CN104245928A

CN104245928A - 核酸内切酶

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Publication number: CN104245928A
Application number: CN201380009915.2A
Authority: CN
Inventors: 奥拉夫·拉纳; 琳达·哈夫达伦; 泰雷斯·索尔斯塔德; 马里特·洛伦森; 比约恩·阿尔特马克; 因加尔·莱罗斯; 罗尼·赫兰
Original assignee: Biotec Pharmacon ASA
Current assignee: Arcticzymes Technologies ASA
Priority date: 2012-02-17
Filing date: 2013-02-18
Publication date: 2014-12-24
Anticipated expiration: 2033-02-18
Also published as: EP2814954A1; LT2814954T; US20140370514A1; WO2013121228A1; US20160355798A1; CA2863756C; JP2015507927A; DK2814954T3; KR102111178B1; ES2622906T3; JP2018038414A; KR20140135962A; EP2814954B1; AU2013220102A1; US9422595B2; CN104245928B; CA2863756A1; US9650618B2; IN2014MN01822A; JP6259775B2

Abstract

本发明提供了核酸内切酶I或其酶促活性片段，以及编码这些酶的核酸分子和使用这些酶从样品中去除污染多核苷酸的方法，其中所述核酸内切酶I具有SEQ ID No.4的序列或与之至少70％相同的序列，并且其中FYCGC五肽基序紧N末端的氨基酸残基已由带负电的残基置换。

Description

核酸内切酶

技术领域

本发明涉及特别显示不耐热特性的、通过温和处理条件失活的核酸内切酶。本发明还包含通过使用此类核酸内切酶从生物制剂中去除污染多核苷酸。本发明还涉及通过使用核酸内切酶阻止核酸扩增反应、特别是涉及聚合酶链反应(PCR)设置的扩增反应中的假阳性结果。

背景技术

核酸且尤其是基因组DNA，通常在细胞培养、细胞裂解产物以及蛋白质纯化和分析中造成问题，因为它在样品中产生粘度或干扰纯化、下游分析或应用。DNA和核酸的去除可在物理上、化学上或酶促完成。DNA和RNA的酶促去除可通过添加核酸酶来实现。然而，核酸酶通常未能降解复杂生物样品中的DNA，因为DNA与蛋白质或其他分子结合，从而保护其不受酶促降解。氯化钠通常加入典型细胞裂解缓冲液中，以限制蛋白质-DNA相互作用，并且因此促进下游蛋白质纯化中的DNA去除。不幸的是，大多数核酸酶在适度盐浓度下变得高度受抑或失活，从而通常使得酶促去除无效。因此，从蛋白质、试剂或生物样品中去除所有痕量DNA通常是麻烦的。

存在在细胞裂解产物、蛋白质纯化中和分析步骤前酶促去除核酸的几种商业替代方案，例如Benzonase(粘质沙雷菌(Serratia marcescens)核酸酶)、Omnicleave(Epicentre)或DNA酶I。然而，不存在可通过适度热处理失活的选项。为了在使用后去除上述酶，通常需要多种树脂、抑制剂或柱纯化步骤。这使得酶促方法更难以使用，因为需要另外的试剂或纯化步骤以在使用后去除核酸酶。这是更耗时的并且可导致目的蛋白质的更低得率。

在蛋白质纯化中或从试剂中去除痕量DNA的问题在商业聚合酶和主要混合物中通常发现的内源DNA中是显而易见的。此外，用于分子生物学应用(例如PCR和测序)和分子诊断学的试剂必须不含污染DNA和核酸酶两者。与在使用后去除上述核酸酶相关的困难使得它们较不适合于清除用于DNA技术的试剂。

核酸扩增技术例如PCR是生物技术中可获得的最有力工具之一，允许由仅含少量核酸的样品制备大量靶序列拷贝。在PCR的情况下，将与其双链靶序列的各自链互补的寡核苷酸引物加入含有靶序列和游离核苷酸的反应混合物中。在DNA聚合酶的存在下的热循环导致在引物之间的序列扩增。由PCR过程产生的扩增片段充当后续PCR循环的模板的能力导致相当大数量的靶序列的快速产生。

对核酸污染的有害效应特别敏感的扩增反应是定量PCR(qPCR)技术，因为这些具有定量反应中的少于20个DNA序列拷贝的能力。因此，即使最小水平的核酸污染也在qPCR技术中给出假结果。另外，这些方法需要检测超过不可避免的本底信号的来自扩增的靶核酸的信号。污染核酸可促成该本底信号，并且因此降低技术的灵敏度。像这样，使污染核酸降到最低使定量PCR实验的灵敏度达到最大。在其中检测小数目的靶核酸拷贝的实验中，例如基于定量PCR的病原体诊断和病原体负荷定量，最重要的是定量PCR的灵敏度达到最大并且假阳性降到最低。在其中通过qPCR技术靶向高度保守的细菌DNA区段(例如16SrRNA或23SrRNA基因)的细菌鉴定和诊断领域中，起于DNA聚合酶制剂的核酸污染(其通常得自细菌和细菌表达系统)是主要问题。因此需要有效去除来自DNA聚合酶制剂的细菌核酸污染物的方法。尤其寻求的是可实现这点而对下游扩增反应没有有害影响并且不损害聚合酶的方法。

已提出个别PCR反应混合物可在添加靶DNA和Taq DNA聚合酶前使用核酸内切酶进行处理，所述核酸内切酶对靶序列内部切割，因此阻止污染DNA的扩增(Furrer等人Nature.第346卷，第324页，1990)。该方法要求30分钟的去污时间，并且为了使去污后的核酸内切酶失活，将反应混合物煮沸。由于该煮沸步骤，需要在去污后加入DNA聚合酶。当然，这代表将携带污染引入扩增前混合物内的进一步危险，并且妨碍DNA聚合酶自身的去污。

特异性破坏DNA的不耐热的核酸内切酶(DNA酶)已得到描述。WO 99/007887公开了从北极甜虾(Pandalus borealis)中分离的DNA酶，所述DNA酶在94℃下2分钟后基本上不可逆地失活。该相同酶还在65℃下15分钟后基本上不可逆地失活。然而，这些温度对于某些应用太高，并且另外希望去除污染RNA和单链DNA(ssDNA)。

核酸内切酶I是已知以序列不依赖性方式切割RNA和DNA两者的≈25 kDa周质或细胞外单体酶。它在许多不同的变形菌门(Proteobacteria)和纤维杆菌属(Fibrobacter)中发现。结构具有混合的α/β拓扑学，含有九条β链、五条短螺旋和五条长螺旋。它能够切割质粒和ssDNA。它在磷酸二酯键的3'侧处切割。

不耐热的核酸内切酶已在本领域中由Altermark等人(FEBS Journal；2007,274:252-263)进行描述。他们描述了从嗜冷菌杀鲑弧菌(Vibrio salmonicida)中分离的核酸内切酶I(VsEndA,SEQ ID NO:1)。与在相同条件下从嗜中温菌霍乱弧菌(Vibriocholerae)中分离的核酸内切酶I(VcEndA,SEQ ID NO:3)中发现的几乎100％活性相比较，发现该酶在50℃的温度下具有小于20％活性(与该酶的最佳活性相比较)的酶促活性。此外，在70℃下的不可逆解折叠率对于VsEndA高于VcEndA。

由于细菌杀鲑弧菌和霍乱弧菌的轻度嗜盐特征，已报道上文描述的VsEndA和VcEndA在高盐度的溶液中更有酶促活性。Niiranen等人(FEBS Journal；2008,275:1593-1605)显示催化常数(k_cat)对于VcEndA和VsEndA酶分别在0.25M和0.5M的盐浓度下达到峰值。

可在温和温度下失活并且不会有害地影响蛋白质或制剂中的其他目的分子的活性的核酸内切酶，将提供用于从生物制剂中去除污染多核苷酸的高度有效和高效的方法。理想地，该核酸内切酶还能够耐受含有高水平盐度的制剂，因为氯化钠通常加入制剂中，以便限制DNA-蛋白质相互作用并在添加核酸内切酶后产生更纯的蛋白质样品。然而，不存在具有这些特性的目前可获得的核酸内切酶。

不被温度的变化逆转的核酸酶的失活对于制剂是尤其重要的，所述制剂待用于可在室温下进行的进一步方法中，或包括具有室温组分的循环。简单不耐热性，即在比现有酶更低的温度下解折叠，是不足够的。在温和条件例如低温下失活需要与在初始合成时正确折叠的蛋白质的合理得率组合，以便提供有用的酶。

发明内容

本发明人已惊讶地发现在VsEndA酶的氨基酸序列中的简单点突变，导致即使在高盐度的制剂中也保持酶促活性并且在温和条件下仍可被失活的酶。其置换导致具有令人惊讶和有利特性的酶的残基是在第44位处发现的丝氨酸残基。该丝氨酸残基位于高度保守的五肽基序(苯丙氨酸-酪氨酸-半胱氨酸-甘氨酸-半胱氨酸、或Phe-Tyr-Cys-Gly-Cys或FYCGC)的紧N末端。野生型(wt)VsEndA的序列由SEQ IDNO:1表示并且显示于图1中。编号(44)包括N末端信号肽，所述信号肽在从细胞质到周质的转运过程中被切割。信号序列未显示于图3和4中，并且那些图中的编号相应地加以调整。

根据Altermark等人(Biological Crystallography；2006,D62,1387-1391)的发现，已测定该丝氨酸残基与埋入的氯离子构成复合物的一部分。该丝氨酸残基可在不同位置中发现，取决于核酸内切酶I源自其的细菌物种(例如VcEndA中的等价丝氨酸残基在第42位处发现，并且源自创伤弧菌(V.vulnificus)的核酸内切酶I中的等价丝氨酸残基在第41位处发现)。根据研究源自弧菌属(Vibrio)的多种细菌的核酸内切酶的序列，已发现在第40至50序列位置处与氯离子相互作用的氨基酸不一定是丝氨酸。例如在源自弗利斯弧菌(V.furnissii)的核酸内切酶中，等价氨基酸是苏氨酸。

本发明人已发现该丝氨酸残基由带负电的残基或另一种极性残基替换导致具有上述特性的酶。

因此，根据本发明，提供了核酸内切酶I或其酶促活性片段，所述核酸内切酶I具有SEQ ID No.1的序列或与之至少60％相同的序列，但其中FYCGC五肽基序紧N末端的氨基酸残基已由带负电或极性的残基置换，当在10mM二硫苏糖醇(DTT)的存在下在30℃下温育15分钟时，所述核酸内切酶I或其酶促活性片段基本上(不可逆地)失活。

作为另外一种选择，本发明提供了核酸内切酶I或其酶促活性片段，所述核酸内切酶I具有SEQ ID No.1的序列或与之至少60％相同的序列，但其中FYCGC五肽基序紧N末端的氨基酸残基已由带负电或极性的残基置换，其中当在10mM DTT或10mM三(2-羧乙基)膦(TCEP)的存在下在4℃下温育6小时时，所述核酸内切酶I或其酶促活性片段基本上(不可逆地)失活。应当理解适当的失活条件是温度、温育时间和任何加入的化学失稳剂浓度的反映。上述条件提供了限定本发明的酶的测试，并且条件和完全测定方案的进一步设置在实例中描述。

另外看来，本发明首次提供了核酸内切酶I或其酶促活性片段，当在10mM DTT的存在下在30℃下温育15分钟时、或当在10mM DTT或10mM TCEP的存在下在4℃下温育6小时时，所述核酸内切酶I或其酶促活性片段基本上(不可逆地)失活。

因此，虽然提供失活的条件可改变，但优选置换的性质是相同的，并且因此另外看来，本发明提供了核酸内切酶I或其酶促活性片段，其与SEQ ID No.1或4至少70％、优选至少80％、90％、95％或98％相同，但其中FYCGC五肽基序紧N末端的氨基酸残基已由或带负电或极性的残基置换。

带负电或极性的残基可以是遗传编码的或并非遗传编码的。优选地，引入的氨基酸是带负电的。在氨基酸的背景下的极性和电荷以及特别是其侧链官能团是本领域众所周知的，并且通常在正常生理条件下进行评估。

FYCGC五肽基序紧N末端的氨基酸残基的“置换”意指该残基替换为不同氨基酸，通常为遗传编码的，但可能是非遗传编码的氨基酸或氨基酸衍生物。优选地，通常为丝氨酸的残基替换为带负电的氨基酸，例如谷氨酸或天冬氨酸，或另一种极性氨基酸例如苏氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺。作为另外一种选择，所述氨基酸残基替换为其为或带负电或极性的非遗传编码的氨基酸。优选的非遗传编码的氨基酸是谷氨酸衍生物例如4-氟-DL-谷氨酸、γ-羧基-DL-谷氨酸和D-2-氨基己二酸。在最优选的实施例中，FYCGC五肽基序紧N末端的氨基酸残基替换为谷氨酸。

在优选实施例中，当在0.5mM TCEP的存在下在50℃下温育30分钟时，本发明的核酸内切酶I或酶促片段是基本上失活的，并且残留活性在0.5mM TCEP的存在下进行评估；优选地，核酸内切酶I或其酶促活性片段在这些条件下是不可逆地失活的。

在进一步方面，本发明包括从样品中去除污染多核苷酸的方法，其包括使用上文描述的核酸内切酶。该方法通常包括使样品与如上文定义的核酸内切酶接触。

在优选实施例中，样品是含有目的蛋白质例如重组产生的目的蛋白质例如酶的制剂。作为另外一种选择，目的蛋白质可以是希望从原材料中纯化的分析物或其他蛋白质。制剂可以是或源自细胞裂解产物或组织样品或体液。

目的蛋白质可以是抗体或抗体片段。蛋白质(例如抗体)可用于诊断或治疗方法中。因此，上文描述的方法可用于确保诊断或治疗蛋白质不含污染多核苷酸，使得它对于施用可以是安全的。

目的蛋白质可以是DNA结合蛋白或与溶液中的核酸结合的其他蛋白质。特别地，对于其可方便地使用盐以使目的蛋白质与核酸分离的此类蛋白质给予观察到的本发明的核酸内切酶在盐的存在下起作用的能力。

本发明的核酸内切酶在50mM～1M、优选约500mM的盐(例如氯化钠或氯化钾)浓度下可以是特别有效的。许多核酸酶在通常加入细胞裂解和纯化缓冲液中的高氯化钠浓度下受抑，并且本发明的核酸内切酶的耐盐性是特别的优点。优选地，本发明的核酸内切酶在0.5M氯化钠或氯化钾下具有最佳催化活性(如本文评估的)，或在该盐浓度下具有的活性不小于60％、优选不小于75％的在最佳盐浓度下显示出的活性。“最佳盐浓度”是在其下酶具有其最高催化活性的氯化钠浓度。另外看来，当氯化钠的浓度为0.35-0.65M、优选0.45-0.55M、更优选约0.5M时，本发明的核酸内切酶具有最佳催化活性。

在另一个实施例中，生物制剂是试剂溶液，例如多核苷酸分析技术例如PCR、DNA/RNA测序或微阵列中使用的试剂溶液。试剂溶液可包含非蛋白质组分或混合物、例如PCR主混合物或缓冲溶液，或由非蛋白质组分或混合物、例如PCR主混合物或缓冲溶液组成。上文描述的核酸内切酶可用于去除来自试剂的任何多核苷酸污染，被失活，并且随后将所述试剂应用于含有目的多核苷酸的样品，因此减少通过添加所述试剂引入样品中的污染的可能性。

本发明具有在阻止或限制关于多核苷酸的污染、且特别是在阻止或减少由于扩增试剂和酶中的内源多核苷酸的假阳性结果并减少本底(阳性无模板对照)中的效用。

本发明的核酸内切酶适用于消除或减少扩增反应中的内源DNA。这是因为核酸内切酶的失活温度越低，就越容易在扩增过程期间使其失活，并且在失活步骤中使用的任何给定温度下可实现更大的失活程度。

本发明的核酸内切酶因此用于降解扩增反应混合物中存在的非靶多核苷酸或其个别组分例如聚合酶。由此，可减少或避免非特异性扩增。

因为本发明的核酸内切酶可在低温下失活，所以在一个优选实施例中，核酸内切酶用于从含有目的蛋白质或试剂的溶液中去除污染多核苷酸，其中所述蛋白质或试剂自身在超过37℃的温度下(在其下核酸内切酶是酶促活性的温度)是不耐热的。

本发明的核酸内切酶的失活通常包括核酸内切酶与失活添加剂一起温育。失活添加剂使核酸内切酶失稳，即致使其对在给定温度下的解折叠更敏感。核酸内切酶I含有配位的Mg²⁺和多重二硫键，并且技术人员应当知道可靶向酶的这些或其他特性以使其失稳的试剂。

由于在核酸内切酶内的配位的Mg²⁺离子，Mg²⁺离子的浓度在核酸内切酶的活性中可能具有重要性。为此，1～20mM、优选5～10mM的Mg²⁺或Mn²⁺离子浓度可用于本发明的方法中。PCR或蛋白质纯化缓冲液通常具有以氯化镁形式的5mM的Mg²⁺离子浓度。

失活添加剂可以是金属离子螯合剂例如乙二胺四乙酸(EDTA)。失活添加剂还可以是二硫键还原剂(即抑制和/或破坏蛋白质中的两个或更多个半胱氨酸残基之间的二硫键的试剂)。此类试剂的例子包括但不限于DTT、2-巯基乙醇(也称为β-巯基乙醇)、2-巯基乙胺·HCl、TCEP(三(2-羧乙基)膦)和N-乙基马来酰亚胺。TCEP和DTT是优选的，TCEP是尤其优选的。技术人员将能够测定对于其需要适当的二硫键还原剂浓度，所述浓度将改善失活但对其下游反应无害。例如，DTT可以0.05～50mM的浓度方便地掺入失活步骤内。

优选地，在本发明的方法中的核酸内切酶失活在0.5～50mM、更优选1～20mM、例如5～20mM的失活添加剂(例如DTT)浓度下发生。

因此，优选的失活添加剂以至少1mM的浓度存在。

如实例中所示，失活所需的条件代表温育温度和时间以及失活添加剂浓度的灵活组合。因此，失活可在40℃下与1mM TCEP的5-10分钟温育后或在30℃下与10mMDTT的15分钟温育后实现。对于技术人员显而易见的是，取决于待处理的生物制剂的性质及其后续用途，哪些条件组合是适当的。本发明的核酸内切酶是不耐热的，但由前述应当理解可能不需要加热酶以便使其失活。

因此，在进一步方面，本发明提供了从样品中去除核酸(污染)的方法，其包括在允许消化其中的任何多核苷酸的条件下使样品与本发明的核酸内切酶接触，并且随后使所述样品和核酸内切酶混合物与失活添加剂在足以使所述核酸内切酶失活的温度和时间下接触。

两个接触步骤通常是温育，并且在本文中、特别是在实例中描述。实现样品中的核酸消化的合适温育条件是本领域已知的，并且可方便地包括在10～50℃下、例如在35～37℃下或约35～37℃下温育5-30分钟、例如10～20分钟、优选约15分钟。

如本文其他地方描述的，用于失活的温育条件可相当大地改变，在10℃以下的温度下，温育可以是1～24小时，在10～30℃的温度下，温育可以是10分钟至2小时，并且在超过30℃的温度(例如30～70℃，更优选40℃)下，温育通常为5～30分钟。如本文实例中所示，失活添加剂的浓度和选择也将影响温育时间/温度。失活添加剂优选在上述低温育温度下使用。

另外看来，本发明的这个方面提供了本发明的核酸内切酶在从扩增反应混合物或试剂中去除核酸污染中的用途。

在进一步方面，本发明还提供了阻止或减少由于核酸扩增反应中的携带污染的假阳性结果的方法，所述方法包括使用本发明的核酸内切酶以降解扩增反应混合物中存在的携带污染性非靶多核苷酸、或其个别组分。

本发明的核酸内切酶还可用于从DNA聚合酶制剂中去除核酸污染物以及用于从包含DNA聚合酶的扩增反应混合物中去除核酸污染物。本发明的核酸内切酶的低失活温度意指可实现在去污后的核酸内切酶失活，而对聚合酶没有有害影响。

术语“核酸扩增反应”指用于增加靶核酸序列的拷贝数的任何体外方法。优选地，方法将涉及“热循环”，即涉及高温循环。扩增方法包括但不限于PCR及其修饰，3SR、SDA、LAR或LCR和LAMP及其修饰。PCR、LAMP和LCR及其修饰是热循环方法。方法可导致靶序列拷贝数中的线性或指数增加。“修饰”包含但不限于实时扩增、定量和半定量扩增、竞争扩增等等。

靶核酸可以是DNA或RNA，取决于选择的扩增方法。例如，对于PCR，靶为DNA，尽管当与逆转录步骤组合时，靶可考虑为RNA序列。3SR直接扩增RNA靶序列。

术语“扩增反应混合物”指包含用于扩增靶核酸的多种试剂的一般为水性的任何溶液。这些包括酶、水性缓冲液、盐和三磷酸核苷。该术语指含有进行成功的扩增反应的所有必需组分的混合物，以及不完全的并且因此仅含有所需组分中的一些(例如至少2、3或4种)的混合物。如果前面为术语“完全的”，则反应混合物含有扩增必需的所有组分。

术语“携带污染”用于描述偶然或无意中引入反应混合物内的任何核酸，特别是从先前扩增反应携带的靶序列。

术语“假阳性结果”指看起来显示处于研究中的核酸样品含有靶序列、但其中扩增产物源自携带污染的结果。明确的是，本发明提供的污染DNA的减少在法医学和诊断学领域中是特别有利的。本发明的方法使得能够增加核酸扩增的特异性与灵敏度。

术语“核酸内切酶”指水解多核苷酸主链中的磷酸二酯键并且并非核苷酸序列特异性的酶。本发明的“核酸内切酶I”可切割ds和ss多核苷酸、DNA和RNA。

术语“多核苷酸”指任何核苷酸链。这些多核苷酸可以是RNA或DNA，并且可以是双链或单链的。链还可以是线性或超螺旋的。

术语“盐”指起因于酸和碱的中和反应的任何离子化合物。有利的盐是通常用于限制DNA-蛋白质相互作用并在添加核酸内切酶后产生更纯的蛋白质样品的盐，并且技术人员将知道这些盐。特别重要的盐是氯化钠和氯化钾。

“基本上失活的”意指该酶是至少95％失活的、优选98％失活的、更优选该酶是100％失活的。失活百分比可方便地通过下述进行测量：使DNA样品(例如500bp PCR产物)或与失活的核酸内切酶或与非失活的核酸内切酶一起在合适缓冲液(例如Tris、HEPES、PBS)中在37℃下温育3小时；使反应产物通过电泳在溴化乙啶琼脂糖凝胶上分离，并且测量在紫外线下有关DNA条带的相对荧光强度。替代方法可由技术人员设计，以测量失活和非失活的核酸内切酶的相对活性。例如，可使用含SYBR绿的DNA样品的荧光的相对变化。进一步方法是Kunitz测定(Kunitz,M；1950,S.GenPhysiol,33:363和WO 2011/010094)和由Yamamoto设计的经修改的Kunitz测定(Yamamoto,M；1971,Biochem Biophys Acta,228:95和WO 2011/010094)。合适的方法在本文实例中描述。

“不可逆的”失活的益处是核酸内切酶的催化功能无法通过温度的变化再获得，并且因此可能仍含有失活核酸内切酶的经处理的样品可用于涉及与目的核酸接触的进一步加工或应用中，而不消化该核酸。因此，核酸内切酶不再获得其活性，并且基本上不存在残留活性；具体地，保留小于5％、优选小于2％、最优选无法检测的核酸内切酶活性。本发明的酶能够这样“不可逆的”失活(提供这种失活的条件在本文中描述)，并且因此失活优选是不可逆的失活。失活可视为“不可逆的”，即使它依赖失活添加剂例如金属离子螯合剂或还原剂的连续存在。

失活包括热交换抗性的(“不可逆的”)失活可能要求如上文定义的核酸内切酶仍与失活添加剂接触。除非由上下文另外明确，本文描述的残留活性假定失活添加剂例如至少0.1、优选至少0.2mM添加剂例如TCEP的连续存在；更弱的还原剂(例如DTT)可能要求更高的浓度，例如至少0.5或1mM。需要或存在通常至多10mM、优选至多5mM。

对于某些应用，可能希望具有即使不存在或基本上不存在失活添加剂时，也是失活的核酸内切酶I。用于去除失活试剂的方法是本领域已知的，并且包括透析和脱盐或缓冲液更换柱的使用。本发明的酶如果适当处理，则可失活至该程度。合适的条件在实例8中描述。适当条件将取决于(i)使用的失活添加剂的选择，(ii)加入核酸内切酶中的失活添加剂浓度，(iii)核酸内切酶加热至其的失活温度(在失活添加剂的存在下)，(iv)核酸内切酶在失活温度下在其下温育的时间，(v)从失活温度冷却后核酸内切酶贮存于其下的温度(在失活添加剂的存在下)，和(vi)核酸内切酶在贮存温度下在其下贮存的时间。

技术人员应当理解对便于失活的一些参数的改变，例如失活添加剂浓度的增加，可影响其他参数，例如在失活添加剂的存在下核酸内切酶需要在贮存温度下贮存的时间，以便使不可逆的失活发生。

例如，本发明人已发现即使在不存在失活试剂的情况下，当加入10mM TCEP，核酸内切酶加热至50℃60分钟，随后在室温下贮存两天(随后去除TCEP)时，VsEndA_S44E也可致使失活。

作为另外一种选择，如果将1mM TCEP加入核酸内切酶中，并且将核酸内切酶再次加热至50℃60分钟，但贮存温度增加至37℃，不可逆失活所需的贮存时间降至一天。

能够实现这种失活而无需温度的任何初始增加。例如，对于VsEndA_S44E，失活可通过将其与10mM TCEP一起在37℃下贮存一天或在室温下贮存四天来实现。在这些情况下，本发明人发现即使当通过透析去除TCEP时，酶仍保持失活。

上文描述的失活条件的变化显示本发明的核酸内切酶提供的灵活性。如果目的样品已知不受失活添加剂影响，则技术人员可选择将添加剂保留在样品中以便减少失活时间或温度。另一方面，如果技术人员希望去除失活添加剂，则他或她可使样品与失活添加剂一起温育更长时间段或应用更高的失活温度。

基本上失活优选在30℃或约30℃例如28～32℃的温度下在失活添加剂的存在下的15分钟温育内发生。本发明的核酸内切酶可在更低的温度下或经过更短的时间段基本上失活，但依照本发明，在DTT的存在下在约30℃下加热约15分钟优选足以使酶基本上失活。对于技术人员显而易见的是，对这两种参数之一的调整可通过调整另一种加以补偿。例如增加失活温度可允许减少温育持续时间。相反，增加温育持续时间可允许使用更低的失活温度。当然，如同样对于技术人员显而易见的和实例中所示的，当本发明的核酸内切酶用于本发明的方法中时，可使用长于15分钟的温育持续时间，并且可使用超过约30℃的失活温度。

核酸内切酶的失活温度和时间应通过使核酸内切酶在溶液中温育进行评估，所述溶液模拟典型的PCR或蛋白质纯化缓冲液(例如25mM Tris/HCl，pH 8.5，5mMMgCl₂)。核酸内切酶应以约0.1U/μl～100U/μl、优选1～50U/μl、例如25～30U/μl存在。合适的方案在实例中描述。

反应混合物优选处于样品或目的蛋白质在其下稳定的pH下。就本发明的核酸内切酶的酶促活性而言，7.0～9.5、优选约8.5的pH是特别合适的。8.5的pH也适合典型的PCR或蛋白质纯化缓冲液。

有利地，本发明的不耐热的核酸内切酶在完全扩增反应混合物中是完全功能的，并且与标准体外扩增反应物和条件相容。酶还应能够去除来自反应混合物的合适量的污染多核苷酸和/或携带污染，通常fg-或pg-水平，但优选高达1ng。优选地，核酸内切酶能够在37℃下在60分钟内、更优选在30分钟内、最优选在15分钟内降解所有携带污染。

还包括在本发明的范围内的是本发明的核酸内切酶的酶促活性片段，应当理解催化活性可在截短的变体及其他变体中保留。实例提供核酸内切酶活性的合适测定。

本发明通过对VsEndA优选的S44E突变进行例示，并且更一般地，修饰形式的VsEndA是本发明的核酸内切酶的优选实施例。丝氨酸可替换为除Glu(E)外的残基，特别是Glu的非遗传编码的同系物或者苏氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺。可置换其他核酸内切酶I序列中与丝氨酸44等价的残基。关于其他物种与VsEndA中的丝氨酸44等价的残基显示于图3和4的序列比对中。下表显示了多种弧菌属物种(表1)和选择的其他细菌(表2)与SEQ ID No.1(VsEndA)的序列同一性百分比。这些表和相应附图中的核酸内切酶是用于根据本发明的教导修饰的优选核酸内切酶，并且所得的酶是本发明的优选核酸内切酶。

序列1	序列2	同一性％
			杀鲑弧菌	费氏弧菌(V.fischeri)	91
杀鲑弧菌	沃当弧菌(V.wodanis)	91
			杀鲑弧菌	灿烂弧菌(V.splendidus)	78
杀鲑弧菌	霍乱弧菌	71
			杀鲑弧菌	哈维氏弧菌(V.harveyi)	77
杀鲑弧菌	轮虫弧菌(V.rotiferianus)	77
			杀鲑弧菌	塔氏弧菌(V.tubiashii)	73
杀鲑弧菌	V.sinaloensis	74
			杀鲑弧菌	创伤弧菌(V.vulnificus)	74
杀鲑弧菌	弗利斯弧菌(V.furnissii)	70
			杀鲑弧菌	鳗弧菌(V.anguillarum)	71

表1

序列1	序列2	同一性％
			杀鲑弧菌	霍乱弧菌	71
杀鲑弧菌	海单胞菌属物种(Oceanimonas sp.)	64
			杀鲑弧菌	沙门菌属物种(Salmonella sp.)	65
杀鲑弧菌	肠杆菌属物种(Enterobacter sp.)	65
			杀鲑弧菌	预研菌属物种(Yokenella sp.)	66
杀鲑弧菌	克雷伯菌属物种(Klebsiella sp.)	65
			杀鲑弧菌	大肠杆菌(Escherichia coli)	65
杀鲑弧菌	志贺菌属物种(Shigella sp.)	64
			杀鲑弧菌	柠檬酸菌属物种(Citrobacter sp.)	66
杀鲑弧菌	克罗诺菌属物种(Cronobacter sp.)	68
			杀鲑弧菌	拉恩氏菌属物种(Rahnella sp.)	63
杀鲑弧菌	欧文氏菌属物种(Erwinia sp.)	62
			杀鲑弧菌	耶尔森菌属物种(Yersinia sp.)	63
杀鲑弧菌	沙雷菌属物种(Serratia sp.)	62
			杀鲑弧菌	假单胞菌属物种(Pseudomonas sp.)	51

表2

优选地，本发明的核酸内切酶是弧菌属核酸内切酶或由其衍生。根据本发明的进一步特别优选的经修饰的核酸内切酶来自霍乱弧菌(VcEndA)，例如其中与五肽基序邻近的丝氨酸替换为谷氨酸。

优选的核酸内切酶是缺乏N末端信号肽、即由SEQ ID No.4表示的核酸内切酶，或与SEQ ID No.4至少60％、优选至少70％、80％、90％、95％或98％相同的序列。因为本发明的成熟核酸内切酶缺乏信号肽，除非由上下文另外明确，本文对SEQ ID No.1的任何提及也可视为对SEQ ID No.4的提及。SEQ ID No.4是图3和4两者中所述的第一序列。

本发明的优选核酸内切酶具有SEQ ID No.1、3、4或5的序列，但其中FYCGC五肽基序紧N末端的氨基酸残基已由或带负电或极性的、优选带负电的残基置换。其中在第44位处的丝氨酸已替换为谷氨酸的SEQ ID No.1或4的核酸内切酶是最优选的。

本发明的进一步优选的核酸内切酶具有可得自弧菌属物种的核酸内切酶I的序列，但其中FYCGC五肽基序紧N末端的氨基酸残基已由或带负电或极性的、优选带负电的残基置换。

如本文讨论的，替换鉴定的五肽基序N末端的残基的氨基酸不应是疏水的。制备经修饰的酶VsEndA_S44A(丙氨酸)，但得率仅为由S44E实现的得率的约5％，并且它是高度不稳定的，快速丧失所有催化活性。

根据本发明的序列同一性百分比可使用可广泛获得的算法中的任一种(例如使用Clustal W2多重序列比对程序(http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalW2)，使用缺省参数(DNA缺口开放罚分＝15.0；DNA缺口延伸罚分＝6.66；DNA矩阵＝同一性；蛋白质缺口开放罚分＝10.0；蛋白质缺口延伸罚分＝0.2；蛋白质矩阵＝Gonnet；蛋白质/DNA ENDGAP＝-1；蛋白质/DNA GAPDIST＝4)进行计算。

在核酸内切酶中的FYCGC五肽基序紧N末端的氨基酸残基(即与氯离子构成复合物的一部分的极性残基)的确切位置可通过使用标准序列比对技术例如Clustal W2容易地鉴定，以产生诸如图3和4中表示的比对。如果序列缺乏完全保守的FYCGC基序，则仍能够使用这些序列比对技术以鉴定与SEQ ID NO 1中的丝氨酸44等价的残基。

编码本发明的核酸内切酶及其片段的核酸分子构成本发明的进一步方面，其中SEQ ID NO:2和与之至少80或90％相同的序列是优选的。

本发明还提供了上文描述的特定核酸内切酶作为扩增核酸的方法中的去污剂的用途。上文描述的特定核酸内切酶在本文描述的去污方法中的用途代表本发明的特别优选的实施例。

如上文描述的用于分离和纯化核酸内切酶或其酶促活性片段的方法代表本发明的进一步方面。因此，在该方面，本发明提供了此类方法，所述方法包括在合适的宿主细胞(例如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)；大肠杆菌；酿酒酵母(S.cereviciae)，杆状病毒感染的昆虫细胞)中表达所述核酸内切酶或其片段，并且随后从所述宿主细胞和/或所述细胞已在其中进行培养的培养基中分离核酸内切酶。所述核酸内切酶或其片段的表达可通过将编码所述核酸内切酶或其片段的表达载体掺入合适的宿主细胞内来实现。包含这些表达盒和核酸分子的宿主细胞由本发明包含。

可使用本领域已知并且在参考文献中广泛描述的用于蛋白质的纯化技术中的任一种或其任何组合，从宿主细胞/培养基中分开或分离核酸内切酶。此类技术可包括例如沉淀，超滤，透析，多种色谱技术例如凝胶过滤、离子交换色谱、亲和色谱，电泳，离心等。

同样地，宿主细胞的提取物也可使用本领域众所周知的技术进行制备，例如匀浆化、冻融等，并且从该提取物中可纯化本发明的核酸内切酶。

已发现基于例如在琼脂糖凝胶柱例如红琼脂糖凝胶(Pharmacia Biotech，瑞典)或蓝琼脂糖凝胶(GE Healthcare)柱上的离子交换色谱和亲和色谱的组合的纯化方案可容易地用于分离酶

更具体而言，可对提取物实施离子交换色谱并且用NaCl梯度洗脱蛋白质。含有核酸内切酶活性的馏分可进行透析并且随后在用NaCl最终洗脱前应用于亲和柱。

本发明的核酸内切酶的得率是格外良好的，并且因此另外看来，本发明提供了增加重组表达的核酸内切酶I的得率的方法，其包括将五肽基序FYCGC紧N末端的残基用或带负电或极性的残基置换。可以这种方式进行修饰的合适核酸内切酶在本文中描述并且例如在图3和4中例示。合适的表达方法在上文描述。

本发明还提供了包含至少根据本发明的核酸内切酶的试剂盒。该试剂盒还可含有进行核酸扩增反应所需的试剂、缓冲液、酶等中的一些或全部。更具体而言，试剂盒可含有三磷酸核苷(包括含有α硫醇基的dATP(dATPαS)用于链置换扩增)，寡核苷酸引物优选能够在约30℃下起作用的寡核苷酸引物，DNA聚合酶优选耐热的聚合酶例如Taq聚合酶或Bst聚合酶(及其热启动形式)，或在LAR的情况下，DNA连接酶(优选耐热的DNA连接酶，例如或公开于US 6280998中从强烈炽热球菌(Pyrococcus furiosus)中分离的连接酶)，或限制性酶(优选耐热的限制性酶例如BsoB1)。核酸内切酶可在一个区室中连同逆转录酶、DNA聚合酶、链置换聚合酶或LCR连接酶一起提供。

试剂盒可含有书面材料作为如何进行与本发明有关的操作的指导。特别地，可提供关于失活条件的指导。合适的条件在本文中的其他地方进行描述，但作为还可与试剂盒或酶一起提供的进一步的一般例子，表3给出了在失活添加剂的存在下的建议的温育条件，所述温育条件适合于具有Ser44Glu突变的源自杀鲑弧菌的核酸内切酶(VsEndA_S44E)失活。

温度(℃)	二硫苏糖醇(DTT)浓度/时间	三(2-羧乙基)膦(TCEP)浓度/时间
			25	20mM/60分钟	15mM/60分钟
40	10mM/30分钟	5mM/30分钟
			50	1mM/30分钟或10mM/15分钟	0.5mM/30分钟
60	1mM/30分钟	0.5mM/30分钟或10mM/15分钟
			65	1mM/30分钟	1mM/30分钟
70	1mM/30分钟	1mM/30分钟

表3

本发明还提供了包含本发明的核酸内切酶和进行核酸扩增和方法所需的试剂中的一种或多种、例如上文描述的那些组分的组合物。通常，此类组合物将是水性的并且由标准缓冲液例如Tris、HEPES等进行缓冲。

在进一步方面，本发明提供了包含如本文定义的核酸内切酶I或活性片段连同第二核酸内切酶I或其酶促活性片段的组合物。优选地，第二核酸内切酶I或其酶促活性片段具有SEQ ID No.5的序列或与之至少80％相同的序列。第二酶可掺入例如对天然霍乱弧菌序列的突变，所述突变致使其更容易失活。此类组合允许组合物整体在更大范围的pH和/或盐浓度和/或温度下提供有效的核酸内切酶活性。

附图说明

本发明现在通过非限制性实例参考下述附图进行描述，在所述附图中：

图1显示了源自杀鲑弧菌(VsEndA)和霍乱弧菌EndA(VcEndA)的核酸内切酶的氨基酸序列(包括信号肽)，分别为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3的比对。

图2显示了具有Ser44Glu突变的VsEndA(VsEndA_S44E)的核酸序列和氨基酸序列(包括信号肽)，分别为SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:6。

图3显示了源自来自多种不同属的细菌的野生型核酸内切酶I的氨基酸序列(排除信号肽)的序列比对数据。

图4显示了源自弧菌属的多种不同细菌的野生型核酸内切酶I的氨基酸序列(排除信号肽)的序列比对数据。

图5显示了VsEndA_S44E突变体(具有Ser44Glu突变的VsEndA核酸内切酶)和野生型VsEndA酶(SEQ ID NO:1)分别在含有pPIC9K-VsEndA_S44E和野生型表达盒的巴斯德毕赤酵母宿主细胞中的表达水平。

图6显示了在1mM DTT的存在和不存在下，在40℃(6a)和50℃(6b)下的VsEndA和VsEndA_S44E失活率。

图7显示了在1mM下述失活添加剂之一的存在下，在40℃下的VsEndA_S44E失活率：DTT、三(2-羧乙基)膦(TCEP)和2-巯基乙醇。

图8显示了琼脂糖凝胶的照片，所述照片显示VsEndA_S44E和野生型VsEndA的核酸内切酶活性，所述核酸内切酶已在以1mM、10mM或20mM浓度的DTT的存在下，在或50℃(图8a)、40℃(图8b)、30℃(图8c)或25℃(图8d)的温度下失活15、30或60分钟。结果针对或无酶(阴性对照)或6U野生型VsEndA(阳性对照)进行比较。

图9显示了琼脂糖凝胶的照片，所述照片显示VsEndA_S44E和野生型VsEndA的核酸内切酶活性，所述核酸内切酶已在以1mM、10mM或20mM浓度的或DTT(图9a)或TCEP(图9b)的存在下，在4℃下温育6或18小时。结果针对或无酶(阴性对照)或6U野生型VsEndA(阳性对照)进行比较。

图10显示了使用VsEndA_S44E突变体，来自商购可得的AccuStart^TM TaqDNA聚合酶(图9a)或Hot Start聚合酶(图9b)的掺料DNA的去除程度。

图11显示了使用VsEndA_S44E突变体，来自商购可得的Maxima qPCR主混合物的掺料DNA的去除程度。

图12显示了在含有或0.5M氯化钠(图11a)或1M氯化钠(图11b)的溶液中，使用VsEndA_S44E突变体，来自商购可得的TEMPase DNA聚合酶的掺料细菌基因组DNA的去除程度。

图13显示了在不同氯化钠溶液(0M、0.25M、0.5M、0.75M和1.0M)中，使用VsEndA_S44E突变体，来自含有重组表达的蛋白质的大肠杆菌细胞裂解产物溶液的掺料细菌基因组DNA的去除程度。

图14显示了在具有高盐度的溶液中的VsEndA_S44E突变体的最佳活性。活性在25mM Tris-HCl缓冲液，pH 8.5，5mM氯化镁中进行测试，伴随不同浓度的氯化钠和氯化钾。获得的最大活性设为100％。

图15显示了在不同温度下的VsEndA_S44E突变体的活性。活性在含有5mM氯化镁和0.5M氯化钠的25mM Tris-HCl缓冲液，pH 8.5中进行测试。

图16显示了与商购可得的Benzonase(粘质沙雷菌)核酸酶相比较，VsEndA_S44E突变体在不同水平的pH和氯化钠浓度下降解DNA的能力。反应在或7.5、8.0或8.5的pH下和在或者0.25M或0.5M(图16a)或者0.75M或1.0M(图16b)的氯化钠浓度下进行。反应混合物含有100μL Tris-HCl缓冲液，所述Tris-HCl缓冲液具有5mM氯化镁、50μg小牛胸腺DNA和300U或VsEndA_S44E或Benzonase。反应混合物在37℃下温育30分钟。使用含EDTA的加样缓冲液停止反应并在1％琼脂糖凝胶上运行。

图17显示了VsEndA_S44E突变体降解含有DNA结合蛋白的大肠杆菌裂解产物中的DNA的能力。将VsEndA_S44E加入在不同氯化钠浓度下的大肠杆菌裂解产物中，并且在37℃下温育30分钟。对照不含氯化钠。

以及其中

SEQ ID NO:1是野生型杀鲑弧菌核酸内切酶I的cDNA核苷酸序列的翻译部分的氨基酸序列，包括信号肽。

SEQ ID NO:2是突变型杀鲑弧菌核酸内切酶I(具有TCC至GAG突变的VsEndA)的cDNA核苷酸序列，包括信号序列。

SEQ ID NO:3是野生型霍乱弧菌核酸内切酶I的cDNA核苷酸序列的翻译部分的氨基酸序列，包括信号肽。

SEQ ID NO:4是野生型杀鲑弧菌核酸内切酶I的cDNA核苷酸序列的翻译部分的氨基酸序列，不含信号肽。

SEQ ID NO:5是野生型霍乱弧菌核酸内切酶I的cDNA核苷酸序列的翻译部分的氨基酸序列，不含信号肽。

SEQ ID NO:6是突变型杀鲑弧菌核酸内切酶I(具有在第44位处的丝氨酸残基被谷氨酸残基置换的VsEndA)的氨基酸序列，包括信号序列。

SEQ ID NO:7至SEQ ID NO:20是源自如表2和图3中所述的多种不同属的细菌的核酸内切酶I氨基酸序列，不含信号肽。

SEQ ID NO:21至SEQ ID NO；30是源自如表1和图4中所述的弧菌属的多种不同细菌的核酸内切酶I氨基酸序列，不含信号肽。

具体实施方式

实例

实例1—克隆和诱变

关于杀鲑弧菌核酸内切酶I的基因从含该基因的载体中进行PCR扩增，并且克隆到用于巴斯德毕赤酵母的pPIC9K表达载体内。杀鲑弧菌核酸内切酶I的天然信号序列在表达载体中省略，使得在由表达质粒编码的α-交配因子后的杀鲑弧菌核酸内切酶I的氨基酸序列是APPSSF。

使用来自Agilent的QuikChange^TM诱变试剂盒，根据制造商的说明书，使杀鲑弧菌核酸内切酶I(VsEndA)在残基44处从丝氨酸(Ser)突变为谷氨酸(Glu)。含有截短的VsEndA序列的pPIC9K载体用作模板。在诱变反应后的正确序列通过DNA测序加以验证。

实例2—表达和纯化

如用于巴斯德毕赤酵母表达试剂盒(Life Technologies)的手册中所述的，使用SacI使pPIC9K-VsEndA_S44E载体线性化，并且转化到巴斯德毕赤酵母GS115内。基本上如毕赤酵母属表达试剂盒中所述的，杀鲑弧菌S44E_核酸内切酶I(VsEndA_S44E)在摇瓶中进行表达。在BMGY培养基中含有VsEndA_S44E的GS115菌株的50ml预培养物在30℃下培养过夜。将细胞离心并重悬浮于250mlBMMY中，并且表达在20℃下进行72小时。每24小时进行甲醇至0.5％的最终浓度的添加。细胞通过离心去除，并且上清液用作用于纯化的原材料。使用阳离子交换色谱纯化VsEndA_S44E。使用5 cm/分钟的流动，将上清液(250ml)应用于SP-Sepharose FF(1.6/3)柱，所述柱在25mM Tris/HCl，pH 8.3，5mM MgCl₂中平衡。柱用在上述缓冲液中的250ml 0.4M NaCl进行洗涤。使用25mM Tris/HCl，pH 8.3，5mMMgCl₂+1M NaCl进行VsEndA_S44E的洗脱。将含有VsEndA_S44E活性的馏分合并并且最后浓缩。

实例3—核酸酶活性的测量

核酸酶活性可根据Kunitz(Kunitz,M.,1950,Crystalline Deoxyribonuclease,II,Digestion of Thymus Nucleic Acid.The Kinetics of Reaction.J.Gen.Physiol.,33,363-377)的操作进行测定。经修饰的该组合物已用于测量核酸酶活性。将十μl酶制剂加入在最终体积1ml中的25mM Tris/HCl，pH 8.5，0.5M NaCl，5mM MgCl₂中的50μg小牛胸腺DNA中。混合物在37℃下温育，并且在260nm处测量吸光度的增加。1U＝0.01OD₂₆₀增加×分钟^-1。

进行由此在不同温度下评估VsEndA_S44E突变体的活性的研究(不存在还原剂)。图15显示了VsEndA_S44E在约35℃下具有最佳活性，但在广泛温度范围下工作(在10℃和50℃下的20％活性)。

实例4—VsEndA_S44E v野生型(VsEndA)的表达水平比较

含有pPIC9K-VsEndA_S44E表达盒的GS115菌株的50ml预培养物与含有野生型表达盒的菌株相比较。两种菌株在30℃下在BGMY培养基中培养过夜。将细胞离心并重悬浮于250ml BMMY中，并且表达在20℃下进行72小时。每24小时进行甲醇至0.5％的最终浓度的添加，并且如所述的测量核酸酶活性。

图5显示了就在细胞上清液中以U/ml测量的活性表达的酶而言，VsEndA_S44E突变体给出比野生型VsEndA酶更高的在巴斯德毕赤酵母中的表达水平。VsEndA_S44E突变体已在图例中缩短为"S44E"，并且野生型VsEndA缩短为"wt"。

在如上所述纯化后(实例2中)，VsEndA_S44E的比活性测定为比VsEndA高约20％，如表4中所示。

表4

实例5—VsEndA_S44E与VsEndA比较的温度稳定性

野生型(VsEndA)酶的半衰期在70℃下是大约2小时，并且在60℃下是5小时(数据未示出)。

将酶VsEndA_S44E和VsEndA在缓冲液中稀释至200,000U/ml的浓度，所述缓冲液含有25mM Tris/HCl，pH 8，5mM MgCl₂，150mM NaCl，0.01％Triton X-100和±1mM二硫苏糖醇(DTT)。将6×100μl体积转移至不同eppendorf管。样品在40℃或50℃下温育0至40分钟，并且其后序贯地置于冰上。如实例3中所述，使用经修饰的Kunitz测定来测量剩余活性。根据图6中所示的数据，显而易见的是对于VsEndA_S44E和VsEndA两者，DTT的添加是热失活所需的。DTT添加后，酶以更快速的速率失活。VsEndA_S44E突变体已在图例中缩短为“S44E”，并且野生型VsEndA缩短为“wt”。

实例6—使用不同还原剂的温度失活

在40℃的温度下，测试使用包含DTT、三(2-羧乙基)膦(TCEP)和2-巯基乙醇的一系列失活添加剂使VsEndA_S44E失活的能力。

当比较图7中所示的数据与图6a的数据时，可测定所有失活添加剂均便于失活。与2-巯基乙醇相比较，发现DTT和TCEP作为失活添加剂是更有效的。VsEndA_S44E突变体已在图例中缩短为“S44E”，并且野生型VsEndA缩短为“wt”。

实例7—热失活实验

为了检查温度稳定性并测定是否能够使用热使VsEndA_S44E完全失活，评估在热失活的酶的存在下纯化的PCR产物的完整性。这提供了与实例3中所述的经修饰的Kunitz测定相比较更灵敏的测定，因为它可测试失活在温度降低后是可逆的还是不可逆的。

将在25mM Tris/HCl pH 8.5、0.5M NaCl、5mM MgCl₂缓冲液中的酶(VsEndA_S44E或野生型VsEndA，130U/μl)转移至总体积50μl的Eppendorf管。将新鲜制备的二硫苏糖醇(DTT)加入至1、10或20mM的最终浓度。使样品在不同温度下热失活15、30或60分钟。在失活步骤后，将管置于冰上。

通过将5μl热失活的酶加入在由25mM Tris/HCl pH 8.5、5mM MgCl₂和0.5MNaCl组成的缓冲液中的500ng500bpPCR产物，进行用于测定残留活性的测定。样品在37℃下温育3小时。当DTT加入酶制剂中用于失活时，它也存在于关于残留活性的测定中。

最后，为了测定PCR产物的任何降解，样品在1％琼脂糖凝胶上进行分析。阴性对照(无酶)和阳性对照(含有6U wt-酶)以与上文反应相同的方式进行处理。

图8概括了在50℃、40℃、30℃和25℃下，与野生型VsEndA酶相比较，VsEndA_S44E突变体的热失活实验。阴性对照显示完整的PCR产物，而阳性对照示出大约1％残留活性的效应。在50℃下，发现VsEndA_S44E突变型酶在1mMDTT的存在下在15分钟后被完全失活，而野生型仅被部分失活。在40℃下，与使VsEndA酶部分失活所需的10mM相比较，1mM DTT在15分钟后能够使VsEndA_S44E突变体部分失活。在25℃下，以20mM或更少浓度的DTT在60分钟后不能使VsEndA酶完全失活，而10mM DTT在60分钟后能够使VsEndA_S44E突变体完全失活，从而证实置换的效应。至少10mM DTT的添加是在30℃下的VsEndA_S44E突变型酶完全失活所需的。VsEndA_S44E突变体已在图例中缩短为“S44E”，并且野生型VsEndA缩短为“wt”。

在进一步的热失活实验中，VsEndA_S44E突变体与野生型VsEndA酶在4℃下、在或1mM、10mM或20mM浓度的或DTT或TCEP的存在下进行比较，其中使用上文描述的相同对照。如图9中所示，即使在该低温下，10mM DTT或TCEP的存在在6小时后也能够使VsEndA_S44E突变体完全失活。相比之下，即使20mMDTT在18小时温育后也不能使野生型VsEndA酶失活。TCEP显示在该温度下或在10mM或更多的浓度下的18小时温育后、或在20mM的浓度下的6小时温育后，使VsEndA酶完全失活。

实例8—热失活实验—在不存在TCEP的情况下的残留活性

在该实例中，我们测定其中在去除失活添加剂后仍观察到VsEndA_S44E的失活的条件。

该实例以与实例7相似的方式进行，除了研究失活添加剂TCEP，并且在失活已发生后，通过使用Pur-A-Lyzer透析管(Sigma)透析后去除TCEP之外。缓冲液在两天透析过程中更换一次。如实例7中所述，使用1％琼脂糖凝胶进行残留活性的测定。

由该研究测定的最佳失活参数的选择呈现于表5中。

表5–实现VsEndA_S44E的失活所需的参数。参数(i)—加入核酸内切酶中的失活添加剂TCEP浓度(mM)，参数(ii)—核酸内切酶加热至其的失活温度(在失活添加剂的存在下)(℃)，参数(iii)—核酸内切酶在失活温度下在其下温育的时间(分钟)，参数(iv)—从失活温度冷却后核酸内切酶贮存于其下的温度(在失活添加剂的存在下)(℃或“RT”用于室温)，和参数(v)核酸内切酶在贮存温度下在其下贮存的时间(天)。当VsEndA_S44E未加热至失活温度时，应用关于参数(ii)和(iii)的“N/A”。

实例9—从DNA聚合酶制剂中去除污染DNA

测试VsEndA_S44E去除在典型的聚合酶缓冲液中来自商业DNA聚合酶的污染细菌基因组DNA的能力。0.14U/μL Accustart Quanta Biosciences)、Tempase(VWR)或GoTaq(Promega)用28U/μL VsEndA_S44E在37℃下在由10mMTris-HCl、111mM KCl、5.6mM MgCl₂组成的缓冲液中处理15分钟。在37℃下温育15分钟后，加入DTT至10mM的最终浓度，并且样品在40℃下温育30分钟，以便使VsEndA_S44E突变体失活。最后加入引物、探针和dNTP，并且聚合酶反应混合物中的组分的最终浓度为：在由10mM Tris-HCl、20mM KCl、5mMMgCl₂组成的缓冲液中的25mU/μL DNA聚合酶，300nM每种引物，200nM探针，100μM dATP、dCTP、dGTP和200μM dUTP。

包括下述对照：a)含有缓冲液代替VsEndA_S44E的样品，b)含有缓冲液和大肠杆菌基因组DNA的样品，c)其中大肠杆菌基因组DNA在VsEndA_S44E失活前加入的样品，和d)其中大肠杆菌基因组DNA在VsEndA_S44E失活后加入的样品。qPCR在20μl反应中在Stratagene Mx3500P(Agilent technologies)中进行，并且热循环条件如由DNA聚合酶的制造商推荐的。

VsEndA_S44E能够去除来自测试的所有聚合酶的污染细菌基因组DNA。图10示出了Accustart和GoTaq聚合酶的VsEndA_S44E处理效应。VsEndA_S44E突变体已在图例中缩短为“S44E”。污染细菌DNA的水平被降低，并且掺料的大肠杆菌基因组DNA被去除。在VsEndA_S44E处理后,不存在聚合酶功能的损害或存在聚合酶功能的最低限度损害。

实例10—从PCR主混合物中去除污染DNA

商业定量PCR(qPCR)主混合物已显示含有痕量污染细菌基因组DNA。在该实例中，测试VsEndA_S44E去除来自商业qPCR主混合物的细菌基因组DNA污染物的能力。Maxima qPCR主混合物(Fermentas)或Express qPCR SupermixUniversal(Invitrogen)用25U/μL VsEndA_S44E在37℃下处理15分钟。通过加入10mM DTT(1-4二硫苏糖醇)并且在40℃下温育30分钟，使S44E_End I失活。为了测试VsEndA_S44E处理对来自聚合酶的污染DNA去除的作用，一份S44E_End I处理的样品连同下述对照一起进行分析：a)含有缓冲液代替VsEndA_S44E的样品，b)其中大肠杆菌基因组DNA在缓冲液前加入的样品，c)其中大肠杆菌基因组DNA在缓冲液后加入的样品，d)其中大肠杆菌基因组DNA在VsEndA_S44E失活前加入的样品，和e)其中大肠杆菌基因组DNA在VsEndA_S44E失活后加入的样品。最后，加入引物和探针分别至300nM和200nM的最终浓度。如由Corless等人(J Clin Microbiol.2000,38(5):1747-52)描述的，引物和探针靶向大肠杆菌的16S rRNA基因。热循环条件如下：50℃2分钟，95℃10分钟，随后为95℃30秒、60℃30秒和72℃30秒的45个循环。qPCR在20μl反应中在Stratagene Mx3500P(Agilent technologies)中进行。

如图11中所示，VsEndA_S44E能够降低Maxima qPCR主混合物中的污染基因组细菌DNA的水平。VsEndA_S44E突变体已在图例中缩短为“S44E”。此外，VsEndA_S44E对由大肠杆菌DNA掺料的主混合物的添加导致与VsEndA_S44E处理的(未掺料的)主混合物相同的QC值。S44E_End I也能够去除主混合物中含有的细菌DNA污染物中的一些。聚合酶反应不受VsEndA_S44E处理影响。因此，VsEndA_S44E能够去除污染DNA，可被完全失活并且失活的VsEndA_S44E不损害聚合酶的性能。对于Express qPCR Supermix Universal(Life Technologies)获得类似结果(数据未示出)。

实例11—来自高盐度的聚合酶溶液的细菌基因组DNA的去除

VsEndA_S44E处理可特别用于必须不含核酸酶活性的蛋白质纯化中，因为VsEndA_S44E的失活可容易地完成。此外，在DNA结合蛋白的纯化中，盐活性核酸酶的使用是方便的，因为盐可加入蛋白质制剂中，以限制DNA-蛋白质相互作用。在该实例中，我们测试了VsEndA_S44E在0.5和1.0M氯化钠的溶液中去除来自DNA聚合酶的DNA污染的能力。

在25mM Tris-HCl、5mM MgCl₂和0.5M或1.0M NaCl中的TEMPase HotStart DNA聚合酶(VWR)用25U/μL VsEndA_S44E在37℃下处理15分钟。下述对照连同上述样品一起进行分析：a)含有缓冲液代替VsEndA_S44E的样品，b)其中20 pg大肠杆菌基因组DNA在缓冲液前加入的样品，和c)其中20 pg大肠杆菌基因组DNA在VsEndA_S44E失活前加入的样品。通过加入10mM DTT并且在40℃下温育30分钟，使VsEndA_S44E失活。在失活步骤后，通过使用具有7K截断值的Zeba^TMSpin脱盐柱(Thermo Scientific)，根据制造商的说明书，将样品的缓冲液更换为聚合酶缓冲液。最后加入引物和探针，并且聚合酶缓冲液的组成成分如下：10mM Tris-HCl，20mM KCl，5mM MgCl₂，100μM dATP、dCTP、dGTP和200μM dUTP，300nM每种引物和200nM探针。热循环条件如下：95℃15分钟，随后为95℃30秒和60℃30秒的45个循环。qPCR在20μl反应中在Stratagene Mx3500P(Agilent technologies)中进行。

图12示出了在含有0.5M和1.0M氯化钠的聚合酶溶液中的VsEndA_S44E处理。VsEndA_S44E突变体已在图例中缩短为"S44E"。这些图显示VsEndA_S44E突变体去除来自聚合酶溶液的掺料的大肠杆菌DNA的能力不受高盐度影响。

在分开的研究中，VsEndA_S44E突变体的活性在一系列不同氯化钠和氯化钾浓度下进行评估。图14示出了VsEndA_S44E在约0.5M氯化钠下具有最佳活性，但在广泛范围的氯化钠和氯化钾浓度下操作。

在进一步的研究中，VsEndA_S44E突变体在一系列不同氯化钠浓度和pH水平下降解小牛胸腺DNA的酶促活性与商购可得的Benzonase(粘质沙雷菌)核酸酶的活性相比较。图16示出了VsEndA_S44E在与Benzonase相比较更广泛范围的pH水平和氯化钠浓度下降解DNA。

在进一步的研究中，评估VsEndA_S44E突变体在一系列不同氯化钠浓度下降解来自大肠杆菌细胞裂解产物的DNA的酶促活性。图17示出了VsEndA_S44E突变体在0.25M-1.0M的氯化钠浓度下是活性的。

实例12—S44E_EndA去除来自蛋白质纯化制剂的DNA的用途

因为VsEndA_S44E可用于蛋白质纯化方案中，特别是必须不含核酸酶活性和污染DNA的DNA结合蛋白的纯化中，我们测试VsEndA_S44E从含有重组表达的DNA结合蛋白的大肠杆菌提取物中去除基因组DNA的能力。

在该实例中的重组表达的蛋白质是鳕鱼尿嘧啶-DNA糖基化酶(鳕鱼UNG)，其催化尿嘧啶从含尿嘧啶DNA中的去除。收获含有鳕鱼UNG的大肠杆菌细胞，洗涤并随后通过在含有溶菌酶的Tris/HCl缓冲液(25mM Tris/HCl pH 8.0、10mMNaCl、1mM EDTA、1％甘油)中的超声处理进行裂解。将细胞提取物离心并且收集上清液。在添加下述浓度的NaCl之前，将上清液的pH调整至8.5：0M、0.25M、0.5M、0.75M或1.0M。在37℃下用50U/μL VsEndA_S44E处理30分钟之前，还加入以10mM的MgCl₂。然后通过加入10mM DTT并在40℃下温育30分钟使VsEndA_S44E失活。还包括未经处理的对照。将VsEndA_S44E处理的上清液(1μL)加入含有TEMPase Hot Start DNA聚合酶(VWR)的50μl qPCR反应中，使用与较早在实例10中所述相同的PCR缓冲液组成和热循环条件。

如图13中所示，VsEndA_S44E能够去除在含有0.5M NaCl或更多的样品中的大部分基因组大肠杆菌DNA(＞99.5％)，尽管显著量的DNA仍留在裂解产物中。在相对低盐度(0M和0.25M NaCl)的样品中，发现Cq值对于未经处理的和VsEndA_S44E处理的样品两者均为相同的。这提示在样品内的DNA与蛋白质相互作用，使得它对于VsEndA_S44E酶和聚合酶两者均无法获得。相比之下，在更高的NaCl浓度(0.5M、0.75M和1.0M)下，在未经处理的样品和含有VsEndA_S44E突变体的样品中可见DNA水平的明确差异，从而提示NaCl使得DNA对于VsEndA_S44E和聚合酶两者均更可获得。该实例证实VsEndA_S44E对于来自含有重组表达的DNA结合蛋白的细胞提取物的DNA去除是理想的。盐的添加减少蛋白质-DNA相互作用，使得DNA可用于盐活性的VsEndA_S44E。此外，VsEndA_S44E可容易地被不可逆地失活，作为通常需要不含核酸酶活性的DNA结合蛋白制剂重要的一个特点。

实例13—失活添加剂TCEP对PCR质量的作用

在该实例中，我们显示TCEP对Tempase聚合酶的作用和Tempase Key缓冲液对PCR效率的作用。

在加入剩余部分的PCR组分之前，将不同浓度的TCEP加入PCR条中。大肠杆菌gDNA(100 fg)用作模板用于23S引物/探针组。所有样品均一式两份地运行，并且所有qPCR反应均具有20μl的总体积。测试Tempase Key缓冲液和“北极缓冲液(Arctic buffer)”(最终浓度：10mM Tris HCl pH 8.3、10mM KCl和5mMMgCl₂)中的Tempase聚合酶(VWR)，以及Agilent Brilliant III主混合物(AgilentTechnologies)。

来自该研究的结果显示2.5mM或以下的TCEP浓度对PCR效率不具有显著作用(数据未示出)。

实例14—VsEndA_S44E失活在Taq聚合酶清除中的稳定性

TCEP的存在对于在已进行失活操作后保持VsEndA_S44E失活可能是必须的。为此，我们评估TCEP维持VsEndA_S44E失活的长期能力。

包含2μL Tempase Key缓冲液、0.8μL dNTP/dUTP(2.5/5mM)、0.2μLTempase(5U/μL)、1μL VsEndA_S44E贮存缓冲液/VsEndA_S44E(10U/μL)和1μL水的缓冲液在17.5×体积中混合，并且在37℃下温育25分钟。在DNA去污步骤后，通过添加1μL 50mM TCEP/1x rx并且在37℃下温育25分钟，使VsEndA_S44E失活。在失活后，将混合物在4℃下贮存14天(以8.3mM TCEP的有效浓度)。经处理的混合物其后在qPCR条中分配，并且加入溶解于14μL中的大肠杆菌23S引物/探针和模板(200 fg大肠杆菌gDNA或无模板)。每个qPCR混合物的总体积为20μL。该稀释确保TCEP的浓度减少至2.5mM，根据实例13的结果，已知该浓度不影响PCR效率。将条在4℃下贮存4小时，以便检测在qPCR运行前由再活化的VsEndA_S44E引起的任何模板丧失。qPCR在StratageneMx3500P(Agilent technologies)中进行，并且热循环条件如下：50℃2分钟，95℃10分钟，随后为95℃、60℃30秒和72℃30秒的45个循环。。

结果显示当在以8.3mM浓度的失活添加剂TCEP的存在下贮存时，在4℃下经过至少2周的时期，不存在VsEndA_S44E的显著再活化(数据未示出)。

实例15—VsEndA_S44E和VcEndA(野生型)的掺和物在具有不同氯化钠浓度和 pH的缓冲液中的性能

VsEndA_S44E具有8.5的最适pH和425mM的最适氯化钠浓度。得自霍乱弧菌的野生型杀鲑弧菌衍生的核酸内切酶(VsEndA)的同系物，此处称为VcEndA，具有广泛pH范围，具有7.5的最适pH和175mM的最适氯化钠浓度。我们因此组合VsEndA_S44E和VcEndA，以便测定它是否导致具有广泛pH和氯化钠浓度工作范围、连同有利的失活特征的核酸酶产物。此处我们测试该酶组合物在具有不同pH和氯化钠浓度的Tris缓冲液中的性能针对Benzonase的性能，所述Benzonase是市场上的最主要的非特异性核酸酶。

制备总共二十种含有5mM MgCl₂的25mM tris缓冲液，具有不同pH和氯化钠浓度的组合，如表6所示的矩阵中描述的。

	0M NaCl	0.25M NaCl	0.5M NaCl	0.75M NaCl	1.0M NaCl
						pH 7	1	2	3	4	5
pH 7.5	6	7	8	9	10
						pH 8.0	11	12	13	14	15
pH 8.5	16	17	18	19	20

表6

通过将酶1:1(w/w)混合制备VsEndA_S44E和VcEndA的掺和物，并且在含有250mM氯化钠的25mM Tris-HCl-缓冲液pH 8中测量活性。在含有50μg小牛胸腺DNA的100μL缓冲液中，加入300U酶，并且反应在37℃下温育30分钟。通过添加含EDTA的加样染料停止反应并在1％琼脂糖凝胶上装载样品。

结果显示在0M-1M的氯化钠浓度范围下，VsEndA_S44E/VcEndA组合物活性没有显著恶化。相比之下，Benzonase显示在0.25M及以上时活性的一些丧失(数据未示出)。另外，包含VsEndA_S44E和VcEndA的组合物显示在与20mMDTT或TCEP一起在4℃下贮存6小时后的完全失活，而包含野生型VsEndA和VcEndA的组合物在这些条件下未显示相似的失活特征(数据未示出)。

Claims

1.一种核酸内切酶I或其酶活性片段，其中所述核酸内切酶I具有SEQ ID No.4的序列或与之至少70％相同的序列，并且其中FYCGC五肽基序紧N末端的氨基酸残基已由带负电的残基置换。

2.根据权利要求1所述的核酸内切酶I或其酶促活性片段，其中所述带负电的残基选自谷氨酸、天冬氨酸、4-氟-DL-谷氨酸、γ-羧基-DL-谷氨酸和D-2-氨基己二酸。

3.根据权利要求2所述的核酸内切酶I或其酶促活性片段，其中所述带负电的残基是谷氨酸。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的核酸内切酶I或其酶促活性片段，所述核酸内切酶I或其酶促活性片段源自杀鲑弧菌。

5.根据权利要求1～4中任一项所述的核酸内切酶I或其酶促活性片段，当在0.5mM TCEP的存在下在50℃下温育30分钟时，所述核酸内切酶I或其酶促活性片段是基本上失活的，并且残留活性在0.5mM TCEP的存在下进行评估。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的核酸内切酶I或其酶促活性片段，在0.5M氯化钠的浓度下，所述核酸内切酶I或其酶促活性片段具有的催化活性不小于60％的在其最佳盐浓度下由所述核酸内切酶I或其酶促活性片段显示出的催化活性。

7.一种从样品中去除污染多核苷酸的方法，所述方法包括使所述样品与根据权利要求1～6中任一项所述的核酸内切酶I或其酶促活性片段接触。

8.根据权利要求7所述的方法，其中在允许消化其中的任何多核苷酸的条件下，使所述样品与所述核酸内切酶I或其酶促活性片段接触，并且随后使所述样品和核酸内切酶混合物与失活添加剂在足以使所述核酸内切酶失活的温度和时间下接触。

9.根据权利要求7或权利要求8所述的方法，其中所述样品是含有重组产生的目的蛋白质的制剂，优选地所述蛋白质是酶。

10.根据权利要求7或权利要求8所述的方法，其中所述样品含有目的分析物蛋白质。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述样品源自细胞裂解产物、组织样品或体液。

12.根据权利要求7或权利要求8所述的方法，其中所述样品包含抗体或抗体片段。

13.根据权利要求7或权利要求8所述的方法，其中所述样品包含DNA结合蛋白或与溶液中的核酸结合的蛋白质。

14.根据权利要求7或权利要求8所述的方法，其中所述样品是可用于多核苷酸分析技术、优选PCR或DNA/RNA测序中的试剂溶液。

15.根据权利要求8～14中任一项所述的方法，其中所述失活添加剂是金属离子螯合剂或二硫键还原剂。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述试剂选自乙二胺四乙酸(EDTA)、二硫苏糖醇(DTT)、2-巯基乙醇、2-巯基乙胺·HCl、TCEP(三(2-羧乙基)膦)和N-乙基马来酰亚胺。

17.一种核酸分子，所述核酸分子编码根据权利要求1～6中任一项所述的核酸内切酶I或其酶促活性片段，或编码包含所述核酸内切酶I或其酶促活性片段的蛋白质。

18.一种用于分离和纯化根据权利要求1～6中任一项所述的核酸内切酶I或其酶促活性片段的方法，所述方法包括在合适的宿主细胞中表达所述核酸内切酶或其片段，并且随后从所述宿主细胞和/或所述细胞已在其中进行培养的培养基中分离所述核酸内切酶。

19.一种组合物，所述组合物包含根据权利要求1-6中任一项所述的核酸内切酶I或其酶促活性片段和第二核酸内切酶I或其酶促活性片段。

20.根据权利要求19所述的组合物，其中所述第二核酸内切酶I或其酶促活性片段具有SEQ ID No.5的序列或与之至少80％相同的序列。

21.根据权利要求20所述的组合物，其中所述第二核酸内切酶I或其酶促活性片段来自霍乱弧菌。