CN112661833A

CN112661833A - 重组人干扰素hIFN-κ基因工程菌株及其构建方法和用途

Info

Publication number: CN112661833A
Application number: CN202011560295.XA
Authority: CN
Inventors: 彭继先; 刘翠英; 李俊霞; 赵杏蕊; 任文杰; 董庆茹; 杨粉; 刘敬
Original assignee: Shandong Jinghui Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shandong Jinghui Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-12-25
Filing date: 2020-12-25
Publication date: 2021-04-16

Abstract

本发明公开了一种重组人干扰素hIFN‑κ基因工程菌株及其构建方法和用途。本发明将人干扰素‑κ(hIFN‑κ)的编码基因通过密码子优化导入大肠杆菌细胞，构建pET30a‑hIFN‑k‑BL21基因工程菌株。所构建的基因工程菌株经培养和诱导，实现了hIFN‑k基因在异源宿主细胞中的高效表达，极大提高了hIFN‑k蛋白的表达量，适用于工业化生产。

Description

重组人干扰素hIFN-κ基因工程菌株及其构建方法和用途

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及重组人干扰素hIFN-κ基因工程菌株及其构建方法和用途。

背景技术

干扰素(Interferon，IFN)是一类具有广谱抗病毒、抗肿瘤、免疫调节作用的细胞因子。其可以通过结合靶细胞上的同源受体复合物而发挥抗病毒的活性。

干扰素卡帕(Interferon-κ，IFN-κ)是近年来发现的一个新的IFN成员，与IFN-α、IFN-β共同使用一个受体蛋白，属于I型干扰素。IFN-κ由207个氨基酸残基组成，包括N端27个氨基酸残基的信号肽，与Ⅰ型IFN的其他成员有约30％的同源性，IFN-κ比其他Ⅰ型IFN稍大，在C和D螺旋间有12个氨基酸残基的插入。IFN-κ基因位于第9对染色体短臂，与其他Ⅰ型IFN的基因邻近，其他Ⅰ型IFN基因无内含子，但IFN-κ基因的3′端非编码区含有1个内含子。目前，有研究发现编码IFN-κ基因选择性的在上皮角蛋白细胞中表达，重组的hIFN-κ与其他同型的干扰素类似，可以保护细胞免于病毒的感染；且所述的表达具有种族的特异性。

皮肤作为第一道免疫屏障，hIFN-κ在皮肤中高表达预示着其在免疫过程中起到非常重要的作用，而从人体中获得纯化获得IFN-κ的量远远不能满足要求。现有技术中，利用细菌高效表达异源蛋白是目前基因工程的首选。目前现有技术中存在利用大肠菌等原核细胞工程菌表达产生人干扰素a2b的方法，也存在利用大肠杆菌表达干扰素λ4的方法，但是还没有外源表达hIFN-κ的有效方法，而如何有效地实现hIFN-κ的高效表达则必须考虑多方面的因素；为解决现有技术中的这些问题，发明人提出了本发明的技术方案。

发明内容

本发明的目的在于构建一种重组人干扰素hIFN-κ基因工程菌株，该菌株能够进行高密度工业化培养，实现了hIFN-k基因在异源宿主细胞中的高效表达，从而为hIFN-k蛋白的工业化生产提供切实可行的途径。

根据本发明的第一个方面，提供一种优化的编码hIFN-κ的核苷酸序列，所述核苷酸序列为选自以下的任一种：a)编码如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的核苷酸序列；b)与SEQ ID NO:2具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同源性，且能够编码SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的核苷酸序列；c)在SEQ ID NO:2序列基础上插入、缺失或添加一个或多个核苷酸残基，且能够编码SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的核苷酸序列；和d)如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

根据本发明的第二个方面，提供一种核酸构建体，所述核酸构建体包含编码hIFN-κ的核苷酸序列，所述核苷酸序列为选自以下的任一种：a)编码如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的核苷酸序列；b)与SEQ ID NO:2具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同源性，且能够编码SEQ IDNO:1所示氨基酸序列的核苷酸序列；c)在SEQ ID NO:2序列基础上插入、缺失/添加一个或多个核苷酸残基，且能够编码SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的核苷酸序列；和d)如SEQ IDNO:2所示的核苷酸序列。

其中，所述核酸构建体是可介导hIFN-κ基因表达的载体。优选地，所述核酸构建体为质粒载体或病毒载体；更优选地，所述核酸构建体为质粒载体，且所述质粒选自但不限于pET30a、pCZN1、pET22b和pET28a中的任意一种。

根据本发明的第三个方面，提供了一种重组hIFN-κ基因工程菌株，所述基因工程菌株包含如上所述的优化的编码hIFN-κ的核苷酸序列或包含如上所述的核酸构建体。

具体地，所述基因工程菌株包含核酸构建体，所述的核酸构建体包含编码hIFN-κ的核苷酸序列，所述核苷酸序列为选自以下的任一种：a)编码如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的核苷酸序列；b)与SEQ ID NO:2具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同源性，且能够编码SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的核苷酸序列；c)在SEQ ID NO:2序列基础上插入、缺失/添加一个或多个核苷酸残基，且能够编码SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的核苷酸序列；和d)如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

其中，所述基因工程菌株的出发细胞为真核细胞，优选为植物细胞、动物细胞、真菌细胞，更优选为酵母细胞。

其中，所述基因工程菌株的出发细胞为原核细胞，优选为细菌，更优选为枯草芽孢杆菌或大肠杆菌细胞；最优选为大肠杆菌BL21(DE3)细胞。

优选地，所述基因工程菌株是pET30a-hIFN-k-BL21基因工程菌株。

根据本发明的第四个方面，提供一种基因工程菌株的构建方法，包括通过转染(真核细胞)、转导(病毒载体)或转化(原核细胞)的方式将含有能够编码表达hIFN–κ的核苷酸序列的核酸构建体导入宿主细胞而获得所述基因工程菌株。

其中，所述导入是通过转化的方式将能够在原核细胞中表达的载体转化到宿主细胞中。优选地，所述转化为电转化；更优选地，所述转化为热激转化。

根据本发明的第五个方面，提供一种生产hIFN-κ蛋白的方法，所述方法通过培养所述基因工程菌株和诱导基因表达获得hIFN-κ蛋白。

优选地，所述方法包括以下步骤：

(1)表达载体构建：将密码子优化后的hIFN-κ的核苷酸序列连接至载体，对合成的载体进行双酶切及测序验证；

(2)导入宿主细胞：将合成的表达载体导入宿主细胞中，培养，选取单菌落；

(3)诱导表达：接种步骤(2)的单菌落，培养，加入0.4-1.2mM的IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)，诱导表达hIFN-κ。

具体地，一种生产hIFN-κ蛋白的方法，包括以下步骤：

(1)表达载体构建：将密码子优化后的hIFN-κ的核苷酸序列合成至pET-30a载体，对合成的载体pET30a-hIFN-κ进行XhoⅠ和ApaⅠ双酶切及测序验证；

(2)导入宿主细胞：将合成好的pET30a-hIFN-κ表达载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，培养，选取单菌落；

(3)诱导表达：接种步骤(2)获得的单菌落，培养，加0.4-1.2mM的IPTG，诱导表达hIFN-κ。

在一个具体的实施方式中，将密码子优化后的SEQ ID NO:2所示的hIFN-κ的核苷酸序列合成至pET-30a载体，插入位点为NdeⅠ(CATATG)-XhoⅠ(CTCGAG)，对合成的载体pET30a-hIFN-κ进行XhoⅠ-ApaⅠ双酶切及测序验证。

在一个具体的实施方式中，将pET30a-hIFN-κ表达载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，在不含卡那霉素的LB固体培养基上36-38℃培养0.5-2h，然后将其涂布在含卡那霉素的LB固体培养基上36-38℃培养过夜，挑取单菌落。

在一个具体的实施方式中，将步骤(2)获得的单菌落接种在LB液体培养基中，36-38℃培养过夜，将培养液以0.5-2‰(体积百分比)的接种量转接至摇瓶中(LB液体培养基，含卡那霉素1‰)，36-38℃培养至OD600为0.4-1.2时，加入终浓度为0.4-1.2mM的IPTG，36-38℃诱导表达2-4h。

优选地，当培养至OD600值为0.4-1.2、0.5-1、0.6-0.9或0.7-0.8时，加入终浓度为0.4-1.2mM的IPTG诱导表达。

优选地，加入0.4-1.2mM、0.5-1.1mM、0.6-1.0mM、0.7-0.9mM的IPTG诱导表达，更优选地，加入0.8mM的IPTG诱导表达。

根据本发明的另一方面，提供了上述的基因工程菌株在制备hIFN-κ中的用途。

根据本发明的又一方面，提供了上述的方法生产的hIFN-κ在制备抗病毒药物中的应用。

本发明的有益效果如下：

pBV220是目前国内较为通用的高效表达载体，天然hIFN-κ基因与pBV220连接后表达非常低，为有效地实现hIFN-κ的高表达，发明人设计了全新的hIFN-κ基因，在保留编码蛋白的DNA序列的同时以大肠杆菌喜用的密码子取代了原基因序列中的稀有密码子。具体地，用CGT取代AGG/AGA(均编码精氨酸)，同时重新构建了基因的5′端，使其A+T的含量增加到最大限度，这将减少mRNA的二级结构，增加翻译效率。通过本申请构建的基因工程菌株pET30a-hIFN-k-BL21，实现了hIFN-k基因在异源大肠杆菌细胞中的高效表达，发酵液中目标蛋白表达量达到3800-4300mg/L。另外，本发明生产hIFN-κ的方法获得的hIFN-κ蛋白经过复性纯化后，最大限度地保持了蛋白的原始结构活性；另外，实验结果表明通过本发明的基因工程菌株制备的hIFN-κ具有与天然hIFN-κ纯品相近的活性。

附图说明

图1示出密码子优化后的核苷酸序列测序结果翻译的氨基酸序列与理论序列的比对；

图2示出pET30a-hIFN-κ质粒构建原理的示意图；

图3示出pET30a-hIFN-κ载体双酶切的琼脂糖凝胶电泳图，其中泳道1：质粒；泳道2：用XhoⅠ和ApaⅠ酶切消化的质粒；泳道M：DNA标记；

图4示出在大肠杆菌BL21(DE3)中表达的hIFN-k蛋白的SDS-PAGE图，其中泳道A：细胞裂解物的沉淀；泳道B：细胞裂解物的上清液；泳道C：全细胞裂解物；泳道D：全细胞裂解液上清液；MK：分子量标记；和

图5示出通过本发明的基因工程菌株制备的hIFN-κ的体外活性检测。

具体实施方式

下面将结合具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是出于举例的目的，而不是全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员将更好地理解和掌握本发明所要求保护的技术方案及其实现的技术效果。

在下面的具体实施例中，采用的菌株为大肠杆菌BL21(DE3)，Arctic Express,，BL21(DE)3Plyss。采用的工具酶和试剂如下所示：限制性内切酶XhoⅠ(NEB)；限制性内切酶ApaⅠ(Takara)；胰蛋白胨(OXOID Ltd.)；酵母粉(OXOID Ltd.)；氯化钠(国药集团化学试剂有限公司)；卡那霉素(INALCO，SPA MILANO ITALY)；IPTG(INALCO，SPA MILANO ITALY)。在具体实施例中所采用的其他试剂皆为商业可购买的试剂。

实施例1：编码hIFN-κ基因的制备

根据hIFN-κ氨基酸序列进行大肠杆菌密码子优化，hIFN-κ的氨基酸序列如下所示：MLDCNLLNVHLRRVTWQNLRHLSSMSNSFPVECLRENIAFELPQEFLQYTQPMKRDIKKAFYEMSLQAFNIFSQHTFKYWKERHLKQIQIGLDQQAEYLNQCLEEDKNENEDMKEMKENEMKPSEARVPQLSSLELRRYFHRIDNFLKEKKYSDCAWEIVRVEIRRCLYYFYKFTALFRRK(SEQ ID NO:1)。

hIFN-κ表达序列密码子优化后的基因序列：

ATGCTGGATTGTAATCTGCTGAATGTGCATCTGCGTCGTGTGACCTGGCAGAATCTGCGTCATCTGAGCAGCATGAGCAATAGCTTTCCGGTTGAATGTCTGCGCGAGAATATTGCCTTTGAACTGCCGCAGGAATTTCTGCAGTATACCCAGCCGATGAAACGCGATATTAAGAAAGCCTTCTATGAAATGAGCCTGCAGGCATTTAATATCTTTAGCCAGCATACCTTTAAGTATTGGAAAGAACGTCATCTGAAACAGATTCAGATTGGCCTGGATCAGCAGGCAGAATATCTGAATCAGTGTCTGGAAGAAGATAAGAATGAGAATGAAGATATGAAGGAAATGAAGGAGAATGAAATGAAACCGAGCGAAGCACGCGTTCCGCAGCTGAGCAGTCTGGAACTGCGTCGCTATTTCCATCGTATTGATAATTTCCTGAAGGAGAAGAAATACAGCGATTGTGCCTGGGAAATTGTTCGCGTTGAAATTCGTCGCTGTCTGTATTATTTCTATAAATTTACCGCCCTGTTCCGCCGCAAATAA(SEQ ID NO:2)。

其中适用于大肠杆菌BL21(DE3)的密码子优化原则是：(1)对稀有密码子较为集中的区域进行整体优化，以达到最佳的优化效果；(2)调整富含AT和GC的区域，使序列的GC含量适宜；(3)在设计基因时不全部采用大肠杆菌BL21的最优密码子，仅是部分采用偏好密码子。

上述优化后的基因序列由上海近岸科技有限公司合成，合成完成后进行测序检测，翻译后氨基酸与理论序列一致(如图1所示)，备用。

实施例2：pET30a-hIFN-κ载体构建及pET30a-hIFN-κ-BL21表达菌株构建

将实施例1制备的优化后的hIFN-κ基因序列与质粒pET30a由上海近岸科技有限公司合成pET30a-hIFN-κ表达载体，将其转化至大肠杆菌菌株BL21(DE3)感受态细胞中，转化后在感受态细胞中加入LB固体培养基(不含卡那霉素)37℃后培养1h，然后将其涂布到含卡那霉素的LB固体培养基上37℃过夜培养(实验原理示意图如图2所示)。

挑取阳性克隆，扩大培养，提取质粒，进行XhoⅠ-ApaⅠ双酶切验证，结果表明大片段约4500bp，小片段约为1500bp，酶切结果与预期相符，如图3所示。

对测序正确的克隆菌株进行-80℃低温保存。

实施例3：hIFN-κ基因在大肠杆菌中的表达

将实施例2制备的单克隆菌株进行复苏，接种至LB液体培养基中，37℃培养过夜，并将培养液以1‰的接种量转接至摇瓶中，37℃培养至OD600为0.8时，加入终浓度为1mM的IPTG 37℃诱导3h进行诱导表达。其中LB液体培养基的配方如下：

按照以上条件进行诱导表达，将诱导完成的菌液离心收集菌体，超声破碎离心，取样进行SDS-PAGE检测，结果如图4所示，hIFN-κ蛋白在BL21(DE3)中包涵体中明显表达，分子量大约为22.3kDa。

另外，将超声破碎离心后的包涵体溶液复性层析纯化，结果显示hIFN-κ蛋白的纯度达到98％以上，且收率达到60％以上，结果表明利用本发明构建的pET30a-hIFN-k-BL21菌株，实现了hIFN-k基因在异源大肠杆菌细胞中的高效表达。

实施例4：干扰素-κ蛋白的体外活性检测

将实施例2制备的单克隆菌株经培养、诱导表达、收集菌体、复性纯化得到hIFN-κ蛋白进行活性检测。

按照报告基因质粒培养方法，先在HEK293-ISRE-Luc细胞中转染荧光素酶报告基因质粒，然后用抗生素筛选阳性克隆，IFN-k从10ug/mL起始，4倍梯度稀释，孵育4.5小时检测ISRE通路的激活，有限稀释法筛选到阳性单克隆后，扩增细胞铺板，加入梯度稀释后的人干扰素-κ共培养，然后加入荧光指示剂，记录信号并分析，结果如图5所示。结果显示，本发明制备的人干扰素-κ活性与人干扰素-κ纯品活性相当。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但是并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可做各种改动和修饰，以本领域技术人员结合所属领域的常规技术概括获得的内容均在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 山东晶辉生物技术有限公司

<120> 重组人干扰素hIFN-κ基因工程菌株及其构建方法和用途

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 181

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

Met Leu Asp Cys Asn Leu Leu Asn Val His Leu Arg Arg Val Thr Trp

1 5 10 15

Gln Asn Leu Arg His Leu Ser Ser Met Ser Asn Ser Phe Pro Val Glu

20 25 30

Cys Leu Arg Glu Asn Ile Ala Phe Glu Leu Pro Gln Glu Phe Leu Gln

35 40 45

Tyr Thr Gln Pro Met Lys Arg Asp Ile Lys Lys Ala Phe Tyr Glu Met

50 55 60

Ser Leu Gln Ala Phe Asn Ile Phe Ser Gln His Thr Phe Lys Tyr Trp

65 70 75 80

Lys Glu Arg His Leu Lys Gln Ile Gln Ile Gly Leu Asp Gln Gln Ala

85 90 95

Glu Tyr Leu Asn Gln Cys Leu Glu Glu Asp Lys Asn Glu Asn Glu Asp

100 105 110

Met Lys Glu Met Lys Glu Asn Glu Met Lys Pro Ser Glu Ala Arg Val

115 120 125

Pro Gln Leu Ser Ser Leu Glu Leu Arg Arg Tyr Phe His Arg Ile Asp

130 135 140

Asn Phe Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Asp Cys Ala Trp Glu Ile Val

145 150 155 160

Arg Val Glu Ile Arg Arg Cys Leu Tyr Tyr Phe Tyr Lys Phe Thr Ala

165 170 175

Leu Phe Arg Arg Lys

180

<210> 2

<211> 546

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgctggatt gtaatctgct gaatgtgcat ctgcgtcgtg tgacctggca gaatctgcgt 60

catctgagca gcatgagcaa tagctttccg gttgaatgtc tgcgcgagaa tattgccttt 120

gaactgccgc aggaatttct gcagtatacc cagccgatga aacgcgatat taagaaagcc 180

ttctatgaaa tgagcctgca ggcatttaat atctttagcc agcatacctt taagtattgg 240

aaagaacgtc atctgaaaca gattcagatt ggcctggatc agcaggcaga atatctgaat 300

cagtgtctgg aagaagataa gaatgagaat gaagatatga aggaaatgaa ggagaatgaa 360

atgaaaccga gcgaagcacg cgttccgcag ctgagcagtc tggaactgcg tcgctatttc 420

catcgtattg ataatttcct gaaggagaag aaatacagcg attgtgcctg ggaaattgtt 480

cgcgttgaaa ttcgtcgctg tctgtattat ttctataaat ttaccgccct gttccgccgc 540

aaataa 546

Claims

1.一种优化的编码hIFN-κ的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列为选自以下的任一种：

a)编码如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的核苷酸序列；

b)与SEQ ID NO:2具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同源性，且能够编码SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的核苷酸序列；

c)在SEQ ID NO:2序列基础上插入、缺失/添加一个或多个核苷酸残基，且能够编码SEQID NO:1所示的氨基酸序列的核苷酸序列；和

d)如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

2.一种核酸构建体，其特征在于，所述核酸构建体包含如权利要求1所述的核苷酸序列。

3.根据权利要求2所述的核酸构建体，其特征在于，所述核酸构建体是可介导hIFN-κ基因表达的载体，优选地，所述核酸构建体是病毒载体或质粒载体。

4.根据权利要求3所述的核酸构建体，其特征在于，所述核酸构建体为质粒载体，且所述质粒选自但不限于pET30a、pCZN1、pET22b和pET28a中的任意一种。

5.一种重组hIFN-κ基因工程菌株，其特征在于，所述基因工程菌株包含如权利要求1所述的核苷酸序列或包含如权利要求2-4中任一项所述的核酸构建体。

6.根据权利要求5所述的基因工程菌株，其特征在于，所述基因工程菌株的出发细胞为真核细胞，优选为植物细胞、动物细胞、真菌细胞，更优选为酵母细胞；或者，所述基因工程菌株的出发细胞为原核细胞，优选为细菌细胞，更优选为枯草芽孢杆菌或大肠杆菌细胞，最优选为大肠杆菌BL21(DE3)细胞；优选地，所述基因工程菌株为pET30a-hIFN-k-BL21基因工程菌株。

7.一种构建权利要求5或6所述的基因工程菌株的方法，其特征在于，通过转染、转导或转化的方式将包含如权利要求2-4中任一项所述的核酸构建体导入宿主细胞而获得所述基因工程菌株。

8.一种生产hIFN-κ蛋白的方法，其特征在于，所述方法通过培养如权利要求5或6所述的基因工程菌株和诱导基因表达获得所述hIFN-κ蛋白；优选地，所述方法包括以下步骤：(1)表达载体构建：将密码子优化后的hIFN-κ的核苷酸序列连接至载体，对合成的载体进行双酶切及测序验证；(2)导入宿主细胞：将合成的表达载体导入宿主细胞中，培养，选取单菌落；和(3)诱导表达：接种步骤(2)的单菌落，培养，加入0.4-1.2mM的IPTG，诱导基因表达。

9.根据权利要求5或6所述的基因工程菌株在制备hIFN-κ中的用途。

10.通过权利要求8所述的方法生产的hIFN-κ在制备抗病毒药物中的应用。