테리아 및 트랜스 유전자적 유기체가 제공된다. 다수의 냉동 식료품은 지속된 영하 온도 또는 반복된 냉동과 해동의 주기로 인해 얼음 결정체가 형성된다. 본 발명의 THP의 존재는 이들 식료품을 보다 입에 맞도록 보다 긴 저장 수명을 제공할 것이다. 트랜스 유전자적 동물 및 식물은 빙점하의 온도에서 보다 우수하게 살아남을 수 있는 것으로 간주된다. 본 발명은 엄격한 조건하에서 청구항 1의 서열 번호: 1 또는 핵산에 특이적으로 혼성되는 외인성 핵산 서열이 도입되고, 유기체가 외인성 핵산을 부동화 단백질로 번역되는 유기체를 제공한다. 유기체로부터 외부에서 발현되는 부동화 단백질로 번역되는 외인성 핵산 서열을 갖는 유기체가 또한 제공된다. 바람직한 구체예에서, 유기체는 어류이다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 유기체는 염수 환경에서 유지된 어류이거나 일종의 샐모니대(Salmonidae) 과의 어류이다. 그 밖의 바람직한 구체예에서, 유기체는 식물, 진균류, 효모 또는 박테리아일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 유기체가 효모인 경우,토룰로프시스 홀밀(Torulopsis holmil), 사카로미세스 프라질리스(Saccharomyces fragilis), 사카로미세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae), 사카로미세스 락티스(Saccharomyces lactis)및칸디다 슈도트로피칼리스(Candida pseudotropicalis)로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 유기체가 박테리아인 경우,에스케리챠 콜리(Escherichia coli), 스트렙토코커스 크레모리스(Streptococus cremoris), 스트렙토코커스 락티스(Streptococcus lactis), 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus), 루코노스톡 시트로보룸(Leuconostoc citrovorum), 루코노스톡 메센터로이데스(Leuconostoc mesenteroides), 락토바실러스 악시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 락티스(Lactobacillus lactis), 비피도박테리움 비피둠(Bifidobacterium bifidum), 비피도박테리움 브리이브(Bifidobacterium breve) 및 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum)으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명은 부동화 단백질을 수용액에 첨가하는 것을 포함하여 수용액의 빙점을 감소시키는 방법을 제공한다. 바람직한 구체예에서, 상기 방법은 청구항 1의 핵산에 의해 코딩된 부동화 단백질을 수용액에 첨가하는 것을 포함한다. 그 밖의 바람직한 구체예에서, 수용액은 유기체에 적용되며; 부동화 단백질은 재조합 수단에 의해 생성되며; 부동화 단백질은 청구항 13 또는 청구항 14의 항체에 특이적으로 결합할 수 있으며; 부동화 단백질은 서열 번호: 2 및 서열 번호: 3으로 구성된 군으로부터 선택되며; 부동화 단백질은 서열 번호: 1의 핵산에 특이적으로 혼성되는 핵산 분자에 의해 코딩된다.
또한, 수용액에 본 발명의 THP의 첨가는 수송중에 기관 및 그 밖의 생물체를 보다 잘 보존할 수 있는 것으로 생각된다.
제빙 처리에서와 같이, 비유기계에서의 냉동을 억제하거나 빙점을 감소시키는데 적합한 신규한 기술 및 조성물에 대한 요구는 또한 여전히 존재한다.
본 발명의 특성 및 장점은 명세서의 나머지 부분, 도면 및 특허청구의 범위를 참조로 하여 추가로 이해될 수 있다.
도면의 간단한 설명
도 1은 세파덱스(Sephadex) G-75 칼럼상에서 이전에 분류된 가문비나무 모충의 제 2 영 유충(instar larvae)으로부터 단백질의 혼합물로 로딩된 HPLC C18 역상 칼럼의 용리 프로파일이다.
도 2는 가문비나무 모충 THP의 cDNA 및 상응하는 아미노산 서열을 나타내는 도면이다.
도 3a는 가문비나무 모충의 제 2 영 유충의 미정제 추출액으로부터 형성된 얼음의 현미경사진이다. 도 3b는 바다에 서식하는 대구로부터 타입 III THP 단백질(어류에서, THP 단백질은 또한 AFP 단백질로서 공지됨) 약 5mg/ml를 함유하는 용액으로부터 형성된 얼음의 사진이다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 신규한 부류의 부동화 단백질(THP)을 코딩시키는 단리된 핵산 서열에 관한 것이다. 천연 THP 유전자를 수득하는 방법은코리스토네우라 푸미레라나(C. fumiferana)및코리스토네우라 옥시덴탈리스(C. occidentalis)와 같은코리스토네우라종으로부터 유전자 라이브러리를 구조화시키거나 수득하는 단계, 원하는 유전자를 검출하여 단리시키는 단계, 이를 클로닝시키는 단계 및 적합한 숙주 세포내에서 이를 발현시키는 단계 및 이어서 발현된 단백질을 정제시키는 단계를 포함한다. 천연 단백질은 개질 없이 사용되거나 이의 TH 활성에 영향을 미치지 않으면서 다양한 방법으로 개질될 수 있다.
본원에 인용된 모든 공보, 특허 및 특허출원은 모두 참조로 인용된다.
휴(Hew) 등은 코리스토네우라 푸미페라나로부터 THP의 미정제 제조물이 어류헤미트리프테루스 아메리카누스(Hemitripterus americanus)(바다 갈가마귀)로부터의 THP와 이의 높은 시스틴 함량, 이의 유사한 분자량(~13kDa) 및 바다 갈가마귀 THP와 이의 항원성 가교 반응성에 있어서 유사하다고 보고했다. 본 발명의 신규한코리스토네우라 푸미페라나THP는 적어도 두가지 점에 있어서 휴 등에 의해 기술된 단백질과 상이하다. 먼저, 분자량은 약 9kDa이다. 둘째, 다클론성 바다 갈가마귀 항혈청과 가교 반응하지 않는다는 것이다[참고문헌: Slaughter, D., et al., Antifreeze proteins from the sea raven,Hemitripterus americanus, J. Biol. Chem.256:2022-2026(1981); gift from Dr. Choy Hew, University of Toronto]. 이와 같이, 휴 등의 제조물은 본 발명의 신규한 THP와는 다르다.
본 발명의 THP는 현재까지 알려진 어떠한 정제된 부동화 단백질보다 활성적이다. 본 발명의 THP에 의해 제공된 빙점 강하는 문헌[Patterson, J.,et al., The role of the thermal hysteresis factor inTenebrio molitorlarvae,J. Exp. Biol.74:37-45 (1978)]에 기술된 바와 같이, 파터슨에 의해 제조된 바와 같은테네브리오 몰리터에 의해 또는 어류 AFP(THP)에 의해 제공된 빙점 보다도 수배 더 크다.
그러나, 어류 부동화 단백질과 유사하게,코리스토네우라THP는 흡착-억제 메카니즘에 의해 작용하는 것으로 보인다. THP의 존재하에 얼음 결정은 비평형 빙점이 초과될 때까지 성장하는 것을 중단시킨다. 그러한 점에서, 얼음 결정은 빙정형성제로부터 파열하여 주로 a-축을 따라서 얼음의 고형 매스를 형성시키며 얼음 전면은 브로드하며서 스무스하다. 이와 대조적으로, 일단 빙점이 어류 AFP의 존재하에 초과되면, 무수한 얼음 침상체는 c-축을 따라서 그리고 평행하게 파열한다.
또한, 어류 AFP와 유사하게[참고문헌: DeVries,Annu, Rev. Physiol. 45:245 (1983)], TH 활성과 THP 농도의 관계는 쌍곡선 관계이다. 그러나, THP의 존재하에 형성된 얼음 결정은 이들이 이들 표면의 현저한 만곡을 갖는다는 점에 있어서 유다르다. 이와는 대조적으로, 어류 AFP 타입 I 및 III에 의해 발생된 얼음 결정은 편평하고 잘 규정된 한 면을 갖는 육각 쌍뿔이다.
정제되고 발현된 THP 단백질이 수용액에 직접 첨가되어 빙점을 감소시키거나, 또 다른 구체예에서, 부동화 단백질을 발현시키는 형질전환된 유기체가 냉동 디저트와 같이 냉동 저장될 품목에 첨가될 수 있다. 더욱 또 다른 구체예에서, 형질전환된 유기체, 즉, 어류, 식물 및 효모는 THP 단백질을 세포 밖으로 발현시킬 필요가 없지만 THP 유전자 및 세포내 단백질의 존재는 빙점에서도 살아남을 수 있는 증가된 능력을 제공한다. 예를 들어, 형질전환된 유기체는 염수 어류일 수 있다. 형질전환된 염수 어류는 일종의 살모니대과, 넙치무리, 은대구 또는 어떠한 또는 충분한 수준의 부동화 단백질도 갖지 않는 어떠한 식용의 염수 종을 포함할 수 있다. THP 서열로 형질전환된 식물은 포도, 및 카놀라(canola), 곡물, 감귤류 및 사탕수수와 같은 오일 종자 식물을 포함할 수 있다.
I. 정의
본원에서 사용되는 용어 "항체"는 하나 이상의 면역글로불린 유전자에 의해 실질적으로 코딩된 폴리펩티드, 또는 특이적으로 결합하여 분석물(항원)을 인지하는 이들의 단편을 의미한다. 인지된 면역글로불린 유전자는 무수한 면역글로불린 가변 영역 유전자 뿐만 아니라 카파, 람다, 알파, 감마, 델타, 엡실론 및 뮤 일정 영역 유전자를 포함한다. 경쇄는 카파 또는 람다로서 분류된다. 중쇄는 면역글로불린 부류, IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE를 정의하는 감마, 뮤, 알파, 델타 또는 엡실론으로서 각각 분류된다.
예시적인 면역글로불린(항체) 구조 단위체는 테트라머를 포함한다. 각각의 테트라머는 두 개의 동일한 쌍의 폴리펩티드 사슬로 구성되는데, 각각의 쌍은 하나의 "경쇄"(약 25kD) 및 하나의 "중쇄"(약 50-70kD)를 갖는다. 각각의 사슬의 N-말단은 항원 인지의 주된 원인이 되는 약 100 내지 110 또는 그 이상의 아미노산의 가변 영역을 규정한다. 용어 "가변 경쇄(VL)" 및 "가변 중쇄(VH)"는 이들의 경쇄 및 중쇄를 각각 언급한다.
항체는 예를 들어 손상되지 않은 면역글로불린, 또는 다양한 펩티다아제로 침지에 의해 생성된 다수의 잘 특성화된 단편으로서 존재한다. 이와 같이, 예를 들어, 펩신은 경첩 영역에서 이황화물 연결 아래의 항체를 침지시켜서 그 자체가 이황화물 결합에 의해 VH-CH1에 결합된 경쇄인 Fab의 다이머 F(ab)'2를 생성시킨다. F(ab)'2는 온화한 조건하에서 감소되어 경첩 영역에서의 이황화물 결합을 끊음으로써 F(ab)'2다이머를 Fab' 모노머로 전환시킬 수 있다. Fab' 모노머는 본질적으로 경첩 영역의 부분을 갖는 Fab이다[참고문헌: Fundamental Immunology, 3rd Ed., W.E. Paul, ed., Raven Press, N.Y.(1993)]. 다양한 항체 단편이 손상되지 않은 항체의 침지에 의해 규정되지만, 당업자는 그러한 단편이 화학적으로 또는 재조합 DNA 방법론을 사용하여 처음부터 합성될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 이와 같이, 본원에서 사용된 용어 항체는 전체 항체의 개질에 의해 생성된 항체 단편 또는 재조합 DNA 방법론(예를 들어, 단일 사슬 Fv)을 사용하여 처음부터 합성된 항체 단편을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "부동화 단백질 항체"는 본 발명의 부동화 단백질 또는 이들의 서열을 특이적으로 결합시키는 항체 또는 항체 단편이다.
본원에서 사용되는 용어 "부동화 단백질"은코리스토네우라 푸미페라나또는코리스토네우라 옥시덴탈리스와 같은코리스토네우라종과 같은 일부 변온성 유기체, 및 물의 빙점을 비속일성적으로 감소시키는 널리 공지된 특성을 갖는테네브리오 몰리터가루진드기 및 식물의 체액에서 발견된 단백질을 언급한다. THP는 "열력 단백질"로서 또한 공지되어 있다. 본원에서 사용되는 용어 "부동화 단백질" 또는 "THP"는 천연 부동화 단백질과 실질적으로 유사한 단백질 서열을 가지며 부동화 폴리펩티드의 특성을 보유하는 화학적으로 합성되고 재조합적으로 생성된 폴리펩티드를 포함한다.
본원에서 사용되는 "수용액의 빙점을 감소시키는"이라는 표현은 얼음 결정이 형성되는 수용액의 온도를 낮추는 것을 언급한다. 빙점의 감소는 수용액에서 빙점 및 이의 농도를 감소시키는데 사용된 조성물 모두에 의존한다. 부동화 조성물이 수용액에 첨가됨에 따라서 빙점 강하는 특성적인 농도가 달성될 때까지 감소한다. 수용액에 에틸렌 글리콜과 같은 부동화 화학물질의 추가의 첨가는 부동화 조성물의 불용해성을 초래하거나 혼합물의 빙점을 감소시키는 역할을 할 것이다. 한편, 본 발명의 추가의 첨가는 용액의 감소된 빙점에 영향을 미치지 않는다.
THP 단백질을 갖는 용액의 빙점은 얼음 결정 빙정형성제를 함유하며 얼음의 고형 매스인 샘플이 측정되는 온도로서 정의된다. 얼음 결정은 자발적으로 형성되거나 얼음 빙정형성제로부터 팽창될 수 있다. 빙정형성제 없이 얼음의 고형 매스의 자발적인 형성은 전형적으로 THP의 "과냉 능력"으로 불린다. 얼음 형성 처리를 일으키는 얼음 빙정형성제의 부재 때문에, 과냉은 매우 낮은 온도에서 일어날 수 있다.
얼음 결정 형성을 가시적으로 조사하는 것 이외에, 열력 검정은 용액의 빙점과 용융점 사이의 차를 측정할 수 있다. 용액의 용융점은 용액중에 남겨진 단지 하나의 얼음 결정만이 존재하는 온도이다(하기, TH 활성에 관한 보다 완전한 설명 참조).
재조합 단백질과 관련하여 표현 "외부적으로 발현된"은 단백질을 합성하고 세포외 매트릭스 내로 이동시키는 형질전환된 세포의 능력을 언급하는 것이다. 세포외 매트릭스는 다세포 유기체, 박테리아 육즙 또는 조직 배양기 중의 세포들 사이의 간질성 공간일 수 있다. 박테리아에 대해, 외부 발현은 또한 박테리아의 페리플라즘 내로의 재조합 단백질의 발현을 포함할 수 있다. 외부 발현은 임의의 수단, 예를 들어 분비성 및 운반성 소포, 막 단백질로서의 발현 등에 의해 이루어질 수 있다.
본 발명과 관련하여 용어 "서열 동일성", "서열 유사성" 및 "상동성"은 2개의 펩티드 서열이 디폴트 갭 중량을 사용하여 프로그램 GAP 또는 BESTFIT에 의해서와 같이 최적으로 정렬될 때, 40% 이상의 서열 동일성, 바람직하게는 50% 이상의 서열 동일성, 가장 바람직하게는 60% 이상의 서열 동일성을 가짐을 의미한다. "퍼센트 아미노산 서열 동일성"은 최적으로 정렬될 때에 대략적으로 지정된 백분율의 동일한 아미노산을 갖는 2개의 폴리펩티드의 아미노산 서열의 비교를 언급하는 것이다. 바람직하게는, 동일하지 않은 잔기 부분은 보존된 아미노산 치환에 의해 달라진다. 예를 들어, 하전 또는 극성과 같은 화학적 성질이 유사한 아미노산의 치환은 또한 단백질의 성질에 영향을 미치지 않는다. 치환기의 예로는 아스파라긴에 대한 글루타민 또는 아스파르트산에 대한 글루탐산이 있다.
용어 "면역학적 반응성 조건"은 항체가 항원에 결합할 수 있는 환경을 의미한다. 전형적으로, 이것은 면역학적 결합 검정이다.
용어 "단리된"은, 핵산 또는 단백질에 적용되는 경우, 핵산 또는 단백질이 본질적으로 자연 상태에서 관련된 다른 세포 성분을 함유하지 않는 것을 나타낸다. 이러한 상태는 건조 용액 또는 수용액일 수도 있지만, 동질 상태인 것이 바람직하다. 순도 및 동질성은 전형적으로, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 또는 고성능 액체 크로마토그래피와 같은 분석 화학적 기술을 사용하여 결정된다. 제조물 중에 존재하는 주된 종인 단백질은 실질적으로 정제된다.
특히, 단리된 부동성 단백질 유전자는 유전자에 플랭킹되고 부동성 단백질과는 상이한 단백질을 코딩시키는 개방 리딩 프레임으로부터 선택된다. 용어 "정제된"은 핵산 또는 단백질이 전기영동 겔에서 본질적으로 하나의 띠를 유발시킴을 나타낸다. 특히, 이것은 핵산 또는 단백질이 85% 이상 순수하고, 더욱 바람직하게는 95% 이상 순수하고, 가장 바람직하게는 99% 이상 순수함을 의미한다.
용어 "핵산 분자" 또는 "핵산 서열"은 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태로 존재하는 데옥시리보누클레오티드 또는 리보누클레오티드 및 이들의 중합체를 의미한다. 특별히 제한하지 않는 한은, 상기 용어는 기준 핵산으로서 유사한 결합 특성을 갖고 천연 발생 누클레오티드와 유사한 방식으로 대사되는 천연 누클레오티드의 공지된 유사체를 함유하는 핵산을 포함한다. 다른식으로 제시하지 않는 한은, 특정 핵산 서열은 또한 보존적으로 변형된 이들의 변이체 (예를 들어, 변성 코돈 치환) 및 상보적 서열, 및 구체적으로 제시된 서열을 함축적으로 포함한다. 특히, 변성 코돈 치환은 1종 이상의 선택된 (또는 모든) 코돈의 제 3 부분이 혼합된 염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 발생시킴으로써 달성될 수 있다 [참고문헌 : Batzer et al., Nucleic Acids Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); Rossolini et al., Nol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)]. 용어 "핵산"은 유전자, cDNA, 및 유전에 의해 코딩된 mRNA와 상호교환적으로 사용된다.
용어 "외인성 핵산"은 천연적으로 결합되지 않고/않거나, 핵산 또는 단백질이 전형적으로 자연적으로 발견되는 세포 또는 세포 환경과는 상이한 세포 또는 세포 환경 중에 도입되고/되거나 이러한 환경 중에서 발현되는 핵산에 결찰되거나, 클로닝되거나, 단리되는 핵산을 나타내는 것이 일반적이다. 상기 용어는 핵산이 발현되는 세포형과는 상이한 유기체 또는 세포형으로부터 원래 수득되는 핵산, 및 또한 핵산이 발현되는 세포주와 동일한 세포주로부터 얻어지는 핵산을 둘 모두 포함한다.
용어 "핵산 서열 코딩"은 특이적 단백질 또는 펩티드의 일차 아미노산 서열, 또는 트랜스 작용 조절제에 대한 결합 부위를 코딩시키는 rRNA, tRNA 또는 mRNA와 같은 구조적 RNA에 대한 서열 정보를 함유하는 핵산을 의미한다. 상기 용어는 특히, 특이적 숙주 세포에서 코돈 선호도에 따르도록 도입될 수 있는 천연 서열(들)의 변성 코돈(즉, 단일 아미노산을 코딩시키는 상이한 코돈)을 포함한다.
용어 "재조합 수단"은 단백질을 단리시키는 기술을 의미하며, cDNA 서열은 확인되고 발현 인자 내로 삽입되는 단백질을 코딩시킨다. 인자는 세포 내로 도입되고, 세포는 단백질을 발현시킨다. 재조합 수단은 또한, 융합 단백질의 발현, 단백질의 구조적 발현 또는 단백질의 유도성 발현을 위한 하나의 인자 내로 상이한 공급원으로부터 코딩 또는 프로모터 DNA를 결찰시키는 것을 포함한다.
단백질 또는 펩티드를 언급할 때에, 용어 "항체에 특이적으로 또는 선택적으로 결합된" 또는 "특이적으로 면역 반응하는"은 단백질 및 다른 생물제제의 이종성 집단의 존재하에 단백질의 존재를 결정하는 결합 반응을 의미한다. 따라서, 지정된 면역 검정 조건하에서, 특정화된 항체는 특정 단백질에 결합하고, 샘플 중에 존재하는 다른 단백질에는 상당한 양으로 결합하지 않는다. 이러한 조건하에서의 항체에 대한 특이적 결합은 특정 단백질에 대한 특이성에 대해 선택된 항체를 필요로 한다. 예를 들어, 본 발명의 THP에 대해 또는 서열 번호: 2 또는 서열 번호: 3으로 표시되는 부분적으로 코딩된 서열에 대해 제기되는 항체는 전장 단백질과 특이적으로 면역 반응하고, 다형태 변이체를 제외한 다른 단백질과는 반응하지 않도록 선택될 수 있다. 하기 기술되는 바와 같이, 다양한 면역 검정 포맷이 특정 단백질과 특이적으로 반응하는 항체를 선택하도록 사용될 수 있다. 예를 들어, 고상 ELISA 면역 검정은 단백질과 특이적으로 면역 반응하는 단클론성 항체를 선택하도록 일상적으로 사용된다. 문헌[Harlow and Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Mannual, Cold Spring Harbor Publications, New York ("Harlow and Lane")]에는, 특이적 면역반응성을 결정하기 위해 사용될 수 있는 면역 검정 포맷 및 조건이 기술되어 있다. 대표적으로, 특이적 또는 선택적 반응은 백그라운드 시그널 또는 노이즈의 2배 이상, 더욱 대표적으로는 10 내지 100배일 것이다.
용어 "특이적 혼성화"는 표적 서열이 전체 세포 DNA 또는 RNA의 제조물 중에 존재하는 경우에 특정 표적 DNA 또는 RNA 서열에 혼성되거나, 중복되거나, 결합하는 핵산 프로브를 의미한다. "상보적" 또는 "표적" 핵산 서열은 핵산 프로브에 선택적으로 혼성되는 핵산 서열을 의미한다. 바람직한 조건은, 예를 들어 프로브의 길이, 기본 조성, 및 프로브 상의 미스매치의 수 및 이들의 위치에 의존하고, 종종 실험적으로 결정되어야 한다. 핵산 프로브 디자인 및 어닐링 조건은 예를 들어, 본원에 참고문헌으로 인용된 샘브룩(Sambrook) 등의 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Mannual (2nd ED.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989) ("Sambrook")], 또는 문헌[Current Protocols In Molecular Biology, F. Ausubel et al., ed. Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (1987) ("Ausubel")]에 기술되어 있다.
써던 및 노던 혼성화와 같은 핵산 혼성화 실험과 관련하여 "엄격한 혼성화" 및 "엄격한 혼성화 세척 조건"은 서열 의존성이며, 상이한 환경 파라미터하에 상이하다. 핵산의 혼성화에 대한 확장된 가이드는 문헌[Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology -- Hybridization and stratagy of nucleic acid probe assays", Elsevier, New York.]에 개시되어 있다. 일반적으로, 고도로 엄격한 혼성화 및 세척 조건은 규정된 이온 강도 및 pH에서 특이적 서열에 대한 열적 융점(Tm)보다 약 5℃ 더 낮도록 선택된다. Tm은 규정된 이온 강도 및 pH하에, 표적 서열의 50%가 완전히 매치된 프로브에 혼성되는 온도이다. 매우 업격한 조건은 특정 프로브에 대한 Tm과 동일해지도록 선택된다. 써던 또는 노던 블롯에서 필터상의 상보성 잔기가 100개 보다 많은 상보적 핵산의 혼성화를 위한 엄격한 혼성화 조건의 일례는 42℃에서 1㎎의 헤파린과 함께 50% 포르말린이며, 혼성화는 밤새 수행된다. 고도로 엄격한 세척 조건은 약 15분 동안 72℃에서 0.15 M NaCl이다. 엄격한 세척 조건의 일례는 15분 동안 65℃에서 0.2xSSC이다 [참조예 : 샘브룩의 SSC 완충액의 설명]. 종종, 고도로 엄격한 세척은 백그라운드 프로브 시그널을 제거하기 위해 낮은 엄격성 세척에 의해 진행된다. 예를 들어 100개 보다 많은 누클레오티드의 듀플렉스에 대한 매질 엄격성 세척의 일례는 15분 동안 45℃에서 1xSSC이다. 예를 들어 100개 보다 많은 누클레오티드의 듀플렉스에 대한 낮은 엄격성 세척의 일례는 15분 동안 40℃에서 4-6xSSC이다. 일반적으로, 특정 혼성화 검정에서 비관련 프로브에 대해 관찰된 것보다 2배 이상인 시그널 대 노이즈는 특이적 혼성화의 검출을 나타낸다. 엄격한 조건하에서 서로 혼성화되지 않는 핵산은 코딩되는 폴리펩티드가 실질적으로 동일한 경우에도 여전히 동일하다. 이것은 예를 들어, 핵산의 복제물이 유전적 코딩에 의해 허용되는 최대 코돈 퇴화를 사용하여 발생하는 경우에 일어난다.
용어 "열력 활성" 또는 "TH 활성"은 얼음을 함유하는 용액의 빙점과 융점 사이의 온도차(℃)를 변동시키는 능력을 의미한다. 바람직하게는, TH 활성은 문헌[Lawson ＆ Semler, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 88:9919 (1991)]에 설명된 방법에 따라 나노리터 오스모미터에서 얼음 결정 형성을 관찰함으로써 측정된다. 대안적으로, TH 활성은 문헌[deVries, Methods in Enzymology, Vol. 127, Packer (ed.), Academic Press, New York (1986)]에 기술된 방법 또는 이들의 변형된 방법에 따라 측정될 수 있다.
예를 들어, 본 발명에서, 1㎎/㎖에서의 혈임파로부터의 THP인, 씨. 푸미페라나(C. fumiferana) 또는 씨. 옥시덴탈리스(C. occidentalis)와 같은 천연 코리스토네우라 종(Choristoneura sp.)의 TH 활성은 약 4℃보다 더 높다. 1㎎/㎖에서 본 발명의 재조합 THP의 TH 활성은 약 4℃ 이하이다. 더욱 바람직하게는, TH 활성은 약 3℃보다 낮다. 가장 바람직하게는, TH 활성은 1.5 내지 3℃이다. 천연 THP와 재조합 THP의 TH 활성의 작은 차이는 박테리아 유도 재조합 단백질에서 최적화되지 않은 폴딩으로 인한 것이로 추정된다. 바람직하게 폴딩되는 경우에, 재조합 THP의 TH 활성은 천연 THP의 TH 활성과 유사할 것으로 예측된다.
II. THP를 코딩시키는 핵산
A. 일반적 기술
RNA, cDNA, 게놈 DNA, 또는 유전적 재조합물의 하이브리드 중 어느 것일 수도 있는 본 발명의 핵산 조성물은 천연 공급원으로부터 단리될 수 있고, 생체내에서 합성될 수 있다. 본 발명의 핵산은 형질전환된 세포 중에, 형질전환된 세포 용해물 중에, 또는 부분적으로 정제되거나 실질적으로 정제된 형태로 존재할 수 있다.
라이브러리의 발생, 발현 인자로의 서브클로닝, 프로브의 표지화, DNA 혼성화 등과 같은 부동화 단백질을 코딩시키는 유전자의 핵산 조작 기술이 또한 일반적으로 샘브룩의 문헌에 기술되어 있다.
핵산과 단백질은 당분야의 전문가에게는 공지된 다양한 수단으로 검출되고 정량화된다. 이러한 수단에는 분광분석법, 방사성 분석법, 전기영동법, 모세관 전기영동법, 고성능 액체크로마토그래피(HPLC), 박층크로마토그래피(TLC), 과확산 크로마토그래피등과 같은 생화학적 분석방법, 및 유체 또는 겔 침강소 반응, 면역확산법(단일 또는 이중), 면역전기영동법, 방사성면역검정법(RIAs), 효소 결합 면역 흡착 검정법(ELISAs), 면역형광검정법등과 같은 다양한 면역학적 방법이 포함된다. 이러한 핵산 검정은 써던 분석, 노던 블롯, 겔 전기영동법, PCR(등록), 방사성 표지화, 신틸레이션 카운팅(scintillation counting) 및 친화성 크로마토그래피와 같은 공지된 방법으로 수행된다.
B. THP를 코딩시키는 핵산의 분리
전체 DNA 또는 mRNA를 분리하는 방법은 기술분야의 전문가에게는 공지되어 있다. 예를 들어, 핵산을 분리 및 정제하는 방법은 문헌[LABORATORY TECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY: HYBRIDIZATION WITH NUCLEIC ACID PROBES,Part I, Theory and Nucleic Acid Preparation, P. Tijssen, ed. Elsevier, N.Y.(1993)("Tijissen")]의 제 3장에 상세히 기재되어 있다.
1. DNA 라이브러리의 제조 및 스크리닝
본 발명의 부동화 단백질을 코딩시키는 DNA 서열을 분리하는 다양한 방법이 있다. 예를 들어, DNA는 본원에 기재된 서열 또는 서브서열(서열 번호: 4 또는 5)에 상보적인 서열을 지니는 표지된 올리고누클레오티드 프로브를 사용함으로써 게놈 또는 cDNA 라이브러리로부터 분리될 수 있다. 이러한 프로브는 혼성화 검정에 직접 사용되어 THP 이소형을 코딩시키는 DNA를 분리시킬 수 있다. 또한, 프로브는 PCR(등록)과 같은 증폭기술에 사용되도록 설계될 수 있으며, THP를 코딩시키는 DNA가 PCR(등록: 하기 참조)과 같은 방법에 의해 분리될 수 있다.
cDNA 라이브러리를 제조하기 위해서, mRNA를 코리스토네우라 종(Choristoneura sp.) 유충 또는 조직 배양물중에서 성장한 유출 세포로부터 분리하여, 당분야에 공지된 방법에 따라 mRNA로부터 역전사시키고 벡터내로 삽입시켰다. 이러한 벡터는 재조합 숙주내로 형질감염되어 증식되고, 스크리닝되어 클로닝된다. cDNA 라이브러리를 제조하고 스크리닝하는 방법은 공지되어 있다[참고문헌: Gubler and Hoffman, Gene 25: 263-269, (1983) and Sambrook].
게놈성 라이브러리를 제조하기 위해서, 전체 DNA를 공지된 방법으로 유충으로부터 추출하여 정제하였다(참조예: Sambrook). 적절한 크기의 DNA는 기계적인 전단 또는 효소분해와 같은 공지된 방법으로 생성되어, 예를 들어 약 12 내지 20kb의 DNA 단편을 형성시킨다. 이러한 단편은 바람직하지 않은 크기들로부터 구배 원심분리에 의해 분리되어, 박테리오파아지-λ 또는 그 밖의 벡터에 삽입된다. 이러한 벡터 및 파아지는 샘브룩(Sambrook)에 기재된 바와 같이 시험관내 충전된다. 재조합 파아지는 문헌[Benton ＆ Davis, Science, 196:180(1977)]에 기재된 바와 같이 플라크 혼성화에 의해 분석된다. 콜로니 혼성화는 문헌[M. Grunstein,et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 72:3961-3965)1975)]에 일반적으로 기재된 바와 같이 수행된다.
THP를 코딩시키는 DNA는 써던 블롯상에서 핵산 프로브, 예를 들어, 서열 번호: 4, 서열 번호: 5, 서열 번호: 13, 서열 번호: 14, 서열 번호: 15 또는 서열 번호: 16으로 혼성화되는 능력에 의해서 cDNA 또는 게놈성 라이브러리에서 동정될 수 있다. 일단 동정되면, 이러한 DNA 영역은 당업자라면 알 수 있는 표준 방법에 의해 분리된다. 또한, 부동화 단백질을 코딩시키는 RNA는 노턴 블롯에서 핵산 프로브에 혼성화되는 RNA의 능력에 의해 동정될 수 있다(참조: 샘브룩).
프로브로 사용하기 위한 올리고누클레오티드는 문헌[Beaucage and Carruther]에 기재된 고형상 포스포르아미디트 트리에스테르 방법에 따라 문헌[Needham-VanDevanter, D.R.,et al., Nucleic Acids Res. 12:6159-6168(1984)]에 기재된 자동화된 합성기를 사용함으로써 화학적으로 합성된다. 올리고누클레오티드의 정제는 문헌[Pearson, J.D. and Regnier, F.E.,J. Chrom.255:137-149(1983)]에 기재된 음이온 교환 HPLC 또는 본래의 아크릴아미드 겔 전기영동법에 의해 수행된다. 합성 올리고누클레오티드의 서열은 문헌[Maxam, A.M. and Gilbert, W., METHODS IN ENZYMOLOGY, 65:499-560, (Grossman, L. and Moldave, D., eds.), Academic Press, New York(1980)]의 화학적 분해방법을 사용함으로써 확인될 수 있다.
당업자에게 공지된 그 밖의 방법이 또한 부동화 단백질을 코딩시키는 DNA를 분리하는데 사용될 수 있다. 이러한 방법에 관해서는 특이적 단백질 분자를 코딩시키는 DNA의 분리에 이용될 수 있는 그밖의 설명에 대한 샘브룩 및 아우수벨(Sambrook and Ausubel)의 문헌을 참조하면 된다.
2. THP를 코딩시키는 핵산의 증폭
핵산서열(서열 번호: 1) 및 단백질 서열 정보(서열 번호: 2 및 서열 번호: 3)은 가문비나무 모충 THP와 같은 부동화 단백질 서열을 동정하는데 사용될 수 있는 PCR 프라이머를 설계하는데 사용될 수 있다. 서열 번호: 4와 서열 번호: 5; 서열 번호: 13과 서열 번호: 14; 및 서열 번호: 15와 서열 번호: 16과 같은 코리스토네우라 종 THP 서열을 생성시키는 것으로 공지된 PCR 프라이머쌍이 새로운 부동화 단백질종 및 이소형을 직접 증폭시키는데 사용될 수 있다. 씨. 푸미페라나(C. fumiferana)의 한가지 이소형에서, 서열 번호: 4와 서열 번호: 5의 프라이머쌍은 전장 THP cDNA 코딩 서열을 증폭시킨다.
서열 번호: 13과 서열 번호: 14와 같은 PCR 프라이머는 새로운 부동화 단백질종과 이소형을 직접 증폭시켜, 시그날 서열, 성숙한 단백질 코딩 영역 및 3' 비번역된 영역, 즉, 폴리-A 부착부위를 포함할 수 있는 DNA 프로브를 생성시키는데 사용될 수 있다. 새로운 THP종을 직접 증폭시키는데 사용되든지, 프로브로서 직접 사용되든지, 보다 긴 DNA 프로브를 생성(PCR 증폭에 의해서)시키는데 사용되든지 간에, 이러한 프라이머는 또한 광범위하게 다양한 상이한 THP종 및 이소형, 특히, 성숙한 단백질 코딩 영역보다는 시그날 서열과 3'-비번역된 영역에서 보다 우수하게 보존되는 THP 서열 변이체를 포함한 것들에 혼성화될 수 있다. 이러한 23-머 프라이머는 62℃의 Tms로 추정된다.
서열 번호: 15과 서열 번호: 16과 같은 PCR 프라이머가 또한 새로운 부동화 단백질종과 이소형을 직접 증폭시켜 THP 코딩 서열의 내부 서브셋을 포함할 수 있는 DNA 프로브를 생성시키는데 사용될 수 있다. 씨. 푸미페라나의 한가지 이소형에서, 서열 번호: 15와 서열 번호: 16 프라이머쌍 은 성숙한 THP 단백질의 내부 블록을 코딩하는 191염기쌍 PCR 생성물을 증폭시킨다.
PCR 생성된 올리고누클레오티드는 상이한 혼성화 기술 및 조건을 사용함으로써 신규한 부동화 단백질 코딩 핵산을 동정하고 검출하는데 유용할 수 있다. 당업자라면 어떠한 증폭방법이든 이용될 수 있으며, 정량적인 결과가 요구되는 경우, 증폭된 핵산의 상대적인 주기를 유지시키거나 조절하는 방법을 사용해야 한다는 것을 인지할 수 있을 것이다. 적합한 증폭방법에는, 이로 한정되는 것은 아니지만, 폴리머라아제 연쇄 반응, PCR(등록)[문헌: PCR PROTOCOLS, A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS, Innis,et al., Academic Press, Inc. N.Y., (1990) ("Innis")], 리가아제 연쇄반응(LCR)[참고문헌: Wu and Wallace, Genomics, 4:560(1989)("Wu"), Landegrenet al., Science, 241:1077(1988)("Landegren") and Barringeret al., Gene89:117(1990)("Barringer")]; 전사증폭 [문헌: Kwohet al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:1173(1989)("Kwoh")]; 및 자가 서열 복제[문헌: Guatelli,et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 87: 1874 (1990) ("Guatelli")]가 포함된다.
상기 방법 모두가 부동화 단백질을 코딩시키는 DNA를 제조하는데 사용될 수 있다. PCR(등록) 기술에서, 증폭되는 DNA 영역의 두 경계에 상보적인 올리고누클레오티드 프라이머가 합성된다. 폴리머라제 연쇄반응이 이어서 두 개의 프라이머(참조, Innis)를 사용함으로써 수행된다. PCR(등록)은 다양한 원안으로 이용되어 THP를 코딩시키는 핵산을 증폭시키고, 동정하고 분리할 수 있다. 이러한 원안에서, 부동화 단백질을 코딩시키는 DNA를 동정하고 증폭시키는 적절한 프라이머 및 프로브가 본원에 기재된 DNA 서열의 분석에 의해 생성된다. 예를 들어, 올리고누클레오티드 5'-CATATGCATATGGATGGCTCGTGTACAAACAC-3'(서열 번호: 4) 및 5'-AAGCTTAAGCTTTTAATTAGCACTGAAAGTACA-3'(서열 번호: 5)가 PCR 원안에 사용되어 THP cDNA의 상이한 종 및 이소형을 동정하고 증폭시킬 수 있다. 씨. 푸미페라나의 한 가지 이소형에서, 이러한 프라이머쌍은 전장 THP cDNA 코딩 서열을 증폭시킨다. 서열 번호: 4 및 서열 번호: 5에서 밑줄친 코돈은 각각 THP 이소형에서 발견되는 개시 및 종료코돈이라는 것을 주지해야 한다.
상기된 바와 같이, THP의 상이한 종 및 이소형을 동정하고 증폭시키는데 사용되는 그밖의 프라이머의 예로는 올리고누클레오티드 5'-TGAAGTGTTTAATGCTGATCATG-3'(서열 번호: 13)과 5'-CATTAGAGTAGCATAATGTAAGC-3'(서열 번호: 14; 및 5'-TCCAAGTGCGAAAAATCGACG-3'(서열 번호: 15)와 5'-GCTGATGGAGCAGGTACACC-3'(서열 번호: 16)이 포함된다.
PCR 증폭된 서열은 또한 표지되어 검출 가능한 올리고누클레오티드 프로브로서 사용될 수 있지만, 그러한 핵산 프로브는 상기된 바와 같이 당분야에 공지된 어떠한 증폭 기술을 이용함으로써 생성될 수 있다. 또한 공지된 기술을 이용하여, 표지되고 증폭된 DNA를 프로브로 사용하여 다양한 cDNA 또는 게놈 라이브러리로부터 추가의 부동화 단백질종 또는 이소형을 추가로 동정하고 분리할 수 있다.
DNA를 증폭시키는 또 다른 방법은 "RACE" 기술이다. 이를 요약하면, 이러한 기술은 PCR(동록)을 사용함과 관련되어, 랜덤 5' 프라이머 및 한정된 3' 프라이머(5'RACE) 또는 랜덤 3' 프라이머 및 한정된 5' 프라이머(3'RACE)를 사용하여 DNA 서열을 증폭시킨다. 증폭된 서열은 이러한 벡터내로 서브클로닝되고, 여기서, 표준기술을 이용함으로써 서열화된다. RACE 방법은 당업자에게는 공지되어 있고, RACE를 수행하는 키트는 시판되고 있다(예, 5'RACE System, GIBCO BRL, Grand Island, New York, USA).
3. 박테리아내로 THP 코딩 삽입물의 클로닝
상기된 바와 같이, 게놈성 DNA를 제조하고 스크리닝하기 위해서, 전체 DNA를 단편화시키고 박테리오파아지내로 삽입시킨다. 목적하는 부동화 핵산 서열을 함유하는 삽입물이 일단 동정되면(PCR, 또는 혼성화등에 의해서), λ 파아지 벡터로부터 절제되고 박테리아성 벡터내로 삽입되어 팽창된다. 전형적으로, 적합한 박테리아성 벡터는 당업자에게 공지되어 있고 시판되고 있다. 가장 적합한 벡터는 사용되는 박테리아, 삽입물의 크기, 목적하는 삽입물을 함유하는 박테리아의 검출방법 및 실험자의 선호도에 좌우될 것이다.
삽입물을 함유하는 벡터로 형질전환된 박테리아의 콜로니의 동정을 간단하게 하기 위해서, 많은 벡터가 효소, 특히 β-갈락토시다아제에 대한 코딩 서열내에 위치한 제한 효소부위 또는 그밖의 스플라이싱 부위를 지닌다. 삽입물이 제한 또는 스플라이싱 부위에서 벡터내로 성공적으로 삽입된면 효소는 불활성화된다. 벡터로 박테리아를 형질전환시킨 후에(하기됨), 이소프로필 β-D-티오갈락토시드(IPTG)(기질 β-갈락토시다아제)의 존재하에 성장된 콜로니는 백색을 나타내는 반면, 삽입물을 혼입하지 않은 박테리아로부터 유도된 콜로니는 푸른색을 나타낸다. 따라서, 삽입물을 벡터내로 결찰시키는 횟수가 적으면, 그렇지 않은 많은 경우에 비해 삽입물을 함유하는 콜로니는 몇 개 않될 수 있다.
벡터는 이어서 대장균(Escherichia coli)의 변이체내로 도입된다. 외래 DNA를 박테리아 세포로 도입시키는데 사용되는 방법이 당업자에게는 공지되어 있지만, 가장 많이 이용되는 방법은 경합 세포의 열충격법 및 전기영동법이다. 가장 적형적으로는, 경합E. coli가 시판되고 있다(예, Invitrogen, San Diego, CA). 대안적으로는, 상기 박테리아는 당분야에 널리 공지된 기술에 의해 외래 DNA를 취할 수 있도록 만들어질 수 있다. 박테리아에 가치 있는 인서트를 함유하는 벡터를 도입시키기 위해, 상기 적합한 세균은 열쇼크 과정으로 처리된다. 요약하면, 세균은 빙수욕에서 유지되고, DNA가 첨가된 후 세균의 온도는 40 내지 50℃, 바람직하게는 42℃로 올려진다. 세균을 다시 빙욕으로 반송시킨 후 배양시킨다. 세균에 DNA를 도입하는 것에 대한 보다 상세한 설명은 샘브룩(Sambrook)의 문헌을 참조한다.
세균 배양물을 배양시킨 후, 한천(agr)상에서 플레이팅시킨다. 일반적으로, 벡터는 형질전환된 세균에 항생물질에 대한 저항성을 부여하는 유전자를 코딩시킨다. 따라서, 벡터를 취한 세균은 생존하여 항생물질이 침투되어 있는 한천 플레이트 상에 콜로니(colony)를 형성한다. 생존한 콜로니는 육즙을 인큐베이팅하는데 사용되고, 다량의 형질전환된 세균 배양물로 확장될 수 있다.
플라즈미드 및 기타 벡터는 당해 공지된 방법에 의해 세균 용해물로부터 정제될 수 있다. 많은 상업 공급자들은 전체 세균 DNA로부터 소원형화 DNA(플라즈미드)를 정제하는 키트를 판매하고 있다. 이들 키트는 제조업자의 지시에 따라 사용이 용이하고, 수율도 일반적으로 상당히 높다.
4. THP DNA의 서열화
새로 분리된 DNA의 서열화는 본 발명의 THP 핵산을 확인하고, 특징화할 것이며, 이 핵산은 THP 종 또는 대립 변형체, 즉 본 발명의 부동화 단백질을 코딩시킨다. 단백질이 코리스토네우라 푸미페라나(Choristoneura fumiferana) THF와 동일한 60% 이상의 아미노산 서열이 서열 번호: 2 및 서열 번호: 3에 의해 확인되는 경우에 단백질은 THP 단백질 이소형으로 간주될 수 있다.
부동화 코딩 서열은 서열화될 수 있는 반면에 벡터내 인서트로서 존재하거나 벡터로부터 방출되거나 분리된 인서트로서 존재할 수 있다. THP 코딩 인서트는 제한 효소에 의해 벡터로부터 방출되거나 PCR에 의해 증폭될 수 있다. 어느 인서트가 완전한 길이의 부동화 코딩 서열을 함유하는 지를 알아내기 위한 인서트의 서열화에는 프라이머로서 서열 번호: 4 및 서열 번호: 5의 것들과 같은 N- 또는 C- 말단, 또는 원래의 λ 파아지에서의 삽입 위치를 근거로 하는 프라이머가 사용될 수 있다. 매우 바람직하게는, 추가 프라이머는 중복 서열을 제공하기 위해 합성될 수 있다. 일반적으로, 디데옥시 서열화가 수행된다(시쿼나아제(등록상표명: Sequenase), U.S. Biochemical). 그러나, 다른 키트 및 방법을 이용할 수 있으며, 당업자들에게 공지되어 있다.
상기 기재된 세균 클로닝에 대한 대안으로써, cDNA 라이브러리로부터의 포지티브 λ 파아지 플라크(plaque)가 헬퍼 파아지, 예를 들어 R408(스트라타유전자:Stratagene)로 생체내 삭제 처리될 수 있다. 이후, 이중 가닥 DNA는 정제되어 서열화되거나 λ 파아지로부터 유도된 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 증폭될 수 있다.
C. 핵산 혼성화 기법(Nucleic Acid Hybridization Techniques)
본원에서 기재된 혼성화 기법은 상이한 THP 종 및 대립 변형체를 포함하는 본 발명의 부동화 단백질을 코딩시키는 유전자 및 유전자 생성물(즉, mRNA)을 확인하고, 분리하고, 특징화하는데 사용될 수 있다.
핵산 혼성화 기법을 사용하여 특이 DNA 및 RNA를 측정하는 여러 방법은 당업자들에게 공지되어 있다[참고문헌: NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION, A PRACTICAL APPROACH, Ed. Hames, B.D. and Higgins, S.J. IRL Press, 1985; Gall and Pardue,Proc. Natl. Acad. Sci.,U.S.A.63:378(1969); John, et al.,Nature 223:582(1969); and Sambrook]. 혼성화 형태의 선택은 중요하지 않다.
예를 들어, 샘플내 부동화 단백질을 코딩시키는 DNA의 존재 또는 부재를 평가하는 한 방법에는 써던 트랜스퍼(Southern transfer)가 관여한다. 요약하면, 분해된 세균 게놈 DNA는 완충액중 아가로오스 슬라브 겔 상에서 조작되어, 막에 옮겨긴다. 혼성화는 핵산 프로브를 사용하여 수행한다. 본 발명의 THP에 대해, 핵산 프로브는 상기류의 단백질 중에서 보존된 핵산 서열을 기초로 하여 구상될 수 있다. 바람직하게는, 핵산 프로브는 20개의 염기 또는 이보다 길다[참조예: 핵산 혼성화에 사용하기 위한 핵산 프로브 서열을 선택하는 샘브룩의 방법]. 혼성화된 부분의 시각화는 부동화 단백질을 코딩시키는 DNA의 존재 또는 부재를 정량적으로 측정가능하게 한다.
유사하게, 노던 트랜스퍼(northern transfer)가 부동화 단백질을 코딩시키는 mRNA를 검출하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, mRNA는 산 구아니디늄-페놀-클로로포름 추출법을 사용하여 주어진 세포 샘플로부터 분리된다. 이후, mRNA는 mRAN 종을 분리시키기 위해 전기영동되고, mRNA는 겔에서 니트로셀룰로오스막으로 트랜스퍼된다. 써던 트랜스퍼와 관련하여, 표지된 프로브 또는 PCR은 부동화 단백질 코딩 핵산의 존재 또는 부재를 확인하는데 사용될 수 있다.
샌드위치 검정이 핵산 서열을 검출하거나 분리시키기 위한 통상적으로 유용한 혼성화 검정이다. 이러한 검정은 고체 지지체에 공유적으로 부동화된 "포획" 핵산 및 용액중의 표지된 "시그날" 핵산을 이용한다. 시그날 핵산은 포획 핵산과 효과적으로 혼성화될 수 없다.
일반적으로, 표지된 시그날 핵산은 혼성화를 검출하는데 사용된다. 보체 핵산 또는 시그날 핵산은 혼성화된 폴리누클레오티드의 존재를 검출하는데 일반적으로 사용되는 수개의 방법중 어느 하나에 의해 표지화될 수 있다. 가장 보편적인 검출방법은3H,125I,35S,14C 또는32P-표지된 프로브 등으로 자가방사기록법 또는 자가투시기록법을 사용하는 것이다. 기타 표지에는 표지된 항체, 플루오로포아, 화학발광제, 효소, 및 표지된 리간드에 대해 특이적 결합쌍원으로서 역할을 할 수 있는 항체가 포함된다.
혼성화 착체의 검출은 시그날 발생 착체의 표적 및 프로브 폴리누클레오티드 또는 핵산의 듀플렉스와의 결합을 필요로 할 수 있다. 예를 들어, 표지가 합텐 또는 항원인 경우, 샘플은 항체에 의해 검출될 수 있다. 이러한 시스템에서, 시그날은 형광 또는 효소 분자를 항체에 부착시키므로써 발생되거나, 일부 경우에 방사활성 표지로의 부착에 의해 발생된다[참조예: Tijssen, pp. 9 to 20].
혼성화 검정의 민감도는 검출하려는 표적 핵산을 증식하는 핵산 증폭 시스템을 사용하므로써 증대될 수 있다. 분자 프로브로서 사용하기 위한 서열을 증폭하거나 이후 서브클론닝을 위한 핵산 단편을 생성하는데 적합한 시험관내 증폭법은 공지되어 있다. 이러한 시험관내 증폭 방법으로 기술자들이 충분히 유도해낼 수 있는 기법의 예가 PCR, LCR, Qβ-레플리카아제 증폭 및 다른 RNA 중합효소 매개법을 포함하여 문헌에 기재되어 있다[참고문헌: Berger, Sambrook, and Ausubel, as well as Mullis et al., (1987); U.S. Patent No. 4,683,202; Arnheim ＆ Levinson,C ＆ EN36-47(1990); Lomell et al.,J. Clin. Chem.,35:1826(1989); Van Brunt,Biotechnology, 8:291-294(1990); Wu and Wallace,Gene 4:560(1989); Sooknanan and Malek,Biotechnology 13:563-564 (1995); Innis; Kwoh; Guatelli; Landegren; and Barringer]. 시험관내 증폭된 핵산을 클로닝하는 개선된 방법은 월리스(Wallace) 등의 미국 특허 제 5,426,039호에 기재되어 있다. 당업에 최근 기재된 다른 방법으로는 핵산 서열 기재 증폭법(NASBA(상표명), Cangene, Mississauga, Ontario) 및 Q 베타 레플리카아제 시스템(Q Beta Replicase system)이 있다. 이들 시스템은 PCR 또는 LCR 프라이머가 선택 서열이 존재하는 경우에만 연장되거나 연결되도록 구상된 돌연변이체를 직접 확인하는데 사용될 수 있다. 다르게는, 선택 서열은 일반적으로 예를 들어, 비특이적 PCR 프라이머를 사용하여 증폭되며, 증폭된 표적 서열은 돌연변이 징후의 특이 서열에 대해 이후 프로빙될 수 있다.
예를 들어, 시험관내 증폭방법에서 프로브로서, 진단 방법에서 유전자 프로브로서, 또는 억제제 성분으로서 사용되는 올리고누클레오티드는 일반적으로 니드함-반데반터(Needham-VanDevanter)에 기재된 바와 같이, 예를 들어 자동화 합성기를 사용하여 뷰케이지(Beaucage)와 카러터(Caruther)에 의해 기재된 고체상 포스포라미다이트 트리에스테르 방법에 따라 화학적으로 합성된다. 필요에 따라, 올리고누클레오티드의 정제는 일반적으로 피어슨(Pearson) 및 레그니어(Regnier)에 기재된 바와 같이 음이온 교환 HPLC에 의해 또는 네이티브 아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 수행된다. 합성 올리고누클레오티드 서열은 맥심(Maxam) 및 길버트(Gilbert)의 화학 분해 방법을 사용하여 검증될 수 있다.
핵산 혼성화 검정은 어레이 기본 형식(array-based format)을 수행될 수 있다. 이러한 방법에서, 다수개의 상이한 "프로브" 핵산을 가지는 어레이는 표적 핵산에 대해 혼성화된다. 이러한 방식에서, 다수의 상이한 혼성화 반응은 실질적으로 "평행"하게 조작될 수 있다. 이 방법은 빠르고 실질적으로 동시에 다수의 반응물을 평가하게 한다. 어레이 기재 형식으로 혼성화 반응을 수행하는 방법은 당업자들에게는 공지되어 있다[참고문헌: Jackson et al.,Nature Biotechnology 14:1685(1996), and Chee et al.,Science 274:610(1995)].
단백질을 코딩시키는 유전자의 발현 수준을 측정하기 위한 또 다른 방법에는 제자리 혼성화가 있다. 제자리 혼성화 검정은 널리 공지되어 있으며, 일반적으로 앙거러(Angerer) 등의 문헌(Methods Enzymol.,152:649(1987))에 기재되어 있다. 제자리 혼성화 검정에서, 세포는 고체 지지체, 일반적으로 유리 슬라이드에 고정된다. DNA를 프로빙시키려는 경우, 세포는 열 또는 알칼리에 의해 변성된다. 이후, 세포는 적정한 온도에서 혼성화 용액과 접촉하여 단백질을 코딩시키는 핵산 서열에 특이적인 표지된 프로브의 어닐링을 가능하게 한다. 이러한 프로브는 바람직하게는 방사성 동위원소 또는 형광 리포터로 표지된다.
D. THP의 발현
부동화 단백질 유전자의 코딩 영역이 확인된 후, 천연 또는 합성 부동화 코딩 핵산의 발현은 부동화 단백질 유전자의 코딩 영역을 프로모터(이는 구성성분이거나 유도될 수 있는 것이다)에 조작가능하게 연결하고, 구성물을 발현 벡터에 혼입시키고, 이 벡터를 적합한 숙주 세포에 도입시키므로써 달성될 수 있다. 일반적인 벡터는 전사 및 번역 말단, 전사 및 번역 개시 서열, 및 특정 핵산의 발현 조절에 유용한 프로모터를 함유한다. 벡터는 임의로 하나의 독립된 말단 서열을 함유하는 일반적인 발현 카셋트, 진핵세포 또는 원핵세포, 또는 둘다에 카셋트의 복제를 허용하는 서열(예를 들어, 셔틀 벡터) 및 진핵세포 및 원핵세포계 둘 모두에 대한 선택 마아커를 포함한다. 벡터는 진핵세포 또는 원핵세포, 또는 바람직하게는 둘 모두에서의 복제 및 통합에 적합하다[참고문헌:Giliman and Smith,Gene 8:81(1979); Roberts, et al.,Nature 328:731(1987); Berger and Kimmel, GUIDE TO MOLECULAR CLONING TECHNIQUES, METHODS IN ENZYMOLOGY, Vol 152, Academic Press, Inc., San Diego, CA("Berger"); Schneider, B., et al.,Protein Expr. Purif. 6435:10(1995); Sambrook and Ausubel]. 생물학적 보조제 및 실험 장비에 대한 제조업자들로부터의 제품 정보가 공지된 생물학적 방법에 유용한 정보를 제공한다. 이러한 제조업자에는 시그마 케미칼 컴패니(SIGMA chemical company: Saint Louis, MO 소재), R＆D 시스템즈(R＆D systems: Minneapolis, MN 소재), 파마샤 바이오테크(Pharmacia Biotech: Piscatawa, NJ 소재), 클론테크 레보러토리즈, 인코포레이티드(CLONTECH Laboratories, Inc.: Palo Alto, CA 소재), 알드리치 케미칼 컴패니(Aldrich Chemical Company: Milwaukee, WI 소재), 기브코 브이알엘 라이프 테크놀로지스, 인코포레이티드(GIBCO BRL Life Technologies, Inc.: Gaithersburg, MD 소재), 플루카 케미카-바이오케미카 어날리카(Fluka Chemica-Biochemika Analytike: Fluka Chemie AG, Buchs, Switzerland), 및 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems: Foster City, CA)이 포함되며, 뿐만 아니라 많은 여러 상업적 공급원이 당업자들에게 공지되어 있다.
본 발명에서 사용된 핵산(예를 들어, 프로모터 및 벡터)은 천연 공급원으로부터 단리되거나, ATCC 또는 진뱅크(GenBank)와 같은 공급원으로부터 입수되거나, 합성 방법에 의해 제조될 수 있다. 합성 핵산은 다양한 용액 또는 고체상 방법에 의해 제조될 수 있다. 포스파이트-트리에스테르, 포스포트리에스테르 및 H-포스포네이트 화학에 의한 핵산의 고체상 합성에 대한 과정의 상세한 설명은 널리 입수가가능하다. 예를 들어, 문헌[Itakura, U.S.Pat.No. 4,401,796; Carruthers,et al., U.S.Pat.No. 4,458,066 및 4,500,707; Beaucage 및 Carruthers; Matteucci; Carruthers,et al.,Genetic Engineering 4:1-17 (1982); Jones, chapter 2, Atkinson,et al., chapter 3, 및 Sproat,et al., chapter 4, in OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS: A PRACTICAL APPROACH, Gait (ed.), IRL Press, Washington D.C. (1984); Froehler,et al., Tetrahedron Lett. 27:469-472 (1986); Froehler,et al., Nucleic Acids Res. 14:5399-5407 (1986); Sinha,et al., Tetrahedron Lett. 24:5843-5846 (1983); 및 Sinha,et al., Nucl. Acids Res. 12:4539-4557 (1984)]을 참조할 수 있으며, 이들 문헌은 본원에 참고문헌으로 포함되어 있다.
핵산을 박테리아 세포내에 도입시키는 수 가지의 널리 공지된 방법이 있으며, 이들 모두는 본 발명에서 이용될 수 있다(참조: Sambrook). 이들 방법은 수용체 세포와 DNA를 함유하는 박테리아 프로토플라스트와의 융합, DEAE 덱스트란, 바이러스 벡터에 의한 감염 등을 포함할 수 있다.
핵산의 박테리아 숙주로의 시험관내 전달은 배양액에서 성장시킨 모든 세포에 대한 것일 수 있다. 시험관내에서 수행하는 경우, 세포와 유전자 조작된 핵산 구성물 사이의 접촉은 생체 적합성 배지에서 일어난다. 핵산의 농도는 특수 분야에 따라 광범위하게 변하지만, 일반적으로 약 1μM 내지 약 10mM 이다. 핵산에 의한 세포의 처리는 일반적으로 생리적 온도(약 37℃)에서 약 1 내지 48시간, 바람직하게는 약 2 내지 4시간 동안 수행된다.
외인성 핵산을 발현시키기 위해 사용될 수 있는 박테리아 균주로는 에스케리챠 콜라이(Escherichia coli), 스트렙토코커스 크레모리스(Streptococcus cremoris), 스트렙토코커스 락티스(Streptococcus lactis), 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus), 루코노스톡 시트로보룸(Leuconostoc citrovorum), 루코노스톡 메센테로이즈(Leuconostoc mesenteroides), 락토바실러스 액시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 락티스(Lactobacillus lactis), 비피도박테리움 비피둠(Bifidobacterium bifidum), 비피도박테리움 브레베(Bifidobacterium breve) 및 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum)이 있다.
박테리아 발현 시스템 이외에, 본 발명의 THP는 그 밖의 시스템, 특히, 특정 효모 및 바쿨로바이러스 뿐만 아니라 포유동물 세포 및 식물 세포에서도 발현될 수 있다. 사용된 시스템은 그 밖의 시스템에서의 성공의 결핍, THP를 적절히 폴딩하는 능력 및 THP의 결과적인 용도에 좌우될 것이다. 예를 들어, THP가 빵반죽용 효모를 동결로부터 보호하기 위해 사용되는 경우(참조: 미국 특허 제 5,118,792호), 효모 시스템이 사용될 것이다. 동결 온도에서 생존할 수 있는 식물이 바람직한 경우, 형질전환된 식물을 만들기 위해 형질전환 기법이 이용될 수 있다. 그러나, 물론, 사용되는 시스템은 코리스토네우라 종(Choristoneura sp.) 유충에서 발견되는 열력 활성과 필적하는 열력 활성을 갖는 THP를 제공해야 한다.
외인성 핵산을 발현시키기 위해 사용될 수 있는 효모 균주로는 토룰롭시스 홀밀(Torulopsis holmil), 사카로마이시스 프래질리스(Saccharomyces fragilis), 사카로마이시스 락티스(Saccharomyces lactis) 및 칸디다 슈도트로피칼리스(Candida pseudotropicalis)가 있다.
대안적인 발현 시스템의 예로서, 본원에 참고문헌으로 포함되어 있는 국제 공개공보 WO 제 96/11586호(1994년 10월 12일에 출원된 미국 특허 출원 제 08/321,991호)를 참조할 수 있으며, 이 공보는 서리가 없는 냉동기에서 유지되는 경우에 냉동-해동 주기로부터 발효된 냉동 식품, 특히 냉동 요거트중의 얼음 결정 형성을 방지하기 위해 AFP를 분비하는 어류 AFP(THP) 형질전환된 락토바실러스 불가리커스(Lactobacillus bulgaricus) 및 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus)를 사용하는 것을 기재하고 있다.
1. 재조합 벡터의 제조
상기 기법에서 단리된 서열을 사용하기 위해, 세포의 형질전환에 적합한 재조합 DNA 벡터가 제조된다. 매우 다양한 동물 및 식물 세포를 형질전환시키기 위한 기법은 널리 공지되어 있으며, 기술 및 과학 문헌에 기술되어 있다. 식물 세포에 대해서는 바이싱(Weising) 등의 문헌[Ann. Rev. Genet.22:421-477 (1988)]을 참조하고, 동물 및 박테리아 세포에 대해서는 샘브룩(Sambrook)을 참조할 수 있다.
부동화 단백질을 코딩하는 DNA 서열 예를 들어, 온길이 THP를 코딩시키는 cDNA 서열은 바람직하게는 세포 또는 형질전환된 고등 생물체의 의도된 조직중의 유전자로부터 서열의 전사를 유도하는 전사 및 번역 개시 조절 서열과 조합될 것이다. 또한, 프모모터 및 인핸서와 같은 매우 다양한 널리 공지된 전사 조절 요소가 본 발명의 THP를 발현시키기 위해 선택된 벡터에 포함될 수 있다. 천연 상태에서 본 발명의 THP를 유도하는 프로모터는 본원에 기술된 부동화 단백질 유전자에 상응하는 게놈 클론의 5' 서열을 분석함으로써 확인될 수 있다. 프로모터 서열의 서열 특징은 프로모터를 확인하기 위해 사용될 수 있다. 진핵 유전자 발현을 조절하는 서열이 집중 연구되어 왔다. 예를 들어, 프로모터 서열 요소는 일반적으로 전사 개시 부위의 20 내지 30 염기쌍 업스트림에 위치하는 TATA 박스 컨센서스 서열(TATAAT)을 포함한다.
본 발명의 재조합 발현 카세트의 구성에 있어서, 본 발명의 THP와 관련되거나 THP와 이종성인 프로모터 단편이 사용될 수 있는데, 이 단편은 형질전환된 생물체의 모든 조직에 있는 유전자의 발현을 유도할 것이다. 이러한 프로모터는 본원에서는 "구성" 프로모터로 명명되며, 발생 또는 세포 분화의 대부분의 환경 조건 및 상태하에서 활성이다. 식물의 구성 프로모터의 예로는 콜리플라워 모자이크 바이러스(CaMV) 35S 전사 개시 영역, 아그로박테리움 투마파시엔스(Agrobacterium tumafaciens)로부터의 T-DNA로부터 유도된 1'- 또는 2'-프로모터, 담배 모자이크 바이러스의 프로모터 및 당분야의 숙련자에게 공지된 다양한 식물로부터의 전사 개시 영역이 있다.
대안적으로, 프로모터는 특정 조직에서 본 발명의 폴리누클레오티드의 발현을 유도하거나(조직 특이적 프로모터), 그렇지 않으면 더욱 정밀한 환경 조절하에 존재할 수 있다 (유도성 프로모터). 발생 조절하의 조직 특이적 식물 프로모터의 예로는 과일, 종자 또는 꽃과 같은 특정 조직에서만 전사를 개시시키는 프로모터가 있다. 토마토로부터의 조직 특이적 E8 프로모터는 바람직한 유전자 생성물이 과일 내에 위치하도록 유전자 발현을 유도시키는데에 특히 유용하다. 그 밖의 적합한 프로모터로는 배 저장 단백질을 코딩시키는 유전자로부터의 프로모터가 있다. 유도성 프로모터에 의해 전사에 영향을 미칠 수 있는 환경의 예로는 혐기성 조건, 승온 또는 빛의 존재가 있다.
적당한 폴리펩티드 발현이 바람직한 경우, 코딩 영역의 3'-말단에 있는 폴리아데닐화 영역이 포함되어야 한다. 폴리아데닐화 영역은 천연 유전자, 다양한 그 밖의 식물 유전자 또는 T-DNA로부터 유도될 수 있다.
본 발명의 유전자로부터의 서열(예를 들어, 프로모터 또는 코딩 영역)을 포함하는 벡터는 전형적으로 형질전환된 세포에 대해 선택성 표현형을 부여하는 마커 유전자를 포함할 것이다. 예를 들어, 마커는 항생제 내성, 특히 카나마이신, G418, 블레오마이신 및 히그로마이신에 대해 내성을 코딩시킬 수 있다.
본 발명의 THP 단백질을 발현시키기 위해, 식물은 바이러스 벡터, 예를 들어, 담배 모자이크 바이러스를 사용하여 형질전환될 수 있다. 벡터의 선택 및 구성, 및 매우 다양한 식물 세포를 형질전환시키는 기법은 널리 공지되어 있으며, 예를 들어, 해마모토(Hamamoto) 등의 미국 특허 제 5,618,699호를 참조할 수 있다.
2. 형질전환된 생물체의 생성
본 발명의 DNA 구성물은 다양한 통상의 기법에 의해 숙주 생물체의 게놈내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 식물체의 경우, DNA 구성물은 식물 세포 프로토플라스트의 일렉트로포레이션 및 마이크로인젝션과 같은 기법을 사용하여 식물 세포의 게놈 DNA내에 직접 도입될 수 있거나, DNA 구성물은 DNA 입자 충격과 같은 충격 방법을사용하여 식물 조직에 직접 도입될 수 있다. 상기에 논의된 바와 같이, 본 발명의 THP 서열을 함유하는 담배 모자이크 바이러스와 같은 식물 바이러스 벡터는 식물을 접종하기 우해 사용될 수 있다. 대안적으로, DNA 구성물은 적합한 T-DNA 플랭킹 영역과 조합되어, 통상의 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 숙주 벡터내로 도입될 수 있다. 아그로박테리움 투메파시엔스 숙주의 독성 기능은 세포가 박테리아에 의해 감염될 때 구성물 및 인접 마커의 식물 세포 DNA 내로의 삽입을 유도할 것이다.
디스아밍(disarming)을 포함하는 아그로박테리움 투메파시엔스 매개된 형질전환 기법은 과학 문헌에 잘 기술되어 있다[참고문헌: Horsch,et al.,Science 233:496(1984), 및 Fraley,et al.,Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 80:4803 (1983)].
상기 형질전환 기법중의 하나에 의해 유도된 형질전환된 식물 세포는 형질전환된 유전자형, 즉 동결에 대해 증가된 내성과 같은 바람직한 표현형을 갖는 온전한 식물을 재생시키기 위해 배양될 수 있다. 또한, 본 발명의 형질전환된 식물은 부동화 단백질을 상당량으로 발현시키는 "리빙 팩토리(living factories)"로서 사용될 수 있다. 이러한 식물 재생 기법은 조직 배양 성장 배지 중의 특정 식물 호르몬의 조작에 좌우되며, 전형적으로 바람직한 누클레오티드 서열과 함께 도입된 살생물제 및/또는 제초제 마커에 좌우된다. 배양된 프로토플라스트로부터의 식물 재생은 에반스(Evans) 등의 문헌[PROTOPLASTS ISOLATION 및 CULTURE, HANDBOOK OF PLANT CELL CULTURE, pp. 124-176, Macmillian Publishing Company, New York, 1983; 및 Binding,REGENERATION OF PLANTS, PLANT PROTOPLASTS, pp. 21-73, CRC Press, Boca Raton, 1985]에 기술되어 있다. 또한 재생은 식물 캘러스, 외식편, 기관 또는 이들의 일부로부터 달성될 수 있다. 이러한 재생 기법은 일반적으로 클리(Klee) 등의 문헌[Ann. Rev. of Phys. 38:467 (1987)]에 기술되어 있다.
형질전환된 식물 또는 동물, 예를 들어, 염수어를 생성하기 위해, 마이크로인젝션 기법이 당분야에 공지되어 있으며, 과학 및 특허 문헌에 잘 기술되어 있다. 폴리에틸렌 글리콜 침전을 이용한 DNA 구성물의 세포내로의 도입은 파스즈코우스키(Paszkowski) 등의 문헌[EMBO J.3:2717 (1984)]에 기술되어 있다. 일렉트로포레이션 기법은 프롬(Fromm) 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:5824 (1985)]에 기술되어 있다. 충격 형질전환 기법은 클레인(Klein) 등의 문헌[Nature 327:70 (1987)]에 기술되어 있다.
III. 본 발명의 THP의 클래스의 검출 및 특징화
하기에 기재된 검정에 의해, 본 발명의 THP는 제 2 누에나이 코리스토네우라 푸미페라나(Choristoneura fumiferana) 및 코리스토네우라 옥시덴탈리스(Choristoneura occidentalis) 혈액림프로부터 단리된 열력 단백질과 함께 특성을 공유한다. 이들 검정은 그 밖의 신규한 THP가 이들 프로토타입 단백질과 충분히 관련되어서 본 발명의 범위에 속하는 지를 규정하기 위해 사용된다. 또한 검정은 박테리아 육즙, 조직 배양 유체 및 식물과 동물 조직에 존재하는 THP 단백질을 검출하고 정량하기 위해 수행될 수 있다.
A. THP의 검출
발현된 THP는 다양한 방법에 의해 검출되거나 정량될 수 있다. 바람직한 방법은 특이적 항체를 이용하는 면역학적 검정 및 기능 활성 검정의 사용을 포함한다.
1. 항체
다클론성 항체 및 단클론성 항체를 생성시키는 방법은 당업자들에게 공지되어 있다[참고문헌: Coligan, CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY (제 7판), Lange Medical Publications, Los Altos, CA 및 이 문헌에 인용된 참고문헌("Stites"); Goding, MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND PRACTICE(제 2판), Academic Press, New York, NY (1986); Kohler and Milstein, Nature 256:495 (1975); and Harlow and Lane]. 상기 기술들은 파지 또는 유사한 벡터내의 재조합 항체의 라이브러리로부터 항체의 선택에 의한 항체 제조를 포함한다[참고문헌: Huse et al., Science 246:1275 (1989); 및 Ward et al., Nature 341:544 (1989)].
예를 들어 면역친화성 정제에 사용하기 위한 다량의 항체를 생성시키기 위해, 수많은 면역원이 사용될 수 있다. 본 발명에서 기술된 바와 같이 코리스토네로아 종 또는 형질전환된 세포로부터의 부동화 단백질은 단클론성 항체 또는 다클론성 항체의 생성에 바람직한 면역원이다. 다른 유기체로부터의 천연 부동화 단백질은 순수한 형태 또는 비순수한 형태로 사용될 수 있다. 본원에 기술된 부동화 단백질 서열의 단편을 사용하여 제조된 합성 펩티드는 또한 단백질에 대한 항체를 생성하기 위한 면역원으로서 사용될 수 있다. 이 펩티드는 단독으로 또는 또 다른 조성물과 컨쥬게이트되어 사용될 수 있다.
다클론성 항체의 생성 방법은 당업자들에게 공지되어 있다. 간단하게, 면역원은 상기에 기술된 바와 같이, 보조제와 함께 혼합되고 동물은 면역화된다. 면역원 제제에 대한 동물의 면역 반응은 시험 혈액을 취해서 면역원에 대한 반응성의 적정 농도를 결정함으로써 모니터링된다. 면역원에 대한 항체의 적정 농도가 적당히 높은 경우에, 혈액을 동물로부터 채취하여 항혈청을 제조한다. 원하는 경우, 단백질에 대한 항체 반응성을 풍부하게 하기 위해 항혈청의 추가 분별화를 수행할 수 있다[참고: Harlow and Lane, supra].
면역친화성 정제 또는 면역검정에 사용하기 위한 다량의 단클론성 항체는 당업자들에게 친숙한 여러 가지 기술에 의해 수득될 수 있다. 간단하게, 원하는 부동화 단백질로 면역화된 동물의 비장 세포는 일반적으로 골수종 세포를 사용한 융합에 의해 불멸화된다[참고문헌: Kohler and Milstein, Eur. J. Immunol. 6:511 (1976)]. 또 다른 불멸화 방법은 엡스타인 바르 바이러스, 종양 유전자, 또는 레트로 바이러스를 사용한 형질전환이나, 당해 분야에 널리 공지된 다른 방법을 포함한다. 단일 불멸화 세포로부터 발생하는 콜로니는 THP에 대해 바람직한 특이성 및 친화성을 갖는 항체의 생성을 위해 스크리닝된다. 상기 세포에 의해 생성되는 단클론성 항체의 수율은 척추 동물 숙주의 복막강내로의 주입을 포함하는, 여러 가지 기술에 의해 향상될 수 있다. 또 다른 방법은 휴즈(Huse)에 약술된 일반적인 원안에 따라 사람 B 세포로부터 DNA 라이브러리를 스크리닝시킴으로써 단클론성 항체 또는 이것의 결합 단편을 코딩시키는 DNA 서열을 단리시키는 것이다.
THP의 농도는 여러 가지 면역검정 방법에 의해 측정될 수 있다. 또한, 본 발명의 면역검정은 각각 본원에 참고 문헌으로서 인용된 하기 문헌에서 광범위하게 검토되는 여러 가지 구성 중 어느 것으로도 수행될 수 있다[참고문헌: ENZYME IMMUNOASSAY, E.T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida (1980); Tijssen, and Harlow and Lane].
예를 들어, 부동화 단백질에 대한 면역검정에서 사용하기 위한 항혈청을 생성시키기 위해, 가문비의 새순을 갈아 먹는 벌래의 재조합 부동화 단백질 또는 이것의 면역원성 단백질을 본원에서 기술한 바와 같이 생성하고 단리시킨다. 마우스 또는 토끼의 근교계는 프로인드 보조제와 같은 보조제 및 표준 면역화 원안을 사용하여, 서열 번호: 2 또는 서열 번호: 3의 폴리펩티드, 또는 이것의 동일형 또는 이것의 면역원성 단편으로 면역화시킨다. 대안적으로, 본원에 기재된 서열로부터 유도되고 담체 단백질에 콘쥬게이트된 합성 폴리펩티드는 면역원으로서 사용될 수 있다. 단클론성 혈청을 모으고, 면역검정, 예를 들어, 고체 지지물상에 고정된 THP를 사용하는 고체상 면역검정에서 THP에 대해 적정한다. 적정 농도가 104이상인 단클론성 항혈청을 선택하고 경쟁적인 결합 면역검정을 사용하여, 다른 유기체 및/또는 비부동화 단백질로부터의 상동 단백질에 대한 상기 항혈청의 교차 반응성에 대해 시험한다. 특이적인 단클론성 및 다클론성 항체 및 항혈청은 일반적으로 KD가 약 0.1mM 이상, 바람직하게는 약 1μM 이상, 더욱 바람직하게는 약 0.1μM 이상, 가장 바람직하게는 약 0.01μM 이상인 결합을 형성한다.
2. 면역학적 결합 검정
바람직한 구체예에서, THP는 많은 널리 인식된 면역학적 결합 검정 중 어느 것을 사용하여 검출되고/거나 정량화된다[참고문헌: 미국 특허 제 4,366,241호, 제 4,376,110 호, 제 4,517,288 호 및 제 4,837,168 호]. 일반적인 면역검정을 검토하기 위해 하기 문헌을 참조한다[참고문헌: METHODS IN CELL BIOLOGY Vol. 37: Antibodies in Cell Biology, Asai, ed. Academic Press, Inc. New York (1993); 및 Stites]. 면역학적 결합 검정(또는 면역검정)은 보편적으로 분석물질(이 경우에는 THP 또는 이것의 단편)에 특이적으로 결합하고 종종 분석물질을 고정시키는 "포획제"를 이용한다. 포획제는 분석물질에 특이적으로 결합하는 물질이다. 바람직한 구체예에서, 포획제는 THP에 특이적으로 결합하는 항체이다. 항체(안티 THP)는 상기에 기술한 바와 같이 당업자들에게 널리 공지된 많은 방식으로 생성될 수 있다.
면역검정은 또한 종종 포획제 및 분석물질에 의해 형성되는 결합 복합체에 특이적으로 결합하여 이 복합체를 표지화시키는 표지화제를 이용한다. 표지화제는 그 자체로 항체/분석물질 복합체를 포함하는 물질 중 하나일 수 있다. 이와 같이, 표지화제는 표지화된 THP 폴리펩티드 또는 표지화된 안티-THP 항체일 수 있다. 대안적으로, 표지화제는 항체/THP 복합체에 특이적으로 결합하는 또 다른 항체와 같이, 제 3의 물질일 수 있다.
바람직한 구체예에서, 표지화제는 제 2 THP 항체 보유 표지이다. 대안적으로, 제 2 THP 항체는 표지가 결여될 수 있지만, 또한 제 2 항체가 유도되는 종의 항체에 특이적인 제 3의 표지된 항체에 의해 결합될 수 있다. 제 2 항체는 비오틴과 같은, 제 3의 표지된 분자가, 효소 표지 스트렙타비딘과 같이 특이적으로 결합할 수 있는 검출가능한 물질을 사용하여 변형될 수 있다.
단배질 A 또는 단백질 G와 같이, 면역글로불린이 일정한 영역을 특이적으로 결합시킬 수 있는 다른 단백질이 또한 표지화제로서 사용될 수 있다. 이러한 단백질은 연쇄상 구균성 박테리아의 세포벽의 정상적인 구성분이다. 이것은 다양한 종으로부터의 면역글로불린 일정 영역에 대해 강한 비면역원성 반응을 나타낸다[참고문헌: Kronval, et al., Immunol. 111:1401-1406 (1973), 및 Akerstrom, et al., J. Immunol. 135:2589-2542 (1985)].
검정 전반에 걸쳐, 각각의 시약 배합 후에 인큐베이션 및/또는 세척 단계가 요구될 수 잇다. 인큐베이션 시간은 약 5초 내지 수시간, 바람직하게는 약 5분 내지 약 24시간이다. 그러나, 인큐베이션 시간은 검정 포맷, 분석물질, 용액 부피, 농도 등에 좌우될 것이다. 일반적으로, 검정은 10 내지 40℃에 걸쳐서 수행될 수 있을지라도, 주위 온도에서 수행될 것이다.
a. 비경쟁적 검정 포맷
THP를 검출하기 위한 면역검정은 경쟁적이거나 비경쟁적일 수 있다. 비경쟁적 면역검정은 포획된 분석물질(이 경우에는 THP)의 양이 직접적으로 측정되는 검정이다. 한 가지 바람직한 "샌드위치" 검정에서는, 예를 들어 포획제(안티-THP 항체)가 이들이 고정되는 고체 기판에 직접 결합될 수 있다. 이러한 고정된 항체는 그 후 시험 샘플내에 존재하는 단백질을 포획한다. 이와 같이 고정된 THP는 그후 제 2 THP 항체 보유 표지와 같은 표지화제에 의해 결합된다. 대안적으로, 제 2 THP 항체는 표지가 결여될 수 있지만, 또한 제 2 항체가 유도되는 종의 항체에 특이적인 제 3의 표지된 항체에 의해 결합될 수 있다. 제 2 항체는 비오틴과 같은, 제 3의 표지된 분자가, 효소 표지 스트렙타비딘과 같이 특이적으로 결합할 수 있는 검출가능한 물질을 사용하여 변형될 수 있다.
b. 경쟁적 검정 포맷
경쟁적 검정에서, 샘플내에 존재하는 분석물질(THP)의 양은 샘플내에 존재하는 분석물질에 의해 포획제(안티 THP 항체)로부터 치환되는 첨가된(외인성) 분석물질(THP)의 양을 측정함으로써 간접적으로 측정된다. 한가지 경쟁적 검정에서, 공지된 양의 THP가 샘플에 첨가되고 샘플은 그 후 포획제(이 경우에는 THP를 특이적으로 결합시키는 항체)와 접촉하게 된다. 항체에 결합되는 THP의 양은 샘플내에 존재하는 THP의 농도에 반비례한다.
특히 바람직한 구체예에서, 항체는 고체 기판상에서 고정된다. 항체에 결합되는 THP의 양은 THP/항체 복합체에 존재하는 THP의 양을 측정하거나, 복합체를 형성하지 않은 잔여 THP의 양을 측정함으로써 결정될 수 있다. THP의 양은 표지된 THP 분자를 제공함으로써 검출될 수 있다.
합텐 억제 검정은 또 다른 바람직한 경쟁적 검정이다. 이 검정에서, 공지된 분석물질(이 경우에는 THP)는 고체 기판상에 고정된다. 안티-THP 항체의 공지된 양이 샘플에 첨가된 후, 샘플은 고정된 THP와 접촉하게 된다. 이 경우에, 고정된 THP에 결합되는 안티-THP 항체의 양은 샘플내에 존재하는 THP의 농도에 반비례한다. 다시 고정된 항체의 양은 고정된 항체의 분획 또는 용액내에 남아있는 항체의 분획을 검출함으로써 검출될 수 있다. 상기에 기술한 바와 같이 검출은 항체가 표지된 곳으로부터 직접적으로 이루어지거나 항체에 특이적으로 결합하는 표지된 물질의 연속 첨가에 의해 간접적으로 이루어진다.
경쟁적 결합 포맷에서의 면역검정은 교차반응성 결정에 사용될 수 있는데, 이 검정으로 당업자는 본 발명의 청구범위내에 제한시키도록 신규 THP가 청구되고 있는 THP와 충분히 관련있는지를 결정할 수 있다. 예를 들어, 서열 번호: 2 또는 서열 번호: 3의 THP는 고체 기판에 고정될 수 있다. 단백질은 검정에 첨가되어 고정된 항원에 대한 항혈청의 결합과 경쟁한다. 고정된 THP에 대한 항혈청의 결합과 경쟁하는 단백질의 능력은 고체 지지체를 피복시키는데 사용되는 경우의 THP에 의한 결합과 비교된다. 상기 단백질의 교차 반응성 비율은 표준 계산법으로 계산된다. 서열 번호: 2 또는 서열 번호: 3의 THP와의 교차 반응성이 10% 미만인 항혈청이 선택되고 푸울링된다. 교차 반응 항체는 상기 단백질을 사용하는 면역흡수에 의해 푸울링된 항혈청으로부터 임의로 제거된다.
면역흡수되고 푸울링된 항혈청을 상기에 기술한 바와 같이, 경쟁적 결합 면역검정에서 사용하여, 제 2 단백질이 본 발명의 부동화 단백질인지를 분석할 수 있다. 경쟁적 결합 면역검정에서 항혈청을 발달시키는데 사용되는 단백질 또는 면역원은 항체 결합 반응에서 제 2의 특정화되지 않은 단백질 또는 펩티드와 경쟁한다. 2가지 단백질은 각각 광범위한 농도 범위에서 검정되고 고정된 단백질에 대한 항혈청의 결합의 50%를 억제시키는데 요구되는 각각의 단백질의 양이 결정된다. 만약 요구된 제 2 단백질의 양이 요구되는 특징화된 면역원(예를 들어, 서열 번호: 2, 서열 번호: 3 또는 이들의 면역원성 단편)의 10배 미만이면, 제 2 단백질은 상기 특징화된(부동화 단백질) 면역원에 대한 생성된 항체에 특징적으로 결합한다.
c. 그 밖의 검정 포맷
웨스턴 블롯(이뮨블롯) 분석은 샘플중의 부동화 단백질의 존재를 검출하거나 양을 측정하는데 이용될 수 있다. 상기 시술은 일반적으로 분자량을 기초로하는 겔 전기영동으로 샘플 단백질을 분리하고, 분리된 단백질을 적합한 고형 지지대(니트로셀룰로오스 필터, 나일론 필터 또는 유도된 나일론 필터)로 이동시키고, 샘플을 THP에 특징적으로 결합하는 항체와 함께 인큐베이팅시키는 것을 포함한다. 안티부동화 단백질 항체는 고형 지지대상의 THP에 특징적으로 결합한다. 이러한 항체를 직접적으로 표지화시키거나, 선택적으로 후에, 안티부동화 단백질에 특징적으로 결합하는 표지화된 항체(예를 들어, 표지화된 양 안티마우스 항체)를 이용함으로써 검출할 수 있다.
본원에 청구된 종류의 단백질의 신규한 형체를 확인하기 위한 핵산 프로브를 이용하는 것 이외에, 발현 라이브러리를 검사하기 위해 항체를 이용하는 것이 가능하다. 이는 잘 공지된 기술이다[참고 문헌: See Young ＆ Davis, Proc. Nat'l Acad, Sci. USA80:1194(1982)]. 일반적으로, cDNA 발현 라이브러리는 시중에서 구입가능한 키트로부터 제조될 수 있거나, 손쉽게 이용할 수 있는 성분을 이용하여 제조될 수 있다. 파지 벡터가 바람직하지만, 다른 벡터의 종도 단밸질 발현에 이용할 수 있다. 이러한 벡터는 효모, 동물 세포 및 제노푸스(Xenopus) 난세포를 포함하며, 여기에 제한되는 것은 아니다. 표적 단백질이 풍부한 공급원으로부터 mRNA를 선택하고, 벡터에 결찰될 cDNA를 생성시켜, 이뮤노스크리닝을 위한 라이브러리 숙주 세포를 형질전화시킨다. 스크리닝은 세포상의 특이적 단백질에 결합되거나 니트로셀룰로오스 또는 나일론 막과 같은 고형 지지대상에 고정된 항체의 결합 및 시각화를 포함한다. 이러한 방법의 우수한 일반적 방법은 문헌[METHOD OF CELL BIOLOGY, VOL. 37 entitled Antibodies in Cell Biology, Assai (ed.) 1993.].
항체가 짧은 펩티드로 생성되는 시험(비특징화된) 단백질은 선택적인 결합을 위한 완전한 시험을 위해 선택적으로 변성되며, 유사한 사이즈의 단백질에 대한 시험 단백질을 측정하는 것이 가장 좋으며, 예를 들어, 항혈청이 원형 THP의 단편에 대해 생성된다 하더라도 원형의 완전한 길이의 THP에 대한 완전한 길이의 THP를 시험하는 것이다. 이는 시험을 간단하게 하며, 경쟁적 면역분석으로부터의 결과 측정에 있어서 배좌 문제 및 분자량/몰랄 농도를 고려해야하는 것을 피한다.
다른 분석 형은 리포좀 면역분석(LIA)을 포함하며, 이는 특정 분자(예를 들어, 항체)에 결합하도록 설계된 리포좀을 이용하며, 비캡슐화된 반응물 또는 마커를 방출한다. 그 후, 방출된 화학품을 표준 방법에 따라 검출한다[참고 문헌: Monroe et al., Nmer. Clin. Prod. Rev. 5:34(1986)].
B. THP의 정제
본 발명의 폴리펩티드는 유충 동종물, 조직 배양 배지, 유전자 이식 식물 및 동물, 효모 및 박테리아와 같은 다양한 공급원으로부터 표준 방법에 의해 고순도로 정제될 수 있다. 표준 정제 과정에 있어서, 황산암모늄과 같은 물질로의 선택적인 침전; 칼럼 크로마토그래피, 면역정제 방법 등을 포함하며, 나머지는 본원에 참고 문헌으로 인용된 문헌[R. Scopes, PROTEIN PURIFICATION: PRINCIPLES AND PRACTICE, Springer-Verlag: New York (1982), U.S. Patent No. 4,673,641, Ausubel, and Sambrook]을 참조하기 바란다.
1. 박테리아 배양물로부터의 THP 정제
분비된 단백질의 경우, 관심 있는 단백질을 박테리아가 성장한 육즙으로부터 하기에 설명된 세포 용해 방법에 의존하지 않고 분리하고 정제할 수 있다.
2. 박테리아 주변세포질로부터의 THP 정제
대장균으로부터 부동화 단백질 발현이 낮을 수 있으며, 단백질이 박테리아의 주변세포질로 이동한다는 것이 예상된다. 박테리아의 주변세포질 분획은 냉 삼투성 쇼크(cold osmotic shock) 이외에 당해분야에 공지된 다른 방법에 의해 분리될 수 있다[참고 문헌: Ausubel and Trayer, H.R. and Buckley, Ⅲ, C.E., J. Biol. Chem.245(18):4842(1970)].
주변세포질로부터 단백질을 분리하기 위해, 박테리아 세포를 원심분리하여 펠렛을 형성시켰다. 펠렛을 20% 자당을 함유하는 완충액에 재현탁시켰다. 세포를 분해하기 위해, 박테리아를 원심분리하고, 펠렛을 얼음같이 찬 5mM의 MgSO4에 재현탁시키고, 약 10 분동안 얼음 중탕기에 보관하였다. 세포 현탁액을 원심분리하고, 현탁액을 가만히 따르고, 저장하였다. 현탁액중의 존재하는 단백질은 당업자에 공지된 표준 분리 방법에 의해 숙주 단백질로부터 분리될 수 있다.
3. 세포 함유체의 정제
통상적으로 프로모터 유도 후, 재조합 단백질이 대량의 형질전환된 박테리아에서 발현될 경우(발현이 구성적인 것은 아님), 단백질은 불용성 집합체를 형성한다.
집합 단백질(이후에는 세포 함유체라고 명했음)의 정제는 약 100 내지 150㎍/mL 리소자임 및 0.1%의 상품명 노니데트 P40(NONIDET P40: 등록 상표) 즉, 비이온성 세정제의 완충액에서 인큐베이션된 박테리아 세포(이것에만 제한되는 것은 아님)의 분열에 의한 세포 함유체의 추출, 분리 및/또는 정제를 포함한다. 세포 부유물은 폴리트론 분쇄기(뉴욕 웨스트버리에 소재한 브링크먼 인스트루먼트스)를 이용하여 분쇄될 수 있다. 대안적으로, 세포는 얼음에서 분해될 수 있다. 박테리아 분해의 대안적인 방법은 문헌[Ausubel and Sambrook]에 설명되어 있으며, 이는 당업자에게 인지될 수 있을 것이다.
세포 현탁액을 원심분리하고, 세로 함유체를 함유하는 펠렛을 예를 들어, 20mM의 트리스-HCl(pH 7.2), 1mM의 EDTA, 150mM의 NaCl 및 2%의 상품명 트리톤-X 100(TRITON-X 100: 등록 상표) 즉, 비이온성 세정제의 완충액에 재현탁시켰다. 가능한 세포 잔해를 많이 제거하기 위해 세척 단계를 반복할 필요가 있다. 세포 함유체의 잔존하는 펠렛을 적합한 완충액(예를 들어, 20mM의 소듐 포스페이트, pH 6.8, 150mM의 NaCl)에 재현탁시킬 수 있다. 다른 적합한 완충액들도 당업자에게 자명할 것이다.
세척 단계 후, 세포 함유체는 DTT와 같은 제재를 환원시키는, 강한 수소 제공체이며, 강한 수소 수용체인 용매(또는 이러한 성질중 하나씩만을 갖는 용매의 배합물)의 첨가에 의해 용해될 수 있다. 그 후, 세포 함유체를 형성한 단백질은 양립할 수 있는 완충액으로의 희석 또는 투석에 의해 원형회복될 수 있다. 적합한 용매는 우레아(약 4M 내지 약 8M), 포름아미드(약 80% 이상의 부피/부피) 및 구아니딘 히드로클로리드(약 4M 내지 약 8M)를 포함하며, 여기에 제한된 것은 아니다. 집합 형성 단백질을 용해시킬 수 있는 일부 용매, 예를 들어 SDS(소듐 도데실 술페이트), 70% 포름산은 면역유전성 및/또는 활성의 결핍과 함께 단백질의 비가역적인 변성 가능성 때문에 상기 공정에 이용하는 것이 적합하지 않다. 구아니딘 히드로클로리드 및 이와 유사한 제재가 변성제이지만, 이 변성은 비가역적이지 않으며, 원형회복이 변성제의 제거(예를 들어, 투석에 의해) 또는 희석에 의해 발생할 수 있으며, 이는 면역학적으로 및/또는 생물학적으로 활성적인 단백질을 재형성시킬 수 있다.
용해 후, 단백질은 표준 분리 방법에 의해 다른 박테리아 단배질로부터 분리될 수 있다.
4. 표준 단백질 분리 기술
a. 용해도 분류
초기 단계에서와 같이 종종, 만약 단백질 혼합물이 복잡하다면, 초기 염 분획은 관심있는 재조합 단백질로부터 많은 원하지 않는 숙주 세포 단백질(또는 세포 배양 배지로부터 유도된 단백질)을 분리시킬 수 있다. 바람직한 염은 암모늄 술페이트이다. 암모늄 술페이트는 단백질 혼합물중의 물의 양을 효과적으로 감소시킴으로써 단백질을 침전시킨다. 그 후, 단백질은 이들의 용해도에 따라 침전한다. 더욱 소수성인 단백질은 더 낮은 암모늄 술페이트 농도에서 더 잘 침전되는 것으로 추정된다. 통상적인 원원은 생성된 암모늄 술페이트 농도가 20 내지 30%가 될 정도로 단백질 용액에 포화된 암모늄 술페이트를 첨가하는 것이다. 이는 가장 소수성인 단백질을 침전시킬 것이다. 침전물을 버리고(만약 관심있는 단백질이 소수성이 아니면), 암모늄 술페이트를 관심있는 단백질을 침전시키기 위한 공지된 농도로 현탁액에 첨가한다. 그 후, 침전물을 완충액에 용해시키고, 필요에 따라 과량의 염을 투석 또는 디아필트레이션(diafiltration)으로 제거한다. 한랭 에탄올 침전과 같은 단백질의 용해도에 의존한 다른 방법은 당업자에 잘 공지되어 있으며, 복잡한 단백질 혼합물을 분류하는데 이용될 수 있다.
b. 상이한 크기별 여과
만약 관심있는 단백질의 크기가 공지되어 있거나, cDNA 서열로부터 측정될 수 있다면, 더 크거나 더 작은 크기의 단백질을 상이한 포아 크기(예를 들어,아미콘(Amicon) 또는 밀리포아(Millipore) 막)를 갖는 막을 통해 초여과(ultrafiltration)시킴으로써 제거될 수 있다. 첫 번째 단계에서와 같이, 단백질 혼합물을 관심있는 단백질의 분자량보다 더 적은 분자량을 차단하는 포아 크기를 갖는 막을 통해 초여과시킨다. 그 후, 초여과한 후의 보유물을 관심있는 단백질의 분자량 보다 더 큰 분자를 차단하는 막에 대해 초여과시킨다. 재조합 단백질은 막을 통해 여과액으로 통과할 것이다. 그 후, 여과물을 하기에 설명된 바와 같이 크로마토그래피한다.
c. 칼럼 크로마토그래피
단백질은 이들의 크기, 최종 표면 전하, 소수성 및 리간드에 대한 친화도에 따라 분리될 수 있다. 또한, 단백질에 대해 배양된 항체는 칼럼 매트릭스와 결합되고, 단백질이 면역정제된다. 이러한 모든 방법은 장 공지되어 있다[참고 문헌: Scopes, R.K., Protein Purification: Principles and Practice, 2nd ed., springer Verlag, (1987)].
크로마토그래피 방법이 임의의 스케일에서 많은 상이한 제조업체(예를 들어, 파마슈티칼스 바이오테크(Pharmacia Biotech))로부터의 장치를 이용하여 수행될 수 있다는 것은 당업자에게는 자명할 것이다.
바람직한 구체예에서, 대장균 상청액으로부터의 부동화 단백질의 정제는 겔 여과에 의해 달성되며, 단백질 농도는 브래드포드(Bradford)의 문헌[Anal. Biochem.72:248-257 (1976)]에 따라 측정된다.
d. 아미노산 서열
본 발명의 THP의 아미노산 서열은 예를 들어, 당해분야에 잘 공지된 방법인 에드만 분해(Edman degradation)에 의해 측정될 수 있다.
내부 시퀀싱 이외에, N-말단 시퀀싱이 당해분야에 공지된 방법에 따라 수행될 수 있다.
e. 분자량/등전점
단백질의 분자량은 당업자에 공지된 많은 상이한 방법에 의해 측정될 수 있다. 측정의 일부 방법은 SDS 겔 전기영동, 천연 겔 전기영동, 분자 배제 크로마토그래피, 조날(zonal) 원심분리, 매스 스펙트로스코피 및 시퀀싱으로부터의 추정을 포함한다. 상이한 방법의 결과들 사이의 상이함은 방법 고유의 인자에 기인한 것이다. 예를 들어, 천연 겔 전기영동, 분자 배제 크로마토그래피 및 조날 원심분리는 단백질의 크기에 의존한다. 본 발명의 단백질은 시스테인 풍부하고, 많은 이황화물 결합(분자외 및 분자내 모두)을 형성하는 것으로 예상된다. SDS 겔 전기영동은 단백질에 존재하는 아미노산으로의 SDS의 결합에 의존한다. 일부 아미노산은 SDS에 다른 것보다 보다 강하게 결합하여, 단백질은 이들의 아미노산 조성물에 따라 상이하게 이동한다. 매스 스펙트로스코피, 및 서열로부터 계산된 분자량은 단백질에 존재하는 아미노산의 빈번도를 이용하며, 아미노산의 분자량으로 그 빈번도를 증폭시킨다. 만약 단백질이 글리코실화된다면, 매스 스펙트로스코피는 이를 반영하지만, 계산된 분자량은 이를 반영하지 않을 것이다.
본 발명에 있어서, 분자 배제 크로마토그래피를 이용한 THP 동등형의 명백한 분자량은 약 5 내지 20kD인 것으로 측정되었으며, SDS 겔 전기영동에 의해서는 약 6 내지 14kD인 것으로 측정되었다. 이는 분자량이 아미노산 시퀀싱으로부터 계산된 경우에 획득된 결과와 일치한다. 그러나, 본 발명의 범위내의 THP 종 또는 동등형은 본 MW 범위에 제한되지 않는다.
단백질의 등전점은 천연 겔(또는 디스크) 전기영동, 등전자 포커싱(focussing) 또는 바람직한 방법으로는, 단백질의 제공된 아미노산 함량을 계산함으로써 측정될 수 있다. 본 발명의 두 가지 THP 동등형의 등전점(pI)은 약 6 내지 9로 계산되었다. 그러나, 본 발명의 범위내의 THP 종 또는 동등형은 상기 등전점의범위내로 제한될 필요는 없다.
f. 기능 검정
본 발명의 THF 종 및 이소형은 적어도 두가지의 기능적인 특성, 예를 들어 열력 및 얼음 결정의 독특한 형성에 의해 확인되고 특성화될 수 있다.
(1) 열력
본 발명의 THP 단백질은 열력 검정시에 공지된 어류(AFP) 부동화 단백질 보다 약 10 내지 50배 더 활성적이다. 열력은 용액의 빙점과 용융점의 차로서 정의된다. 빙점은 조절할 수 없는 결정 성장 또는 침상체 얼음 성장이 성장하기 시작하는 온도로서 취해진다. 용융점은 얼음 결정이 용융 없이 안정하게 유지될 수 있는 가장 따뜻한 온도로서 취해진다. TH 활성은 당분야에 널리 공지된 방법[참고문헌: 예를 들어, Chakrabartty ＆ Hew,Eur. J. Biochem. 202:1057(1991)]에 의해 나노리터 삼투압계(뉴욕 마트포트에 소재하는 클리프톤 테크니칼 피직스(Clifton Technical Physics)에서 시판)에서 측정될 수 있다. 출발 얼음 결정의 직경은 보통 20 내지 50㎛이다. 사용된 완충액은 전형적으로 100mM NH4HCO3(pH 7.9)지만 유사한 삼투도를 지닌 완충액이 사용될 수 있다. 대안적으로, TH 활성은 박테리아 육즙, 조직 배양액 또는 혈임파중에서 측정될 수 있다. 그러나, 수득된 TH값은 측정되는 용액의 삼투도에 의존할 것이다.
삼투압계는 별도의 그러나 연결된 가변 온도 조절을 갖는 열전기 냉각 모듈이다. 이러한 장치는 -40℃까지 냉동 저장 모드로 0 내지 -9℃ 범위에서 온도 조절을 허용한다. 냉각 모듈은 얼음 결정의 성장 및 용융 거동이 직접 관찰될 수 있는 현미경 스테이지상에 배치될 수 있다. 샘플 홀더는 다수의 작은 샘플 홀(지름 약 0.35mm)을 함유하는 약 7mm×7mm×0.75mm의 치수를 갖는 작은 플레이트일 수 있다. 한 방울의 잠입 오일(예, 카르킬(Cargille)의 B 잠입 오일)은 샘플 홀이 충전되도록 샘플 홀더의 이면에 배치될 수 있다. 그런 다음, 1 내지 5nL의 샘플이 모세관에 의해 오일 충전 홀의 중앙으로 운반된다.
TH 활성을 측정하기 위해, 샘플은 샘플을 -40℃까지 신속하게 냉각시킴으로써 먼저 냉동되고, 이어서 용융점 온도까지 가온된다. 일단 용융점이 도달되면, 샘플은 빙점이 도달될 때까지 10 내지 15초 당 약 0.02℃(10 밀리 오스몰 또는 모스몰) 정도씩 냉각된다. 단위 "오스모스"로부터 "℃"로의 변환은 1.00 오스몰 = 1.86℃이다. 대부분의 경우에, THP 샘플의 빙점이 도달되는 경우, 샘플내에서의 얼음 결정은 자발적으로 신속하게 성장할 것이다. 이렇게 하여 전체 샘플이 냉동된다.
대안적으로, 작은 얼음 결정은 용액의 표면상에서 동결될 수 있으며, 용액의온도는 빙점 미만의 온도로 곧바로 감소될 수 있다. 빙정형성된 얼음 결정이 성장하기 시작할 때 빙점 미만의 온도는 빙점 강하 또는 열력 측정이다[참고문헌: Patterson ＆ Duman,J. Exp. Zool. 210:361 (1979); and Wu, et al.,J. Comp. Physiol. B 161:271 (1991)]. 용액의 열력 활성은 부동화 단백질의 농도에 의존적인데, 단백질의 농도가 크면 클수록 용액이 보여주는 활성은 더 크다. 그러나, THP의 증가된 농도는 TH 활성의 증분적으로 보다 작은 증가를 나타내며 최대치에 이른다. 즉, THP 농도와 TH 사이의 관계는 선형 관계가 아닌 쌍곡선 관계이다.
본 발명의 단백질은 바람직하게는 약 1mg/mL에서 약 1.5 보다 크며, 보다 바람직하게는 약 1mg/mL에서 2℃ 보다 크며 가장 바람직하게는 약 1mg/mL에서 1.5 내지 3.0℃인 열력 값을 갖는다.
(2) 얼음 결정의 독특한 형성
이미 공지된 어류 부동화 단백질 보다 약 10 내지 50배 더 특정 활성을 갖는 것 이외에, 본 발명의 단백질은 상이한 형상화된 얼음 결정을 생성시킨다. 현미경 분석하에서, 어류 부동화 단백질은 편평하고 잘 규정된 한 면을 갖는 육각 쌍뿔인 얼음 결정을 생성시킨다. 다른 한편으로는, 본 발명의 THP는 한 면의 어떠한 명백한 발현도 갖지 않는 둥근 결정을 형성시킨다.
IV. 부동화 단백질 및 관련 유전자의 사용
THP를 코딩시키는 유전자 및 단백질은 얼음 결정 성장을 억제시키는 방법에서 사용될 수 있다. 부동화 단백질 사용의 포괄적인 검토를 위해서는 미국특허 제 5,118,792호를 참조해야 한다. 본 발명의 THP는 단백질 형태로 도입되거나, 이들은 적합한 강한 프로모터의 조절하에 세포내에서 부동화 단백질을 발현시켜서 단백질을 생성시킴으로써 달성되어야 하는 수준으로 외인적으로 발현되는 유전자로서 도입될 수 있다. THP의 적합한 농도는 용도에 따라서 변화될 것이지만, 전형적으로 약 백만분의 1 내지 약 천분의 1 범위(즉, 1㎍/L 내지 1g/L)일 것이다.
본 발명의 한 구체예에서, 단백질은 식료품으로 도입될 것이다. 이것은 다수의 상이한 일면을 갖는다. 하나는 식물 식료품으로의 도입, 전체 식물내로 도입되어 빙점 이하의 기후 조건으로부터 오는 손상에 약간 정도의 일반적인 내성을 제공하거나 과일 또는 양채 부분과 같은 식물 부분내로 도입되어 냉동시 특히 특정의 식물 기관에 대한 손상을 최소화시키는 것이다. 예시적인 식물 부분은 줄기, 뿌리, 잎, 꽃, 잎꼭지, 과피, 종자, 성장 조직, 괴경 등이다.
냉동 야채, 예를 들어 셀러리, 감자, 아스파라거스, 완두콩, 당근, 콩, 브로콜리, 사탕옥수수 및 시금치의 감촉, 맛, 및 유용한 저장 수명은 개선될 것이다. 유사하게, 딸기, 월귤나무, 나무딸기, 감귤 과일, 바나나, 포도, 키위, 복숭아, 파인애플, 서양자두, 체리, 토마토 및 망고열매를 포함하는 과일의 감촉, 맛 및 유용한 저장 수명이 증대될 것이다.
식물 및 그 밖의 산물내로의 이러한 도입은 표적 유기체내로 적합한 핵산의 유전자 도입에 의해 가장 용이하게 달성될 수 있다. 식품 처리가 시작되기 전, 또는 수확과 처리가 시작된 후, 구조적으로 또는 유도적으로 핵산의 발현은 충분히 높은 수준의 폴리펩티드를 유도하여 전체 식물 단백질의 매스를 기준으로 하여 0.5% 이하, 보다 바람직하게는 약 0.1% 이하로 식료품을 효과적으로 보호한다. 발현은 조직 특이적 기재상에서도 또한 일어날 수 있다. 예를 들어, 과일내 숙성 유전자에 결합은 산출되는 식물로부터의 수확 후에도 발현을 유도할 수 있다.
폴리펩티드는 냉동될 것으로 예상되는 식품내로 또한 첨가될 수 있다. 많은 냉동 식품은 냉각 상태, 예를 들어 아이스크림, 냉동 요거트, 아이스밀크, 샤베트, 아이스케이크, 냉동 생크림, 냉동 크림파이, 냉동 푸딩 등으로 소비되도록 의도된다. 특히, 감촉 및 맛은 대부분의 가정의 서리가 없는 냉동기 또는 냉동 상태에서의 지속적인 저장시에 일어나는 냉동과 해동의 주기를 거치면서 큰 얼음 결정의 형성에 의해 역효과를 받는다. 이러한 얼음 결정 성장은 전적으로 억제되거나, 부동화 폴리펩티드의 첨가에 의해 적어도 최소화될 수 있다. 정제된 부동화 단백질은 식료품에 완전히 혼입되거나, 대안적으로는, 응축 및 결정 형성이 가장 용이하게 일어날 것으로 예상되는 표면에 적용될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 THP를 코딩시키는 유전자가 사용되어, 식료품에 첨가되는 경우, 냉동으로부터 식료품 또는 미생물을 보호하는 미생물을 형질전환시킨다. 예를 들어,스트렙토코커스 써모필러스및락토바실러스 불가리쿠스와 같은 박테리아가 냉동 요거트로서 시판되도록 의도되는 낙농 제품에 첨가될 수 있다. 낙농 제품을 발효시켜서 요거트를 생산하는 것 이외에, 박테리아에 의해 발현된 THP는 가정의 냉동기의 냉동-해동 주기로부터 제품을 보호하고 보다 맛 좋은 제품을 생산할 것이다.
또 다른 사용은 핵산 코딩 THP로 가루반죽 효모를 형질전환시키게 될 것이다. 효모내로 이러한 유전자의 혼입 및 발현시 및 냉동 가루반죽에서의 이들 효모의 사용시에, 효모 생존력이 해동시에 높을 것이기 때문에 가루반죽은 해동시에 천연 효모일 것이다. 보다 적은 손상이 이들 부동화 폴리펩티드의 존재하에 저장으로부터 축적되고 해동된 샘플의 높은 생존력이 보존되기 때문에, 보다 긴 저장 시간이 가능할 것이며, 아마도 훨씬 작은 분취액이 저장에 필요로 될 것이다.
식품 냉동기에 특이적이지 않은 다양한 구체예가 있다. 하나는 기후상의 냉동 조건으로부터 식물을 보호하기 위해 THP를 사용하는 것이다. THP는 도입된 유전자의 발현에 의해 세포질내로 내부적으로 혼입되거나 단백질이 식물에 외부적으로 적용될 수 있다. 외부 적용은 식물에 단백질의 직접 적용에 의해서, 또는 단백질을 분비하는 유기체의 식물상으로의 외부 유착에 의해서 달성될 수 있다.
식물 이외에, 본 발명의 THP가 사용되어 영하의 온도를 견뎌낼 수 있는 트랜스 유전자적 어류를 생성시킬 수 있음이 예상된다. 일부의 극지의 어류는 부동화 단백질을 합성하지만, 대부분의 어류는 물의 온도가 0℃ 미만으로 떨어지는 환경에서 살지않는다. 그러나, 외인성 핵산 코딩 THP를 함유하는 트랜스 유전자적 어류는 영하의 염수에서 유지되고 아마도 부분적으로 길러질 수 있었다. 특히, 염수 어류, 가장 특히 연어는 양식장에서 길러지고 있다.
상기 구체예 이외에, 본 발명의 THP가 사용되어 내한성 유기체내에서 외인성 THP 유전자의 발현을 조절할 수 있음이 예견된다. 유전자가 생성시키는 부동화 단백질의 발현은, 예를 들어 후속의 단리를 위해, 외인성 부동화 단백질을 제조하는 방법으로서 증가될 수 있다. 역으로, 외인성 부동화 유전자 발현을 하향 조절함으로써, 그렇지 않은 경우에 내한성 해충은 덜 악화되는 표현형으로 전환될 수 있다.
외인성 유전자의 발현을 변경시키는 방법은 당업자에게는 널리 공지되어 있다. 전형적으로 그러한 방법은 조절하고자 하는 특정의 유전자의 발현을 조절하는 조절 서열의 전부 또는 일부를 변경시키거나 대체시키는 것을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 하나 이상의 THP의 업스트림에 있는 조절 서열(예를 들어, 네거티브 프로모터)이 변경된다.
이것은 전형적으로 이종 핵산을 네거티브 조절 서열에 도입시키는 동종 재조합의 사용에 의해 달성된다. 하나 이상의 THP 유전자 생성물의 발현을 하향 조절하기 위해, 리딩 프레임(reading frame)을 변경시키거나 프로모터를 붕괴시키는 단순한 변이체가 적합하다. THP 유전자 생성물의 발현을 상향 조절하기 위해, 하나 이상의 네거티브 프로모터가 보통 수준 이상의 전사를 야기시키는 하나 이상의 이종 프로모터로 치환될 수 있다.
특히 바람직한 구체예에서, 문제의 구조 유전자를 포함하는 핵산 서열 또는 업스트림 서열은 이종 재조합 구성물을 표적화하기 위해 이용된다. 서열 번호: 1에 제공된 구조 유전자 서열 정보를 이용하여, 당업자는 단지 통상적인 실험만으로도 동종 재조합 구성물을 제조할 수 있다.
외인성 유전자의 발현을 변경시키기 위한 동종 재조합의 사용은 미국특허 제 5,272,071호, WO 91/09955호, WO 93/09222호, WO 96/29411호, WO 95/31560호 및 WO 91/12650호에 상세하게 기술되어 있다. 미코박테리아에서의 동종 재조합은 문헌[Azad,et al.,Proc. Nat'l Acad. Sci. USA93:4787(1996); Baulard,et al., J. Bacteriol.178:3091(1996); 및 Pelicic,et al., Mol. Microbiol.20:919(1996)]에 기술되어 있다. 동물에서의 동종 재조합은 문헌[Moynahan,et al., inHum. Mol. Genet.5(7):875(1996)]에 기술되어 있으며, 식물에서의 동종 재조합은 문헌[Offringa,et al., EMBO J 9(10):3077(1990)]에 기술되어 있다.
또 다른 구체예는 기관, 조작 또는 그 밖의 생물학적인 샘플을 둘러싸고 있는 수액내로 부동화 단백질을 도입시키는 것이다. 이식 수술 또는 저장 목적을 위해 병원으로 수송되는 동안 하나의 특정 사용이 이루어질 것이다. 부동화 단백질은 빙점하의 온도에서 단기간 또는 장기간 저장을 허용하여, 고유의 대사 또는 분해반응(얼음 결정 성장으로부터의 실질적으로 감소된 세포 손상을 갖지만)을 최소화시켜야 한다. 그 밖의 의학적으로 중요한 온도 민감성 생물학적인 샘플은 혈액 및 혈액 산물, 치료제, 단백질 약물, 생검 시약 및 백신이다.
더욱 또 다른 구체예는 냉동 저장될 세포 또는 이들의 추출액내로 부동화 단백질을 도입시키는 것이다. 예를 들어, 박테리아 세포, 효모 세포, 식물, 식물 세포 및, 가장 특히, THP를 함유하는 동물 세포는 냉동-해동 과정으로 인해 고유 특성이 최소로 또는 전혀 손실이 없는 증가된 세포 또는 조직 생존력을 갖는다. 세포 억제 샘플 또는 세포 추출액은 특히 장기간의 저장시에 냉동에 유사한 민감성을 갖는다. 전형적인 예로는 체외의 단백질 번역 시스템, 효소 제조물, 및 특히 엽록체 또는 미토콘드리아 막 제조물과 같은 민감한 막 성분을 함유하는 샘플이 있다. 특히, 세포 기관을 함유하는 샘플은 이들 부동화 폴리펩티드의 첨가시에 냉동 손상에 증가된 내성을 보여줄 수 있다. 연성의 동물 조직은 대상 폴리펩티드의 존재하에서의 냉동시에 보다 적은 손상을 나타낼 것이며, 폴리펩티드의 첨가는 냉동 및 후속적인 해동시에 세포 완전성이 중요하거나 바람직한 경우에 유용할 것이다. 이와 같이, 세포 또는 조직 수탁용과 같은 냉동 저장하게 될 샘플은 이들에 첨가된 단백질을 가질 수 있다. 세포 타입 중에서도, 박테리아, 균류(효모 포함)와 같은 유전학적인 변이체, 및 특히 고등 진핵 세포(예, 히브리도마 스트레인 및 조직 배양 세포주)가 종종 저장된다.
당업자에게 널리 공지된 안정화제와 THP의 혼합물 및 그 밖의 첨가제를 기재로 하는 조성물 및 용도도 본 발명에 포함된다. 이들 화합물은 부패를 억제하고, 산화를 억제하고, 변색을 억제하고, 미생물 성장을 억제하고, 에멀션을 안정화시키 등의 목적으로 존재할 수 있다.
제빙 처리를 목적으로 하는 것과 같이, 비유기계에서 빙점을 감소시키거나 냉동을 억제하는데 적합한 THP를 기재로 하는 조성물도 본 발명에 포함된다.
본원에 기술된 실시예 및 구체예는 설명을 목적으로 한 것이며, 이러한 견지에서 변경 또는 변화가 당업자에게 제시되며, 이러한 변경 및 변화도 본 출원의 사상 및 범위, 및 특허청구의 범위의 범위내에 포함되어야 한다는 것이 이해되어야 한다.
실시예
하기의 실시예는 설명을 목적으로 제공된 것이며, 청구된 본 발명을 제한하려는 것은 아니다.
실시예 1: 코리스토네우라 종 유충으로부터의 THP
하기 실시예는 그 밖의 많은 종 보다 더 먼 북쪽에서 겨울을 나는 것으로 공지된 나비목의 종,코리스토네우라 푸미페라나의 혈임파로부터 THP의 단리를 상술한다.코리스토네우라속의 두 종,코리스토네우라 푸미페라나및코리스토네우라 옥시덴탈리스의 균등질은 실험실에서 특히 높은 부동화 활성(하기에 기술된 정량화 방법에 의해)을 보여주었다.
이스턴 가문비나무 모충(코리스토네우라 푸미페라나) 제 2 영 유충을 캐나다 온타리오 솔트 스테. 마리 포레스트리 캐나다에 소재하는 인섹트 프로덕션 유닛 오브 더 포레스트 페스트 매니지먼트 인스티튜트(Insect Production Unit of the Forest Pest Management Institute)에서 구입하였다. 2 내지 4℃에서 20 내지 30주 후에, 치이즈클로쓰로부터 휴면중인 유충을 수집하고 하기에 기술된 바와 같이 사용하였다.
차크라바티(Chakrabatty) 등(1991)의 방법에 따라서 클리프톤 디렉션 리딩 나노리터 오스모미터(Clifton Direction Reading Nanoliter Osmometer)(뉴욕 하트포드에 소재하는 클리프톤 테크니컬 피직스(Chlifton Technical Physics))를 사용하여 열력(즉, 용액의 빙점과 용융점의 온도차(℃))에 의해 THP의 추출 및 정제 동안 부동화 활성을 검정하였다. 이러한 검정 동안, 얼음 결정 형태학에 관한 AFP의 효과를 모니터링하고 비디오 검경에 의해 기록하였다. 전체 단백질 농도는 비색 검정(브래드포드, 1976) 또는 230nm에서의 흡광도(A230)에 의해 모니터링하였다.
모든 용액 및 얼음상의 샘플을 유지시키고, 이스턴 가문비나무 모충의 제 2 영 유충 100mg을 1mM 페닐메틸술포닐 플루오라이드(PMSF, 프로테아제 억제제) 및 0.5mM 페닐티오우레아(페닐 옥시다아제 억제제)를 함유하는 0.1M NH4HCO3250㎕(pH 8.0) 중에서 균질화시켰다. 균등질을 4℃에서 2분 동안 10,000×g에서 마이크로퓨지에서 원심분리시킨 후, 균질화 완충액에 대하여 밤새 투석하였다. 투석물을 펄터 스핀 칼럼(캐나다에 소재하는 바이오-래드 허큘레스(Bio-Rad Hercules)에서 구입)상에서 로딩시켜서 세포 잔해 및 미립 물질을 제거하였다.
어류 혈청으로부터 AFP의 분리를 위한 표준인 크래마토그래피 방법을 사용하여 생성된 여과물로부터 THP를 정제하였다[참고문헌: Fourneyet al., 1984; Liet al., 1985; Nget al., 1986]. 먼저, THP를 균질화 완충액중에서 세파덱스 G-75 칼럼(스웨덴 웁살라에 소재하는 파르마시아(Pharmacia)에서 구입)상에서 4℃에서 겔 여과에 의해 크기별로 선택하였다. 보이드(void) 피크 후에 곧바로 THP를 용리시켰다. 그런 다음, 가장 높은 열력 활성을 갖는 분획을 푸울링시키고, 동결건조시키고, H2O 1mL 중에 현탁시키고, 재동결건조시키고, H2O 100㎕ 중에 재현탁시켰다. 그런 다음, 샘플을 0 내지 65%(v/v) 범위의 선형 아세토니트릴 기울기를 사용하여 0.1% 트리플루오로아세트산(TFA)중의 C18 역상 칼럼상에서 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)(베크만(Beckman))를 수행하였다. 도 1에 도시된 바와 같이, 열력 활성을 나타내는 한 무리의 피크(22, 23 및 24로 표지)로서 이러한 칼럼으로부터 THP를 용리시켰다. 이러한 결과는 한 세트의 THP 이소형에서의 분류와 일치하였다.
특정의 시험에서, 이소형을 HPLC에 의해 재분류시켜서 이들의 순도를 개선시켰다. 이러한 방법을 사용하여 MALDI(매트릭스 지지된 레이저 탈착/이온화: matrix-assisted laser desorption/ionization) 질량 분광법에 의해 측정된 바와 같이 각각의 이소형에 대한 단일의 분자량 단백질 생성물을 수득하였다. 피니간 TSQ700 삼중 4중극 질량 분광계(캘리포니아 샌어제이에 소재하는 피니간(Finnigan))상에서 전기분무 질량 분광법을 사용하여 3개 이상의 개별적인 AFP 이소형(모두 약 9,000Da의 분자량을 가짐)을 동정하였는다. THP 이소형을 아미노산 분석(캘리포니아 포스터 시티에 소재하는 어플라이드 바이오시스템즈, 인코포레이티드의 모델 920A)하였다.
실시예 2 : THP의 단백질 시퀀싱
도 1의 피크 24에 상응하는 THP 이소형 2㎍을 요오도아세트아미드와의 반응에 의해 시스테인상에서 환원시키고 알킬화시켰다. 공유결합적으로 개질된 THP를 트립신을 사용하여 침지시키고 0.1% 트리플루오로아세트산중의 비닥(Vydac) C18 칼럼상에서 역상 HPLC에 의해 침지 생성물을 용해시켰다. 세 파장: 210nm, 277nm 및 292nm에서 용리 프로파일을 모니터링하였다. 소수의 개별적인 잘 분리된 트립신에 의해 잘린 펩티드를 피니간 레이저매트 질량 분광계(캘리포니아 샌어제이에 소재하는 피니간)상에서 수행한 MALDI 질량 분광법에 의해 분석하였다. 모델 120A 페닐티오히단토인(PTH)-아미노산 분석기를 갖춘 어플라이드 바이오시스템즈, 인코포레이티드의 모델 477A 단백질 시퀀서를 사용하여 자동 에드만(Edman) 분해반응(하바드 유니버시티의 하바드 마이크로켐)에 의해 세 개의 상기 펩티드를 시퀀싱하였다. 수득된 펩티드 서열은 서열 번호: 6, 서열 번호: 7 및 서열 번호: 8로서 나타냈다. 또한, 이러한 이소형의 N-말단 서열을 침지되지 않은 단백질의 시퀀싱으로부터 결정하고 서열 번호: 9로서 나타냈다. 하이픈은 기술된 원안을 사용하여 최종 확인될 수 없는 아미노산 잔기를 의미하며; 그러나, 대다수의 경우, 그러한 잔기는 시스테인일 것이다. 본 발명자들은 서열 번호: 9가 내부 트립신에 의해 잘린 펩티드 서열중의 한 서열, 즉 서열 번호: 7과의 오버랩을 보여주는 것을 인지하였다.
도 1의 분획 23에 상응하는 이소형의 N-말단 서열을 결정하고 서열 번호: 10으로서 나타냈다. 수득된 서열이 서열 번호: 7과의 어떠한 오버랩을 보여주기에 매우 충분히 연장되어 있지 않지만, 본 발명자들은 서열 번호: 9로 나타낸 N-말단 서열에 분명히 일치함을 인지하였다. 이것은 이웃하는 HPLC 피크의 이소형 상태를 확실하게 하였다.
실시예 3: THP cDNA의 클로닝 및 시퀀싱
핵산 서열(서열 번호: 1) 및 단백질 서열 정보(서열 번호: 2 및 서열 번호: 3)을 사용하여 하나 이상의 가문비나무 모충 부동화 유전자 및 cDNA 확인용으로 PCR 프라이머 및 올리고누클레오티드를 침지시킬 수 있었다. 서열 번호: 4와 서열 번호: 5 및 서열 번호: 13과 서열 번호: 14와 같은, THP 서열을 발생시키는 것으로 공지되어 있는 PCR 프라이머를 사용하여, 새로운 THP 종 및 이소형을 직접 증폭시킬 수 있었다.
대안적으로, 올리고누클레오티드는 다양한 혼성 기술 및 조건을 사용하여 THP 코딩 핵산을 검출하는데 유용할 수 있다. PCR, 단리된 DNA의 효소적 제한 침지, 또는 유기 합성을 포함하여 임의의 공지된 기술을 사용하여 이들 올리고누클레오티드를 발생시킬 수 있었다. 이들 핵산을 검출하기 위해 표지화시키고, 상기된 바와 같은 어떠한 기술에 의해서도 DNA에 혼성시킬 수 있었다.
전체 RNA를 코리스토네우라 종 유충으로부터 추출하고 제조업자의 지침에 따라 QuickPrep Micro mRNA 정제 키트(뉴저지 피스캐트어웨이 파르마시아(Pharmacia))를 사용하여 mRNA 용으로 부화시켰다. 그런 다음, 샘브룩에 의해 기술된 바와 같이, 예를 들어 조류의 골수아구증 바이러스(AMV) 역전사 효소(파르마시아)를 사용하는 역전사에 의해 cDNA 주형을 제조하기 위해 mRNA를 사용하였다.
증폭은 다양한 아닐링 조건, 예를 들어 40분 동안 52℃에서의 아닐링 후 15분 동안 72℃에서의 연장화 및 이어서 1시간 동안 94℃에서의 변성을 포함하였다. 이것을 전체 약 30 내지 40 사이클을 반복하여 DNA 생성물을 수득하고, 수득된 생성물을 정제하였다. 다이 터미네이터 사이클 시퀀싱 키트 레디 리액션 키트(CA 포스터 시티에 소재하는 어플라이드 바이오시스템즈) 및 모델 373A DNA 시퀀서(어플라이드 바이오시스템즈)를 사용하는 디데옥시-사슬 말단화 방법과 같은 어떠한 공지된 기술에 의해서도 PCR 생성물을 시퀀싱할 수 있었다.
컴퓨터 데이타베이스 및 프로그램을 사용하여 공지된 THP 서열에 서열 동일성, 또는 동족성을 확인하기 위해 생성된 DNA 서열을 분석하였다. 예를 들어, PC/GeneTM 소프트웨어(CA 마운틴 뷰에 소재하는 인텔리제너틱스 인코포레이티드(IntelliGenetics Inc.))는 서열을 정렬시키고 개방 리딩 프레임을 디스플레이한다. 블라스트 엔(BLAST N) 및 블라스트 디(BLAST D) 써치 알고리즘을 사용하여 데이타베이스내에서 유도된 THP 서열과 공지된 서열 사이의 어떠한 매치에 대해서도 진뱅크 데이타베이스(NIH, Bethesda, MD)를 조사하였다.
실시예 4 : THP에 유도된 항체의 배양
본 발명자들은 유용한 항체가 배양될 수 있는 항원 결정소의 우수한 후보로서 9,060 Da의 성숙한 THP의 친수성 펩티드(서열 번호: 3)를 확인하였다. 이러한 펩티드는 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 지녔다. 도시된 바와 같이 N-말단이 아세틸화되고 C-말단이 아미드화된 펩티드를 표준 기술에 의해 화학적으로 합성하였다. 이러한 펩티드에 대하여 다클론성 항체를 할로우(Harlow) 및 레인(Lane)(1988)에서 일반적으로 약술된 방법을 사용하여 캐나다 온타리오 킹스턴 퀸즈 유니버시티에 소재하는 코어 패실러티에서 뉴질랜드산 흰토끼에서 배양하였다. 상기된 바와 같이, 항혈청을 사용하여 웨스턴 블롯에서 THP를 검출하고, 이를 사용하여 THP에 대한 재조합 발현 라이브러리를 검출하였다.
실시예 5 : 얼음 결정 형성에 대한 THP의 효과
실시예 1에 기술된 바와 같이, THP의 열력 검정을 비디오 검경에 의해 기록하였다. 이것은 다음과 같은 관심있는 관찰을 유도하였다: 본 발명의 THP를 함유하는 용액을 동결시켰을 때, 얼음은 평탄한 파형을 이뤘다. 이것은 가문비나무 모충의 제 2 영 유충의 미정제 추출물로부터 형성된 얼음의 현미경 사진으로서 도 3a에 도시하였다. 이와는 대조적으로, 어류의 THP를 함유하는 용액을 동결시켰을 때, 얼음은 전형적으로 날카로우면서 침상체 모양을 이뤘다. 이러한 바다에 서식하는 대구 타입 III 부동화 단백질(5mg/mL)의 예는 도 3b에 도시하였다. 그러한 날카로운 얼음 형성은 세포의 전단을 야기시킬 수 있다.
본원에 기술된 실시예 및 구체예는 설명을 목적으로 한 것이며, 이러한 견지에서 변경 또는 변화가 당업자에게 제시되며, 이러한 변경 및 변화도 본 출원의 사상 및 범위, 및 특허청구의 범위의 범위내에 포함되어야 한다는 것이 이해되어야 한다. 본원에 인용된 모든 공보, 특허 및 특허출원은 모두 참조로 인용된 것이다.
(1) 일반적 사항
(i) 출원인:
(A) 성명: 퀸즈 유니버시티 엣 킹스턴
(B) 거리: 퀸즈 유니버시티
(C) 도시: 킹스턴
(D) 주: 온타리오
(E) 국가: 캐나다
(F) 우편 번호: 케이7엘 3엔6
(G) 전화: (613) 545-2342
(H) 팩스: (613) 545-6853
(I) 텔렉스:
(A) 성명: 왈커, 버지니아, 케이.
(B) 거리: 알.알. #1
(C) 도시: 시든햄
(D) 주: 온타리오
(E) 국가: 캐나다
(F) 우편 번호: 케이0에이치 2티0
(G) 전화:
(H) 팩스:
(I) 텔렉스:
(A) 성명: 데이비스, 피터, 엘.
(B) 거리: 디킨스 드라이브 100
(C) 도시: 킹스턴
(D) 주: 온타리오
(E) 국가: 캐나다
(F) 우편 번호: 케이7엠 2엠8
(G) 전화:
(H) 팩스:
(I) 텔렉스:
(A) 성명: 라하바드, 미트라
(B) 거리: 써 존 에이. 맥토날드 불러바드 10이-244
(C) 도시: 킹스턴
(D) 주: 온타리오
(E) 국가: 캐나다
(F) 우편 번호: 케이7엠 5더블유9
(G) 전화:
(H) 팩스:
(I) 텔렉스:
(A) 성명: 티신코, 마이클, 지.
(B) 거리: 토론토 스트리트 3
(C) 도시: 킹스턴
(D) 주: 온타리오
(E) 국가: 캐나다
(F) 우편 번호: 케이7엘 4에이3
(G) 전화:
(H) 팩스:
(I) 텔렉스:
(ii) 발명의 명칭: 가문비나무 모충 부동화 단백질, 유전자 및 이들을 사용하는 방법
(iii) 서열의 수: 17개
(iv) 연락처:
(A) 수신인: 파테큐 이노베이션스
(B) 거리: 퀸즈 유니버시티
(C) 도시: 킹스턴
(D) 주: 온타리오
(E) 국가: 캐나다
(F) 우편 번호: 케이7엘 3엔6
(v) 컴퓨터 판독 형태:
(A) 매체 유형: 플로피 디스크
(B) 컴퓨터: IBM PC 호환기종
(C) 작업 시스템: PC-DOS / MS-DOS
(D)소프트웨어: Patentin Release #1.0, 버전 # 1.30
(vi) 현재 출원 상황:
(A) 출원 번호: PCT/CA97/00371
(B) 출원일: 1997-6-3
(C) 분류:
(vii) 우선 출원 상황:
(A) 출원 번호: 미국특허출원 제 08/657,264 호
(B) 출원일: 1996-6-3
(viii) 변리사/대리인 상황
(A) 성명: 스티그, 캐롤 미에르니키
(B) 등록 번호: 4250 (캐나다)
(C) 참고/서류 번호: Q1669
(ix) 통신처
(A) 전화: (613) 545-2342
(B) 팩스: (613) 545-6853
(2) 서열 번호 1에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 1387 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1 본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 서열의 종류: cDNA
(2) 서열 번호 2에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 108 아미노산
(B) 서열의 형: 아미노산
(C) 쇄의 수:
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 서열의 종류: 단백질
(2) 서열 번호 3에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 90 아미노산
(B) 서열의 형: 아미노산
(C) 쇄의 수:
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 서열의 종류: 단백질
(2) 서열 번호 4에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 32 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1 본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 서열의 종류: DNA
(2) 서열 번호 5에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 33 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1 본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 서열의 종류: DNA
(2) 서열 번호 6에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 15 아미노산
(B) 서열의 형: 아미노산
(C) 쇄의 수:
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 서열의 종류: 펩티드
(2) 서열 번호 7에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 22 아미노산
(B) 서열의 형: 아미노산
(C) 쇄의 수:
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 서열의 종류: 펩티드
(2) 서열 번호 8에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 18 아미노산
(B) 서열의 형: 아미노산
(C) 쇄의 수:
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 서열의 종류: 펩티드
(2) 서열 번호 9에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 25 아미노산
(B) 서열의 형: 아미노산
(C) 쇄의 수:
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 서열의 종류: 펩티드
(2) 서열 번호 10에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 19 아미노산
(B) 서열의 형: 아미노산
(C) 쇄의 수:
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 서열의 종류: 펩티드
(2) 서열 번호 11에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 18 아미노산
(B) 서열의 형: 아미노산
(C) 쇄의 수:
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 서열의 종류: 펩티드
(2) 서열 번호 12에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 16 아미노산
(B) 서열의 형: 아미노산
(C) 쇄의 수:
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 서열의 종류: 펩티드
(ix) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: 개질 부위
(B) 존재 위치: 1
(D) 기타 정보:/생성물="OTHER"
/주="Xaa = N-아세틸 시스테인"
(ix) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: 개질 부위
(B) 존재 위치: 16
(D) 기타 정보:/생성물="OTHER"
/주="Xaa = 발린아미드"
(2) 서열 번호 13에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 23 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1 본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 서열의 종류: DNA
(2) 서열 번호 14에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 23 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1 본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 서열의 종류: DNA
(2) 서열 번호 15에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 21 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1 본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 서열의 종류: DNA
(2) 서열 번호 16에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 20 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1 본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 서열의 종류: DNA

Claims (34)

  1. (i) 계산된 분자량이 7 내지 15kDa이고;
    (ii) 약 1mg/mL의 농도에서 열력 활성이 약 1.5℃ 보다 크고;
    (iii) (a) 서열 번호: 2 및 서열 번호: 3으로 구성된 군으로부터 선택된 부동화 단백질에 대하여 배양된 항체 특이적으로 결합하거나 (b) 서열 번호: 2 및 서열 번호: 3으로 구성된 군으로부터 선택된 부동화 단백질에 대한 아미노산 서열 동일성이 60% 이상인 부동화 단백질을 코딩시키는 단리된 핵산.
  2. 제 1항에 있어서, 코딩된 단백질의 계산된 분자량이 약 8 내지 12kDa임을 특징으로 하는 단리된 핵산.
  3. 제 1항에 있어서, 열력 활성이 약 1mg/mL의 농도에서 2℃ 보다 큼을 특징으로 하는 단리된 핵산.
  4. 제 1항에 있어서, 코딩된 단백질이 서열 번호: 2 및 서열 번호: 3으로 구성된 군으로부터 선택된 부동화 단백질에 대한 아미노산 서열 동일성이 80% 이상임을 특징으로 하는 단리된 핵산.
  5. 제 1항에 있어서, 코딩된 단백질이 서열 번호: 2 및 서열 번호: 3으로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 단리된 핵산.
  6. 제 1항에 있어서, 부동화 단백질이 곤충에서 발견될 수 있음을 특징으로 하는 단리된 핵산.
  7. 제 6항에 있어서, 부동화 단백질이코리스토네우라 종(Choristoneura sp.)에서 발견될 수 있음을 특징으로 하는 단리된 핵산.
  8. 엄격한 조건하에서, 서열 번호: 1에 특이적으로 혼성되는 단리된 핵산.
  9. 서열 번호: 2 및 서열 번호: 3으로 구성된 군으로부터 선택된 부동화 단백질에 대하여 유도된 항체에 특이적으로 결합하는 정제된 부동화 단백질을 코딩시키는 단리된 핵산.
  10. (i) 계산된 분자량이 7 내지 15kDa이고;
    (ii) 약 1mg/mL의 농도에서 열력 활성이 약 1.5℃ 보다 크고;
    (v) (a) 서열 번호: 2 및 서열 번호: 3으로 구성된 군으로부터 선택된 부동화 단백질에 대하여 배양된 항체 특이적으로 결합하거나 (b) 서열 번호: 2 및 서열 번호: 3으로 구성된 군으로부터 선택된 부동화 단백질에 대한 아미노산 서열 동일성이 60% 이상인 단리된 부동화 단백질.
  11. 제 10항에 있어서, 부동화 단백질이 곤충에서 발견될 수 있음을 특징으로 하는 단리된 부동화 단백질.
  12. 제 10항에 있어서, 부동화 단백질이코리스토네우라 종에서 발견될 수 있음을 특징으로 하는 단리된 부동화 단백질.
  13. 제 10항에 있어서, 열력 활성이 약 1mg/mL의 농도에서 약 2℃ 보다 큼을 특징으로 하는 단리된 부동화 단백질.
  14. 제 10항에 있어서, 단백질이 서열 번호: 2 및 서열 번호: 3으로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 단리된 부동화 단백질.
  15. 면역학적 반응성 조건하에서 서열 번호: 2 또는 서열 번호: 3을 포함하는 부동화 단백질에 특이적으로 면역반응하는 항체.
  16. 면역학적 반응성 조건하에서 제 1항의 핵산에 의해 코딩된 단백질을 포함하는 부동화 단백질에 특이적으로 면역반응하는 항체.
  17. 엄격한 조건하에서 서열 번호: 1에 특이적으로 혼성되는 외인성 핵산 서열 또는 제 1항의 핵산이 도입되고, 부동화 단백질로서 외인성 핵산을 발현시키는 유기체.
  18. 제 17항에 있어서, 외인성 핵산 서열이 유기체로부터 외부적으로 발현되는 부동화 단백질로 번역됨을 특징으로 하는 유기체.
  19. 제 17항에 있어서, 유기체가 어류임을 특징으로 하는 유기체.
  20. 제 19항에 있어서, 어류가 염수 환경하에서 유지됨을 특징으로 하는 유기체.
  21. 제 19항에 있어서, 어류가 일종의살모니대(Salmonidae)과 임을 특징으로 하는 유기체.
  22. 제 17항에 있어서, 유기체가 식물임을 특징으로 하는 유기체.
  23. 제 17항에 있어서, 유기체가 진균류임을 특징으로 하는 유기체.
  24. 제 17항에 있어서, 유기체가 효모임을 특징으로 하는 유기체.
  25. 제 24항에 있어서, 효모가토룰로프시스 홀밀(Torulopsis holmil), 사카로미세스 프라질리스(Saccharomyces fragilis), 사카로미세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae), 사카로미세스 락티스(Saccharomyces lactis)및칸디다 슈도트로피칼리스(Candida pseudotropicalis)로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 유기체.
  26. 제 17항에 있어서, 유기체가 박테리아임을 특징으로 하는 유기체.
  27. 제 26항에 있어서, 박테리아가에스케리챠 콜리(Escherichia coli), 스트렙토코커스 크레모리스(Streptococus cremoris), 스트렙토코커스 락티스(Streptococcus lactis), 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus), 루코노스톡 시트로보룸(Leuconostoc citrovorum), 루코노스톡 메센터로이데스(Leuconostoc mesenteroides), 락토바실러스 악시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 락티스(Lactobacillus lactis), 비피도박테리움 비피둠(Bifidobacterium bifidum), 비피도박테리움 브리이브(Bifidobacterium breve) 및 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum)으로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 유기체.
  28. 제 10항의 부동화 단백질을 수용액에 첨가하는 것을 포함하여, 수용액의 빙점을 감소시키는 방법.
  29. 제 1항의 핵산에 의해 코딩된 부동화 단백질을 수용액에 첨가하는 것을 포함하여, 수용액의 빙점을 감소시키는 방법.
  30. 제 28항 또는 제 29항에 있어서, 수용액이 유기체에 적용됨을 특징으로 하는 방법.
  31. 제 28항 또는 제 29항에 있어서, 부동화 단백질이 재조합 수단에 의해 생성됨을 특징으로 하는 방법.
  32. 제 28항 또는 제 29항에 있어서, 부동화 단백질이 제 15항 또는 제 16항의 항체에 추가로 특이적으로 결합함을 특징으로 하는 방법.
  33. 제 28항에 있어서, 부동화 단백질이 서열 번호: 2 및 서열 번호: 3으로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  34. 제 28항에 있어서, 부동화 단백질이 서열 번호: 1에 특이적으로 혼성되는 핵산 분자에 의해 코딩됨을 특징으로 하는 방법.
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Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9801408D0 (en) * 1998-01-22 1998-03-18 Unilever Plc Frozen food product
US20020173024A1 (en) * 2000-06-08 2002-11-21 Horwath Kathleen L. Nucleic acid sequences encoding type III tenebrio antifreeze proteins and method for assaying activity
AU2001279130A1 (en) * 2000-08-01 2002-02-13 Qwest Communications International Inc. Performance modeling, fault management and repair in a xdsl network
US6923939B1 (en) * 2001-07-05 2005-08-02 Uop Llc Heat activated membrane introduction apparatus and method for screening materials
AU2002352231A1 (en) * 2002-01-04 2003-07-15 Unilever Plc Antifreeze proteins in vegetables
WO2003087532A1 (en) 2002-04-12 2003-10-23 Queen's University At Kingston Antifreeze proteins for inhibition of clathrate hydrate formation and reformation
US7052916B2 (en) * 2002-05-24 2006-05-30 Immunex Corporation Polypeptide analyses using stable isotope labeling
JP4718493B2 (ja) * 2004-02-04 2011-07-06 キアジェン ノース アメリカン ホールディングス，インコーポレイティド 核酸増幅中のプライマー凝集体形成を減少させるためのｄＵＴＰに基づく組成物
KR100543063B1 (ko) * 2004-03-16 2006-01-20 (주)넥스젠 재조합 단백질의 제조 및 분리 방법
US20060280847A1 (en) * 2005-05-26 2006-12-14 Cardon George H Apparatus and method for serving a frozen confection
JPWO2012026596A1 (ja) * 2010-08-26 2013-10-28 株式会社ニチレイフーズ 熱ヒステリシス活性増加方法、熱ヒステリシス活性の熱失活の低減方法、及び熱ヒステリシス活性増加用組成物
CN104927789B (zh) * 2015-06-26 2016-04-20 中南大学 一种用于动态冰浆蓄冰储能的载冷剂
CN111417656A (zh) 2017-08-23 2020-07-14 西卡肿瘤解决方案有限公司 细胞膜穿透缀合物
CN107840874A (zh) * 2017-12-11 2018-03-27 江南大学 一种重组胡萝卜抗冻蛋白基因CaAFP及其应用
GB201902648D0 (en) * 2019-02-27 2019-04-10 Cyca Oncosolutions Ltd Cell membrane penetrating conjugates
CN110367208A (zh) * 2019-08-30 2019-10-25 浙江省农业科学院 一种稻螟赤眼蜂滞育诱导储存的方法
CN110950945B (zh) * 2019-12-31 2021-08-31 石河子大学 一种蝠蛾昆虫的抗冻蛋白及其编码基因和应用
CN114395025B (zh) * 2021-01-27 2023-08-08 昆明学院 白蜡虫抗冻蛋白基因ep-afp及其用途

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5118792A (en) * 1989-05-10 1992-06-02 Dna Plant Technology Corporation Ice crystal growth suppression polypeptides and method of making
US5358931A (en) * 1990-01-17 1994-10-25 The Regents Of The University Of California Interaction of thermal hysteresis proteins with cells and cell membranes and associated applications
US5356816A (en) * 1991-11-19 1994-10-18 Board Of Trustees Operating Michigan State University Method and compositions using polypeptides of arabidopsis thaliana
US5296462A (en) * 1992-11-19 1994-03-22 Board Of Trustees Operating Michigan State University Method and compositions using polypeptides of arabidopsis thaliana
US5627051A (en) * 1995-06-07 1997-05-06 University Of Notre Dame Du Lac Nucleic acid sequences encoding dendroides antifreeze proteins

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