CN1793172A

CN1793172A - 无诱导表达基因工程菌株及构建方法和应用

Info

Publication number: CN1793172A
Application number: CN 200510120504
Authority: CN
Inventors: 孟小林; 徐进平; 丁玲; 鲁伟; 王健
Original assignee: Wuhan University WHU
Current assignee: Wuhan University WHU
Priority date: 2005-12-22
Filing date: 2005-12-22
Publication date: 2006-06-28
Anticipated expiration: 2025-12-22
Also published as: CN100389124C

Abstract

本发明公开了一种无诱表达基因工程菌株及构建方法和应用，无诱导表达基因工程菌株的宿主细胞为肠杆菌E.coliBL21，CCTCC M205136，PCR扩增hrp Z基因片段，克隆到pGEM－T载体中，经EcoR I/Xho I酶切、酶连接，将hrp Z基因插入大肠杆菌表达载体pET－32b(+)硫氧还蛋白下游，构建重组表达质粒pET－32b－hrp，再将其转化至E.coliBL21中，经筛选得到阳性克隆子。无诱导表达重组HrpZ蛋白，SDS－PAGE显示，高效表达了可溶性重组蛋白APDZ蛋白。用叶片穿刺法，表明重组蛋白APDZ具有诱导烟草过敏反应的生物功能。该重组蛋白对植物病害有良好的防治效果和促进植物的生长、提高了农作物产量。

Description

无诱导表达基因工程菌株及构建方法和应用

技术领域

本发明涉及植物病害的防治，可以抵抗细菌、真菌、病毒、线虫等对植物的危害。更具体地讲，本发明涉及无诱导表达Harpin基因工作菌株，同时还涉及该菌株的构建方法，该发明在防治植物病害中的应用。

背景技术

过敏反应是植物自身具有的一种保护反应，类似于高等动物所具有的广谱抗病菌免疫反应。植物病原真菌、细菌和病毒都能够引起过敏性反应(hypersensitive response，HR)。过敏性反应是一种快速的、与防卫反应相关的在侵染位点造成的植物细胞程序性死亡(programmedcell death，PCD)(Dangl et al.，1996；Klement et al.，1982)，从而使病原菌被限制在侵染部位，不能增殖。主要表现为接种区植物组织局部产生枯斑。病原菌所产生的一些多糖、脂多糖、糖蛋白、脂肪酸、蛋白质以及多肽等物质是诱导植物过敏性反应的主要因子，这些物质被称为激发子(elicitor)。高等植物过敏性反应(hypersensitiveresponse，HR)，是植物在受到病原细菌侵染、发生不亲和(incompatible)反应时所产生的一种特有现象。

植物病原细菌属Erwinia、Pseudomonas、Xanthomonas和Ralstonia中许多病原菌存在寄主专一性。它们侵染寄主植物后，能够引起各种各样不同的病症；而在侵染非寄主植物后，则能够激发过敏性反应的产生。最初，在用转座子随机诱变病原菌的研究中发现，某些突变体丧失了在寄主植物上的致病性，又丧失了在非寄主植物上的过敏性反应，这被称之为hrp-表型(Lindgren et al，1986；Niepold et al.，1985)。后来的研究发现，这种表型的产生是由于病原菌中hrp基因(Hypersensitivereaction and pathogenicity gene)发生突变所致。革兰氏阴性植物病原细菌属中的大部分病原菌都含有hrp基因，控制其在寄主上的致病性和在非寄主上引起过敏性反应。HR反应后，受侵染植物体内出现了一系列的生理、生化及细胞结构的变化，例如：强化结构屏障作用(Ride JP et al，1983)、合成裂解酶(Linthorst H J M et al，1990)或者产生植物抗毒素(Paxton J D et al，1994)等，具体表现在能够防止病菌二次或继发性侵染(Harald K et al，1996)。

1992年，Wei等首先从梨火疫病的病原细菌(Erwinia amylovora)中分离到一种约44kDa、能激发HR的蛋白类激发子harpin(hrpN基因编码，常用harpin Ea表示)，并将研究成果发表在《Science》上(Weiet al.，1992)。随后利用hrpN基因的内同源性，相继从E.chrysanthemi和E.carotovora中获得了HR激发子harpinEch和harpinEcc(David etal.，1995；Asita et al.，1997)。丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)中的harpin由hrpZ基因编码产生，它同样能够通过Hrp通道分泌(He etal.，1993；Yuan et al.，1996；Charkowski et al.，1997)。虽然harpinPss与harpinEa具有类似的性质与功能，但hrpZ与hrpN基因之间缺乏同源性。也就是说hrp基因的外同源性很低。利用hrpZ基因探针，在P.s.pv.tomato和P.s.pv.glycine中分离到HR激发子harpinPst和harpinPsg(Prestin et al.，1995)。harpinPst和harpinPsg与harpinPss分别具有76％和63％的序列同源性。PopA1是从R.solanacearum中发现的HR激发子(Arlat et al.，1994)，其性质与功能类似于harpin，能诱导烟草及牵牛花的过敏性反应，因此也是harpin蛋白家族的成员。

hrp基因存在于植物病原细菌中，决定病原菌对寄主植物的致病性和非寄主植物的过敏反应HR。HrpW是在E.amylovora和P.s.pv.syringae中发现的第二种类型的harpin蛋白(Amy et al.，1998；Gaudriault et al.，1998)。在序列上，它同时具有harpin和果胶裂解酶的特征，但在功能上只有诱导非寄主植物过敏性反应的活性而没有果胶裂解酶的活性。hrpW与hrpN、hrpZ基因之间缺乏明显的序列同源性，但hrpW与P.s.pvs.、R.solanacearum和Xanthomonas campestris的基因组DNA有同源杂交信号，这表明，hrpW基因可能广泛存在于革兰氏阴性植物病原细菌中。

hrp基因一般以簇的形式存在于细菌染色体上，长度在17-41kb之间，由多个转录单元组成。E.amylovora的hrpN基因与P.s.pv.syringae的hrpZ基因分别编码使烟草产生HR反应的蛋白harpinEa和harpinPss，它们的分子量分别为44kDa和34.7kDa，由385个氨基酸和341个氨基酸残基组成。虽然这两种蛋白具有类似的性质与功能，但hrpN与hrpZ基因之间缺乏同源性，也就是说harpin编码基因在属与属之间的同源性很低，但在同一个属内同源性很高。

harpin在植物病原细菌中起到一个激发非寄主HR和诱导抗病性的功能，但是对于其在病原菌与亲和寄主互作时所起的作用还不甚清楚。Harpin与其受体HrBPI结合后，会激活多种防卫反应信号传导，从而使植物产生防卫反应。其激活植物防卫反应的途径主要有三种：(1)一种未知途径激活植物抗细菌反应；(2)水杨酸途径激活植物的抗细菌/真菌/病毒反应；(3)乙烯和茉莉酸途径激活抗真菌反应。

Harpin蛋白并不直接作用于靶标作物，而是刺激作物产生自然的免疫机制，使得植物能抵抗一系列的细菌、真菌和病毒病害。因此，harpin能够直接应用于植物病害防治(直接喷洒使用或构建多功能生防微生物)，也能够应用于转基因植物为产生广谱的抗病特性。

Harpin蛋白还具有促进生长和发育的功能。研究表明过敏素蛋白可以增强植物的光合作用，利于营养物质的摄取，因此可以促进种子萌发和植物发育，提高作物的产量和质量，增大植株个体，利于植物的早熟和结实(傅华欣，1999；高正良，1999)。此外还有研究发现过敏素蛋白可提高蔬菜、水果抗腐烂、霉变能力，延长贮藏时间。可能与细胞壁修饰基因，生长时相调节基因有关。此外，Harpin蛋白对于农作物、蔬菜害虫如棉铃虫、甜菜夜蛾、菜青虫等也有一定的趋避和控制作用。

美国EDEN公司利用harpin蛋白开发一种新的生物农药MessengerTM，并于2000年4月在US-EPA获得登记。HarpinEa蛋白是通过将E.amylovora编码harpin蛋白的DNA片段转入E.coli K-12中表达进行商业化生产而获得的。用于生产harpin蛋白的E.coli是一弱毒株系，不能在人体消化道中生长，也不能在环境中存活。发酵以后，E.coli K-12细胞被杀死和溶解，harpin蛋白和其它细胞成分被提取用来制成Messenger^TM产品。该产品对农作物、果林、花卉等具有提高免疫力，增强抗病、抗虫性和调节生长发育、改善品质、增产增收两大功能。还能够促进根系、茎叶、果实生长。还可以增强植物的光合作用活性，提高光合速率和效率；加快植物生长发育进程，促进作物提前开花和成熟，减轻采后病害危害，延长农产品货架保鲜期，对改善作物品质，提高商品等级，增产增收有明显的效果。Messenger^TM也是一种无毒、无害、无残留、无抗性风险的生物农药。由于该产品用量低，且在土壤中容易降解，在实验作物中不出现残留，所以它对人的健康和周围环境无影响。此外，实验证明该产品对野生动物(如鸟、鱼、蜜蜂、水蚤和藻类植物等)无害。harpin蛋白对植物病原不具有直接的抑制或毒杀效果，不存在促进有害生物种群抗性发展的选择压。

国内，赵立平等用表达Harpin基因的大肠杆菌DH5α进行了诱导植物抗病性的研究，发现表达Harpin基因的重组菌除可明显诱发烟草、番茄叶片的过敏反应外，对玉米、水稻叶片也能诱发过敏反应。李汝刚等也将harpin应用于转基因植物的研究，获得了抗晚疫病的转基因马铃薯。

发明内容

本发明的目在于提供一种无诱导表达基因工程蛋白质APDZ。APDZ蛋白能刺激作物产生自然的免疫机制，使得植物能抵抗一系列的细菌、真菌和病毒病害。APDZ蛋白还具有促进生长和发育的功能，对于农作物、蔬菜害虫如棉铃虫、甜菜夜蛾、菜青虫等也有一定的趋避和控制作用。

本发明的另一个目的在于提供一种重组基因工程菌株EscherichiacoliBL21(DE3)(pET-32b-hrp)，该大肠杆菌包含编码基因工程蛋白APDZ的核苷酸序列，或者包含编码本发明所述的基因工程蛋白APDZ的DNA片段。利用该重组基因工程菌株E.coliBL21(DE3)(pET-32b-hrp)可以表达基因工程蛋白质APDZ。

本发明的再一个目的在于提供一种大肠杆菌宿主细胞的构建方法，方法简便，操作方便，该宿主细胞包含基因工程蛋白APDZ的核苷酸序列。表达量高，基因工程蛋白的表达量最高可以达到菌体蛋白总量的30-50％，融合表达，安全性高，利于产业化生产。

本发明的目的还涉及一种无诱导表达HarpinZ基因的方法，方法易行。可以不用诱导物，表达基因工程蛋白质APDZ。

本发明还涉及基因工程蛋白在防治植物病虫害中的应用。

本发明还涉及基因工程蛋白在提高植物质量和产量中的应用。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术措施：

本发明提供一种基因工程蛋白质APDZ，其氨基酸序列具有与SEQ IDNO.2所示氨基酸至少70％同源性的序列，其分子量为约55.8kDa。所述的基因工程蛋白质APDZ具有抗植物病虫害的生物活性。

本发明提供一种基因工程蛋白质APDZ，一种分离的蛋白质其具有与SEQ ID NO.2所示氨基酸序列至少70％同源性的序列。

本发明提供一种编码基因工程蛋白质APDZ的核苷酸序列，一种分离的蛋白质，其具有与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列至少50％同源性的序列。

本发明提供一种编码基因工程蛋白质APDZ的核苷酸序列，一种分离的蛋白质其具有与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列至少70％同源性的序列。

本发明是提供一种编码基因工程蛋白质APDZ的核苷酸序列，一种分离的蛋白质其具有与SEQ ID NO.1所示核苷酸至少80％同源性的序列。

本发明提供一种编码基因工程蛋白质APDZ的核苷酸序列，与HarpinZ蛋白质编码的核苷酸具有至少90％同源性的核苷酸序列。

本发明提供一种DNA片段的制备方法，该片段包含所述的编码基因工程蛋白APDZ的核苷酸序列。

在本发明的一个实施方案中，本发明所提供的一种基因工程蛋白质APDZ，一种分离的蛋白质，其具有与SEQ ID NO.2所示氨基酸至少70％同源性的序列，其分子量为约55.8kDa，该基因工程蛋白质APDZ具有抗植物病虫害的特性。

在本发明的一个实施方案中，提供了一种基因工程蛋白质APDZ，一种分离的蛋白质，其具有与SEQ ID NO.2所示氨基酸至少80％同源性的序列。

在本发明的一个实施方案中，提供了一种基因工程蛋白质APDZ，一种分离的蛋白质，其具有与SEQ ID NO.2所示氨基酸至少90％同源性的序列。

本发明所述的基因工程蛋白质APDZ的氨基酸序列包括与蛋白质Harpin Z具有至少96％同源性的氨基酸序列。

对于蛋白质Harpin的研究，已经有多种报道。在基因库(GENEBANK)中，已经存在了关于Harpin氨基酸序列的信息。

在本发明的一个实施方案中，本发明所述的基因工程蛋白质APDZ具有的氨基酸序列已经被测序，具体结果如下：

MSDKIIHLTDDSFDTDVLKADGAILVDFWAEWCGPCKMIAPILDEIADEYQGKLTVAKLNID

QNPGTAPKYGIRGIPTLLLFKNGEVAATKVGALSKGQLKEFLDANLAGSGSGHMHHHHHHSS

GLVPRGSGMKETAAAKFERQHMDSPDLGTDDDDKAMAISDPNSMRGSHHHHHHGMASMTGGQ

QMGRDLYDDDDKDPTLMQSLSLNSMSSLQTSASLFPVSLNSDVSANTSTSSKELKAVIDQLV

QALTQSGQLDETSPLGKMLAKAMAADGKSANSIDDITASLDKLIHEKLGNNFGASAGIGAGG

GGGGIGGAGSGSGVGGGLSSDAGAGQSDLMSQVLNGLGKAVLDDLLTPSGEGGTTFSSDDMP

TLEKVARFMDDNKAQFPTRDGGSWMNELKEDNGLYAQETAQFRSALDVIGQQLGQQQGDASG

VTSGGGLGSPVSDSSLGNPAIDANTGPAANGNASVDVGQLIGQLIDRGLQSVSSGGGLGTPV

DNSTQPTGGTPAANPTGNVSNQDLGQLLNGLLQRGLEATLQDAGNTGADLQSSAAQVAAQLI

NA > LLQGTNNQTNQAVALEHHHHHH.

本发明所述的基因工程蛋白质APDZ的氨基酸序列可以在一定范围内进行修饰、改变，所获得的修饰后的蛋白质或蛋白质的片段与基因工程蛋白质APDZ有相同的生物学功能，即它们富含甘氨酸、热稳定且对蛋白酶敏感，能使烟草、马铃薯、番茄、大豆、黄瓜及拟南芥菜产生过敏性反应。对蛋白质进行修饰和改变的方法为常规的方法，为本专业技术人员所熟悉。按照现代生命科学的理论，氨基酸序列同源性70％以上的蛋白质在生物学中常被诠释为是具有相同生物学功能的蛋白质。在此范围内对蛋白质氨基酸序列进行的修饰和突变均被认为并未改变蛋白质的生物学特性，这些改变和修饰包括：

(1)对个别氨基酸进行突变，特别是非功能决定位点的氨基酸。

(2)缺失或插入个别氨基酸，特别是非功能决定位点的氨基酸。这样的改变如果没有改变蛋白的空间构象，就不会影响蛋白质的生物学功能，也不会改变蛋白质的免疫原性。

(3)插入特殊的氨基酸残基。为了增加或改变蛋白质的可溶性，增加稳定性，在基因工程生产过程中，往往会在蛋白质的N、C端加入一些氨基酸残基，以避免形成包涵体，减少宿主细胞蛋白质内切酶的降解；或者在N、C端加入一些特殊的氨基酸功能位点以利于蛋白质的表达和纯化。

以上对蛋白质进行修饰和改变的方法为常规的方法，为本专业技术人员所熟悉。通过上述方法获得的与本发明所述的基因工程蛋白质有70％同源性的蛋白质或免疫性片段都具有与本发明所述基因工程蛋白APDZ相同的生物学功能，即它们能使烟草、马铃薯、番茄、大豆、黄瓜及拟南芥菜产生过敏性反应，能够用于实现本发明的一个或多个目的。

根据蛋白质的氨基酸组成，结合SDS-PAGE的分析结果，本发明所涉及的基因工程蛋白APDZ的分子量为约55.8kDa。如果蛋白质的氨基酸序列发生部分或局部的改变，蛋白质的分子量会发生变化。选用不同的宿主菌株和表达载体，由于翻译后修饰的原因，蛋白质的分子量也会发生变化。选用不同的检测方法，蛋白质的分子量也会有一些差异，但这些变化和差异在原则上不会超过蛋白质分子量的10％。

本申请人还对Harpin Z基因进行了PCR扩增，扩增得到的Harpin Z基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1

在一些丁香假单胞杆菌变种(Pseudomonas syringae pvl)、青枯假单胞杆菌(Pseudomonas solanacearum)、野油菜黄单胞杆菌(Xanthomonas campestris)及一些欧文氏杆菌属(Erwinia)的细菌中发现有3类hrp基因簇(Bogdanpve A J et al，1998)。这3类hrp基因簇间同源性很小，但同类hrp基因簇内同源性很强。根据基因的序列相似性及其操纵子的组织结构可将hrp分为两个组，第一个组包括丁香假单胞菌(Pseudomonas)和梨火疫病欧文氏菌(Erwinia)属的hrp基因，第二个组是野油菜单胞菌(Xanthomonas campestris)和Ralstoniasolanacearum中发现的hrp基因，两组hrp基因簇的主要差异是基因调控不同。

本申请人针对已经报道的Harpin进行了基因的同源性比较，Hrp基因序列分析及比较具体结果如图7、8、9所示。

图7、8、9、是三种不同来源的hrp基因的序列及推导的氨基酸序列比较分析结果，可以发现，Pseudomonas syringae的两个hrp基因同源性仅有56％，而不同属的基因同源性更低。其中，hrpZ分离自Pseudomonassyringae(假单胞菌)；hrpH分离自Pseudomonas syringae(假单胞菌)；Ea-harpin(hrpN)分离自Erwinia amylovora(梨火疫病菌)。

Harpin Z基因克隆至表达载体pET-32b(+)中，实际编码区核苷酸序列为SEQ ID NO.1，推导的氨基酸序列为SEQ ID NO.2

阴影部分表示载体的序列，其它为Harpin Z基因序列。

在本发明的一个实施方案中，提供了一种基因工程蛋白质APDZ，该蛋白为基因工程融合蛋白，其N和C端的氨基酸是载体编码的，N端氨基酸是：

MSDKIIHLTDDSFDTDVLKADGAILVDFWAEWCGPCKMIAPILDEIADEYQGKLTVAKLNID

QNPGTAPKYGIRGIPTLLLFKNGEVAATKVGALSKGQLKEFLDANLAGSGSGHMHHHHHHSS

GLVPRGSGMKETAAAKFERQHMDSPDLGTDDDDKAMAISDPNS

C端氨基酸是：

LEHHHHHH

本发明提供一种编码基因工程蛋白质APDZ的核苷酸序列，一种分离的蛋白质，其具有与SEQ ID NO.1所示核苷酸至少有50％同源性的序列。

基因工程蛋白质氨基酸序列的任何改变归根结底都是其核苷酸序列的改变。任何核苷酸序列的改变都有可能改变其编码的氨基酸，进而改变其编码蛋白质的结构和功能。但生物的氨基酸密码子存在兼并性，即不同的密码子可以编码相同的氨基酸，比如，GCA、GCC、GCG、GCT都编码Ala(丙氨酸)。在DNA的复制过程中，遗传物质可以因为内部的或者外部的条件或因素发生改变，这些改变如果立即造成氨基酸的变化，就会直接影响蛋白质特别是功能蛋白质的结构和功能。大部分核苷酸序列的变化是不利于生物体的突变，而密码子的兼并性就大大减少了核苷酸的突变对蛋白质功能的影响。此外，密码子的兼并性也是氨基酸的变异率远远低于核苷酸变异率的原因。因此，本发明所述的基因工程蛋白质APDZ的核苷酸序列可以进行突变，但其编码的蛋白质有相同的生物学功能。这些突变包括：

(1)同义突变：个别核苷酸的突变，但是其编码的氨基酸未发生改变，因此其编码的蛋白质的所有生物学特征与原来相同。

(2)错义突变；个别核苷酸的改变，其编码的氨基酸也发生改变，但这些氨基酸的改变往往是非功能决定位点的氨基酸，这些氨基酸的变化往往是中性的。结构相似的氨基酸之间的替换一般不影响蛋白质的功能。

(3)移码突变：个别核苷酸的增加或缺失，进而导致缺失或插入个别氨基酸，这样的改变如果没有改变蛋白的空间构象，就不会改变蛋白质的生物学功能。事实上，在基因工程蛋白的研究过程中，为了增加或改变蛋白质的可溶性，增加稳定性，往往会在蛋白质的N、C端加入一些氨基酸残基，或者在N、C端加入一些功能位点以利于蛋白质表达和纯化。

以上对核苷酸进行修饰和改变的方法为常规的方法，比如可以通过PCR的方法实现，这些方法为本专业技术人员所熟悉，不需进行创造性劳动即可获得。通过该方法获得的与本发明所述的核苷酸序列有50％同源性的核苷酸序列都具有与本发明所述核苷酸序列相同的生物学功能，即它们能使烟草、马铃薯、番茄、大豆、黄瓜及拟南芥菜产生过敏性反应，能够用于实现本发明的一个或多个目的。

在本发明的一个实施方案中，提供了一种编码基因工程蛋白质APDZ的核苷酸序列，其核苷酸序列与SEQ ID NO.1的核苷酸序列至少有70％的同源性。

在本发明的另一个实施方案中，提供了一种编码基因工程蛋白质APDZ的核苷酸序列，其核苷酸序列与SEQ ID NO.1的核苷酸序列优选地至少有80％的同源性。

本发明所述的编码基因工程蛋白质APDZ的核苷酸序列可以在一定范围内进行改变，所获得的核苷酸序列与编码基因工程蛋白质APDZ的核苷酸序列具有相同的生物学功能。

按照现代生物学的概念，尤其是生物信息学的理论，同源性在70％以上的核苷酸序列可以判定为具有显著的相似性，同源性在80％以上的核苷酸序列可以判定为具有相同的生物学功能。

以上对核苷酸进行修饰和改变的方法为常规的方法，比如可以通过PCR的方法实现，这些方法为本专业技术人员所熟悉，不需进行创造性劳动即可获得。获得的与本发明所述的核苷酸序列有70％同源性、优选有80％同源性的核苷酸序列都具有与本发明所述核苷酸序列有相同的生物学功能，即它们能使烟草、马铃薯、番茄、大豆、黄瓜及拟南芥菜产生过敏性反应，能够用于实现本发明的一个或多个目的。

在本发明的一个实施方案中，提供了一种编码基因工程蛋白质APDZ的核苷酸序列，包含Harpin Z基因，通过EcoR I和XhoI两个位点插入到表达载体pET-32(b)(Novagen公司产品)中。

在本发明的一个实施方案中，提供了一种编码基因工程蛋白质APDZ的核苷酸序列，该核苷酸序列的上游和下游包括载体的序列。

序列的上游包括载体的序列是：

ATGAGCGATAAAATTATTCACCTGACTGACGACAGTTTTGACACGGATGTACTCAAAGCGGA

CGGGGCGATCCTCGTCGATTTCTGGGCAGAGTGGTGCGGTCCGTGCAAAATGATCGCCCCGA

TTCTGGATGAAATCGCTGACGAATATCAGGGCAAACTGACCGTTGCAAAACTGAACATCGAT

CAAAACCCTGGCACTGCGCCGAAATATGGCATCCGTGGTATCCCGACTCTGCTGCTGTTCAA

AAACGGTGAAGTGGCGGCAACCAAAGTGGGTGCACTGTCTAAAGGTCAGTTGAAAGAGTTCC

TCGACGCTAACCTGGCCGGTTCTGGTTCTGGCCATATGCACCATCATCATCATCATTCTTCT

GGTCTGGTGCCACGCGGTTCTGGTATGAAAGAAACCGCTGCTGCTAAATTCGAACGCCAGCA

CATGGACAGCCCAGATCTGGGTACCGACGACGACGACAAGGCCATGGCGATATCGGATCCGA

ATTCG

序列的下游包括载体的序列是：

CTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA

在本发明的一个实施方案中，所用pET-32b(+)质粒(Novagen公司产品)带有TrxA.Tag，有108个氨基酸组成，其相对分子量为12kDa；另外，在pET-32b(+)质粒多克隆位点上游还带有His.Tag、S.Tag及肠激酶和凝血酶酶切位点，载体部分相对分子量为19kDa；hrpZ基因有1116bp编码372个氨基酸，相对分子质量为36.8kDa；融合蛋白分子质量大约55.8kDa。

在本发明的一个实施方案中，提供了一种DNA片段及其制备方法。该片段包含本发明所述的编码基因工程蛋白APDZ的核苷酸序列。

发明所涉及的DNA片断可以通过以下方式获得：

(1)人工合成，可直接用DNA合成仪人工合成本发明所述的DNA片段，或者分段合成本发明所述的DNA片段，这些合成产物具有与本发明所述的DNA片段相同的生物学功能，可以实现本发明所述的一个或多个目的。

(2)PCR扩增，以本发明所述的DNA片段为模板，或者以含有本发明所述的DNA片段的质粒、载体、宿主细胞为模板，通过PCR扩增得到DNA片段，这些PCR产物具有与本发明所述的DNA片段相同的生物学功能，可以实现本发明所述的一个或多个目的。

以上方法为分子生物学中常用的方法，为本领域技术人员所熟悉，不需通过创造性劳动即可获得，所获得的DNA片段被视为与本发明所涉及的核苷酸序列有相同的生物学功能，能够进一步通过基因工程的方法实现本发明的一个或多个发明目的。

在本发明的一个实施方案中，提供了一种宿主细胞，该宿主细胞包含编码本发明所述的基因工程蛋白APDZ的核苷酸序列，或者包含编码本发明所述的基因工程蛋白APDZ的DNA片段。宿主细胞的制备方法为分子生物学中常用的方法，为本领域技术人员所熟悉，不需通过创造性劳动即可获得，所获得的宿主细胞能够进一步通过基因工程的方法实现本发明的所有发明目的。

在本发明的一个实施方案中，提供了一种大肠杆菌重组基因工程菌株，该菌株分类命名为Eshcherichia.coliBL21(DE3)/(pET-32b-hrp)，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期：2005年11月30日，保藏编号：CCTCC M205136，该宿主细胞包含本发明所述的基因工程蛋白APDZ的核苷酸序列。

一种重组基因工程菌株，它包括下列步骤：

A.PCR扩增Hrp Z基因；

B.将纯化的PCR产物克隆于pGEM-T-Vector，重组质粒转化大肠杆菌JM109感受态细胞，筛选阳性重组子；

C.用Xho I和EcoR I双酶切pGEM-T-hrpZ质粒和表达载体pET-32(b)+，将Hrp Z基因克隆于pET-32(b)+，重组质粒转化大肠杆菌JM109感受态细胞，筛选阳性重组子。

利用重组基因工程菌株E.coliBL21，其无诱导表达、提取基因工程蛋白质APDZ步骤如下：

首先是将重组获得的携带Harpin蛋白的工程菌株M205136单菌落挑到内含100μg/ml的氨苄青霉素的LB培养基中，37℃，200rpm过夜培养；其次是以1∶20比例接种到含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中继续培养，200rpm诱导表达5hr，收获菌液；第三是4000rpm离心10min，收集菌体沉淀；第四是按常规方法即可获得Harpin蛋白。

在本发明的一个实施方案中，提供了一种大肠杆菌宿主细胞的构建方法，该宿主细胞包含本发明所述的基因工程蛋白APDZ的核苷酸序列。

(1)hrpZ基因片段的PCR扩增制备

以本室保存的含有hrpZ基因的质粒为模板，用上游引物G GAATTC GATG CAG AGC TCT AGT CTT AAC(下划线为引入的EcoR I酶切位点)和下游引物G CTCGAG TCA GGC CAC AGC CTG GTT AGT C(下划线为引入的Xho I限酶切位点)，利用PCR仪扩增1.1kb的hrpZ基因片段。回收PCR产物并将其克隆入T载体中，并转化大肠杆菌E.coliJM109，用于基因的增殖和保藏。

(2)用EcoR I和Xho I双酶切将hrpZ基因定向插入表达载体pET-32b(+)，获得重组质粒pET-32b-hrp。

(3)转化到大肠杆菌细胞中：构建好的重组表达载体转化大肠杆菌，转化方法包括但不仅限于电转化法，氯化钙转化法。在本发明的一个实施例中提供了一种氯化钙转化方法，使用的表达载体是pET-32b(+)，宿主细胞是E.coliBL21(DE3)。

以上分子生物学的操作方法为本领域技术人员所熟悉，可以参考JoeSambrook，David Russell等编写的Molecular Cloning：A LaboratryManual，Cold Spring Harbor Lab(CSHL)Press，2001。

在本发明的一个实施方案中，提供了一种基因工程蛋白质APDZ，或编码所述的基因工程蛋白质APDZ的核苷酸序列，或编码所述的基因工程蛋白质APDZ的DNA片段，或本发明所述的宿主细胞。

本发明选用pET-32b(+)表达载体制备基因工程蛋白APDZ，宿主细胞是E.coli BL21(DE3)，本发明具有以下优点和效果：

(1)表达量高，基因工程蛋白的表达量最高可以达到菌体蛋白总量的30-50％。本发明采用的pET-32b(+)载体是一种表达量很高的载体，外源蛋白约占菌体蛋白总量的29％以上，表达的基因工程HrpZ蛋白主要形成可溶性蛋白。曾同时将目的基因插入pET-15b(+)、pET-22b(+)表达载体中，均没有ET-32b(+)载体表达量大。

(2)融合表达：N端含有6个连续的组氨酸，利于蛋白质的分离和纯化。组氨酸在一般蛋白中为稀有氨基酸，引入连续的6个组氨酸具有很高的特异性。His₆尾与金属离子有很强的结合能力，而且对目的蛋白的结构和功能的影响很小，通常生物学活性可以得以保持，不经去除His₆尾可直接研究目的蛋白的生物学活性。

(3)安全性高：大肠杆菌表达系统是一种安全的表达系统，已经成功的用大肠杆菌表达系统表达出多种医用的蛋白质，安全无毒，对人畜及环境无毒无害。

(4)利于产业化生产：在所有基因工程表达系统中，大肠杆菌的生产成本是最低的，而且已经有成型的发酵设备和生产方法。本发明采用的表达系统，有利于实现产业化生产。氨苄青霉素是最为廉价的抗生素，可以进一步降低生产成本。

附图说明

本发明的上述和其他目的，特点和优势可显而易见地从下面对本发明优选实施例的详细描述和附图示出的内容得到，不同视图中相同的参考符号代表相同的部分。附图并不一定是按比例示出，其重点在于说明本发明的实施和效果。

图1为重组质粒pET-32b-hrp的构建示意图；

图2为PCR扩增hrpZ基因鉴定图；泳道1.DL2000marker；泳道2.PCRproduct.

图3为pGEM-T-hrpZ的PCR及酶切验证结果图；泳道1.DL2000marker；泳道2.PCR product；泳道3.pGEM-T-hrpZ/EcoR I+Xho I；泳道4.pGEM-T-hrpZ/Xho I；泳道5.λDNA/Hind III+EcoR I Marker.

图4为重组表达载体pET-32b-hrp酶切验证结果图；泳道1.DL2000marker；泳道2.PCR product；泳道3.pET-32b-hrp/EcoR I+XhoI；泳道4.pET-32b-hrp/Xho I；泳道5.λDNA/Hind III+EcoR I Marker.

图5为基因工程菌株表达蛋白的SDS-PAGE电泳结果图；泳道1.Protein molecular marker；泳道2.E.coli BL21(pET-32)；泳道3.Induced E.coli BL21(pET-32)；泳道4.E.coli BL21(DE3)(pET-32b-hrp)；泳道5.Supernatant of E.coliBL21(DE3)(pET-32b-hrp)；泳道6.Pelletof E.coli BL21(DE3)(pET-32b-hrp).

图6为蛋白质APDZ在烟草叶片上诱导产生的过敏反应；1.PBSBuffer；2/4.supernatant of IPTG-induced E.coliBL21(pET-32b)；3/5.APDZ sample.

图7为hrpZ与hrpH、Ea-harpin基因的同源性比较；hrpZ与hrpH、Ea-harpin基因的同源性分别为56％、13％

图8为hrpZ与hrpH基因的同源性比较；hrpZ与hrpH基因的同源性为56％

图9hrpZ与hrpH产生的蛋白质的同源性比较；hrpZ与hrpH产生的蛋白质的同源性为78％。

具体实施方式

实施例1PCR扩增Harpin Z基因

扩增引物合成：引物根据Harpin Z基因的ORF及载体设计，用oligo6.0软件检测。上游引物：G GAATTC G ATG CAG AGC TCT AGT CTT AAC(下划线为EcoR I酶切位点)：下游引物：G CTCGAG TCA GGC CAC AGC CTGGTT AGT C(下划线为Xho I限酶切位点)。以上引物均由上海生工合成。以本室保存的含有hrpZ基因的质粒为模板，用上游引物和下游引物，利用PCR仪扩增1.1kb的hrp Z基因片段。

PCR体系组分：5μl 10×PCR buffer，4μl 2.5mM dNTPs，3μl 25mMMgCl₂，1μl上游引物(20μM)，1μl下游引物(20μM)，2μl hrpZ plasmidDNA plate，0.5μl Taq DNA聚合酶，补无菌ddH₂O至50μl。

用移液枪抽吸混匀，最后加无菌石蜡油50μl，向无菌PCR管中加上述组分的操作在冰上进行。1000rpm离心10sec后，将PCR管置于PCR仪上。

PCR反应条件：95℃，5min；95℃，1min；58℃，1min；72℃，1min30s，30次；72℃，10min。

取5uL PCR产物在1.0％的琼脂糖凝胶上电泳，EB染色后紫外灯下观察扩增结果。PCR扩增hrpZ基因，PCR产物在1.0％的琼脂糖凝胶上电泳，EB染色后紫外灯下观察，有与目的基因大小相符的目的条带，大小为1.1kb左右。

实施例2PCR产物的回收与纯化

(1)将剩余的PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶上电泳(1×TAE)，用紫外灯观察电泳情况，当要回收的DNA带与其他带完全分离时，停止电泳，在紫外灯下用刀片切下欲回收带，用PCR产物纯化试剂盒纯化。(2)在Eppendorf管中将胶捣碎，加入等体积的溶胶液Binding Buffer，65℃水浴7min，其间每2min轻摇Eppendorf管一次直至胶完全融解。(3)将融解的样品加入层析柱中，12000rpm离心1min，弃去液体。(4)加300μl Binding Buffer，离心弃去液体。(5)加750μl Washing Buffer，离心弃去液体。(6)重复步骤5)。(7)空柱子12000rpm离心1min以甩干液体。(8)将柱子放于1.5ml Eppendorf管，加入30μl Elution buffer，37℃保温2min，12000rpm离心1min，将得到的PCR产物取2μl电泳检测定量，其余的贮于-20℃备用。PCR扩增hrpZ基因鉴定结果见图2。

实施例3将PCR产物克隆于pGEM-T-Vector

将以上纯化的PCR产物克隆于pGEM-T-Vector。其连接体系为：5.0μl 2×ligation buffer；0.5μl pGEM-T-Vector；4.0μl PCRproducts；0.5μl T4 DNA ligase，补无菌ddH₂O至10μl。在冰上混合上述液体，将10μl混合液放在250μl的无菌离心管中，用移液枪轻轻抽吸几下混匀，5000rpm瞬时离心，将混合液集中在管底，然后4℃连接过夜。

实施例4大肠杆菌的转化

采用冷氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞：(1)以无菌牙签挑取平板上的大肠杆菌JM109单菌落，接种到5mL LB培养基中，37℃，220rpm活化过夜。(2)取10～20uL上述活化大肠杆菌，接种到5mL新鲜的LB培养基中，37℃，220rpm培养2～3h，至OD600值为0.4～0.6。(3)取1.5mL步骤2中的菌液加入无菌的Eppendorf离心管中，4,000rpm离心10min，抽干上清。(4)加入800uL冰预冷的0.1M氯化钙，轻轻振荡重悬菌体沉淀，冰浴30min。4,000rpm离心10min，抽干上清。(5)加入100uL冰预冷的0.1M氯化钙重悬沉淀，得到制备好的感受态细胞。4℃保存，7～10天内使用。

质粒转化大肠杆菌JM109感受态细胞：(1)取10uL连接反应液，加入到100uL上述制备的感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min。(2)42℃水浴中热激90s，迅速移至冰中冰浴2-3min。(3)加入390uL新鲜LB液体培养基，37℃，150rpm轻摇，50min。(4)4,000rpm离心5min，吸弃400uL上清，将剩余的菌液用移液枪轻轻混匀。(5)取100uL细菌悬液，用无菌三角玻璃涂棒涂布于含氨苄青霉素的LB平板上，正向放置1-2小时，直至液体被充分吸收，倒置平板，于37℃培养箱中培养过夜。(6)12-16小时后，观察结果。

实施例5阳性重组子pGEM-T-hrpZ的检测

(1)菌落PCR鉴定：

从LBA平板上挑取白色单菌落，接种于3ml LB培养液，37℃培养8h，取2μl菌液作为模板进行菌落PCR鉴定。

(2)pGEM-T-hrpZ质粒的双酶切鉴定：

将初步鉴定后的菌液小量提取质粒，再进行酶切鉴定。

反应体系：2μl 10×H buffer；pGEM-T-hrpZ plasmid≤1μg；1μlXho I酶；1μl EcoR I酶；补无菌水ddH₂O至2μl。

反应过程：将反应体系组分在冰上混合并混匀，5000rpm瞬时离心10s，置于37℃水浴锅中保温反应2-4h，加反应量0.1倍体积的10×loading Buffer终止反应，取8μl酶切产物，用0.7％的琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果。根据双酶切后是否有大小正确的带来判断该质粒是否为阳性重组子pGEM-T-hrpZ。

hrpZ片段引物引入了EcoR I和Xho I酶切位点，hrpZ片段的大小约为1.1kb，载体pGEM-T(Promage公司产品)的大小为3.0kb，所以构建的重组质粒pGEM-T-hrpZ，应得3.0kb片段和1.1kb片段，单酶切时，应有约4.1kb的片段(3.0kb+1.1kb)。

pGEM-T-hrpZ的PCR及酶切验证结果见图3。

(3)hrpZ序列测定：

将经过PCR鉴定及双酶切鉴定的pGEM-T-hrpZ重组质粒送往上海生物工程公司测序列。序列测定结果正确。

实施例6重组基因工程菌株

E.coliBL21(DE3)(pET-32b-hrp)的构建

(1)用Xho I和EcoR I双酶切pGEM-T-hrpZ质粒和表达载体pET32(b)+

双酶切pGEM-T-hrpZ质粒体系：8μl 10×H buffer；40μlpGEM-T-hrpZ plasmid；3μl Xho I酶；3μl EcoR I酶；补无菌ddH₂O至80μl。

双酶切pET32(b)+体系：8μl 10×H buffer；40μl pET32(b)+plasmid；3μl Xho I酶；3μl EcoR I；补无菌ddH₂O至80μl。

37℃水浴酶切2-4小时后，用0.7％的琼脂糖凝胶电泳紫外灯下切下目的条带，用胶回收试剂盒进行回收纯化。最后用30μl无菌水洗脱。取2μl样品1％琼脂糖电泳检测，其余贮于-20℃备用。

(2)连接反应

反应体系：1μl 10×连接反应缓冲液；6μl hrpZ片断；2.5μlpET32(b)+；0.5μl T4连接酶；总体积为10μl。

在冰上混合上述液体，将10μl混合液放在250μl的无菌离心管中，用移液枪轻轻抽吸几下混匀，5000rpm瞬时离心，将混合液集中在管底，然后16℃连接过夜。连接产物转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞(感受态细胞制备同实施例4)，涂布LBA固体培养基平板。

(3)含重组pET-hrpZ质粒的阳性菌落的筛选与鉴定

从LBA平板上挑取多个白色单菌落，接种于3ml LBA培养液，37℃培养8h，取2μl菌液作为模板进行菌落PCR鉴定，将初步鉴定后的菌液小量提取质粒，再进行酶切鉴定。

用EcoR I和XhoI双酶切将hrpZ基因定向插入表达载体pET32b(+)，得重组质粒pET-hrpZ。pET-hrpZ经PCR应得1.1kb的片段，EcoR I和Xho I双酶切产生5.9kb和1.1kb的2个片段；经Xho I单切产生一个7.0kb的片段。重组表达载体pET-32b-hrp酶切验证结果见图4，表明重组质粒构建正确。

实施例7外源蛋白APDZ的诱导表达

(1)从平板上挑取携带有质粒pET-32b-hrp的重组基因工程菌株E.coliBL21(DE3)(pET-32b-hrp)单菌落，接种于20mL含100mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基中，在37℃，250rpm振荡培养8-12h，4℃静置过夜。(2)次日按1-2％接种到新鲜LB液体培养基中，在37℃下继续振荡培养约2-3小时左右。(3)至菌液OD₆₀₀值为0.6-0.8时，加入诱导物IPTG至终浓度为0.6mM，在37℃下诱导表达3-5h。(4)菌液在4℃下12,000离心1min，收集菌体。

实施例8外源蛋白APDZ的无诱导表达

(1)配制丰富LB培养基：蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，氯化钠5g/L。(2)从平板上挑取携带有质粒pET-32b-hrp的重组基因工程菌株E.coliBL21(DE3)(pET-32b-hrp)单菌落，接种于250ml的三角瓶中的丰富LB培养基内，Amp终浓度为200μg/ml，37℃220rpm/min，振荡培养8小时后，置冰箱过夜。(3)按4％的接种量接种于丰富LB和2YT培养基中，Amp终浓度为200μg/ml，37℃200rpm/min，振荡培养2小时后，OD值为0.6-0.8之间，继续振荡培养4小时。(4)菌液在4℃下12,000离心1min，收集菌体。

实施例9基因工程蛋白APDZ的提取

(1)向收集的菌体加入适量PBS(5mM/L，pH6.5)，-20℃反复冻融几次后，再进行超声波破碎菌处理(4℃，处理3次，每次10秒，间隔30秒)。(2)待菌液变清亮，绝大部分菌体破裂后，4,000rpm离心菌液15-20分钟。(3)分别收集得到菌体残渣和上清液。上清在4℃下12,000rpm继续离心15分钟。(4)收集两次离心所得上清和沉淀。上清即为基因工程蛋白APDZ的提取液。

实施例10基因工程蛋白APDZ的纯化

(1)Ni2+柱层析样品处理：取发酵罐发酵菌液经离心得到的湿菌体30g，用60ml 1×Binding Buffer(0.5M NaCl+5mM咪唑+20mM Tris·HClpH7.9)重悬，超声波破碎3×30分钟(有效破碎时间为30分钟)，破碎后的蛋白悬液在15000RPM、30分钟条件下离心，取上清液，再用0.45μm的滤膜过滤，用1×Binding Buffer定容至100ml Ni2+柱层析样品。(2)Ni2+柱的预处理：用10床1×Binding Buffer，20床无菌水清洗柱床；用10床1×Charge Buffer(5mM NiSO4)，结合Ni2+；再用10床1×Binding Buffer平衡柱床后，备用(1床即是柱内介质的体积)。(3)柱层析：浓缩过的样品经蠕动泵以循环方式通过Ni2+柱，使带有6×His的蛋白样品流动相充分与Ni2+柱中的Ni2+相结合，过夜后从Ni2+柱出口收集未与Ni2+结合的样品(穿漏液)。(4)清洗柱：分别采用50床1×Binding Buffer；75床60mM咪唑；75床100mM咪唑；30床150mM咪唑梯度洗涤留在柱内的少量样品和与Ni2+柱结合的非目的蛋白。(5)洗脱Ni2+柱用1×Elute Buffer(1M咪唑+0.5M NaCl+20mM Tris·HCl pH7.9)洗脱与Ni2+柱结合的目的蛋白，分部收集，每床体积为5管。通过SDS-PAGE检验目的蛋白在洗脱液中的分布。(6)Ni2+柱用1×Elute Buffer继续洗脱，洗样柱中全部蛋白；再用1×Strip Buffer(100mM EDTA+0.5MNaCl+20mM Tris·HCl pH7.9)洗去柱子上的Ni2+离子。

实施例11 APDZ纯化样品中蛋白质含量的确定

将11ml Ni2+柱洗脱、收集的样品装入处理好的透析袋中，并加入PBS至终体积60ml。PEG浓缩至干瘪状态，再加入PBS后PEG浓缩。重复PEG浓缩，直至加入PBS的总体积达300ml。将浓缩好的透析袋用ddH₂O冲洗干净后，放入盛有1000ml PBS烧杯中反透、过夜。往反透好的透析袋中加入50ml PBS，再用PEG浓缩至干瘪状态。加入1.6ml PBS将透析袋中的蛋白冲洗出来，以上操作均在4℃进行。

实施例12表达产物APDZ的SDS-PAGE鉴定

收集上述离心所得上清和沉淀，分别取样加入5×SDS-PAGE加样缓冲液，经沸水浴10分钟后，离心用10％SDS-PAGE进行电泳检测。

SDS-PAGE电泳按照分子克隆上所讲述的标准方法进行。浓缩胶的浓度为4.5％，分离胶的浓度为10％，电泳时电压为8V/cm。当溴酚蓝指示线到达分离胶底边时，关掉电源。用0.1％考马斯亮蓝染液染色4-6h后，再用脱色液(甲醇∶乙酸∶ddH2O＝4.5∶1∶4.5)将背景色脱尽为止，中间更换脱色液。

10％SDS-PAGE分析表明，该工程菌菌体经破碎后分为上清和沉淀，上清在相对分子质量55.8kDa处有明显的表达，含量约占总蛋白的79％，而沉淀中很少，可见表达的hrpZ蛋白主要以可溶性形式存在。基因工程菌株表达蛋白的SDS-PAGE电泳结果见图5。

实施例13表达产物APDZ的生物活性测定

采用叶片穿刺法测定hrpZ蛋白诱导烟草的过敏反应。不锈钢毫针用酒精棉球擦拭，并在酒精灯上灼烧，待冷却后在烟叶叶面穿刺小孔，将处理好的样品20μl，分别点加在上述小孔上，控制水渍斑直径为2cm，标明各孔处理。采用重组基因工程菌株E.coliBL21(DE3)(pET-32b-hrp)无诱导表达，所制备的基因工程蛋白APDZ的提取液样品。并以E.coliBL21(pET-32b)诱导表达上清和PBS(5mmol/L，pH6.5)做对照。将烟草置20℃-25℃温室培养，分别于12h、24h、36h和48h后观察叶片反应及反应程度。

12h后，APDZ蛋白样品穿刺点样的孔周围出现萎缩，24h后出现塌陷，36h后出现枯斑，而对照E.coli BL21(pET-32b)诱导表达上清及PBS无此现象。蛋白质APDZ在烟草叶片上诱导产生的过敏反应结果见图6，表明重组表达的基因工程蛋白质APDZ能引起烟草的过敏反应。

实施例14APDZ的田间应用试验

以APDZ蛋白作为活性成分制备的抗菌抑菌剂中，基因工程蛋白质APDZ有效含量为3％。将该抗菌抑菌剂粉剂或乳剂均匀的喷洒于植物表面即可达到对细菌、真菌、病毒性植物病害广谱的预防和控制作用。

在一组田间实验中，以APDZ蛋白作为活性成分的抗菌抑菌剂对真菌引起的茄子棉疫病防治效果达到75％，而常用的化学农药只有43％；对黄瓜细菌性角斑病防治效果达到93％，远远超过化学农药的40％；对黄瓜花叶病毒引起的病毒性病害，本发明的抗菌抑菌剂对黄瓜花叶病防治效果达到96％，而常用的化学农药只能达到78.8％的防治效果。

序列表

<110>武汉大学

<120>无诱导表达基因工程菌株及构建方法和应用

<130>无诱导表达基因工程菌株及构建方法和应用

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1749

<212>DNA

<213>Pseudachorutes sp.

<221>CDS

<222>(1)..(1749)

<221>Trx.Tag

<222>(1)..(327)

<221>His.tag

<222>(514)..(531)

<221>His.tag

<222>(1729)..(1746)

<400>1

atg agc gat aaa att att cac ctg act gac gac agt ttt gac acg gat 48

Met Ser Asp Lys Ile Ile His Leu Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr Asp

1 5 10 15

gta ctc

aaa gcg gac ggg gcg atc ctc gtc gat ttc tgg gca gag tgg 96

Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile Leu Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp

20 25 30

tgc ggt ccg tgc aaa atg atc gcc ccg att ctg gat gaa atc gct gac 144

Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala Pro Ile Leu Asp Glu Ile Ala Asp

35 40 45

gaa tat cag ggc aaa ctg acc gtt gca aaa ctg aac atc gat caa aac 192

Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr Val Ala Lys Leu Asn Ile Asp Gln Asn

50 55 60

cct ggc act gcg ccg aaa tat ggc atc cgt ggt atc ccg act ctg ctg 240

Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly Ile Arg Gly Ile Pro Thr Leu Leu

65 70 75 80

ctg ttc aaa aac ggt gaa gtg gcg gca acc aaa gtg ggt gca ctg tct 288

Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu Ser

85 90 95

aaa ggt cag ttg aaa gag ttc ctc gac gct aac ctg gcc ggt tct ggt 336

Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe Leu Asp Ala Asn Leu Ala Gly Ser Gly

100 105 110

tct ggc cat atg cac cat cat cat cat cat tct tct ggt ctg gtg cca 384

Ser Gly His Met His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro

115 120 125

cgc ggt tct ggt atg aaa gaa acc gct gct gct aaa ttc gaa cgc cag 432

Arg Gly Ser Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln

130 135 140

cac atg gac agc cca gat ctg ggt acc gac gac gac gac aag gcc atg 480

His Met Asp Ser Pro Asp Leu Gly Thr Asp Asp Asp Asp Lys Ala Met

145 150 155 160

gcg ata tcg gat ccg aat tcg atg cgg ggt tct cat cat cat cat cat 528

Ala Ile Ser Asp Pro Asn Ser Met Arg Gly Ser His His His His His

165 170 175

cat ggt atg gct agc atg act ggt gga cag caa atg ggt cgg gat ctg 576

His Gly Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Asp Leu

180 185 190

tac gac gat gac gat aag gat cca acc ctt atg cag agt ctc agt ctt 624

Tyr Asp Asp Asp Asp Lys Asp Pro Thr Leu Met Gln Ser Leu Ser Leu

195 200 205

aac agc atg agt tcg ttg caa acc tct gca tca ttg ttc ccc gtg tcg 672

Asn Ser Met Ser Ser Leu Gln Thr Ser Ala Ser Leu Phe Pro Val Ser

210 215 220

ctc aac agc gat gtg agc gcc aac acc agc act tcc agc aaa gag ctc 720

Leu Asn Ser Asp Val Ser Ala Asn Thr Ser Thr Ser Ser Lys Glu Leu

225 230 235 240

aag gct gtg atc gat cag ctg gtt cag gcg ctg acc caa agt ggg cag 768

Lys Ala Val Ile Asp Gln Leu Val Gln Ala Leu Thr Gln Ser Gly Gln

245 250 255

ctc gat gaa acc tca ccg ctc ggc aaa atg ctc gcc aag gcc atg gct 816

Leu Asp Glu Thr Ser Pro Leu Gly Lys Met Leu Ala Lys Ala Met Ala

260 265 270

gcg gat ggc aag tcg gct aac agc atc gat gac atc act gca tcg ctc 864

Ala Asp Gly Lys Ser Ala Asn Ser Ile Asp Asp Ile Thr Ala Ser Leu

275 280 285

gac aag ctg atc cac gaa aag ctc ggc aac aat ttc ggt gcc tct gcc 912

Asp Lys Leu Ile His Glu Lys Leu Gly Asn Asn Phe Gly Ala Ser Ala

290 295 300

ggc atc ggc gcg ggt ggc ggt ggc ggt ggc att ggc ggg gcg ggt tct 960

Gly Ile Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ile Gly Gly Ala Gly Ser

305 310 315 320

ggt tcg ggt gtc ggt ggc ggt ctg agc agc gac gcg ggt gcc ggg caa 1008

Gly Ser Gly Val Gly Gly Gly Leu Ser Ser Asp Ala Gly Ala Gly Gln

325 330 335

tcc gat ctg atg agc cag gtc ctg aac ggc ctc ggc aaa gcc gtg ctg 1056

Ser Asp Leu Met Ser Gln Val Leu Asn Gly Leu Gly Lys Ala Val Leu

340 345 350

gac gat ctg ctg aca ccg agt ggt gaa ggc gga aca acc ttt tcc agt 1104

Asp Asp Leu Leu Thr Pro Ser Gly Glu Gly Gly Thr Thr Phe Ser Ser

355 360 365

gat gac atg ccg acc ctg gaa aaa gtc gcc cgg ttc atg gac gac aac 1152

Asp Asp Met Pro Thr Leu Glu Lys Val Ala Arg Phe Met Asp Asp Asn

370 375 380

aag gcc cag ttc cct act cgg gac ggc ggc tcg tgg atg aac gag ctg 1200

Lys Ala Gln Phe Pro Thr Arg Asp Gly Gly Ser Trp Met Asn Glu Leu

385 390 395 400

aag gaa gac aat ggc ctg tat gca cag gaa acc gct cag ttt cgt tcg 1248

Lys Glu Asp Asn Gly Leu Tyr Ala Gln Glu Thr Ala Gln Phe Arg Ser

405 410 415

gct ctc gac gtc att ggt caa cag ctc ggc cag caa caa ggt gat gcc 1296

Ala Leu Asp Val Ile Gly Gln Gln Leu Gly Gln Gln Gln Gly Asp Ala

420 425 430

agt ggc gtt acc agt ggc ggc ggt ctg ggt tcg ccc gtg agt gac agc 1344

Ser Gly Val Thr Ser Gly Gly Gly Leu Gly Ser Pro Val Ser Asp Ser

435 440 445

tcc ctg ggt aat cct gca atc gat gcc aac aca ggt ccc gcg gcc aat 1392

Ser Leu Gly Asn Pro Ala Ile Asp Ala Asn Thr Gly Pro Ala Ala Asn

450 455 460

ggc aat gcc agc gtc gac gta ggt caa ctg atc ggt caa ctc atc gac 1440

Gly Asn Ala Ser Val Asp Val Gly Gln Leu Ile Gly Gln Leu Ile Asp

465 470 475 480

cgt ggt ttg cag tcg gtt tcg tcg ggt ggc ggt ctg ggt aca ccg gtc 1488

Arg Gly Leu Gln Ser Val Ser Ser Gly Gly Gly Leu Gly Thr Pro Val

485 490 495

gac aat tcc acg cag ccg aca ggt ggc acg cca gcg gct aac ccg acg 1536

Asp Asn Ser Thr Gln Pro Thr Gly Gly Thr Pro Ala Ala Asn Pro Thr

500 505 510

ggc aac gtg tcc aat cag gac ctg ggt caa ctg ctg aac ggc ttg ctg 1584

Gly Asn Val Ser Asn Gln Asp Leu Gly Gln Leu Leu Asn Gly Leu Leu

515 520 525

caa cgc ggg ctg gaa gcg acg ctt cag gat gct ggc aac acc ggc gcc 1632

Gln Arg Gly Leu Glu Ala Thr Leu Gln Asp Ala Gly Asn Thr Gly Ala

530 535 540

gac ctg caa tcg agc gct gcg caa gtg gca gct cag ctg atc aat gcg 1680

Asp Leu Gln Ser Ser Ala Ala Gln Val Ala Ala Gln Leu Ile Asn Ala

545 550 555 560

ctg ttg caa ggc acc aat aac cag act aac cag gct gtg gcc ctc gag 1728

Leu Leu Gln Gly Thr Asn Asn Gln Thr Asn Gln Ala Val Ala Leu Glu

565 570 575

cac cac cac cac cac cac tga 1749

His His His His His His

580

<210>2

<211>582

<212>PRT

<213>Pseudachorutes sp.

<400>2

Met Ser Asp Lys Ile Ile His Leu Thr Asp Asp Ser Phe As

p Thr Asp

1 5 10 15

Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile Leu Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp

20 25 30

Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala Pro Ile Leu Asp Glu Ile Ala Asp

35 40 45

Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr Val Ala Lys Leu Asn Ile Asp Gln Asn

50 55 60

Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly Ile Arg Gly Ile Pro Thr Leu Leu

65 70 75 80

Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu Ser

85 90 95

Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe Leu Asp Ala Asn Leu Ala Gly Ser Gly

100 105 110

Ser Gly His Met His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro

115 120 125

Arg Gly Ser Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln

130 135 140

Hi s Met Asp Ser Pro Asp Leu Gly Thr Asp Asp Asp Asp Lys Ala Met

145 150 155 160

Ala Ile Ser Asp Pro Asn Ser Met Arg Gly Ser His His His His His

165 170 175

His Gly Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Asp Leu

180 185 190

Tyr Asp Asp Asp Asp Lys Asp Pro Thr Leu Met Gln Ser Leu Ser Leu

195 200 205

Asn Ser Met Ser Ser Leu Gln Thr Ser Ala Ser Leu Phe Pro Val Ser

210 215 220

Leu Asn Ser Asp Val Ser Ala Asn Thr Ser Thr Ser Ser Lys Glu Leu

225 230 235 240

Lys Ala Val Ile Asp Gln Leu Val Gln Ala Leu Thr Gln Ser Gly Gln

245 250 255

Leu Asp Glu Thr Ser Pro Leu Gly Lys Met Leu Ala Lys Ala Met Ala

260 265 270

Ala Asp Gly Lys Ser Ala Asn Ser Ile Asp Asp Ile Thr Ala Ser Leu

275 280 285

Asp Lys Leu Ile His Glu Lys Leu Gly Asn Asn Phe Gly Ala Ser Ala

290 295 300

Gly Ile Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ile Gly Gly Ala Gly Ser

305 310 315 320

Gly Ser Gly Val Gly Gly Gly Leu Ser Ser Asp Ala Gly Ala Gly Gln

325 330 335

Ser Asp Leu Met Ser Gln Val Leu Asn Gly Leu Gly Lys Ala Val Leu

340 345 350

Asp Asp Leu Leu Thr Pro Ser Gly Glu Gly Gly Thr Thr Phe Ser Ser

355 360 365

Asp Asp Met Pro Thr Leu Glu Lys Val Ala Arg Phe Met Asp Asp Asn

370 375 380

Lys Ala Gln Phe Pro Thr Arg Asp Gly Gly Ser Trp Met Asn Glu Leu

385 390 395 400

Lys Glu Asp Asn Gly Leu Tyr Ala Gln Glu Thr Ala Gln Phe Arg Ser

405 410 415

Ala Leu Asp Val Ile Gly Gln Gln Leu Gly Gln Gln Gln Gly Asp Ala

420 425 430

Ser Gly Val Thr Ser Gly Gly Gly Leu Gly Ser Pro Val Ser Asp Ser

435 440 445

Ser Leu Gly Asn Pro Ala Ile Asp Ala Asn Thr Gly Pro Ala Ala Asn

450 455 460

Gly Asn Ala Ser Val Asp Val Gly Gln Leu Ile Gly Gln Leu Ile Asp

465 470 475 480

Arg Gly Leu Gln Ser Val Ser Ser Gly Gly Gly Leu Gly Thr Pro Val

485 490 495

Asp Asn Ser Thr Gln Pro Thr Gly Gly Thr Pro Ala Ala Asn Pro Thr

500 505 510

Gly Asn Val Ser Asn Gln Asp Leu Gly Gln Leu Leu Asn Gly Leu Leu

515 520 525

Gln Arg Gly Leu Glu Ala Thr Leu Gln Asp Ala Gly Asn Thr Gly Ala

530 535 540

Asp Leu Gln Ser Ser Ala Ala Gln Val Ala Ala Gln Leu Ile Asn Ala

545 550 555 560

Leu Leu Gln Gly Thr Asn Asn Gln Thr Asn Gln Ala Val Ala Leu Glu

565 570 575

His His His His His His

580

Claims

1、一种分离的蛋白质，其具有与SEQ ID NO.2所示氨基酸序列至少70％同源性的序列。

2、一种分离的蛋白质，其具有与SEQ ID NO.2所示氨基酸序列至少80％同源性的序列。

3、根据权利要求1或2所述的蛋白质，其特征在于：蛋白质APDZ的分子量为55.8kDa道尔顿。

4、一种分离的蛋白质，其具有与SEQ ID NO.2所示氨基酸序列至少70％同源性的序列。

5、一种分离的蛋白质，其具有与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列至少50％同源性的序列。

6、一种分离的蛋白质，其具有与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列至少70％同源性的序列。

7、一种分离的蛋白质，其具有与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列至少80％同源性的序列。

8、一种重组基因工程菌株Eshcherichia.coliBL21(DE3)/(pET-32b-hrp)，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为M205136，宿主细胞为大肠杆菌。

9、一种用于实现权利要求8所述的重组基因工程菌株的方法，它包括下列步骤：

A.PCR扩增Hrp Z基因；

10、一种无诱导表达基因工程蛋白质APDZ的方法，其特征在于：利用重组基因工程菌株E.coliBL21，其无诱导表达、提取基因工程蛋白质APDZ步骤如下：

首先是将重组获得的携带Harpin蛋白的工程菌株M205136单菌落挑到内含100g/ml的氨苄青霉素的LB培养基中，37℃，200rpm过夜培养；其次是以1∶20比例接种到含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中继续培养，200rpm诱导表达5hr，收获菌液；第三是4000rpm离心10min，收集菌体沉淀；第四是按常规方法即可获得Harpin蛋白。

11、权利要求1所述的基因工程蛋白质在防治植物病害中的应用。