CN1266163C - 棉花黄萎病菌分泌型激发子基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种能够在棉花及其它植物上引起抗病过敏反应的大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)非特异性激发子的基因VdNEP及其应用。VdNEP蛋白能够诱导拟南芥病程相关(PR)基因的表达。低浓度VdNEP蛋白可诱导棉花悬浮细胞合成植保素棉酚，高浓度VdNEP引起棉花悬浮细胞的过敏性死亡。将该蛋白注射入棉花子叶，在低浓度下同样会出现过敏性坏死斑，而在高浓度条件下出现叶片失水萎蔫。用该蛋白处理成熟的棉花真叶叶片，则造成叶片的失水干枯。VdNEP为改善植物的抗病性提供了新的途径，因而具有巨大的应用前景。

Description

棉花黄萎病菌分泌型激发子基因及其应用

技术领域

本发明涉及植物抗病基因工程领域，更具体地涉及一种能够在棉花及其它植物上引起抗病过敏反应的非特异性大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)激发子的基因及其应用。

背景技术

识别在植物与病原物的互作过程中起着关键作用。病原物必须识别其生存环境中可能的寄主植物，并进一步识别寄主植物特殊的表面特征以便成功的侵入和侵染，病原物要成功的侵染寄主，必须识别并克服植物的防卫反应。与此同时，植物也必须识别其生存环境中各种各样可能的病原物并启动自身相应的防卫机制。

在植物与病原物的识别过程中，激发子及其受体起着非常重要的作用。激发子最初仅表示能诱导植物合成并积累植物保卫素的分子或其他刺激因子，但现在普遍用于所有能刺激防卫机制的分子，包括寡糖，糖蛋白，多肽和脂类分子等。

激发子可能是来源于病原菌的物质分子，也可能是在病原菌的作用下植物释放的化合物。激发子可以分为2大类，非特异性的激发子和小种特异性的激发子。非特异性激发子能够在寄主和非寄主植物上引起防卫反应，而特异性的激发子只能在特异品种的植物上引起抗病反应。

植物的防卫机制包括抗微生物的植物保卫素的合成和积累，攻击病原物表面多聚物的糖基水解酶的产生，活性氧的产生，细胞的过敏性坏死，抑制病原物降解酶的蛋白质抑制物的合成和由于胼胝质、富含羟脯氨酸糖蛋白或木质索沉积而对植物细胞壁的修饰作用。最终的结果是增强植物的抗病性。

植物病害严重影响植物的生长发育，病害的发生往往给农业生产造成极大的损失，严重影响国民经济的发展。在植物病害的防治方面，由于毒性、残留和抗药性三大问题，化学防治的应用受到很大限制。随着分子生物学的深入发展和重组DNA技术的日趋完善，利用抗病基因工程来改良作物的抗病性，近年来取得了迅速的发展。

最初的策略是在植物中过量表达抗菌蛋白以增强作物的抗病性，但是这种方法往往会影响作物的产量和品质，而且这种抗性往往只局限于很少几种病原菌，不能产生广谱的抗病性。最重要的是，转入的抗菌蛋白的作用会受到植物本身防卫机制的影响，转入的蛋白必须与植物内源的抗病化合物相匹配才能起到抗病的作用。植物的抗病基因也被广泛应用于抗病育种，但植物所获得的抗病性往往会由于病原菌小种的变异而丧失，而且抗病基因在亲缘关系较远的物种中常常不能很好的工作，这给抗病基因的应用带来了很大的限制(Maarten &Jerome，2001，Nature，411：865-868)。

过敏反应(hypersensitive response)是植物防卫反应系统中最强有力的武器。选择能够诱导植物过敏反应的激发子基因，以病原菌诱导启动子驱动并转化植物，使该基因在病原菌侵入的情况下表达，启动植物的过敏反应，从而有望获得广谱性的抗病性。Harald keller等(Harald keller等，1999，The plant cell，11：223-235)以烟草hsr203J基因的启动子驱动来自大雄疫霉的激发子基因cryptogein转化烟草，获得了广普的抗真菌烟草，而且转入的激发子基因只在病原物侵染的情况下表达。而Maarten & Jerome的转基因番茄能够抑制病毒的侵染(Maarten & Jerome，2001，Nature，411：865-868)。

棉花是我国重要的经济作物之一，黄萎病是棉花广泛流行的一种病害。由于黄萎病的发生，给我国的棉花生产造成相当严重的经济损失。针对黄萎病所采取的防治措施中最有效的就是种植抗病品种。获得抗性品种的途径，一种是传统的育种方法，但是育种时间长，耗资大，抗性品种的抗性易退化，而且受到抗性品种资源少的限制。另一种方法是通过抗病基因工程将相关基因导入棉花体内，使棉花获得或增强抗病性，且不影响棉花本身的优良品质。克隆能够在棉花上引起过敏反应的激发子基因将为棉花抗病基因工程提供基因资源。

迄今为止，本领域尚没有报道过棉花黄萎病菌分泌型激发子基因，因此本领域迫切需要开发棉花黄萎病菌分泌型激发子基因。

发明内容

本发明的目的就是提供一种棉花黄萎病菌分泌型激发子基因。

在本发明的第一方面，提供了一种新颖的分离出的VdNEP多肽，该多肽源自大丽轮枝菌，它包含：具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。

较佳地，该多肽选自下组：(a)具有SEQ ID NO：2中第1-233位，第19-233位(去除信号肽)，或第24-233位(去除信号肽和前5个aa)氨基酸序列的多肽；(b)将SEQ ID NO：2中第1-233位，第19-233位，或第24-233位所述的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有引起过敏性坏死斑功能的由(a)衍生的多肽。

更佳地，该多肽是具有SEQ ID NO：2中第1-233位，第19-233位，或第24-233位氨基酸序列的多肽。

在本发明的第二方面，提供编码分离的这些多肽的多核苷酸，该多核苷酸包含一核苷酸序列，该核苷酸序列与选自下组的一种核苷酸序列有至少70％相同性：(a)编码上述VdNEP多肽的多核苷酸；和(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。较佳地，该多核苷酸编码具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽。更佳地，该多核苷酸的序列是选自下组的一种：(a)具有SEQ ID NO：1中19-717位的序列；(b)具有SEQ ID NO：1中1-903位的序列；(c)具有SEQ ID NO：1中73-717位的序列。

在本发明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的载体，以及被该载体转化或转导的宿主细胞或者被上述多核苷酸直接转化或转导的宿主细胞。

在本发明的第四方面，提供了制各具有VdNEP活性的多肽的方法，该方法包含：(a)在适合表达VdNEP的条件下，培养上述被转化或转导的宿主细胞；(b)从培养物中分离出具有VdNEP活性的多肽。

在本发明的第五方面，提供了与上述的VdNEP多肽特异性结合的抗体。还提供了可用于检测的核酸分子，它含有上述的多核苷酸中连续的10-903个核苷酸。

在本发明的第六方面，提供了检测样品中是否存在VdNEP的方法，它包括：将样品与VdNEP的特异性抗体接触，观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在VdNEP。

在本发明的第七方面，提供了一种改善植物抗病性的方法，它包括步骤：

(1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有VdNEP多肽DNA编码序列，所述的VdNEP多肽具有SEQ ID NO：2中第1-233位，第19-233位，或第24-233位的氨基酸序列；

(2)将植物细胞或组织或器官与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使VdNEP多肽DNA编码序列转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上：

(3)选择出转入VdNEP多肽DNA编码序列的植物细胞或组织或器官；

(4)将步骤(3)中的植物细胞或组织或器官再生成植株。

本发明的其它方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1显示了VdNEP基因核苷酸序列

图2显示了VdNEP基因的蛋白质序列：

图3显示了VdNEP蛋白与几个不同物种的乙烯和坏死诱导蛋白的同源比较(BLASTP)结果。VdNEP蛋白与来自尖镰孢霉(Fusarium oxysporum)、单子腐霉(Pythium monospermum)、瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)和大雄疫霉(Phytophthora sojae)的乙烯和坏死诱导蛋白氨基酸序列同源性分别为62％，38％，36％，33％。

图4显示了VdNEP表达蛋白在烟草(A)、拟南芥(B)和棉花(C)叶片上引起的过敏性坏死斑。

具体实施方式

本发明经过广泛而深入的研究，首次从大丽轮枝菌获得了一个编码乙烯和坏死诱导蛋白的基因VdNEP。该基因共计702个核苷酸，原核表达获得的蛋白能够在烟草和拟南芥叶片上引起过敏性坏死斑，并伴随有活性氧的爆发，是一种非特异性的激发子。在此基础上完成了本发明。

本发明的研究表明：VdNEP蛋白能够诱导拟南芥病程相关(PR)基因的表达。VdNEP蛋白在很低的浓度下即可诱导棉花悬浮细胞合成棉酚(一种植物保卫素)。随着使用浓度的提高引起棉花悬浮细胞的过敏性死亡(有典型的DNA剪切现象)。将VdNEP蛋白注射入棉花子叶，在低浓度下同样会出现过敏性坏死斑，而在高浓度条件下出现叶片失水萎蔫。用VdNEP蛋白处理成熟的棉花真叶叶片，则造成叶片的失水干枯。

在本发明中，术语“VdNEP”、“VdNEP多肽”或“激发子VdNEP”可互换使用，都指具有大丽轮枝菌激发子VdNEP氨基酸序列(SEQ ID NO：2)的蛋白或多肽。它们包括含有或不含起始甲硫氨酸的激发子VdNEP，还包括含有不含有信号肽的VdNEP。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，“分离的VdNEP或多肽”是指VdNEP多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化VdNEP。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。

本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括VdNEP的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然VdNEP相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

在本发明中，术语“VdNEP多肽”指具有VdNEP活性的SEQ ID NO.2序列的多肽。该术语还包括具有与VdNEP相同功能的、SEQ ID NO.2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或多个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括VdNEP的活性片段和活性衍生物。

该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与VdNEPDNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗VdNEP多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含VdNEP多肽或其片段的融合蛋白(如SEQ ID NO：3所示的融合蛋白)。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了VdNEP多肽的可溶性片段。通常，该片段具有VdNEP多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

发明还提供VdNEP或多肽的类似物。这些类似物与天然VdNEP多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，“VdNEP保守性变异多肽”指与SEQ ID NO：2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。

                      表1

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Ash	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO：1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO：2的蛋白质，但与SEQ ID NO：1所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码SEQ ID NO：2的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SFQ ID NO：2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码VdNEP的多聚核苷酸。

本发明的VdNEP核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或VdNEP编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的重组DNA技术(Science，1984；224：1431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的VdNEP多肽。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码VdNEP多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，VdNEP多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含VdNEP编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞等。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得抗病性提高的植物。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

重组的VdNEP或多肽有多方面的用途。例如用于筛选促进或对抗VdNEP功能的抗体、多肽或其它配体。用表达的重组VdNEP筛选多肽库可用于寻找有价值的能抑制或刺激VdNEP功能的多肽分子。

另一方面，本发明还包括对VdNEPDNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。较佳地，指那些能与VdNEP基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制VdNEP的分子，也包括那些并不影响VdNEP功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的VdNEP基因产物结合的抗体。

本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段、或嵌合抗体。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的VdNEP基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达VdNEP或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备。本发明的各类抗体可以利用VdNEP基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与VdNEP基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。

多克隆抗体的生产可用VdNEP或多肽免疫动物，如家兔，小鼠，大鼠等。多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。

本发明还涉及定量和定位检测VdNEP水平的测试方法。这些试验是本领域所熟知的。一种检测检测样品中是否存在VdNEP的方法是利用VdNEP的特异性抗体进行检测，它包括：将样品与VdNEP特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在VdNEP。

在本发明的一个实例中，提供了一种分离的多核苷酸，它编码具有SEQ IDNO：2所示氨基酸序列的多肽。本发明的多核苷酸是从大丽轮枝菌cDNA文库中分离出的。其序列如SEQ ID NO：1所示，它包含的多核苷酸序列全长为903个碱基，其开放读框位于19-717位，编码全长为233个氨基酸的VdNEP(SEQ IDNO：2)。

VdNEP为改善植物的抗病性提供了新的途径，因而具有巨大的应用前景。可用本发明的VdNEP改善抗病性(尤其是抗黄萎病菌)的植物没有特别限制，因为VdNEP是非特异性的激发子。代表性的植物包括(但并不限于)：棉花、烟草、拟南芥等等。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

大丽轮枝菌cDNA文库的构建和噬菌体的释放

25℃，150rpm震荡悬浮培养大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)2-3周，在其分泌蛋白的分泌达到高峰时，收取菌体为材料，提取总RNA，利用Stratagene公司的建库试剂盒，用以下方法构建了一个棉花黄萎病菌的cDNA文库。

合成的第一、二链cDNA及分级分离后的样品均取一定的量电泳，确保cDNA的质量，尤其是分级分离后，含有500bp以下cDNA的组分均不采用，以免影响大片段cDNA的连接效率。cDNA与ZAP express载体(Stratagene公司)连接后，经包装蛋白包装，得到约含1.0×10⁶Pfu独立克隆的原库。

将XL₁-Blue感受态细胞(Stratagene公司)用10mM MgSO₄稀释至OD₆₀₀为1.0。SOLR细胞的制备类似于XL₁-Blue细胞，最后长至OD₆₀₀为0.5-1.0之间。在1.5ml离心管中加入200μl XLl-Blue细胞，5μl阳性噬菌体溶液，1μl ExAssit辅助噬菌体(＞1×10⁶pfu/ml，Stratagene公司)，混匀，37℃温育15min。将混合液转至3ml LB中，37℃振荡培养2-2.5小时。2,000g离心15min，吸出上清。70℃温育15min，4,000g离心15min，吸出上清液。两个1.5ml离心管中各加入200μl新鲜的XLOLR细胞(Stratagene公司)，并分别加入上述的上清液100、10μl，37℃温育15min，各取10-50μl铺LB(含100μg/ml Amp)平板，37℃培养过夜。获得单克隆。

结果：

将文库噬菌体释放到XLOLR细胞中，获得单克隆2000个。

实施例2

测序和ESTs序列的分析

挑取单克隆，96孔板震荡培养过夜。提取质粒，抽样电泳检测质粒质量。以T3引物为测序引物，在Megabase自动测序仪上测序。将获得的1300个DNA序列在Genebank中进行比较，根据比较结果，按照ESTs序列可能的功能进行分类(期望值大于e-3)。

结果：

在这1300个ESTs序列中，决定蛋白命运的序列有35个；与蛋白合成有关的序列12个；与细胞骨架有关的序列5个；转运相关蛋白24个；信号传导相关的序列71个；转录相关的序列10个；与自身防御和侵染寄主相关的序列52个；DNA代谢的序列5个：能量代谢有关的序列17个；在Genebank中未发现任何同源序列的229个，约占17.6％，同源性较低(期望值大于e-3)的序列646个，接近50％；与功能未知的蛋白同源的序列41个；以及其它功能的序列100多个。

与真菌防御和侵染寄主相关的52个ESTs序列中，部分序列编码的蛋白与其它植物或动物病原菌中的毒性因子或侵染相关蛋白有较高的相似性，可能编码大丽轮枝菌的激发子。

其中，06H05号序列编码分泌出胞外的天冬氨酸蛋白酶，该蛋白酶在许多动物病原菌侵染寄主的过程中起着关键的作用，可能与病原菌的附着、定殖和侵入相关。03E05号序列编码分泌出胞外的丝氨酸蛋白酶，09F07号序列编码木质素酶，都可能参与寄主细胞壁的降解。

令人感兴趣的是，07G01号序列编码一个约25KD的乙烯和坏死诱导蛋白，与分离自镰刀菌的乙烯和坏死诱导蛋白氨基酸序列同源性为62％。有研究表明，分离自镰刀菌的乙烯和坏死诱导蛋白能够诱导烟草的抗病防卫反应，因而07G01很有可能也编码一种激发子，该基因被命名为VdNEP。

对VdNEP的测序结果如SEQ ID NO：1和图1所示，共903bp，其中ORF位于第19-717位，编码一个全长为233aa的蛋白(SEQ ID NO：2和图2)。其中信号肽位于第1-18位。

VdNEP蛋白与几个不同物种的乙烯和坏死诱导蛋白的同源比较(BLASTP)结果如图3所示。VdNEP蛋白与来自Fusarium oxysporum、Pythium monospermum、Pythium aphanidermatum和Phytophthora sojae的乙烯和坏死诱导蛋白氨基酸序列同源性分别为62％，38％，36％，33％。

实施例3

VdNEP基因的原核表达和纯化

(a)表达载体的构建：

VdNEP基因cDNA全长序列用正向引物VdNEPEcoRF 5′gaattccagcagccccccaaggtt 3′(SEQ ID NO：3；含EcoR I酶切位点)和反向引物VdNEPNotR 5′gcggccgcttaaaacgcggcgcgcatg 3′(SEQ ID NO：4；含Not I酶切位点)，以抽提的大丽轮枝菌mRNA为模板，经Pfu聚合酶进行RT-PCR扩增后(去除了预测的信号肽序列)，酶切，连接导入pET32a(+)质粒(Novagen公司)，热激法转入大肠杆菌DH5α，挑选阳性克隆，摇菌提取质粒，测序验证。

(b)诱导表达：

将步骤(a)获得的质粒用热激法转入大肠杆菌BL21。挑选阳性克隆，在含100μg/ml Amp的LB培养基中37℃培养至OD₆₀₀＝0.4-0.6，加入IPTG(终浓度为1mM)，22℃，220rpm震荡培养12小时。高速离心收集菌体。用裂解缓冲液重新悬浮菌体，经超声波破碎菌体以后，4℃高速离心，收集上清液。取上清液20uL，加入等量的2XSDS上样缓冲液，沸水浴3-5分钟后高速离心5分钟。SDS-PAGE电泳，考马斯亮兰R250溶液染色，观察蛋白诱导表达情况。

结果：SDS-PAGE电泳检测，获得一个约42KD的融合表达蛋白(His-VdNEP融合蛋白)，与预测值相符。

蛋白纯化：

按照Novagen公司的pET系统操纵手册进行，采用pET HisTag Ni亲和层析法。缓冲液的配制参见操作手册。将收集的上清液缓慢通过Ni-NTA树脂柱，使带有his蛋白标签的表达蛋白与树脂结合，用大量清洗缓冲液非特异性结合的杂蛋白，最后用洗脱缓冲液将表达蛋白从树脂柱上洗脱下来。收集洗脱下来的蛋白溶液，在大体积的磷酸盐缓冲液中4℃透析过夜。

蛋白定量：

将获得的蛋白溶液用考马斯亮蓝G-250溶液定量。同时纯化pET32a(+)空质粒表达的约20KD的his标签蛋白作为对照。

结果：获得了纯化的约42KD的融合表达蛋白(His-VdNEP融合蛋白)。

实施例4

VdNEP表达蛋白在烟草和拟南芥上引起的反应

用无针头的1mL注射器将0.02μg/μL的VdNEP表达蛋白溶液从叶片背面分别注射入烟草和拟南芥的叶片，同时注射his标签蛋白作为对照。48小时后观察烟草和拟南芥叶片上的反应。

注射2小时以后用DAB(3，3′-Diaminobenzidine)溶液对拟南芥叶片进行染色，观察活性氧的产生。切取叶片浸泡在lmg/mL的DAB(Sigma)(pH3.8)中，25℃光照8小时，取出叶片置于96％乙醇中煮沸10分钟，然后在新鲜的乙醇中浸泡4小时，观察有无红褐色沉淀产生并拍照。

注射8小时以后用台盼蓝溶液对拟南芥叶片进行染色，观察细胞的过敏性死亡。将叶片在含0.25mg/mL台盼蓝的乳酚溶液中煮沸2分钟，置于2.5g/mL的水合氯醛溶液中脱色12小时，观察并拍照。死亡的细胞被染成蓝色。

RT-PCR分析：取所需的材料用液氮磨成细粉，加1mLTRIzol试剂(Invitrogen)，混匀并室温静置5分钟。再加入0.2mL氯仿混匀，室温静置3分钟。4℃12000g离心10分钟，上清移至新管加0.5mL异丙醇室温放置10分钟以沉淀RNA，12000g离心10分钟。沉淀用70％乙醇稍洗，RNA溶于一定体积的DEPC处理的水中。

PolyA mRNA第一链反转录采用Takara公司RNA PCR系统。取1μg总RNA，按照试剂盒说明书操作，室温静置10min后，42℃反应30min，取出，沸水煮5min后，置于冰上，以使反转录酶失活。取1μl反转录产物作PCR。以肌动蛋白为内标，校正用于RT-PCR反应的模板量。以PR基因各自特异性的引物做PCR(PR1基因正向引物PR1F：5′tcccgctcaaccgccaaaag3′(SEQ ID NO：5)，反向引物PR1R：5′acggaggcacaaccaagtcg3′(SEQ ID NO：6)；ACS6基因正向引物ACS6F：5′cataagtgttgcggaagtaa3′(SEQ ID NO：7)，反向引物ACS6R：5′ggcaatggaacgaacc3′(SEQ ID NO：8))，分析PR基因表达的变化。

结果：

48小时后0.02ug/uL的VdNEP表达蛋白在烟草和拟南芥叶片上引起了过敏性坏死斑(图4A和图4B)。注射2小时以后，用DAB溶液对拟南芥叶片进行染色，发现有活性氧的产生。注射8小时以后用台盼蓝溶液对拟南芥叶片进行染色，即发现有细胞的过敏性死亡。

RT-PCR分析表明，VdNEP表达蛋白在注射4小时以后即可诱导拟南芥PR蛋白(ACS6和PR1)的表达。

实施例5

VdNEP表达蛋白在棉花上引起的反应

(a)对悬浮培养的棉花细胞的影响

棉花细胞悬浮培养：

挑取生长旺盛、结构疏松的愈伤组织块，转接到MB(MS大量元素、微量元素+B5有机物，并附加1mg/L 2，4-D，0.1mg/L IAA，0.1mg/L KT)液体培养基中，24℃，110rpm振荡培养，每7天继代培养一次，继代3-5次后，用于激发子处理实验。

伊文思蓝染色：

将细胞在0.02％的伊文思蓝染色液中染色20分钟，用大量水冲洗细胞后，将细胞铺在载玻片上，在显微镜下观察并拍照，死亡的细胞被染成蓝色。

DNA剪切：

用凋亡DNA抽提试剂盒(华舜公司)提取悬浮细胞DNA，在2％的琼脂糖凝胶上进行电泳检测，观察DNA剪切现象并拍照。

将VdNEP表达蛋白溶液加入棉花悬浮培养细胞至终浓度分别为0.01、0.05、0.1、0.5和1μg/mL，继续培养36小时以后，测定悬浮细胞中棉酚的含量，同时伊文思(Evans)蓝染色观察棉花悬浮培养细胞的死亡率。

结果：

在VdNEP蛋白浓度为0.01-0.1ug/mL时，悬浮细胞中的棉酚含量随着VdNEP表达蛋白浓度的提高而增加，Evans蓝染色表明棉花悬浮培养细胞的死亡率也在增加。在VdNEP表达蛋白浓度浓度达到0.5ug/mL时，悬浮细胞中的棉酚含量急剧下降，Evans蓝染色表明棉花悬浮培养细胞几乎全部死亡。DNA检测表明，死亡的细胞有明显的DNA剪切现象，是典型的过敏性死亡。

(b)对棉花叶子的影响

(i)用无针头的1mL注射器将不同浓度(0.02、0.2、和2ug/uL)的VdNEP表达蛋白溶液分别注射入棉花的子叶，28℃光照培养，定时观察叶片症状。

结果发现，在低浓度下(0.02ug/uL)，48小时后叶片上会形成过敏性坏死斑(图4C)，在高浓度下(2ug/uL)，12小时后叶片即脱水萎蔫。

(ii)将新剪下的棉花真叶叶片叶柄浸入0.7ug/uLVdNEP表达蛋白溶液，28℃光照培养，定时观察叶片症状。

结果发现，48小时后，叶片失水干枯。

实施例6

VdNEP基因的分子特征

Southern blot分析：

提取大丽轮枝菌的基因组DNA，每样品取20μg DNA分别用Pst I，Xba I，Xho I酶切。待DNA完全酶切后，0.8％琼脂糖凝胶电泳，切去多余的凝胶，0.25M HCl浸泡15min，水洗，加入变性液，于室温轻摇变性45min，短暂水洗，加入中和液室温中和30min。以20×SSC为转移液，用毛细管吸印法转膜12-16小时，将DNA转移到Hybond-XL膜上，用铅笔标记上样孔位置，6×SSC短暂漂洗，80℃烘烤固定2小时，备用。

探针标记：

将实施例3获得的PCR产物经电泳、割胶纯化后，取25ng作为模板标记探针。探针的标记使用Prime-a-Gene Labeling System(Promega)，标记体系为50μL(掺入α-³²P-dCTP)，37℃温浴1小时。标记的探针以QIAquick NucleotideRemoval Kit纯化。

预杂交和杂交：

将转有总RNA硝酸纤维素膜，浸入10mL预杂交液中，在杂交炉中42℃预杂交2-4小时。将变性后的探针，全部加入上述预杂交液中，42℃杂交24小时。

洗膜与压片：

杂交结束后，倒出杂交液。按照以下程序洗膜：

1)2×SSC，0.1％SDS室温洗涤两次，每次5min，

2)0.2×SSC，0.1％SDS室温洗涤两次，每次5min，

3)0.2×SSC，0.1％SDS，42℃洗涤两次，每次15min，

4)2×SSC，室温短暂漂洗。

将膜置于纸巾上，以除去大部分液体。将膜用保鲜膜包裹，平整压于X光片下，附加增感屏，-70℃曝光合适的时间，一般2-3天。按照常规方法冲洗X光片。

Northern blot分析：

从不同培养时间的大丽轮枝菌菌丝中提取RNA，定量。样品中加入溴乙锭，以便在电泳结束后初步观察同时调整RNA的上样量。每泳道加样量为15μg总RNA，电泳使用1.2％的琼脂糖，1×MOPS电泳缓冲液，电场强度8V/cm，至染料迁移至凝胶的一半时结束。凝胶经20×SSC平衡45min后，加筑转移平台，在20×SSC中，将RNA转移到Hybond-XL膜上(24小时)。转移结束后，用铅笔在膜上标记出加样孔的位置，并剪去膜的左上角作为标记。膜经6×SSC溶液短暂漂洗后，夹在两层滤纸之间，在80℃烘烤2小时后，密封保存或直接用于杂交。探针标记和杂交同Southern blot分析。

结果：

对VdNEP基因的Southern分析表明，该基因在大丽轮枝菌中为单拷贝。而Northern分析表明，该基因在震荡培养条件下的表达水平不高，在第7天左右时表达量略高。

实施例7

VdNEP蛋白的结构分析

用常规的Megaprimer的方法，以VdNEP基因为模板，设计不同的引物进行PCR，获得点突变序列。同时设计引物，以VdNEP基因为模板，获得VdNEP基因各种不同的两端缺失序列。酶切，连接导入pET32a(+)质粒，热激法转入大肠杆菌DH5α，挑选阳性克隆，摇菌提取质粒，测序验证。

诱导表达突变蛋白，纯化后注射烟草叶片。以能否在烟草叶片上造成过敏性坏死斑为标准判断突变蛋白的激发子活性。

结果：

点突变分析表明，VdNEP蛋白的3个半胱氨酸残基以及几个保守的氨基酸残基(SEQ ID NO：2中第C56，C82，C218和122-128位GHRHDWE)对于蛋白的激发子活性是必须的。而两端缺失的实验结果表明，蛋白的完整性对其激发子的活性同样重要。只有N端跟在信号肽后面的5个氨基酸残基可以缺失，即SEQ IDNO：2中第24-233位的缺失型VdNEP仍具有激发子活性。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

                     序列表

<110>中国科学院上海生命科学研究院

<120>棉花黄萎病菌分泌型激发子基因及其应用

<130>036260

<160>8

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>903

<212>DNA

<213>大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)

<220>

<221>CDS

<222>(19)..(717)

<223>

<400>1

gccatctgca cctgctac atg ctt ccc tcc gca gtc ttc tcg gtc ttt gcc      51

                    Met Leu Pro Ser Ala Val Phe Ser Val Phe Ala

                    1               5                   10

ctc gtc ggc agc gcc ttg gct cag cag ccc ccc aag gtt aac cac gac      99

Leu Val Gly Ser Ala Leu Ala Gln Gln Pro Pro Lys Val Asn His Asp

            15                  20                  25

agt atc aac ccc gtc cgc gat act ctg ggg ccc aac ggc gac atg atc     147

Ser Ile Asn Pro Val Arg Asp Thr Leu Gly Pro Asn Gly Asp Met Ile

        30                  35                  40

agg sag ttc cag cct ctg ctt cac att gcc cac ggt tgc cag cct tac     195

Arg Lys Phe Gln Pro Leu Leu His Ile Ala His Gly Cys Gln Pro Tyr

    45                  50                  55

tcc gct gtc aac acc cgc ggt gag gtc aac gcc ggt ctc caa gac agc     243

Ser Ala Val Asn Thr Arg Gly Glu Val Asn Ala Gly Leu Gln Asp Ser

60                  65                  70                  75

ggt acc acc gca ggc ggc tgc aag gaa acc agc aag ggc cag acc tac     291

Gly Thr Thr Ala Gly Gly Cys Lys Glu Thr Ser Lys Gly Gln Thr Tyr

                80                  85                  90

gcc cgc tcc atg acc ctg aac ggc cag ttc ggc atc atg tac gcc tgg     339

Ala Arg Ser Met Thr Leu Asn Gly Gln Phe Gly lle Met Tyr Ala Trp

            95                  100                 105

tac tgg ccc aag gac cag ccc gcc gac ggc aac ctc gcc agc ggc cac     387

Tyr Trp Pro Lys Asp Gln Pro Ala Asp Gly Asn Leu Ala Ser Gly His

        110                 115                 120

cgc cac gac tgg gag aac gtc gtc atc tgg ttc aac tcg aac aac gca      435

Arg His Asp Trp Glu Asn Val Val Ile Trp Phe Asn Ser Asn Asn Ala

    125                 130                 135

aac cag gcc ggc atc ctg cgc ggc gcc gcc tcg ggc cac ggc gac tac      483

Asn Gln Ala Gly Ile Leu Arg Gly Ala Ala Ser Gly His Gly Asp Tyr

140                 145                 150                 155

aag aag gtc aac aac ccc cag cgc aac aac aac aec ctc cac gtc gag      531

Lys Lys Val Asn Asn Pro Gln Arg Asn Asn Asn Asn Leu His Val Glu

                160                 165                 170

tac ttc acc agc ctc ggc aag aac cac gag ctg cag ttc aag acg tcg      579

Tyr Phe Thr Ser Leu Gly Lys Asn His Glu Leu Gln Phe Lys Thr Ser

            175                 180                 185

ccc ggc cgc acc tac tgg atc tgg gac tgg gac agg atg gac acc acc      627

Pro Gly Arg Thr Tyr Trp Ile Trp Asp Trp Asp Arg Met Asp Thr Thr

        190                 195                 200

gtc cag ggc gcc ctc aac cgc gcc gac ttt ggc agc gcc aac tgc ccc      675

Val Gln Gly Ala Leu Asn Arg Ala Asp Phe Gly Ser Ala Asn Cys Pro

    205                 210                 215

ttc aac aac aac aac ttt gag agg aac atg cgc gcc gcg ttt              717

Phe Asn Asn Asn Asn Phe Glu Arg Asn Met Arg Ala Ala Phe

220                 225                 230

taaaggctcg acgcgcggct cgccagtcct ggattccatc tgggcacgca ccttggctct    777

ttctcctccc gccttggctt ggcttcttga ggctagtcga gtgctagcat aggtcctgta    837

catagcttgt tctgaattac atacaactct gcctgtcgaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa    897

ctcgag                                                               903

<210>2

<211>233

<212>PRT

<213>大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)

<400>2

Met Leu Pro Ser Ala Val Phe Ser Val Phe Ala Leu Val Gly Ser Ala

1               5                   10                  15

Leu Ala Gln Gln Pro Pro Lys Val Asn His Asp Ser Ile Asn Pro Val

            20                  25                  30

Arg Asp Thr Leu Gly Pro Asn Gly Asp Met Ile Arg Lys Phe Gln Pro

        35                  40                  45

Leu Leu His Ile Ala His Gly Cys Gln Pro Tyr Ser Ala Val Asn Thr

    50                  55                  60

Arg Gly Glu Val Asn Ala Gly Leu Gln Asp Ser Gly Thr Thr Ala Gly

65                  70                  75                  80

Gly Cys Lys Glu Thr Ser Lys Gly Gln Thr Tyr Ala Arg Ser Met Thr

                85                  90                  95

Leu Asn Gly Gln Phe Gly Ile Met Tyr Ala Trp Tyr Trp Pro Lys Asp

            100                 105                 110

Gln Pro Ala Asp Gly Asn Leu Ala Ser Gly His Arg His Asp Trp Glu

        115                 120                 125

Asn Val Val Ile Trp Phe Asn Ser Asn Asn Ala Asn Gln Ala Gly Ile

    130                 135                 140

Leu Arg Gly Ala Ala Ser Gly His Gly Asp Tyr Lys Lys Val Asn Asn

145                 150                 155                 160

Pro Gln Arg Asn Asn Asn Asn Leu His Val Glu Tyr Phe Thr Ser Leu

                165                 170                 175

Gly Lys Asn His Glu Leu Gln Phe Lys Thr Ser Pro Gly Arg Thr Tyr

            180                 185                 190

Trp Ile Trp Asp Trp Asp Arg Met Asp Thr Thr Val Gln Gly Ala Leu

        195                 200                 205

Asn Arg Ala Asp Phe Gly Ser Ala Asn Cys Pro Phe Asn Asn Asn Asn

    210                 215                 220

Phe Glu Arg Asn Met Arg Ala Ala Phe

225                 230

<210>3

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(24)

<223>引物

<400>3

gaattccagc agccccccaa ggtt                                           24

<210>4

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(27)

<223>引物

<400>4

gcggccgctt aaaacgcggc gcgcatg                                        27

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(20)

<223>引物

<400>5

tcccgctcaa ccgccaaaag                                                20

<210>6

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(20)

<223>引物

<400>6

acggaggcac aaccaagtcg                                                20

<210>7

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(20)

<223>引物

<400>7

cataagtgtt gcggaagtaa                                                20

<210>8

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(16)

<223>引物

<400>8

ggcaatggaa cgaacc                                                    16

Claims (10)

1.一种分离的多肽，其特征在于，该多肽选自下组：

(a)具有SEQ ID NO：2中第1-233位，第19-233位，或第24-233位氨基酸序列的多肽；

(b)将SEQ ID NO：2中第1-233位，第19-233位，或第24-233位所述的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有引起过敏性坏死斑功能的由(a)衍生的多肽。

2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，该多肽具有SEQ ID NO：2中第1-233位，第19-233位，或第24-233位的氨基酸序列。

3.一种分离的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列选自下组：

(a)编码如权利要求1所述多肽的多核苷酸；

(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。

4.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸编码具有SEQ IDNO：2中第1-233位，第19-233位，或第24-233位所示氨基酸序列的多肽。

5.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸的序列选自下组的一种：

(a)具有SEQ ID NO：1中19-717位的序列；

(b)具有SEQ ID NO：1中1-903位的序列；

(c)具有SEQ ID NO：1中73-717位的序列。

6.一种载体，其特征在于，它含有权利要求3所述的多核苷酸。

7.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求6所述的载体。

8.一种权利要求1所述的多肽的制备方法，其特征在于，该方法包含：

(a)在表达条件下，培养权利要求7所述的宿主细胞；

(b)从培养物中分离出权利要求1所述的多肽。

9.一种能与权利要求1所述的多肽特异性结合的抗体。

10.一种改善植物抗病性的方法，其特征在于，它包括步骤：

(1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有一多肽的DNA编码序列，所述的多肽具有SEQ ID NO：2中第1-233位，第19-233位，或第24-233位的氨基酸序列；

(2)将植物细胞或组织或器官与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使所述多肽的DNA编码序列转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；

(3)选择出转入所述多肽的DNA编码序列的植物细胞或组织或器官；

(4)将步骤(3)中的植物细胞或组织或器官再生成植株。

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