CN116640743B

CN116640743B - 一种核酸内切酶及其应用

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Publication number: CN116640743B
Application number: CN202310905132.8A
Authority: CN
Inventors: 周家杰; 冉冬; 高展; 刘懿; 张秋磊; 张建军; 夏文娟; 张维
Original assignee: Leto Laboratories Co Ltd
Current assignee: Leto Laboratories Co Ltd
Priority date: 2023-07-24
Filing date: 2023-07-24
Publication date: 2023-11-07
Anticipated expiration: 2043-07-24
Also published as: CN116640743A

Abstract

本发明提供了一种核酸内切酶突变体，包括：(a)所述核酸内切酶突变体与SEQ ID NO.1所示氨基酸序列相比，含有如下至少一个位点：T43、G67、Q69、W89、Q99、G101、G132、S135、N136、F137、S140、N143、S145、F149、Q152、A154、Q169、N188或G222，经过氨基酸突变且具有核酸内切酶活性功能的蛋白质；或(b)所述核酸内切酶突变体与(a)所示的氨基酸序列经过一个或几个保守氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加具有相同功能的氨基酸序列。本发明得到的核酸内切酶突变体具备耐受更高盐浓度的能力，并且在低温和室温环境中具有较高活性。

Description

一种核酸内切酶及其应用

技术领域

本发明涉及核酸酶技术领域，尤其涉及一种核酸内切酶及其应用。

背景技术

近年来随着生物技术的发展，越来越多的抗体，重组蛋白，重组蛋白疫苗、病毒载体疫苗、细胞治疗和基因治疗药物等生物制品进入治疗领域，生物制品的质量控制也日趋严格。宿主核酸残留具有多种生物安全风险，过量的宿主核酸残留可能会导致机体感染，致瘤，引发免疫副反应，基因转座和重组等，因此宿主核酸残留成为了生物制品质控的重中之重。我国药典中明确规定酵母和大肠杆菌表达的生物制品中DNA残留量不超过10 ng/剂量。2020年我国药典将人用狂犬病疫苗（Vero细胞）DNA残留标准更新为≤3 ng/剂量。除了残留量的规定，FDA、CDE发布的相关指导文件中建议残留的细胞宿主DNA片段不能超过一个功能基因的长度（约200 bp）。因此在生物制品生产工艺中必须含有去除核酸的步骤并进行检验验证，以确保生物制品中的核酸残留满足相应法规的要求。常用的去除核酸的方法如沉淀法，因为会发生聚集和包裹现象，影响去除效率，在核酸残留要求较高时难以达到标准。为了实现生物制品中核酸残留量的控制，近年来各类核酸酶已被广泛用于生物制品的纯化工艺中并取得了良好的效果。

核酸酶是一种能够将聚核苷酸链的磷酸二酯键切断的酶，核酸酶属于水解酶，作用于磷酸二酯键的P-O位置。不同来源的核酸酶，其专一性、作用方式都有所不同。有些核酸酶只能作用于RNA，称为核糖核酸酶（RNase），有些核酸酶只能作用于DNA，称为脱氧核糖核酸酶（DNase），有些核酸酶专一性较低，既能作用于RNA也能作用于DNA，因此被称为非特异性核酸酶。根据核酸酶作用的位置不同，又可将核酸酶分为核酸外切酶（Exonuclease）和核酸内切酶（Endonuclease）。

目前市面上主流的商业化核酸酶主要为Benzonase (粘质沙雷菌Serratiamarcescens核酸酶)、Omnicleave (Epicentre)或DNA酶I。Benzonase和Omnicleave是全能核酸酶可以消化DNA和RNA，而DNA酶I只能消化DNA。通常情况下，核酸酶在低于100 mM NaCl的条件下具有较高的核酸酶活性，当盐浓度高于100 mM后，酶活性显著降低。核酸酶具有广泛的用途，例如Benzonase 全能核酸酶的主要应用如下：1）病毒疫苗、细胞和基因治疗用病毒载体、溶瘤病毒中核酸的去除；2）去除蛋白质等生物制品中的核酸；3）降低核酸引起的粘度；4)可加入细胞培养基，防止细胞聚集；5）降低大肠杆菌细胞裂解液的粘度以提高过滤性；6）颗粒(病毒、包涵体等)的预处理；7）ELISA、柱层析、双向电泳和western blot分析的样品制备，核酸酶处理后可提高分辨率和回收率。利用核酸酶可以高效的去除生物制品中的核酸残留，但是目前主流的核酸酶在较高盐浓度下活性高度受抑制甚至失活，无法满足需求。因此，开发一种耐盐的高效的核酸酶对于生物样品中宿主核酸残留的去除具有重要的意义，具有高耐盐性的核酸酶可以更广泛地应用于基因工程，生物大分子生产，特别是核酸药物的生产。市售核酸酶一般为酵母表达或者大肠杆菌上清表达，生产工艺复杂，成本较高。

蛋白质对盐浓度的耐受是多方面因素影响的。其中蛋白表面理化性质的改变会显著影响蛋白质对盐浓度的耐受，蛋白表面变化趋势包括等电点降低、疏水性降低、热容增加、可压缩性降低和柔韧性参数增加等。

目前，对嗜盐菌蛋白质的序列分析发现嗜盐蛋白中带负电荷的氨基酸有统计学上的增加。Asp和Glu的富集导致等电点的降低，而赖氨酸则相对减少。酸性氨基酸在表面的积累是适应高盐度的酶的最显著特征，这种酸度的增加也被认为可以防止蛋白自身聚集。此外，酸性氨基酸的增加也促进了蛋白溶解度，且负电荷之间的排斥力为高盐浓度下的蛋白质功能提供了灵活性。研究发现碳酸酐酶II和胆碱激酶在表面进行酸性氨基酸替代后，其耐盐性得到了显著的提高。

然而，除了蛋白表面酸性氨基酸的增多，碱性氨基酸的增加也被报道可以增强蛋白的耐盐性。在盐度为3.5%的海水中，含有约470 mM Na⁺和540 mM Cl^-。因此，大多数海洋原核生物可以被认为是轻微的嗜盐生物，它们的质周/细胞外蛋白均暴露在外界较高的盐浓度环境中。弧菌属于革兰氏阴性细菌主要分布在江河湖口及海洋环境中，在盐度2-4%的环境中生长良好，在无盐环境中无法生长。研究发现来源于海洋细菌嗜鲑弧菌的核酸内切酶I（VsEndA）相较于来源于咸水细菌霍乱弧菌的同源核酸内切酶I（VcEndA），VsEndA展现出对较高盐浓度的适应性。VsEndA在425 mM NaCl的盐浓度时具有最高的核酸酶活性，在600 mM盐浓度下仍然有60%左右的活性。相比之下VcEndA只有在200 mM盐时才具有最高的活性，在500 mM盐的条件下VcEndA的活性仅存10%。VsEndA与VcEndA的蛋白结构高度相似，但VsEndA表面带正电荷的氨基酸显著增加，例如赖氨酸和精氨酸。研究人员推测VsEndA表面正电荷的增加，可以与高盐环境中的Cl^-相互作用从而稳定蛋白自身的结构，此外VsEndA表面更多的正电荷也有利于与带负电荷的DNA相互作用。

虽然VsEndA展现出良好的耐盐性能，但是在溶液中的盐浓度超过500 mM以后酶活性急剧下降，在700 mM的盐浓度下酶活性仅存约30%，仍然不能满足生物制品生产时的耐高盐需求。因此，亟需一种耐盐性能更好的核酸酶。

发明内容

针对现有技术中所存在的不足，本发明提供了一种核酸内切酶及其应用。其解决了现有技术中存在的耐盐性能不高，不能满足生物制品生产时的耐高盐需求的问题。

本发明一方面，提供一种核酸内切酶突变体，包括：(a)所述核酸内切酶突变体与SEQ ID NO.1所示氨基酸序列相比，含有如下至少一个位点：T43、G67、Q69、W89、Q99、G101、G132、S135、N136、F137、S140、N143、S145、F149、Q152、A154、Q169、N188或G222经过氨基酸突变且具有核酸内切酶活性功能的蛋白质；或

(b)所述核酸内切酶突变体与(a)所示的氨基酸序列经过一个或几个保守氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加具有相同功能的氨基酸序列。

进一步地，所述核酸内切酶突变体包含选自下组的至少一个位点取代：T43E、G67E或G67K、Q69E、W89D、Q99K、G101K、S135K、N136R、F137E、S140E、N143D或N143K、S145D、F149D、Q152K、Q169D、N188E、G222E或G222K。

进一步地，所述核酸内切酶突变体包括如下所示的任一种氨基酸突变：

G67E+Q69E+S140E+N143D+S145D+F149D+Q169D+N188E+G222E；

Q69E+S140E+N143D+G222E；

G67K+N143K+Q152K+G222K；

T43E；

F137E；

W89D+N136R；

Q99K+G101K+S135K。

本发明第二方面，提供一种DNA分子，所述DNA分子编码上述核酸内切酶突变体。

进一步地，所述DNA分子的核苷酸序列对应的氨基酸序列包括SEQ ID NO.2-7所示。

本发明第三方面，提供含有上述DNA分子的重组载体、表达盒或宿主细胞。

本发明第四方面，提供一种试剂盒，包括上述核酸内切酶突变体。

本发明第五方面，提供一种切割核酸的方法，利用上述核酸内切酶突变体、DNA分子、重组载体、表达盒或宿主细胞。

本发明第六方面，提供一种制备上述核酸内切酶突变体的方法，培养上述宿主细胞，并从培养物中得到核酸内切酶突变体；优选地，所述宿主细胞包括大肠杆菌。

本发明第七方面，提供上述核酸内切酶突变体、上述DNA分子、上述重组载体、表达盒或宿主细胞、上述试剂盒在去除生物制品残留核酸中的应用。

术语“生物制品”是指应用普通的或以基因工程、细胞工程、蛋白质工程、发酵工程等生物技术获得的微生物、细胞及各种动物和人源的组织和液体等生物材料制备的，包括菌苗，疫苗，毒素，类毒素，免疫血清，血液制品，免疫球蛋白，抗原，变态反应原，细胞因子，激素，酶，发酵产品，单克隆抗体，DNA重组产品，体外免疫诊断制品等。

术语“试剂盒”是指由可用于检测化学成分、药物残留、病毒种类等的化学试剂组成的盒子。

由于野生型VsEndA蛋白的前21个氨基酸是信号肽，生物体内合成的蛋白会自动切除信号肽，所以在重组表达时，从第22位开始表达，本发明中SEQ ID NO.1为切除信号肽的VsEndA蛋白，因此，第一个氨基酸从22开始编号。

本发明的技术原理为：本发明基于计算机辅助设计的方法，在不影响VsEndA整体结构稳定性的情况下进行改造，在其表面特定的位点进行多个极性氨基酸替代，降低VsEndA表面的疏水性和电中性。经过计算机的虚拟筛选和实验最终验证，合理的氨基酸替代改变了蛋白表面带电性，疏水性和稳定性，从而使VsEndA具备耐受更高盐浓度的能力，并且在低温和室温环境中具有较高活性。此外，本发明的核酸酶均是以包涵体形式在在大肠杆菌中表达，并通过定向变复性技术得到最终产物。

相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：

（1）本发明通过对VsEndA进行点突变，得到了新的高耐盐性和低温活性的核酸酶。筛选得到的核酸酶在700 mM的NaCl环境下达到最高酶活，在400-900 mM的NaCl环境中能保持较高的核酸酶活性，基本覆盖了生物制品生产过程中的高盐环境。改造后的分子在低温和室温环境中仍然保持较高的生物活性，并在25℃时达到酶活的最大值，也恰好适配生物制品生产的环境温度。

（2）本发明的新的核酸酶均由大肠杆菌表达成包涵体，通过蛋白质变复性方法纯化得到高活性核酸酶，生产工艺简单，生产成本低廉，具备成本优势。

（3）本发明的核酸酶是一种新的全能核酸酶，不仅作用于DNA还可以作用于RNA，底物具有广泛性和普适性，具有巨大的经济效益。

附图说明

图1为本发明实施例1中三种同源核酸酶的氨基酸序列和三维结构比对图；

图2为本发明实施例1中VsEndA的表面电势分析图；

图3为本发明实施例2中VsEndA及其突变体的大肠杆菌表达电泳图，其中，T表示全菌，S表示上清液，P表示沉淀；

图4为本发明实施例2中VsEndA及其突变体纯品电泳图；

图5为本发明实施例3中不同核酸酶在不同盐离子浓度下的酶活检测结果图；

图6为本发明实施例4中1527在不同温度下的酶活检测结果图；

图7为本发明实施例5中1527对DNA和RNA的酶切效果图。

具体实施方式

下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。

除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。

实施例1 基于计算机辅助设计的蛋白结构改造和突变体筛选

1、嗜盐微生物的筛选

(1)不同嗜盐微生物的氨基酸序列和三维结构比对

选取三种不同嗜盐弧菌的核酸酶VnnEndA（vibrio vulnificus），VcEndA（Vibriocholerae）和VsEndA（Vibrio salmonicida）作为研究对象，对三种核酸内切酶Ⅰ进行氨基酸序列比对和蛋白三维结构比对，结果如图1所示。

由图1可以看出，用Clustal Omega对三种核酸酶进行同源序列比对，三种的核酸酶具有高度的序列同源性（同源性高达75%），其中与金属离子相互作用和活性相关的关键氨基酸均保持一致。三者的三维结构同样具有很高的相似性，整体均呈现为一种带有缺口的球形，缺口区域为酶活中心。三种核酸酶结构整体都较为刚性，含有大量的α螺旋和两对小β片层，其中有四对二硫键。酶活中心位于由α螺旋和β片层组成的狭长区域，金属离子也位于其中。以VsEndA为例，保守的His84和Arg103对酶活性至关重要。特别的，Asp40–Arg216, Glu81–Arg76, Glu83–Arg134, Glu117–Arg103和Glu210–Arg176五对盐键在三种耐盐弧菌的核酸酶中高度保守，对维持核酸酶整体结构的稳定性具有重要意义。

(2)三种核酸酶的表面氨基酸比对

在PyMOL中对三种核酸酶的表面氨基酸进行分析，发现VsEndA表面相较于其他两种核酸酶出现大量的碱性氨基酸替代，使得VsEndA表面带有大量的正电荷，一方面有助于VsEndA的溶解度提升和抑制自身聚集，另一方面有助于VsEndA与DNA的结合以及与高盐溶液中Cl^-相互作用维持自身结构稳定。

由于VsEndA的耐盐性明显优于其他两种核酸酶，因此选取VsEndA为研究对象，对其进行进一步的改造。

2、VsEndA的改造

通过降低蛋白表面的疏水性和电中性，对VsEndA进行点突变。

(1)VsEndA的表面电势分析

VsEndA的表面电势分析如图2所示。由图2可看出，VsEndA的酶活中心区域富含赖氨酸和精氨酸，带有强烈的正电荷，有利于带有负电荷的DNA靠近活性中心。活性中心的背面区域出现许多带有负电荷的酸性氨基酸，有利于与高盐环境中的Na⁺相互作用，促进整体结构的稳定性。VsEndA表面电荷的分布具有明显的两面性，即活性中心带正电，非活性中心带负电，具有广阔的改造空间。

(2)VsEndA的氨基酸突变位点的选择

为了不影响VsEndA的酶活和结构稳定性，对VsEndA进行改造时选取远离活性中心的柔性区域进行改造，结合同源序列比对中保守性相对较低的区域，最终选取出T43, G67,Q69, W89, Q99, G101, G132, S135, N136, F137, S140, N143, S145, F149, Q152,A154, Q169, N188, G222等位点进行突变体的筛选。

(3)VsEndA突变体的筛选

在挑选突变体时，对不同突变位点进行合理的极性氨基酸替代，设计出若干不同的突变体。首先用计算机模拟突变后自由能的变化，选取突变后自由能变小或者轻微升高的突变体，以减小氨基酸替换对结构整体稳定性的影响。进一步采用同源建模的方法分别模拟出不同突变体的三维结构，并在一定的力场中对预测出的结构构象进行优化。最后采用分子对接的方法对各个突变体与来自VnnEndA晶体结构（PDB ID：1OUP）中的DNA进行分子对接，挑选出与DNA结合的空间构象合理且亲和力较高的突变体。筛选出的VsEndA突变体如表1所示。

表1 不同突变体的氨基酸突变信息

实施例2 VsEndA及其突变体质粒构建、蛋白表达与纯化

1、质粒构建

在本专利中，对野生型VsEndA进行如表1的多种突变组合后得到7个不同的突变体，分别为1525 (Q69E, S140E, N143D, G222E)，1526 (G67E, Q69E, S140E, N143D,S145D, F149D, Q169D, N188E, G222E)，1527 (G67K, N143K, Q152K, G222K)，1692(T43E)，1699 (F137E)，1700 (W89D, N136R)和1701 (Q99K, G101K, S135K)，每个分子的具体氨基酸序列信息如表2所示。来自海洋细菌嗜鲑弧菌VsEndA的前面21个氨基酸为信号肽，所以本实施例合成的野生型VsEndA是从第22位丙氨酸开始的。

委托北京擎科生物科技有限公司合成VsEndA（下文中标记为WT）及其突变体（1525, 1526, 1527, 1692, 1699, 1700, 1701）的基因序列。按照《分子克隆》中的操作方法，PCR得到目的片段。然后将目的片段与通用载体pET28a重组连接、转化、测序和保菌，从而得到能够表达相应蛋白质粒。按照《Qiagen Mini-prep Kit》中的操作方法，对核酸内切酶进行质粒制备。

表2 Endonuclease氨基酸序列表

2、蛋白表达

将上述构建成功的质粒转化至大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）中，从平板上挑取单克隆菌落按1: 50的体积比转接到含Kana 抗性的500 mL TB培养基的三角瓶中，初始OD600大约为0.1，37℃，220 rpm，培养至OD600为2.0 ，加入终浓度为0.5 mM的IPTG，37℃、220rpm培养4 h后收菌。使用SDS-PAGE检测蛋白表达情况，如图3所示。

由图3可知，所有蛋白均以包涵体（inclusion body）的形式成功表达，且表达量较高。

3、菌体破碎回收包涵体

菌体经高压破碎，洗涤后回收包涵体，为下一步的蛋白复性做准备。菌体破碎时使用的缓冲液为20 mM Tris, pH 8.0, 0.5 M NaCl。

4、蛋白纯化

(1)蛋白复性

步骤3中的包涵体使用10倍（v/w）体积的变性液（8 M Urea, 50 mM Tris, pH9.0)在室温下溶解，30分钟后加入DTT，继续还原30分钟。变性液使用12000 g离心，将上清液滴入50倍体积的复性液中（20 mM Tris, 0.5 M arginine, 2.5 mM Cysteine, pH8.0），在室温下搅拌过夜，第二天质谱检测复性效果。

(2)蛋白纯化

将步骤(1)中复性的蛋白用盐酸调整pH至7.5，电导用去离子水稀释至10 ms/cm以下，离心后上清直接流经SPHP柱(GE公司)进行捕获。

操作如下：纯化前用5倍柱体积的平衡液(20 mM Tris, pH 7.5）平衡SPHP柱；将复性液流经柱子，再用5倍柱体积的平衡液清洗柱子，去除非特异性结合蛋白；用15倍柱体积的洗脱缓冲液(20 mM Tris, pH 7.5, 1 M NaCl)线性梯度洗脱，收集含目标蛋白的洗脱液，得到酶溶液。

最终产物如图4所示，在经过SPHP的纯化后，8种目标蛋白的条带清晰，纯度较高，仅1526的产率和纯度稍差。

实施例3 不同盐浓度下突变体酶活检测

以市售Benzonase和WT为对照，检测各个突变体在不同盐离子浓度下的核酸酶活性。具体检测方法如下：

首先，将小牛胸腺 DNA溶解在5 mM MgCl₂, 0.1 mg/ml BSA, 50 mM Tris, pH8.0中，最终浓度为0.1 mg/ml。取2.5 ml的DNA样品，根据设置的盐浓度加入一定量的NaCl和0.125 ml实施例2获得的酶溶液，对照组加0.125 ml 1×PBS, 混匀后置于37℃水浴中，分别于15 min, 30 min, 45 min和60 min取样。每步反应结束后取0.5 ml反应后的产物，加入0.5 ml的4%高氯酸溶液，混匀后，冰上孵育30 min。14000 rpm离心最终的反应物后，在260 nm下（紫外分光光度计）测定上清的OD值，并计算出酶活。

计算公式为：

△A: 测量溶液在时间t时的吸光度。t: 测量溶液的反应时间

结果如图5所示，Benzonase在低于100 mM NaCl的条件下具有较高的核酸酶活性，当盐浓度高于100 mM后，酶活性显著降低，当盐浓度达到300 mM以上，Benzonase基本无活性。相比之下，WT在400 mM的盐浓度下表现出了最强的核酸酶活性，随着反应体系中盐浓度的提高，酶活性逐步降低。1525和1527展现出了更优的耐盐能力，1525在400-800 mM的盐浓度范围内具有较高的核酸酶活性，且最适盐浓度为600 mM，而1527在500-800 mM的盐浓度范围内有较高的活性，且最适的盐浓度为700 mM。经过改造后，1525和1527对NaCl的耐受能力得到显著提高，达到了生物制品生产时的耐盐要求。

实施例4 不同温度下酶的活性

在实际的生物制品生产过程中，生物制品一般处于室温环境中。室温条件下核酸酶的活性显著地影响了最终产品的核酸残留。常规核酸酶通常在37-42℃时具有较高的酶活，在室温环境下，酶活性大大降低。基于现实生产的需求，本实施例中检测了1527在较低的温度下核酸酶的活性，实验的NaCl浓度选择为700 mM，实验方法与实施例3基本一致。实验结果如图6所示。

由结果可知，在低温下，1527较为稳定，保持了一定的核酸酶活性。随着温度的升高，在25℃（接近室温）的条件下1527展现出最高的酶活，进一步提高反应温度，1527的活性逐步下降。由此可见，在室温条件下，1527的活性最高，非常符合实际生产的需求，有利于在工业生产中大规模应用。

实施例5 1527对DNA和RNA的核酸酶活性

在5 mM MgCl₂, 0.7 M NaCl, 20 mM Tris, pH 8.0的反应体系中，用1527消化5µg DNA和5 µg RNA。室温反应30 分钟后，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果。结果如图7所示。

由结果可知，与对照组相比在1527可以将DNA和RNA完全酶切去除。1527核酸酶为全能性酶，使用范围更广泛。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims

1.一种核酸内切酶突变体，其特征在于，所述核酸内切酶突变体的氨基酸序列如SEQID NO.6所示。

2.一种DNA分子，其特征在于，所述DNA分子编码权利要求1所述的核酸内切酶突变体。

3.含有权利要求2所述DNA分子的重组载体、表达盒或宿主细胞。

4.一种试剂盒，包括权利要求1所述的核酸内切酶突变体。

5.一种切割核酸的方法，其特征在于，利用权利要求1所述的核酸内切酶突变体、权利要求2所述的DNA分子、权利要求3所述的重组载体、表达盒或宿主细胞对核酸进行切割。

6.一种制备权利要求1所述核酸内切酶突变体的方法，其特征在于，培养权利要求3所述宿主细胞，并从培养物中得到核酸内切酶突变体。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞包括大肠杆菌。

8.权利要求1所述核酸内切酶突变体、权利要求2所述DNA分子、权利要求3所述重组载体、表达盒或宿主细胞、权利要求4所述试剂盒在去除生物制品残留核酸中的应用。