KR20170110721A - 비특이적 증폭 생성물을 감소시키기 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

비특이적 증폭 생성물을 감소시키기 위한 방법 및 조성물 Download PDF

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KR20170110721A
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Abstract

본 발명은 다수의 상이한 뉴클레오티드 영역을 증폭시킬 때 비특이적 증폭 생성물(예컨대, 프라이머-다이머)을 감소시킴에 의해 표적-특이적 증폭 생성물을 증폭시키거나 증폭을 개선시키는 방법, 조성물, 시스템 및 키트에 관한 것이다. 본원에 기재된 방법, 조성물, 시스템 및 키트는 이상 DNA 구조를 인지하여 이에 결합하고/거나 절단하는 하나 이상의 레솔바제를 포함하거나 이의 이용을 포함할 수 있다.

Description

비특이적 증폭 생성물을 감소시키기 위한 방법 및 조성물
관련 출원의 전후 참조
본 특허 출원은 하기 가특허 출원 각각의 우선권을 주장한다: 2015년 2월 11일 출원된 명칭 "A method for eliminating nonspecific amplification products in multiplex PCR"의 미국 가특허 출원 62/114,788호; 및 2015년 4월 21일 출원된 명칭 "Methods and Compositions for Reducing Non-Specific Amplification Products"의 미국 가특허 출원 62/150,600호. 이러한 가특허 출원 각각은 그 전문이 본원에 참조로서 포함된다.
참조에 의한 통합
본 명세서에서 언급된 모든 공보 및 특허 출원은 각 개별 공보 또는 특허 출원이 구체적으로 및 개별적으로 참조로서 포함된다고 지시된 것과 동일한 정도로 그 전문이 본원에 참조로서 포함된다.
분야
본원에 기재된 방법, 조성물, 시스템 및 키트는 뉴클레오티드 서열의 증폭에 관한 것이다. 특히, 본원에 기재된 방법, 조성물, 시스템 및 키트는, 예컨대 차세대 시퀀싱(NGS)을 포함하는 멀티플렉스 PCR 동안, 다수의 상이한 뉴클레오티드 영역을 증폭시킬 때 비특이적 증폭 생성물(예컨대, 프라이머-다이머)의 감소에 관한 것이다.
배경
유니플렉스 PCR 반응(이하 유니플렉스 PCR로서 언급됨)에서, 반응은 전형적으로 주형 DNA, 단일 증폭 부위 측면의 2개의 프라이머, 열안정성 DNA 폴리머라제, dNTP 및 완충제를 함유한다. 생성된 증폭 생성물인 암플리콘은 일반적으로 표적 DNA 단편(들)이다. 때때로 비특이적 증폭 생성물은 어닐링 온도, 마그네슘 농도와 같은 PCR 조건을 미세 조정함에 의해, 또는 프라이머의 보다 엄격한 설계를 통해 일반적으로 제거된다.
멀티플렉스 PCR은 동일한 튜브 또는 웰에서 동시에 복수의 표적 DNA 단편을 증폭시키는 것을 말한다. 이는 한 쌍 초과의 프라이머를 함께 배치하는 것과 관련이 있다. 실제 적용에서, 일반적으로 수십 내지 수만개의 상이한 종류의 표적 DNA 단편이 단일 튜브에서 동시에 증폭될 것으로 예상된다. 멀티플렉스 PCR은 단일 튜브에서 상이한 DNA 단편을 함께 증폭해야 하는 경우, 유니플렉스 PCR에 비해 탁월한 단순성, 처리량 및 경제적 이점을 제공한다. 이것은 또한 귀중한 샘플(예컨대, 임상 샘플)을 다룰 때 자주 사용된다.
멀티플렉스 PCR은 이미 인간, 동물, 작물 및 식물의 유전자 및 미생물의 검출 및 임상 진단, 종 확증, 및 보다 최근에, 차세대 시퀀싱(비제한적으로, 디 노보 시퀀싱 및 표적화된 재-시퀀싱 포함)을 위한 샘플 및 라이브러리 제조에 광범위하게 이용된다. 유전자 시험 및 진단에서, 멀티플렉스 PCR은 단일 뉴클레오티드 다형태(SNP)의 검정, 유전형질분석, 복사체 수 변이, 후성유전학, 유전자 발현, 및 돌연변이 및 하이브리드화 어레이에 이용된다.
멀티플렉스 PCR은 전형적으로 동일한 부피의 특정 농도의 다수의 프라이머를 함께 배치할 것을 요구한다. 이러한 프라이머는, 수천개의 프라이머가 사용될 때, 예를 들어 마이크로그램까지 매우 높은 양으로 축적된다. 멀티플렉스 PCR의 어려움은 이러한 프라이머가 서로 어닐링될 수 있어서, 엄청난 양의 비특이적 증폭 생성물의 생성으로 이어진다는 것이다. 이러한 비특이적 증폭 생성물은 일반적으로 표적 단편을 검출할 수 없도록 만들거나, 단순히 표적 단편의 생산을 상쇄시킨다.
이러한 다량의 프라이머 및 생성된 배경 '노이즈'의 문제에도 불구하고 멀티플렉스 PCR을 수행할 수 있게 하는 현재의 기술은 프라이머를 매우 좁은 파라메터 범위 내에서 특별히 설계하고/거나, 외국(exotic) 마커를 혼입시키는 것(예컨대, 미국 특허 8,586,310호 및 8,673,560호는 티미딘을 우레딘으로 교체하여 비특이적 생성물이 프라이머의 길이에 따라 여러 우리딘을 갖는 프라이머의 비특이적 어닐링으로부터 우세하게 형성되고 이 기준에 따라 특이적으로 표적화될 수 있도록 하는 프라이머의 변형을 기재하고 있다), 프라이머-다이머 형성을 방지하거나 감소시키는 올리고뉴클레오티드의 이용(예컨대, WO2015063154 A1을 참조하라), 및 보편적 프라이머와 함께 차단된 태그형 표적-특이적 프라이머 및 차단된 프라이머를 특이적으로 활성화하기 위한 전략의 이용(예컨대, US20140329245를 참조하라)을 포함할 수 있다. 이러한 모든 기술에는 상당한 단점과 한계가 있다.
예를 들어, 핵산 증폭 동안 프라이머-다이머와 같은 아티팩트의 형성을 회피하거나 감소시키는 방법은 프라이머 설계 과정의 중심에 있고 종종 증폭 동안 푸울의 다른 프라이머들 간의 최소 상호작용을 나타낼 것으로 예상되는 프라이머 쌍을 설계하기 위해 전용 소프트웨어 패키지(예컨대, DNAoftwares's Visual OMP, MultiPLX, ABI's Pimer Express, 등)를 활용한다. 그러한 소프트웨어의 사용을 통해, 프라이머는 가능한 한 표적-특이적 또는 암플리콘-특이적으로 설계될 수 있고, 종종 프라이머-프라이머 상호작용, 프라이머-다이머 형성 및 슈퍼암플리콘을 최소화하기 위해 서브세트로 분류된다. 그러나, 엄격한 설계 파라메터는 동시에 공-증폭될 수 있는 암플리콘의 수를 제한하고 일부 경우에 일부 암플리콘의 증폭을 완전히 방지할 수 있다. 다른 현재의 방법은 프라이머를 비-중첩 푸울에 분리하여 증폭 단계 동안 프라이머 아티팩트를 최소화하거나 방지하기 위한 다중 PCR 프라이머의 사용을 필요로 한다. 다른 방법은 반응 당 증폭 생성물의 전체 수율을 향상시키기 위해 다중 프라이머 푸울 또는 단일 플렉스 반응의 사용을 포함한다.
멀티플렉스 PCR 반응에서, 각 프라이머 쌍은 증폭 반응에서 한정된 양의 dNTP, 폴리머라제 및 다른 시약에 대해 추가 프라이머 쌍과 경쟁한다. 프라이머는 높은 용융 온도(65℃ 또는 그 초과) 및 50-60%의 GC 함량을 가지며, 모든 프라이머에 걸쳐 유사한 용융 온도를 유지하고, 3' 말단에서 3개 이상의 Gs 또는 Cs의 실행 및 상보적인 서열을 회피하면서, 유니플렉스 PCR에서보다 길게 설계될 수 있다(24-35개 염기); 각 쌍의 프라이머의 특이성은 유니플렉스 PCR에서 먼저 검증되어 단일 표적 단편이 증폭되도록 보장한다; 프라이머 쌍의 농도는 수율의 균일성을 보장하기 위해 일반적으로 50nM 내지 400nM으로 적정된다; 프라이머는 비-중첩 푸울로 분리된다; dNTPS, 마그네슘 및 열안정성 DNA 폴리머라제의 최적 농도가 결정되며, 이는 일반적으로 유니플렉스 PCR에서보다 높다; 그리고 증폭 특이성을 최적화하기 위해 염 농도도 적정된다. 이러한 파라메터가 최적화되면, 일반적으로 2-5개의 표적 단편이 동시에 성공적으로 증폭된다. 프라이머의 추가 컴퓨터 보조-설계를 통해, 동일한 튜브에서 약 20개의 표적 단편을 동시에 증폭시키는 방법이 시장에서 관찰되었다. 비특이적 생성물을 완화하거나 제거하기가 어렵기 때문에, 현재 수십개의 표적만이 일상적인 진단상 실시로 증폭된다. 이러한 방법은 프라이머 및 PCR 조건의 신중한 설계를 요구하며, 일반적인 진단 적용분야의 표준으로 사용되지 않는다.
다수의 네스티드 프라이머 또는 유사한 전략이 멀티플렉스 PCR에서 증폭된 표적의 수를 확장시키는 것이 보고되었다. 이러한 방법은 비특이적 생성물 생성을 완화시킬 수 있거나 항상 완화시키는 것은 아닐 수도 있다. 또한 이러한 방법에는 더 많은 프라이머 층, 취급 및 사이클링 전략이 필요하다. 따라서 이러한 방법은 제한된 용도를 갖는다.
따라서, 프라이머 다이머를 포함하는 아티팩트(비특이적 증폭 생성물로도 언급됨)의 형성을 회피하거나 최소화하면서, 핵산 분자의 집단 내에서 다중 표적 핵산 분자의 선택적 증폭을 가능하게 하는 개선된 방법, 조성물, 시스템, 장치 및 키트에 대한 요구가 존재한다. 또한 아티팩트의 형성을 회피하거나 최소화하면서, 유전체 DNA 및/또는 포르말린-고정된 파라핀 임베디드(FFPE) DNA와 같이, 단일 핵산 샘플로부터 다중 표적 핵산 분자의 선택적 증폭을 가능하게 하는 개선된 방법, 조성물, 시스템, 장치 및 키트에 대한 요구가 존재한다. 또한 임의의 이용가능한 다운스트림 검정 또는 분석에 이용될 수 있는, 단일 반응에서 수천개의 표적-특이적 핵산 분자의 동시 증폭을 가능하게 하는 개선된 방법, 조성물, 시스템 및 키트에 대한 요구가 당 분야에 존재한다. 본원에 기재된 방법, 조성물, 시스템 및 키트는 상기 논의된 문제 및 한계를 해결할 수 있다.
개시 내용의 요약
일반적으로, 주형-의존성 프라이머 신장 반응으로부터 비특이적 증폭 생성물을 감소시키기 위한 방법, 조성물, 시스템 및 키트가 본원에 기재된다. 이러한 방법, 조성물, 시스템 및 키트는 복수의 프라이머가 이용될 수 있고 소위 "프라이머 다이머"를 포함하는 비특이적 하이브리드화 및/또는 증폭 생성물을 생성할 수 있는 임의의 반응에 유용할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 방법, 조성물, 시스템 및 키트는 멀티플렉스 PCR 및 차세대 시퀀싱에 이용하기에 특히 매우 적합할 수 있다.
본원에 기재된 방법, 조성물, 시스템 및 키트는 레솔바제, 및 특히 T4 엔도뉴클레아제 VII 및/또는 T7 엔도뉴클레아제 I이 과도한 복수의 프라이머 쌍(예컨대, >10, >100, >1000, >10,000, 등)이 사용된 증폭(예컨대, 멀티플렉스 증폭) 동안 또는 이후에 같은 반응 혼합물에 상당한 비율의 표적-특이적 증폭 생성물을 남기면서, 비특이적 증폭 생성물을 효과적 및 효율적으로 절단하는데 사용될 수 있다는 신규하고 예기치 않은 발견에서 비롯된다. 임의의 특정 작동 이론에 얽매이지 않으며, 본원에 기재된 방법, 조성물, 시스템 및 키트는 이들이 이상 부위(예컨대, Holliday 구조 또는 이음부, 분지된 DNA, Y-구조, 십자형, 헤테로듀플렉스 루프, 거대 부가물(bulky adduct), 단일 가닥 오버행, DNA 미스매치, 또는 완전하게-매칭되지 않은 DNA)를 표적으로 하므로 예기치 않게 효과적이다. 그러한 이상 부위는 멀티플렉스 증폭에서 대다수의 비특이적 증폭 생성물의 특징이며, 놀랍게도, 이러한 이상 부위를 표적으로 함에 의해, 멀티플렉스 증폭은 상당한 백분율의 표적-특이적 증폭 생성물을 무손상인 채로 두면서 현저하게 정화될 수 있다.
예를 들어, 주형-의존성 프라이머 신장 반응으로부터 비특이적 증폭 생성물을 감소시키는 방법은 복수의 표적 핵산을 복수의 쌍의 표적-특이적 프라이머를 이용하여 증폭시키는 단계로서, 상기 증폭이 복수의 표적-특이적 증폭 생성물 및 복수의 비특이적 증폭 생성물을 생성하는, 단계; 이상 DNA 구조를 인지하는 레솔바제를 도입시키고 상기 비특이적 증폭 생성물을 레솔바제로 절단하여, 상당한 비율의 상기 복수의 표적-특이적 증폭 생성물을 유지하면서 복수의 절단된 비특이적 증폭 생성물을 생성하는 단계를 포함할 수 있다. 임의의 적절한 레솔바제가 이용될 수 있다. 특히, 레솔바제는 T4 엔도뉴클레아제 VII 또는 T7 엔도뉴클레아제 I 중 하나일 수 있다. 일부 예에서 레솔바제는 T4 엔도뉴클레아제 VII이다.
예를 들어, 주형-의존성 프라이머 신장 반응으로부터 비특이적 증폭 생성물을 감소시키는 방법은 복수의 표적 핵산을 복수의 쌍의 표적-특이적 프라이머를 이용하여 증폭시켜 복수의 표적-특이적 증폭 생성물 및 복수의 비특이적 증폭 생성물을 포함하는 혼합물을 형성하는 단계; 이상 DNA 구조를 인지하는 레솔바제를 혼합물에 도입시키고 복수의 비특이적 증폭 생성물을 레솔바제로 절단하여, 상당한 비율의 상기 복수의 표적-특이적 증폭 생성물을 유지하면서 복수의 절단된 비특이적 증폭 생성물을 생성하는 단계로서, 레솔바제가 T4 엔도뉴클레아제 VII 또는 T7 엔도뉴클레아제 I 중 하나인, 단계; 및 절단된 비특이적 증폭 생성물을 제거하여, 상당한 비율의 상기 복수의 표적-특이적 증폭 생성물을 남기는 단계를 포함할 수 있다.
주형-의존성 프라이머 신장 반응으로부터 비특이적 증폭 생성물을 감소시키는 방법은 복수의 표적 핵산을 복수의 쌍의 표적-특이적 프라이머를 이용하여 증폭시켜 복수의 표적-특이적 증폭 생성물 및 복수의 비특이적 증폭 생성물을 포함하는 혼합물을 형성하는 단계; T4 엔도뉴클레아제 VII을 혼합물에 도입시키는 단계로서, T4 엔도뉴클레아제 VII이 비특이적 증폭 생성물 상의 이상 DNA 구조를 인지하는, 단계; 복수의 비특이적 증폭 생성물을 T4 엔도뉴클레아제 VII로 절단하여 50% 초과의 상기 복수의 표적-특이적 증폭 생성물을 유지하면서 복수의 절단된 비특이적 증폭 생성물을 생성하는 단계; 및 절단된 비특이적 증폭 생성물을 제거하여, 상당한 비율의 상기 복수의 표적-특이적 증폭 생성물을 남기는 단계를 포함할 수 있다.
임의의 이러한 방법에서, 폴리뉴클레오티드의 증폭 및 레솔바제로의 절단 후에, DNA 라이가제는 특이적 표적(및 그 결과가 아닌, 비특이적 생성물)에서 발생한 임의의 닉(nick)을 봉쇄하는데 사용될 수 있고, 표적을 증폭시키기 위해 1라운드 이상의 PCR이 수행될 수 있다. 그러한 경우에, 제1 복수의 쌍의 표적-특이적 프라이머는 제2 PCR 프라이머의 서열의 적어도 일부를 함유할 수 있다.
예를 들어, 주형-의존성 프라이머 신장 반응으로부터 비특이적 증폭 생성물을 감소시키는 방법은 복수의 표적 핵산을 복수의 쌍의 표적-특이적 프라이머를 이용하여 증폭시켜 복수의 표적-특이적 증폭 생성물 및 복수의 비특이적 증폭 생성물을 포함하는 혼합물을 형성하는 단계; 이상 DNA 구조를 인지하는 레솔바제를 혼합물에 도입시키고 복수의 비특이적 증폭 생성물을 레솔바제로 절단하여, 상당한 비율의 상기 복수의 표적-특이적 증폭 생성물을 유지하면서 복수의 절단된 비특이적 증폭 생성물을 생성하는 단계로서, 레솔바제가 T4 엔도뉴클레아제 VII 또는 T7 엔도뉴클레아제 I 중 하나인, 단계; 절단된 비특이적 증폭 생성물을 제거하여, 상당한 비율의 상기 복수의 표적-특이적 증폭 생성물을 남기는 단계; 표적-특이적 증폭 생성물 상의 닉을 DNA 라이가제로 수복시키는 단계; 및 표적-특이적 증폭 생성물을 재증폭시키는 단계를 포함할 수 있다.
임의의 이러한 방법에서, 상기 방법은 또한 절단된 비특이적 증폭 생성물을 제거하여, 상당한 비율의 상기 복수의 표적-특이적 증폭 생성물을 남기는 단계를 포함할 수 있다.
본원에 기재된 임의의 방법은 표적-특이적 증폭 생성물을 분석하는 단계를 포함할 수 있다. 분석은 시퀀싱, 예컨대 차세대 시퀀싱 반응을 비제한적으로 포함하는 임의의 적절한 방법 또는 기술을 포함할 수 있다.
증폭은 특히 멀티플렉스 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 포함하는 임의의 적절한 폴리뉴클레오티드 증폭 기술을 포함할 수 있다.
일반적으로, 표적 핵산은 DNA 또는 RNA, 예를 들어, 유전체 DNA 또는 cDNA를 포함할 수 있다.
표적-특이적 프라이머는 임의의 적절한 복수의 쌍, 예컨대 10쌍 이상(예컨대, 적어도 10쌍)의 표적-특이적 프라이머, 10쌍 내지 100,000쌍, 10쌍 내지 1000쌍, 1,000쌍 내지 100,000쌍, 100,000쌍 이상의 표적-특이적 프라이머를 포함할 수 있다(기타 등등).
본원에 기재된 임의의 방법에서, 레솔바제는 이상 폴리뉴클레오티드(예컨대, DNA) 구조를 인지한다. 특히, 레솔바제는 Holliday 구조 또는 이음부, 분지된 DNA, Y-구조, 십자형, 헤테로듀플렉스 루프, 거대 부가물, 단일 가닥 오버행, DNA 미스매치, 또는 완전하게-매칭되지 않은 DNA 중 적어도 하나를 포함하는 이상 폴리뉴클레오티드 구조를 인지한다.
임의의 이러한 방법은 레솔바제 도입 및/또는 레솔바제로의 처리 전 또는 후에, 복수의 표적-특이적 증폭 생성물 및 복수의 비특이적 증폭 생성물 상의 말단 수복을 수행하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 임의의 방법은 레솔바제를 도입하기 전에 복수의 표적-특이적 증폭 생성물 및 복수의 비특이적 증폭 생성물 상의 말단 수복을 수행하는 것을 포함할 수 있다.
임의의 이러한 방법은 레솔바제의 도입 후에 어댑터를 상당한 비율의 상기 복수의 표적-특이적 증폭 생성물에 라이게이션하는 것을 포함할 수 있다. 어댑터는 적어도 3개의 연속적인 포스포로티오에이트를 포함할 수 있다.
언급된 대로, 임의의 이러한 방법은 상기 비특이적 증폭 생성물을 엑소뉴클레아제로 절단하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 임의의 이러한 방법은 복수의 표적-특이적 증폭 생성물 및 복수의 비특이적 증폭 생성물 상의 말단-수복 및 어댑터 라이게이션을 수행한 후에 상기 비특이적 증폭 생성물을 람다 엑소뉴클레아제 또는 E. 콜라이(E. coli) 엑소뉴클레아제 I 중 적어도 하나를 포함하는 엑소뉴클레아제로 절단하는 단계를 포함할 수 있다.
레솔바제로의 처리는 임의의 적절한 조건(예컨대, 레솔바제 농도, 처리 시간, 온도, 등)에서 수행될 수 있다. 일반적으로, 상기 비특이적 증폭 생성물을 레솔바제로 절단하는 단계는 비특이적 증폭 생성물 및 복수의 표적-특이적 증폭 생성물을 약 0.2 유닛(U) 내지 1000 U의 하나 이상의 레솔바제에 약 0.5분 내지 60분(예컨대, 0.5분 내지 30분, 20분, 15분, 등) 동안 10℃ 내지 40℃(예컨대, 보다 특히 16℃ 내지 37℃)에서 노출시키는 것을 포함할 수 있다.
본원에 기재된 임의의 방법에서 레솔바제 처리는 소정의 상당한 비율의 상기 복수의 표적-특이적 증폭 생성물이 혼합물에 유지되도록 적정될 수 있다. 상당한 비율의 복수의 표적-특이적 증폭 생성물은 30% 이상(및/또는 30% 초과), 40% 이상(및/또는 40% 초과), 50% 이상(및/또는 50% 초과), 60% 이상(및/또는 60% 초과), 70% 이상(및/또는 70% 초과), 80% 이상(및/또는 80% 초과), 90% 이상(및/또는 90% 초과), 95% 이상(및/또는 95% 초과)의 복수의 표적-특이적 증폭 생성물을 포함할 수 있다. 따라서, 레솔바제 반응이 수행될 수 있지만, 표적-특이적 증폭 생성물의 상당한 절단을 방지하기 위해 중단될 수 있다. 이는 상기 논의된 레솔바제 처리 조건을 조정함에 의해 조정될 수 있다(예컨대, 약 0.5분 내지 60분, 예컨대, 0.5분 내지 30분, 20분, 15분, 등, 10℃ 내지 40℃, 예컨대, 보다 특히 16℃ 내지 37℃에서 약 0.2 유닛(U) 내지 1000 U의 하나 이상의 레솔바제). 적절한 레솔바제 완충제 조건은 본원에 기재된 대로 이용될 수 있다.
또한 본원에 기재된 임의의 방법을 수행하기 위한 키트가 본원에 기재된다. 예를 들어, 비특이적 증폭 생성물을 선택적으로 제거하는 주형-의존성 프라이머 신장 반응용 키트는 폴리머라제; 복수의 표적-특이적 프라이머 쌍; 증폭 완충제; 레솔바제 완충제; 이상 DNA 구조를 갖는 폴리뉴클레오티드를 인지하고 절단하는 적어도 하나의 레솔바제; 및 증폭 후 증폭 반응으로부터의 비특이적 증폭 생성물을 레솔바제를 이용하여 제거하기 위한 상기 키트에 사용되는 지시서를 포함할 수 있다. 임의의 이러한 키트는 적어도 3개의 포스포로티오에이트를 포함하는 적어도 하나의 핵산 어댑터를 포함하는, 적어도 하나의 핵산 어댑터를 포함할 수 있다.
상기 언급된 대로, 키트의 표적-특이적 프라이머는 적어도 10쌍의 표적-특이적 프라이머(10 이상, 100 이상, 1000 이상, 10,000 이상, 10 내지 100,000, 10 내지 10,000, 10 내지 1000, 100 내지 100,000, 100 내지 10,000, 100 내지 1000, 1000 내지 100,000, 1000 내지 10,000, 등)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 키트는 약 1,000 내지 약 100,000 표적-특이적 프라이머를 포함할 수 있다. 일부 변형에서, 키트는 100,000 이상의 표적-특이적 프라이머를 포함할 수 있다.
키트는 이상 폴리뉴클레오티드(예컨대, DNA) 구조, 예컨대 Holliday 구조 또는 이음부, 분지된 DNA, Y-구조, 십자형, 헤테로듀플렉스 루프, 거대 부가물, 단일 가닥 오버행, DNA 미스매치, 또는 완전하게-매칭되지 않은 DNA 중 적어도 하나를 포함하는 이상 폴리뉴클레오티드 구조를 인지하는 임의의 적절한 레솔바제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 레솔바제는 T4 엔도뉴클레아제 VII일 수 있다.
본원에 기재된 임의의 키트는 또한 비특이적 증폭 생성물을 절단하기 위한 하나 이상의 엑소뉴클레아제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 키트는 비특이적 증폭 생성물을 절단하기 위한 엑소뉴클레아제를 포함할 수 있고, 엑소뉴클레아제는 람다 엑소뉴클레아제 또는 E. 콜라이 엑소뉴클레아제 I을 포함한다.
또한 복수의 표적 핵산을 복수의 쌍의 표적-특이적 프라이머를 이용하여 증폭시켜 복수의 표적-특이적 증폭 생성물 및 복수의 비특이적 증폭 생성물을 포함하는 혼합물을 형성하는 단계; 혼합물을 이상 DNA 구조를 갖는 폴리뉴클레오티드를 인지하고 이에 결합하는 단백질에 도입시켜, 상당한 비율의 복수의 표적-특이적 증폭 생성물을 유지하면서 상기 비특이적 증폭 생성물을 제거하는 단계로서, 상기 이상 DNA 구조가 Holliday 구조 또는 이음부, 분지된 DNA, Y-구조, 십자형, 헤테로듀플렉스 루프, 거대 부가물, 단일 가닥 오버행, DNA 미스매치, 또는 완전하게-매칭되지 않은 DNA 중 적어도 하나를 포함하는, 단계를 포함하는, 주형-의존성 프라이머 신장 반응으로부터 비특이적 증폭 생성물을 감소시키는 방법이 본원에 기재된다.
특히, 이상 DNA 구조를 갖는 폴리뉴클레오티드를 인지하고 이에 결합하는 단백질은 MutS일 수 있다. 일반적으로, 이상 DNA 구조를 갖는 폴리뉴클레오티드를 인지하고 이에 결합하는 단백질은 기질에 결합될 수 있다. 본원에 상세히 설명된 대로, 비특이적 증폭 생성물을 ?g수하지만 절단하지는 않기 위해 이용된 효소는 상이한 종으로부터의 임의의 MutS, 또는 인간 엔도뉴클레아제 V일 수 있다. 바람직한 효소는 E. 콜라이로부터의 MutS, 또는 E. 콜라이 및 T. 아쿠아티쿠스(T. aquaticus)로부터의 MutS의 혼합물, 및 인간 엔도뉴클레아제 V이다.
상기 언급된 대로, 본원에 기재된 임의의 방법은, 예를 들어 시퀀싱(예컨대, 차세대 시퀀싱 반응)에 의해, 표적-특이적 증폭 생성물을 분석하는 단계를 포함할 수 있다.
일반적으로 증폭은 멀티플렉스 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 수행하는 것을 포함할 수 있다. 표적 핵산은 DNA 및/또는 RNA를 포함할 수 있다. 표적 핵산은 유전체 DNA 또는 cDNA이다. 임의의 적절한 수의 표적-특이적 프라이머가 사용될 수 있다(예컨대, 10, 100, 1000, 10,000, 100,000 초과, 등).
언급된 대로, 본원에 기재된 임의의 방법은 또한 이상 DNA 구조를 갖는 폴리뉴클레오티드를 인지하고 이에 결합하는 단백질을 도입시키기 전에 복수의 표적-특이적 증폭 생성물 및 복수의 비특이적 증폭 생성물 상의 말단 수복을 수행하는 단계를 포함할 수 있다. 임의의 이러한 방법은 이상 DNA 구조를 갖는 폴리뉴클레오티드를 인지하고 이에 결합하는 단백질의 도입 후에 어댑터를 상당한 비율의 상기 복수의 표적-특이적 증폭 생성물에 라이게이션시키는 것을 포함할 수 있다. 어댑터는 적어도 3개의 연속적인 포스포로티오에이트를 포함할 수 있다.
이상 DNA 구조를 갖는 폴리뉴클레오티드를 인지하고 이에 결합하는 단백질을 도입시키는 단계는 비특이적 증폭 생성물 및 복수의 표적-특이적 증폭 생성물을 임의의 적절한 시간 및 인큐베이션 조건, 예컨대 약 0.5분 내지 60분(예컨대, 0.5분 내지 40분, 0.5 내지 30분, 0.5분 내지 20분, 등) 동안 약 10℃ 내지 40℃(예컨대 15℃ 내지 37℃, 20℃ 내지 40℃, 등)에서 인큐베이션시키는 것을 포함할 수 있다.
증폭 반응, 예컨대 본원에 기재된 멀티플렉스 PCR에서 비특이적 증폭 생성물을 감소시키는 방법은 복수의 DNA 프라이머를 사용하게 만드는 임의의 반응일 수 있는 증폭 반응의 임의의 적절한 구성을 포함할 수 있다. 멀티플렉스 PCR 반응은 당 분야에 공지된 임의의 멀티플렉스 PCR일 수 있다. 보다 구체적으로, 주형은 임의의 공급원으로부터의 DNA일 수 있고; 임의의 호열성 DNA 폴리머라제가 사용될 수 있으며, 비제한적으로, 임의의 기능적 pH, 염 농도, 첨가제, dNTP의 농도, 프라이머, 및 10 내지 100,000 이상(또는 그 초과)의 임의의 수의 프라이머 쌍이 이용될 수 있다. 사용된 프라이머 쌍의 수에 따라 2 내지 30 이상의 임의의 기능적인 수의 증폭 반응 사이클이 또한 이용될 수 있다. 일부 예에서, 증폭 반응, 예컨대 멀티플렉스 PCR로부터 생성된 비특이적 증폭 생성물은 본원 및 하기에 더욱 상세하게 기재된 방법 및/또는 키트를 사용한 후에 증폭 생성물의 총 양의 약 0%에서 약 50%까지 감소될 수 있다. 본원에서 상세하게 설명한 대로, 비특이적 증폭 생성물을 절단하는데 사용된 효소("레솔바제")는 정의된 이상 DNA 구조-특이적 효소로부터의 어느 하나일 수 있다. 바람직하지만 비제한적인 효소는 T7 엔도뉴클레아제 I 또는 T4 엔도뉴클레아제 VII이다.
일반적으로, 레솔바제는 이상 DNA 구조를 특이적으로 인지하고 이상 DNA 구조에서 또는 근처에서 절단하는 효소 또는 효소의 집합이다. 따라서, 레솔바제는 이상 DNA 구조-특이적 효소(총칭적으로 본원에서 레솔바제로서 언급됨)로서 언급될 수 있고 폴리뉴클레오티드 상의 이상 DNA 구조에서 또는 근처에서 비특이적 증폭 생성물을 절단할 수 있다. 이상 DNA 구조는 Holliday 구조 또는 이음부, 분지된 DNA, Y-구조, 십자형, 헤테로듀플렉스 루프, 거대 부가물, 단일 가닥 오버행, DNA 미스매치, 또는 다른 완전하게-매칭되지 않은 DNA 중 적어도 하나를 포함할 수 있다. 이들은 두 가닥 초과의 단일 가닥 DNA 단편을 포함하는 구조를 추가로 포함할 수 있다. 이들은 현저한 염기쌍 없이 프라이머 또는 프라이머-주형 DNA의 응집물일 수 있다. 바람직한 이상 DNA 구조-특이적 효소는 T7 엔도뉴클레아제 I 또는 T4 엔도뉴클레아제 VII이다. 레솔바제일 수 있는(또는 레솔바제로서 작용하는 효소의 칵테일의 일부로서 이용될 수 있는) 다른 효소는 Holliday 이음부 레솔바제, Ser-재조합효소, Tyr-재조합효소, Cre 재조합효소, Hin 재조합효소, 인테그라제, 재조합효소 A (RecA), 등을 포함할 수 있다. 이들 중 하나 이상(예컨대, 조합물)이 이용될 수 있다.
본원에서 상세하게 설명된 대로, 효소적 절단 후에, 절단된 비특이적 증폭 생성물은 정제(AMPure 비드 또는 컬럼 여과와 같은 크기 선택에 의한 임의의 일반적인 정제 방법에 의해)에 의해 제거될 수 있거나, 대안적으로, 제거되지 않을 수 있다. 더욱이, 및 본원에 기재된 대로, 특이적 증폭 생성물의 닉은, 예컨대, 하기 효소 중 어느 하나를 이용하여, 추가로 채워질 수 있다: 9°N™ DNA 라이가제, Taq DNA 라이가제, Tth DNA 라이가제, Tfi DNA 라이가제, Ampligase®, 등. 그 후, 특이적 증폭 생성물은, 특히 네스티드(nested) 프라이머가 증폭 반응에 이용될 때, PCR에 의해 추가로 증폭될 수 있다.
추가로, 증폭 후 및 효소적 절단 전에, 증폭 생성물은 당업자에게 공지된 방법에 의해 말단 수복될 수 있다. 어댑터는 라이게이션에 의해 상기 말단-수복된 특이적 증폭 생성물의 양 말단에 첨가될 수 있다. 이용된 라이가제는 T4 DNA 라이가제 및 하기 중 하나의 조합물이다: 9°N™ DNA 라이가제, Taq DNA 라이가제, Tth DNA 라이가제, Tfi DNA 라이가제, Ampligase®, 등. 어댑터는 3' 또는 5' 말단 포스포로티오에이트, 또는 바이오틴, 또는 엑소뉴클레아제의 분해로부터 어댑터를 보호하는 다른 화학기 또는 단백질을 함유할 수 있다. 어댑터의 라이게이션 후, 절단된 비특이적 증폭 생성물은 당업자에게 공지된 엑소뉴클레아제에 의해 추가로 분해될 수 있다. 엑소뉴클레아제에 의한 절단된 비특이적 증폭 생성물의 분해 후, 어댑터-라이게이션된 특이적 증폭 생성물은 PCR에 의해 추가로 증폭될 수 있다.
따라서, 감소된 비특이적 증폭 생성물을 갖는 증폭 반응을 생성하는 방법이 기재되고 이는 적어도 하나의 표적 핵산을 포함하는 핵산 샘플을 제공하는 단계; 적어도 하나의 표적 핵산을 표적-특이적 프라이머를 이용하여 증폭시키는 단계로서, 증폭이 복수의 표적-특이적 증폭 생성물 및 복수의 비특이적 증폭 생성물을 생성하는, 단계; 및 비특이적 증폭 생성물을 절단하기 위한 이상 DNA 구조-특이적 효소를 도입시켜, 상당한 비율의 복수의 표적-특이적 증폭 생성물을 유지하면서 복수의 절단된 비특이적 증폭 생성물을 생성하는 단계를 포함할 수 있다.
언급된 대로, 임의의 이러한 방법은 절단된 비특이적 증폭 생성물을 제거하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이상 DNA 구조-특이적 효소(레솔바제)는 이상 DNA 구조에서 비특이적 증폭 생성물을 절단할 수 있다. 이상 DNA 구조는 Holliday 구조 또는 이음부, 분지된 DNA, Y-구조, 십자형, 헤테로듀플렉스 루프, 거대 부가물, 단일 가닥 오버행, DNA 미스매치, 또는 다른 완전하게-매칭되지 않은 DNA 중 적어도 하나를 포함할 수 있다. 이들은 두 가닥 초과의 단일 가닥 DNA 단편을 포함하는 구조를 추가로 포함할 수 있다. 이들은 현저한 염기쌍 없이 프라이머 또는 프라이머-주형 DNA의 응집물일 수 있다. 바람직한 이상 DNA 구조-특이적 효소는 T7 엔도뉴클레아제 I 또는 T4 엔도뉴클레아제 VII이다.
본원에 기재된 방법은 절단된 비특이적 증폭 생성물을 엑소뉴클레아제와 조합시키는 단계를 포함할 수 있다. 엑소뉴클레아제는 람다 엑소뉴클레아제 또는 E. 콜라이 엑소뉴클레아제 I 중 적어도 하나일 수 있다. 추가로, 상기 방법은 절단된 비특이적 증폭 생성물을 엑소뉴클레아제와 조합시키기 전에, 표적-특이적 증폭 생성물이 엑소뉴클레아제에 의한 절단으로부터 보호되게 하는 것을 포함할 수 있다. 보호는 어댑터를 상기 표적-특이적 증폭 생성물의 양 말단에 라이게이션시키는 것을 포함할 수 있다. 어댑터는 적어도 3개의 연속적인 포스포로티오에이트를 포함할 수 있다. 임의로, 적어도 3개의 연속적인 포스포로티오에이트는 3개, 4개, 5개, 또는 6개의 연속적인 포스포로티오에이트를 포함할 것이다. 추가로, 상기 방법은 T4 DNA 라이가제에 의해 수행되는 라이게이션을 포함할 수 있다. 추가로, 라이게이션은 9°N™ DNA 라이가제, Taq DNA 라이가제, Tth DNA 라이가제, Tfi DNA 라이가제, 또는 Ampligase® 중 적어도 하나를 추가로 수반할 수 있다.
언급된 대로, 증폭 반응으로부터 비특이적 증폭 생성물을 제거하기 위한 키트가 기재된다. 키트는 적어도 하나의 이상 DNA 구조-특이적 효소(레솔바제); 완충제; 및 상기 증폭 반응으로부터 비특이적 증폭 생성물을 제거하기 위한 키트의 사용을 위한 지시서를 포함할 수 있다. 키트는 적어도 하나의 핵산 어댑터를 포함할 수 있다. 적어도 하나의 핵산 어댑터는 적어도 3개의 포스포로티오에이트를 포함할 수 있다. 추가로, 적어도 3개의 포스포로티오에이트는 3개, 4개, 5개, 또는 6개의 포스포로티오에이트를 포함할 수 있다. 적어도 3개의 포스포로티오에이트는 연속적일 수 있다. 키트는 멀티플렉스 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 수행하기 위한 시약을 추가로 포함할 수 있고, 시약은 적어도 완충제, dNTP, DNA 폴리머라제, 및, 임의로, 적어도 한 쌍의 표적-특이적 프라이머를 포함한다. 적어도 한 쌍의 표적-특이적 프라이머는 적어도 10쌍의 표적-특이적 프라이머를 포함할 수 있다. 추가로, 키트는 적어도 하나의 엑소뉴클레아제를 포함할 수 있다. 적어도 하나의 엑소뉴클레아제는 람다 엑소뉴클레아제 또는 E. 콜라이 엑소뉴클레아제 I을 포함할 수 있다.
증폭 반응으로부터 비특이적 증폭 생성물을 제거하기 위한 키트는 적어도 하나의 DNA 미스매치-결합 단백질; 완충제; 및 증폭 반응으로부터 비특이적 증폭 생성물을 제거하기 위한 키트의 사용을 위한 지시서를 포함할 수 있다. DNA 미스매치-결합 단백질은, 예컨대, MutS일 수 있다.
증폭 반응에서 비특이적 증폭 생성물을 감소시키는데 사용되는 이상 DNA 구조-특이적 효소가 본원에 기재된다. 이상 DNA 구조-특이적 효소는 이상 DNA 구조의 시작 부근 또는 이상 DNA 구조에서 비특이적 증폭 생성물을 절단할 수 있다. 이상 DNA 구조는 Holliday 구조 또는 이음부, 분지된 DNA, Y-구조, 십자형, 헤테로듀플렉스 루프, 거대 부가물, 단일 가닥 오버행, DNA 미스매치, 또는 다른 완전하게-매칭되지 않은 DNA 중 적어도 하나를 포함할 수 있다. 이들은 두 가닥 초과의 단일 가닥 DNA 단편을 포함하는 구조를 추가로 포함할 수 있다. 이들은 현저한 염기쌍 없이 프라이머 또는 프라이머-주형 DNA의 응집물일 수 있다. 이상 DNA 구조-특이적 효소는 T7 엔도뉴클레아제 I 또는 T4 엔도뉴클레아제 VI이다.
본 발명의 새로운 특징은 이하의 청구범위에 구체적으로 개시된다. 본 발명의 특징 및 이점에 대한 더 나은 이해는 본 발명의 원리가 활용되는 예시적인 구체예를 설명하는 다음의 상세한 설명, 및 첨부 도면을 참조하여 얻어질 것이다:
도 1은 이상 폴리뉴클레오티드 구조를 갖는 비특이적 증폭 생성물을 절단함에 의해 멀티플렉스 PCR에서 생성된 비특이적 생성물을 제거하기 위한 본 개시 내용의 방법을 개략적으로 설명한다.
도 2는 이상 폴리뉴클레오티드 구조를 갖는 비특이적 증폭 생성물의 흡수에 의해 멀티플렉스 PCR에서 생성된 비특이적 생성물을 제거하기 위한 본 개시 내용의 방법의 또 다른 예를 도시한다.
도 3은 멀티플렉스 증폭 반응으로부터 표적 폴리뉴클레오티드 증폭 생성물을 얻기 위한 본 개시 내용의 방법의 또 다른 예를 설명한다.
도 4는 본원에 기재된 대로 멀티플렉스 증폭 반응으로부터 표적 DNA 단편을 얻기 위한 또 다른 잠재적인 방법을 도시한다.
도 5는 멀티플렉스 증폭 반응으로부터 표적 증폭 생성물을 얻기 위한 본 개시 내용의 대안적인 방법을 설명한다.
도 6a는 다양한 처리 파라메터(예컨대, 37℃에서 10분 동안 레솔바제의 유닛)에서 레솔바제 (이 예에서 T4 엔도뉴클레아제 VII)의 적정의 한 예의 결과를 도시하는 그래프이다.
도 6b는 도 6a에 도시된 것과 유사한 적정 곡선에서 비특이적 증폭 생성물의 남아 있는 양을 도시하는 그래프이다(비특이적 증폭 생성물은 "프라이머-다이머"로서 언급된다).
도 7a 및 7b는 멀티플렉스 증폭 반응 혼합물로부터 비특이적 증폭 생성물을 제거하는 최적 조건을 찾아내기 위해 이용될 수 있는 상이한 처리 조건(37℃에서 1 U, 5 U, 10 U)에서 레솔바제 (이 예에서 T4 엔도뉴클레아제 VII)의 시간 경과를 예시하는 그래프이다.
도 8a는 비특이적 증폭 생성물에 기인한 전형적인 배경을 도시하는 멀티플렉스 증폭 반응의 한 예를 예시한다. 이 예에서, 비특이적 증폭 생성물은 요망되는 특이적 증폭 생성물("표적")을 압도한다.
도 8b는 비특이적 증폭 생성물에서 이상 부위를 절단함에 의해 비특이적 증폭 생성물을 선택적으로 제거하기 위해 레솔바제(예컨대, T4 엔도뉴클레아제 VII)로 처리함에 의해 주형-의존성 프라이머 신장 반응으로부터 비특이적 증폭 생성물을 감소시키는 방법을 도식적으로 예시한다.
도 8c 및 8d는 비특이적 증폭 생성물을 선택적으로 제거하기 위해 레솔바제로 처리함에 의해 비특이적 증폭 생성물을 감소시키는 방법의 효과를 예시하는 예를 도시한다; 도 8c는 레솔바제로의 처리 전 결과를 도시하고, 도 8d는 처리 후 결과를 도시하며, 이들은 207쌍의 프라이머에 의한 멀티플렉스 증폭 반응에서 생성된 비특이적 증폭 생성물의 제거를 예시한다.
도 9a 및 9b는 207쌍의 긴 프라이머에 의한 멀티플렉스 증폭 반응에서 생성된 비특이적 증폭 생성물의 제거의 또 다른 예를 도시한다; 도 9a는 레솔바제로의 처리 전 결과를 예시하고, 도 9b는 비특이적 증폭 생성물의 처리 및 분해 후 결과를 도시한다.
도 10A-10F는 멀티플렉스 증폭 반응(이 예에서, 207쌍의 프라이머 이용)으로부터 비특이적 증폭 생성물을 제거하기 위한 본원에 기재된 방법에 의한 다양한 DNA 폴리머라제의 이용을 예시한다.
도 11은 본원에 기재된 비특이적 증폭 생성물을 제거하기 위한 방법에 의해 여전히 효과적으로 처리되면서 전체 농도가 높을수록 수율이 높아짐을 나타내는 표적 암플리콘의 전체 수율에 대한 프라이머 쌍의 전체 농도를 증가시킨 효과를 예시하는 그래프이다. 이 예에서, 207쌍의 프라이머가 사용되었다.
도 12는 본원에 기재된 비특이적 증폭 생성물을 제거하기 위한 방법에 의한 멀티플렉스 증폭(다시 207쌍의 프라이머를 사용함) 동안 어닐링 및 신장 지속의 효과를 예시하는 그래프이다.
도 13은 2915쌍의 프라이머를 수반한 멀티플렉스 증폭 반응(PCR)에서 본원에 기재된 비특이적 증폭 생성물을 제거하기 위한 방법의 예를 예시한다.
도 14는 16000쌍의 프라이머를 수반한 멀티플렉스 증폭 반응(예컨대, PCR)에서 본원에 기재된 비특이적 증폭 생성물을 제거하기 위한 방법의 또 다른 예이다.
도 15는 인간 유방암으로부터 포르말린-고정된 파라핀 임베디드(FFPE) DNA를 이용한 207쌍의 프라이머에 의한 멀티플렉스 증폭 반응의 예를 예시한다.
도 16은 하기 기재된 대로 207쌍의 포스포릴화된 프라이머를 이용한 멀티플렉스 증폭의 실패한 실험 예의 결과를 예시한다.
도 17은 본원에 기재된 대로 비특이적 증폭 생성물을 제거하기 위해 멀티플렉스 증폭 및 레솔바제로의 처리를 이용하여(이 예에서, 207쌍의 프라이머를 사용함) 라이브러리(예컨대, 시퀀싱용)를 제조한 결과의 예를 도시한다.
도 18은 본원에 기재된 대로 비특이적 증폭 생성물을 제거하기 위해 멀티플렉스 증폭 및 레솔바제로의 처리를 이용하여(이 예에서, 2915쌍의 프라이머를 사용함) 라이브러리(예컨대, 시퀀싱용)를 제조하는 방법의 또 다른 예를 예시한다.
도 19는 본원에 기재된 대로 비특이적 증폭 생성물을 제거하기 위해 멀티플렉스 증폭 및 레솔바제로의 처리를 이용하여(이 예에서, 207쌍의 프라이머를 사용함) 라이브러리(예컨대, 시퀀싱용)를 제조하는 방법의 또 다른 예를 예시한다.
도 20은 본원에 기재된 대로 비특이적 증폭 생성물을 제거하기 위해 멀티플렉스 증폭 및 레솔바제로의 처리를 이용하여(이 예에서, 207쌍의 긴 프라이머를 사용함) 라이브러리(예컨대, 시퀀싱용)를 제조하는 방법의 또 다른 예를 예시한다.
도 21a는 라이브러리(예컨대, 시퀀싱용)를 제조하는 방법을 도식적으로 예시한다. 도 21b는 본원에 기재된 대로 비특이적 증폭 생성물을 제거하기 위해 16000쌍의 긴 프라이머를 사용한 멀티플렉스 증폭 및 레솔바제로의 처리를 이용하여 라이브러리를 제조하는 도 21a에 도시된 것과 같은 방법의 결과를 예시한다.
도 22는 비특이적 증폭 생성물을 제거하기 위해 멀티플렉스 증폭 및 레솔바제로의 처리를 이용하여(이 예에서, 207쌍의 프라이머를 사용함) 본원에 기재된 바와 같은 방법을 이용하여 제조된 라이브러리로부터 시퀀싱에 기반한 품질 확인을 예시하는 표(또한 본원에서 표 1로서 언급됨)를 보여준다.
도 23은 본원에 기재된 대로 비특이적 증폭 생성물을 제거하기 위해 멀티플렉스 증폭 및 레솔바제로의 처리를 이용한 방법의 라이브러리(207쌍의 긴 프라이머에 의해 생성됨)로부터 시퀀싱 결과에 기반한 품질 확인을 예시하는 표(또한 본원에서 표 2로서 언급됨)이다.
도 24는 본원에 기재된 대로 비특이적 증폭 생성물을 제거하기 위해 멀티플렉스 증폭 및 레솔바제로의 처리를 이용한 방법의 라이브러리(16000쌍의 프라이머에 의해 생성됨)로부터 시퀀싱 결과에 기반한 품질 확인을 예시하는 표(본원에서 표 3으로서 언급됨)이다.
상세한 설명
일반적으로, 다수의 상이한 뉴클레오티드 영역을 증폭시킬 때 비특이적 증폭 생성물(예컨대, 프라이머-다이머)를 감소시킴에 의해 표적-특이적 증폭 생성물을 증폭시키거나 증폭을 개선시키기 위해 이용될 수 있는 방법, 조성물, 시스템 및 키트가 본원에 기재된다. 이러한 방법, 조성물, 시스템 및 키트는 전형적으로 이상 DNA 구조를 인지하여 이에 결합하고/거나 절단하는 하나 이상의 레솔바제를 포함하거나 이의 이용을 포함한다.
예를 들어, 본원에 제공된 방법은 복수의 DNA 프라이머 또는 올리고뉴클레오티드를 수반하는 멀티플렉스 증폭(예컨대, PCR) 프로토콜 또는 임의의 다른 방법의 개선에 이용될 수 있다. 보다 특히, 본원에 제공된 방법은 복수의 DNA 프라이머 또는 올리고뉴클레오티드를 수반하는 멀티플렉스 PCR 프로토콜 또는 임의의 다른 방법에서 비특이적 증폭 생성물을 감소시키는데 이용될 수 있다. 본원에 기재된 방법은 멀티플렉스 PCR 반응을 수행하는 최적 프로토콜을 제공하여, 비특이적 증폭 생성물은 제거되고 표적 DNA 암플리콘은 보존되도록 한다. 전반적으로, 상기 방법은 핵산 라이브러리의 개선된 제조 방법과 관련될 수 있다.
한 양태에서, 상기 방법은 증폭 반응으로부터 비특이적 증폭 생성물의 감소를 제공한다. 상기 방법은 적어도 하나의 표적 핵산을 포함하는 핵산 샘플을 제공하는 것을 포함할 수 있다. 핵산은 RNA 또는 DNA일 수 있다. DNA는 유전체 DNA 또는 cDNA 또는 이의 임의의 조합물일 수 있다. DNA는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. DNA는 진핵생물 세포, 고세균 세포, 박테리아 세포, 마이코박테리아 세포, 박테리오파지, DNA 바이러스, 또는 RNA 바이러스로부터 유래되거나, RNA로부터 전환될 수 있다. 일부 경우에, DNA는 포유동물로부터 유래될 수 있다. 일부 경우에, DNA는 인간으로부터 유래될 수 있다. DNA는 변형되지 않을 수 있거나, 변형될 수 있다(예컨대, 메틸화, 당화, 등). 핵산은 증폭 반응에 이용될 수 있다. 증폭 반응에 이용된 핵산은 적어도 하나의 표적 핵산 서열을 포함할 수 있다. 표적 핵산 서열은 일반적으로 핵산의 혼합물에서, 예를 들어, 표적-특이적 프라이머에 의해 표적화되고 풍부화된 핵산 서열을 의미한다. 증폭 반응은 복수의 DNA 프라이머 또는 올리고뉴클레오티드를 이들의 상응하는 표적에 하이브리드화시키는 것을 포함하는 임의의 방법일 수 있다. 증폭은 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)일 수 있다. 한 예에서, 증폭 반응은 멀티플렉스 PCR이다. 다른 예에서, 증폭 반응은 라이게이션 신장, 네스티드 멀티플렉스 PCR, 전체 유전체 증폭, 전체 엑손 증폭, 또는 한 쌍 초과의 올리고뉴클레오티드에 의한 등온 증폭 반응, 등에 의한 증폭일 수 있다. 한 예를 들자면, 멀티플렉스 PCR은 복수의 암플리콘을 생성하기 위해 단일 용기(즉, 튜브, 웰, 바이알, 등)에서 복수의 표적 핵산의 동시 증폭을 제공한다. 멀티플렉스 PCR은 일반적으로 복수의 표적 핵산을 선택적으로 풍부화시킬 수 있는 복수의 표적-특이적 프라이머 쌍의 이용을 포함한다. 복수의 표적-특이적 프라이머 쌍은 10 미만의 프라이머 쌍 내지 100,000 이상의 프라이머 쌍일 수 있다. 한 경우에, 복수의 표적-특이적 프라이머 쌍은 적어도 10쌍의 표적-특이적 프라이머 쌍을 포함한다. 또 다른 경우에, 복수의 표적-특이적 프라이머 쌍은 약 10 내지 약 100 프라이머 쌍을 포함한다. 또 다른 경우에, 복수의 표적-특이적 프라이머 쌍은 약 100 내지 약 1,000 프라이머 쌍을 포함한다. 또한 또 다른 경우에, 복수의 표적-특이적 프라이머 쌍은 약 1,000 내지 약 100,000 프라이머 쌍을 포함한다. 추가 경우에, 복수의 표적-특이적 프라이머 쌍은 100,000 이상의 프라이머 쌍을 포함한다.
프라이머는 변형되지 않은 염기 및/또는 포스포다이에스테르 결합, 또는 변형된 염기 및/또는 포스포다이에스테르 결합, 보호되지 않은 5' 말단, 또는 보호된 5' 말단, 5' 포스포릴화되거나 5' 포스포릴화되지 않은 말단을 포함할 수 있다. 프라이머 쌍은 암플리콘 길이가 100개 이하 내지 1000개 이상의 염기쌍일 수 있도록 설계될 수 있다. 본 개시 내용에서 구상된 멀티플렉스 PCR 반응은 PCR 반응에 일반적으로 사용되는 열안정성 DNA 폴리머라제에 의해 수행될 수 있다. 열안정성 DNA 폴리머라제는 야생형일 수 있거나, 3'-5', 5'-3', 또는 둘 모두의 3'-5' 및 5'-3' 엑소뉴클레아제 활성을 가질 수 있거나, 보다 높은 정확도를 위해 열안정성 폴리머라제의 혼합물일 수 있거나, 긴 암플리콘을 합성할 수 있거나, 더 빠른 합성 속도를 지닐 수 있다. 적합한 열안정성 DNA 폴리머라제의 예는 Taq DNA 폴리머라제일 수 있다. PCR에 대한 열 프로파일(온도 및 시간)은 최적화될 수 있고, 프라이머 농도 또한 최고의 성능을 달성하도록 최적화될 수 있다. 마지막으로 암플리콘의 최적 증폭을 촉진할 수 있는 임의의 첨가제가 이용될 수 있다. 이러한 첨가제는 비제한적으로 디메틸 설폭사이드, 베타인, 포름아미드, Triton X-100, Tween 20, Nonidet P-40, 4-메틸모르폴린 N-옥사이드, 테트라메틸암모늄 클로라이드, 7-데아자-2'-데옥시구아노신, L-프롤린, 소혈청 알부민, 트레할로스, 및 T4 유전자 32 단백질을 포함한다.
본원에 기재된 방법은 표적 핵산을 표적-특이적 프라이머를 이용하여 증폭시키는 단계를 포함할 수 있고, 증폭 단계는 복수의 표적-특이적 증폭 생성물 및 복수의 비특이적 증폭 생성물을 생성한다. 멀티플렉스 PCR 반응은 복수의 표적-특이적 증폭 생성물 및 복수의 비특이적 증폭 생성물을 포함하는 복수의 증폭 생성물을 생성할 수 있다. 일부 경우에, 복수의 표적-특이적 증폭 생성물은 증폭 반응에서 가장 풍부한 증폭 생성물일 수 있고(즉, 증폭 반응 생성물의 50% 초과), 다른 경우에, 복수의 비특이적 증폭 생성물이 증폭 반응에서 가장 풍부한 증폭 생성물일 수 있다. 일부 경우에, 감소된 비특이적 증폭 생성물을 갖는 증폭 반응을 생성하기 위해(즉, 표적-특이적 증폭 생성물이 증폭 반응에서 가장 풍부한 증폭 생성물이 되도록) 비특이적 증폭 생성물을 제거하거나 감소시키는 것이 바람직할 수 있다.
비특이적 증폭 생성물은 종종 증폭 반응에서 표적-특이적 증폭 생성물을 분석하는 능력을 방해할 수 있는 멀티플렉스 PCR 반응의 바람직하지 않은 부산물이다. 비특이적 증폭 생성물의 형성은 멀티플렉스 PCR 반응에 활용된 프라이머 쌍의 수에 의존적일 수 있다. 증폭 반응에서 비특이적 증폭 생성물의 형성은 사용된 프라이머 쌍의 수, 반응 온도, 반응의 염 농도, 프라이머의 길이, 프라이머의 GC 함량, 이차 구조 형성, 및 프라이머-프라이머 결합과 프라이머-주형 결합 간의 경쟁을 포함하는 다수의 인자에 의존적일 수 있는 복잡한 과정일 수 있다. 멀티플렉스 PCR의 초기 사이클에서, 비특이적 증폭 생성물은 프라이머들 간의 부분적 어닐링, 또는 프라이머-주형 DNA 간의 부분적 어닐링을 통해, 또는 현저한 염기쌍 없이 프라이머 및/또는 프라이머 및 주형 DNA의 응집에 의해 처음 형성된다. 멀티플렉스 PCR의 이러한 초기 단계에서, 이러한 비특이적 증폭 생성물은 완전하게 매칭되지 않은 DNA의 영역을 그 구조의 일부로서 함유할 수 있다(즉, 부분적으로 어닐링된 부분은 완전하게 매칭되지 않은 DNA 구조를 함유하고, 새롭게 합성된 부분은 완전하게 매칭된 이중 가닥 DNA이다). 멀티플렉스 PCR의 후기 사이클에서, 완전하게 매칭되지 않은 이러한 영역은 완전하게 매칭된 이중 가닥 DNA가 된다(즉, 비특이적 증폭 생성물의 전체 구조는 완전한 염기쌍의 이중 가닥 DNA가 된다).
놀랍게도, 본 발명자들은 제한된 수의 PCR 사이클(즉, 8-28회 사이클) 내에서, 멀티플렉스 PCR 생성물을 이상 DNA 구조의 절단을 선호하는 조건 하에 T4 엔도뉴클레아제 VII로 처리함에 의해 비특이적 증폭 생성물이 감소될 수 있다고 판단하였다. T4 엔도뉴클레아제 VII 및 T7 엔도뉴클레아제 I, 기타 등등은 광범한 스펙트럼의 기질을 갖는 효소의 그룹에 속한다. T4 엔도뉴클레아제 VII 및 T7 엔도뉴클레아제 I은 완전하게 매칭된 이중 가닥 DNA에서 벗어난 다양한 이상 DNA 구조를 인지하고, 이상 DNA 구조의 시작 1-10개 염기 내에서 DNA의 한 가닥 또는 두 가닥 모두를 절단함이 일련의 간행물에서 보고되었다. 이러한 이상 DNA 구조는 분지된 DNA, Y-구조, 십자형, 헤테로듀플렉스 루프, 거대 부가물, 단일 가닥 오버행, 미스매치, Holliday 구조 또는 이음부, 및 다른 종류의 완전하게-매칭되지 않은 DNA를 포함한다. 이들은 두 가닥 초과의 단일 가닥 DNA 단편을 포함하는 구조를 추가로 포함할 수 있다. 이들은 현저한 염기쌍 없이 프라이머 또는 프라이머-주형 DNA의 응집물일 수 있다. 놀랍게도, 멀티플렉스 PCR의 처음 8-28회 사이클에서 형성된 비특이적 증폭 생성물은 T4 엔도뉴클레아제 VII과 유사한 활성을 갖는 효소에 의해 절단될 수 있는 다양한 이상 이중 가닥 및 단일 가닥 DNA 구조를 함유한다. 멀티플렉스 PCR의 처음 8-28회 사이클에서 생성된 비특이적 증폭 생성물이 T4 엔도뉴클레아제 VII에 의한 절단을 통해 제거될 수 있는 방법, 조성물, 시스템 및 키트가 본원에 기재된다. 이러한 발견은 본 개시 내용의 방법에 특히 유용하다.
본원에 기재된 방법은 비특이적 증폭 생성물을 절단하기 위한 효소를 증폭 반응과 접촉시켜 복수의 절단된 비특이적 증폭 생성물을 생성하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "접촉"은 본원에 기재된 대로 기존의 혼합물에 그러한 효소를 도입하는 것과 동일하다. 본 개시 내용의 방법은 이상 DNA 구조를 인지하고 절단할 수 있는 다양한 효소를 이용할 수 있다. 일부 경우에, 본원에 기재된 방법을 수행하는데 유용한 효소는 이상 DNA 구조-특이적 효소이다. 용어 "이상 DNA 구조-특이적 효소"는 이상 DNA 구조에 결합하여 이를 절단하는 효소를 나타내기 위해 본원에서 이용될 것이다. 이상 DNA 구조에 결합하여 이를 절단하는 효소를 나타내기 위해 복수 형태가 본원에서 이용될 것이다. 이상 DNA 구조-특이적 효소는 일반적으로 적어도 2쌍의 불완전하게 매칭된(즉, 비상보적) 염기의 스트레치에서 이상 이중 가닥 DNA 구조 내에 또는 근방의 어느 한 가닥(즉, 센스 또는 안티센스) 상에 적어도 하나의 파손 또는 절단 사건을 만드는 적어도 하나의 활성을 가질 것이나 이로 제한되는 것은 아니다. 이러한 이상 DNA 구조-특이적 효소는 이상 DNA 구조의 절단에 제한되지 않는 복수의 효소적 활성을 가질 수 있다. 이상 DNA 구조-특이적 효소는 이중 가닥 DNA의 단일 가닥에 파손 또는 닉을 발생시키는 DNA 백본의 포스포다이에스테르 결합을 절단할 수 있다. 본원에 기재된 이상 DNA 구조-특이적 효소는 비제한적으로 Holliday 구조 또는 이음부, 분지된 DNA, Y-구조, 십자형, 헤테로듀플렉스 루프, 거대 부가물, 단일 가닥 오버행, 미스매치, 및 다른 종류의 완전하게-매칭되지 않은 DNA를 포함하는 다양한 이상 DNA 구조를 인지할 수 있다. 이들은 두 가닥 초과의 단일 가닥 DNA 단편을 포함하는 구조를 추가로 포함할 수 있다. 이들은 현저한 염기쌍 없이 프라이머 또는 프라이머-주형 DNA의 응집물일 수 있다. 일부 경우에, 이상 DNA 구조-특이적 효소는 특정 유형의 이상 DNA 구조를 인지할 수 있다. 다른 경우에, 이상 DNA 구조-특이적 효소는 한 유형 초과의 이상 DNA 구조를 인지할 수 있다. 본원에 제공된 방법은 복수의 표적-특이적 증폭 생성물 및 복수의 비특이적 증폭 생성물을 포함하는 증폭 반응에서 생성된 이상 DNA 구조를 인지하고 이를 절단할 수 있는 이상 DNA 구조-특이적 효소를 조합시킬 수 있다. 일부 경우에, 이상 DNA 구조-특이적 효소는 비특이적 증폭 생성물을 선택적으로 절단할 수 있다. 일부 경우에, 이상 DNA 구조-특이적 효소는 비특이적 증폭 생성물 및 표적-특이적 증폭 생성물 둘 모두를 절단할 수 있다. 일부 예에서, 이상 DNA 구조-특이적 효소는 표적-특이적 증폭 생성물의 양을 감소시키지 않으며 증폭 반응에서 비특이적 증폭 생성물의 양을 감소시킬 수 있다. 다른 예에서, 둘 모두의 비특이적 증폭 생성물 및 표적-특이적 증폭 생성물이 감소될 수 있다. 일부 경우에, 증폭 반응에는 비특이적 증폭 생성물이 실질적으로 없을 수 있다. 비특이적 증폭 생성물이 실질적으로 없다는 것은 증폭 반응에서 비특이적 증폭 생성물의 양이 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 초과, 최대 100%만큼 감소되었음을 의미할 수 있다.
본원에 제공된 방법에서 이상 DNA 구조를 절단하는데 활용될 수 있는 이상 DNA 구조-특이적 효소의 예는, 비제한적으로, 파지 T7로부터의 박테리오파지 Holliday 이음부 레솔바제 T7 엔도뉴클레아제, 또는 파지 T3, YeO3-12로부터의 이의 동족체; 파지 T4로부터의 T4 엔도뉴클레아제 VII, 또는 파지 YeO3-12, L5, D29로부터의 이의 동족체; 파지 람다로부터의 Rap, 폭스바이러스로부터의 A22, 또는 파지 P22, H-19B, 933W, 21, PS34, VT2-Sa, D3으로부터의 이들의 동족체; 파지 bIL66/67/70으로부터의 RuvC-유사 엔도뉴클레아제, 또는 파지 sk1, c2, vML3, 712로부터의 동족체; r1t로부터의 RusA, 파지 SPP1로부터의 G44P, 또는 파지 Tuc, ul36, g1e, 82, HK122/97, PVL, TM4, A118로부터의 이들의 동족체; flap 엔도뉴클레아제 (FEN), 또는 박테리아, 고세균 및 진핵생물로부터의 이의 동족체; 엔도뉴클레아제 V 또는 E. 콜라이 엔도뉴클레아제 V, 써모토가 마리티마(Thermotoga maritima) 엔도뉴클레아제 V를 포함하는 박테리아, 고세균 및 진핵생물로부터의 이의 동족체; RuvC, RecU, Hjc, Hje, Hjr, CCE1, YDC2, XPG 부류를 포함하는 박테리아, 고세균 및 진핵생물로부터의 구조-특이적 엔도뉴클레아제: GEN1/Yen1, UvrC 부류: Slx1-Slx4, ERCC4 부류: Xpf(Xpf-Ercc1), Mus81(MUS81-EME1/Mms4); 박테리아로부터의 미스매치 수복 효소 MutHLS; 진균 및 식물로부터의 단일 가닥 특이적 뉴클레아제(이들은 아스퍼질루스 오리제(Aspergillus oryzae)로부터의 S1 뉴클레아제를 포함한다), 페니실리움 시트리눔(Penicillium citrinum)으로부터의 P1 뉴클레아제, 녹두(mung bean) 뉴클레아제, 또는 CEL 뉴클레아제 패밀리(CEL I 및 SP1)를 포함한다. 본원에 제공된 방법에서 이상 DNA 구조에 결합하나 이를 절단하지 않는데 활용될 수 있는 효소의 예는, 비제한적으로, 박테리아로부터의 MutS 또는 인간 엔도뉴클레아제 V를 포함한다. 특정 예에서, 이상 DNA 구조-특이적 효소는 T7 엔도뉴클레아제 I 또는 T4 엔도뉴클레아제 VII일 수 있다. 본질적으로 본원에 기재된 본 개시 내용의 방법을 수행할 수 있는 임의의 이상 DNA 구조-특이적 효소 또는 이의 돌연변이체가 구상됨이 이해되어야 한다. 보다 특히, 이상 DNA 구조를 절단하거나 이에 결합할 수 있는 임의의 이상 DNA 구조-특이적 효소 또는 돌연변이체가 이용될 수 있다.
본 개시 내용의 다른 방법에서, 비특이적 증폭 생성물은 이상 DNA 구조의 절단 없이 증폭 반응으로부터 제거될 수 있다. 이 경우에, 복수의 표적-특이적 증폭 생성물 및 비특이적 증폭 생성물을 포함하는 증폭 반응은 DNA 미스매치-결합 단백질과 접촉할 수 있다. 이러한 유형의 단백질은 DNA 합성 또는 재조합 동안 DNA 미스매치를 인지하고 수복하기 위한 시스템인 미스매치 수복 경로에 수반된 효소일 수 있다. 이러한 예에서, DNA 미스매치-결합 단백질은 핵산 샘플에서 쌍을 이루지 않은 염기의 스트레치를 포함하는 DNA 염기쌍 미스매치(즉, 비상보적 염기쌍)에 선택적으로 결합할 수 있다. 이러한 예에서, 비특이적 증폭 생성물은 DNA 미스매치-결합 단백질에 선택적으로 결합할 수 있는 반면, 표적-특이적 증폭 생성물은 DNA 미스매치-결합 단백질에 결합하지 않을 것이다. 본원에 기재된 방법에 유용한 DNA 미스매치-결합 단백질은 핵산 샘플의 적어도 하나의 DNA 미스매치를 인지하고 이에 결합할 수 있는 임의의 DNA 미스매치-결합 단백질일 수 있다. 한 특정 예에서, DNA 미스매치-결합 단백질은 MutS일 수 있다. MutS는 박테리아, 일부 경우에 E. 콜라이 또는 T. 아쿠아티쿠스로부터 유래될 수 있다. 일부 경우에, DNA 미스매치-결합 단백질은 고체 지지체 상에 고정될 수 있다. 이 예에서, 비특이적 증폭 생성물은 고체 지지체 상에 흡수되어 증폭 반응으로부터 제거될 수 있다. 비록 특정 예가 기재되었으나, 비특이적 증폭 생성물에 선택적으로 결합할 수 있는 본질적으로 임의의 물질이 이용될 수 있다.
일부 경우에, 상기 방법은 증폭 반응으로부터 절단된 비특이적 증폭 생성물을 제거하는 단계를 포함할 수 있다. 다른 경우에, 절단된 비특이적 증폭 생성물은 제거되지 않는다. 절단된 비특이적 생성물은 엑소뉴클레아제에 의해 작은 올리고뉴클레오티드 및 뉴클레오티드로 추가로 분해될 수 있다. 이들은 이중 가닥-DNA-특이적 엑소뉴클레아제 및 단일 가닥-DNA-특이적 엑소뉴클레아제를 포함한다. 일부 경우에, 엑소뉴클레아제는 람다 엑소뉴클레아제, E. 콜라이 엑소뉴클레아제 I, 또는 둘의 조합물일 수 있다. 이 예에서, 엑소뉴클레아제에 의한 분해로부터 표적-특이적 증폭 생성물의 말단을 보호하는 것이 바람직할 수 있다. 이 경우에, 엑소뉴클레아제는 표적-특이적 증폭 생성물이 아니라 비특이적 증폭 생성물을 분해할 것이다. 한 예에서, 표적-특이적 증폭 생성물을 분해로부터 보호하는 것은 어댑터를 표적-특이적 증폭 생성물의 말단에 라이게이션시키는 것을 포함할 수 있다. 이러한 어댑터는 센스-가닥의 3' 말단에 복수의 연속적인 포스포로티오에이트를 지닐 수 있다. 포스포로티오에이트는 뉴클레아제에 의한 절단에 내성인 정상 DNA의 변종이다. 일부 경우에, 어댑터는 센스-가닥의 3' 말단에 3개, 4개, 5개, 6개, 또는 6개 초과의 연속적인 포스포로티오에이트를 포함할 수 있다. 한 예에서, 어댑터는 하기에 보다 상세하게 기재된 대로, 차세대 시퀀싱용 라이브러리를 제조하는데 이용되는 어댑터일 수 있다. 어댑터는 바코드 또는 태그를 추가로 포함할 수 있다. 어댑터-라이게이션된 표적 DNA 단편은 PCR에 의해 추가로 증폭될 수 있다. 일부 경우에, 어댑터는 센스 가닥의 5' 말단에서 포스포릴화된다. 일부 경우에, 어댑터의 안티-센스 가닥의 3' 말단은 티민(T) 오버행을 가질 수 있다. 이 예에서, 어댑터의 T 오버행은 말단-수복된, A-테일드(tailed) 표적-특이적 증폭 생성물에 라이게이션될 수 있다.
일부 경우에, 본원에 기재된 증폭 생성물은 차세대 시퀀싱용 라이브러리를 제조하는데 이용될 수 있다. 차세대 시퀀싱 적용에 유용한 어댑터는 상기 기재된 대로, 표적-특이적 증폭 생성물의 말단에 라이게이션될 수 있다. 일부 경우에, 어댑터는 센스-가닥의 3' 말단에 복수의 연속적인 포스포로티오에이트를 가질 수 있다. 일부 경우에, 어댑터는 센스-가닥의 3' 말단에 3개, 4개, 5개, 6개, 또는 6개 초과의 연속적인 포스포로티오에이트를 포함할 수 있다. 어댑터는 차세대 시퀀싱 플랫폼 상에서 유용한 시퀀싱 어댑터일 수 있다(예컨대, Illumina TruSeq 어댑터). 예를 들어, 본 발명의 방법은 미국 특허 번호 5,750,341(Macevicz); 6,306,597(Macevicz); 및 5,969,119(Macevicz)에 기재된 대로, Illumina에 의해 상용화된 방법에 의해 차세대 시퀀싱에 유용하다.
키트
본 개시 내용은 본원에 기재된 방법을 실시하는데 유용한 키트를 추가로 제공한다. 한 양태에서, 본 개시 내용은 멀티플렉스 PCR 반응을 수행하고 비특이적 증폭 생성물을 감소시키기 위한 키트를 제공한다. 이 예에서, 키트는 멀티플렉스 PCR 반응에 사용하기 적합한 시약, 예를 들어, 비제한적으로, 완충제, dNTP, 및 DNA 폴리머라제(예컨대, Taq DNA 폴리머라제)를 포함할 수 있다. 멀티플렉스 PCR 반응에 사용하기 위한 복수의 프라이머 쌍은 따로 판매될 수 있다. 일부 경우에, 프라이머 쌍은 주문품(custom-made)이다. 일부 경우에, 프라이머 쌍은 고객에 의해 선택된다. 일부 경우에, 프라이머 쌍은 표적-특이적 프라이머 쌍이다. 다른 경우에, 프라이머 쌍은 무작위 프라이머 쌍일 수 있다. 프라이머 쌍은 10 내지 100,000 이상의 프라이머 쌍을 포함할 수 있다. 이 예의 키트는 비특이적 증폭 생성물을 감소시키는데 적합한 이상 DNA 구조-특이적 효소 및 완충제를 추가로 포함할 수 있다(예컨대, T4 엔도뉴클레아제 VII). 이 예의 키트는 제2 라운드의 PCR을 수행하기 위한 DNA 폴리머라제(예컨대, Taq DNA 폴리머라제) 및 한 쌍의 PCR 프라이머를 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 경우에, 본 개시 내용은 차세대 시퀀싱을 위한 어댑터-라이게이션된 라이브러리를 제조하기 위한 키트를 제공한다. 이 예에서, 키트는 멀티플렉스 PCR 반응을 수행하고 비특이적 증폭 생성물을 감소시키기 위한 상기 기재된 임의의 시약 뿐만 아니라 라이브러리 제조용 추가 시약을 포함할 수 있다. 라이브러리 제조용 추가 시약은, 비제한적으로, 말단 수복에 적합한 효소 및 완충제(예컨대, Klenow 폴리머라제 및/또는 T4 DNA 폴리머라제), 증폭 생성물의 5' 말단을 포스포릴화하는데 적합한 효소 및 완충제(예컨대, T4 폴리뉴클레오티드 키나제), A-테일링(tailing)에 적합한 효소 및 완충제(예컨대, Taq DNA 폴리머라제), 라이게이션 반응을 수행하는데 적합한 어댑터, DNA 라이가제 및 완충제, 엑소뉴클레아제(예컨대, 람다 엑소뉴클레아제, 엑소뉴클레아제 I), 및 어댑터-라이게이션된 핵산을 증폭시키기 위한 PCR 프라이머를 포함할 수 있다. 어댑터는 본원에 기재된 대로 임의의 어댑터 또는 이의 조합물일 수 있고, 복수의 포스포로티오에이트를 포함하는 어댑터 및/또는 차세대 시퀀싱에 적합한 어댑터를 포함한다. DNA 라이가제는 T4 DNA 라이가제 및 9°N™ DNA 라이가제, Taq DNA 라이가제, Tth DNA 라이가제, Tfi DNA 라이가제, 및 Ampligase®로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 추가적인 라이가제를 포함할 수 있다. 어댑터-라이게이션된 핵산을 증폭시키는데 사용되는 PCR 프라이머는 어댑터 서열의 적어도 일부를 어닐링하는 서열을 포함할 수 있다.
또 다른 경우에, 본 개시 내용은 멀티플렉스 PCR 반응 및 비특이적 증폭 생성물을 감소시키기 위한 대안적인 방법을 수행하는 키트를 제공한다. 이 예에서, 키트는 멀티플렉스 PCR 반응에 사용하기 적합한 시약, 예를 들어, 비제한적으로, 완충제, dNTP, 및 DNA 폴리머라제(예컨대, Taq DNA 폴리머라제)를 포함할 수 있다. 멀티플렉스 PCR 반응에 사용하기 위한 복수의 프라이머 쌍은 따로 판매될 수 있다. 일부 경우에, 프라이머 쌍은 주문품이다. 일부 경우에, 프라이머 쌍은 고객에 의해 선택된다. 일부 경우에, 프라이머 쌍은 표적-특이적 프라이머 쌍이다. 다른 경우에, 프라이머 쌍은 무작위 프라이머 쌍일 수 있다. 프라이머 쌍은 10 내지 100,000 이상의 프라이머 쌍을 포함할 수 있다. 키트는 DNA-미스매치 결합 단백질, 예를 들어, MutS를 추가로 포함할 수 있다. 일부 경우에, MutS가 표면에 결합된 고체 지지체가 키트에 제공될 수 있다. 다른 경우에, MutS 및 고체 지지체는 MutS를 고체 지지체에 결합시키기에 적합한 시약과 따로 제공될 수 있다. 키트는 본 개시 내용의 방법을 수행하는데 적합한 임의의 적합한 세척 완충제, 용리 완충제, 등을 추가로 포함할 수 있다.
이제 본 개시 내용의 특정 양태 및 도면에 대한 특정 참조가 이루어질 것이다. 그러한 양태는 단지 예로서 제공된 것이다. 본 개시 내용을 벗어나지 않으며 당업자에게 다양한 변형, 변경, 및 대체가 이제 가능할 것이다.
도 1에서, 멀티플렉스 PCR은 주형 DNA, 프라이머, dNTP 및 열안정성 DNA 폴리머라제에 의해 수행된다. 프라이머 쌍의 수는 단일 튜브 또는 웰에서의 단일 반응에서 10 이하 내지 100,000 이상의 임의의 수일 수 있다. PCR 생성물은 표적 DNA 단편, 즉, 암플리콘, 및 이상 DNA 구조를 함유하는 다양한 비특이적 생성물을 포함한다. 생성물은 표적 DNA 단편은 무손상인 채로 유지하면서, 이상 DNA 구조의 근방에 이중 가닥 파손을 발생시키는 T4 엔도뉴클레아제 VII과 접촉한다. 절단된 비특이적 생성물을 제거하기 위해 추가 정제되거나 정제되지 않은 표적 DNA 단편을 수득하고, 다양한 다운스트림 적용에 이용한다. 단일 가닥 DNA를 작은 올리고뉴클레오티드 및 뉴클레오티드로 분해하기 위해 멀티플렉스 PCR 후에 E. 콜라이 엑소뉴클레아제 I을 T4 엔도뉴클레아제 VII과 함께 이용할 수 있다. 표적 DNA 단편은 닉 번역에 의해 형광 또는 방사성동위원소로 표지될 수 있고 마이크로어레이, 하이브리드화, 또는 검출 및 진단을 위한 다른 기술로 분석될 수 있다. 추가로, 표적 DNA 단편의 닉은 다음 효소 중 임의의 하나로 채워질 수 있다: 9°N™ DNA 라이가제, Taq DNA 라이가제, Tth DNA 라이가제, Tfi DNA 라이가제, Ampligase®, 등. 닉을 채운 후, 네스티드 프라이머가 멀티플렉스 PCR에 사용되는 경우 DNA 단편은 PCT에 의해 추가로 증폭될 수 있다.
도 1에서 멀티플렉스 PCR에서 생성된 비특이적 증폭 생성물을 제거하기 위한 절차의 개략도는, 멀티플렉스 PCR 후, 비특이적 증폭 생성물이 레솔바제(이 예에서, T4 엔도뉴클레아제 VII)에 의해 절단될 수 있고 임의로 정제에 의해 제거될 수 있음을 보여준다. 표적 암플리콘은 후속 단계에서 직접 사용되거나, 수율을 증가시키거나 추가적인 서열, 예컨대 어댑터를 추가하기 위해 추가 라운드의 PCR을 거칠 수 있고, 라이브러리로서 이용될 수 있다.
대안적으로 또는 추가로, 폴리뉴클레오티드의 이상부에 결합하는 단백질(예컨대, 레솔바제)은 비특이적 결합 증폭 생성물에 결합하여 단순히 이를 절단하기보다 제거하는데 이용될 수 있다. 예를 들어, 레솔바제 또는 레솔바제의 이상부-결합 부분은 고체상 기질에 묶일 수 있다. 도 2는 멀티플렉스 PCR에서 생성된 비특이적 증폭 생성물을 제거하기 위한 절차의 개략도이다. 멀티플렉스 PCR 후, 비특이적 증폭 생성물은 상이한 유기체로부터의 고정된 MutS 또는 고정된 MutS의 조합물 상에 흡수되는 한편, 표적 DNA 단편은 용해 상태이고 비특이적 생성물로부터 분리된다. 고정된 MutS는 컬럼 또는 카트리지에 함유될 수 있고 E. 콜라이 또는 써무스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus)로부터 올 수 있다. MutS는 폴리뉴클레오티드의 이상부에 결합하기 위한 하나 이상의 결합 부위를 포함한다.
도 2에서, 멀티플렉스 PCR은 주형 DNA, 프라이머, dNTP 및 호열성 DNA 폴리머라제에 의해 수행된다. 프라이머 쌍의 수는 단일 튜브 또는 웰에서의 단일 반응에서 10 이하 내지 100,000 이상의 임의의 수일 수 있다. PCR 생성물은 표적 DNA 단편, 즉, 암플리콘, 및 이상 DNA 구조를 함유하는 다양한 비특이적 생성물을 포함한다. 이러한 PCR 생성물은 상이한 유기체로부터의 고정된 MutS 또는 고정된 MutS의 조합물과 접촉한다. 비특이적 생성물은 고정된 단백질 상에 흡수되는 한편, 표적 DNA 단편은 용해 상태이고 비특이적 생성물로부터 분리된다. 언급된 대로, 고정된 MutS는 E. 콜라이 또는 써무스 아쿠아티쿠스로부터 올 수 있다.
본원에 기재된 임의의 방법을 이용하여 라이브러리를 생성할 수 있다; 라이브러리는, 예를 들어, 시퀀싱에 이용될 수 있다. 이는 도 3 및 21a에 예시되어 있다. 도 3은 멀티플렉스 PCR에서 생성된 비특이적 증폭 생성물 및 표적 암플리콘으로부터의 라이브러리를 제거하기 위한 절차의 개략도이다. 상기 절차는 DNA 단편의 말단들의 말단 수복, 비특이적 생성물의 절단, 어댑터 라이게이션, 라이게이션되지 않은 어댑터의 제거 및 라이브러리의 추가 증폭을 포함한다.
도 3에서, 멀티플렉스 PCR은 주형 DNA, 포스포릴화되지 않은 프라이머, dNTP 및 열안정성 DNA 폴리머라제에 의해 수행된다. 프라이머 쌍의 수는 단일 튜브 또는 웰에서의 단일 반응에서 10 이하 내지 100,000 이상의 임의의 수일 수 있다. 생성물은 표적 DNA 단편, 즉, 암플리콘, 및 이상 DNA 구조를 함유하는 다양한 비특이적 생성물을 포함한다. PCR 후, 생성물은 T4 DNA 폴리머라제에 의해 말단-수복되어 평활 말단(blunt-end)을 만든 다음, T4 폴리뉴클레오티드 키나제에 의해 5'-말단을 포스포릴화하고, 이어서 Taq 폴리머라제에 의해 dATP를 함유하는 완충제에서 A를 3' 말단에 추가한다. 그 후 생성물은 표적 DNA 단편은 무손상인 채로 유지하면서, T4 엔도뉴클레아제 VII과 접촉하여, 이상 DNA 구조에서 또는 근처에서 이중 가닥 파손을 발생시킨다. 그 후 DNA 혼합물은 어댑터와 라이게이션된다. 어댑터는 센스-가닥의 3' 말단에 3 내지 6개의 연속적인 포스포로티오에이트를 함유한다(도 3에서 *N3'로 표시됨). DNA 혼합물이 E. 콜라이 엑소뉴클레아제 I 및 람다 엑소뉴클레아제에 의해 분해될 때, 표적 DNA 단편은 어댑터에 의해 양 측에서 보호되는 한편, 모든 다른 DNA 단편은 작은 올리고뉴클레오티드 및 뉴클레오티드로 분해된다. 표적 DNA 단편은 비특이적 생성물의 파편을 제거하기 위해 추가 정제되거나 정제되지 않고 다양한 다운스트림 적용에 이용될 수 있다.
보다 상세하게, 어댑터는 센스-가닥의 5' 말단에서 포스포릴화된다. 안티센스-가닥의 3' 말단은 말단-수복된 PCR 생성물과의 T-A 라이게이션을 허용하는 여분의 T를 함유한다.
더 상세하게는, 라이게이션 반응은 T4 DNA 라이가제, 및 하기 DNA 라이가제 중 하나를 포함한다: 9°N™ DNA 라이가제, Taq DNA 라이가제, Tth DNA 라이가제, Tfi DNA 라이가제, Ampligase®, 등.
더 상세하게는, 어댑터-라이게이션 및 비특이적 생성물의 제거 후, 표적 DNA 단편은 PCR에 의해 추가로 증폭될 수 있다.
도 4는 멀티플렉스 PCR에서 생성된 비특이적 증폭 생성물 및 표적 암플리콘으로부터의 라이브러리를 제거하기 위한 선견적 절차의 개략도이다. 이러한 절차에, 포스포릴화된 프라이머가 사용된다. 절차는 DNA 단편의 말단들의 말단 수복, 비특이적 생성물의 절단, 어댑터 라이게이션, 라이게이션되지 않은 어댑터의 제거 및 라이브러리의 추가 증폭을 포함한다. 도 4에서, 포스포릴화된 프라이머가 멀티플렉스 PCR에 사용된다. PCR은 주형 DNA, 포스포릴화된 프라이머, dNTP 및 열안정성 DNA 폴리머라제에 의해 수행된다. 프라이머 쌍의 수는 단일 튜브 또는 웰에서의 단일 반응에서 10 이하 내지 100,000 이상의 임의의 수일 수 있다. 생성물은 표적 DNA 단편, 즉, 암플리콘, 및 이상 구조를 함유하는 다양한 비특이적 생성물을 포함한다. 생성물은 T4 엔도뉴클레아제 VII과 접촉하여, 표적 DNA 단편은 무손상인 채로 유지하면서 이상 DNA 구조의 근처에 이중 가닥 파손을 발생시킨다. 그 후 DNA 혼합물은 어댑터로 라이게이션된다. 어댑터는 센스-가닥의 3' 말단에 3 내지 6개의 연속적인 포스포로티오에이트를 함유한다(도 4에서 *N3'로 표시됨). DNA 혼합물이 E. 콜라이 엑소뉴클레아제 I 및 람다 엑소뉴클레아제에 의해 분해될 때, 표적 DNA 단편은 어댑터에 의해 양 측에서 보호되는 한편, 모든 다른 DNA 단편은 작은 올리고뉴클레오티드 및 뉴클레오티드로 분해된다. 표적 DNA 단편은 비특이적 생성물의 파편을 제거하기 위해 추가 정제되거나 정제되지 않고 다양한 다운스트림 적용에 이용될 수 있다. 보다 상세하게, 어댑터는 센스-가닥의 5' 말단에서 포스포릴화될 수 있다. 안티센스-가닥의 3' 말단은 PCR 생성물과의 T-A 라이게이션을 허용하는 여분의 T를 함유한다. 더 상세하게는, 라이게이션 반응은 T4 DNA 라이가제, 및 하기 DNA 라이가제 중 하나를 포함한다: 9°N™ DNA 라이가제, Taq DNA 라이가제, Tth DNA 라이가제, Tfi DNA 라이가제, Ampligase®, 등. 어댑터-라이게이션 및 비특이적 생성물의 제거 후, 표적 DNA 단편은 PCR에 의해 추가로 증폭될 수 있다.
도 5는 멀티플렉스 PCR에서 생성된 비특이적 증폭 생성물 및 표적 암플리콘으로부터의 라이브러리를 제거하기 위한 절차의 또 다른 변형의 개략도를 보여준다. 이러한 절차에서, 라이게이션되지 않은 어댑터는 분해에 의해 제거되지 않는다. 절차는 DNA 단편의 말단들의 말단 수복, 비특이적 생성물의 절단, 어댑터 라이게이션 및 라이브러리의 추가 증폭을 포함한다. 도 5에서, 멀티플렉스 PCR은 주형 DNA, 포스포릴화되지 않은 프라이머, dNTP 및 열안정성 DNA 폴리머라제에 의해 수행된다. 프라이머 쌍의 수는 단일 튜브 또는 웰에서의 단일 반응에서 10 이하 내지 100,000 이상의 임의의 수일 수 있다. 생성물은 표적 DNA 단편, 즉, 암플리콘, 및 이상 구조를 함유하는 다양한 비특이적 생성물을 포함한다. 생성물은 T4 DNA 폴리머라제에 의해 말단-수복되어 평활 말단을 만든 다음, T4 폴리뉴클레오티드 키나제에 의해 5'-말단을 포스포릴화하고, 이어서 Taq 폴리머라제에 의해 dATP를 함유하는 완충제에서 A를 3' 말단에 추가한다. 그 후 생성물은 T4 엔도뉴클레아제 VII과 접촉하여, 표적 DNA 단편은 무손상인 채로 유지하면서 이상 DNA 구조의 근처에 이중 가닥 파손을 발생시킨다. 그 후 DNA 혼합물은 어댑터로 라이게이션된다. 라이게이션된 표적 DNA 단편은 PCR에 의해 추가로 증폭된다.
어댑터는 센스-가닥의 5' 말단에서 포스포릴화될 수 있다. 안티센스-가닥의 3' 말단은 말단-수복된 PCR 생성물과의 T-A 라이게이션을 허용하는 여분의 T를 함유한다. 어댑터는 포스포로티오에이트를 함유하지 않는다. 라이게이션 반응은 T4 DNA 라이가제, 및 하기 DNA 라이가제 중 하나를 포함한다: 9°N™ DNA 라이가제, Taq DNA 라이가제, Tth DNA 라이가제, Tfi DNA 라이가제, Ampligase®, 등.
실시예
하기 실시예는 본 발명의 다양한 구체예를 예시하기 위한 것이며 임의의 방식으로 본 발명을 제한하려는 것이 아니다. 본원에 기재된 방법과 함께, 본 실시예는 현재 바람직한 구체예를 대표하고, 예시하며, 본 발명의 범위를 제한하려는 것이 아니다. 그 안에서의 변경 및 청구범위에 의해 정의된 본 발명의 범위 내에 포함되는 다른 용도는 당업자에게 자명할 것이다.
실시예 1
실시예 1은 위에서 간략하게 논의된 도 1에 도시되며, 주형 DNA, 프라이머, dNTP 및 열안정성 DNA 폴리머라제에 의한 멀티플렉스 PCR의 개략도를 보여준다.
실시예 2
실시예 2는 위에서 간략하게 논의된 도 2에 도시되며, 주형 DNA, 프라이머, dNTP 및 호열성 DNA 폴리머라제에 의한 멀티플렉스 PCR의 방법이다.
실시예 3
위에서 간략하게 논의된 도 3에 도시된 실시예 3은 주형 DNA, 포스포릴화되지 않은 프라이머, dNTP 및 열안정성 DNA 폴리머라제에 의한 멀티플렉스 PCR의 방법이다.
실시예 4
위에서 간략하게 논의된 도 4에 도시된 실시예 4는 멀티플렉스 PCR에 이용된 포스포릴화된 프라이머에 의한 멀티플렉스 PCR의 방법이다.
실시예 5
위에서 간략하게 논의되고 도 5에 도시된 실시예 5는 주형 DNA, 포스포릴화되지 않은 프라이머, dNTP 및 열안정성 DNA 폴리머라제에 의한 멀티플렉스 PCR의 개략도이다.
실시예 6: 반응 조건의 최적화
본원에 기재된 임의의 방법에서, 레솔바제 조건(농도, 완충제, 인큐베이션/처리 시간 및/또는 온도)이 결정될 수 있다. 상당한 비율의 상기 복수의 표적-특이적 증폭 생성물을 유지하면서 주형-의존성 프라이머 신장 반응으로부터 비특이적 증폭 생성물을 감소시키기 위해 레솔바제를 이용하기 위한 일반적인 파라메터가 본원에 제공된다. 예를 들어, 일반적으로 상당한 비율의 표적-특이적 증폭 생성물을 유지하면서 비특이적 증폭 생성물을 레솔바제에 의해 절단하는 것은 비특이적 증폭 생성물 및 복수의 표적-특이적 증폭 생성물을 약 0.2 U 내지 1000 U의 레솔바제에 0.5분 내지 60분 동안 16℃ 내지 37℃에서 노출시키는 것을 포함할 수 있다. 도 6a-7b는 그러한 범위의 결정을 예시한다. 도 6a 및 6b는 207쌍의 프라이머를 수반한 멀티플렉스 PCR에서 비특이적 증폭 생성물을 제거하는데 이용될 수 있는 농도 범위를 찾기 위한 T4 엔도뉴클레아제 VII의 적정을 예시한다. T4 엔도뉴클레아제 VII의 효과는 남아 있는 표적 DNA의 양 또는 남아 있는 프라이머-다이머의 양에 의해 검정되었다. 하기에 보다 상세하게 설명되는 대로, 약 0.5 내지 20(예컨대, 약 10 유닛) 범위의 T4 엔도뉴클레아제 VII이 충분한 것으로 밝혀졌다. 도 7a-7b는 207쌍의 프라이머를 수반한 멀티플렉스 PCR에서 비특이적 증폭 생성물을 제거하기 위한 최적 지속기간을 찾기 위한 T4 엔도뉴클레아제 VII의 시간 경과의 예를 보여준다. T4 엔도뉴클레아제 VII의 효과는 남아 있는 표적 DNA의 양에 의해 검정되었다. 약 0.5분 내지 20분(예컨대, 5분)의 인큐베이션이 충분한 것으로 밝혀졌다.
이상 DNA 구조의 근방에서 다양한 활성으로 DNA를 절단할 수 있는 많은 효소가 있지만, T7 엔도뉴클레아제 I, T4 엔도뉴클레아제 VII 및 E. 콜라이 및 T. 마리티마로부터의 엔도뉴클레아제 V가 시판된다. T7 엔도뉴클레아제 I 및 T4 엔도뉴클레아제 VII 둘 모두는 다양한 이상 DNA 구조에 대해 강력한 활성을 갖는다고 보고된다. T7 엔도뉴클레아제 I은 최대 6개 뉴클레오티드 길이의 5' 돌출 말단을 생산하는 한편 T4 엔도뉴클레아제 VII은 동일한 길이의 3' 돌출 말단을 생성한다. 이러한 2개의 엔도뉴클레아제는 또한 단일 가닥 DNA에 대해 강력한 활성을 갖는다. 이들은 기능적으로 교환가능하다. 엔도뉴클레아제 V는 DNA에서 데옥시아데노신의 탈아미노화 생성물인 데옥시이노신을 인지하는 DNA 수복 효소로서 간주되고, 종종 데옥시이노신 3' 엔도뉴클레아제라고 불린다. 엔도뉴클레아제 V는 다양한 이상 DNA 구조에 대해 약한 활성을 갖는다. 이러한 모든 효소는 이중 가닥 DNA에 무작위 닉을 만든다. 이중 가닥 DNA는 다량의 효소와 장기간 인큐베이션시 점차 작은 조각의 DNA 단편으로 절단될 것이다. 이러한 이유로, T4 엔도뉴클레아제 VII이 하기 실험에 이용되었으나, 다른 레솔바제가 이용될 수 있고 본원에 기재된 방법, 키트 및 조성물은 T4 엔도뉴클레아제 VII에 제한되지 않는다.
T4 엔도뉴클레아제 VII의 최적 농도를 찾기 위해, 본 발명자들을 멀티플렉스 PCR을 수행한 다음 T4 엔도뉴클레아제 VII을 이용하여 증폭 생성물을 처리하였다. 작은 DNA 단편을 자기 비드를 이용한 1 라운드의 정제를 통해 제거하였다. 생성된 DNA를 고 민감성 칩의 BioAnalyzer로 검정하였다.
Ion AmpliSeq™ 핫스팟 암 패널 v2(Life Technologies, 카달로그 번호 4475346)의 프라이머 패널을 멀티플렉스 PCR에 이용하였다. 이 프라이머 패널은 50개 종양유전자 및 종양 억제 유전자로부터의 약 2,800개 COSMIC 돌연변이를 커버한다. 이것은 한 푸울에 207개 프라이머 쌍을 갖는다. 멀티플렉스 PCR 반응은 10μl로 수행되었다. 하기 성분을 0.2ml의 얇은 벽 PCR 튜브(Thomas Scientific, Snapstrip II natural 0.2ml PCR 스트립 튜브, 카달로그 번호 1228F73) 각각에 첨가하였다: 5μl 2배 농축된 프라이머 푸울, 1μl 10X PCR 완충제(1X PCR 완충제: 50 mM TrisHCl, pH8.3, 50 mM KCl, 5 mM MgCl2, 0.8 mM dNTP 각각), 2μl Omni KlenTaq DNA 폴리머라제(4.2 유닛/μl)(Enzymatics, P7500-LC-F), 1μl의 10ng/μl의 인간 DNA(Coriell Institute, NA12878), 및 1μl 증류수.
0.2ml 얇은 벽 PCR 튜브를 부착된 캡으로 덮고, 3초 동안 간단히 볼텍싱하고 미니 원심분리기에서 3초 동안 회전시켰다(Pipette.com, MyFuge 12 place 미니 원심분리기, 카달로그 번호 C1012). PCR 반응 혼합물을 덮기 위해 광유는 필요하지 않았다. 튜브를 써모스 사이클러(GeneAmp® PCR system 9700 96-웰 금 플레이팅됨, Life Technologies, 카달로그 번호 4314878)에 놓았다.
PCR을 초기에 98℃에서 2분 동안 유지한 다음, 17회 사이클의 98℃에서 15초간 변성 및 60℃에서 4분간 어닐링 및 합성이 이어졌다. 사이클링 후, 다음 단계로 진행할 때까지 반응물을 10℃로 유지시켰다.
PCR 후, 하기 성분을 상기 반응물에 직접 첨가하였다: 10μl 2X 분해 완충제(50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 15 mM MgCl2, 20mM 베타 메르캅토에탄올), 1μl T4 엔도뉴클레아제 VII(Affymetrix, part number 78300 50KU), 18μl 증류수. 반응물을 37℃에서 10분 동안 인큐베이션시켰다.
인큐베이션 후, 반응을 1μl 0.5M EDTA로 정지시켰다. DNA를 1.6X MagSi-NGSprep 비드로 1회 정제시켰다. 상자성 비드는 Amsbio LLC(Amsbio LLC, MagSi-NGSprep, 카달로그 번호 MD61021)로부터 얻었다. MagSi-NGSprep 비드를 컨테이너에서 볼텍싱에 의해 완전히 현탁시킨 다음, 증폭되고 조합된 암플리콘의 부피의 1.6배를 나타내는 64μl의 MagSi-NGSprep 비드를 증폭된 암플리콘을 함유하는 튜브에 첨가하였다. 튜브를 볼텍싱에 의해 5초 동안 혼합시키고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션시켰다. 그 후 튜브를 미니 원심분리기에서 3초 동안 회전시키고, 자기 랙에 두어 비드를 2분 동안 포집하였다. 자기 랙 내의 자석은 KJ Magnetics(KJ Magnetics, 카달로그 번호 D4X0DIA-N52)로부터 얻었다. 용액이 정화되면, 상청액을 비드 펠렛을 건드리지 않고 조심스럽게 피펫팅하여 폐기하였다. 자기 랙으로부터 튜브를 제거하지 않고, 150μl의 신선하게 제조된 70% 에탄올을 튜브에 첨가하였다. 그 후 튜브를 자석 랙 상에서 180도로 회전시켜, 비드 펠렛이 각 튜브의 한 쪽 내벽, 및 반대쪽 펠렛으로부터 분리되게 하였다. 용액이 정화되면, 상청액을 비드 펠렛을 건드리지 않고 조심스럽게 피펫팅하여 폐기하였다. 비드를 이러한 방식으로 70% 에탄올로 총 2회 세척하였다. 최종 세척에서 70% 에탄올을 피펫팅한 후, 튜브를 미니 원심분리기에서 3초 동안 회전시켰다. 튜브 내부에 남아 있는 임의의 에탄올 액적을 비드 펠렛을 건드리지 않으며 피펫팅하였다. 비드 펠렛을 튜브 캡이 열린 상태로 자석 랙 상에서 실온에서 3분 동안 공기 건조시켰다. 마지막으로, 자기 랙에서 튜브를 제거하고, 40μl 증류수를 튜브에 첨가하였다. 튜브를 5초 동안 힘차게 볼텍싱하여 비드를 증류수에 재현탁시키고, 미니 원심분리기에서 3초 동안 회전시키고, 자기 랙에 2분 동안 두었다. 용액이 정화된 후, 용리된 DNA 단편을 함유하는 상청액을 새로운 튜브로 옮겼다. DNA 단편을 이 방법에 의해 1.6X MagSi-NGSprep 비드로 총 2회 정제하였다. 최종 정제 후, DNA 단편을 5μl 증류수에 용리시키고, 하기 단계에서 검정하였다.
DNA 단편의 크기, 농도 및 순도는 2100 BioAnalyzer 기계(Agilent Technologies, 카달로그 번호 G2938B)에서 검정되었다. 이전 단계에서 수득된 1μl의 정제된 DNA 단편을 고 민감성 DNA 분석 키트(Agilent Technologies, 카달로그 번호 5067-4626)로 공급업체가 제공한 방법에 따라 검정하였다. 상기 언급된 대로, 도 6a는 37℃에서 10분 후에 0-200 유닛의 T4 엔도뉴클레아제 VII(T4E7로도 언급됨)에 의해 처리된 남아 있는 표적 DNA를 보여준다. 남아 있는 표적 DNA는 예상 크기를 갖는 PCR 생성물을 의미한다. 본 발명자들은 이중 가닥 DNA가 더 높은 농도의 T4 엔도뉴클레아제 VII로 분해되는 것을 보았다. 이것은 또한 유사한 크기를 가진 비특이적 생성물이 표적 DNA를 뒤에 남기며 효소에 의해 제거되었음을 나타낼 수 있다.
도 6b는 37℃에서 10분 후에 0-200 유닛의 T4E7 T4 엔도뉴클레아제 VII에 의해 남아 있는 프라이머-다이머를 보여준다. 비특이적 증폭 생성물의 양은 감소되었다. 또한, 본 발명자들은 비특이적 증폭 생성물의 크기가 BioAnalyzer에 의한 검정에 의해 더 작은 값으로 이동한 것을 봤으며, 이는 이들이 T4 엔도뉴클레아제 VII에 의해 적어도 1회 절단되었음을 나타낸다. 이는 선택적 분해 및/또는 추가 라운드의 폴리머라제 연쇄 반응과 같은 추가 접근법에 의해 이러한 단편의 제거를 용이하게 할 것이다.
비특이적 증폭 생성물은 한번 절단된 후에 제거될 수 있으므로, 상기 결과는 T4 엔도뉴클레아제 VII의 제한된 활성이 충분함을 나타낸다. 이는 비특이적 증폭 생성물을 제거하면서 표적 DNA를 보존할 수 있다.
멀티플렉스 PCR은 상기 기재된 대로 수행되었다. PCR 후, 하기 성분을 상기 반응물에 직접 첨가하였다: 10μl 2X 분해 완충제(50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 15 mM MgCl2, 20mM 베타 메르캅토에탄올), 1μl T4 엔도뉴클레아제 VII(Affymetrix, part number 78300 50KU), 18μl 증류수. 반응물을 37℃에서 다양한 기간 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후, 상기 기재된 대로 반응을 정지시키고, DNA를 정제하고 BioAnalyzer에서 검정하였다.
첫 번째 실험에서, T4 엔도뉴클레아제 VII의 효과를 5분 간격으로 최대 20분 동안 검정하였다(도 7a). 본 발명자들은 낮은 농도(5 유닛)의 T4 엔도뉴클레아제 VII에 의한 표적 DNA의 점진적 감소, 및 10 유닛의 T4 엔도뉴클레아제 VII에서 표적 DNA의 급격한 감소를 보았다. 두 번째 실험에서, T4 엔도뉴클레아제 VII의 효과를 1분 간격으로 최대 9분 동안 검정하였다(도 7b). 이 적정은 37℃에서 5분 후에 10 유닛의 T4 엔도뉴클레아제 VII이 비특이적 증폭 생성물을 제거하는데 충분하다는 것을 발견하였다.
도 8a는 비특이적 증폭 생성물로 인한 전형적인 배경을 보여주는 예시적인 멀티플렉스 증폭 반응을 예시한다. 표적-특이적 증폭 생성물은 이 예에서, 염기쌍(bp)의 크기에 대한 상대적 형광 강도(형광 단위의 양, FU)를 나타내는 그래프에 기반하여, 크기 마커들 사이의 비특이적 증폭 생성물("멀티플렉스 PCR로부터 생성된 배경")에 의해 사실상 뒤덮인다.
실시예 7
도 1 및 3-5에 예시된 방법과 유사한 도 8b는 멀티플렉스 증폭 절차에서 비특이적 증폭 생성물을 감소시키고 표적-특이적 증폭 생성물을 드러내기 위한 레솔바제(예컨대 T4 엔도뉴클레아제 VII)의 이용을 예시한다. 도 8b에서, 레솔바제는, 제시된 대로, 하나 이상의 이상 폴리뉴클레오티드 구조를 갖는 것으로 가정된 비특이적 증폭 생성물인 배경을 표적으로 한다(예컨대, Holliday 구조 또는 이음부, 분지된 DNA, Y-구조, 십자형, 헤테로듀플렉스 루프, 거대 부가물, 단일 가닥 오버행, DNA 미스매치, 또는 완전하게-매칭되지 않은 DNA).
도 8c 및 8d는 이 방법의 작업 예를 예시한다. Ion AmpliSeq™ 핫스팟 암 패널 v2(Life Technologies, 카달로그 번호 4475346)의 프라이머 패널을 멀티플렉스 PCR에 이용하였다. 이 프라이머 패널은 50개 종양유전자 및 종양 억제 유전자로부터의 약 2,800개 COSMIC 돌연변이를 커버한다. 이것은 한 푸울에 207 프라이머 쌍을 갖는다. 멀티플렉스 PCR 반응은 10μl로 수행되었다. 하기 성분을 0.2ml의 얇은 벽 PCR 튜브(Thomas Scientific, Snapstrip II natural 0.2ml PCR 스트립 튜브, 카달로그 번호 1228F73) 각각에 첨가하였다: 5μl 2배 농축된 프라이머 푸울, 1μl 10X PCR 완충제(1X PCR 완충제: 50 mM TrisHCl, pH8.3, 50 mM KCl, 5 mM MgCl2, 0.8 mM dNTP 각각), 2μl Omni KlenTaq DNA 폴리머라제(4.2 유닛/μl)(Enzymatics, P7500-LC-F), 1μl의 10ng/μl의 인간 DNA(Coriell Institute, NA12878), 및 1μl 증류수.
0.2ml 얇은 벽 PCR 튜브를 부착된 캡으로 덮고, 3초 동안 간단히 볼텍싱하고 미니 원심분리기에서 3초 동안 회전시켰다(Pipette.com, MyFuge 12 place 미니 원심분리기, 카달로그 번호 C1012). PCR 반응 혼합물을 덮기 위해 광유는 필요하지 않았다. 튜브를 써모스 사이클러(GeneAmp® PCR system 9700 96-웰 금 플레이팅됨, Life Technologies, 카달로그 번호 4314878)에 놓았다.
PCR을 초기에 98℃에서 2분 동안 유지한 다음, 15회 사이클의 98℃에서 15초간 변성 및 60℃에서 4분간 어닐링 및 합성이 이어졌다. 사이클링 후, 다음 단계로 진행할 때까지 반응물을 10℃로 유지시켰다.
PCR 후, 하기 성분을 상기 반응물에 직접 첨가하였다: 0μl 2X 분해 완충제(50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 15 mM MgCl2, 20mM 베타 메르캅토에탄올), 1μl T4 엔도뉴클레아제 VII(Affymetrix, part number 78300 50KU), 18μl 증류수. 반응물을 37℃에서 10분 동안 인큐베이션시켰다.
반응 후, DNA를 1.6X MagSi-NGSprep 비드로 1회 정제시켰다. 상자성 비드는 Amsbio LLC(Amsbio LLC, MagSi-NGSprep, 카달로그 번호 MD61021)로부터 얻었다. MagSi-NGSprep 비드를 컨테이너에서 볼텍싱에 의해 완전히 현탁시킨 다음, 증폭되고 조합된 암플리콘의 부피의 1.6배를 나타내는 64μl의 MagSi-NGSprep 비드를 증폭된 암플리콘을 함유하는 튜브에 첨가하였다. 튜브를 볼텍싱에 의해 5초 동안 혼합시키고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션시켰다. 그 후 튜브를 미니 원심분리기에서 3초 동안 회전시키고, 자기 랙에 두어 비드를 2분 동안 포집하였다. 자기 랙 내의 자석은 KJ Magnetics(KJ Magnetics, 카달로그 번호 D4X0DIA-N52)로부터 얻었다. 용액이 정화되면, 상청액을 비드 펠렛을 건드리지 않고 조심스럽게 피펫팅하여 폐기하였다. 자기 랙으로부터 튜브를 제거하지 않고, 150μl의 신선하게 제조된 70% 에탄올을 튜브에 첨가하였다. 그 후 튜브를 자석 랙 상에서 180도로 회전시켜, 비드 펠렛이 각 튜브의 한 쪽 내벽, 및 반대쪽 펠렛으로부터 분리되게 하였다. 용액이 정화되면, 상청액을 비드 펠렛을 건드리지 않고 조심스럽게 피펫팅하여 폐기하였다. 비드를 이러한 방식으로 70% 에탄올로 총 2회 세척하였다. 최종 세척에서 70% 에탄올을 피펫팅한 후, 튜브를 미니 원심분리기에서 3초 동안 회전시켰다. 튜브 내부에 남아 있는 임의의 에탄올 액적을 비드 펠렛을 건드리지 않으며 피펫팅하였다. 비드 펠렛을 튜브 캡이 열린 상태로 자석 랙 상에서 실온에서 3분 동안 공기 건조시켰다. 마지막으로, 자기 랙에서 튜브를 제거하고, 40μl 증류수를 튜브에 첨가하였다. 튜브를 5초 동안 힘차게 볼텍싱하여 비드를 증류수에 재현탁시키고, 미니 원심분리기에서 3초 동안 회전시키고, 자기 랙에 2분 동안 두었다. 용액이 정화된 후, 용리된 DNA 단편을 함유하는 상청액을 새로운 튜브로 옮겼다. DNA 단편을 이 방법에 의해 1.6X MagSi-NGSprep 비드로 총 2회 정제하였다. 최종 정제 후, DNA 단편을 5μl 증류수에 용리시키고, 하기 단계에서 검정하였다.
DNA 단편의 크기, 농도 및 순도는 2100 BioAnalyzer 기계(Agilent Technologies, 카달로그 번호 G2938B)에 의해 검정되었다. 이전 단계에서 수득된 1μl의 정제된 DNA 단편을 고 민감성 DNA 분석 키트(Agilent Technologies, 카달로그 번호 5067-4626)로 공급업체가 제공한 방법에 따라 검정하였다. 결과는 도 8c 및 8d에 제공된다. 도 8c는 T4 엔도뉴클레아제 VII에 의한 분해 전에 표적 암플리콘 및 비특이적 증폭 생성물의 존재를 보여준다. 비특이적 증폭 생성물은 200bp 내지 2000bp 이상이었다. 100bp 내지 200bp의 피크는 표적 DNA 단편이었다. 도 8d는 T4 엔도뉴클레아제 VII에 의한 분해 후 효과를 보여준다. 200bp 내지 2000bp 이상의 비특이적 증폭 생성물은 T4 엔도뉴클레아제 분해 및 후속 정제에 의해 제거되었다.
실시예 8
도 9a-9b에 도시된 바와 같이, 비특이적 증폭 생성물의 유사한 감소가 207쌍의 긴 프라이머에 의한 멀티플렉스 PCR에서 관찰될 수 있다. 이 예에서, 프라이머 패널은 Ion AmpliSeq™ 핫스팟 암 패널 v2(Life Technologies, 카달로그 번호 4475346)의 것과 동일하였으나, 5'CCTACACGACGCTCTTCCGATCT3'이 각 정방향 프라이머의 5' 말단에 첨가되고, 5'TTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT3'이 각 역방향 프라이머의 5' 말단에 첨가된 것이 예외였다. 이러한 "긴" 프라이머는 추가 라운드의 PCR에 의해 암플리콘에 어댑터를 쉽게 추가할 수 있게 한다.
멀티플렉스 PCR 및 후속 처리 및 검정을 수행하는 방법은 상기 실시예 7의 방법과 동일하였다. 결과는 도 9a-9b에 제공된다. 도 9a는 T4 엔도뉴클레아제 VII에 의한 분해 전에 긴 프라이머를 갖는 멀티플렉스 PCR의 결과를 보여준다. 도 9b는 T4 엔도뉴클레아제 VII에 의한 분해를 통한 비특이적 증폭 생성물의 제거를 보여준다.
실시예 9: 멀티플렉스 PCR의 폴리머라제
일반적으로, 임의의 적절한 폴리머라제를 이용하여 본원에 기재된 증폭(멀티플렉스 증폭)을 수행할 수 있다. 본원에 기재된 방법, 조성물 및 키트는 다양한 효소와 상용가능하다. 도 10A-10F는 멀티플렉스 PCR에서 다양한 폴리머라제 효소의 이용을 예시한다. 각 예에서, 멀티플렉스 PCR은 상기 실시예 6에 기재된 대로 수행되었으나, 5 유닛의 백금 taq(도 10A), 티타늄 taq(도 10B), Omni Klen taq(도 10C), Taq Klenow(도 10D), KOD DNA 폴리머라제(도 10E) 및 Tfi DNA 폴리머라제(도 10F)가 각 멀티플렉스 PCR 반응에 사용된 것이 예외였다. PCR 후, 하기 성분을 상기 반응에 직접 첨가하였다: 10μl 2X 분해 완충제(50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 15 mM MgCl2, 20mM 베타 메르캅토에탄올), 1μl T4 엔도뉴클레아제 VII(Affymetrix, part number 78300 50KU), 18μl 증류수. 반응물을 37℃에서 5분 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후, 0.5 M EDTA로 반응을 정지시켰다. 실시예 6에 기재된 대로, DNA를 정제하고 BioAnalyzer에서 검정하였다. 결과는 백금 taq, 티타늄 taq 및 Omni Klen taq가 비슷한 수율의 표적 암플리콘을 생산한 반면, Taq Klenow, KOD DNA 폴리머라제 및 Tfi DNA 폴리머라제는 엄청나게 높은 양의 비특이적 증폭 생성물을 생산하였음을 보여준다. 이 예에서, 백금 taq, 티타늄 taq 및 Omni Klen taq가 멀티플렉스 PCR에 바람직할 수 있다.
실시예 10
멀티플렉스 PCR에서 프라이머 농도는 적정될 수 있다. 이 예에서, 멀티플렉스 PCR은 실시예 6에 기재된 대로 수행되었으나, 20, 30, 40, 50 nM의 207쌍의 프라이머가 각 멀티플렉스 PCR 반응에 이용된 것이 예외였다. PCR 후, 하기 성분을 상기 반응에 직접 첨가하였다: 10μl 2X 분해 완충제(50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 15 mM MgCl2, 20mM 베타 메르캅토에탄올), 1μl T4 엔도뉴클레아제 VII(Affymetrix, part number 78300 50KU), 18μl 증류수. 반응물을 37℃에서 5분 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후, 0.5 M EDTA로 반응을 정지시켰다. 실시예 6에 기재된 대로, DNA를 정제하고 BioAnalyzer에서 검정하였다. 결과는 도 11에 제공된다. 이 실험은 높은 농도의 프라이머가 더 높은 수율의 표적 암플리콘을 발생시킴을 보여주었다.
실시예 11
멀티플렉스 PCR의 어닐링 및 신장 시간은 또한, 도 12에 도시된 대로, 본원에 기재된 효과를 최적화하기 위해 조정될 수 있다. 이 예에서, 멀티플렉스 PCR은 실시예 6에 기재된 대로 수행되었으나, 1, 2, 3분의 어닐링 및 신장 시간이 각 멀티플렉스 PCR 반응에 사용된 것이 예외였다. PCR 후, 하기 성분을 상기 반응에 직접 첨가하였다: 10μl 2X 분해 완충제(50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 15 mM MgCl2, 20mM 베타 메르캅토에탄올), 1μl T4 엔도뉴클레아제 VII(Affymetrix, part number 78300 50KU), 18μl 증류수. 반응물을 37℃에서 5분 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후, 0.5 M EDTA로 반응을 정지시켰다. 실시예 6에 기재된 대로, DNA를 정제하고 BioAnalyzer에서 검정하였다. 결과는 도 12에 제공된다. 이 실험은 1분의 어닐링 및 신장이 더 높은 수율의 표적 암플리콘을 발생시킴을 보여주었다.
실시예 12
상기 언급된 대로, 많은 수의 프라이머 쌍이 본원에 기재된 방법에 이용될 수 있고 여전히 비특이적 증폭 생성물의 실질적인 감소를 발생시킬 수 있다. 예를 들어, 도 13은 2915쌍의 프라이머를 수반한 멀티플렉스 PCR에서 비특이적 증폭 생성물의 제거를 예시한다.
프라이머 패널은 Qiagen GeneRead DNAeq 인간 유방암 패널(Qiagen, 카달로그 번호 NGHS-001X-12)이었다. 이 패널은 4개의 푸울로 나뉘고, 각 푸울은 약 730 프라이머 쌍을 함유하는 2915쌍의 프라이머에 의해, 268621개 표적 염기의 44개 유전자를 커버한다. 이 패널은 20X 중앙 시퀀싱 깊이에서 98.2% 적용범위, 96.8% 특이성, 91% 균일성을 보고하였다. 이 패널의 각 프라이머에는 우라실 뉴클레오티드 또는 염기의 임의의 다른 변형이 없다. 이 프라이머 패널은 2배 농축된다. 따라서, 4개 PCR 반응이 4개 푸울의 프라이머 각각으로 수행되었고, 각 반응에서 총 PCR 부피의 50%는 4개의 푸울 각각이었다.
각 멀티플렉스 PCR 반응은 10μl로 수행되었다. 하기 성분을 0.2ml의 얇은 벽 PCR 튜브(Thomas Scientific, Snapstrip II natural 0.2ml PCR 스트립 튜브, 카달로그 번호 1228F73) 각각에 첨가하였다: 5μl의 2배 농축된 프라이머 푸울, 1μl 10X PCR 완충제(1X PCR 완충제: 50 mM TrisHCl, pH8.3, 50 mM KCl, 5 mM MgCl2, 0.8 mM dNTP 각각), 2μl Omni KlenTaq DNA 폴리머라제(4.2 유닛/μl)(Enzymatics, P7500-LC-F), 1μl의 10ng/μl의 인간 DNA(Coriell Institute, NA12878), 및 1μl 증류수. Qiagen GeneRead DNAeq 인간 유방암 패널에 대해 4개의 멀티플렉스 PCR 반응이 존재하였다.
0.2ml 얇은 벽 PCR 튜브를 부착된 캡으로 덮고, 3초 동안 간단히 볼텍싱하고 미니 원심분리기에서 3초 동안 회전시켰다(Pipette.com, MyFuge 12 place 미니 원심분리기, 카달로그 번호 C1012). PCR 반응 혼합물을 덮기 위해 광유는 필요하지 않았다. 튜브를 써모스 사이클러(GeneAmp® PCR system 9700 96-웰 금 플레이팅됨, Life Technologies, 카달로그 번호 4314878)에 놓았다. 각 프라이머 패널에 대해 하기 두 온도 프로파일이 수행되었다.
Qiagen GeneRead DNAeq 인간 유방암 패널에 대해, PCR을 초기에 98℃에서 2분 동안 유지한 다음, 15회 사이클의 98℃에서 15초간 변성 및 60℃에서 4분간 어닐링 및 합성이 이어졌다. 사이클링 후, 다음 단계로 진행할 때까지 반응물을 10℃로 유지시켰다.
인큐베이션 후, 완충제 교체 없이 반응 혼합물을 이 단계로 직접 진행시켰다. 하기 성분을 상기 반응물 각각에 직접 첨가하였다: 40μl 2X 분해 완충제(50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 15 mM MgCl2, 20mM 베타 메르캅토에탄올), 4μl T4 엔도뉴클레아제 VII(Affymetrix, part number 78300 50KU), 18μl 증류수. 반응물을 37℃에서 5분 동안 인큐베이션시켰다.
인큐베이션 후, 0.5 M EDTA로 반응을 정지시켰다. DNA를 1.6X MagSi-NGSprep 비드로 1회 정제하였다. MagSi-NGSprep 비드를 컨테이너에서 볼텍싱에 의해 완전히 현탁시키고, 128μl의 MagSi-NGSprep 비드를 각 튜브에 첨가하였다. 이러한 튜브를 볼텍싱에 의해 5초 동안 혼합시키고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션시켰다. 그 후 튜브를 미니 원심분리기에서 3초 동안 회전시키고, 자기 랙에 두어 비드를 2분 동안 포집하였다. 용액이 정화되면, 상청액을 비드 펠렛을 건드리지 않고 조심스럽게 피펫팅하여 폐기하였다. 자기 랙으로부터 튜브를 제거하지 않고, 150μl의 신선하게 제조된 70% 에탄올을 각 튜브에 첨가하였다. 그 후 튜브를 자석 랙 상에서 180도로 회전시켜, 비드 펠렛이 각 튜브의 한 쪽 내벽, 및 반대쪽 펠렛으로부터 분리되게 하였다. 용액이 정화되면, 상청액을 비드 펠렛을 건드리지 않고 조심스럽게 피펫팅하여 폐기하였다. 비드를 이러한 방식으로 70% 에탄올로 총 2회 세척하였다. 최종 세척에서 70% 에탄올을 피펫팅한 후, 튜브를 미니 원심분리기에서 3초 동안 회전시켰다. 튜브 내부에 남아 있는 임의의 에탄올 액적을 비드 펠렛을 건드리지 않으며 피펫팅하였다. 비드 펠렛을 튜브 캡이 열린 상태로 자석 랙 상에서 실온에서 3분 동안 공기 건조시켰다. 마지막으로, 자기 랙에서 튜브를 제거하고, 5μl 증류수를 각 튜브에 첨가하였다. 튜브를 5초 동안 힘차게 볼텍싱하여 비드를 증류수에 재현탁시키고, 미니 원심분리기에서 3초 동안 회전시키고, 자기 랙에 2분 동안 두었다. 용액이 정화된 후, 용리된 DNA 단편을 함유하는 상청액을 새로운 튜브로 옮기고, 하기 단계에서 검정하였다.
DNA 단편의 크기, 농도 및 순도는 2100 BioAnalyzer 기계(Agilent Technologies, 카달로그 번호 G2938B)에서 검정되었다. 이전 단계에서 수득된 1μl의 정제된 DNA 단편을 고 민감성 DNA 분석 키트(Agilent Technologies, 카달로그 번호 5067-4626)로 공급업체가 제공한 방법에 따라 검정하였다. 결과는 도 13에 제공된다.
실시예 13
도 14는 16000쌍의 프라이머를 수반한 멀티플렉스 PCR에서 비특이적 증폭 생성물을 제거하는 예를 예시한다. 이 예에서, 프라이머 패널은 Ion AmpliSeq™ 포괄적 암 패널(Life Technologies, 카달로그 번호 4477685)이었다. 이 프라이머 패널은 빈번하게 돌연변이되고 과학 간행물에서 인용되는 409개의 주요 종양 억제 유전자 및 종양유전자의 모든-엑손을 커버한다. 이것은 4개의 푸울에 16000 프라이머 쌍을 갖는다; 각 푸울은 약 4,000 프라이머 쌍을 갖는다. 암플리콘의 길이는 125-175개 염기쌍의 범위이고, 표적 영역은 약 173만 개의 염기를 포함한다. 라이브러리가 이 패널 및 Life Technologies' Ion AmpliSeq™ 라이브러리 Kit 2.0으로 제조되고, Life Technologies' Ion PGM™ 시스템에서 서열화될 때, 이 패널은 표적 염기(표적 영역에 맵핑된 염기, 실행 당 총 맵핑된 염기 중)에 대해 97%와 함께, >20% 중앙 시퀀싱 깊이에서 94%의 적용범위를 보고하였다. 멀티플렉스 PCR에서, 4개의 프라이머 푸울 각각은 주형으로서 10ng의 인간 유전체 DNA를 필요로 하고, 전체 패널을 커버하기 위해 총 40ng가 필요하다. 이 프라이머 패널의 각 프라이머에는 적어도 하나의 우라실 뉴클레오티드가 존재한다. 이 프라이머 패널은 2배 농축된다. 따라서, 4회의 PCR 반응은 4개 푸울의 프라이머 각각으로 수행되었다.
각 멀티플렉스 PCR 반응은 10μl로 수행되었다. 하기 성분을 0.2ml의 얇은 벽 PCR 튜브(Thomas Scientific, Snapstrip II natural 0.2ml PCR 스트립 튜브, 카달로그 번호 1228F73) 각각에 첨가하였다: 5μl의 2배 농축된 프라이머 푸울, 1μl 10X PCR 완충제(1X PCR 완충제: 50 mM TrisHCl, pH8.3, 50 mM KCl, 5 mM MgCl2, 0.8 mM dNTP 각각), 2μl Omni KlenTaq DNA 폴리머라제(4.2 유닛/μl)(Enzymatics, P7500-LC-F), 1μl의 10ng/μl의 인간 DNA(Coriell Institute, NA12878), 및 1μl 증류수. Ion AmpliSeq™ 포괄적 암 패널에 대해 4개의 멀티플렉스 PCR 반응 및 Qiagen GeneRead DNAeq 인간 유방암 패널에 대해 4개의 멀티플렉스 PCR 반응이 존재하였다.
0.2ml 얇은 벽 PCR 튜브를 부착된 캡으로 덮고, 3초 동안 간단히 볼텍싱하고 미니 원심분리기에서 3초 동안 회전시켰다(Pipette.com, MyFuge 12 place 미니 원심분리기, 카달로그 번호 C1012). PCR 반응 혼합물을 덮기 위해 광유는 필요하지 않았다. 튜브를 써모스 사이클러(GeneAmp® PCR system 9700 96-웰 금 플레이팅됨, Life Technologies, 카달로그 번호 4314878)에 놓았다. 각 프라이머 패널에 대해 하기 두 온도 프로파일이 수행되었다.
PCR을 초기에 98℃에서 2분 동안 유지한 다음, 13회 사이클의 98℃에서 15초간 변성 및 60℃에서 8분간 어닐링 및 합성이 이어졌다. 사이클링 후, 다음 단계로 진행할 때까지 반응물을 10℃로 유지시켰다.
인큐베이션 후, 완충제 교체 없이 반응 혼합물을 이 단계로 직접 진행시켰다. 하기 성분을 상기 반응물 각각에 직접 첨가하였다: 20μl 2X 분해 완충제(50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 15 mM MgCl2, 20mM 베타 메르캅토에탄올), 2μl T4 엔도뉴클레아제 VII(Affymetrix, part number 78300 50KU), 18μl 증류수. 반응물을 37℃에서 5분 동안 인큐베이션시켰다.
반응 후, DNA를 1.6X MagSi-NGSprep 비드로 1회 정제시켰다. MagSi-NGSprep 비드를 컨테이너에서 볼텍싱에 의해 완전히 현탁시키고, 128μl의 MagSi-NGSprep 비드를 각 튜브에 첨가하였다. 이러한 튜브를 볼텍싱에 의해 5초 동안 혼합시키고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션시켰다. 그 후 튜브를 미니 원심분리기에서 3초 동안 회전시키고, 자기 랙에 두어 비드를 2분 동안 포집하였다. 용액이 정화되면, 상청액을 비드 펠렛을 건드리지 않고 조심스럽게 피펫팅하여 폐기하였다. 자기 랙으로부터 튜브를 제거하지 않고, 150μl의 신선하게 제조된 70% 에탄올을 각 튜브에 첨가하였다. 그 후 튜브를 자석 랙 상에서 180도로 회전시켜, 비드 펠렛이 각 튜브의 한 쪽 내벽, 및 반대쪽 펠렛으로부터 분리되게 하였다. 용액이 정화되면, 상청액을 비드 펠렛을 건드리지 않고 조심스럽게 피펫팅하여 폐기하였다. 비드를 이러한 방식으로 70% 에탄올로 총 2회 세척하였다. 최종 세척에서 70% 에탄올을 피펫팅한 후, 튜브를 미니 원심분리기에서 3초 동안 회전시켰다. 튜브 내부에 남아 있는 임의의 에탄올 액적을 비드 펠렛을 건드리지 않으며 피펫팅하였다. 비드 펠렛을 튜브 캡이 열린 상태로 자석 랙 상에서 실온에서 3분 동안 공기 건조시켰다. 마지막으로, 자기 랙에서 튜브를 제거하고, 10μl 증류수를 각 튜브에 첨가하였다. 튜브를 5초 동안 힘차게 볼텍싱하여 비드를 증류수에 재현탁시키고, 미니 원심분리기에서 3초 동안 회전시키고, 자기 랙에 2분 동안 두었다. 용액이 정화된 후, 용리된 DNA 단편을 함유하는 상청액을 새로운 튜브로 옮기고, 하기 단계에서 검정하였다.
DNA 단편의 크기, 농도 및 순도는 2100 BioAnalyzer 기계(Agilent Technologies, 카달로그 번호 G2938B)에 의해 검정되었다. 이전 단계에서 수득된 1μl의 정제된 DNA 단편을 고 민감성 DNA 분석 키트(Agilent Technologies, 카달로그 번호 5067-4626)로 공급업체가 제공한 방법에 따라 검정하였다. 결과는 도 14에 제공된다.
실시예 14
본원에 기재된 방법은, 특히 주형으로서 FFPE DNA를 이용한 멀티플렉스 PCR에서 비특이적 증폭 생성물을 제거하는 것을 포함하여, 심지어 매우 작은 및/또는 손상된 DNA 주형에도 이용될 수 있다. 이 예에서, 멀티플렉스 PCR은 실시예 6에 기재된 대로 수행되었으나, 10 ng FFPE DNA가 각 멀티플렉스 PCR 반응에 사용된 것이 예외였다. PCR 후, 하기 성분을 상기 반응에 직접 첨가하였다: 10μl 2X 분해 완충제(50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 15 mM MgCl2, 20mM 베타 메르캅토에탄올), 1μl T4 엔도뉴클레아제 VII(Affymetrix, part number 78300 50KU), 18μl 증류수. 반응물을 37℃에서 5분 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후, 0.5 M EDTA로 반응을 정지시켰다. 실시예 6에 기재된 대로, DNA를 정제하고 BioAnalyzer에서 검정하였다. 결과는 도 15에 제공된다. 이 실험은 비특이적 증폭 생성물이 207쌍의 프라이머 및 10ng의 FFPA DNA를 수반한 멀티플렉스 PCR로부터 효과적으로 제거되었음을 보여주었다.
실시예 15
포스포릴화된 프라이머를 수반한 멀티플렉스 PCR이 본원에 기재된 방법을 이용하여 시도되었다. Ion AmpliSeq™ 핫스팟 암 패널 v2(Life Technologies, 카달로그 번호 4475346)의 프라이머 패널은 T4 폴리뉴클레오티드 키나제에 의해 5' 말단에서 포스포릴화되었다. 그 후 프라이머는 멀티플렉스 PCR 반응에 10μl의 50 nM으로 이용되었다. 멀티플렉스 PCR 및 그 후의 DNA 정제는 실시예 8에 기재된 대로 수행되었다. 정제된 DNA는 20μl 증류수에서 자기 비드로부터 용리되었다.
DNA 단편은 이전의 정제된 DNA 용액, 4μl 10X 평활 말단 완충제(1X 평활 완충제: 50mM Tris-HCl(pH 7.6), 10mM MgCl2, 10mM 베타 메르캅토에탄올, 1mM ATP, 0.4mM dNTP 각각), 12 유닛의 T4 DNA 폴리머라제(Molecular Cloning laboratories, 카달로그 번호 T4DP-100), 40 유닛의 폴리뉴클레오티드 키나제(Molecular Cloning laboratories, 카달로그 번호 T4PK-100)를 첨가함에 의해 총 40μl로 평활 말단화되었다. 각 튜브의 반응 혼합물을 먼저 미니 원심분리기에서 3초 동안 간단히 회전시켜 모든 액적을 튜브 바닥에 수집하고, 3초 동안 볼텍싱한 다음, 다시 3초 동안 회전시켜 반응의 균일성을 보장하였다. 튜브를 실온에서 10분 동안 인큐베이션시켰다.
반응 후, DNA를 실시예 8에 기재된 대로 1.6X MagSi-NGSprep 비드로 1회 정제하였다. DNA를 20μl 증류수에서 자기 비드로부터 용리시켰다.
하기 성분을 정제된 DNA 용액에 첨가하였다: 4μl 10X A-테일링 완충제(1X A-테일링 완충제: 50 mM TrisHCl, pH8.3, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2), 0.5μl의 100mM ATP, 1 μl의 Omni KlenTaq DNA 폴리머라제(4.2 유닛/μl), 및 40μl까지의 증류수. 각 튜브의 반응 혼합물을 먼저 미니 원심분리기에서 3초 동안 간단히 회전시켜 모든 액적을 튜브 바닥에 수집하고, 3초 동안 볼텍싱한 다음, 다시 3초 동안 회전시켜 반응의 균일성을 보장하였다. 튜브를 72℃에서 10분 동안 인큐베이션시켰다.
인큐베이션 후, 완충제 교체 없이 반응 혼합물을 이 단계로 직접 진행시켰다. 하기 성분을 상기 반응물 각각에 직접 첨가하였다: 20μl 2X 분해 완충제(50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 15 mM MgCl2, 20mM 베타 메르캅토에탄올), 2μl T4 엔도뉴클레아제 VII(Affymetrix, part number 78300 50KU), 18μl 증류수. 반응을 37℃에서 5분 동안 인큐베이션시켰다.
반응 후, DNA를 실시예 8에 기재된 대로 1.6X MagSi-NGSprep 비드로 1회 정제하고 10μl 증류수에서 용리시켰다.
어댑터 라이게이션을 위해, 2개의 올리고 뉴클레오티드가 Integrated DNA Technologies에 의해 합성되었다. 한 올리고는 Illumina TruSeq universal 어댑터와 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖고(5'AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T3'), 다른 하나는 TruSeq 어댑터 index 1과 동일한 서열을 가지며(5'PGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACATCACGATCTCGTATGCCGTCTTCT*G*C*T*T*G3'), 이 때 *는 서열에 추가로 첨가된 포스포로티오에이트 결합을 나타낸다. 이중 가닥 어댑터를 제조하기 위해, 상기 올리고를 0.2ml 얇은 벽 PCR 튜브에서 총 100 μl의 1X T4 DNA 라이가제 완충제(50 mM TrisHCl, pH7.5, 10 mM MgCl2, 1 mM ATP, 10 mM DTT)에서 각 10 μM로 함께 혼합시켰다. 튜브를 써모스 사이클러(GeneAmp® PCR 시스템 9700 96-웰 금 플레이팅됨)에 놓고 95℃에서 2분 동안, 75℃에서 1분 동안, 55℃에서 1분 동안 가열시키고, 다음 단계로 진행할 때까지 25℃에서 유지시켰다.
하기 성분을 상기 DNA 용액에 첨가하였다: 4μl T4 DNA 라이가제 완충제, 2μl 10μM 어댑터, 1μl T4 DNA 라이가제(New England BioLabs Inc., 카달로그 번호 M0202S), 1μl 9oN™ DNA 라이가제(New England BioLabs Inc., 카달로그 번호 M0238S), 및 40μl까지의 증류수. 16℃에서 15분, 그 다음 45℃에서 15분 동안 인큐베이션시켰다.
하기 성분을 상기 반응물 각각에 직접 첨가하였다: 1μl의 람다 엑소뉴클레아제(New England BioLabs Inc., 카달로그 번호 M0262S), 1μl의 E. 콜라이 엑소뉴클레아제 I(New England BioLabs Inc., 카달로그 번호 M0293S). 반응물을 37℃에서 5분 동안 인큐베이션시켰다.
반응 후, DNA를 실시예 8에 기재된 대로 1.6X MagSi-NGSprep 비드로 1회 정제하고 20μl 증류된 상태로 용리시켰다.
상기 단계에서 수득된 DNA 단편을 추가 5회 사이클 동안 PCR에 의해 증폭시켰다. 하기 성분을 상기 DNA 용액에 첨가하였다: 5μl의 10X PCR 완충제, 2.5μl의 10μM 프라이머 믹스, 2μl의 Omni KlenTaq 폴리머라제(4.2 유닛/μl), 및 50μl까지의 증류수. 98℃에서 2분간, 그 다음 5회 사이클의 98℃에서 15초, 58℃에서 1분의 변성에 의해 PCR을 써모스 사이클러(GeneAmp® PCR 시스템 9700 96-웰 금 플레이팅됨)에서 수행한 다음, 다음 단계로 진행할 때까지 10℃에서 유지시켰다.
PCR에 이용된 프라이머는 5'AATGATACGGCGACCACCGA3' 및 5'CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT3'이었다. 이러한 올리고는 Integrated DNA Technologies에 의해 합성되었다.
마지막으로, DNA를 실시예 8에 기재된 대로 1.6X MagSi-NGSprep 비드로 1회 정제하고 20μl TE 완충제에서 자기 비드로부터 용리시켰다.
라이브러리의 크기, 농도 및 순도는 2100 BioAnalyzer 기계(Agilent Technologies, 카달로그 번호 G2938B)에서 검정되었다. 이전 단계에서 수득된 1μl의 각 라이브러리를 고 민감성 DNA 분석 키트(Agilent Technologies, 카달로그 번호 5067-4626)로 공급업체가 제공한 방법에 따라 검정하였다. 결과는 도 16에 제공된다. 이 예에서, 라이게이션 및 제2 라운드의 PCR 후에 상당한 양의 표적 암플리콘은 생산되지 않았다.
실시예 16
라이게이션되지 않은 어댑터를 제거하지 않고 라이브러리를 제조하는 것은 본원에 기재된 방법을 이용하여 성공적으로 수행되었다. 멀티플렉스 PCR 및 그 후 DNA 정제는 실시예 8에 기재된 대로 수행되었다. 정제된 DNA를 20μl 증류수에서 자기 비드로부터 용리시켰다.
DNA 단편은 이전의 정제된 DNA 용액, 4μl 10X 평활 말단 완충제(1X 평활 완충제: 50mM Tris-HCl(pH 7.6), 10mM MgCl2, 10mM 베타 메르캅토에탄올, 1mM ATP, 0.4mM dNTP 각각), 12 유닛의 T4 DNA 폴리머라제(Molecular Cloning laboratories, 카달로그 번호 T4DP-100), 40 유닛의 폴리뉴클레오티드 키나제(Molecular Cloning laboratories, 카달로그 번호 T4PK-100)를 첨가함에 의해 총 40μl로 평활 말단화되었다. 각 튜브의 반응 혼합물을 먼저 미니 원심분리기에서 3초 동안 간단히 회전시켜 모든 액적을 튜브 바닥에 수집하고, 3초 동안 볼텍싱한 다음, 다시 3초 동안 회전시켜 반응의 균일성을 보장하였다. 튜브를 실온에서 10분 동안 인큐베이션시켰다.
반응 후, DNA를 실시예 8에 기재된 대로 1.6X MagSi-NGSprep 비드로 1회 정제하였다. DNA를 20μl 증류수에서 자기 비드로부터 용리시켰다.
하기 성분을 정제된 DNA 용액에 첨가하였다: 4μl 10X A-테일링 완충제(1X A-테일링 완충제: 50 mM TrisHCl, pH8.3, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2), 0.5μl의 100mM ATP, 1 μl의 Omni KlenTaq DNA 폴리머라제(4.2 유닛/μl), 및 40μl까지의 증류수. 각 튜브의 반응 혼합물을 먼저 미니 원심분리기에서 3초 동안 간단히 회전시켜 모든 액적을 튜브 바닥에 수집하고, 3초 동안 볼텍싱한 다음, 다시 3초 동안 회전시켜 반응의 균일성을 보장하였다. 튜브를 72℃에서 10분 동안 인큐베이션시켰다.
인큐베이션 후, 완충제 교체 없이 반응 혼합물을 이 단계로 직접 진행시켰다. 하기 성분을 상기 반응물 각각에 직접 첨가하였다: 20μl 2X 분해 완충제(50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 15 mM MgCl2, 20mM 베타 메르캅토에탄올), 2μl T4 엔도뉴클레아제 VII(Affymetrix, part number 78300 50KU), 18μl 증류수. 반응물을 37℃에서 5분 동안 인큐베이션시켰다.
반응 후, DNA를 실시예 8에 기재된 대로 1.6X MagSi-NGSprep 비드로 1회 정제하고 10μl 증류수에서 용리시켰다.
어댑터 라이게이션을 위해, 2개의 올리고 뉴클레오티드가 Integrated DNA Technologies에 의해 합성되었다. 한 올리고는 Illumina TruSeq universal 어댑터와 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖고 (5'AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T3'), 다른 하나는 TruSeq 어댑터 index 1과 동일한 서열을 가지며(5'PGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACATCACGATCTCGTATGCCGTCTTCT*G*C*T*T*G3'), 이 때 *는 서열에 추가로 첨가된 포스포로티오에이트 결합을 나타낸다. 이중 가닥 어댑터를 제조하기 위해, 상기 올리고를 0.2ml 얇은 벽 PCR 튜브에서 총 100 μl의 1X T4 DNA 라이가제 완충제(50 mM TrisHCl, pH7.5, 10 mM MgCl2, 1 mM ATP, 10 mM DTT)에서 각 10 μM로 함께 혼합시켰다. 튜브를 써모스 사이클러(GeneAmp® PCR 시스템 9700 96-웰 금 플레이팅됨)에 놓고 95℃에서 2분 동안, 75℃에서 1분 동안, 55℃에서 1분 동안 가열시키고, 다음 단계로 진행할 때까지 25℃에서 유지시켰다.
하기 성분을 상기 DNA 용액에 첨가하였다: 4μl T4 DNA 라이가제 완충제, 2μl 10μM 어댑터, 1μl T4 DNA 라이가제(New England BioLabs Inc., 카달로그 번호 M0202S), 1μl 9oN™ DNA 라이가제(New England BioLabs Inc., 카달로그 번호 M0238S), 및 40μl까지의 증류수. 16℃에서 15분, 그 다음 45℃에서 15분 동안 인큐베이션시켰다.
반응 후, DNA를 실시예 8에 기재된 대로 1.6X MagSi-NGSprep 비드로 1회 정제하고 20μl 증류된 상태로 용리시켰다.
상기 단계에서 수득된 DNA 단편을 추가 5회 사이클 동안 PCR에 의해 증폭시켰다. 하기 성분을 상기 DNA 용액에 첨가하였다: 5μl의 10X PCR 완충제, 2.5μl의 10μM 프라이머 믹스, 2μl의 Omni KlenTaq 폴리머라제(4.2 유닛/μl), 및 50μl까지의 증류수. 98℃에서 2분간, 그 다음 5회 사이클의 98℃에서 15초, 58℃에서 1분의 변성에 의해 PCR을 써모스 사이클러(GeneAmp® PCR 시스템 9700 96-웰 금 플레이팅됨)에서 수행한 다음, 다음 단계로 진행할 때까지 10℃에서 유지시켰다.
PCR에 이용된 프라이머는 5'AATGATACGGCGACCACCGA3' 및 5'CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT3'이었다. 이러한 올리고는 Integrated DNA Technologies에 의해 합성되었다.
마지막으로, DNA를 실시예 8에 기재된 대로 1.6X MagSi-NGSprep 비드로 1회 정제하고 20μl TE 완충제에서 자기 비드로부터 용리시켰다.
라이브러리의 크기, 농도 및 순도는 2100 BioAnalyzer 기계(Agilent Technologies, 카달로그 번호 G2938B)에서 검정되었다. 이전 단계에서 수득된 1μl의 각 라이브러리를 고 민감성 DNA 분석 키트(Agilent Technologies, 카달로그 번호 5067-4626)로 공급업체가 제공한 방법에 따라 검정하였다. 결과는 도 17에 제공된다. 일부 비특이적 생성물이 최종 라이브러리에 존재하였다.
실시예 17
본원에 기재된 방법을 이용하여 라이브러리를 제조할 수 있다. 예를 들어, 도 18은 2915쌍의 프라이머를 수반한 라이브러리의 생산에서 비특이적 증폭 생성물을 제거하기 위한 레솔바제의 이용 결과를 예시한다.
이 예에서, 프라이머 패널 Qiagen GeneRead DNAeq 인간 유방암 패널(Qiagen, 카달로그 번호 NGHS-001X-12)이, 실시예 8에 기재된 대로, 라이브러리를 제조하기 위한 작업흐름을 시험하는데 사용되었다. 멀티플렉스 PCR 및 그 후 DNA 정제는 실시예 8에 기재된 대로 수행되었다. 정제된 DNA를 20μl 증류수에서 자기 비드로부터 용리시켰다.
DNA 단편은 이전의 정제된 DNA 용액, 4μl 10X 평활 말단 완충제(1X 평활 완충제: 50mM Tris-HCl(pH 7.6), 10mM MgCl2, 10mM 베타 메르캅토에탄올, 1mM ATP, 0.4mM dNTP 각각), 12 유닛의 T4 DNA 폴리머라제(Molecular Cloning laboratories, 카달로그 번호 T4DP-100), 40 유닛의 폴리뉴클레오티드 키나제(Molecular Cloning laboratories, 카달로그 번호 T4PK-100)를 첨가함에 의해 총 40μl로 평활 말단화되었다. 각 튜브의 반응 혼합물을 먼저 미니 원심분리기에서 3초 동안 간단히 회전시켜 모든 액적을 튜브 바닥에 수집하고, 3초 동안 볼텍싱한 다음, 다시 3초 동안 회전시켜 반응의 균일성을 보장하였다. 튜브를 실온에서 10분 동안 인큐베이션시켰다.
반응 후, DNA를 실시예 8에 기재된 대로 1.6X MagSi-NGSprep 비드로 1회 정제하였다. DNA를 20μl 증류수에서 자기 비드로부터 용리시켰다.
하기 성분을 정제된 DNA 용액에 첨가하였다: 4μl 10X A-테일링 완충제(1X A-테일링 완충제: 50 mM TrisHCl, pH8.3, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2), 0.5μl의 100mM ATP, 1 μl의 Omni KlenTaq DNA 폴리머라제(4.2 유닛/μl), 및 40μl까지의 증류수. 각 튜브의 반응 혼합물을 먼저 미니 원심분리기에서 3초 동안 간단히 회전시켜 모든 액적을 튜브 바닥에 수집하고, 3초 동안 볼텍싱한 다음, 다시 3초 동안 회전시켜 반응의 균일성을 보장하였다. 튜브를 72℃에서 10분 동안 인큐베이션시켰다.
인큐베이션 후, 완충제 교체 없이 반응 혼합물을 이 단계로 직접 진행시켰다. 하기 성분을 상기 반응물 각각에 직접 첨가하였다: 20μl 2X 분해 완충제(50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 15 mM MgCl2, 20mM 베타 메르캅토에탄올), 2μl T4 엔도뉴클레아제 VII(Affymetrix, part number 78300 50KU), 18μl 증류수. 반응을 37℃에서 5분 동안 인큐베이션시켰다.
반응 후, DNA를 실시예 8에 기재된 대로 1.6X MagSi-NGSprep 비드로 1회 정제하고 10μl 증류수에서 용리시켰다.
어댑터 라이게이션을 위해, 2개의 올리고 뉴클레오티드가 Integrated DNA Technologies에 의해 합성되었다. 한 올리고는 Illumina TruSeq universal 어댑터와 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖고(5'AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T3'), 다른 하나는 TruSeq 어댑터 index 1과 동일한 서열을 가지며(5'PGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACATCACGATCTCGTATGCCGTCTTCT*G*C*T*T*G3'), 이 때 *는 서열에 추가로 첨가된 포스포로티오에이트 결합을 나타낸다. 이중 가닥 어댑터를 제조하기 위해, 상기 올리고를 0.2ml 얇은 벽 PCR 튜브에서 총 100 μl의 1X T4 DNA 라이가제 완충제(50 mM TrisHCl, pH7.5, 10 mM MgCl2, 1 mM ATP, 10 mM DTT)에서 각 10 μM로 함께 혼합시켰다. 튜브를 써모스 사이클러(GeneAmp® PCR 시스템 9700 96-웰 금 플레이팅됨)에 놓고 95℃에서 2분 동안, 75℃에서 1분 동안, 55℃에서 1분 동안 가열시키고, 다음 단계로 진행할 때까지 25℃에서 유지시켰다.
하기 성분을 상기 DNA 용액에 첨가하였다: 4μl T4 DNA 라이가제 완충제, 2μl 10μM 어댑터, 1μl T4 DNA 라이가제(New England BioLabs Inc., 카달로그 번호 M0202S), 1μl 9oN™ DNA 라이가제(New England BioLabs Inc., 카달로그 번호 M0238S), 및 40μl까지의 증류수. 16℃에서 15분, 그 다음 45℃에서 15분 동안 인큐베이션시켰다.
하기 성분을 상기 반응물 각각에 직접 첨가하였다: 1μl의 람다 엑소뉴클레아제(New England BioLabs Inc., 카달로그 번호 M0262S), 1μl의 E. 콜라이 엑소뉴클레아제 I(New England BioLabs Inc., 카달로그 번호 M0293S). 반응물을 37℃에서 5분 동안 인큐베이션시켰다.
반응 후, DNA를 실시예 8에 기재된 대로 1.6X MagSi-NGSprep 비드로 1회 정제하고 20μl 증류된 상태로 용리시켰다.
상기 단계에서 수득된 DNA 단편을 추가 5회 사이클 동안 PCR에 의해 증폭시켰다. 하기 성분을 상기 DNA 용액에 첨가하였다: 5μl의 10X PCR 완충제, 2.5μl의 10μM 프라이머 믹스, 2μl의 Omni KlenTaq 폴리머라제(4.2 유닛/μl), 및 50μl까지의 증류수. 98℃에서 2분간, 그 다음 5회 사이클의 98℃에서 15초, 58℃에서 1분의 변성에 의해 PCR을 써모스 사이클러(GeneAmp® PCR 시스템 9700 96-웰 금 플레이팅됨)에서 수행한 다음, 다음 단계로 진행할 때까지 10℃에서 유지시켰다.
PCR에 이용된 프라이머는 5'AATGATACGGCGACCACCGA3' 및 5'CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT3'이었다. 이러한 올리고는 Integrated DNA Technologies에 의해 합성되었다.
마지막으로, DNA를 실시예 8에 기재된 대로 1.6X MagSi-NGSprep 비드로 1회 정제하고 20μl TE 완충제에서 자기 비드로부터 용리시켰다.
라이브러리의 크기, 농도 및 순도는 2100 BioAnalyzer 기계(Agilent Technologies, 카달로그 번호 G2938B)에서 검정되었다. 이전 단계에서 수득된 1μl의 각 라이브러리를 고 민감성 DNA 분석 키트(Agilent Technologies, 카달로그 번호 5067-4626)로 공급업체가 제공한 방법에 따라 검정하였다. 결과는 도 18에 제공된다. 이 예에서, 표적 증폭 생성물은 200-300 bp 사이의 피크에 의해 도시된다; 상기 논의된 레솔바제 처리 후 배경은 거의 남아 있지 않다.
실시예 18
도 19는 시퀀싱을 위해 207쌍의 프라이머로 제조된 라이브러리의 또 다른 예를 예시한다. 이 예에서, Ion AmpliSeq™ 핫스팟 암 패널 v2(Life Technologies, 카달로그 번호 4475346)의 프라이머 패널을 멀티플렉스 PCR에 이용하였다. 이 프라이머 패널은 50개 종양유전자 및 종양 억제 유전자로부터의 약 2,800개 COSMIC 돌연변이를 커버한다. 이것은 한 푸울에 207 프라이머 쌍을 갖는다. 멀티플렉스 PCR 반응은 10μl로 수행되었다. 하기 성분을 0.2ml의 얇은 벽 PCR 튜브(Thomas Scientific, Snapstrip II natural 0.2ml PCR 스트립 튜브, 카달로그 번호 1228F73) 각각에 첨가하였다: 5μl의 2배 농축된 프라이머 푸울, 1μl 10X PCR 완충제(1X PCR 완충제: 50 mM TrisHCl, pH8.3, 50 mM KCl, 5 mM MgCl2, 0.8 mM dNTP 각각), 2μl Omni KlenTaq DNA 폴리머라제(4.2 유닛/μl)(Enzymatics, P7500-LC-F), 1μl의 10ng/μl의 인간 DNA(Coriell Institute, NA12878), 및 1μl 증류수.
0.2ml 얇은 벽 PCR 튜브를 부착된 캡으로 덮고, 3초 동안 간단히 볼텍싱하고 미니 원심분리기에서 3초 동안 회전시켰다(Pipette.com, MyFuge 12 place 미니 원심분리기, 카달로그 번호 C1012). PCR 반응 혼합물을 덮기 위해 광유는 필요하지 않았다. 튜브를 써모스 사이클러(GeneAmp® PCR system 9700 96-웰 금 플레이팅됨, Life Technologies, 카달로그 번호 4314878)에 놓았다.
PCR을 초기에 98℃에서 2분 동안 유지한 다음, 17회 사이클의 98℃에서 15초간 변성 및 60℃에서 4분간 어닐링 및 합성이 이어졌다. 사이클링 후, 다음 단계로 진행할 때까지 반응물을 10℃로 유지시켰다.
PCR 후, 상자성 비드를 이용하여 DNA를 흡수시킨 다음, 70% 에탄올로 세척하여 단백질, dNTP, 염, 및 PCR 프라이머의 부분을 제거하였다. 상자성 비드는 Amsbio LLC(Amsbio LLC, MagSi-NGSprep, 카달로그 번호 MD61021)로부터 얻었다. MagSi-NGSprep 비드를 컨테이너에서 볼텍싱에 의해 완전히 현탁시킨 다음, 증폭되고 조합된 암플리콘의 부피의 1.6배를 나타내는 64μl의 MagSi-NGSprep 비드를 각 튜브에 첨가하였다. 이러한 튜브를 볼텍싱에 의해 5초 동안 혼합시키고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션시켰다. 그 후 튜브를 미니 원심분리기에서 3초 동안 회전시키고, 자기 랙에 두어 비드를 2분 동안 포집하였다. 자기 랙 내의 자석은 KJ Magnetics(KJ Magnetics, 카달로그 번호 D4X0DIA-N52)로부터 얻었다. 용액이 정화되면, 상청액을 비드 펠렛을 건드리지 않고 조심스럽게 피펫팅하여 폐기하였다. 자기 랙으로부터 튜브를 제거하지 않고, 150μl의 신선하게 제조된 70% 에탄올을 각 튜브에 첨가하였다. 그 후 튜브를 자석 랙 상에서 180도로 회전시켜, 비드 펠렛이 각 튜브의 한 쪽 내벽, 및 반대쪽 펠렛으로부터 분리되게 하였다. 용액이 정화되면, 상청액을 비드 펠렛을 건드리지 않고 조심스럽게 피펫팅하여 폐기하였다. 비드를 이러한 방식으로 70% 에탄올로 총 2회 세척하였다. 최종 세척에서 70% 에탄올을 피펫팅한 후, 튜브를 미니 원심분리기에서 3초 동안 회전시켰다. 튜브 내부에 남아 있는 임의의 에탄올 액적을 비드 펠렛을 건드리지 않으며 피펫팅하였다. 비드 펠렛을 튜브 캡이 열린 상태로 자석 랙 상에서 실온에서 3분 동안 공기 건조시켰다. 마지막으로, 자기 랙에서 튜브를 제거하고, 20μl 증류수를 각 튜브에 첨가하였다. 튜브를 5초 동안 힘차게 볼텍싱하여 비드를 증류수에 재현탁시키고, 미니 원심분리기에서 3초 동안 회전시키고, 자기 랙에 2분 동안 두었다. 용액이 정화된 후, 용리된 DNA 단편을 함유하는 상청액을 각각 새로운 튜브로 옮겼다.
DNA 단편은 이전의 정제된 DNA 용액, 4μl 10X 평활 말단 완충제(1X 평활 완충제: 50mM Tris-HCl(pH 7.6), 10mM MgCl2, 10mM 베타 메르캅토에탄올, 1mM ATP, 0.4mM dNTP 각각), 12 유닛의 T4 DNA 폴리머라제(Molecular Cloning laboratories, 카달로그 번호 T4DP-100), 40 유닛의 폴리뉴클레오티드 키나제(Molecular Cloning laboratories, 카달로그 번호 T4PK-100)를 첨가함에 의해 총 40μl로 평활 말단화되었다. 각 튜브의 반응 혼합물을 먼저 미니 원심분리기에서 3초 동안 간단히 회전시켜 모든 액적을 튜브 바닥에 수집하고, 3초 동안 볼텍싱한 다음, 다시 3초 동안 회전시켜 반응의 균일성을 보장하였다. 튜브를 실온에서 10분 동안 인큐베이션시켰다.
반응 후, DNA를 1.6X MagSi-NGSprep 비드로 1회 정제하였다. MagSi-NGSprep 비드를 컨테이너에서 볼텍싱에 의해 완전히 현탁시킨 다음, 64μl의 MagSi-NGSprep 비드를 각 튜브에 첨가하였다. 이러한 튜브를 볼텍싱에 의해 5초 동안 혼합시키고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션시켰다. 그 후 튜브를 미니 원심분리기에서 3초 동안 회전시키고, 자기 랙에 두어 비드를 2분 동안 포집하였다. 용액이 정화되면, 상청액을 비드 펠렛을 건드리지 않고 조심스럽게 피펫팅하여 폐기하였다. 자기 랙으로부터 튜브를 제거하지 않고, 150μl의 신선하게 제조된 70% 에탄올을 각 튜브에 첨가하였다. 그 후 튜브를 자석 랙 상에서 180도로 회전시켜, 비드 펠렛이 각 튜브의 한 쪽 내벽, 및 반대쪽 펠렛으로부터 분리되게 하였다. 용액이 정화되면, 상청액을 비드 펠렛을 건드리지 않고 조심스럽게 피펫팅하여 폐기하였다. 비드를 이러한 방식으로 70% 에탄올로 총 2회 세척하였다. 최종 세척에서 70% 에탄올을 피펫팅한 후, 튜브를 미니 원심분리기에서 3초 동안 회전시켰다. 튜브 내부에 남아 있는 임의의 에탄올 액적을 비드 펠렛을 건드리지 않으며 피펫팅하였다. 비드 펠렛을 튜브 캡이 열린 상태로 자석 랙 상에서 실온에서 3분 동안 공기 건조시켰다. 마지막으로, 자기 랙에서 튜브를 제거하고, 20μl 증류수를 각 튜브에 첨가하였다. 튜브를 5초 동안 힘차게 볼텍싱하여 비드를 증류수에 재현탁시키고, 미니 원심분리기에서 3초 동안 회전시키고, 자기 랙에 2분 동안 두었다. 용액이 정화된 후, 용리된 DNA 단편을 함유하는 상청액을 각각 새로운 튜브로 옮겼다.
하기 성분을 정제된 DNA 용액에 첨가하였다: 4μl 10X A-테일링 완충제(1X A-테일링 완충제: 50 mM TrisHCl, pH8.3, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2), 0.5μl의 100mM ATP, 1 μl의 Omni KlenTaq DNA 폴리머라제(4.2 유닛/μl), 및 40μl까지의 증류수. 각 튜브의 반응 혼합물을 먼저 미니 원심분리기에서 3초 동안 간단히 회전시켜 모든 액적을 튜브 바닥에 수집하고, 3초 동안 볼텍싱한 다음, 다시 3초 동안 회전시켜 반응의 균일성을 보장하였다. 튜브를 72℃에서 10분 동안 인큐베이션시켰다.
인큐베이션 후, 완충제 교체 없이 반응 혼합물을 이 단계로 직접 진행시켰다. 하기 성분을 상기 반응물 각각에 직접 첨가하였다: 20μl 2X 분해 완충제(50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 15 mM MgCl2, 20mM 베타 메르캅토에탄올), 2μl T4 엔도뉴클레아제 VII(Affymetrix, part number 78300 50KU), 18μl 증류수. 반응물을 37℃에서 5분 동안 인큐베이션시켰다.
반응 후, DNA를 1.6X MagSi-NGSprep 비드로 1회 정제하하였다. MagSi-NGSprep 비드를 컨테이너에서 볼텍싱에 의해 완전히 현탁시킨 다음, 128μl의 MagSi-NGSprep 비드를 각 튜브에 첨가하였다. 이러한 튜브를 볼텍싱에 의해 5초 동안 혼합시키고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션시켰다. 그 후 튜브를 미니 원심분리기에서 3초 동안 회전시키고, 자기 랙에 두어 비드를 2분 동안 포집하였다. 용액이 정화되면, 상청액을 비드 펠렛을 건드리지 않고 조심스럽게 피펫팅하여 폐기하였다. 자기 랙으로부터 튜브를 제거하지 않고, 150μl의 신선하게 제조된 70% 에탄올을 각 튜브에 첨가하였다. 그 후 튜브를 자석 랙 상에서 180도로 회전시켜, 비드 펠렛이 각 튜브의 한 쪽 내벽, 및 반대쪽 펠렛으로부터 분리되게 하였다. 용액이 정화되면, 상청액을 비드 펠렛을 건드리지 않고 조심스럽게 피펫팅하여 폐기하였다. 비드를 이러한 방식으로 70% 에탄올로 총 2회 세척하였다. 최종 세척에서 70% 에탄올을 피펫팅한 후, 튜브를 미니 원심분리기에서 3초 동안 회전시켰다. 튜브 내부에 남아 있는 임의의 에탄올 액적을 비드 펠렛을 건드리지 않으며 피펫팅하였다. 비드 펠렛을 튜브 캡이 열린 상태로 자석 랙 상에서 실온에서 3분 동안 공기 건조시켰다. 마지막으로, 자기 랙에서 튜브를 제거하고, 10μl 증류수를 각 튜브에 첨가하였다. 튜브를 5초 동안 힘차게 볼텍싱하여 비드를 증류수에 재현탁시키고, 미니 원심분리기에서 3초 동안 회전시키고, 자기 랙에 2분 동안 두었다. 용액이 정화된 후, 용리된 DNA 단편을 함유하는 상청액을 각각 새로운 튜브로 옮겼다.
어댑터에 의한 라이게이션을 위해, 2개의 올리고 뉴클레오티드가 Integrated DNA Technologies에 의해 합성되었다. 한 올리고는 Illumina TruSeq universal 어댑터와 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖고(5'AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T3'), 다른 하나는 TruSeq 어댑터 index 1과 동일한 서열을 가지며(5'PGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACATCACGATCTCGTATGCCGTCTTCT*G*C*T*T*G3'), 이 때 *는 서열에 추가로 첨가된 포스포로티오에이트 결합을 나타낸다. 이중 가닥 어댑터를 제조하기 위해, 상기 올리고를 0.2ml 얇은 벽 PCR 튜브에서 총 100 μl의 1X T4 DNA 라이가제 완충제(50 mM TrisHCl, pH7.5, 10 mM MgCl2, 1 mM ATP, 10 mM DTT)에서 각 10 μM로 함께 혼합시켰다. 튜브를 써모스 사이클러(GeneAmp® PCR 시스템 9700 96-웰 금 플레이팅됨)에 놓고 95℃에서 2분 동안, 75℃에서 1분 동안, 55℃에서 1분 동안 가열시키고, 다음 단계로 진행할 때까지 25℃에서 유지시켰다.
하기 성분을 상기 DNA 용액에 첨가하였다: 4μl T4 DNA 라이가제 완충제, 2μl 10μM 어댑터, 1μl T4 DNA 라이가제(New England BioLabs Inc., 카달로그 번호 M0202S), 1μl 9oN™ DNA 라이가제(New England BioLabs Inc., 카달로그 번호 M0238S), 및 40μl까지의 증류수. 16℃에서 15분, 그 다음 45℃에서 15분 동안 인큐베이션시켰다.
하기 성분을 상기 반응물 각각에 직접 첨가하였다: 1μl의 람다 엑소뉴클레아제(New England BioLabs Inc., 카달로그 번호 M0262S), 1μl의 E. 콜라이 엑소뉴클레아제 I(New England BioLabs Inc., 카달로그 번호 M0293S). 반응물을 37℃에서 5분 동안 인큐베이션시켰다.
반응 후, DNA를 1.6X MagSi-NGSprep 비드로 1회 정제시켰다. MagSi-NGSprep 비드를 컨테이너에서 볼텍싱에 의해 완전히 현탁시킨 다음, 64μl의 MagSi-NGSprep 비드를 각 튜브에 첨가하였다. 이러한 튜브를 볼텍싱에 의해 5초 동안 혼합시키고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션시켰다. 그 후 튜브를 미니 원심분리기에서 3초 동안 회전시키고, 자기 랙에 두어 비드를 2분 동안 포집하였다. 용액이 정화되면, 상청액을 비드 펠렛을 건드리지 않고 조심스럽게 피펫팅하여 폐기하였다. 자기 랙으로부터 튜브를 제거하지 않고, 150μl의 신선하게 제조된 70% 에탄올을 각 튜브에 첨가하였다. 그 후 튜브를 자석 랙 상에서 180도로 회전시켜, 비드 펠렛이 각 튜브의 한 쪽 내벽, 및 반대쪽 펠렛으로부터 분리되게 하였다. 용액이 정화되면, 상청액을 비드 펠렛을 건드리지 않고 조심스럽게 피펫팅하여 폐기하였다. 비드를 이러한 방식으로 70% 에탄올로 총 2회 세척하였다. 최종 세척에서 70% 에탄올을 피펫팅한 후, 튜브를 미니 원심분리기에서 3초 동안 회전시켰다. 튜브 내부에 남아 있는 임의의 에탄올 액적을 비드 펠렛을 건드리지 않으며 피펫팅하였다. 비드 펠렛을 튜브 캡이 열린 상태로 자석 랙 상에서 실온에서 3분 동안 공기 건조시켰다. 마지막으로, 자기 랙에서 튜브를 제거하고, 20μl 증류수를 각 튜브에 첨가하였다. 튜브를 5초 동안 힘차게 볼텍싱하여 비드를 증류수에 재현탁시키고, 미니 원심분리기에서 3초 동안 회전시키고, 자기 랙에 2분 동안 두었다. 용액이 정화된 후, 용리된 DNA 단편을 함유하는 상청액을 각각 새로운 튜브로 옮겼다.
상기 단계로부터 수득된 DNA 단편을 추가 5회 동안 PCR에 의해 증폭시켰다. 하기 성분을 상기 DNA 용액에 첨가하였다: 5μl의 10X PCR 완충제, 2.5μl의 10μM 프라이머 믹스, 2μl의 Omni KlenTaq 폴리머라제(4.2 유닛/μl), 및 50μl까지의 증류수. 98℃에서 2분간, 그 다음 5회 사이클의 98℃에서 15초, 58℃에서 1분의 변성에 의해 PCR을 써모스 사이클러(GeneAmp® PCR 시스템 9700 96-웰 금 플레이팅됨)에서 수행한 다음, 다음 단계로 진행할 때까지 10℃에서 유지시켰다.
PCR에 이용된 프라이머는 5'AATGATACGGCGACCACCGA3' 및 5'CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT3'이었다. 이러한 올리고는 Integrated DNA Technologies에 의해 합성되었다.
반응 후, DNA를 1.6X MagSi-NGSprep 비드로 1회 정제하였다. MagSi-NGSprep 비드를 컨테이너에서 볼텍싱에 의해 완전히 현탁시킨 다음, 64μl의 MagSi-NGSprep 비드를 각 튜브에 첨가하였다. 이러한 튜브를 볼텍싱에 의해 5초 동안 혼합시키고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션시켰다. 그 후 튜브를 미니 원심분리기에서 3초 동안 회전시키고, 자기 랙에 두어 비드를 2분 동안 포집하였다. 용액이 정화되면, 상청액을 비드 펠렛을 건드리지 않고 조심스럽게 피펫팅하여 폐기하였다. 자기 랙으로부터 튜브를 제거하지 않고, 150μl의 신선하게 제조된 70% 에탄올을 각 튜브에 첨가하였다. 그 후 튜브를 자석 랙 상에서 180도로 회전시켜, 비드 펠렛이 각 튜브의 한 쪽 내벽, 및 반대쪽 펠렛으로부터 분리되게 하였다. 용액이 정화되면, 상청액을 비드 펠렛을 건드리지 않고 조심스럽게 피펫팅하여 폐기하였다. 비드를 이러한 방식으로 70% 에탄올로 총 2회 세척하였다. 최종 세척에서 70% 에탄올을 피펫팅한 후, 튜브를 미니 원심분리기에서 3초 동안 회전시켰다. 튜브 내부에 남아 있는 임의의 에탄올 액적을 비드 펠렛을 건드리지 않으며 피펫팅하였다. 비드 펠렛을 튜브 캡이 열린 상태로 자석 랙 상에서 실온에서 3분 동안 공기 건조시켰다. 마지막으로, 자기 랙에서 튜브를 제거하고, 20μl 증류수를 각 튜브에 첨가하였다. 튜브를 5초 동안 힘차게 볼텍싱하여 비드를 증류수에 재현탁시키고, 미니 원심분리기에서 3초 동안 회전시키고, 자기 랙에 2분 동안 두었다. 용액이 정화된 후, 용리된 DNA 단편을 함유하는 상청액을 각각 새로운 튜브로 옮겼다.
라이브러리의 크기, 농도 및 순도는 2100 BioAnalyzer 기계(Agilent Technologies, 카달로그 번호 G2938B)에서 검정되었다. 이전 단계에서 수득된 1μl의 각 라이브러리를 고 민감성 DNA 분석 키트(Agilent Technologies, 카달로그 번호 5067-4626)로 공급업체가 제공한 방법에 따라 검정하였다. 결과는 도 19에 제공된다. 이 라이브러리를 서열화하고 SeqMatic LLC(Fremont, CA 94539)에 의해 분석하여, 그 결과를 도 22(표 1)에 제공하였다. 이 라이브러리는 300개 염기쌍(예컨대, 200 내지 400 bp)의 주요 피크를 가졌다. 표 1은 207쌍의 프라이머에 의한 라이브러리의 시퀀싱 결과의 품질 확인을 보여준다. 명세의 강조표시는 PCT_PF_UQ_READS_ALIGNED 99.46%, PCT_AMPLIFIED_BASES 95.63%, >=20%에서 평균 98.55%의 암플리콘 퍼센트이다. 적용범위 (PCT_TARGET_BASES_2X-PCT_TARGET_BASES_100X)는 이 예에서 양호한 (99.97-100%) 적용범위를 보여준 한편, 균일성(>=20%에서 평균 98.55%의 암플리콘 퍼센트)은 매우 높았다.
실시예 19
도 20은 시퀀싱을 위해 207쌍의 긴 프라이머에 의해 본원에 기재된 대로 제조된 라이브러리의 또 다른 예를 도시한다. 이 라이브러리의 분석은 도 23의 표(표 2)에 도시된다. 이 예에서, 프라이머 패널은 Ion AmpliSeq™ 핫스팟 암 패널 v2(Life Technologies, 카달로그 번호 4475346)의 것과 동일하였으나, 5'CCTACACGACGCTCTTCCGATCT3'이 각 정방향 프라이머의 5' 말단에 첨가되고, 5'TTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT3'이 각 역방향 프라이머의 5' 말단에 첨가된 것이 예외였다. 이러한 "긴" 프라이머는 추가 라운드의 PCR에 의해 암플리콘에 어댑터를 쉽게 추가할 수 있게 한다. 멀티플렉스 PCR 반응은 10μl로 수행되었다. 하기 성분을 0.2ml의 얇은 벽 PCR 튜브(Thomas Scientific, Snapstrip II natural 0.2ml PCR 스트립 튜브, 카달로그 번호 1228F73) 각각에 첨가하였다: 5μl의 2배 농축된 프라이머 푸울, 1μl 10X PCR 완충제(1X PCR 완충제: 50 mM TrisHCl, pH8.3, 50 mM KCl, 5 mM MgCl2, 0.8 mM dNTP 각각), 2μl Omni KlenTaq DNA 폴리머라제(4.2 유닛/μl)(Enzymatics, P7500-LC-F), 1μl의 10ng/μl의 인간 DNA(Coriell Institute, NA12878), 및 1μl 증류수.
0.2ml 얇은 벽 PCR 튜브를 부착된 캡으로 덮고, 3초 동안 간단히 볼텍싱하고 미니 원심분리기에서 3초 동안 회전시켰다(Pipette.com, MyFuge 12 place 미니 원심분리기, 카달로그 번호 C1012). PCR 반응 혼합물을 덮기 위해 광유는 필요하지 않았다. 튜브를 써모스 사이클러(GeneAmp® PCR system 9700 96-웰 금 플레이팅됨, Life Technologies, 카달로그 번호 4314878)에 놓았다.
PCR을 초기에 98℃에서 2분 동안 유지한 다음, 17회 사이클의 98℃에서 15초간 변성 및 60℃에서 4분간 어닐링 및 합성이 이어졌다. 사이클링 후, 다음 단계로 진행할 때까지 반응물을 10℃로 유지시켰다.
PCR 후, 상자성 비드를 이용하여 DNA를 흡수시킨 다음, 70% 에탄올로 세척하여 단백질, dNTP, 염, 및 PCR 프라이머의 부분을 제거하였다. 상자성 비드는 Amsbio LLC(Amsbio LLC, MagSi-NGSprep, 카달로그 번호 MD61021)로부터 얻었다. MagSi-NGSprep 비드를 컨테이너에서 볼텍싱에 의해 완전히 현탁시킨 다음, 증폭되고 조합된 암플리콘의 부피의 1.6배를 나타내는 64μl의 MagSi-NGSprep 비드를 각 튜브에 첨가하였다. 이러한 튜브를 볼텍싱에 의해 5초 동안 혼합시키고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션시켰다. 그 후 튜브를 미니 원심분리기에서 3초 동안 회전시키고, 자기 랙에 두어 비드를 2분 동안 포집하였다. 자기 랙 내의 자석은 KJ Magnetics(KJ Magnetics, 카달로그 번호 D4X0DIA-N52)로부터 얻었다. 용액이 정화되면, 상청액을 비드 펠렛을 건드리지 않고 조심스럽게 피펫팅하여 폐기하였다. 자기 랙으로부터 튜브를 제거하지 않고, 150μl의 신선하게 제조된 70% 에탄올을 각 튜브에 첨가하였다. 그 후 튜브를 자석 랙 상에서 180도로 회전시켜, 비드 펠렛이 각 튜브의 한 쪽 내벽, 및 반대쪽 펠렛으로부터 분리되게 하였다. 용액이 정화되면, 상청액을 비드 펠렛을 건드리지 않고 조심스럽게 피펫팅하여 폐기하였다. 비드를 이러한 방식으로 70% 에탄올로 총 2회 세척하였다. 최종 세척에서 70% 에탄올을 피펫팅한 후, 튜브를 미니 원심분리기에서 3초 동안 회전시켰다. 튜브 내부에 남아 있는 임의의 에탄올 액적을 비드 펠렛을 건드리지 않으며 피펫팅하였다. 비드 펠렛을 튜브 캡이 열린 상태로 자석 랙 상에서 실온에서 3분 동안 공기 건조시켰다. 마지막으로, 자기 랙에서 튜브를 제거하고, 20μl 증류수를 각 튜브에 첨가하였다. 튜브를 5초 동안 힘차게 볼텍싱하여 비드를 증류수에 재현탁시키고, 미니 원심분리기에서 3초 동안 회전시키고, 자기 랙에 2분 동안 두었다. 용액이 정화된 후, 용리된 DNA 단편을 함유하는 상청액을 각각 새로운 튜브로 옮겼다.
하기 성분을 상기 반응물 각각에 직접 첨가하였다: 20μl 2X 분해 완충제(50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 15 mM MgCl2, 20mM 베타 메르캅토에탄올), 2μl T4 엔도뉴클레아제 VII(Affymetrix, part number 78300 50KU), 18μl 증류수. 반응물을 37℃에서 5분 동안 인큐베이션시켰다.
반응 후, DNA를 1.6X MagSi-NGSprep 비드로 1회 정제시켰다. MagSi-NGSprep 비드를 컨테이너에서 볼텍싱에 의해 완전히 현탁시킨 다음, 128μl의 MagSi-NGSprep 비드를 각 튜브에 첨가하였다. 이러한 튜브를 볼텍싱에 의해 5초 동안 혼합시키고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션시켰다. 그 후 튜브를 미니 원심분리기에서 3초 동안 회전시키고, 자기 랙에 두어 비드를 2분 동안 포집하였다. 용액이 정화되면, 상청액을 비드 펠렛을 건드리지 않고 조심스럽게 피펫팅하여 폐기하였다. 자기 랙으로부터 튜브를 제거하지 않고, 150μl의 신선하게 제조된 70% 에탄올을 각 튜브에 첨가하였다. 그 후 튜브를 자석 랙 상에서 180도로 회전시켜, 비드 펠렛이 각 튜브의 한 쪽 내벽, 및 반대쪽 펠렛으로부터 분리되게 하였다. 용액이 정화되면, 상청액을 비드 펠렛을 건드리지 않고 조심스럽게 피펫팅하여 폐기하였다. 비드를 이러한 방식으로 70% 에탄올로 총 2회 세척하였다. 최종 세척에서 70% 에탄올을 피펫팅한 후, 튜브를 미니 원심분리기에서 3초 동안 회전시켰다. 튜브 내부에 남아 있는 임의의 에탄올 액적을 비드 펠렛을 건드리지 않으며 피펫팅하였다. 비드 펠렛을 튜브 캡이 열린 상태로 자석 랙 상에서 실온에서 3분 동안 공기 건조시켰다. 마지막으로, 자기 랙에서 튜브를 제거하고, 10μl 증류수를 각 튜브에 첨가하였다. 튜브를 5초 동안 힘차게 볼텍싱하여 비드를 증류수에 재현탁시키고, 미니 원심분리기에서 3초 동안 회전시키고, 자기 랙에 2분 동안 두었다. 용액이 정화된 후, 용리된 DNA 단편을 함유하는 상청액을 각각 새로운 튜브로 옮겼다.
상기 단계에서 수득된 DNA 단편을 추가 5회 동안 PCR에 의해 증폭시켰다. 하기 성분을 상기 DNA 용액에 첨가하였다: 5μl의 10X PCR 완충제, 2.5μl의 10μM 프라이머 믹스, 2μl의 Omni KlenTaq 폴리머라제(4.2 유닛/μl), 및 50μl까지의 증류수. 98℃에서 2분간, 그 다음 5회 사이클의 98℃에서 15초, 58℃에서 1분의 변성에 의해 PCR을 써모스 사이클러(GeneAmp® PCR 시스템 9700 96-웰 금 플레이팅됨)에서 수행한 다음, 다음 단계로 진행할 때까지 10℃에서 유지시켰다.
PCR에 이용된 프라이머는 5' AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT3' 및 5' GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACATCACGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG3'이었다. 이러한 올리고는 Integrated DNA Technologies에 의해 합성되었다.
라이브러리의 크기, 농도 및 순도는 2100 BioAnalyzer 기계(Agilent Technologies, 카달로그 번호 G2938B)에서 검정되었다. 이전 단계에서 수득된 1μl의 각 라이브러리를 고 민감성 DNA 분석 키트(Agilent Technologies, 카달로그 번호 5067-4626)로 공급업체가 제공한 방법에 따라 검정하였다. 결과는 도 20에 제공된다. 이 라이브러리를 서열화하고 SeqMatic LLC(Fremont, CA 94539)에 의해 분석하여, 그 결과를 도 23의 표 2에 제공하였다. 이 라이브러리는 300개 염기쌍(예컨대, 200 내지 400 bp)의 주요 피크를 가졌다. 도 23에 도시된 207쌍의 긴 프라이머에 의한 라이브러리의 시퀀싱 결과의 품질 확인은 PCT_PF_UQ_READS_ALIGNED 99.62%, PCT_AMPLIFIED_BASES 98.94%, 및 높은 균일성(예컨대, >=20%에서 평균 97.52%의 암플리콘 퍼센트)을 포함하는 명세의 강조표시를 보여준다.
실시예 20
도 21a는 비특이적 증폭 생성물을 감소시키기 위해 레솔바제로의 처리를 포함하는 본원에 기재된 대로 제조된 라이브러리의 또 다른 예의 결과를 도시하고, 여기서 라이브러리는 시퀀싱을 위한 16000쌍의 프라이머에 의해 제조되었다. 표 3(도 24)은 이러한 라이브러리의 분석을 기재한다.
프라이머 패널은 Ion AmpliSeq™ 포괄적 암 패널(Life Technologies, 카달로그 번호 4477685)이었다. 이 프라이머 패널은 빈번하게 돌연변이되고 과학 간행물에서 인용되는 409개의 주요 종양 억제 유전자 및 종양유전자의 모든-엑손을 커버한다. 이것은 4개의 푸울에 16000 프라이머 쌍을 갖는다; 각 푸울은 약 4,000 프라이머 쌍을 갖는다. 암플리콘의 길이는 125-175개 염기쌍의 범위이고, 표적 영역은 약 173만 개의 염기를 포함한다. 라이브러리가 이 패널 및 Life Technologies' Ion AmpliSeq™ 라이브러리 Kit 2.0으로 제조되고, Life Technologies' Ion PGM™ 시스템에서 서열화될 때, 이 패널은 표적 염기(표적 영역에 맵핑된 염기, 실행 당 총 맵핑된 염기 중)에 대해 97%와 함께, >20% 중앙 시퀀싱 깊이에서 94%의 적용범위를 보고하였다. 멀티플렉스 PCR에서, 4개의 프라이머 푸울 각각은 주형으로서 10ng의 인간 유전체 DNA를 필요로 하고, 전체 패널을 커버하기 위해 총 40ng가 필요하다. 이 프라이머 패널의 각 프라이머에는 적어도 하나의 우라실 뉴클레오티드가 존재한다. 이 프라이머 패널은 2배 농축된다. 따라서, 4회의 PCR 반응은 4개 푸울의 프라이머 각각으로 수행되었다.
멀티플렉스 PCR 반응은 10μl로 수행되었다. 하기 성분을 0.2ml의 얇은 벽 PCR 튜브(Thomas Scientific, Snapstrip II natural 0.2ml PCR 스트립 튜브, 카달로그 번호 1228F73) 각각에 첨가하였다: 5μl의 2배 농축된 프라이머 푸울, 1μl 10X PCR 완충제(1X PCR 완충제: 50 mM TrisHCl, pH8.3, 50 mM KCl, 5 mM MgCl2, 0.8 mM dNTP 각각), 2μl Omni KlenTaq DNA 폴리머라제(4.2 유닛/μl)(Enzymatics, P7500-LC-F), 1μl의 10ng/μl의 인간 DNA(Coriell Institute, NA12878), 및 1μl 증류수. Ion AmpliSeq™ 포괄적 암 패널에 대해 4개의 멀티플렉스 PCR 반응이 존재하였다.
0.2ml 얇은 벽 PCR 튜브를 부착된 캡으로 덮고, 3초 동안 간단히 볼텍싱하고 미니 원심분리기에서 3초 동안 회전시켰다(Pipette.com, MyFuge 12 place 미니 원심분리기, 카달로그 번호 C1012). PCR 반응 혼합물을 덮기 위해 광유는 필요하지 않았다. 튜브를 써모스 사이클러(GeneAmp® PCR system 9700 96-웰 금 플레이팅됨, Life Technologies, 카달로그 번호 4314878)에 놓았다. 각 프라이머 패널에 대해 하기 두 온도 프로파일이 수행되었다.
PCR을 초기에 98℃에서 2분 동안 유지한 다음, 13회 사이클의 98℃에서 15초간 변성 및 60℃에서 8분간 어닐링 및 합성이 이어졌다. 사이클링 후, 다음 단계로 진행할 때까지 반응물을 10℃에서 유지시켰다.
PCR 후, Ion AmpliSeq™ 포괄적 암 패널의 완전한 프라이머 패널을 나타내는 4개 반응물을 합쳐, 1개 튜브의 40μl의 증폭된 암플리콘 라이브러리를 생성하였다. 상자성 비드를 이용하여 DNA를 흡수시킨 다음, 70% 에탄올로 세척하여 단백질, dNTP, 염, 및 PCR 프라이머의 부분을 제거하였다. 상자성 비드는 Amsbio LLC(Amsbio LLC, MagSi-NGSprep, 카달로그 번호 MD61021)로부터 얻었다. MagSi-NGSprep 비드를 컨테이너에서 볼텍싱에 의해 완전히 현탁시킨 다음, 증폭되고 조합된 암플리콘의 부피의 1.6배를 나타내는 64μl의 MagSi-NGSprep 비드를 각 튜브에 첨가하였다. 이러한 튜브를 볼텍싱에 의해 5초 동안 혼합시키고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션시켰다. 그 후 튜브를 미니 원심분리기에서 3초 동안 회전시키고, 자기 랙에 두어 비드를 2분 동안 포집하였다. 자기 랙 내의 자석은 KJ Magnetics(KJ Magnetics, 카달로그 번호 D4X0DIA-N52)로부터 얻었다. 용액이 정화되면, 상청액을 비드 펠렛을 건드리지 않고 조심스럽게 피펫팅하여 폐기하였다. 자기 랙으로부터 튜브를 제거하지 않고, 150μl의 신선하게 제조된 70% 에탄올을 각 튜브에 첨가하였다. 그 후 튜브를 자석 랙 상에서 180도로 회전시켜, 비드 펠렛이 각 튜브의 한 쪽 내벽, 및 반대쪽 펠렛으로부터 분리되게 하였다. 용액이 정화되면, 상청액을 비드 펠렛을 건드리지 않고 조심스럽게 피펫팅하여 폐기하였다. 비드를 이러한 방식으로 70% 에탄올로 총 2회 세척하였다. 최종 세척에서 70% 에탄올을 피펫팅한 후, 튜브를 미니 원심분리기에서 3초 동안 회전시켰다. 튜브 내부에 남아 있는 임의의 에탄올 액적을 비드 펠렛을 건드리지 않으며 피펫팅하였다. 비드 펠렛을 튜브 캡이 열린 상태로 자석 랙 상에서 실온에서 3분 동안 공기 건조시켰다. 마지막으로, 자기 랙에서 튜브를 제거하고, 20μl 증류수를 각 튜브에 첨가하였다. 튜브를 5초 동안 힘차게 볼텍싱하여 비드를 증류수에 재현탁시키고, 미니 원심분리기에서 3초 동안 회전시키고, 자기 랙에 2분 동안 두었다. 용액이 정화된 후, 용리된 DNA 단편을 함유하는 상청액을 각각 새로운 튜브로 옮겼다.
DNA 단편은 이전의 정제된 DNA 용액, 4μl 10X 평활 말단 완충제(1X 평활 완충제: 50mM Tris-HCl(pH 7.6), 10mM MgCl2, 10mM 베타 메르캅토에탄올, 1mM ATP, 0.4mM dNTP 각각), 12 유닛의 T4 DNA 폴리머라제(Molecular Cloning laboratories, 카달로그 번호 T4DP-100), 40 유닛의 폴리뉴클레오티드 키나제(Molecular Cloning laboratories, 카달로그 번호 T4PK-100)를 첨가함에 의해 총 40μl로 평활 말단화되었다. 각 튜브의 반응 혼합물을 먼저 미니 원심분리기에서 3초 동안 간단히 회전시켜 모든 액적을 튜브 바닥에 수집하고, 3초 동안 볼텍싱한 다음, 다시 3초 동안 회전시켜 반응의 균일성을 보장하였다. 튜브를 실온에서 10분 동안 인큐베이션시켰다.
반응 후, DNA를 1.6X MagSi-NGSprep 비드로 1회 정제하였다. MagSi-NGSprep 비드를 컨테이너에서 볼텍싱에 의해 완전히 현탁시킨 다음, 64μl의 MagSi-NGSprep 비드를 각 튜브에 첨가하였다. 이러한 튜브를 볼텍싱에 의해 5초 동안 혼합시키고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션시켰다. 그 후 튜브를 미니 원심분리기에서 3초 동안 회전시키고, 자기 랙에 두어 비드를 2분 동안 포집하였다. 용액이 정화되면, 상청액을 비드 펠렛을 건드리지 않고 조심스럽게 피펫팅하여 폐기하였다. 자기 랙으로부터 튜브를 제거하지 않고, 150μl의 신선하게 제조된 70% 에탄올을 각 튜브에 첨가하였다. 그 후 튜브를 자석 랙 상에서 180도로 회전시켜, 비드 펠렛이 각 튜브의 한 쪽 내벽, 및 반대쪽 펠렛으로부터 분리되게 하였다. 용액이 정화되면, 상청액을 비드 펠렛을 건드리지 않고 조심스럽게 피펫팅하여 폐기하였다. 비드를 이러한 방식으로 70% 에탄올로 총 2회 세척하였다. 최종 세척에서 70% 에탄올을 피펫팅한 후, 튜브를 미니 원심분리기에서 3초 동안 회전시켰다. 튜브 내부에 남아 있는 임의의 에탄올 액적을 비드 펠렛을 건드리지 않으며 피펫팅하였다. 비드 펠렛을 튜브 캡이 열린 상태로 자석 랙 상에서 실온에서 3분 동안 공기 건조시켰다. 마지막으로, 자기 랙에서 튜브를 제거하고, 20μl 증류수를 각 튜브에 첨가하였다. 튜브를 5초 동안 힘차게 볼텍싱하여 비드를 증류수에 재현탁시키고, 미니 원심분리기에서 3초 동안 회전시키고, 자기 랙에 2분 동안 두었다. 용액이 정화된 후, 용리된 DNA 단편을 함유하는 상청액을 각각 새로운 튜브로 옮겼다.
하기 성분을 정제된 DNA 용액에 첨가하였다: 4μl 10X A-테일링 완충제(1X A-테일링 완충제: 50 mM TrisHCl, pH8.3, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2), 0.5μl의 100mM ATP, 1 μl의 Omni KlenTaq DNA 폴리머라제(4.2 유닛/μl), 및 40μl까지의 증류수. 각 튜브의 반응 혼합물을 먼저 미니 원심분리기에서 3초 동안 간단히 회전시켜 모든 액적을 튜브 바닥에 수집하고, 3초 동안 볼텍싱한 다음, 다시 3초 동안 회전시켜 반응의 균일성을 보장하였다. 튜브를 72℃에서 10분 동안 인큐베이션시켰다.
인큐베이션 후, 완충제 교체 없이 반응 혼합물을 이 단계로 직접 진행시켰다. 하기 성분을 상기 반응물 각각에 직접 첨가하였다: 20μl 2X 분해 완충제(50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 15 mM MgCl2, 20mM 베타 메르캅토에탄올), 2μl T4 엔도뉴클레아제 VII(Affymetrix, part number 78300 50KU), 18μl 증류수. 반응물을 37℃에서 5분 동안 인큐베이션시켰다.
반응 후, DNA를 1.6X MagSi-NGSprep 비드로 1회 정제하였다. MagSi-NGSprep 비드를 컨테이너에서 볼텍싱에 의해 완전히 현탁시킨 다음, 128μl의 MagSi-NGSprep 비드를 각 튜브에 첨가하였다. 이러한 튜브를 볼텍싱에 의해 5초 동안 혼합시키고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션시켰다. 그 후 튜브를 미니 원심분리기에서 3초 동안 회전시키고, 자기 랙에 두어 비드를 2분 동안 포집하였다. 용액이 정화되면, 상청액을 비드 펠렛을 건드리지 않고 조심스럽게 피펫팅하여 폐기하였다. 자기 랙으로부터 튜브를 제거하지 않고, 150μl의 신선하게 제조된 70% 에탄올을 각 튜브에 첨가하였다. 그 후 튜브를 자석 랙 상에서 180도로 회전시켜, 비드 펠렛이 각 튜브의 한 쪽 내벽, 및 반대쪽 펠렛으로부터 분리되게 하였다. 용액이 정화되면, 상청액을 비드 펠렛을 건드리지 않고 조심스럽게 피펫팅하여 폐기하였다. 비드를 이러한 방식으로 70% 에탄올로 총 2회 세척하였다. 최종 세척에서 70% 에탄올을 피펫팅한 후, 튜브를 미니 원심분리기에서 3초 동안 회전시켰다. 튜브 내부에 남아 있는 임의의 에탄올 액적을 비드 펠렛을 건드리지 않으며 피펫팅하였다. 비드 펠렛을 튜브 캡이 열린 상태로 자석 랙 상에서 실온에서 3분 동안 공기 건조시켰다. 마지막으로, 자기 랙에서 튜브를 제거하고, 10μl 증류수를 각 튜브에 첨가하였다. 튜브를 5초 동안 힘차게 볼텍싱하여 비드를 증류수에 재현탁시키고, 미니 원심분리기에서 3초 동안 회전시키고, 자기 랙에 2분 동안 두었다. 용액이 정화된 후, 용리된 DNA 단편을 함유하는 상청액을 각각 새로운 튜브로 옮겼다.
어댑터에 의한 라이게이션을 위해, 2개의 올리고 뉴클레오티드가 Integrated DNA Technologies에 의해 합성되었다. 한 올리고는 Illumina TruSeq universal 어댑터와 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖고(5'AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T3'), 다른 하나는 TruSeq 어댑터 index 1과 동일한 서열을 가지며(5'PGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACATCACGATCTCGTATGCCGTCTTCT*G*C*T*T*G3'), 이 때 *는 서열에 추가로 첨가된 포스포로티오에이트 결합을 나타낸다. 이중 가닥 어댑터를 제조하기 위해, 상기 올리고를 0.2ml 얇은 벽 PCR 튜브에서 총 100 μl의 1X T4 DNA 라이가제 완충제(50 mM TrisHCl, pH7.5, 10 mM MgCl2, 1 mM ATP, 10 mM DTT)에서 각 10 μM로 함께 혼합시켰다. 튜브를 써모스 사이클러(GeneAmp® PCR 시스템 9700 96-웰 금 플레이팅됨)에 놓고 95℃에서 2분 동안, 75℃에서 1분 동안, 55℃에서 1분 동안 가열시키고, 다음 단계로 진행할 때까지 25℃에서 유지시켰다.
하기 성분을 상기 DNA 용액에 첨가하였다: 4μl T4 DNA 라이가제 완충제, 2μl 10μM 어댑터, 1μl T4 DNA 라이가제(New England BioLabs Inc., 카달로그 번호 M0202S), 1μl 9oN™ DNA 라이가제(New England BioLabs Inc., 카달로그 번호 M0238S), 및 40μl까지의 증류수. 16℃에서 15분, 그 다음 45℃에서 15분 동안 인큐베이션시켰다.
하기 성분을 상기 반응물에 직접 첨가하였다: 1μl의 람다 엑소뉴클레아제(New England BioLabs Inc., 카달로그 번호 M0262S), 1μl의 E. 콜라이 엑소뉴클레아제 I(New England BioLabs Inc., 카달로그 번호 M0293S). 반응물을 37℃에서 5분 동안 인큐베이션시켰다.
반응 후, DNA를 1.6X MagSi-NGSprep 비드로 1회 정제시켰다. MagSi-NGSprep 비드를 컨테이너에서 볼텍싱에 의해 완전히 현탁시킨 다음, 64μl의 MagSi-NGSprep 비드를 각 튜브에 첨가하였다. 이러한 튜브를 볼텍싱에 의해 5초 동안 혼합시키고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션시켰다. 그 후 튜브를 미니 원심분리기에서 3초 동안 회전시키고, 자기 랙에 두어 비드를 2분 동안 포집하였다. 용액이 정화되면, 상청액을 비드 펠렛을 건드리지 않고 조심스럽게 피펫팅하여 폐기하였다. 자기 랙으로부터 튜브를 제거하지 않고, 150μl의 신선하게 제조된 70% 에탄올을 각 튜브에 첨가하였다. 그 후 튜브를 자석 랙 상에서 180도로 회전시켜, 비드 펠렛이 각 튜브의 한 쪽 내벽, 및 반대쪽 펠렛으로부터 분리되게 하였다. 용액이 정화되면, 상청액을 비드 펠렛을 건드리지 않고 조심스럽게 피펫팅하여 폐기하였다. 비드를 이러한 방식으로 70% 에탄올로 총 2회 세척하였다. 최종 세척에서 70% 에탄올을 피펫팅한 후, 튜브를 미니 원심분리기에서 3초 동안 회전시켰다. 튜브 내부에 남아 있는 임의의 에탄올 액적을 비드 펠렛을 건드리지 않으며 피펫팅하였다. 비드 펠렛을 튜브 캡이 열린 상태로 자석 랙 상에서 실온에서 3분 동안 공기 건조시켰다. 마지막으로, 자기 랙에서 튜브를 제거하고, 20μl 증류수를 각 튜브에 첨가하였다. 튜브를 5초 동안 힘차게 볼텍싱하여 비드를 증류수에 재현탁시키고, 미니 원심분리기에서 3초 동안 회전시키고, 자기 랙에 2분 동안 두었다. 용액이 정화된 후, 용리된 DNA 단편을 함유하는 상청액을 각각 새로운 튜브로 옮겼다.
상기 단계로부터 수득된 DNA 단편을 추가 5회 사이클 동안 PCR에 의해 증폭시켰다. 하기 성분을 상기 DNA 용액에 첨가하였다: 5μl의 10X PCR 완충제, 2.5μl의 10μM 프라이머 믹스, 2μl의 Omni KlenTaq 폴리머라제(4.2 유닛/μl), 및 50μl까지의 증류수. 98℃에서 2분간, 그 다음 5회 사이클의 98℃에서 15초, 58℃에서 1분의 변성에 의해 PCR을 써모스 사이클러(GeneAmp® PCR 시스템 9700 96-웰 금 플레이팅됨)에서 수행한 다음, 다음 단계로 진행할 때까지 10℃에서 유지시켰다.
PCR에 이용된 프라이머는 5'AATGATACGGCGACCACCGA3' 및 5'CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT3'이었다. 이러한 올리고는 Integrated DNA Technologies에 의해 합성되었다.
반응 후, DNA를 1.6X MagSi-NGSprep 비드로 1회 정제하였다. MagSi-NGSprep 비드를 컨테이너에서 볼텍싱에 의해 완전히 현탁시킨 다음, 64μl의 MagSi-NGSprep 비드를 각 튜브에 첨가하였다. 이러한 튜브를 볼텍싱에 의해 5초 동안 혼합시키고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션시켰다. 그 후 튜브를 미니 원심분리기에서 3초 동안 회전시키고, 자기 랙에 두어 비드를 2분 동안 포집하였다. 용액이 정화되면, 상청액을 비드 펠렛을 건드리지 않고 조심스럽게 피펫팅하여 폐기하였다. 자기 랙으로부터 튜브를 제거하지 않고, 150μl의 신선하게 제조된 70% 에탄올을 각 튜브에 첨가하였다. 그 후 튜브를 자석 랙 상에서 180도로 회전시켜, 비드 펠렛이 각 튜브의 한 쪽 내벽, 및 반대쪽 펠렛으로부터 분리되게 하였다. 용액이 정화되면, 상청액을 비드 펠렛을 건드리지 않고 조심스럽게 피펫팅하여 폐기하였다. 비드를 이러한 방식으로 70% 에탄올로 총 2회 세척하였다. 최종 세척에서 70% 에탄올을 피펫팅한 후, 튜브를 미니 원심분리기에서 3초 동안 회전시켰다. 튜브 내부에 남아 있는 임의의 에탄올 액적을 비드 펠렛을 건드리지 않으며 피펫팅하였다. 비드 펠렛을 튜브 캡이 열린 상태로 자석 랙 상에서 실온에서 3분 동안 공기 건조시켰다. 마지막으로, 자기 랙에서 튜브를 제거하고, 20μl 증류수를 각 튜브에 첨가하였다. 튜브를 5초 동안 힘차게 볼텍싱하여 비드를 증류수에 재현탁시키고, 미니 원심분리기에서 3초 동안 회전시키고, 자기 랙에 2분 동안 두었다. 용액이 정화된 후, 용리된 DNA 단편을 함유하는 상청액을 각각 새로운 튜브로 옮겼다.
라이브러리의 크기, 농도 및 순도는 2100 BioAnalyzer 기계(Agilent Technologies, 카달로그 번호 G2938B)에서 검정되었다. 이전 단계에서 수득된 1μl의 각 라이브러리를 고 민감성 DNA 분석 키트(Agilent Technologies, 카달로그 번호 5067-4626)로 공급업체가 제공한 방법에 따라 검정하였다. 결과는 도 21b에 제공된다. 이 라이브러리를 서열화하고 SeqMatic LLC(Fremont, CA 94539)에 의해 분석하여, 그 결과를 표 3(도 24)에 제공하였다. 도 21a에 요약된 대로, 라이브러리(차세대 시퀀싱에 이용될 수 있음)는 실시예 3에 기재된 방법에 의해 16000쌍의 프라이머 및 인간 유전체 DNA(NA12878)로 제조되었고, 최종 라이브러리는 도 21b에 도시되어 있다. 이 라이브러리는 300개 염기쌍(200-400 bp)의 단일 피크이다. 표 3(도 24)에 도시된 대로, 16000쌍의 프라이머로 제조된 이 라이브러리의 시퀀싱 결과의 품질 확인은 높은 적용범위 및 균일성 둘 모두를 발생시켰다(예컨대, PCT_PF_UQ_READS_ALIGNED 98.18%, PCT_AMPLIFIED_BASES 99.39%, >=20%에서 평균 95.20%의 암플리콘 퍼센트).
본원에 사용된 용어는 단지 특정 구체예를 설명하기 위한 것이며, 본 발명을 제한하려는 것이 아니다. 예를 들어, 본원에서 사용된 단수 형태는, 문맥에서 달리 명확하게 지시하지 않는 한, 복수 형태를 포함하고자 한다. 용어 "포함하다" 및/또는 "포함하는"은 본 명세서에 사용될 때 언급된 특징, 단계, 동작, 요소, 및/또는 구성요소의 존재를 명시하나, 하나 이상의 다른 특징, 단계, 동작, 요소, 구성요소, 및/또는 이의 그룹의 존재 또는 추가를 배제하지 않음이 추가로 이해될 것이다. 본원에서 사용되는 용어 "및/또는"은 관련하여 열거된 항목 중 하나 이상의 임의의 및 모든 조합을 포함하며 "/"로서 줄여서 표시할 수 있다.
다양한 특징/요소(단계 포함)를 설명하기 위해 용어 "제1" 및 "제2"가 본원에서 사용될 수 있으나, 이러한 특징/요소는, 문맥에서 달리 지시하지 않는 한, 이러한 용어에 의해 제한되어서는 안된다. 이러한 용어는 한 특징/요소를 또 다른 특징/요소로부터 구별하기 위해 이용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 교시로부터 벗어나지 않으며 하기 논의된 제1 특징/요소는 제2 특징/요소로 명명될 수 있고, 유사하게, 하기 논의된 제2 특징/요소는 제1 특징/요소로 명명될 수 있었다.
본 명세서 및 이어지는 청구범위를 통틀어, 문맥에서 달리 요구하지 않는 한, 단어 "포함하다", 및 "포함" 및 "포함하는"과 같은 변형은 다양한 구성요소가 방법 및 물품에 공동으로 사용될 수 있음을 의미한다(예컨대, 디바이스 및 방법을 포함하는 조성물 및 장치). 예를 들어, 용어 "포함하는"은 임의의 다른 요소 또는 단계를 배제하지 않으며 임의의 언급된 요소 또는 단계의 포함을 의미하는 것임이 이해될 것이다.
실시예에 사용된 것을 포함하여, 본 명세서 및 청구범위에서 본원에 사용된 바와 같이, 달리 분명하게 명시되지 않는 한, 모든 숫자는 비록 단어 "약" 또는 "대략"이 분명히 보이지 않더라도 그 단어가 앞에 있는 것처럼 이해될 수 있다. 용어 "약" 또는 "대략"은 기술된 값 및/또는 위치가 값 및/또는 위치의 합리적으로 기대되는 범위 내에 있음을 나타내기 위해 크기 및/또는 위치를 기술할 때 이용될 수 있다. 예를 들어, 숫자 값은 언급된 값(또는 값의 범위)의 +/- 0.1%, 언급된 값(또는 값의 범위)의 +/- 1%, 언급된 값(또는 값의 범위)의 +/- 2%, 언급된 값(또는 값의 범위)의 +/- 5%, 언급된 값(또는 값의 범위)의 +/- 10%, 등의 값을 가질 수 있다. 본원에서 주어진 임의의 숫자 값은 또한, 문맥에서 달리 지시하지 않는 한, 약 또는 대략의 그 값을 포함하는 것임이 이해되어야 한다. 예를 들어, 값 "10"이 기재된 경우, "약 10"이 또한 기재된 것이다. 본원에 인용된 임의의 숫자 범위는 그 안에 포함된 모든 하위 범위를 포함하고자 한다. 당업자가 적절하게 이해하는 바와 같이, 값이 기재된 경우, 그 값 "이하", "그 값 이상" 및 값들 사이의 가능한 범위가 또한 기재된 것임이 또한 이해된다. 예를 들어, 값 "X"가 기재된 경우, "X 이하" 뿐만 아니라 "X 이상"(예컨대, 여기서 X는 숫자 값임)도 기재된 것이다. 또한 출원을 통틀어 데이터는 다수의 상이한 포맷으로 제공되며, 이 데이터는 종말점과 시작점, 및 데이터 포인트의 임의의 조합에 대한 범위를 나타내는 것임이 이해된다. 예를 들어, 특정 데이터 포인트 "10" 및 특정 데이터 포인트 "15"가 기재된 경우, 10 및 15 초과, 그 이상, 그 미만, 그 이하, 및 10 및 15 뿐만 아니라 10 내지 15가 기재된 것으로 간주됨이 이해된다. 또한 2개의 특정 유닛 사이의 각 유닛이 또한 기재된 것으로 이해된다. 예를 들어, 10 및 15가 기재된 경우, 11, 12, 13, 및 14도 기재된 것이다.
비록 다양한 예시적인 구체예가 상기 기재되었으나, 청구범위에 기재된 바와 같은 본 발명의 범위를 벗어나지 않으며 다양한 구체예에 대한 임의의 많은 변경이 이루어질 수 있다. 예를 들어, 다양한 기재된 방법 단계가 수행되는 순서는 대안적인 구체예에서 종종 변경될 수 있고, 다른 대안적인 구체예에서, 하나 이상의 방법 단계를 모두 건너뛸 수 있다. 다양한 디바이스 및 시스템 구체예의 선택적 특징은 일부 구체예에 포함될 수 있고 다른 구체예에서는 포함되지 않을 수 있다. 따라서, 전술한 설명은 주로 예시적인 목적으로 제공되며 청구범위에 개시된 바와 같은 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
본원에 포함된 실시예 및 예시는 요지가 실시될 수 있는 특정 구체예를 제한이 아닌 예시로서 보여준다. 언급된 대로, 본 개시 내용의 범위를 벗어나지 않으며 구조적 및 논리적 대체 및 변경이 이루어질 수 있도록, 다른 구체예가 활용되고 그로부터 도출될 수 있다. 본 발명의 요지의 이러한 구체예는, 사실상, 하나를 초과하는 발명이 기재된 경우, 본 출원의 범위를 임의의 단일 발명 또는 발명적 개념으로 자발적으로 제한하지 않고 편의상 단지 "발명"이라는 용어에 의해 개별적으로 또는 집합적으로 본원에서 언급될 수 있다. 그러므로, 비록 특수한 구체예가 본원에 예시되고 기재되었으나, 동일한 목적을 달성하도록 계산된 임의의 배치가 제시된 특수한 구체예를 대체할 수 있다. 본 개시 내용은 다양한 구체예의 임의의 및 모든 적응 또는 변형을 포함하고자 한다. 상기 구체예의 조합, 및 본원에서 구체적으로 기술되지 않은 다른 구체예는 상기 설명을 검토해 볼 때 당업자에게 명백할 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> PARAGON GENOMICS, INC. <120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR REDUCING NON-SPECIFIC AMPLIFICATION PRODUCTS <130> 13982-700.600 <140> PCT/US2016/017454 <141> 2016-02-11 <150> 62/150,600 <151> 2015-04-21 <150> 62/114,788 <151> 2015-02-11 <160> 8 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1 cctacacgac gctcttccga tct 23 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2 ttcagacgtg tgctcttccg atct 24 <210> 3 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (57)..(58) <223> Phosphorothioate linkage <400> 3 aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatct 58 <210> 4 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> 5' phosphate <220> <221> misc_feature <222> (58)..(63) <223> Phosphorothioate linkage <400> 4 gatcggaaga gcacacgtct gaactccagt cacatcacga tctcgtatgc cgtcttctgc 60 ttg 63 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 5 aatgatacgg cgaccaccga 20 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 6 caagcagaag acggcatacg agat 24 <210> 7 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 7 aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatct 58 <210> 8 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 8 gatcggaaga gcacacgtct gaactccagt cacatcacga tctcgtatgc cgtcttctgc 60 ttg 63

Claims (54)

  1. 주형-의존성 프라이머 신장 반응으로부터 비특이적 증폭 생성물을 감소시키는 방법으로서, 상기 방법이,
    복수의 표적 핵산을 복수의 쌍의 표적-특이적 프라이머를 이용하여 증폭시키는 단계로서, 상기 증폭이 복수의 표적-특이적 증폭 생성물 및 복수의 비특이적 증폭 생성물을 생성하는, 단계;
    이상 DNA 구조를 인지하는 레솔바제를 도입시키고 상기 비특이적 증폭 생성물을 레솔바제로 절단하여, 상당한 비율의 상기 복수의 표적-특이적 증폭 생성물을 유지하면서 복수의 절단된 비특이적 증폭 생성물을 생성하는 단계로서, 레솔바제가 T4 엔도뉴클레아제 VII 또는 T7 엔도뉴클레아제 I 중 하나인, 단계를 포함하는, 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상당한 비율의 상기 복수의 표적-특이적 증폭 생성물을 남기면서, 절단된 비특이적 증폭 생성물을 제거하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 표적-특이적 증폭 생성물을 분석하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  4. 제 3항에 있어서, 분석이 차세대 시퀀싱 반응을 포함하는 방법.
  5. 제 1항에 있어서, 증폭이 멀티플렉스 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 수행하는 것을 포함하는 방법.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 표적 핵산이 DNA 또는 RNA를 포함하는 방법.
  7. 제 1항에 있어서, 상기 표적 핵산이 유전체 DNA 또는 cDNA인 방법.
  8. 제 1항에 있어서, 상기 표적-특이적 프라이머가 적어도 10쌍의 표적-특이적 프라이머를 포함하는 방법.
  9. 제 1항에 있어서, 상기 표적-특이적 프라이머가 10쌍 내지 1000쌍의 표적-특이적 프라이머를 포함하는 방법.
  10. 제 1항에 있어서, 상기 표적-특이적 프라이머가 1,000쌍 내지 약 100,000쌍의 표적-특이적 프라이머를 포함하는 방법.
  11. 제 1항에 있어서, 상기 표적-특이적 프라이머가 100,000 초과의 표적-특이적 프라이머를 포함하는 방법.
  12. 제 1항에 있어서, 상기 레솔바제가 Holliday 구조 또는 이음부, 분지된 DNA, Y-구조, 십자형, 헤테로듀플렉스 루프, 거대 부가물, 단일 가닥 오버행, DNA 미스매치, 또는 완전하게-매칭되지 않은 DNA 중 적어도 하나를 포함하는 이상 DNA 구조를 인지하는 방법.
  13. 제 1항에 있어서, 레솔바제가 T4 엔도뉴클레아제 VII인 방법.
  14. 제 1항에 있어서, 상기 비특이적 증폭 생성물을 엑소뉴클레아제로 절단하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  15. 제 1항에 있어서, 복수의 표적-특이적 증폭 생성물 및 복수의 비특이적 증폭 생성물에 대한 말단-수복을 수행한 후 상기 비특이적 증폭 생성물을 람다 엑소뉴클레아제 또는 E. 콜라이 엑소뉴클레아제 I 중 적어도 하나를 포함하는 엑소뉴클레아제로 절단하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  16. 제 1항에 있어서, 복수의 표적-특이적 증폭 생성물 및 복수의 비특이적 증폭 생성물에 대한 말단 수복을 수행하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  17. 제 1항에 있어서, 레솔바제를 도입하기 전에 복수의 표적-특이적 증폭 생성물 및 복수의 비특이적 증폭 생성물에 대한 말단 수복을 수행하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  18. 제 1항에 있어서, 레솔바제의 도입 후에 어댑터를 상당한 비율의 상기 복수의 표적-특이적 증폭 생성물에 라이게이션시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  19. 제 18항에 있어서, 상기 어댑터가 적어도 3개의 연속적인 포스포로티오에이트를 포함하는 방법.
  20. 제 1항에 있어서, 상기 비특이적 증폭 생성물을 레솔바제로 절단하는 단계가 비특이적 증폭 생성물 및 복수의 표적-특이적 증폭 생성물을 약 0.2 U 내지 1000 U의 레솔바제에 0.5분 내지 60분 동안 16℃ 내지 37℃에서 노출시키는 것을 포함하는 방법.
  21. 제 1항에 있어서, 상당한 비율의 상기 복수의 표적-특이적 증폭 생성물이 50% 초과의 복수의 표적-특이적 증폭 생성물을 포함하는 방법.
  22. 주형-의존성 프라이머 신장 반응으로부터 비특이적 증폭 생성물을 감소시키는 방법으로서, 상기 방법이,
    복수의 표적 핵산을 복수의 쌍의 표적-특이적 프라이머를 이용하여 증폭시켜 복수의 표적-특이적 증폭 생성물 및 복수의 비특이적 증폭 생성물을 포함하는 혼합물을 형성하는 단계;
    이상 DNA 구조를 인지하는 레솔바제를 혼합물에 도입시키고 복수의 비특이적 증폭 생성물을 레솔바제로 절단하여, 상당한 비율의 상기 복수의 표적-특이적 증폭 생성물을 유지하면서 복수의 절단된 비특이적 증폭 생성물을 생성하는 단계로서, 레솔바제가 T4 엔도뉴클레아제 VII 또는 T7 엔도뉴클레아제 I 중 하나인, 단계; 및
    상당한 비율의 상기 복수의 표적-특이적 증폭 생성물을 남기면서, 절단된 비특이적 증폭 생성물을 제거하는 단계를 포함하는, 방법.
  23. 주형-의존성 프라이머 신장 반응으로부터 비특이적 증폭 생성물을 감소시키는 방법으로서, 상기 방법이,
    복수의 표적 핵산을 복수의 쌍의 표적-특이적 프라이머를 이용하여 증폭시켜 복수의 표적-특이적 증폭 생성물 및 복수의 비특이적 증폭 생성물을 포함하는 혼합물을 형성하는 단계;
    T4 엔도뉴클레아제 VII을 혼합물에 도입시키는 단계로서, T4 엔도뉴클레아제 VII이 비특이적 증폭 생성물 상의 이상 DNA 구조를 인지하는, 단계;
    복수의 비특이적 증폭 생성물을 T4 엔도뉴클레아제 VII로 절단하여, 50% 초과의 상기 복수의 표적-특이적 증폭 생성물을 유지하면서 복수의 절단된 비특이적 증폭 생성물을 생성하는 단계; 및
    상당한 비율의 상기 복수의 표적-특이적 증폭 생성물을 남기면서, 절단된 비특이적 증폭 생성물을 제거하는 단계를 포함하는, 방법.
  24. 주형-의존성 프라이머 신장 반응으로부터 비특이적 증폭 생성물을 감소시키는 방법으로서, 상기 방법이,
    복수의 표적 핵산을 복수의 쌍의 표적-특이적 프라이머를 이용하여 증폭시켜 복수의 표적-특이적 증폭 생성물 및 복수의 비특이적 증폭 생성물을 포함하는 혼합물을 형성하는 단계;
    이상 DNA 구조를 인지하는 레솔바제를 혼합물에 도입시키고 복수의 비특이적 증폭 생성물을 레솔바제로 절단하여, 상당한 비율의 상기 복수의 표적-특이적 증폭 생성물을 유지하면서 복수의 절단된 비특이적 증폭 생성물을 생성하는 단계로서, 레솔바제가 T4 엔도뉴클레아제 VII 또는 T7 엔도뉴클레아제 I 중 하나인, 단계;
    상당한 비율의 상기 복수의 표적-특이적 증폭 생성물을 남기면서, 절단된 비특이적 증폭 생성물을 제거하는 단계; 및
    표적-특이적 증폭 생성물을 재증폭시키는 단계를 포함하는, 방법.
  25. 제 24항에 있어서, 표적-특이적 증폭 생성물 상의 닉을 DNA 라이가제로 수복시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  26. 비특이적 증폭 생성물을 선택적으로 제거하는 주형-의존성 프라이머 신장 반응용 키트로서, 상기 키트가,
    폴리머라제;
    복수의 표적-특이적 프라이머 쌍;
    증폭 완충제;
    레솔바제 완충제;
    이상 DNA 구조를 갖는 폴리뉴클레오티드를 인지하고 절단하는 적어도 하나의 레솔바제; 및
    증폭 후 증폭 반응으로부터의 비특이적 증폭 생성물을 레솔바제를 이용하여 제거하기 위한 상기 키트에 사용되는 지시서를 포함하는, 키트.
  27. 제 26항에 있어서, 적어도 하나의 핵산 어댑터를 추가로 포함하는 키트.
  28. 제 26항에 있어서, 적어도 하나의 핵산 어댑터를 추가로 포함하고, 상기 적어도 하나의 핵산 어댑터가 적어도 3개의 포스포로티오에이트를 포함하는 키트.
  29. 제 26항에 있어서, 상기 표적-특이적 프라이머가 적어도 10쌍의 표적-특이적 프라이머를 포함하는 키트.
  30. 제 26항에 있어서, 상기 표적-특이적 프라이머가 약 1,000 내지 약 100,000의 표적-특이적 프라이머를 포함하는 키트.
  31. 제 26항에 있어서, 상기 표적-특이적 프라이머가 100,000 초과의 표적-특이적 프라이머를 포함하는 키트.
  32. 제 26항에 있어서, 상기 레솔바제가 Holliday 구조 또는 이음부, 분지된 DNA, Y-구조, 십자형, 헤테로듀플렉스 루프, 거대 부가물, 단일 가닥 오버행, DNA 미스매치, 또는 완전하게-매칭되지 않은 DNA 중 적어도 하나를 포함하는 이상 DNA 구조를 인지하는 키트.
  33. 제 26항에 있어서, 레솔바제가 T4 엔도뉴클레아제 VII인 키트.
  34. 제 26항에 있어서, 비특이적 증폭 생성물을 절단하기 위한 엑소뉴클레아제를 추가로 포함하는 키트.
  35. 제 26항에 있어서, 비특이적 증폭 생성물을 절단하기 위한 엑소뉴클레아제를 추가로 포함하고, 엑소뉴클레아제가 람다 엑소뉴클레아제 또는 E. 콜라이 엑소뉴클레아제 I을 포함하는 키트.
  36. 비특이적 증폭 생성물을 선택적으로 제거하는 주형-의존성 프라이머 신장 반응용 키트로서, 상기 키트가,
    폴리머라제;
    복수의 표적-특이적 프라이머 쌍;
    증폭 완충제;
    레솔바제 완충제;
    이상 DNA 구조를 갖는 폴리뉴클레오티드를 인지하고 절단하는 적어도 하나의 레솔바제;
    표적-특이적 암플리콘을 재증폭시키기 위한 한 쌍의 재증폭 PCR 프라이머, 및
    증폭 후 증폭 반응으로부터의 비특이적 증폭 생성물을 레솔바제를 이용하여 제거하기 위한 상기 키트에 사용되는 지시서를 포함하는, 키트.
  37. 제 36항에 있어서, 상기 표적-특이적 프라이머가 적어도 10쌍의 표적-특이적 프라이머를 포함하는 키트.
  38. 제 36항에 있어서, 상기 표적-특이적 프라이머가 약 1,000 내지 약 100,000의 표적-특이적 프라이머를 포함하는 키트.
  39. 제 36항에 있어서, 상기 표적-특이적 프라이머가 100,000 초과의 표적-특이적 프라이머를 포함하는 키트.
  40. 제 36항에 있어서, 상기 레솔바제가 Holliday 구조 또는 이음부, 분지된 DNA, Y-구조, 십자형, 헤테로듀플렉스 루프, 거대 부가물, 단일 가닥 오버행, DNA 미스매치, 또는 완전하게-매칭되지 않은 DNA 중 적어도 하나를 포함하는 이상 DNA 구조를 인지하는 키트.
  41. 제 36항에 있어서, 레솔바제가 T4 엔도뉴클레아제 VII인 키트.
  42. 주형-의존성 프라이머 신장 반응으로부터 비특이적 증폭 생성물을 감소시키는 방법으로서, 상기 방법이,
    복수의 표적 핵산을 복수의 쌍의 표적-특이적 프라이머를 이용하여 증폭시켜 복수의 표적-특이적 증폭 생성물 및 복수의 비특이적 증폭 생성물을 포함하는 혼합물을 형성하는 단계;
    혼합물을 이상 DNA 구조를 갖는 폴리뉴클레오티드를 인지하고 이에 결합하는 단백질에 도입시켜 상당한 비율의 복수의 표적-특이적 증폭 생성물을 유지하면서 상기 비특이적 증폭 생성물을 제거하는 단계로서, 상기 이상 DNA 구조가 Holliday 구조 또는 이음부, 분지된 DNA, Y-구조, 십자형, 헤테로듀플렉스 루프, 거대 부가물, 단일 가닥 오버행, DNA 미스매치, 또는 완전하게-매칭되지 않은 DNA 중 적어도 하나를 포함하는, 단계를 포함하는, 방법.
  43. 제 42항에 있어서, 이상 DNA 구조를 갖는 폴리뉴클레오티드를 인지하고 이에 결합하는 상기 단백질이 MutS인 방법.
  44. 제 42항에 있어서, 이상 DNA 구조를 갖는 폴리뉴클레오티드를 인지하고 이에 결합하는 상기 단백질이 기질에 결합되는 방법.
  45. 제 42항에 있어서, 표적-특이적 증폭 생성물을 분석하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  46. 제 42항에 있어서, 표적-특이적 증폭 생성물을 분석하는 단계를 추가로 포함하고, 분석이 차세대 시퀀싱 반응을 포함하는 방법.
  47. 제 42항에 있어서, 증폭이 멀티플렉스 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 수행하는 것을 포함하는 방법.
  48. 제 42항에 있어서, 상기 표적 핵산이 DNA 또는 RNA를 포함하는 방법.
  49. 제 42항에 있어서, 상기 표적 핵산이 유전체 DNA 또는 cDNA인 방법.
  50. 제 42항에 있어서, 상기 표적-특이적 프라이머가 적어도 10쌍의 표적-특이적 프라이머를 포함하는 방법.
  51. 제 42항에 있어서, 상기 표적-특이적 프라이머가 약 1,000 내지 약 100,000의 표적-특이적 프라이머를 포함하는 방법.
  52. 제 42항에 있어서, 상기 표적-특이적 프라이머가 100,000 초과의 표적-특이적 프라이머를 포함하는 방법.
  53. 제 42항에 있어서, 이상 DNA 구조를 갖는 폴리뉴클레오티드를 인지하고 이에 결합하는 상기 단백질을 도입시키는 단계가 비특이적 증폭 생성물 및 복수의 표적-특이적 증폭 생성물을 0.5분 내지 20분 동안 20℃ 내지 40℃에서 인큐베이션시키는 것을 포함하는 방법.
  54. 제 42항에 있어서, 상당한 비율의 상기 복수의 표적-특이적 증폭 생성물이 50% 초과의 복수의 표적-특이적 증폭 생성물을 포함하는 방법.
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