CN112176028B - 一种基于核酸内切酶的快速wgs建库方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于核酸内切酶的快速WGS建库方法。本发明提供了一种制备DNA文库的方法,依次包括如下步骤:(1)采用核酸内切酶进行打断;所述核酸内切酶具有在双链DNA上产生单链切口的活性;(2)同时采用Taq‑Klenow和DNA聚合酶进行末端补平和加A,同时利用DTT进行灭活前一步骤中加入的核酸内切酶;(3)完成步骤(2)后,不进行纯化,直接进行加接头。本发明中,实现一管内完成打断、补平、加dA和连接。从而实现简化和稳定的WGS(包括PCR‑free WGS)建库。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于核酸内切酶的快速WGS建库方法。
背景技术
现有技术中,全基因组测序(WGS)建库的第一步是打断,纯化,然后依次进行末端修复、加A、连接接头、PCR扩增。最常见的打断方式是物理打断以及酶打断。物理打断的方法主要包括超声或者声波共聚焦(Covaris),需要特殊仪器,并且用时较长。Covaris并非各个分子生物学实验室都有,且使用相对复杂,打断需要时间较长。酶打断,最常见的是NEB的NEBNext DNA双链片段化酶或者Tn5,DNaseI也可以实现打断,但是活性难以控制,很少使用。
NEBNext DNA双链片段化酶是时间依赖型酶,能根据不同作用时间将dsDNA切割成50-1000bp片段。NEBNext DNA双链片段化酶由两种酶组成,一种酶随机的在dsDNA上产生切刻,另一种酶识别切刻处并在对链进行切割,产生dsDNA片段。所得DNA片段含有极短突出末端,5′含磷酸基,3′含羟基。经过文库制备及测序验证,NEBNext DNA双链片段化酶具有随机切割特性。但是这样产生的DNA片段内部仍会有很多单链缺口,后续加A会有潜在问题。
加A有两种酶:Taq DNA聚合酶或者Klenow Fragment(无核酸酶活性)。采用TaqDNA聚合酶进行加A会使单链缺口平移,这样就产生新的粘性末端,导致前一步进行的末端修复失效的潜在问题。Klenow Fragment(无核酸酶活性)有链置换(Strand-Displacement)活性,会产生单链DNA以及同样会使DNA片段进一步断裂。这样产生的片段不能进行连接。NEB的DNA双链片段化酶是同时加入了单链内切酶(突变型T7核酸内切酶I,但是比较贵,且有专利保护),使单链缺口变成双链断裂。
Tn5建库是在一个反应中实现打断和连接。Tn5测序质量不如常规建库,因为两边的接头序列是固定的,而且成本会高一些,而且必须严格限制DNA投入量和Tn5的比例。如果想降低PCR循环数就必须增加DNA投入量,那么必须对应增加Tn5使用量,这样可能会使成本非常高。
发明内容
本发明提供了一种基于核酸内切酶的快速WGS建库方法。
本发明提供了一种制备DNA文库的方法,依次包括如下步骤:
(1)采用核酸内切酶进行打断;所述核酸内切酶具有在双链DNA上产生单链切口的活性;
(2)进行末端补平和加A;本步骤中同时采用Taq-Klenow和DNA聚合酶;所述DNA聚合酶满足如下两个条件:①不具有链置换活性和5’-3’外切酶活性;②具有3’-5’外切酶活性;
(3)完成步骤(2)后,不进行纯化,直接进行加接头。
所述核酸内切酶为DNA双链内切酶。具体的,所述核酸内切酶为NEBNext DNA双链片段化酶或嗜盐弧菌核酸酶。
示例性的,所述步骤(1)的反应体系可如表1所示。
示例性的,所述步骤(1)的反应条件可为:37℃,15分钟。
具体的,所述DNA聚合酶为T4DNA聚合酶。
步骤(2)的反应体系中,Taq-Klenow和DNA聚合酶的配比可为2.5U:4-8U,更具体可为2.5U:5-7U,更具体可为2.5U:6U。
步骤(2)的反应体系中,dATP、dTTP、dGTP和dCTP的摩尔配比可为6:0.5-1.5:0.5-1.5:0.5-1.5,dATP、dTTP、dGTP和dCTP的摩尔配比具体可为6:1:1:1。
步骤(2)中,利用二硫苏糖醇(DTT)灭活步骤(1)的产物中的核酸内切酶。
步骤(2)的反应体系中,二硫苏糖醇的浓度可为10mM。
步骤(2)中,室温反应。
示例性的,所述步骤(2)的反应体系可为:按照表2制备反应体系,然后加入到步骤一的反应产物中。
示例性的,所述步骤(2)的反应条件可为:25℃,15分钟;然后70℃,15分钟。
所述接头具体可为Ad153-2B Adaptor。
Ad153-2B Adaptor是由如下两条单链DNA分子复性形成的:DNA分子1如序列表的序列1所示;DNA分子2如序列表的序列2所示。
DNA分子1的5’末端进行磷酸化修饰。
DNA分子2中,下划线标的10个N组成样本标签。
示例性的,所述步骤(3)的反应体系可为:在步骤二的反应产物中加入1μL Ad153-2B Adaptor溶液,再加入按照表3制备的反应体系。
示例性的,所述步骤(3)的反应条件可为:23℃,60分钟。
完成步骤(3)后,可通过磁珠纯化DNA片段。
所述方法还包括如下步骤(4):完成步骤(3)后,进行PCR扩增。
PCR扩增采用的引物具体可为Ad153-F和AD153-R。
Ad153-F:5’-GAACGACATGGCTACGA-3’;
AD153-R:5’-TGTGAGCCAAGGAGTTG-3’。
Ad153-F的5’末端进行磷酸化修饰。
示例性的,所述步骤(4)的反应体系可如表4所示。
示例性的,所述步骤(4)的反应条件可如表5所示。
完成步骤(4)后,可通过磁珠纯化DNA片段。
本发明还保护一种针对采用核酸内切酶进行打断的DNA建库方法中防止核酸内切酶产生的单链缺口进一步断裂的方法,包括如下步骤:进行末端补平和加A时,同时采用Taq-Klenow和DNA聚合酶;
所述核酸内切酶具有在双链DNA上产生单链切口的活性;
所述DNA聚合酶满足如下两个条件:①不具有链置换活性和5’-3’外切酶活性;②具有3’-5’外切酶活性。
所述核酸内切酶为DNA双链内切酶。具体的,所述核酸内切酶为NEBNext DNA 双链片段化酶或嗜盐弧菌核酸酶。
具体的,所述DNA聚合酶为T4DNA聚合酶。
进行末端补平和加A的反应体系中,Taq-Klenow和DNA聚合酶的配比可为2.5U:4-8U,更具体可为2.5U:5-7U,更具体可为2.5U:6U。
进行末端补平和加A的反应体系中,dATP、dTTP、dGTP和dCTP的摩尔配比可为6:0.5-1.5:0.5-1.5:0.5-1.5,dATP、dTTP、dGTP和dCTP的摩尔配比具体可为6:1:1:1。
进行末端补平和加A时,利用二硫苏糖醇(DTT)灭活打断产物中的核酸内切酶。
进行末端补平和加A的反应体系中,二硫苏糖醇的浓度可为10mM。
本发明还保护一种制备DNA文库的试剂盒,包括如下组分:核酸内切酶、Taq-Klenow和DNA聚合酶;
所述核酸内切酶具有在双链DNA上产生单链切口的活性;
所述DNA聚合酶满足如下两个条件:①不具有链置换活性和5’-3’外切酶活性;②具有3’-5’外切酶活性。
所述核酸内切酶为DNA双链内切酶。具体的,所述核酸内切酶为NEBNext DNA 双链片段化酶或嗜盐弧菌核酸酶。
具体的,所述DNA聚合酶为T4DNA聚合酶。
Taq-Klenow和DNA聚合酶的配比可为2.5U:4-8U,更具体可为2.5U:5-7U,更具体可为2.5U:6U。
所述试剂盒还包括二硫苏糖醇(DTT)。
所述试剂盒还包括记载有以上任一所述方法的载体。
本发明还保护以上任一所述方法或以上任一所述试剂盒在DNA测序中的应用。
所述DNA测序为基因组DNA测序或双链cDNA测序。
本发明中利用核酸内切酶进行简单快速、低起始量、高质量的建库。本发明解决的核心问题:如何防止核酸内切酶产生的单链缺口进一步断裂。解决核心问题的方案(本发明属于改进型发明,原理和常规WGS基本一致):(1)使用Taq-Klenow(没有切刻平移活性)代替TaqDNA聚合酶,同时使用T4DNA聚合酶,这两个酶都不会影响单链缺口或者导致含有单链缺口的DNA片段进一步断裂,暂时保留核酸内切酶酶切产物含有的单链切口在一定程度上避免片段大小不均一/不稳定的问题,单链缺口后续连接步骤中会被T4DNA Ligase修复;(2)利用二硫苏糖醇(DTT)来灭活核酸内切酶,而不用进行纯化(DTT本来就是末端修复以及连接缓冲液里的成分,因此添加DTT不干扰其他酶的活性)。
现有技术中,用核酸内切酶进行打断后需要进行纯化步骤以去除核酸内切酶。本发明发现,DTT可以在常温灭活核酸内切酶,灭活后对后续反应无干扰,利用这一发现可以省略掉纯化步骤。
本发明中,使用核酸内切酶进行打断后,同时采用Taq-Klenow和DNA聚合酶进行末端补平和加A,同时利用DTT进行灭活前一步骤中加入的核酸内切酶,从而实现一管内完成打断、补平、加dA和连接。从而实现简化和稳定的WGS(包括PCR-free WGS)建库。
所述DNA文库具体可为WGS文库(全基因组测序文库)。
所述WGS文库包括但不限于PCR-free WGS文库。
所述WGS文库为PCR-free WGS文库时,模板加入量为500ng以上,后续无需进行PCR扩增。
本发明提供的方法可以用于基因组DNA建库也可以用于双链cDNA建库。
本发明的有益效果:简化流程,PCR前只需要一次纯化;降低成本,避免使用Covaris;对要求初始投入量较低(可以少至10ng),改变投入量(可以兼容10-200ng)的时候只用调整PCR循环数,更加简单。
附图说明
图1为本发明提供的方法的流程示意图。
图2为实施例2的电泳检测图。
图3为8个文库溶液的琼脂糖凝胶电泳图。
图4为利用安捷伦2100生物分析仪检测片段大小的结果。
图5为测序深度分布。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明,但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均为自常规生化试剂商店购买得到的。如无特殊说明,实施例中的水均采用灭菌超纯水。DNAClean Beads:Vazyme,N411;http://www.vazyme.com/product/210.html。
实施例1、方法的建立
本发明提供的方法的流程示意图见图1。
一、打断。
按照表1制备反应体系,然后进行反应(反应条件:37℃,15分钟),反应完成后置于冰上。
表1
体积 | |
基因组DNA | 50ng |
10X NEBNext DNA双链片段化酶反应缓冲液v2 | 2.5μL |
NEBNext DNA双链片段化酶 | 1.0μL |
水 | 补足至25μL |
NEBNext DNA双链片段化酶:NEB公司,货号M0348;http://www.neb-china.com/ pshow.asp?id=3411。配套提供10X NEBNext DNA双链片段化酶反应缓冲液v2。
二、末端补平,加A。
按照表2制备反应体系,然后加入到步骤一的反应产物中,此时总体积为50μL(50μL体系中,由10X T4DNALigase Buffer和DTT溶液提供DTT,在50μL体系中DTT浓度为10mM);然后进行反应(反应条件:25℃15分钟;然后70℃15分钟),反应结束后4℃放置。
表2
体积 | |
10X T4DNA Ligase Buffer | 2.5μL |
DTT溶液 | 2.5μL |
dATP/dNTP溶液 | 0.6μL |
T4Polymerase | 2.0μL |
Taq-Klenow | 0.5μL |
水 | 补足至25μL |
10X T4DNA Ligase Buffer:同步骤三中的10X T4DNA Ligase Buffer。
T4Polymerase:产品形式为溶液,规格为3U/μL;QIAGEN公司,货号为P7080L;http://www.enzymatics.com/products/t4-dna-polymerase/。
Taq-Klenow即Taq DNA聚合酶(Klenow大片段):产品形式为溶液,规格为5U/μL;MCLAB公司,货号为TT-200;http://icloning.cn/Taq-DNA-Polymerase-Klenow- Fragment.html。
DTT溶液中,DTT的浓度为150mM。
dATP/dNTP溶液:将5体积份浓度为100mM的dATP溶液和4体积份浓度为25mM的dNTP溶液(25mM的dNTP溶液提供的有效成分为dATP、dTTP、dGTP和dCTP,且四种成分的浓度均为25mM)混合,得到dATP/dNTP溶液。
三、连接接头
在步骤二的反应产物中加入1μL Ad153-2B Adaptor溶液,再加入按照表3制备的反应体系,此时总体积为80μL;然后进行反应(反应条件:23℃60分钟),反应结束后4℃放置。
然后加入30μL水,此时总体积为110μL;然后加入20μL DNA clean bead混匀,此时总体积为130μL;放在磁力架上,使磁珠充分吸附到管壁上,收集上清。上清中加入20μL DNAclean bead混匀,放在磁力架上,使磁珠充分吸附到管壁上,弃除上清,收集磁珠,用80%的乙醇洗两遍,晾干。然后加入50μL 1×TE缓冲液进行溶解,然后放在磁力架上,使磁珠充分吸附到管壁上,收集上清。
表3
体积 | |
10X T4DNA Ligase Buffer | 3.0μL |
PEG-8000溶液 | 12.0μL |
T4DNA Ligase | 1.6μL |
水 | 补足至29μL |
Ad153-2B Adaptor溶液提供的有效成分为Ad153-2B Adaptor。Ad153-2B Adaptor溶液中,Ad153-2B Adaptor的浓度为10μM。
Ad153-2B Adaptor是由如下两条单链DNA分子复性形成的:
DNA分子1:5’-AGTCGGATCGTAGCCATGTCGTTCCTTAGGAAGACAA-3’;
DNA分子2:
5’-TGTGAGCCAAGGAGTTGNNNNNNNNNNTTGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTT-3’。
DNA分子1如序列表的序列1所示。DNA分子2如序列表的序列2所示。
DNA分子1的5’末端进行磷酸化修饰。DNA分子2中,下划线标的10个N组成样本标签。
T4DNA Ligase:产品形式为溶液,规格为600U/mL;QIAGEN公司,货号为L6030-HC-L。http://www.enzymatics.com/products/t4-dna-ligase-rapid/。配套提供10X T4DNALigase Buffer。
PEG-8000溶液:规格为50g/100mL;RIGAKU,货号为1008062。http://www.rigakureagents.com/p-146-peg-8000-50wv-100ml.aspx。
四、PCR扩增
按照表4制备反应体系,然后进行反应,反应条件见表5。
然后加入60μL DNA clean bead混匀,这时体积是160μL,放在磁力架上,使磁珠充分吸附到管壁上,取上清。再加入20μL DNA clean bead混匀,这时体积是180μL,放在磁力架上,使磁珠充分吸附到管壁上,弃除上清,收集磁珠,用80%的乙醇洗两遍,晾干。然后加入27μL 1×TE缓冲液进行溶解,然后放在磁力架上,使磁珠充分吸附到管壁上,收集上清,即为DNA文库溶液。
表4
体积 | |
步骤三得到的产物溶液 | 46μL |
Ad153-Primer Mix | 4μL |
2×HiFi PCR Mix | 50μL |
总体积 | 100μL |
Ad153-Primer Mix:提供的有效成分为Ad153-F和AD153-R,且两条引物的浓度均为10μM。Ad153-F的5’末端进行磷酸化修饰。
Ad153-F(序列表的序列3):5’-GAACGACATGGCTACGA-3’;
AD153-R(序列表的序列4):5’-TGTGAGCCAAGGAGTTG-3’。
2×HiFi PCR Mix即Q5Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix;NEB M0494;https://www.neb.com/products/m0494-q5-hot-start-high-fidelity-2x-master-mix。
表5
五、用Qubit dsDNA HS Assay Kit进行定量,DNA文库溶液的DNA浓度应大于5ng/μL。
实施例2、
基因组DNA为从自然人的胎盘提取的基因组DNA。
分别按照表6和表7制备两个反应体系,然后进行反应(反应条件:37℃,15分钟)。然后进行电泳检测,结果见图2。反应体系中10mM DTT即可完全抑制NEBNext DNA双链片段化酶活性。
表6
表7
体积 | |
基因组DNA | 50ng |
10X NEBNext DNA双链片段化酶反应缓冲液v2 | 2.5μL |
NEBNext DNA双链片段化酶 | 1.0μL |
DTT溶液 | 2.5μL |
水 | 补足至25μL |
NEBNext DNA双链片段化酶:NEB公司,货号M0348;http://www.neb-china.com/ pshow.asp?id=3411。配套提供10X NEBNext DNA双链片段化酶反应缓冲液v2。
DTT溶液中,DTT的浓度为100mM。
实施例3、基因组DNA为从自然人的胎盘提取的基因组DNA。
按照实施例1的方法制备DNA文库溶液(同一样本进行8次文库溶液制备,每次制备采用独特的样本标签,8次制备的标签分别为:ATTTATGACA、CCTTAATTAA、TCAGTGAGTC、ACTGCCTTAT、AATCTATCAA、ACCAGGAAGG、GAGAGATATT、GGGAAACATG)。
8个文库溶液的琼脂糖凝胶电泳图见图3。图3中,每个泳道代表1个文库溶液。将8个文库溶液混合后利用安捷伦2100生物分析仪检测片段大小,结果见图4。片段范围是300-500bp。
将8个文库溶液混合后使用BGISEQ-500进行PE100测序(按说明书进行参数设置,按说明书进行操作),数据量为一个Lane。结果见表8。测序深度分布见图5。
表8比对率、重复率和覆盖率
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳华大生命科学研究院
<120> 一种基于核酸内切酶的快速WGS建库方法
<130> GNCYX191642
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
agtcggatcg tagccatgtc gttccttagg aagacaa 37
<210> 2
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)..(27)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 2
tgtgagccaa ggagttgnnn nnnnnnnttg tcttcctaag accgcttggc ctccgactt 59
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
gaacgacatg gctacga 17
<210> 4
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
tgtgagccaa ggagttg 17
Claims (4)
1.一种制备DNA文库的方法,依次包括如下步骤:
(1)采用NEBNext DNA双链片段化酶进行打断;
(2)进行末端补平和加A;本步骤中同时采用Taq-Klenow和T4DNA聚合酶;步骤(2)中,利用二硫苏糖醇灭活步骤(1)的产物中的NEBNext DNA双链片段化酶;
(3)完成步骤(2)后,不进行纯化,直接进行加接头。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于:所述方法还包括如下步骤(4):完成步骤(3)后,进行PCR扩增。
3.一种针对采用核酸内切酶进行打断的DNA建库方法中防止核酸内切酶产生的单链缺口进一步断裂的方法,包括如下步骤:进行末端补平和加A时,同时采用Taq-Klenow和DNA聚合酶;进行末端补平和加A时,利用二硫苏糖醇灭活打断产物中的核酸内切酶;
所述核酸内切酶为NEBNext DNA双链片段化酶;
所述DNA聚合酶为T4DNA聚合酶。
4.权利要求1或2或3所述方法在DNA测序中的应用。
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