CN1221450A - 枞色卷蛾抗冻蛋白、基因及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

已经从枞色卷蛾属(包括东枞色卷蛾)中分离纯化获得一类热滞后抗冻蛋白(THP)。本发明提供编码这些抗冻蛋白的核酸。本发明也提供了与这些抗冻蛋白反应的抗体。本发明还包括通过在溶液中加入这些抗冻蛋白来降低水溶液冰点的方法。

Description

枞色卷蛾抗冻蛋白、基因及其使用方法
                 相关申请交叉文献
本申请是1996年6月3日提交的美国申请No.08/657,264的部分续展申请，该申请结合入本文作参考。
                      发明背景
当今，制冷尤其是冷冻是常用的且较佳的保藏生物制品的方法。尽管制冷保留了样品的一些重要性质，但是其它性质仍以缓慢但显著的速度受损。冷冻虽然可阻止大多数这种损害，但是冷冻和解冻的结合会导致其它变化，破坏其它重要的性能。
在现今社会中，冷冻食品已经成为人类日常饮食的主要部分。为了确保高质量的产品，满足消费者口味的需求，食品加工者已经对尤其是冷冻蔬菜以及冷冻甜点(如冰淇淋)进行了广泛的研究。现已知道，再次结晶对冷冻食品的味道和质地产生很大的不利影响。运输时更经常伴有温度波动的无霜冷冻机的出现加剧了这种情况。保存在不低于0℃的温度下或者即使维持在冰点温度下相当短的时间后，许多冷冻食品会使人失去胃口，或会变坏而根本不适合人食用。
尽管已经采用了各种技术来减少再结晶带来的损坏，但是取得的进展很有限，仍有大量问题存在。对冷冻食品的加工作改动常会显著影响冷冻食品的质量、颜色、口味和/或质地。另外，额外的加工是非常昂贵和耗时的，从而使得加工方法不经济。在食品中加入添加剂也会有类似问题。
对于生物制品，如治疗药物、血浆、组织培育用的哺乳动物细胞等，冷冻会引起大量的破坏。例如，冷冻本身会杀死大多数真核细胞，而且只经历一次冻融的细胞就会表现出活力大大降低。在组织深低温保藏中也普遍存在存活细胞功能受损的情况，从而给器官移植带来缺点。同样，在农业上霜冻或其它冷冻对作物的损伤也是一个严重的问题。最后，如果药物不维持在所需的严格的温度条件下，就会变得失效甚至有害。
虽然大约30年前就已首次描述了在黄粉虫(Tenebrio molitor)中的蛋白质介导的热滞后(TH)(Grimstone等，Philos.Trans.B 253:343(1968))，但是纯化这些热滞后蛋白质(THP)的许多尝试并未获得有足够TH的纯化组分来解释血淋巴活性(Grimstone，等，(1968)；Patterson & Duman,J.Exp.Zool.210:361(1979)；Schneppenheim & Theede Comp.Biochem.Physiol.67B:561(1980)；Tomchaney，等，Biochemistry 21:716 (1982)；Paterson Duman J.Exp.Zool.219:381(1982)；以及(Horwath,et al.,Eur.J.Entomol.93:419(1996))。这些蛋白质的均一性并没有得到证实，它们之间的氨基酸组成互不相同，也不与本文报道的组成相同。
当前需要促进生物体物质低温保藏性质(包括冷冻食品和生物制品的保存)的合适的新技术和新组分。理想的是，这些方法和组分是廉价的，而且是完全安全的，适于人类消费或体内治疗之用。也需要有合适的新方法和新组成来降低非生物体系统的冰点、或抑制其结冰(如除冰处理)。本发明满足了这些需求以及其它需要。
                        发明慨述
东枞色卷蛾(Choristoneura fumiferana)和西枞色卷蛾(Choristoneuraoccidentalis)是北美森林中的耐冻害虫。它们的抗冻防御靠的是它们血淋巴中的热滞后(TH)活性，热滞后活性可以使昆虫在冰或冰核存在下降低它们的冰点。这种活性用含冰溶液的冰点和融点间的温度差(℃)来确定。枞色卷蛾幼虫的血淋巴证明，冰点降低超过4℃。
本发明提供了编码在枞色卷蛾幼虫中起热滞后作用的蛋白质的核酸分子，如SEQ ID NO:1中的核酸。本发明也提供可分离出的核酸编码的抗冻蛋白，该蛋白质的性质如下：计算分子量在7-15kDa间；在约1mg/mL浓度下其热滞后活性大于约1.5℃；可与抗冻蛋白或其抗原片段的抗体特异性结合，此种抗原性片段选自SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3，或有至少60％氨基酸序列与选自SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的抗冻蛋白相同。在一个较佳的实例中，分离出的核酸编码计算分子量约为8-12kDa的蛋白质。在一个较佳的实例中，核酸编码的蛋白质热滞后活性在约1mg/mL浓度时大于2℃。在一个较佳的实例中，核酸编码的蛋白质有至少80％的序列与选自SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的抗冻蛋白相同。在还有一个实例中，本发明提供了编码有SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示序列的蛋白质的核酸。在另一个实例中，分离出的核酸可编码在昆虫中发现的蛋白质，在较佳的实例中该昆虫是枞色卷蛾属。本发明也提供了分离出的核酸，该核酸可在严格的条件下与SEQ ID NO:1特异性杂交。本发明还提供一种从纯化的枞色卷蛾属抗冻蛋白中分离的核酸，该抗冻蛋白可与针对选自SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3抗冻蛋白的抗体特异性结合。
本发明提供了THP蛋白质，其包括从本发明核酸衍生获得的重组蛋白质。THP前体蛋白(SEQ ID NO:2)N端有18个残基信号序列(SEQ ID NO:11)，该序列断裂后生成成熟的THP蛋白(SEQ ID NO:3)(见图2，在图中显示了枞色卷蛾THP的cDNA和相应的氨基酸序列)。前体蛋白质(SEQ ID NO:2)的分子量约为11000道尔顿，成熟THP(SEQ ID NO:3)蛋白质的分子量约为9060道尔顿。本发明也提供了一种分离的抗冻蛋白，该蛋白质的计算分子量约为7-15kDa；在约1mg/mL的浓度下其热滞后活性大于约1.5℃；而且它可与选自SEQ ID NO:2和SEQ IDNO:3的抗冻蛋白产生的抗体特异性结合，或者有至少60％氨基酸序列与选自SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的抗冻蛋白相同。在一个较佳的实例中，可在昆虫中发现抗冻蛋白，而在一个更佳的实例中，该昆虫是枞色卷蛾属。在一个较佳的实例中，抗冻蛋白在约1mg/mL的浓度下其热滞后活性大于约2℃。在另一个较佳的实例中，抗冻蛋白选自SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3。
本发明也提供了抗本发明蛋白质的抗体，该抗体可与本发明的蛋白质结合。本发明提供了在免疫反应条件下与包括SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的抗冻蛋白发生特异性免疫反应的抗体。本发明也提供了一种抗体，该抗体可在免疫反应条件下与包括权利要求1所述核酸编码的蛋白质在内的抗冻蛋白发生特异性免疫反应。
在本发明的另一个实例中，提供了转化的酵母、细菌和转基因生物。许多冷冻食品会由于持续处于冰点下温度或反复冷融而形成冰晶。本发明的THP的存在可提供更长的保藏期，使这些食品更加可口。预计转基因动物和植物可在冰点下的温度下更好地存活。本发明提供了一种生物，在该生物内引入外源核酸序列(该核酸序列可在严格的条件下与SEQ ID NO:1或权利要求1所述的核酸特异性杂交)，该生物可将外源核酸翻译成一种抗冻蛋白。本发明还提供了一种有外源核酸序列的生物，该外源核酸序列可翻译成抗冻蛋白表达到生物体外。在一个较佳的实例中，生物是鱼。在另一个较佳的实例中，生物是生活在咸水环境中的鱼，或该鱼是鲑科家族成员。在其它较佳的实例中，生物可以是植物、真菌、酵母或细菌。在另一实例中，如果生物是酵母，则其选自Torulopsis holmil、Saccharomycesfragilis、酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)、Saccharomyces lactis、以及Candida pseudotropicalis。在另一个实例中，如果生物是细菌，则其选自大肠杆菌(Escherichia coli)、坚忍链球菌(Streptococcus cremoris)、乳链球菌(Streptococcuslactis)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、嗜柠檬酸明串球菌(Leuconostoccitrovorum)、肠系膜样明串球菌(Leuconostoc mesenteroides)、嗜酸乳酸杆菌(Lactobacillus acidophilus)、乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)、Bifidobacteriumbifidum、Bifidobacteriu breve以及Bifidobacterium longum。
本发明提供了一种降低水溶液冰点的方法，该方法包括在水溶液中加入抗冻蛋白。在一个较佳的实例中，该方法包括将权利要求1所述的核酸编码的抗冻蛋白加入水溶液中。在另一个较佳的实例中，将水溶液施用于生物；抗冻蛋白用重组体方法来制得；抗冻蛋白可与权利要求13或14所述的抗体特异性结合；抗冻蛋白选自SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3；抗冻蛋白由与SEQ ID NO:1的核酸特异性杂交的核酸分子编码。
此外，认为将本发明的THP加入水溶液中可更好地保藏运输中的器官和其它生物制品。
也需要有合适的新方法和新组分来降低非生物系统的冰点或抑制其结冰(如去冰处理)。
参照说明书的其余部分，附图和权利要求可进一步理解本发明的特征和优点。
                          附图简述
图1是HPLC C18反相柱的洗脱曲线，在反相柱上加有枞色卷蛾第二龄期幼虫的蛋白质混合物，该混合物预先在Sephadex G-75柱上进行分子筛分离(见文本)。
图2表明枞色卷蛾THP的cDNA和相应的氨基酸序列。
图3A是枞色卷蛾第二龄期幼虫的粗提物上形成的冰的光学显微照片。图3B是含有约5mg/mL美洲大绵尉Ⅲ型THP蛋白质(在鱼类中，THP蛋白也称为AFP蛋白)的溶液形成的冰光学显微照片。
                          发明详述
本发明涉及分离的核酸序列编码的新一类的抗冻蛋白(THP)。获得天然THP基因的步骤通常包括：从枞色卷蛾属(如东枞色卷蛾和西枞色卷蛾)构建或获得基因文库，检测和分离所需的基因，将其克隆入合适的宿主细胞中，使其在宿主细胞中表达，然后纯化获得表达的蛋白质。天然的蛋白质可不经修饰加以使用，或是在不影响TH活性的条件下进行各种修饰。
本文引用的所有出版物、专利和专利申请均结合入本文作为参考。
Hew等报道了东枞色卷蛾的THP粗品与绒林父鱼(Hemitripterus americanus)的THP在胱氨酸含量高、分子量相近(约13kDa)、以及与绒林父鱼THP抗原交叉反应性方面相似。本发明的新的东枞包卷蛾THP至少在两个方面与Hew等描述的蛋白质不同。首先，其分子量约为9kDa。第二，它并不与抗-绒林父鱼多克隆抗血清交叉反应(Slaughter,D.,等，Antifreeze proteins from the sea raven,Hemitripterus americanus,J.Biol.Chem.256:2022-2026(1981)；Dr.Choy Hew,University of Toronto馈赠)。这样Hew等的制品与本发明的新型THP不同。
本发明的THP比至今为止公开的任何纯化的抗冻蛋白更具活性。本发明的THP提供的冰点降低程度比鱼类AFP(THP)或黄粉虫THP(由Patterson制备，如Patterson,J.等在The role of the thermal hysteresis factor in Tenebrio molitor larvae,J.Exp.Biol.74:37-45(1978)所述)提供的高几倍。
然而，和鱼类抗冻蛋白一样，枞色卷蛾THP看来是通过吸附-抑制机理来作用的。在THP存在下，直至超过不平衡的冰点时冰晶才生长。在此时，冰晶体从晶核中暴长，主要沿a轴形成固态冰，冰的前缘宽而光滑。相反，在鱼类AFP存在下，一旦超过冰点，无数冰针将沿着和平行于c轴暴长。
另外，与鱼AFP相似(DeVries,Annu.Rev.Physiol.45:245(1983)),TH活性和THP浓度间的关系呈双曲线。然而，在THP存在时形成的冰晶是不同寻常的，因为它们的表面有明显的弧度。相反，在鱼类Ⅰ型和Ⅲ型AFP存在下形成的冰晶是六方双锥形，有着多个界线清晰的小平面。
经纯化的表达的THP蛋白可直接加入水溶液中以降低冰点，或在另一个实例中，可表达抗冻蛋白的经转化生物可加入待冷冻保藏的物品(如冷冻甜点)中。在还有一个实例中，经转化的生物(即鱼、植物和酵母)不需要胞外表达THP蛋白，但是THP基因和胞内蛋白质的存在将提高生物在冰点温度下的存活能力。例如，经转化的生物可以是咸水鱼。经转化的咸水鱼包括鲑鱼亚科家族成员、大西洋庸鲽、裸盖鱼或任何没有抗冻蛋白或蛋白水平不足的可食咸水动物。用THP序列转化的植物包括葡萄、油籽植物如canola、谷类、柑橘类和甘蔗。
Ⅰ.定义
术语“抗体”指可以特异性识别和结合分析物(抗原)的、基本上由一个或多个免疫球蛋白基因或其片段编码的多肽。识别的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε、μ恒定区基因以及无数个免疫球蛋白可变区基因。轻链分为κ或λ。重链分为γ、μ、α、δ或ε，它们依次确定了免疫球蛋白类：IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。
典型的免疫球蛋白(抗体)结构单元包括一个四聚体。每个四聚体由两对相同的多肽链组成，每一对有一条“轻链(约25kD)”和一条“重链(约50-70kD)”。每条链的N端是有约100-110或更多的氨基酸的可变区，该可变区主要是起抗原识别作用。术语“可变轻链(VL)”和“可变重链(VH)”分别指这些轻链和重链。
例如，抗体以完整的免疫球蛋白形式存在，或以由各种肽酶消化产生的许多特性明确的片段的形式存在。因此，例如，胃蛋白酶在铰链区二硫键下消化抗体，形成Fab的二聚体F(ab)′2，该二聚体本身由轻链通过二硫键与VH-CH1相连。F(ab)′2可在温和的条件下被还原，铰链区内的二硫键断裂，使F(ab)′2二聚体变成Fab′单体。Fab′单体基本上是带部分铰链区的Fab(参见FUNDAMENTALIMMUNOLOGY,3RD ED.,W.E.Paul,ed.,Raven Press,N.Y.(1993))。尽管在完整的抗体消化时可以产生明确的各种抗体片段，但是普通技术人员也应当理解，这些片段可用化学从头合成或用重组体DNA方法来制得。因此，本文所用的术语“抗体”也包括通过对整个抗体进行修饰制得的或是那些用重组DNA法从头合成的抗体片段(如单链Fv)。
“抗冻蛋白抗体”指能与本发明的抗冻蛋白或其亚序列特异性结合的抗体或抗体片段。
术语“抗冻蛋白”指在一些异型体温生物(如枞色卷蛾属，如东枞色卷蛾或西枞色卷蛾，黄粉虫和植物)的体液中发现的蛋白质，它们有共同的已知性能，即它们可非依数性(non-colligatively)降低水的冰点。THP也称为“热滞后蛋白”。如本文所用的，“抗冻蛋白”或“THP”包括化学合成的以及重组产生的多肽，该多肽的蛋白质序列与天然存在的抗冻蛋白基本相似，而且保留了抗冻多肽的性质。
术语“降低水溶液冰点”指降低水溶液在形成冰晶时的温度。冰点的降低程度取决于用来降低冰点的组分及其在水溶液中的浓度。冰点降低幅度随着水溶液中加入的抗冻组分的增加而提高，直至达到特定的浓度而不再改变。再在水溶液中加入抗冻化学物质(如乙二醇)会使抗冻组分不溶，或是会提高混合物的冰点。另一方面，再加入本发明的THP不会对降低的溶液冰点有影响。
含有THP蛋白的溶液的冰点定义为含有冰晶成核剂的待测样品变成固态冰时的温度。冰晶可自发产生或从冰核扩张形成。没有成核剂时固态冰的自发形成通常称为THP的“过冷能力”。因为如果没有冰成核剂来引发冰的形成，就会在更低的温度下发生过冷。
除了用肉眼观察冰晶的形成外，可用热滞后测定法来测定溶液冰点和融点间的差值。溶液的融点是溶液仅有一片冰晶时的温度(见下文，关于TH活性的更完整的描述)。
在本文重组体蛋白部分中术语“外部表达”指转化细胞合成蛋白质并将其送到胞外基质中的能力。胞外基质可以是多细胞生物细胞的间质空间、细菌肉汤或组织培养基。对于细菌，外部表达也包括将重组蛋白表达入细菌的外周质中。外部表达可以是任何方式，例如分泌和运输小泡、以膜蛋白形式表达等。
在本发明内容中的术语“序列相同性”、“序列相似性”和“同源性”均表示，当将两个肽序列用例如GAP或BESTFIT程序以缺省的间隙重(default gapweight)进行最优对比时，它们有至少40％的序列相同，以至少50％序列相同为佳，至少60％序列相同为更佳。“氨基酸相同百分数”指两个多肽的氨基酸序列比较结果，当对两个多肽进行最佳对比排列时，它们的相同氨基酸接近指定百分数。例如“60％序列相同性”和“60％同源”指两个多肽的氨基酸序列比较结果，当将它们进行最佳对比排列时，它们有60％的氨基酸相同。较佳的，不同的残基位置是因保守氨基酸取代而不同。例如，化学性质(如电荷或极性)相似的氨基酸取代不太会影响蛋白质的性能。实例包括谷氨酰胺被天冬酰胺取代或谷氨酸被天冬氨酸取代。
术语“免疫反应条件”指抗体可以与抗原结合的环境。通常，它是免疫结合测定。
术语“分离的”在用于核酸或蛋白质时，表示核酸或蛋白质基本上不含其它在天然状态下相关的细胞成分。最好呈均质状态，但也可以是干的或水溶液。纯度和均一性通常可用分析化学方法如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱法来测得。在制品中占主要的蛋白质是基本上纯的。
具体地说，分离的抗冻蛋白基因是从侧接基因并编码非抗冻蛋白的蛋白的开放读框中分离获得的。术语“纯化的”表示核酸或蛋白质在电泳凝胶中基本上形成一条带。它尤其指核酸或蛋白质至少有85％纯，以至少95％纯为佳，至少99％纯为更佳。
术语“核酸分子”或“核酸序列”指脱氧核糖核酸或核糖核酸及其单链或双链形式的聚合物。除非另有特别限定，该术语包括含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，该核酸有与参比核酸相似的结合性能，并以与天然存在的核苷酸相似的方式进行代谢。除非另有所述，特定的核酸序列也包括其保守性修饰的变体(如简并密码子取代物)和互补序列，以及显式表示的序列。特别是，简并密码子取代可通过形成序列，使序列中一个或多个所选(或所有)密码子的第三个位置被混合的碱基和/或脱氧肌苷残基取代来实现的。(Batzer等，Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka等，J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；Rossolini等，Mol.Cell.Probes 8:91-98(1994))。术语核酸可与基因、cDNA和基因编码的mRNA互换。
术语“外源核酸”通常指一种核酸，该核酸经分离、克隆并连接入在自然界中不会与其发生结合的核酸中，和/或导入细胞或细胞环境并在其中表达，而该种细胞或细胞环境不是通常自然界中发现含有所述核酸或蛋白质的细胞或细胞环境。该术语包括从与表达核酸的细胞类型不同的生物或细胞类型原始获得的核酸，也包括从与表达核酸的细胞系相同的细胞系中获得的核酸。
术语“核酸编码序列”表示含有结构RNA(如rRNA、tRNA或mRNA)的序列信息的核酸，该信息可编码特定蛋白质或肽的初级氨基酸序列或是反式调节因子的结合位点。该术语特别包括天然序列或引入特定宿主细胞中以符合密码子优先的序列中的简并密码子(即编码单个氨基酸的不同密码子)。
术语“重组方法”指分离蛋白质、鉴定编码蛋白质的cDNA序列并插入表达载体中的方法。然后将载体引入细胞中，使细胞表达蛋白质。重组方法也包括将不同来源的编码或启动子DNA连接入表达融合蛋白的载体中，使蛋白质组成型表达或诱导型表达。
术语“特异性或选择性与抗体结合”或“发生特异性免疫反应”在指蛋白质或肽时，是指在大量异源蛋白质和其它生物制品存在下可测定蛋白质存在的结合反应。因此，在指定的免疫测定条件下，特定的抗体与特定的蛋白质结合，而不会与样品中其它蛋白质大量结合。在这样的条件下与抗体的特异性结合可能需要选择对特定蛋白质有特异性的抗体。例如，可选择针对本发明THP或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示部分序列编码产物的抗体，来与全长蛋白特异性免疫反应，而不与其它蛋白质(除非是多形性变体)结合。如下所述，可用各种免疫测定形式来选择与特定蛋白质发生特异性免疫反应的抗体。例如，通常用固相ELISA免疫测定来选择与蛋白质发生特异性免疫反应的单克隆抗体。参见Harlow和Lane(1988)ANTIBODIES,A LABORATORY MANUAL,Cold Spring HarborPublications,New York(“Harlow and Lane”)关于用来测定特异性免疫反应活性的免疫测定形式和条件部分。通常，特异性或选择性反应的信号至少是本底信号或噪扰的两倍，更通常的为大于本底的10倍-100倍以上。
术语“特异性杂交”指当细胞全部DNA或RNA的制品中存在靶序列时，核酸探针可以与特定的靶DNA或RNA序列杂交、组成双链或结合。“互补的”或“靶”核酸序列指那些可选择性与核酸探针杂交的核酸序列。合适的退火条件例如取决于探针的长度、碱基组成，以及错配的数量及其在探针上的位置，通常必需靠试验来确定。关于核酸探针设计和退火条件的描述，例如可参见Sambrook等，MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL(2ND ED.),Vols.1-3,Cold Spring Harbor Laboratory,(1989)(“Sambrook”)，其内容结合入本文作参考，或CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,F.Ausubel等，ed.Greene Publishing and Wiley-Interscience,New York(1987)(“Ausubel”)。
在核酸杂交实验(如Southern和Northern杂交)中，“严格的杂交”和“严格的杂交洗涤条件”取决于序列，而且在不同的环境参数下有所不同。在Tijssen(1993)LABORATORY TECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY AND MOLECULARBIOLOGY--HYBRIDIZATION WITH NUCLEIC ACID PROBES第2章第1部分(“overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probeassays”,Elsevier,New York)中有关于核酸杂交的广泛的指导。通常，选择高度严格的杂交和洗涤条件使得比在确定的离子强度和pH下特定核酸序列的热融点(Tm)低大约5℃。Tm是在确定的离子强度和pH下，50％的靶序列与最佳匹配的探针杂交时的温度。选择非常严格的条件，使其等于特定探针的Tm。在Southern或Northern印迹法中过滤器上有100个以上互补残基的互补性核酸杂交物的严格杂交条件实例是，42℃下50％福尔马林和1毫克肝素，杂交过夜。高度严格的洗涤条件实例是72℃ 0.15M NaCl洗涤约15分钟。严格的洗涤条件实例是65℃0.2×SSC洗涤15分钟(参见Sambrook关于SSC缓冲液的描述)。通常，高严格性的洗涤前有低严格性的洗涤以除去背景探针信号。例如超过100个核苷酸的双链体的中等严格性洗涤是45℃ 1×SSC洗涤15分钟。例如超过100个核苷酸的双链体的低严格性洗涤是40℃ 4-6×SSC洗涤15分钟。通常在特定的杂交测定中，信噪比为不相关探针所测得的信噪比的2倍(或更高)，就表明检测到有特异性杂交。如果核酸编码的多肽是基本相同的话，则在严格条件下不相互杂交的核酸仍是基本相同的。例如当用基因密码所允许的最大密码子简并性来生成核酸拷贝时，会发生这种现象。
术语“热滞后活性”或“TH活性”指改变含冰溶液的冰点和融点间温度差(℃)的能力。较佳的，TH活性可根据Lawson & Semler,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA88:9919(1991)中提出的步骤在纳升渗压计中观察冰晶的形成来测定。或者，可根据deVries,METHODS IN ENZYMOLOGY,VOL.127,Packer(ed.),Academic Press,New York(1986)所述的方法或其变化方案来测定TH活性。
例如，在本发明中，天然枞色卷蛾属(如东枞色卷蛾或西枞色卷蛾)血淋巴中的THP在1mg/mL下的TH活性大于约4℃。本发明的重组THP在1mg/mL时的TH活性约为4℃或更低。更佳的，TH活性低于约3℃。最佳的，TH活性在1.5-3℃间。据推测，天然THP和重组THP的TH活性间的小差别是因为在从细菌衍生获得的重组蛋白质没有最优的折叠。当蛋白质经适当折叠后，预计重组THP的TH活性将与天然THP的TH活性相似。
Ⅱ.编码THP的核酸
A．总体方法
本发明的核酸组分，无论是RNA、cDNA、基因组DNA还是基因重组的杂交体，均可从天然来源中分离获得，或可体外合成制得。权利要求所述的核酸可以存在于转化细胞中，转化细胞裂解物中或以部分纯化或基本纯的形式存在。
编码抗冻蛋白的基因的核酸操作方法，如文库的生成，亚克隆入表达载体，标记探针，DNA杂交等在Sambrook一书中均有大致描述。
本文中核酸和蛋白质的检测和定量可采用本领域技术人员熟知的许多方法中的任何一种。这些方法包括生化分析方法(如分光光度法、放射显影法、电泳、毛细管电泳、高效液相色谱法(HPLC)、薄层层析(TLC)、超扩散色谱法等)，以及免疫方法(如流体或凝胶沉淀素反应、免疫扩散(单向或双向)、免疫电泳、放射免疫测定(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫荧光测定等)。核酸的检测可用熟知的方法如Southern分析、northern分析、凝胶电泳、PCR、放射标记、闪烁计数和亲和层析来进行。
B．编码THP的核酸的分离
分离全部DNA或RNA的方法是本领域技术人员已知的。例如核酸的分离和纯化方法如LABORATORY TECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY ANDMOLECULAR BIOLOGY:HYBRIDIZATION WITH NUCLEIC ACID PROBES,Part I.Theory and Nucleic Acid Preparation,P.Tijssen,ed.Elsevier,N.Y.(1993)(“Tijssen”)中第3章所描述的。
1．DNA文库的制备和筛选
可采用许多方法来分离编码本发明的抗冻蛋白的DNA序列。例如，可用含有与本文公开的序列或亚序列(SEQ ID NO:4或5)互补序列的标记寡核苷酸探针来从基因组或cDNA文库中分离DNA。这些探针可直接用于杂交测定来分离编码同种型THP的DNA。或者，探针可用于扩增方法如PCR，并可用例如PCR方法(见下文)来分离编码THP的DNA。
为了制备cDNA文库，将mRNA从枞色卷蛾属幼虫或在组织培养物中生长的幼虫细胞中分离出来，用本领域熟知的方法从mRNA逆转录并插入载体中。将载体转染入重组的宿主中进行繁殖，然后筛选和克隆。制备和筛选cDNA文库的方法是熟知的。参见Gubler和Hoffman,Gene 25:263-269,(1983)和Sambrook。
为了制备基因组文库，用熟知的方法从幼虫中抽提出全部DNA并进行纯化(例如参见Sambrook)。用已知的方法(如机械剪切或酶消化)产生适当大小的DNA，获得约12-20kb的DNA片段。然后用梯度离心将片段与不需要的片段分离，并插入λ噬菌体或其它载体中。这些载体和噬菌体如Sambrook所述的在体外包装。用Benton & Davis,Science,196:180(1977)中所述的噬斑杂交分析重组的噬菌体。按照M.Grunstein，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,72:3961-3965(1975)中大致描述的方法进行菌落杂交。
可用与核酸探针(例如，SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:1 3、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16)在Southern印迹法上杂交的能力来鉴定cDNA或基因组文库中的编码THP的DNA。这些DNA区域一旦被鉴定就可用本领域技术人员熟知的标准方法来分离获得。或者，可用RNA在Northern印迹法中与核酸探针杂交的能力(参见Sambrook)来鉴定编码抗冻蛋白的RNA。
用作探针的寡核苷酸可根据由Beaucage和Carruthers首先提出的固相亚磷酰胺三酯方法用自动合成仪(如Needham-VanDevanter,D.R.,等，Nucleic Acids Res.12:6159-6168(1984)中所述)来化学合成。寡核苷酸的纯化可采用非变性丙烯酰胺凝胶电泳或阴离子交换HPLC(如Pearson,J.D.和Regnier,F.E.,J.Chrom.255:137-149(1983)中所述)。合成的寡核苷酸序列可用化学降解方法(Maxam,A.M.和Gilbert,W.,METHODS IN ENZYMOLOGY,65:499-560,(Grossman,L.和Moldave,D.,eds.),Academic Press,New York(1980))来验证。
也可用本领域技术人员已知的其它方法来分离编码抗冻蛋白的DNA。参见Sambrook和Ausubel中对于其它可用来分离编码特定蛋白质分子的DNA的方法。
2．编码THP的核酸的扩增
可用核酸序列(SEQ ID NO:1)和蛋白质序列信息(SEQ ID NO:2和SEQ IDNO:3)来设计用来鉴定抗冻蛋白(如枞色卷蛾THP)序列的PCR引物。可用已知可生成枞色卷蛾属THP序列的PCR引物对(如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5；SEQID NO:13和SEQ ID NO:14；SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16)来直接扩增新的抗冻蛋白种类和同种型。在东枞色卷蛾的一种同种型中，SEQ ID NO:4和SEQ IDNO:5引物对将扩增全长THP cDNA编码序列。
可用PCR引物对(如SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14)来直接扩增新的抗冻蛋白种类及其同种型，或用PCR引物对来生成包括信号序列、成熟蛋白质编码区和大部分3′非翻译区(即poly-A附着位点)的DNA探针。这些引物，无论是用来直接扩增新的THP种类，直接用作探针，还是用来生成(通过PCR扩增)较长的DNA探针，均还可以与各种不同的THP种类及其同种型(尤其是包括那些在信号序列和3′非翻译区的保守性比成熟蛋白质编码区的保守性好的THP序列变体)杂交。估计这些23聚体的引物的Tm为62℃。
PCR引物(如SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16)也可用来直接扩增新的抗冻蛋白种类及其同种型，或用来生成包括THP编码序列内部亚系列的DNA探针。在东枞色卷蛾的一种同种型中，SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16引物对可扩增获得编码成熟THP蛋白质内部模块的191碱基对的PCR产物。这些引物的估计Tm为62-64℃。
采用不同的杂交方法和条件，可用PCR生成的寡核苷酸来鉴定和检测编码抗冻蛋白的新的核酸。本领域技术人员应当知道，无论采用何种扩增方法，如果希望获得定量的结果，就必须注意采用可维持或控制扩增核酸的相对频率的方法。合适的扩增方法包括但不局限于：聚合酶链反应PCR(PCR PROTOCOLS,AGUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS,Innis，等，Academic Press,Inc.N.Y.,(1990)(“Innis”))，连接酶链反应(LCR)(参见Wu和Wallace,Genomics,4:560(1989)(“Wu”),Landegren等，Science,241:1077(1988)(“Landegren”)以及Barringer等，Gene 89:117(1990)(“Barringer”)；转录扩增(Kwoh等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:1173(1989)(“Kwoh”))；以及自动维持序列扩增(Guatelli，等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA,87:1874(1990)(“Guatelli”))。
上述所有的方法均可用来制备编码抗冻蛋白的DNA。在PCR技术中，合成与待扩增DNA区域两端互补的寡核苷酸引物。然后用这两个引物进行聚合酶链反应(参见Innis)。PCR可用于各种扩增、鉴定和分离编码THP核酸的过程。在这些过程中，通过分析本文列出的DNA序列，制成可鉴定可扩增编码抗冻蛋白的DNA的合适的引物和探针。例如寡核苷酸5′-CATATGCATATGGATGGCTCGTGTACAAACAC-3′(SEQ ID NO:4)和5′-AAGCTTAAGCTTTTAATTAGCACTGAAAGTACA-3′(SEQ ID NO:5)可用于PCR程序，以鉴定和扩增THPcDNA的不同种类和同种型。在东枞色卷蛾的一个同种型中，该引物对可扩增全长THP cDNA编码区。应注意，SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:5中有下划线的密码子分别表示THP同种型中发现的起始密码子和终止密码子。
如上所述，用来鉴定和扩增THP不同种类和同种型的其它引物对例子包括寡核苷酸5′-TGAAGTGTTTAATGCTGATCATG-3′(SEQ ID NO:13)和5′-CATTAGAGTAGCATAATGTAAGC-3′(SEQ ID NO:14)；和5′-TCCAAGTGCGAAAAATCGACG-3′(SEQ ID NO:15)和5′-GCTGATGGAGCAGGTACACC-3′(SEQID NO:16)。
PCR扩增的序列也可被标记并用作可检测的寡核苷酸探针，这些核酸探针可如上所述用本领域熟知的扩增方法来生成。另外，用熟知的方法，还可用标记的扩增DNA作为探针来进一步从各种cDNA或基因组文库中鉴定和分离其它抗冻蛋白种类或同种型。
DNA扩增的另一种方法是“RACE”方法。简单地说，该方法包括用随机的5′引物和确定的3′引物(5′RACE)或随机的3′引物和确定的5′引物(3′RACE)通过PCR来扩增DNA序列。然后将扩增后的序列亚克隆入载体中，再用标准方法在载体中对扩增序列进行测序。RACE方法是本领域技术人员所熟知的，用来进行RACE的试剂盒是商业上可获得的(例如，5′RACE系统，GIBCO BRL,GrandIsland,New York,USA)。
3．将编码THP插入物插入细菌中
如上所述，使全部DNA断裂，以制备和筛选基因组DNA，并将其插入噬菌体中。一旦确定(用PCR、杂交等方法)了含有所需的抗冻核酸序列的插入物，就将它们从λ噬菌体载体中切下，然后插入细菌载体中进行扩展。合适的细菌载体是本领域工作人员已知的，可从商业上购得。最合适的载体取决于采用的细菌、插入物的大小、对含有所需的插入物的细菌的检测方法以及从业者的偏好。
为了简化对含有插入物的载体所转化细菌菌落的鉴定，许多载体在酶(尤其是β-半乳糖苷酶)的编码区中有限制性酶切位点或其它剪接位点。如果插入物成功地插入载体的限制性或剪接位点，则酶被灭活。在用载体转化细菌后(见下文)，在异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(β-半乳糖苷酶的底物)存在下生长的菌落呈白色，而不含插入物的细菌长成的菌落呈蓝色。因此，如果插入物连接入载体的频率非常低，则只能从众多不含插入物的菌落中挑取到少量含插入物的菌落。
然后将载体引入大肠杆菌变体中。将外源DNA引入细菌细胞中的方法是本领域技术人员已知的，但是最常用的方法是电穿孔和感受态细胞的热休克。更通常的，感受态大肠杆菌是由商业上购得的(例如购自Invitrogen,San Diego,CA)。或者，可用本领域熟知的方法(Sambrook)使细菌成为感受态，以接受外源DNA。为了将含有感兴趣的插入物的载体引入细菌中，使感受态细菌经历热休克过程。简单地说，将细菌放置在冰浴中，在加入DNA后，将细菌温度升高至40-50℃(42℃较佳)。将细菌放回冰浴进行培育。关于将DNA引入细菌的更详细描述可参见Sambrook。
使细菌培养物生长并在琼脂糖上划平板。通常，载体编码区中的基因可使经转化的细菌能够耐受抗生素。因此，接受了载体的细菌可在掺有抗生素的琼脂糖平板上存活并形成菌落。存活菌落可用来肉汤培育，扩展成大量转化细菌的培养物。
用本领域熟知的方法可从细菌裂解液中获得纯化质粒和其它载体。有许多商业供应商出售可从全部细菌DNA获得纯化小的环化DNA(质粒)的试剂盒。这些试剂盒按照生产商的说明很容易使用，而且得率通常非常高。
4．THP DNA的测序
对新分离的DNA进行测序就可鉴定本发明的THP核酸、该核酸编码的THP种类或其等位基因变异体、以及本发明的抗冻蛋白并明确它们的特性。如果蛋白质有至少60％氨基酸序列与SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3确定的东枞色卷蛾THP序列相同，则认为该蛋白质是THP蛋白的同种型。
当抗冻蛋白编码序列仍为载体中的插入物、或从载体释放、或从载体分离时，就可对抗冻蛋白编码序列进行测序。THP编码插入物可通过限制性酶切或PCR扩增从载体中释放出。为了对插入物测序以求寻找那一个插入物含有全长抗冻编码序列，可用根据N端或C端而定的引物(如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5)或根据原始λ噬菌体中的插入点而定的引物作为引物。更佳的是，可合成其它引物以提供重叠的序列。通常，采用双脱氧测序方法(Sequenase,U.S.Biochemical)。然而，也可采用其它本领域技术人员已知的试剂盒和方法。
上述细菌克隆的另一种方法是，用辅助噬菌体(如R408(Stratagene))对cDNA文库的阳性λ噬菌斑进行斑内切割。然后可对双链DNA纯化、测序或用衍生自λ噬菌体的引物进行PCR扩增。
C．核酸杂交方法
本文公开的杂交方法可用来鉴定、分离和表征编码本发明的抗冻蛋白(包括不同的THP种类和等位基因变异)的基因和基因产物(即mRNA)。
采用核酸杂交方法来测定特定的DNA和RNA的各种方法是本领域技术人员已知的。参见NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION,A PRACTICAL APPROACH,Ed.Hames,B.D.和Higgins,S.J.,IRL Press,1985；Gall和Pardue,Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.63:378(1969)；John，等，Nature 223:582(1969)；和Sambrook。杂交形式的选择并不是关键。
例如，评价样品中编码抗冻蛋白的DNA是否存在的方法包括Southern转移法。简单地说，使消化的细菌基因组DNA在缓冲液中的琼脂糖板凝胶上走电泳，并转移到膜上。用核酸探针进行杂交。对于本发明的THP，核酸探针可根据这类蛋白质中的保守的核酸序列来设计。核酸探针宜有20个碱基或更长。(参见Sambrook关于选择核酸探针序列用于核酸杂交部分。)杂交部分的显现使得能够定性地确定编码抗冻蛋白的DNA是否存在。
同样，可用northern转移法来检测编码抗冻蛋白的mRNA。例如，用酸性胍-苯酚-氯仿抽提方法可从给定的细胞样品中分离出mRNA。然后对mRNA进行电泳，分离出mRNA类，将mRNA从凝胶转移到硝酸纤维素膜上。如同Southern转移法，可用标记的探针或PCR来鉴定编码抗冻蛋白的核酸是否存在。
夹心测定法是用来检测或分离核酸序列的商业上有用的杂交测定法。这些测定法采用共价固定在固体支持物的“捕获”核酸，以及溶液中标记过的“信号”核酸。临床样品则提供靶核酸。“捕获”核酸和“信号”核酸探针与靶核酸杂交，形成“夹心式”杂交复合物。为了使该方法有效，信号核酸不能与捕获核酸杂交。
通常，用标记信号核酸来检测杂交。互补核酸或信号核酸可用通常用来检测杂交多核苷酸存在与否的几种方法中的任一种来作标记。最常用的检测方法是用3H、125I、35S、14C或32P标记的探针等进行放射自显影或荧光自显影。其它标记包括与标记过的抗体结合的配体、荧光团、化学发光剂、酶和作为标记配体的特异性结合对成员的抗体。
杂交复合体的检测可能需要使产生信号的复合体与靶和探针多核苷酸或核酸的二聚体结合。通常，在交联探针的配体和交联信号的抗配体间通过配体和抗配体间的相互反应会产生这样的结合。
标记也可间接地检测杂交复合体。例如，当标记是半抗原或抗原时，可用抗体来检测样品。在这些体系中，通过使荧光素或酶分子与抗体结合，或在一些情况下是通过与放射性标记连接(例如参见Tijssen,pp.9-20)来产生信号的。
用核酸扩增系统使被检测的靶核酸倍增，可增强杂交测定法的灵敏度。适用于扩增序列(用作分子探针或产生核酸片段以进行以后的亚克隆)的体外扩增方法是已知的。足以指导本领域技术人员进行这些体外扩增(包括PCR、LCR、Qβ-复制酶扩增和其它RNA聚合酶介导的方法(如NASBA))的方法实例在Berger，Sambrook以及Ausubel和Mullis等，(1987)；美国专利No.4,683,202；Arnheim &Levinson,C & EN 36-47(1990)；Lomell等，J.Clin.Chem.,35:1826(1989)；VanBrunt,Biotechnology,8:291-294(1990)；Wu和Wallace,Gene 4:560(1989)；Sooknanan和Malek,Biotechnology 13:563-564(1995)；Innis；Kwoh；Guatelli；Landegren；以及Barringer中有所描述。克隆体外扩增核酸的改进方法在Wallace等，美国专利No.5,426,039中有所描述。目前在本领域中提出的其它方法是核酸序列为基础的扩增(NASBATM,Cangene,Mississauga,Ontario)和Qβ复制酶体系。这些系统可用来直接鉴定突变体，只有当有选择序列存在时设计PCR或LCR引物才能延伸或连接。或者，选择序列通常可用例如非特异性PCR引物来扩增，扩增后的靶区域再探测表示突变体的特异性序列。
例如在体外扩增方法中用作探针、在诊断方法中用作基因探针或者用作抑制成分(见下文)的寡核苷酸通常是根据Beaucage和Caruthers描述的固相亚磷酰胺三酯方法，如用自动合成仪来化学合成制得的(如Needham-Vandevanter中所述)。寡核苷酸的纯化(如果需要)通常用非变性丙烯酰胺凝胶电泳或阴离子交换HPLC(如Pearson和Regnier中所述)来进行。合成的寡核苷酸序列可用Maxam和Gilbert的化学降解法来验证。
应当理解，核酸杂交测定法也可以排列为基础(array-based)的方式进行。在该方法中，将有多个不同的“探针”核酸排列后与一个靶核酸杂交。通过这种方式，大量不同的杂交反应可基本上“平行地”进行。这就可迅速地、基本同时评价大量反应物。以排列方式进行杂交反应的方法是本领域技术人员所熟知的。(例如参见Jackson，等，Nature Biotechnology 14:1685(1996)，以及Chee，等，Science274:610(1995))。
测定编码蛋白质基因表达水平的另一种方法是原位杂交。原位杂交测定法是众所周知的，该方法在Angerer等，Methods Enzymol.,152:649(1987)中有所描述。在原位杂交测定中，将细胞固定在固体支持物(通常是载玻片)上。如果要探测DNA，则用热或碱来使细胞变性。然后使细胞在适当的温度下以杂交溶液接触，以使对编码蛋白质的核酸序列有特异性的标记探针退火。探针最好用放射性同位素或荧光报道分子作标记。
D．THP的表达
在鉴定出抗冻蛋白基因的编码区后，使抗冻蛋白基因的编码区与启动子(组成型或诱导型)相连，将构建物插入表达载体中，将载体引入合适的宿主细胞中，就可使天然或合成的编码抗冻蛋白的核酸表达。典型的载体含有用来调节特定的核酸表达的转录和翻译终止子、转录和翻译的起始序列以及启动子。载体任选地包含基因表达盒，该盒含有至少一个独立的终止子序列以及适于真核生物和原核生物的选择标记，该序列允许盒在真核生物或原核生物或两者(如穿梭载体)中进行复制。载体适于在原核生物或真核生物中复制和整合，或最好在两者中均能进行复制和整合。参见Giliman和Smith,Gene 8:81(1979)；Roberts，等，Nature328:731(1987)；Berger和Kimmel,GUIDE TO MOLECULAR CLONINGTECHNIQUES,METHODS IN ENZYMOLOGY,Vol 152,Academic Press,Inc.,SanDiego,CA(“Berger”)；Schneider,B.,等，Protein Expr.Purif.6435:10(1995)；Sambrook和Ausubel。生物试剂和实验设备的生产商提供的产品信息也为已知的生物方法提供了有用的信息。这些生产商包括SIGMA chemical company(SaintLouis,MO),R&D systems(Minneapolis,MN),Pharmacia Biotech(Piscataway,NJ),CLONTECH Laboratories,Inc.(Palo Alto,CA),Aldrich Chemical Company(Milwaukee,WI),GIBCO BRL Life Technologies,Inc.(Gaithersburg,MD),FlukaChemica-Biochemika Analytika(Fluka Chemie AG,Buchs,Switzerland)，和AppliedBiosystems(Foster City,CA)，以及许多其它技术人员所知的商业来源。
用于本发明方法的核酸(如启动子和载体)可从天然来源分离获得，从ATCC或GenBank库获得，或用合成方法制得。合成的核酸可用各种液相或固相方法制得。用亚磷酸三酯、磷酸三酯和H-膦酸酯化学物质固相合成核酸的程序的详细描述可从许多文献获得。例如参见Itakura,美国专利No.4,401,796；Carruthers,等，U.S.Pat.Nos.4,458,066和4,500,707；Beaucage和Carruthers；Matteucci；Carruthers,等，Genetic Engineering 4:1-17(1982)；Jones,chapter 2,Atkinson，等，第3章，和Sproat，等，第4章，in OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS:A PRACTICALAPPROACH,Gait(ed.),IRL Press,Washington D.C.(1984)；Froehler，等，Tetrahedron Lett.27:469-472(1986)；Froehler，等，Nucleic Acids Res.14:5399-5407(1986)；Sinha，等，Tetrahedron Lett.24:5843-5846(1983)；以及Sinha，等，Nucl.Acids Res.12:4539-4557(1984)，这些内容均结合入本文作为参考。
有几种熟知的方法可将核酸引入细菌细胞中，其中任何一种可用于本发明(参见Sambrook)。这些方法可以包括使受体细胞与含有DNA、DEAE葡聚糖的细菌原生质体融合，用病毒载体感染等。
核酸体外输送入细菌宿主，可以是输送入在培养物中生长的任何细胞中。细胞和基因工程化的核酸构建物在体外进行接触时，接触可在生物相容的基质中进行。核酸的浓度可根据特定应用在很大范围内变化，但通常在约1μM-10mM间。细胞用核酸处理通常在生理温度(约37℃)下进行约1-48小时(以约2-4小时为佳)。
可用来表达外源核酸的细菌菌株包括大肠杆菌、坚忍链球菌、乳链球菌、嗜热链球菌、嗜柠檬酸明串球菌、肠系膜样明串球菌、嗜酸乳酸杆菌、乳酸乳杆菌、Bifidobacterium bifidum、Bifidobacteriu breve以及Bifidobacterium longum。
除了细菌表达体系外，本发明的THP还可以在其它体系中，尤其是酵母和杆状病毒中表达，而且还可在哺乳动物和植物细胞中表达。体系的采用将取决于在其它体系中是否能够成功表达、使THP适当折叠的能力以及THP的最终用途。例如，如果用THP来防止面包酵母(bread dough yeast)结冻(参见美国专利No.5,118,792)，可采用酵母体系。如果希望使植物在冰点温度下存活，可用转基因技术来形成转基因植物。然而，当然采用的体系应使THP有与在枞色卷蛾属幼虫中发现的相当的热滞后活性。
可用来表达外源核酸的酵母菌株包括Torulopsis holmil、Saccharomycesfragilis、酿酒酵母菌、Saccharomyces lactis、以及Candida pseudotropicalis。
表达体系的另一个实例可参见国际出版物WO96/11586(美国专利申请08/321,991,1994年10月12日提交)，该文内容结合入本文作参考，它描述了用鱼AFP(THP)转化的Lactobacillus bulgaricus和Streptococus thermophilus来分泌AFP，以防止发酵的冷冻食品(尤其是冷冻酸乳)放置在无霜冷冻机中时由于冻融而形成冰晶。
1．重组载体的制备
为了采用上述方法中的分离的序列，制备适于细胞转化的重组DNA载体。转化入各种动物和植物细胞中的方法是众所周知的，这些方法在技术和科学文献中均有描述。例如参见Weising等,Ann.Rev.Genet.22:421-477(1988)关于植物细胞部分和Sambrook关于动物和细菌细胞部分。
编码所需的抗冻蛋白的DNA序列(例如编码全长THP的cDNA序列)最好与转录和翻译起始调控序列组合，该调控序列可指导此基因序列在细胞内或转基因高级生物的预定组织中转录。选用来表达本发明THP的载体中也可包括各种熟知的转录调控元件(如启动子和增强子)。指导本发明THP处于其天然状态的启动子可通过分析与本文所述抗冻蛋白基因相对应的基因组克隆的5′序列来鉴定。启动子序列的序列特征可用来鉴定启动子。已经对控制真核生物基因表达的序列进行了深入得研究。例如，启动子序列元件包括TATA盒共有序列(TATAAT)，该共有序列通常是转录起始位点上游的20-30个碱基对。在大多数情况下，要准确地引发转录就需要有TATA盒。
在构建本发明的重组表达盒时，可采用与本发明THP相关或异源的启动子片段，该片段可使基因在转基因生物所有组织中表达。在本文中，这些启动子称为“组成型”启动子，它们在大多数环境条件下以及发育或细胞分化状态下具有活性。植物的组成型启动子实例包括花椰菜花叶病毒(CaMV)35S转录起始区、衍生自根癌脓杆菌(Agrobacterium tumafaciens)T-DNA的1′或2′启动子、烟草花叶病毒的启动子和本领域技术人员已知的各种植物基因的转录起始区。
或者，启动子可在特异性组织中使本发明的多核苷酸表达(组织特异性启动子)或可以使其在更精确的环境控制条件下表达(诱导型启动子)。在发育控制条件下的组织特异性植物启动子实例包括只引发某些组织(如果实、种子或花)中的转录。来自西红柿的组织特异性E8启动子特别适用于指导基因表达，使所需的基因产物位于果实中。其它合适的启动子包括那些编码胚胎储藏蛋白的基因。可影响诱导型启动子转录的环境条件例子，包括厌氧条件、高温或有光存在。
如果需要表达合适的多肽，编码区3′端的聚腺苷酸化区应被包括在内。聚腺苷酸化区可以从天然的基因、各类或其它植物基因或从T-DNA衍生获得。
含有本发明基因序列(如启动子或编码区)的载体通常包括一个赋予转化细胞可选择性表型的标记基因。例如，标记物可编码出对抗生素，尤其是卡那霉素、G418、博来霉素和潮霉素的抗性。
植物可用病毒载体(例如烟草花叶病毒)转化，以表达本发明的THP蛋白。选择和构建载体以及转化入各类植物细胞的方法是众所周知的，例如参见Hamamoto等，美国专利5,618,699。
2．转基因生物的制备
本发明的DNA构建物可用各种常规方法引入宿主生物的基因组中。例如，在植物中，用植物细胞原生质体电穿孔和微注射方法可以将DNA构建物直接引入植物细胞的基因组DNA中，或者，用弹道方法(如DNA颗粒轰击方法)可将DNA构建物直接引入植物组织中。如上所述，可用含有本发明的THP序列的植物病毒载体(如烟草花叶病毒)可接种入植物。或者，DNA构建物可与合适的T-DNA侧翼区结合，然后引入常规的根癌脓杆菌宿主载体中。当植物细胞被细菌感染时，根癌脓杆菌宿主的侵入功能会将构建物及其毗邻的标记物插入植物细胞DNA中。
根癌脓杆菌介导转化的方法(包括去臂和二载体(binary vector)的采用)在科学文献中已有描述。例如参见Horsch,等，Science 233:496(1984)，以及Fraley等，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 80:4803(1983)。
用上述任一转化方法获得的转化植物细胞可培育再生成有转化基因型和所需表型(例如增强的耐冻性)的整个植物。本发明的转化的植物也可用作“活工厂”来大量表达抗冻蛋白。这种植物再生方法需要对组织培养生长培养基中的某些植物激素进行控制，通常需要将抗生计和/或除草剂标记和所需的核苷酸序列一起引入。从培育的原生质体中再生植物的方法在Evans等，PROTOPLASTSISOLATION AND CULTURE,HANDBOOK OF PLANT CELL CULTURE,pp.124-176,Macmillian Publishing Company,New York,1983；以及Binding,REGENERATION OF PLANTS,PLANT PROTOPLASTS,pp.21-73,CRC Press,Boca Raton,1985中有所描述。也可从植物愈伤组织如外值体、器官或其部分获得再生。这些再生方法在Klee等，Ann.Rev.of Plant Phys.38:467(1987)中有大致描述。
制备转基因植物或动物例如咸水鱼的微注射方法是本领域中已知的，并在科技和专利文献中有详细地描述。用聚乙二醇沉淀将DNA构建物导入细胞的方法在Paszkowski等，EMBO J.3:2717(1984)中有所描述。电穿孔方法在Fromm等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:5824(1985)中有所描述。弹道转化方法在Klein等，Nature 327:70(1987)中有所描述。
Ⅲ．本发明THP种类的检测和特性
通过采用下述测定方法，本发明的THP具有从东枞色卷蛾和西枞色卷蛾第二龄期幼虫血淋巴分离获得的热滞后蛋白的特性。用这些测定方法可检测其它新的THP是否与这些原型蛋白足够相关而包括在本发明范围内。这些测定方法也可用来检测和测定细菌肉汤、组织培养液和植物及动物组织中存在的THP蛋白质的量。
A．THP的检测
表达的THP可用各种方法来检测或定量。较佳的方法包括功能活性测定法和采用特异性抗体的免疫测定法。
1．抗体
产生单克隆和多克隆抗体的方法是本领域已知的。参见例如Coligan,CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY,Wiley/Greene,NY(1991)；Stites等编辑。BASIC AND CLINICAL IMMUNOLOGY(第7版)，Lange Medical Publications,Los Altos,CA和本文引用的参考文献(“Stites”)；Goding,MONOCLONALANTIBODIES:PRINCIPLES AND PRACTICE(第2版)Academic Press,New York.NY(1986)；Kohler和Milstein,Nature 256:485(1975)；和Harlow和Lane。此类技术包括通过从噬菌体之类载体重组抗体文库中挑选抗体来制备抗体。参见，Huse等，Science 246:1275(1889)(“Huse”)；和Ward等，Nature 341:544(1989)。
要制备用于(例如)免疫亲和纯化的大量抗体，可能要使用大量免疫原。本文所述来自枞色卷蛾属或来自转化细胞的抗冻蛋白是生产单克隆抗体或多克隆抗体的优选免疫原。也可以使用纯或不纯形式的来自其它微生物的天然抗冻蛋白。利用本文所述抗冻蛋白序列片段制造的合成肽也可以用作生产所述蛋白质的抗体的免疫原。这些肽可以单独使用，也可以与其它组份结合后使用。
生产多克隆抗体的方法对本领域技术人员来说是已知的。简而言之，如前文所述，将免疫原与佐剂混合，然后免疫动物。动物对免疫原制剂的免疫应答反应通过测试血样和对免疫原反应的效价来监测。如果获得了适当高效价的抗免疫原的抗体，就收集动物的血液并制备抗血清。根据需要，可以进一步分离血清以富集对蛋白质具有反应性的抗体。(参见Harlow和Lane，同上)。
用于免疫亲和纯化或免疫试验的大量单克隆抗体可以通过各种本领域众所周知的技术获得。简而言之，以所需抗冻蛋白免疫动物，取其脾细胞通常与骨髓瘤细胞融合而无限繁殖化(参见Koler和Milstein,Eur.J.Immnolo.6:511(1976)，本文参考了其中内容)。无限繁殖化的其它方法包括用Epstein Barr病毒、癌基因或逆转录病毒转化，或其它本领域的已知方法。筛选出产生具有所需特异性和对THP亲和性的抗体的无限繁殖化的单细胞形成的克隆。可以利用各种技术来提高由此类细胞生产单克隆抗体的得率，其中包括对脊椎动物宿主进行腹膜腔内注射。或者，可以根据Huse中的总大纲所述，通过筛选人B细胞DNA文库来分离编码单克隆抗体或其结合片段的DNA序列。
THP的浓度可以利用多种免疫试验方法来测定。若要总览免疫学和免疫试验的方法，可参见Stites。而且，本发明的试验过程可以数种构型中的任何一种进行，ENZYME IMMUNOASSAY,E.T.Maggio编辑，CRC Press,Boca Raton,Florida(1980)中对此有充分论述；对Tijssen；和Harlow和Lane，本文进行了参考。
例如，为了生产用于抗冻蛋白免疫试验的抗血清，如本文所述生产并分离重组的枞色卷蛾抗冻蛋白或其免疫原性片段。用SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3多肽、或其同种型或它们的免疫原性片段，免疫近交品系的小鼠或家兔，使用Freund氏佐剂之类的标准佐剂，并使用标准免疫程序。或者，可以将衍生自本文所述序列的合成肽与载体蛋白质交联用作免疫原。收集多克隆抗血清，并在免疫试验中滴定抗THP的效价，例如将THP固定在固相载体上的固相免疫试验。选出效价为104或更高的多克隆抗血清，利用竞争结合免疫试验测试它们对其它微生物的同源蛋白和/或非抗冻蛋白的交叉反应性。特异性的单克隆和多克隆抗体及抗血清的结合力效价KD一般至少约为0.1mM，更多情况至少约1μM，较好的是至少约0.1μM或更小，最好至少约0.01μM或更小。
2．免疫结合测试
在优选实施方案之一中，可用任何一种已被充分认可的免疫效价结合测试检测和/或定量测定THP(参见例如美国专利4,366,241；4,376,110；4,517,288和4,837,168)。有关一般免疫试验的论述，还可参见METHOD IN CELL BIOLOGY第37卷:Antibodies in Cell biology,Asai编辑，Academic Press,Inc.,NewYork(1993)；和Stites。免疫结合测试(或免疫试验)通常使用一种“捕捉剂”来特异性结合分析物并将其固定化(以THP或其片段为例)。捕捉剂是一种特异性结合分析物的物质。在优选实施方案之一中，捕捉剂是特异性结合THP的抗体。此抗体(抗-THP)可以利用本领域技术人员熟知的任何一种方法以及前文所述的方法来生产。
免疫试验还经常使用标记试剂来特异性结合由捕捉剂和分析物构成的复合物，将它们标记。标记试剂本身可以是包含抗体/分析物复合物的一个部分。这样，标记试剂可以是经标记的THP多肽或经标记的抗THP抗体。或者，标记试剂可能是第三种物质，例如特异性结合抗体/THP复合物的另一种抗体。
在优选实施方案之一中，标记试剂是带有标记的第二THP抗体。或者，第二THP抗体可以没有标记，但它又被经标记的第三抗体结合，该第三抗体对衍生出第二抗体的原抗体具有特异性。可以用生物素之类的可测物质修饰第二抗体，生物素修饰的第二抗体可被酶标记的链霉亲和素之类第三标记分子特异性地结合。
能够特异性结合免疫球蛋白恒定区的其它蛋白质，例如蛋白A或蛋白G也可以用作标记试剂。这类蛋白质是葡萄球菌和链球菌细胞壁的正常组份。它们表现出很强的与多种动物免疫球蛋白恒定区的非免疫原性反应性(参见，Kronval等，J.Immunol.111:1401-1406(1973)，和Akerstrom,等，J.Immunol.135:2589-2541(1985))。
在试验全过程中，在每一次反应试剂混合后可能都需要进行孵育和/或洗涤。孵育时间可能约5秒至数小时不等，以约5分钟至约24小时为佳。但是，孵育时间取决于孵育方式、分析物、溶液体积、浓度等。通常，试验在环境温度下进行，虽然它们可以在例如10℃至40℃的温度范围内进行。
a．非竞争性试验方式
检测THP的免疫试验可以是竞争性的或非竞争性的。非竞争性试验即直接测定被捕获的分析物(以THP为例)的试验。例如，在优选的“夹心”试验中，捕捉剂(抗THP抗体)可以直接与固相基质结合而固定在上面。这些固定化的抗体然后捕捉测试样品中的蛋白质。由此被固定的THP然后被标记试剂(例如带有标记的第二THP抗体)结合。或者，第二THP抗体没有标记，但它又被经标记的第三抗体结合，该第三抗体对产生第二抗体的动物具有特异性。可以用生物素之类的可测物质修饰第二抗体，而生物素则被酶标记的链霉亲和素之类第三经标记分子特异性地结合。
b．竞争性试验方式
在竞争性试验方式中，样品中分析物(THP)的量是间接测定的，即测定加入的(外源)分析物(THP)被样品中的分析物从捕捉剂(抗THP抗体)上取代掉(或被排挤掉)的量。在一竞争性试验中，在样品中加入已知量的分析物例如THP，然后此样品与捕捉剂(此处即特异性结合THP的抗体)接触。与固定化抗体结合的THP的量与样品中THP的量成反比。
在一特别优选的实施方案中，抗体被固定在固相基质上。与抗体结合的THP量可以通过测定THP/抗体复合物中的THP量来测定，或者通过测定未被复合的THP量来测定。可以通过使用标记过的THP分子来测定THP量。
半抗原抑制试验是另一种较好的竞争性试验。其中，已知量的分析物(此处即THP)被固定在固相基质上。在样品中加入已知量的抗THP抗体，然后，样品与固定的THP接触。此时，与固定THP结合的抗THP抗体量与样品中的THP量成反比。同样，被固定的抗体的量可以通过测定抗体被固定的分数或留在溶液中抗体的分数来测定。如果抗体被标记，可以直接检测，或如前文所述，通过再加入特异性结合抗体的被标记物质来间接检测。
竞争性结合方式的免疫试验可以用于交叉反应性测定，技术人员因而能够确定一种新的THP是否与属于本发明权利要求范围内的THP充分相关。例如，可以将SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的THP固定在固相基质上。在试验中加入蛋白，该蛋白与抗血清竞争与固定抗原的结合。蛋白同抗血清竞争与固定THP结合的能力，与包被固相载体所用THP的结合能力相比较，利用标准计算法计算出上述蛋白质的交叉反应性百分比。挑选并汇集与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的THP的交叉反应性低于10％的抗血清，可以利用上述蛋白进行免疫吸附从汇集的抗血清中去除交叉反应性抗体。
经免疫吸附和汇集后的抗血清可以用于上述竞争性免疫试验来分析第二蛋白是否是本发明的抗冻蛋白。在竞争性免疫试验中，用于产生抗血清的蛋白质或免疫原在抗体结合反应中与第二、未鉴定蛋白或肽竞争。两种蛋白质都在一较宽浓度范围内接受测试，并测定抑制50％抗血清与固定蛋白结合所需的各蛋白的量。如果第二种蛋白的所需量比已鉴定的免疫原(例如SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:3的THP)的所需量低10倍以上，就认为该第二种蛋白与所产生的针对已鉴定免疫原(抗冻蛋白)的抗体有特异性结合。
c．其它试验方式
Westen印迹(免疫印迹)分析可以用来检测和定量样品中的抗冻蛋白。该技术一般包括用凝胶电泳按分子量分离样品蛋白，将分离后的蛋白转移到合适的固相载体上(例如硝酸纤维素滤膜、尼龙滤膜或尼龙类滤膜)，将样品与特异性结合THP的抗体孵育。抗抗冻蛋白抗体特异性结合固定在固体载体上的THP。可以直接标记这些抗体，或者继而用特异性结合抗抗冻蛋白的标记抗体(例如标记的绵羊抗鼠抗体)检测。
除了利用核酸探针来鉴定本申请权利要求的蛋白质的新类型之外，还可以使用抗体探测表达文库。这是一种已知技术。(参见Young & Davis，美国科学院院报80:1194(1982))。简而言之，可以利用市售试剂盒或利用可方便得到的成份来制备cDNA表达文库。优选噬菌体载体，但是还有许多用于蛋白质表达的其它载体。这类载体包括但不限于酵母、动物细胞和蟾属卵母细胞。从用目标蛋白富集的原料中挑选mRNA，产生cDNA，连接到载体中，再转化到用于免疫筛选的文库宿主细胞中。筛选包括结合，和显现与细胞上或固定在固相载体(例如硝酸纤维素或尼龙薄膜)上的特定蛋白结合的抗体。选出阳性克隆，纯化至均一，然后制备分离的cDNA，并在所希望的宿主细胞内表达。对该技术较好的论述可参见METHODSOF CELL BIOLOGY，第37卷，题为Antibody in Cell biology,Assai编辑，1993。
如果产生的抗体是针对一段短肽的，可将被测蛋白(未鉴定的)变性来充分测定抗体的选择性结合性能，而且，可能最好测定抗体对与被测蛋白大小相似的蛋白的选择性结合能力，例如测试抗体对全长THP与原型全长THP的选择性结合能力，即使抗血清是针对原型THP片段产生的。这就简化了测试，并且在确定竞争性免疫试验结果时无需考虑构象问题和分子量/摩尔浓度。
其它试验方式包括脂质体免疫试验(LIA)，该试验使用的脂质体设计成能结合特定分子(例如抗体)，并能释放出包裹的反应剂或标记物。然后根据标准技术检测释放出的化学物质。(参见Monroe等，Amer.Clin.Prod.Rev.5:34(1986))。
B．THP的纯化
可以利用标准技术将来自例如幼虫匀浆、组织培养基、转基因植物和动物、酵母和细菌等多种来源的本发明多肽纯化至基本纯。标准纯化程序包括利用硫酸铵之类物质选择性沉淀；柱色谱，免疫纯化及其它方法可参见例如R.Scopes,PROTEN PURIFICATION:PRINCIPLES AND PRACTICE,Springer-Verlag:NewYork(1982),U.S.专利4,673,641,Ausubel和Sambrook，本文参考了以上全部内容。
1．从细菌培养物中纯化THP
如果是分泌蛋白质，无需借助于以下所述的细胞裂解就可以从培养有细菌的肉汤培养液中分离和纯化所要的蛋白质。
2．从细菌周质中纯化THP
据估计，大肠杆菌的抗冻蛋白表达水平较低，而且，该蛋白被分泌在细菌的周质中。除了其它本领域已知方法之外，还可以利用低温渗透休克法来分离细菌周质组份。(参见Ausubel和Trayer,H.R.和Buckley,Ⅲ,C.E.,J.Biol.Chem.245(18):4842(1970))。
为了从周质中分离蛋白质，离心细菌细胞生成沉淀。将沉淀重悬在含有20％蔗糖的缓冲液中。为了裂解细胞，离心细菌，并将沉淀重悬在冰冷的5mM MgSO4中，并在冰浴中保持约10分钟。离心细胞悬浮液，倾出上清液进行保存。可以利用本领域众所周知的标准分离技术将上清液中的蛋白质与宿主细胞蛋白质分离。
3．包涵体的分离
当转化细菌大量表达重组蛋白质时，(一般是在启动子诱导之后，但表达可能是组成型的)，蛋白质可能形成不溶性凝集体。
凝集蛋白(后文称为包涵体)的纯化涉及通过破坏细胞(通常但不限于将细胞培养在含约100-150μg/mL溶菌酶和非离子除垢剂NONIDET P40的缓冲液中)来提取、分离和/或纯化包涵体。可以用Polytron粉碎机(Brinkman Instruments,Westbury,N.Y.)粉碎细胞悬浮液。或者，可以对细胞进行冰上超声波处理。Ausubel和Sambrook还说明了其它裂解细胞的方法，这些对本领域技术人员来说是显而易见的。
离心细胞悬浮液，将含有包涵体的沉淀重悬在缓冲液(例如20mMTris-HCl(pH7.2),1mM EDTA,150mM NaCl和2％非离子除垢剂TRITON-X 100)中。可能需要反复洗涤以尽可能去除细胞碎片。将留下的包涵体沉淀重悬在合适的缓冲液中(例如20mM磷酸钠，pH6.8,150mM NaCl)。其它合适的缓冲液是本领域技术人员熟知的。
洗涤之后，通过加入既是强氢受体又是强氢供体的溶剂(或分别具有两种特性之一的溶剂的混合物)来溶解包涵体，同时加入DTT之类的还原剂。然后可以通过用相容性缓冲液稀释或透析来复性形成包涵体的蛋白质。合适的溶剂包括但不限于尿素(约4M至约8M)，甲酰胺(至少约80％(v/v))和盐酸胍(约4M至约8M)。有些能够溶解形成凝集体的蛋白质的溶剂，例如SDS(十二烷基硫酸钠)，70％的甲酸是不适用于该过程的，因为可能导致蛋白质的不可逆变性，伴有免疫原性和/或活性的丧失。虽然盐酸胍之类试剂是变性剂，但这种变性不是不可逆的，在去除(例如通过透析)或稀释变性剂后，即可发生复性，重新形成免疫活性和/或生物活性的蛋白质。
溶解后，可以利用标准分离技术将所需蛋白质与其它细菌蛋白质分离。
4．标准蛋白质分离技术
a．溶解度分级分离
经常作为最初步骤，而且如果蛋白质混合物较复杂时，初步的盐分级分离可以从所需重组蛋白中分离掉许多不需要的宿主细胞蛋白质(或来自细胞培养基的蛋白质)。优选盐是硫酸铵。硫酸铵通过有效去除蛋白质混合物的含水量来沉淀蛋白质。然后，蛋白质根据它们的溶解度沉淀。蛋白质越疏水，越可能在较低的硫酸铵浓度沉淀。典型的方案是在蛋白质溶液中加入饱和硫酸铵溶液，使得硫酸铵的终浓度介于20-30％。这将沉淀出疏水性最强的蛋白质。弃去沉淀(除非所需蛋白是疏水性的)，在上清液中加入硫酸铵，至已知可沉淀所需蛋白的浓度。然后将沉淀溶解在缓冲液中，根据需要利用透析或渗滤去除过量的盐。其它依赖于蛋白质溶解度的方法，例如低温乙醇沉淀法，是本领域众所周知的，并可以用于分级分离复杂的蛋白质混合物。
b．分子大小差异过滤
如果所需蛋白质的分子大小是已知的，或者可从其cDNA序列估计，可用不同孔径的膜(例如Amicon或Millipore薄膜)超滤去除过大和过小的蛋白质。作为第一步，蛋白质混合物透过孔径的分子量截留值低于所需蛋白分子量的膜进行超滤。然后用分子量截留值大于所需蛋白分子量的膜超滤滞留物。重组蛋白将透过滤膜进入滤液。然后可以如下色谱分离滤液。
c．柱色谱
可以根据分子大小、表面净电荷、疏水性和与配体的亲和性分离蛋白质。此外，产生的抗蛋白质抗体可以与色谱柱基质交联来免疫纯化蛋白质。所有这些方法都是本领域熟知的。参见Scope,R.K.,Protein Purification:Principles and Practice第2版，Springer Verlag(1987)。
对技术人员来说显而易见的是，可以进行各种规模的色谱技术，而是使用各种不同生产商的设备(例如Pharmacia Biotech)。
在一优选实施方案中，从大肠杆菌上清液中纯化抗冻蛋白是通过凝胶过滤进行的，而蛋白质浓度测定方法是根据Bradford,Anal.Biochem.72:248-257(1976)。
d．氨基酸序列
本发明THP的氨基酸序列可以通过Edman降解，一种本领域众所周知的技术来测定。
除了内部测序之外，N末端测序可利用本领域的已知技术进行。
e．分子量/等电点
蛋白质的分子量可利用本领域众所周知的多种方法来测定。其中包括：SDS凝胶电泳、非变性凝胶电泳、分子量排阻色谱、区带离心、质谱法和根据测序结果计算。由于各技术本身的原因，不同技术所得结果之间会有差异。例如，非变性凝胶电泳、分子量排阻色谱和区带离心是根据蛋白质的大小。本发明蛋白质富含半胱氨酸，估计可能形成大量胞间和胞内的二硫键。SDS凝胶电泳依赖于SDS与蛋白质中氨基酸的结合。有些氨基酸与SDS的结合比其它的强，所以，蛋白质会因其氨基酸组成的不同而发生差异性迁移。质谱法和根据序列计算分子量是利用蛋白质中的氨基酸的出现频率，然后将该频率乘以氨基酸的分子量。如果蛋白质被糖基化，质谱法会反映出这一点，而不能计算得到该分子量。
在本发明中，THP同种型的表观分子量经分子量排阻色谱分析估计约为5kD至20kD；利用SDS凝胶电泳测定，约为6kD至14kD。这与根据氨基酸序列算得的分子量一致。但是，本发明范围内的各种THP或同种型不局限于上述分子量范围。
蛋白质等电点的测定可以利用非变性(或圆盘)电泳、等电聚焦，或者更好的是，以蛋白质的氨基酸含量来计算。本发明两种THP同种型的等电点(Ip)经计算约为6至9。但是，本发明范围内的各种THP或同种型不局限于上述等电点范围。
f．功能试验
本发明各种THP和同种型可以通过至少两种功能特性，例如热滞后和独特的冰晶形成，进行鉴定和特征描述：
                     (1)热滞后
在热滞后试验中本发明THP蛋白比已知的鱼类(AFP)抗冻蛋白活性高约10至50倍。热滞后的定义为溶液冰点和熔点之间的温度差。冰点即发生不可控晶体或针状冰晶生长的温度。熔点即保持冰晶稳定但不融化的最高温度。TH活性可以利用本领域众所周知的技术(例如，参见Ghakrabartty & Hew,Eur.J.Biochem.202:1057(1991))以纳升渗透压力计(Clifion Technical Physics,Martford,NY)测定。起始冰晶的直径通常约20至50微米。所用的缓冲液典型的是100mMNH4HCO3(pH7.9)，但是渗透压相近的其它缓冲液也可使用。或者，可以测定细菌肉汤培养液、组织培养液、或血淋巴中的TH活性。但是，所得的TH活性值将取决于被测溶液的渗透压。
渗透压力计是一套热电冷却组件(module)，具有分开但相联的可变温度控制。该仪器允许在0℃至-9℃范围内作温度调节，具有低至-40℃的深冷模式。可将冷却组件安装在显微镜的平台上，可以直接观察冰晶的生长和熔解方式。样品容器可以是一7mm×7mm×0.75的小板，具有许多小的样品孔(直径约0.35mm)。可以在样品孔下部加一滴Cargille氏B浸渍油之类的浸渍油，将样品孔填满。然后用毛细管将1至5nL样品注入被油填满的孔的中心。
为了测定TH活性，先冷冻样使其快速降温至-40℃，然后温热至熔解温度。一旦达到熔点，以每10至15秒约0.02℃(10毫渗克分子(mosmole))的速度冷却样品，直至到达冰点温度。“渗克分子”向“℃”的转换是1.00渗克分子等于1.86℃。在多数情况下，当达到THP样品的冰点时，样品内的冰晶会自发而且迅速生长。这使得整个样品冻结。
或者，可能在溶液的表面冻结少量冰晶，而溶液的温度立即降至冰点以下。成核冰晶开始生长的冰点以下的温度即冰点降低或热滞后量度(参见，Patterson& Duman,J.Exp.Zool.210:361(1979)；和Wu等，J.Comp.Physiol.B161:271(1991))。溶液的热滞后活性取决于抗冻蛋白的浓度，抗冻蛋白的浓度越高，溶液表现出的活性越高。但是，提高THP浓度只略微提高TH活性，而且具有极限最大值。换言之，THP与TH之间的关系是双曲线型的，而非线性的。
本发明蛋白质宜在1mg/mL时具有约1.5℃的热滞后值，1mg/mL时高于约2℃更好，达1.5℃至3.0℃之间则最好。
                   (2)独特的冰晶形成
除比已知鱼抗冻蛋白活性高约10至50倍之外，本发明蛋白可产生不同形状的冰晶。在显微分析下，鱼抗冻蛋白形成的冰晶为六方双锥体，具有界面清晰的多个小平面。相比之下，本发明THP形成圆形晶体，没有明显的界面。Ⅳ．抗冻蛋白及相关基因的用途
THP蛋白或其编码基因可以多种方式用来抑制冰晶的生长。关于抗冻蛋白的全面论述可参见美国专利5,118,792。本发明的THP可以蛋白质的形式加入，或者以基因形式引入，以一定的水平作内源性表达，在细胞内，在适合生产蛋白质的强启动子调控下，表达抗冻蛋白达到一定的水平。合适的THP浓度根据用途而不同，但一般在约每十亿一份至约每一千一份的范围内(即1微克/升至1克/升)。
在本发明实施方案之一中，该蛋白被引入食物。这包括许多方面。其一是引入植物性食物，或者是引入整个植株，提供某种程度对冰点以下气候条件造成的损害的总体抵抗能力，或者引入植物的某部分，例如果实或蔬菜，尽可能减小冷冻对这些特定植物器官造成的特殊伤害。植物部分例如茎、根、叶、花、柄、果皮、种子、营养组织、维管等。
冷冻蔬菜例如芹菜、马铃薯、芦笋、豌豆、胡萝卜、菜豆、椰菜、甜玉米和菠菜等的质地、口味和保质期将得以改善。草莓、蓝酶、悬钩子、柑橘类水果、香蕉、葡萄、猕猴桃、梨、菠萝、李子、樱桃、西红柿和芒果等水果的质地、口味和保质期将得以改进。
这样引入植株或其它产品，最方便的是将合适的核酸遗传性引入目标生物来实现。在食品加工开始之前或在收获和开始加工食品之后，组成型或诱导性的核酸表达将产生足够高水平的多肽，可有效地保护食物，例如，产生高达总植物蛋白质量的0.5％的多肽，高达约0.1％则更好。表达也可以是组织特异性的。例如，中将其与水果成熟基因连锁，可能导致生产植株甚至在采摘后也会表达。
该多肽还可以加入欲冷冻的食品中。许多冷冻食品希望在冷冻状态下食用，例如冰淇淋、冻酸奶、冰牛奶、冰糕、冰棒、冷冻鲜奶油、冷冻奶油馅饼、冷冻布丁等。特别是，在多数家用无霜冰箱的冻融循环中或长期以冷冻状态保存，大冰晶的形成会破坏质地和口味。通过加入抗冻多肽，可以完全避免，或者尽可能减小这种冰晶生长过程。纯化的抗冻蛋白可以加入整个食物中，也可以用于被认为最易发生缩水和结晶的表面。
在另一实施方案中，编码本发明THP的基因被用于转化加入食物的微生物，保护食物或微生物不被冻结。例如，嗜热性链球菌和保加利亚乳酸杆菌可以加在乳制品中，以冷冻酸奶出售。除发酵乳制品生产酸奶之外，由细菌表达的THP将保护产品免受家用冰箱冻融循环的破坏，并产生更可口的产品。
另一种用途是用编码THP的核酸转化面团发酵酵母。将该基因引入酵母并表达后，并将这些酵母用于冷冻面团中时，面团会在解冻时自然发酵，因为在解冻过程中，酵母将保持高活性。由于因冷冻保存所累积的损害较少，而且解冻后样品保留了高活性，或可延长保存时间，或可将需要保存的东西分成更小的等份。
除了食品冷藏之外，还有许多实施方案。其一是利用THP保护植物免受气候性冰冻情况的伤害。THP可以通过引入基因的表达来内部掺入细胞质中，也可以从外部将该蛋白用于植物。外部使用可以直接将该蛋白用于植物，或者将分泌该蛋白的微生物沉积在植物外部。这些不同的引入方法也可以用于其它用途。
除植物之外，可以看出，本发明的THP可以用来生产可耐受零℃以下温度的转基因鱼。虽然有些南北极鱼类的确合成抗冻蛋白，但是大多数鱼类不生活在水温低于0℃的环境中。但是，含有THP外源核酸的转基因鱼可以保持在低于零点的咸水中，而且可能会生长。具体地说，即在养殖场中培养咸水鱼类，特别是鲑鱼。
除以上实施方案之外，可以看出，本发明THP可以用来调节耐寒生物的内源性THP基因的表达。为制备(例如以后的分离)内源抗冻蛋白，应提高抗冻蛋白基因产物的表达。相反，负调节内源性抗冻蛋白基因的表达，可以将本来耐寒的害虫转化侵害性较低的表型。
改变内源基因表达的方法是本领域众所周知的。典型的是，此类方法涉及改变或替换全部或部分调控序列，所述调控序列调控特定基因的表达。在一优选实施方案中，一个或数个THP上游的调控序列(例如天然启动子)被改变。
这通常是通过同源重组将异源核酸引入天然调控序列内。要负调节一个或多个THP基因产物的表达，宜进行简单突变来改变读码框或破坏启动子。要正调节THP基因产物的表达，可用能够诱导高于正常转录水平的异源启动子替代天然启动子。
在一特别优选的实施方案中，用含有所述结构基因或上游序列的核酸序列来寻找异源重组结构。使用SEQ IN NO:1中提供的结构基因序列信息，本领域技术人员仅用常规实验即可构建出同源重组结构。
美国专利5,272,071,WO91/09955,WO93/09222,WO96/29411,WO95/31560,WO91/12650详细说明了同源重组作用改变内源基因表达的用途。Azad等，美国科学院院报93:4787(1996)；Baulard等，J.Bacteriol.178:3091(1996)和Pelicic等，Mol.Microbiol.20:919(1996)中说明了分枝杆菌内的同源重组。Moynahan等在Hum.Mol.Genet.5(7):875(1996)中说明了动物的同源重组，Offringa等，EMBO.J.9(10):3077(1990)说明了植物的同源重组。
另一实施方案是将抗冻蛋白引入器官、组织或其它生物样品周围的水性液体中。具体用途之一是在去医院进行移植手术的运输途中，或用于保存这些材料。抗冻蛋白将允许这些材料在冰点以下短期或长期保存，因此尽可能减低了这些材料的天然代谢或变质，但是基本消除了冰晶生长造成的细胞伤害。其它医药上重要的温度敏感性生物样品是血液和血制品，药物、蛋白质类药、生物测试试剂和疫苗。
另一种实施方案是将抗冻蛋白引入需要冷冻保存的细胞或其提取物。例如，细菌细胞、酵母细胞、植物细胞，尤其是动物细胞，它们含有THP后提高了细胞或组织的活性，尽可能减少或避免因冻融过程而致的天然特性的损失。亚细胞样品或细胞提取物可能对冷冻具有类似的敏感性，尤其是长期保存的话。典型的例子是，体外蛋白质翻译系统、酶制剂和含有敏感性膜组份的样品(例如叶绿体和线粒体膜制剂)。尤其是，加入这些抗冻蛋白后，含细胞器的样品会表现出提高的抗冷冻损伤能力。在本发明多肽存在下，动物软组织将表现出较轻的冻伤，而且，在经冻融后细胞完整性很重要或必须的情况下，例如细胞或组织的保藏，可加入该多肽。所以，要求冷冻保存的样品，例如细胞或组织保藏物，最好常规性添加这些抗冻蛋白。经常要保藏的细胞类型中包括细菌的遗传变种、真菌(包括酵母)，特别是高级真核细胞(例如杂交瘤细胞株或组织培养细胞系)。
本发明还包括基于THP与本领域众所周知的稳定剂和其它添加剂的混合物的组合物和用途。这些化合物可以用来抑制变质、抑制氧化、防止褪色、抑制微生物的生长、稳定乳液等。
本发明还包括基于THP的适合在非有机系统中降低冰点或抗冻的组合物，例如用于除冰处理。
应该将所述的实施方案和实施例理解是为了说明，对于本领域技术人员来说可以由此做出许多修改和变换，这些都应包涵在本申请和后文权利要求的宗旨和范围内。
实施例
以下实施例是为了说明而不是限定本发明。
实施例1：枞色卷蛾属幼虫的THP
以下实施例详细说明了从翎翅目东枞色卷蛾的血淋巴中分离THP，该物种是已知最靠北寒带的物种。枞色卷蛾属下两种，枞色卷蛾属和西枞色卷蛾属的匀浆在实验室中已经表现出了特别高的抗冻活性。
东枞色卷蛾(C.fumiferana)二龄幼虫购自Insect Production Unit of the ForestPest Management Institute,Forestry Canada,Sault Ste.Marie,Ontario,Canada。与2至4℃保持20至30周后，从粗棉布上收集血细胞渗出(diapausing)的幼虫并如下使用。
根据Chakrabartty等(1991)的方法，使用Clifton直接读数纳升渗透压力计(Clifton Technical Physics,hartford,NY)，在提取和纯化THP过程中以热滞后测定抗冻活性(即，溶液冰点和熔点之间的温度差(℃))。在测试过程中，通过视频显微镜监测和记录AFP对冰晶形态的影响。利用比色法(Bradford,1976)或230纳米的吸光度(A230)来检测总蛋白浓度。
将所有溶液和样品保持在冰上，在250微升0.1M NH4HCO3,pH8.0(含1mM苯基甲基磺酰氟(PMSF，蛋白酶抑制剂)和0.5mM苯硫脲(苯基氧化酶抑制剂))中将100毫克二龄东方东枞色卷蛾匀浆化。在微型离心机中以10,000×g于4℃离心2分钟，然后用匀浆缓冲液透析过夜。将透析液上样在滤膜旋转柱上(Bio-Rad,Hercules,CA)，去除细胞碎片和颗粒物质。
利用色谱法从所得的滤液中纯化出THP，该方法是从血清中分离鱼AFP的标准方法(Fourney等，1984；Li等，1985；Ng等，1986)。首先，在匀浆缓冲液中，在Sephadex G-75柱(Pharmacia,Uppsala,Sweden)上，通过4℃的凝胶过滤对THP作分子筛筛选。THP紧接着空白峰被洗出。然后，汇集具有最高热滞后活性的流份，低温干燥，悬浮在1mL水中，再低温干燥，重悬在100微升的水中。然后，在C18反相柱上，以0.1％三氟乙酸(TFA)对样品进行高效液相色谱(HPLC)(Beckman)，用0至65％(v/v)的乙腈线性梯度洗脱。如图1所示，THP从柱上洗脱成一簇峰，标以22、23和24，它们显示有热滞后活性。这与一组THP同种型组份一致。
在特定实验中，同种型以HPLC再分级分离来提高它们的纯度。该过程产生各同种型的单一分子量的蛋白质产品，这是根据MALDI(基质-辅助激光吸收/离子化)质谱法测定的。在Finnigan TSQ700三倍四重质谱仪(Finnigan,San Jose,CA)上用电子喷射(Electrospray)质谱法鉴别了至少三种AFP同种型，分子量都约为9,000Da。还对THP同种型进行了氨基酸分析(920型、Applied Biosystems,Inc.,Foster City,CA).
实施例2：THP的蛋白质测序
取2微克图1中峰24的THP同种型，与碘乙酰胺反应将半胱氨酸还原并碱化。共价修饰后的THP用胰蛋白酶充分消化，并在Vydac C18柱上以0.1％三氟乙酸(TFA)作反相HPLC分离消化产物。在三个波长：210纳米、277纳米和292纳米监测洗脱形式。在Finnigan Lasermat质谱仪(Finnigan,San Jose,CA)上进行MALDI质谱法对几个单独、充分分离的胰酶酶解肽进行分析。用AppliedBiosystems,Inc.,477A型蛋白质测序仪和120A型乙内酰胺苯硫脲(PTH)-氨基酸分析仪通过自动化Edman降解法(Harvard Microchem,Harvard University)对三种此类肽进行了测序。所得的肽序列显示在SEQ ID NO6,SEQ ID NO:7和SEQ IDNO:8。此外，通过对非消化蛋白质的测序测定了该同种型的N末端序列，列于SEQ ID NO:9。短线表示不能用所述方法完全确定的氨基酸残基；但是，在大多数情况下，该残基是半胱氨酸。本发明者认识到，SEQ ID NO:9显示与内部胰酶酶解肽序列之一即SEQ ID NO:7有重迭。
与图1流份23对应的同种型的N末端序列已测定，显示在SEQ ID NO:10。虽然所得序列延伸的不够远，没有显示与SEQ ID NO:7有任何重迭，本发明者认识到，该序列与SEQ ID NO:9的N末端具有明显的同源性。这证实了相邻HPLC峰的同种型地位。
实施例3：THPcDNA的克隆和测序
SEQ ID NO:1的核酸序列信息和SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的蛋白质序列信息可用来设计鉴定枞色卷蛾抗冻基因和cDNA的PCR引物和寡核苷酸。已知产生THP序列的PCR引物对，例如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5，以及SEQ IDNO:13和SEQ ID NO:14，可直接用来扩增新种THP和同种型。
或者，利用多种杂交技术和条件，可用寡核苷酸检测THP编码核酸序列。这些寡核苷酸可以用已知技术来产生，其中包括PCR、分离DNA的限制性酶消化，或者有机合成。如前文所述，这些核酸可以被标记用于检测，并经各种已知技术与DNA杂交。可以从枞色卷蛾属幼虫回收总RNA，并用QuickPrep MicromRNA纯化试剂盒(Phamacia,Piscataway,NJ)，根据制造商的说明富集mRNA。然后，如Sambrook所述，利用例如禽成髓细胞瘤病毒(AMV)逆转录酶(Phamacia)，将mRNA用于逆转录产生cDNA模板。
可以用例如PHC-3热循环仪(Techne,Princeton,NJ)，利用以一已知THP序列(例如SEQ ID NO:1)为基础的任何一组引物，或已知能扩增THP序列的引物对(例如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5，以及SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14)在cDNA上进行PCR。
扩增可能涉及多种退火条件，例如，52℃退火40秒，然后72℃延伸15秒，然后94℃变性1分钟。这样重复30至40轮，产生DNA产物，将其纯化。PCR产物可以利用各种已知技术测序，例如双脱氧链终止法，使用Dye终止仪循环测序试剂盒TM快速反应试剂盒(Applied Biosystem,Foster City,CA)和373A型DNA测序仪(Applied Biosystem)。如前所述，PCR产物一经鉴定为THP序列，就可以进一步标记，用作杂交探针。
可以使用计算机数据库和程序来分析所得DNA序列与已知THP序列是否一致或同源。例如，PC/Gene TM软件(IntelliGenetics Inc.,Mountain View,CA)将序列列队，并显示开放式读码框。可使用BLAST N和BLAST D检索算法来检索GeneBank数据库(NIH,Bethesda,MD)，查找该衍生THP与数据库中已知序列之间有无任何匹配。
实施例4：产生针对THP的抗体
本发明者鉴定到了一段9,060Da成熟THP的亲水肽(SEQ ID NO:3)，将其作为可产生有用抗体的优良候选抗原决定基。该肽具有SEQ ID NO:12氨基酸序列。具有所示乙酰化N末端和酰胺化C末端的该肽是利用标准技术化学合成的。在Core Facility,Queen’s University,Kingston,ON,Canada，利用Harlowd和Lane(1988)所述的方法，在新西兰白兔中产生了抗该肽的多克隆抗体。如前所述，该抗血清已在Western印迹法中用于检测THP，并用在重组表达文库中筛选THP。
实施例5：THP对冰晶形成的影响
如实施例1所述，利用视频显微镜记录了THP的热滞后试验。得到了以下有意义的发现：当含有本发明THP的溶液真的冻结时，冰形成光滑的波纹或前缘，这显示在图3A二龄云杉食心幼虫粗制提取物所成冰的显微照片。相反，当含鱼THP的溶液冻结时，冰形锐利而呈针状。例如，海撅鱼Ⅲ型抗冻蛋白(5mg/ml)，如图3B所示。如此锐利的冰形可切破细胞。
以上实施例是实施方案应理解成仅是为了说明，据此，本领域技术人员可以据此提出各种修改和变换，这些都包括在本申请和后文权利要求的宗旨和范围内。为了此种目的，本文参考了文中引用的所有出版物、专利和专利申请。序列表(1)一般信息：
(ⅰ)申请人：
    (A)姓名：Queen’s University at Kingston
    (B)街道：Queen’s University
    (C)城市：Kingston
    (D)州(省)：Ontario
    (E)国家：Canada
    (F)邮政编码：K7L 3N6
    (G)电话：(613)545-2342
    (H)电传：(613)545-6853
    (I)电报：
    (A)姓名：Walker,Virginia K.
    (B)街道：R.R.#1
    (C)城市：Sydenham
    (D)州(省)：Ontario
    (E)国家：Canada
    (F)邮政编码：KOH 2TO
    (G)电话：
    (H)电传：
    (I)电报：
    (A)姓名：Davies.Peter L
    (B)街道：100 Dickens Drive
    (C)城市：Kingston
    (D)州(省)：Ontario
    (E)国家：Canada
    (F)邮政编码：K7M 2M8
    (G)电话：
    (H)电传：
    (I)电报：
    (A)姓名：Rahavard,Mitra
    (B)街道：10e-244 Sir John A.MacDonald Blvd.
    (C)城市：Kingston
    (D)州(省)：Ontario
    (E)国家：Canada
    (F)邮政编码：K7M 5W9
    (G)电话：
    (H)电传：
    (I)电报：
    (A)姓名：Tyshenko.Michael G.
    (B)街道：3 Toronto street
    (C)城市：Kingston
    (D)州(省)：Ontario
    (E)国家：Canada
    (F)邮政编码：K7L 4A3
    (G)电话：
    (H)电传：
    (I)电报：
(ⅱ)发明名称：枞色卷蛾抗冻蛋白、基因及其使用方法
(ⅲ)序列数目：17
(ⅳ)通信地址：
    (A)收件人：Parteq Innovations
    (B)街道：Queen’s University
    (C)城市：Kingston
    (D)州(省)：Ontario
    (E)国家：Canada
    (F)邮政编码：K7L 3N6
(ⅴ)计算机可读形式：
    (A)记录介质类型：软盘
    (B)计算机：IBM PC兼容型
    (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
    (D)软件：PatentIn Release#1.0.Version#1.30
(ⅵ)本申请资料：
    (A)申请号：PCT/CA97/00371
    (B)申请日：03-JUN-1997
    (C)分类：
(ⅶ)在先申请资料：
    (A)申请号：US 08/657,264
    (B)申请日：03-JUN-1996
(ⅷ)律师/代理人信息：
    (A)姓名：Steeg,Carol Miernicki
    (B)登记号：39.539
    (C)参考/案卷号：Q1669
(ⅸ)通讯信息：
    (A)电话：(613)545-2342
    (B)电传：(613)545-6853(2)SEQ ID NO:1的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：1388碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:1:CGGCACGAGG AAAGACATAT TTTTTTTTTA GTTTCAAAAG TTGTGTACAT TTTTCTCAAG      60TATCATGAAG TGTTTAATGC TGATCATGGC TCTAGCCATT ATCAACACTG TATCTTCTGA     120TGGCTCGTGT ACAAACACGA ACTCTCAGCT CAGCGCAAAC TCCAAGTGCG AAAAATCGAC     180GTTGACCAAC TGCTACGTCG ATAAAAGCGA GGTTTACGGC ACTACCTGTA CAGGAAGCCG     240ATTCGACGGA GTCACTATAA CGACTTCAAC ATCTACCGGT TCACGTATTT CAGGCCCTGG     300ATGCAAGATT TCCACTTGCA TTATCACCGG GGGTGTACCT GCTCCATCAG CTGCTTGCAA     360GATTTCTGGA TGTACTTTCA GTGCTAATTA TAGCCATGAA AGTCGTCCGA GATTGAGTTT     420GGCCATTTCA TATGTAAGTA GAATAGGCTA GTGGCTTAAA AAATGTAATG AGTCCCGTCA     480GTTAGAATAT CAAAAAACAT GTATTTTTTC GGTTACCTAT ATAATGATTC GCCGACAATT     540CTTACGCAGA TTATTGATTG GCAGACAACG TTTCGCCGAG TAAAGGTACG CTGATGAATT     600TGAGCGCATA TGTATTGTTT CGCGTACTAA CGTTTAATTG ACTATTTATT CATTCAGTTG     660GCTTATGGGT CAGTAAGCCG AGCAACTAAT AACAGAAATT CGTTTAGCCG ATTAATCACT     720ACACATTTTG AACGTTTACT CAAACAAGTT TTCGCTTTAG AATTTGTGAT TATTTTAAAT     780TTAAAGTCAA AACAAACCAC GTCGCGACAC GCCAGCAGTT CGGTTATTGT TTGCCGCAAT     840TCTACCTAAC ACTCCTCCTC GCTGACGCTC GTCGTTGCAC CTAACTATAT TTCGGTGCCA     900TGTGATAACT CTGCTTATCA TGTTCCGGCG AACAGTTGTT CGCTTAACTC AAACAATTAC     960GAACCAAACA ATCGAATAAA CGTAAATCTG CATACCGCAA TTCTTTCGTA CCGACTACTC    1020GGCGAAATGA ATAATAGGCG TAACAATATT ATACCAAACG TTGCTCGGCC AAAAGAAAAA    1080TCTGCGTAAT CAAACTCGGC GAATCGACCG GTCACCATTA TCACTGAAAT AGATGGCCGT    1140AAATTGTAAT CTATTAATTT AATCGATTAA CATGTTTATA ATAGAATAAT AAATATTACT    1200TAACATTACT TAGTATTAAA TGATAGTAAC ATATTTTAAC ACTAGAGGGC TAGAAAATTA    1260AAATAAAGCT TACATTATGC TACTCTAATG ACGGACTAAA AAGATTTTTT TTCCCCAATT    1320ACCACTGTAC TTACTGTTTT TAAATATTTT AAAATACAGA AATTGTAACC AAAAAAAAAA    1380AAAAAAAA                                                             1388(2)SEQ ID NO:2的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：108氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：
    (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：蛋白质
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:2:Met Lys Cys Leu Met Leu Ile Met Ala Leu Ala Ile Ile Asn Thr Val1               5                   10                  15Ser Ser Asp Gly Ser Cys Thr Asn Thr Asn Ser Gln Leu Ser Ala Asn
        20                  25                  30Ser Lys Cys Glu Lys Ser Thr Leu Thr Asn Cys Tyr Val Asp Lys Ser
    35                  40                  45Glu Val Tyr Gly Thr Thr Cys Thr Gly Ser Arg Phe Asp Gly Val Thr
50                  55                  60Ile Thr Thr Ser Thr Ser Thr Gly Ser Arg Ile Ser Gly Pro Gly Cys65                  70                  75                  80Lys Ile Ser Thr Cys Ile Ile Thr Gly Gly Val Pro Ala Pro Ser Ala
            85                  90                  95Ala Cys Lys Ile Ser Gly Cys Thr Phe Ser Ala Asn
        100                 105(2)SEQ ID NO:3的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：90氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：
    (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：蛋白质
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:3:Asp Gly Ser Cys Thr Asn Thr Asn Ser Gln Leu Ser Ala Asn Ser Lys1               5                   10                  15Cys Glu Lys Ser Thr Leu Thr Asn Cys Tyr Val Asp Lys Ser Glu Val
        20                  25                  30Tyr Gly Thr Thr Cys Thr Gly Ser Arg Phe Asp Gly Val Thr Ile Thr
    35                  40                  45Thr Ser Thr Ser Thr Gly Ser Arg Ile Ser Gly Pro Gly Cys Lys Ile
50                  55                  60Ser Thr Cys Ile Ile Thr Gly Gly Val Pro Ala Pro Ser Ala Ala Cys65                  70                  75                  80Lys Ile Ser Gly Cys Thr Phe Ser Ala Asn
            85                  90(2)SEQ ID NO:4的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：32碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：DNA
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:4:CATATGCATA TGGATGGCTC GTGTACAAAC AC                                   32(2)SEQ ID NO:5的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：33碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：DNA
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:5:AAGCTTAAGC TTTTAATTAG CACTGAAAGT ACA                                 33(2)SEQ ID NO:6的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：15氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：
    (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:6:Phe Asp Gly Val Thr Ile Thr Ser Ser Thr Ser Thr Gly Ser Arg1               5                   10                  15(2)SEQ ID NO:7的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：22氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：
    (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:7:Ser Thr Leu Thr Asn Cys Tyr Val Asp Lys Ser Glu Val Tyr Gly Thr1               5                   10                  15Thr Cys Thr Gly Ser Arg
        20(2)SEQ ID NO:8的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：18氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：
    (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:8:Ile Ser Ser Cys Ile Ile Thr Gly Gly Val Pro Ala Pro Ser Ala Ala1               5                   10                  15Cys Lys(2)SEQ ID NO:9的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：25氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：
    (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:9:Asp Gly Thr Xaa Thr Asn Thr Asn Ser Gln Leu Ser Ala Asn Ser Gln1               5                   10                  15Xaa Asp Lys Ser Thr Leu Thr Asn Xaa
        20                  25(2)SEQ ID NO:10的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：19氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：
    (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:10:Asp Gly Thr Xaa Arg Asn Thr Asn Ser Gln Ile Thr Asn Ser Gln Gly1               5                   10                  15Xaa Asp Arg(2)SEQ ID NO:11的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：18氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：
    (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:11:Met Lys Cys Leu Met Leu Ile Met Ala Leu Ala Ile Ile Asn Thr Val1               5                   10                  15Ser Ser(2)SEQ ID NO:12的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：16氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：
    (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅸ)特征：
    (A)姓名/关键：修饰位点
    (B)位置：1
    (D)其它信息：/产物=“其它”
                          /注意=“Xaa=N-乙酰半胱氨酸”
(ⅸ)特征：
    (A)姓名/关键：修饰位点
    (B)位置：16
    (D)其它信息：/产物=“其它”
               /注意=“Xaa=缬氨酰胺”
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:12:Xaa Asp Lys Ser Thr Leu Thr Asn Ala Tyr Val Asp Lys Ser Glu Xaa1               5                   10                  15(2)SEQ ID NO:13的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：23碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：DNA
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:13:TGAAGTGTTT AATGCTGATC ATG                                             23(2)SEQ ID NO:14的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：23碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：DNA
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:14:CATTAGAGTA GCATAATGTA AGC                                             23(2)SEQ ID NO:15的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：21碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：DNA
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:15:TCCAAGTGCG AAAAATCGAC G                                               21(2)SEQ ID NO:16的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：20碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：DNA
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:16:GCTGATGGAG CAGGTACACC                                                 20(2)SEQ ID NO:17的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：327碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：cDNA
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:17:ATGAAGTGTT TAATGCTGAT CATGGCTCTA GCCATTATCA ACACTGTATC TTCTGATGGC      60TCGTGTACAA ACACGAACTC TCAGCTCAGC GCAAACTCCA AGTGCGAAAA ATCGACGTTG     120ACCAACTGCT ACGTCGATAA AAGCGAGGTT TACGGCACTA CCTGTACAGG AAGCCGATTC     180GACGGAGTCA CTATAACGAC TTCAACATCT ACCGGTTCAC GTATTTCAGG CCCTGGATGC     240AAGATTTCCA CTTGCATTAT CACCGGGGGT GTACCTGCTC CATCAGCTGC TTGCAAGATT     300TTCGGATGTA CTTTCAGTGC TAATTTA                                         327

Claims (34)

1．一种分离的编码抗冻蛋白的核酸，所述蛋白的定义如下：
(ⅰ)计算分子量在7至15kDa之间；
(ⅱ)在约1mg/mL的浓度下，热滞后活性大于约1.5℃；和
(ⅲ)(a)可与选自SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的抗冻蛋白的抗体特异性结合；或
(b)有至少60％的氨基酸序列与选自SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的抗冻蛋白相同。
2．根据权利要求1所述的分离的核酸，其中编码的蛋白质的计算分子量在约8至12kDa间。
3．根据权利要求1所述的分离的核酸，其中在约1mg/mL的浓度下，热滞后活性大于2℃。
4．根据权利要求1所述的分离的核酸，其中编码的蛋白质有至少80％的氨基酸序列与选自SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的抗冻蛋白相同。
5．根据权利要求1所述的分离的核酸，其中编码的蛋白质选自SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3。
6．根据权利要求1所述的分离的核酸，其中抗冻蛋白可在昆虫体内发现。
7．根据权利要求6所述的分离的核酸，其中抗冻蛋白可在枞色卷蛾属中发现。
8．一种分离的核酸，该核酸可在严格的条件下与SEQ ID NO:1特异性杂交。
9．一种分离的核酸编码的纯抗冻蛋白，该抗冻蛋白可与针对选自SEQ IDNO:2和SEQ ID NO:3的抗冻蛋白的抗体特异性结合。
10．一种分离的抗冻蛋白，所述蛋白的定义如下：
(ⅰ)计算分子量在7至15kDa之间；
(ⅱ)在约1mg/mL的浓度下，蛋白的热滞后活性大于约1.5℃；和
(v)(a)可与选自SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的抗冻蛋白的抗体特异性结合；或
(c)有至少60％的氨基酸序列与选自SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的抗冻蛋白相同。
11．根据权利要求10所述的分离的抗冻蛋白，其中抗冻蛋白可在昆虫体内发现。
12．根据权利要求10所述的分离的抗冻蛋白，其中抗冻蛋白可在枞色卷蛾属中发现。
13．根据权利要求10所述的分离的抗冻蛋白，其中在约1mg/mL的浓度下，抗冻蛋白的热滞后活性大于约2℃。
14．根据权利要求10所述的分离的抗冻蛋白，其中蛋白选自SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3。
15．一种抗体，该抗体可在免疫反应条件下与包括SEQ ID NO:2和SEQ IDNO:3的所述抗冻蛋白发生特异性免疫反应。
16．一种抗体，该抗体可在免疫反应条件下与抗冻蛋白发生特异性免疫反应，所述抗冻蛋白包括由权利要求1所述的核酸编码的蛋白。
17．一种生物，向该生物内引入在严格条件下与SEQ ID NO:1特异性杂交的外源核酸序列或权利要求1所述的核酸，该生物将外源核酸表达成抗冻蛋白。
18．根据权利要求17所述的生物，其中外源核酸序列被翻译成表达到生物体外的抗冻蛋白。
19．根据权利要求17所述的生物，其中所述生物是鱼。
20．根据权利要求19所述的生物，其中所述的鱼生活在咸水环境中。
21．根据权利要求19所述的生物，其中所述的鱼是鲑科家族成员。
22．根据权利要求17所述的生物，其中所述生物是植物。
23．根据权利要求17所述的生物，其中所述生物是真菌。
24．根据权利要求17所述的生物，其中所述生物是酵母。
25．根据权利要求24所述的生物，其中酵母选自Torulopsis holmil、Saccharomyces fragilis、酿酒酵母菌、Saccharomyces lactis和Candidapseudotropicalis。
26．根据权利要求17所述的生物，其中生物是细菌。
27．根据权利要求26所述的生物，其中细菌选自大肠杆菌、坚忍链球菌、乳链球菌、嗜热链球菌、嗜柠檬酸明串球菌、肠系膜样明串球菌、嗜酸乳酸杆菌、乳酸乳杆菌、Bifidobacterium bifidum、Bifidobacteriu breve和Bifidobacteriumlongum。
28．一种降低水溶液冰点的方法，所述方法包括将权利要求10所述的抗冻蛋白加入所述水溶液中。
29．一种降低水溶液冰点的方法，所述方法包括将权利要求1所述的核酸编码的抗冻蛋白加入所述水溶液中。
30．根据权利要求28或29所述的方法，其中将水溶液施用于生物。
31．根据权利要求28或29所述的方法，其中抗冻蛋白用重组方法生产。
32．根据权利要求28或29所述的方法，其中抗冻蛋白还可与权利要求15或权利要求16所述的抗体特异性结合。
33．根据权利要求28所述的方法，其中抗冻蛋白选自SEQ ID NO:2和SEQ IDNO:3。
34．根据权利要求28所述的方法，其中抗冻蛋白由与SEQ ID NO:1特异性杂交的核酸分子编码。
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