CN112694527B

CN112694527B - 一种重组人干扰素-κ包涵体的纯化和复性方法

Info

Publication number: CN112694527B
Application number: CN202011560333.1A
Authority: CN
Inventors: 彭继先; 李振森; 晁香君; 吴桂苹; 韩景花
Original assignee: Shandong Ruiying Pharmaceutical Group Co ltd
Current assignee: Shandong Ruiying Pharmaceutical Group Co ltd
Priority date: 2020-12-25
Filing date: 2020-12-25
Publication date: 2022-09-09
Anticipated expiration: 2040-12-25
Also published as: CN112694527A

Abstract

本发明公开了一种重组人干扰素‑κ包涵体的纯化和复性方法。所述方法包括：将人干扰素kappa(hIFN‑κ)的编码基因通过密码子优化转化大肠杆菌，构建基因工程菌，所构建的基因工程菌经诱导，以包涵体的方式高效表达重组人干扰素hIFN‑κ，经过纯化复性，获得高纯度的具有抗病毒活性的hIFN‑κ。本发明的纯化及复性方法实现了88％以上的包涵体纯度和60％以上的hIFN‑κ蛋白收率，操作简单且适于大规模生产。

Description

一种重组人干扰素-κ包涵体的纯化和复性方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种重组人干扰素-κ包涵体的柱层析复性方法。

背景技术

干扰素(Interferon，IFN)是一类具有广谱抗病毒、抗肿瘤、免疫调节作用的细胞因子，其可以通过结合靶细胞上的同源受体复合物而发挥抗病毒的活性。其中，I型干扰素家族的多位成员，作为抗病毒药物候选，已经完成临床的药物试验，如重组IFN-α2被应用于抗乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)感染的治疗药物，IFN-β被应用于治疗多发性硬化症(MS)。对重症急性呼吸综合征急性期患者联合使用激素与IFN-α治疗，可缩短患者的住院时间，促进肺部病变的吸收，减少对激素的需求量，但不会缩短发热持续时间，而且IFN-α治疗可能与机体持续的炎症反应相关，不利于患者的恢复。

干扰素卡帕(Interferon-κ，IFN-κ)是近年来发现的一个新的IFN成员，IFN-κ由207个氨基酸残基组成，包括N端27个氨基酸残基的信号肽，与Ⅰ型IFN的其他成员有约30％的同源性，IFN-员比其他Ⅰ型IFN稍大，在C和D螺旋间有12个氨基酸残基的插入。IFN-κ与IFN-α、IFN-β共同使用一个受体蛋白，属于I型干扰素。目前，已有研究发现编码IFN-κ的基因选择性地在上皮角蛋白细胞中表达，重组hIFN-κ与其他同型的干扰素类似，可以保护细胞免于病毒的感染；且所述表达具有种族的特异性。

IFN-κ能够活化干扰素刺激基因，抑制脑心肌炎病毒(ECMV)和人类乳头瘤病毒(HPV)的复制。IFN-κ是一种相对温和的I型干扰素，能有效抑制囊膜病毒的复制，是构成性表达的干扰素成员之一，组成抗病毒的天然免疫屏障，呼吸道给药无明显毒性，能够有效抑制流感病毒PR8、H9N2和H7N9以及寨卡病毒的复制，在降低病毒致病性中发挥重要保护作用，与IFN-α相似，其作用机制主要是通过上调干扰素刺激基因以抑制病毒复制。

目前，对于IFN-κ蛋白的研究相对较少，且从人体中获得IFN-κ蛋白的量远远不能满足科研或临床应用的要求。因此，如何获得高纯度和高收率的IFN-κ蛋白是当前迫切需要解决的问题。在现有技术中，利用大肠杆菌为宿主菌高效表达外源基因，形成包涵体，然后对包涵体复性是一种常用的方法。然而，包涵体蛋白的复性是当前一个重要的难题。传统的复性方法采用稀释、透析等常规操作，或者采用低浓度变性剂(盐酸胍或者尿素)洗涤，造成了洗涤过程中包涵体损失较大，产生大量废水，耗时耗能，且IFN-κ蛋白的活性和收率都不高，不利于大规模生产。

因此，针对现有技术中存在的IFN-κ蛋白复性过程存在的问题，提出了本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的重组人干扰素-κ包涵体的复性方法，其通过采用含有密码子优化的序列的基因工程菌株，将包涵体的溶解、纯化和复性步骤有机结合，实现了高的包涵体纯度和目标蛋白收率，且包涵体复性后获得具有优异的抗病毒活性的hIFN-κ。

本发明的目的通过包括以下的技术方案来实现：

本发明的第一个方面，提供一种在原核生物细胞中高效表达的编码hIFN-κ的基因，所述编码hIFN-κ的基因具有：1)编码如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的核苷酸序列；2)与SEQ ID NO:2具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同源性，且能够编码SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的核苷酸序列；3)在SEQ ID NO:2序列基础上插入、缺失/添加一个或多个核苷酸残基，且能够编码SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的核苷酸序列；或4)如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

本发明的第二个方面，提供一种核酸构建体，所述的核酸构建体包含可以在原核生物细胞中高效表达的编码hIFN-κ的基因，所述编码hIFN-κ的基因如本发明的第一个方面所述。

在另外的一个具体实施例中，所述的核酸构建体是可介导基因表达的载体。优选地，所述的载体为质粒载体或病毒载体；更优选地，所述的载体为质粒载体；更优选地，所述质粒选自但不限于pET30a、pCZN1、pET22b和pET28a中的任意一种。

本发明的第三个方面，提供核酸构建体的制备方法。具体的，所述的核酸构建体如本发明第二个方面所述；在一个具体的实施例中，所述的核酸构建体是将编码hIFN-κ的编码基因插入到可诱导基因表达的表达框中。优选地，所述的基因是通过PCR的方法获得，所述的插入是通过酶切连接的方式进行；更优选地，所述的核酸构建体为质粒，优选为pET30a。

本发明的第四个方面，提供一种基因工程修饰的宿主细胞，所述的宿主细胞包含核酸构建体，所述的核酸构建体包含可以在原核生物中进行高效表达的编码hIFN-κ的基因，所述的编码hIFN-κ的基因如本发明的第一个方面所述；在一个具体的实施例中，载体为质粒载体或病毒载体；更优选地，所述的载体为质粒载体；更优选地，所述质粒选自但不限于pET30a、pCZN1、pET22b和pET28a中的任意一种。在另外的一个具体实施例中，所述的宿主细胞为原核生物细胞，优选为细菌细胞，更优选为枯草芽孢杆菌或大肠杆菌细胞；最优先为大肠杆菌BL21(DE3)细胞。在另外的一个具体实施例中，所述宿主细胞为真核生物细胞，优选为植物细胞、动物细胞、真菌细胞，更优选为酵母细胞。

本发明的第五个方面，提供如上所述的宿主细胞的制备方法，在一个具体的实施例中，所述的宿主细胞是通过转染(真核细胞)、转导(病毒载体)或转化(原核细胞)的方式将含有能够编码hIFN–κ的核苷酸序列的核酸构建体导入宿主细胞而获得；优选地，所述的转化为电转化；更优选地，所述的转化为热激转化。

本发明的第六个方面，提供一种重组人干扰素kappa(hIFN-κ)包涵体的复性方法，包括如下步骤：

a)包涵体的获得：培养宿主细胞，诱导表达后收集菌体、重悬缓冲液重悬、破碎细胞后离心收集沉淀；

b)包涵体的洗涤：利用洗涤缓冲液重悬沉淀，均质2～3次，离心收集洗涤后的包涵体；

c)包涵体的纯化：利用变性缓冲液溶解步骤b)获得的包涵体，离子交换层析得到包含纯化包涵体的洗脱液；

d)包涵体的复性：将步骤c)获得包含纯化包涵体的洗脱液加入到复性缓冲液中复性。

在一个具体的实施例中，步骤a)的包涵体的获得是培养如本发明第四方面所述的宿主细胞后，加入诱导剂培养，离心收集菌体，破碎细胞，离心获得沉淀，即为包涵体；优选地，所述的诱导剂为IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)或乳糖，所述的诱导是将细菌培养到OD600在10-20时加入诱导剂。优选地，在OD600为12-18、13-17、14-16或者它们之间任意值时加入诱导剂。

其中，在步骤a)中，所述的诱导剂的浓度为0.4mM-1.2mM，优选地为0.6-1.0mM，更优选地为0.7-0.9mM。

具体地，在步骤a)中，在诱导剂诱导表达后，在低温条件下，以7000-9000rpm转速离心5-15min，收集菌体沉淀。

具体地，在步骤a)中，所述的破碎细胞是利用重悬缓冲液重悬离心菌体沉淀后利用高压均质方法破碎2-3次，离心收集沉淀。

具体地，在步骤a)中，在培养温度35～38℃或36～37℃下，优选地37℃下培养所述的宿主细胞。

具体地，在步骤a)中，在转速200、210、220、230、240或250rpm条件下培养所述的宿主细胞。

在另外的一个具体的实施例中，在步骤b)中，所述的包涵体的洗涤是利用洗涤缓冲液重悬后再次经过高压均质，离心收集获得洗涤后的包涵体。

在另外的一个具体的实施例中，在步骤c)中，将溶解后的包涵体依次进行阳离子交换层析和阴离子交换层析。具体地，将溶解后的包涵体依次上阳离子交换层析柱和阴离子交换层析柱，洗脱缓冲液洗脱得到包含纯化包涵体的洗脱液。优选地，所述的溶解是利用变性缓冲液对包涵体进行溶解。

优选地，所述阴离子交换层析采用的交换介质为季铵基(Q)为配基的离子交换介质；所述阳离子交换层析采用的交换介质为磺酸基(SP)为配基的离子交换介质。

优选地，所述阳离子交换层析采用的交换介质为选自SP Bestarose HP、SPBestarose FF、SP Bestarose XL和SP Sepharose XL中的任一种；更优选地，所述阳离子交换层析采用的交换介质为SP Bestarose HP。

优选地，所述阴离子交换层析采用的交换介质为选自Q Bestarose FF、DEAEBestarose Fast Flow、Q sepharose FF、UNOsphere Q、Q Bestarose XL和Mono Q中的任一种；更优选地，所述阴离子交换层析采用的交换介质为Q Bestarose FF。

在本文中，使用含有阳离子交换介质的阳离子交换层析柱进行阳离子交换层析，使用含有阴离子交换介质的阴离子交换层析柱进行阴离子交换层析。其中，SP型层析柱是指以磺酸基(SP)为配基的离子交换介质为交换介质的阳离子交换层析柱；Q型层析柱是指以季铵基(Q)为配基的离子交换介质为交换介质的阴离子交换层析柱。

不拘于理论的限制，在本发明中，阴离子交换层析是指阴离子交换剂的电荷基团(配基)带正电，而反离子带负电，反离子可与溶液中的阴离子或带负电荷的化合物进行交换反应。阳离子交换是指阳离子交换剂的电荷基团(配基)带负电，而反离子带正电，反离子可与溶液中的阳离子或带正电荷的化合物进行交换反应。在一定pH条件下，根据蛋白质所带电荷的不同，离子交换剂上的可交换离子(即反离子)与溶液中被分离的离子吸附结合，从而实现分离。其中，与离子交换介质无结合能力或结合能力弱的蛋白质被洗脱下来，而亲和力强的蛋白被结合在柱上。

在本发明中，阴离子交换层析采用的交换介质为季铵基为配基的离子交换介质。季铵基是一种强碱性基团，其水中解离出OH-而成强碱性，在洗脱时，OH-与溶液中的阴离子进行交换使得其被吸附在介质上。强阴离子型交换介质适用的范围较广，在酸性环境下都能够进行反应。阳离子交换层析采用的交换介质为磺酸基为配基的离子交换介质，磺酸基为强酸性基团，其在溶液中容易离解出H+，故呈强酸性，在洗脱时，H+与溶液中的阳离子进行交换使得溶液中的阳离子被SO3-吸附结合，从而实现H+与溶液中的阳离子互相交换。强酸性阳离子交换树脂的离解能力非常强，在酸性或碱性条件下均能离解并产生离子交换作用。

在另外的一个具体的实施例中，在步骤d)中，纯化的包涵体经过复性缓冲液复性获得具有活性的hIFN-κ；优选地，所述的复性是将收集获得的纯化的溶解于变性液中的包涵体于2-8℃条件下缓慢滴加入复性缓冲液中，滴加完毕后，于2-8℃静置20-72h。

优选地，所述的重悬缓冲液为10-50mM Tris,200-500mM NaCl，PH8.0-8.5。

优选地，所述的洗涤缓冲液为洗涤缓冲液：5-20mM Tris，0.02-0.05M NaCl，0.5-2mMEDTA，0.5-2％TritionX-100，PH 8.0-8.5。

优选地，所述的变性缓冲液为10-50mM Tris，6-10M尿素，50-150mM NaCl，1-2mMEDTA，1-10mM二硫苏糖醇或巯基乙醇，pH 8.0-10.5。

优选地，洗脱缓冲液为：10-50mM Tris，6-10M尿素，500-1000mM NaCl，1-2mMEDTA，1-10mM二硫苏糖醇或巯基乙醇，pH 8.0-10.5。

优选地，复性缓冲液为1-30mM TriS，1-20mM磷酸二氢钠，20-100mM NaCl，0.2-0.6mM氧化型还原剂，0.5-3mM EDTA，0.05-0.2％TritionX-100，PH 7.0-8.5。优选地，所述氧化型还原剂选自氧化型谷胱甘肽和氧化型半胱氨酸中的一种或多种。

在另外的一个具体的实施例中，上述的复性还包括步骤e)活性检测，其中所述活性检测包括亲和力检测。

根据上述复性方法制备获得的hIFN-κ在制备抗病毒药物中的应用。

本发明的有益效果如下：

1)本发明通过采用含有密码子优化的核苷酸序列的基因工程菌株，在保留编码hIFN-κ蛋白的DNA序列的同时以大肠杆菌喜用的密码子取代了原基因序列中的稀有密码子，有效地实现了hIFN-κ蛋白在宿主细胞内的高表达；

2)本发明的方法通过将包涵体的溶解、阳离子交换层析和阴离子交换层析纯化和复性操作有机结合，显著提高了包涵体的纯度和目标蛋白的收率；

3)本申请的方法获得的hIFN-κ为包涵体表达，经过复性纯化后，最大限度的保持了蛋白的原始结构活性；另外，实验结果表明本申请的方法获得的hIFN-κ具有与hIFN-κ纯品等同的活性，满足了将其应用于进一步科学研究的需求。

附图说明

图1示出pET30a-hIFNk质粒构建原理示意图；

图2示出pET30a-hIFN-κ载体双酶切的琼脂糖凝胶电泳图，其中泳道1：质粒；泳道2：用XhoⅠ-ApaⅠ酶切消化的质粒；泳道M：DNA标记；

图3示出在大肠杆菌BL21(DE3)中表达的hIFN-κ蛋白的SDS-PAGE图，其中泳道A：细胞裂解物的沉淀；泳道B：细胞裂解物的上清液；泳道C：全细胞裂解物；泳道D：全细胞裂解液上清液；MK：分子量标记；

图4示出阳离子交换树脂流穿液和阴离子交换树脂洗脱液的SDS-PAGE图；

图5示出纯化包涵体进行复性后还原-非还原的SDS-PAGE图；和

图6示出本发明制备的干扰素-κ与干扰素-κ纯品的活性检测结果。

具体实施方式

下面将结合具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是出于举例的目的，而不是全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员将更好地理解和掌握本发明所要求保护的技术方案及其实现的技术效果。

在下面的具体实施例中，采用的菌株为大肠杆菌BL21(DE3)，Arctic Express,，BL21(DE)3Plyss。采用的工具酶和试剂如下所示：限制性内切酶XhoⅠ(NEB)；限制性内切酶ApaⅠ(Takara)；胰蛋白胨(OXOID Ltd.)；酵母粉(OXOID Ltd.)；氯化钠(国药集团化学试剂有限公司)；IPTG(INALCO，SPA MILANO ITALY)。在具体实施例中所采用的其他试剂皆为商业可购买的试剂。

实施例1：编码hIFN-κ基因的制备

根据hIFN-κ的氨基酸序列进行大肠杆菌密码子优化，其中，hIFN-κ的氨基酸序列如下所示：

MLDCNLLNVHLRRVTWQNLRHLSSMSNSFPVECLRENIAFELPQEFLQYTQPMKRDIKKAFYEMSLQAFNIFSQHTFKYWKERHLKQIQIGLDQQAEYLNQCLEEDKNENEDMKEMKENEMKPSEARVPQLSSLELRRYFHRIDNFLKEKKYSDCAWEIVRVEIRRCLYYFYKFTALFRRK(SEQ ID NO:1)。

其中适用于大肠杆菌BL21(DE3)的密码子优化原则是：(1)对稀有密码子较为集中的区域进行整体优化，以达到最佳的优化效果；(2)调整富含AT和GC的区域，使序列的GC含量适宜；(3)在设计基因时不全部采用大肠杆菌BL21的最优密码子，仅是部分采用偏好密码子。

hIFN-κ表达序列密码子优化后的基因序列如下所示：

ATGCTGGATTGTAATCTGCTGAATGTGCATCTGCGTCGTGTGACCTGGCAGAATCTGCGTCATCTGAGCAGCATGAGCAATAGCTTTCCGGTTGAATGTCTGCGCGAGAATATTGCCTTTGAACTGCCGCAGGAATTTCTGCAGTATACCCAGCCGATGAAACGCGATATTAAGAAAGCCTTCTATGAAATGAGCCTGCAGGCATTTAATATCTTTAGCCAGCATACCTTTAAGTATTGGAAAGAACGTCATCTGAAACAGATTCAGATTGGCCTGGATCAGCAGGCAGAATATCTGAATCAGTGTCTGGAAGAAGATAAGAATGAGAATGAAGATATGAAGGAAATGAAGGAGAATGAAATGAAACCGAGCGAAGCACGCGTTCCGCAGCTGAGCAGTCTGGAACTGCGTCGCTATTTCCATCGTATTGATAATTTCCTGAAGGAGAAGAAATACAGCGATTGTGCCTGGGAAATTGTTCGCGTTGAAATTCGTCGCTGTCTGTATTATTTCTATAAATTTACCGCCCTGTTCCGCCGCAAATAA(SEQ ID NO:2)。

上述优化后的基因序列由上海近岸科技有限公司合成，备用。

实施例2：pET30a-hIFN-κ载体构建及表达菌株构建

将实施例1制备的优化后的hIFN-κ基因序列与质粒pET30a由上海近岸科技有限公司合成pET30a-hIFNk表达载体，将其转化至大肠杆菌菌株BL21(DE3)感受态细胞中，转化后在感受态细胞中加入LB培养基(不含卡那霉素)37℃后培养1h，然后将其涂布到含卡那霉素的LB固体培养基上37℃过夜培养(实验过程如图1所示)。

挑取阳性克隆，扩大培养，提取质粒，进行XhoⅠ-ApaⅠ双酶切验证，结果表明大片段约4500bp，小片段约为1500bp，酶切结果与预期相符，如图2所示。

对测序正确的克隆菌株进行-80℃低温保存。

实施例3：hIFN-κ基因在大肠杆菌中的表达

1)将实施例2制备的单克隆菌株进行复苏，接种至LB液体培养基中，37℃培养过夜，并将培养液以1‰的接种量转接至摇瓶中，37℃培养至OD600为0.8时，加入终浓度为1mM的IPTG 37℃诱导3h进行诱导表达。其中LB培养基的配方如下：

2)按照以上条件进行诱导表达，将诱导完成的菌液离心收集菌体，超声破碎离心，分别取样进行SDS-PAGE检测，结果如图3所示。将阳性菌株(BL21(DE3)-hIFNk)进行保种并于-80℃冰箱保存。

实施例4：hIFN-κ的蛋白包涵体的纯化和复性

操作过程1

1)培养实施例3制备的含有hIFN-κ基因的大肠杆菌菌株：培养温度37℃、转速230rpm，OD600值达到15时用1mM的IPTG诱导3h，诱导表达使其形成包涵体，8000rpm离心10min收集菌体沉淀，菌体沉淀用重悬缓冲液重悬；

2)破碎细胞：高压均质3次，4℃下以8500rpm离心20min，弃上清，收集沉淀；

3)沉淀用洗涤缓冲液重悬，均质2次，离心收集含有洗涤后的包涵体的上清液；

4)溶解包涵体：利用含有高浓度尿素或盐酸胍的变性缓冲液溶解步骤3)获得的包涵体上清液，得到变性液；

5)包涵体纯化：将变性液上SP Bestarose FF层析柱(SP-FF)，得到阳离子交换树脂产物；阳离子交换树脂产物上Q Bestarose FF层析柱(Q-FF)，经洗脱缓冲液洗脱得到阴离子交换树脂产物，即纯化后的包涵体溶液；

6)包涵体复性：用变性缓冲液将上步洗脱下的包涵体溶液进行稀释，使得蛋白浓度稀释至8mg/ml；

7)将稀释后的包涵体溶液于4℃条件下缓慢滴加入复性缓冲液中，滴加完毕，于4℃静置48h。

8)分别对阳离子交换树脂产物和阴离子交换树脂产物(复性)进行SDS-PAGE实验，结果见图4；对复性的蛋白进行还原型SDS-PAGE和非还原型SDS-PAGE实验，结果见图5。

其中，步骤1)中的重悬缓冲液为：30mM Tris，300mM NaCl，PH 8.5；

步骤3)中的洗涤缓冲液为：15mM Tris，0.03M NaCl，1mM EDTA，1％TritionX-100，PH 8.5；

步骤4)中的变性缓冲液：30mM Tris，8M尿素，100mM NaCl，1.5mM EDTA，5mM巯基乙醇，pH 9；

步骤5)中的洗脱缓冲液为：30mM Tris，8M尿素，800mM NaCl，1.5mM EDTA，5mM巯基乙醇，pH 9；

步骤7)中的复性缓冲液为15mM Tris，10mM磷酸二氢钠，50mM氯化钠，0.4mM氧化型谷胱甘肽，1.5mM EDTA，0.1％Trition X-100，PH 8。

结果显示，经过阳离子树脂和阴离子树脂层析纯化后的包涵体纯度明显提高，在非还原电泳中，复性正确的蛋白表现为小条带，经过复性后的蛋白复性正确率较高。另外，采用常规的SEC-HPLC法对制得的重组人干扰素-κ蛋白的纯度进行检测，结果表明本发明的复性纯化得到的包涵体纯度达到90％以上，目标蛋白收率达64％。

操作过程2

在该操作过程中，使用如下的缓冲液：步骤1)中的重悬缓冲液为：10mM Tris，200mM NaCl，PH 8.0；步骤3)中的洗涤缓冲液为：5mM Tris，0.02M NaCl，0.5mM EDTA，0.5％TritionX-100，PH 8.0；步骤4)中的变性缓冲液：10mM Tris，6M尿素，50mM NaCl，1mM EDTA，1mM二硫苏糖醇，pH 8.0；步骤5)中的洗脱缓冲液为：10mM Tris，6M尿素，500mM NaCl，1mMEDTA，1mM二硫苏糖醇，pH 8；步骤7)中的复性缓冲液为1mM Tris，1mM磷酸二氢钠，20mM氯化钠，0.2mM氧化型谷胱甘肽，0.5mM EDTA，0.05％Trition X-100，PH 7。

其余的操作条件和步骤与操作过程1相同。

结果显示，采用常规的SEC-HPLC法对制得的重组人干扰素-κ蛋白的纯度进行检测，结果表明本发明的复性纯化得到的包涵体纯度达到89％，目标蛋白收率达62％。

操作过程3

在该操作过程中，使用如下的缓冲液：步骤1)中的重悬缓冲液为：50mM Tris，500mM NaCl，PH 8.5；步骤3)中的洗涤缓冲液为：20mM Tris，0.05M NaCl，2mM EDTA，2％TritionX-100，PH 8.5；步骤4)中的变性缓冲液：50mM Tris，10M尿素，150mM NaCl，2mMEDTA，10mM二硫苏糖醇，pH 10.5；步骤5)中的洗脱缓冲液为：50mM Tris，10M尿素，1000mMNaCl，2mM EDTA，10mM巯基乙醇，pH 10.5；步骤7)中的复性缓冲液为30mM Tris，20mM磷酸二氢钠，100mM氯化钠，0.6mM氧化型谷胱甘肽，3mM EDTA，2％Trition X-100，PH 8.5。

其余的操作条件和步骤与操作过程1相同。

结果显示，采用常规的SEC-HPLC法对制得的重组人干扰素-κ蛋白的纯度进行检测，结果表明本发明的复性纯化得到的包涵体纯度达到88％，目标蛋白收率达61％。

实施例5：干扰素-κ蛋白与其受体结合的亲和力测定

采用苏州晶源实验室的gator非标记生物分子分析仪(probelife)，按照其使用说明书操作步骤，检测干扰素-κ和其受体的结合亲和力：首先倍比稀释实施例4的操作过程1制备的hIFN-κ，总共5个浓度，然后让抗-huFc探针先结合干扰素受体，再与不同浓度的hIFN-κ反应，此时受体与hIFN-κ蛋白结合形成一条动态曲线，再将反应后的探针放入解离缓冲液中，此时受体与干扰素-κ蛋白会慢慢发生解离形成一条动态曲线，最后根据曲线和浓度计算出亲和力。具体结果如表1所示。

表1

样品	K<sub>off</sub>(1/s)	K<sub>on</sub>(1/Ms)	KD(M)	响应
					hIFN-κ纯品	0.00421	5.22E+04	8.07E-08	0.147
复性纯化样品	0.00462	5.16E+04	8.95E-08	0.132

如表1所示，经过本发明的复性纯化后的干扰素-κ的KD接近hIFN-κ纯品的KD值，这充分表明经过本发明的纯化复性方法制备的hIFN-κ对其受体的亲和力与标准品接近。结果表明，本发明的复性确保了hIFN-κ肽链中的半胱氨酸之间的正常连接，促使了二硫键的正常形成，进而确保了蛋白与其受体结合的亲和力。

实施例6：干扰素-κ蛋白的体外活性检测

按照报告基因质粒培养方法，检测实施例4操作过程1制备的hIFN-κ活性。先在HEK293-ISRE-Luc细胞中转染荧光素酶报告基因质粒，然后用抗生素筛选阳性克隆，hIFN-κ从10ug/mL起始，4倍梯度稀释，孵育4.5小时检测ISRE通路的激活，有限稀释法筛选到阳性单克隆后，扩增细胞铺板，加入梯度稀释后的干扰素-κ共培养，然后加入荧光指示剂，记录信号并分析，结果如图6所示。结果显示，本发明的干扰素-κ活性与干扰素-κ纯品活性相当。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但是并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可做各种改动和修饰，以本领域技术人员结合所属领域的常规技术概括获得的内容均在本发明的范围之内。

序列表

<110> 山东晶辉生物技术有限公司

<120> 一种重组人干扰素-κ包涵体的纯化和复性方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 181

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

Met Leu Asp Cys Asn Leu Leu Asn Val His Leu Arg Arg Val Thr Trp

1 5 10 15

Gln Asn Leu Arg His Leu Ser Ser Met Ser Asn Ser Phe Pro Val Glu

20 25 30

Cys Leu Arg Glu Asn Ile Ala Phe Glu Leu Pro Gln Glu Phe Leu Gln

35 40 45

Tyr Thr Gln Pro Met Lys Arg Asp Ile Lys Lys Ala Phe Tyr Glu Met

50 55 60

Ser Leu Gln Ala Phe Asn Ile Phe Ser Gln His Thr Phe Lys Tyr Trp

65 70 75 80

Lys Glu Arg His Leu Lys Gln Ile Gln Ile Gly Leu Asp Gln Gln Ala

85 90 95

Glu Tyr Leu Asn Gln Cys Leu Glu Glu Asp Lys Asn Glu Asn Glu Asp

100 105 110

Met Lys Glu Met Lys Glu Asn Glu Met Lys Pro Ser Glu Ala Arg Val

115 120 125

Pro Gln Leu Ser Ser Leu Glu Leu Arg Arg Tyr Phe His Arg Ile Asp

130 135 140

Asn Phe Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Asp Cys Ala Trp Glu Ile Val

145 150 155 160

Arg Val Glu Ile Arg Arg Cys Leu Tyr Tyr Phe Tyr Lys Phe Thr Ala

165 170 175

Leu Phe Arg Arg Lys

180

<210> 2

<211> 546

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgctggatt gtaatctgct gaatgtgcat ctgcgtcgtg tgacctggca gaatctgcgt 60

catctgagca gcatgagcaa tagctttccg gttgaatgtc tgcgcgagaa tattgccttt 120

gaactgccgc aggaatttct gcagtatacc cagccgatga aacgcgatat taagaaagcc 180

ttctatgaaa tgagcctgca ggcatttaat atctttagcc agcatacctt taagtattgg 240

aaagaacgtc atctgaaaca gattcagatt ggcctggatc agcaggcaga atatctgaat 300

cagtgtctgg aagaagataa gaatgagaat gaagatatga aggaaatgaa ggagaatgaa 360

atgaaaccga gcgaagcacg cgttccgcag ctgagcagtc tggaactgcg tcgctatttc 420

catcgtattg ataatttcct gaaggagaag aaatacagcg attgtgcctg ggaaattgtt 480

cgcgttgaaa ttcgtcgctg tctgtattat ttctataaat ttaccgccct gttccgccgc 540

aaataa 546

Claims

1.一种重组人干扰素kappa(hIFN-κ)包涵体的纯化和复性方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

a)包涵体的获得：培养宿主细胞，诱导表达后收集菌体、重悬缓冲液重悬、破碎细胞后离心收集沉淀；所述重悬缓冲液为10-50mM Tris，200-500mM NaCl，PH 8.0-8.5；

步骤b)中使用的b)包涵体的洗涤：利用洗涤缓冲液重悬沉淀，均质2~3次，离心收集洗涤后的包涵体；所述洗涤缓冲液为：5-20mM Tris，0.02-0.05M NaCl，0.5-2mM EDTA，0.5-2%TritionX-100，pH 8.0-8.5；

c)包涵体的纯化：利用变性缓冲液溶解步骤b)获得的包涵体，离子交换层析得到包含纯化包涵体的洗脱液，所述离心层析具体是：将溶解后的包涵体进行阳离子交换层析得到阳离子交换层析产物，将所述阳离子交换层析产物进行阴离子交换层析得到阴离子交换层析产物，其中变性缓冲液为：10-50mM Tris，6-10M尿素，50-150mM NaCl，1-2mM EDTA，1-10mM二硫苏糖醇或巯基乙醇，pH 8.0-10.5；洗脱缓冲液为：10-50mM Tris，6-10M尿素，500-1000mM NaCl，1-2mM EDTA，1-10mM二硫苏糖醇或巯基乙醇，pH 8.0-10.5；

d)包涵体的复性：用变性缓冲液稀释在步骤c）获得的纯化的包涵体使得所述包涵体中的蛋白浓度为5-10mg/ml，将稀释后的洗脱液加入复性缓冲液中，于2-8℃静置20-72h，从而将步骤c）获得的包含纯化包涵体的洗脱液复性;

其特征在于，所述步骤a)的包涵体通过培养含有编码hIFN-κ的基因的宿主细胞后，诱导剂诱导表达、离心收集菌体、高压均质破碎细胞、离心收集获得；其中，所述编码hIFN-κ的基因SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列;

步骤d)中使用的复性缓冲液为1-30mM Tris，1-20mM磷酸二氢钠，20-100mM氯化钠，0.2-0.6mM氧化型还原剂，0.5-3mM EDTA，0.05-0.2% TritionX-100，PH 7.0-8.5。

2.如权利要求1所述的纯化和复性方法，其特征在于，在步骤a)中，所述诱导表达包括在培养温度35~38℃、转速200~250rpm条件下培养宿主细胞，当OD600值达到0.8时用IPTG诱导，形成包涵体。

3.根据权利要求2所述的纯化和复性方法，其中所述IPTG的浓度为0.4-1.2mM。

4.根据权利要求3所述的纯化和复性方法，其中，所述IPTG的浓度为0.6-1.0mM。

5.如权利要求1-3中任一项所述的纯化和复性方法，其特征在于，所述方法还包括步骤e)活性检测，所述活性检测包括亲和力检测。