JP6755890B2 - 非特異的増幅産物を減少させる為の方法及び組成物 - Google Patents
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Description
本特許出願は:2015年2月11日出願の米国仮特許出願第62/114,788号「マルチプレックスPCRにおいて非特異的増幅産物を排除する為の方法(A method for eliminating nonspecific amplification products in multiplex PCR)」、及び2015年4月21日出願の米国仮特許出願第62/150,600号「非特異的増幅産物を減少させる為の方法及び組成物(Methods and Compositions for Reducing Non-Specific Amplification Products)」のそれぞれに対して優先権を主張する。各上記仮出願は、その全体において引用により本明細書に援用される。
本明細書に記載の全ての刊行物及び特許出願は、個々の刊行物又は特許出願それぞれが引用により援用されることが具体的かつ個別に示されているのと同じ程度に、それらの全体が引用により本明細書に援用される。
本開示は更に、本明細書中で開示される方法を実行する為に有用なキットを提供する。1つの態様では、本開示はマルチプレックスPCR反応を実行する為、及び非特異的増幅産物を減少させる為のキットを提供する。この例では、キットはマルチプレックスPCR反応における使用に適している試薬(例えば、限定ではないが、緩衝液、dNTP、及びDNAポリメラーゼ(例えば、Taq DNAポリメラーゼ))を含み得る。マルチプレックスPCR反応において使用される複数のプライマー対は別々に販売されているものであってよい。いくつかの場合では、プライマー対は注文品である。いくつかの場合では、プライマー対は注文者により選択される。いくつかの場合では、プライマー対は標的特異的プライマー対である。他の場合では、プライマー対はランダムプライマー対であり得る。プライマー対は、10〜100,000超のプライマー対を含み得る。この例のキットは更に、非特異的増幅産物を減少させる為に適している異常DNA構造特異的酵素及び緩衝液(例えば、T4エンドヌクレアーゼVII)を含み得る。この例のキットは更に、DNAポリメラーゼ(例えば、Taq DNAポリメラーゼ)及び2回目のPCRを実行する為の1対のPCRプライマーを含み得る。
実施例1は、上で簡単に論じたように図1に示されており、鋳型DNA、プライマー、dNTP、及び熱安定性DNAポリメラーゼを用いるマルチプレックスPCRの模式図を示す。
実施例2は、上で論じたように図2に示されており、鋳型DNA、プライマー、dNTP、及び好熱性DNAポリメラーゼを用いるマルチプレックスPCRの1つの方法である。
上で簡単に論じた図3に示した実施例3は、鋳型DNA、リン酸化されていないプライマー、dNTP、及び熱安定性DNAポリメラーゼを用いるマルチプレックスPCRの1つの方法である。
上で簡単に論じた図4に示した実施例4は、マルチプレックスPCRにおいて使用されるリン酸化されたプライマーを用いるマルチプレックスPCRの1つの方法である。
図5に示し、上で簡単に論じた実施例5は、鋳型DNA、リン酸化されていないプライマー、dNTP、及び熱安定性DNAポリメラーゼを用いるマルチプレックスPCRの模式図である。
本明細書に記載の任意の方法で、リゾルバーゼ条件(濃度、緩衝液、インキュベーション/処理時間、及び/又は温度)を決定できる。上記複数の標的特異的増幅産物のかなりの割合を維持しつつ、鋳型依存性プライマー伸張反応による非特異的増幅産物を減少させる為の、リゾルバーゼの使用についての一般的なパラメーターが本明細書中で提供される。例えば、一般的には、標的特異的増幅産物のかなりの割合を維持しつつ、リゾルバーゼで非特異的増幅産物を切断することは、非特異的増幅産物及び複数の標的特異的増幅産物を、約0.2U〜1000Uのリゾルバーゼに対して、0.5分〜60分、16℃〜37℃で曝露することを含み得る。図6A〜7Bはそのような範囲の決定を説明している。図6A及び6Bは、207対のプライマーが関係するマルチプレックスPCRにおいて非特異的増幅産物を除去する為に使用できる濃度の範囲を見出す為の、T4エンドヌクレアーゼVIIの滴定を説明している。T4エンドヌクレアーゼVIIの効果は、残留している標的DNAの量又は残留しているプライマーダイマーの量のいずれかによりアッセイした。以下に更に詳細に記載するように、約0.5〜20の範囲(例えば、およそ10単位)のT4エンドヌクレアーゼVIIが十分であることが明らかになった。図7A〜7Bは、207対のプライマーを含むマルチプレックスPCRにおいて非特異的増幅産物を除去する為の最適な時間を見出す為の、T4エンドヌクレアーゼVIIの時間経過の例を示す。T4エンドヌクレアーゼVIIの効果は、残留している標的DNAの量のいずれかによりアッセイした。約0.5分〜20分(例えば、5分)のインキュベーションが十分であることが明らかになった。
図8Bは、図1及び図3〜5で例示した方法と同様に、マルチプレックス増幅手順において非特異的増幅産物を減少させ、標的特異的増幅産物を明らかにする為のリゾルバーゼ(例えば、T4エンドヌクレアーゼVII)の使用を説明している。図8Bでは、リゾルバーゼは、示したような1つ以上の異常なポリヌクレオチド構造(例えば、ホリデー構造若しくはジャンクション、分岐したDNA、Y構造、十字部、ヘテロデュブレックスループ、かさ高い付加物、一本鎖突出、DNAミスマッチ、又は完全にはマッチしていないDNA)を有すると仮定される、バックグラウンドである非特異的増幅産物を標的とする。
非特異的増幅産物の同様の減少を、図9A〜9Bに示すように、207対の長いプライマーを用いたマルチプレックスPCRにおいて見ることができる。この実施例では、5’CCTACACGACGCTCTTCCGATCT3’を各正方向プライマーの5’末端に付加し、5’TTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT3’を各逆方向プライマーの5’末端に付加したことを除いて、プライマーパネルは、イオンアンプリシーク(商標)ホットスポットキャンサーパネルv2(Ion AmpliSeqTM hotspot cancer panel v2)(ライフテクノロジーズ社(Life Technologies)、カタログ番号4475346)のプライマーパネルと同じであった。これらの「長い」プライマーは、PCRの更なる回によるアンプリコン上へのアダプターの容易な付加を可能にする。
一般的には、任意の適切なポリメラーゼが、本明細書中で記載される増幅(マルチプレックス増幅)を実行する為に使用され得る。本明細書中で記載される方法、組成物、及びキットは、様々な酵素に対応している。図10A〜10Fは、マルチプレックスPCRにおける様々なポリメラーゼ酵素の使用を説明している。各実施例において、マルチプレックスPCRを、5単位のプラチナタック(Platinum taq)(図10A)、チタンタック(Titanium taq)(図10B)、オムニ・クレンタック(Omni Klen taq)(図10C)、タッククレノウ(Taq Klenow)(図10D)、KOD DNAポリメラーゼ(図10E)、及びTfi DNAポリメラーゼ(図10F)を各マルチプレックスPCR反応で使用したことを除いて、上記実施例6に記載したように行った。PCR後、以下の構成成分を上記反応物に直接添加した:10μlの2×消化緩衝液(50mMのTris−HCl(pH8.0)、15mMのMgCl2、20mMのβ−メルカプトエタノール)、1μlのT4エンドヌクレアーゼVII(アフィメトリクス社(Affymetrix)、部品番号78300 50KU)、18ulの蒸留水。反応物を37℃で5分間インキュベートした。インキュベーション後、0.5MのEDTAで反応を停止させた。DNAを、実施例6で記載したように、精製し、バイオアナライザー(BioAnalyzer)でアッセイした。結果は、プラチナタック(Platinum taq)、チタンタック(Titanium taq)、及びオムニ・クレンタック(Omni Klen taq)は比較可能な量の標的アンプリコンを生じ、一方、タッククレノウ(Taq Klenow)、KOD DNAポリメラーゼ、及びTfi DNAポリメラーゼは非常に多量の非特異的増幅産物を生じたことを示している。この実施例では、プラチナタック(Platinum taq)、チタンタック(Titanium taq)、及びオムニ・クレンタック(Omni Klen taq)がマルチプレックスPCRに好ましいものであり得る。
マルチプレックスPCR中のプライマー濃度を滴定できる。この実施例では、20、30、40、50nMの207対のプライマーを各マルチプレックスPCR反応において使用したことを除いて、実施例6で記載したようにマルチプレックスPCRを行った。PCR後、以下の構成成分を上記反応物に直接添加した:10μlの2×消化緩衝液(50mMのTris−HCl(pH8.0)、15mMのMgCl2、20mMのβ−メルカプトエタノール)、1μlのT4エンドヌクレアーゼVII(アフィメトリクス社(Affymetrix)、部品番号78300 50KU)、18ulの蒸留水。反応物を37℃で5分間インキュベートした。インキュベーション後、0.5MのEDTAで反応を停止させた。DNAを、実施例6で記載したように、精製し、バイオアナライザー(BioAnalyzer)でアッセイした。結果を図11に示す。この実験は、高濃度のプライマーがより多量の標的アンプリコンをもたらしたことを示していた。
マルチプレックスPCRのアニーリング及び伸張時間もまた、図12に示すように、本明細書中で記載される効果を最適化する為に調整できる。この実施例では、1分、2分、3分のアニーリング及び伸張時間を各マルチプレックスPCR反応において使用したことを除いて、実施例6で記載したようにマルチプレックスPCRを行った。PCR後、以下の構成成分を上記反応物に直接添加した:10μlの2×消化緩衝液(50mMのTris−HCl(pH8.0)、15mMのMgCl2、20mMのβ−メルカプトエタノール)、1μlのT4エンドヌクレアーゼVII(アフィメトリクス社(Affymetrix)、部品番号78300 50KU)、18ulの蒸留水。反応物を37℃で5分間インキュベートした。インキュベーション後、0.5MのEDTAで反応を停止させた。DNAを、実施例6で記載したように、精製し、バイオアナライザー(BioAnalyzer)でアッセイした。結果を図12に示す。この実験は、1分のアニーリング及び伸張が、より多量の標的アンプリコンをもたらしたことを示していた。
上記のように、多数のプライマー対を本明細書に記載の方法において使用でき、それでもなお非特異的増幅産物の実質的な減少を生じさせることができる。例えば、図13は、2915対のプライマーを含むマルチプレックスPCRにおける非特異的増幅産物の除去を説明している。
図14は、16000対のプライマーを必要とするマルチプレックスPCRにおける非特異的増幅産物の除去の一例を説明している。この実施例では、プライマーパネルは、イオンアンプリシーク(商標)コンプリヘンシブ・キャンサー・パネル(Ion AmpliSeq(商標)comprehensive cancer panel)(ライフテクノロジーズ社(Life Technologies)、カタログ番号4477685)であった。このプライマーパネルは、頻繁に突然変異する、学術論文に記載されている409の重要な腫瘍抑制遺伝子及び発癌遺伝子の全てのエキソンを網羅する。これは、4つのプールの中に16000のプライマー対を有し、各プールがおよそ4,000のプライマー対を有する。アンプリコンの長さは125〜175塩基対までの範囲であり、標的領域はおよそ173万塩基を網羅する。ライブラリーをこのパネル及びライフテクノロジーズ社(Life Technologies)のイオンアンプリシーク(商標)ライブラリーキット2.0(Ion AmpliSeq(商標)Library Kit 2.0)を用いて作製し、ライフテクノロジーズ社(Life Technologies)のイオン・ピー・ジー・エム(商標)システム(Ion PGM(商標)system)でシーケンシングした場合、このパネルは、97%の標的塩基(1回の実行あたりで、マップされた全塩基のうち、標的領域にマップされた塩基)について>20%のシークエンシング深度中央値で94%のカバー率が報告されている。マルチプレックスPCRでは、4つのプライマープールのそれぞれに鋳型としての10ngのヒトゲノムDNAが必要であり、パネル全体を網羅する為には合計40ngが必要である。このプライマーパネルの各プライマーの中には少なくとも1つのウラシルヌクレオチドが存在する。このプライマーパネルは2倍濃縮されている。従って、4つのPCR反応をプライマーの4つのプールのそれぞれを用いて行った。
本明細書に記載の方法は、非常に小さい及び/又は損傷したDNA鋳型を用いる場合(特に、鋳型としてのFFPE DNAを伴うマルチプレックスPCRにおける非特異的増幅産物の除去の為を含む)にもなお使用できる。この実施例では、10ngのFFPE DNAを各マルチプレックスPCR反応において使用したことを除いて、実施例6で記載したようにマルチプレックスPCRを行った。PCR後、以下の構成成分を上記反応物に直接添加した:10μlの2×消化緩衝液(50mMのTris−HCl(pH8.0)、15mMのMgCl2、20mMのβ−メルカプトエタノール)、1μlのT4エンドヌクレアーゼVII(アフィメトリクス社(Affymetrix)、部品番号78300 50KU)、18ulの蒸留水。反応物を37℃で5分間インキュベートした。インキュベーション後、0.5MのEDTAで反応を停止させた。DNAを、実施例6で記載したように精製し、バイオアナライザー(BioAnalyzer)でアッセイした。結果を図15に示す。この実験は、207対のプライマー及び10ngのFFPA DNAを含むマルチプレックスPCRにより非特異的増幅産物が効率よく除去されたことを示していた。
本明細書に記載の方法を使用して、リン酸化されたプライマーを含むマルチプレックスPCRを試みた。イオンアンプリシーク(商標)ホットスポットキャンサーパネルv2(Ion AmpliSeqTM hotspot cancer panel v2)(ライフテクノロジーズ社(Life Technologies)、カタログ番号4475346)のプライマーパネルをT4ポリヌクレオチドキナーゼによって5’末端でリン酸化した。次いで、プライマーをマルチプレックスPCR反応において10μl中で50nMで使用した。その後、マルチプレックスPCR及びDNA精製を実施例8に記載したように行った。精製したDNAを20μlの蒸留水の中でマグネティックビーズから溶離させた。
連結されていないアダプターを除去する工程を含まないライブラリーの作製を、本明細書に記載の方法を使用してうまく実行できた。その後、マルチプレックスPCR及びDNA精製を実施例8に記載したように行った。精製したDNAを20μlの蒸留水の中でマグネティックビーズから溶離させた。
本明細書に記載の方法を使用してライブラリーを作製できる。例えば、図18は、2915対のプライマーを含むライブラリーの生産において非特異的増幅産物を除去する為のリゾルバーゼの使用の結果を説明している。
図19は、シーケンシング用の207対のプライマーを用いて作製したライブラリーの別の例を説明している。この実施例では、イオンアンプリシーク(商標)ホットスポットキャンサーパネルv2(Ion AmpliSeqTM hotspot cancer panel v2)(ライフテクノロジーズ社(Life Technologies)、カタログ番号4475346)のプライマーパネルをマルチプレックスPCRにおいて使用した。このプライマーパネルは、50の発癌遺伝子及び腫瘍抑制遺伝子に由来するおよそ2,800のCOSMIC突然変異を網羅する。これは1つのプールの中に207のプライマー対を有する。マルチプレックスPCR反応を10μl中で行った。以下の構成成分を0.2mlの薄壁PCRチューブ(トーマスサイエンティフィック社(Thomas Scientific)、スナップストリップIIナチュラル0.2ml PCRストリップチューブ(Snapstrip II natural 0.2ml PCR strip tube)、カタログ番号1228F73)のそれぞれに添加した:5μlの2倍に濃縮したプライマープール、1μlの10×PCR緩衝液(1×PCR緩衝液:それぞれ50mMのTrisHCl(pH8.3)、50mMのKCl、5mMのMgCl2、0.8mMのdNTP)、2μlのオムニ・クレンタックDNAポリメラーゼ(Omni KlenTaq DNA polymerase)(4.2単位/μl)(エンザイマティック社(Enzymatics)、P7500−LC−F)、1μlの10ng/μlのヒトDNA(コーリエル社(Coriell Institute)、NA12878)、及び1μlの蒸留水。
図20は、シーケンシング用の207対の長いプライマーを用いて本明細書に記載したように作製したライブラリーの別の例を示している。このライブラリーの分析を図23の表(表2)に示す。この実施例では、プライマーパネルは、5’CCTACACGACGCTCTTCCGATCT3’を各正方向プライマーの5’末端に付加し、5’TTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT3’を各逆方向プライマーの5’末端に付加したことを除いて、イオンアンプリシーク(商標)ホットスポットキャンサーパネルv2(Ion AmpliSeqTM hotspot cancer panel v2)(ライフテクノロジーズ社(Life Technologies)、カタログ番号4475346)のプライマーパネルと同じであった。これらの「長い」プライマーは、PCRの更なる回によるアンプリコン上へのアダプターの容易な付加を可能にする。マルチプレックスPCR反応を10μl中で行った。以下の構成成分を0.2mlの薄壁PCRチューブ(トーマスサイエンティフィック社(Thomas Scientific)、スナップストリップIIナチュラル0.2ml PCRストリップチューブ(Snapstrip II natural 0.2ml PCR strip tube)、カタログ番号1228F73)のそれぞれに添加した:5μlの2倍に濃縮したプライマープール、1μlの10×PCR緩衝液(1×PCR緩衝液:それぞれ50mMのTrisHCl(pH8.3)、50mMのKCl、5mMのMgCl2、0.8mMのdNTP)、2μlのオムニ・クレンタックDNAポリメラーゼ(Omni KlenTaq DNA polymerase)(4.2単位/μl)(エンザイマティック社(Enzymatics)、P7500−LC−F)、1μlの10ng/μlのヒトDNA(コーリエル社(Coriell Institute)、NA12878)、及び1μlの蒸留水。
図21Aは、非特異的増幅産物を減少させる為のリゾルバーゼでの処理を含め本明細書に記載したように作製したライブラリーの別の例の結果を示している。ここでは、ライブラリーを、シーケンシング用の16000対のプライマーを用いて作製した。表3(図24)はこのライブラリーの分析を記載している。
〔付記1〕
鋳型依存性プライマー伸張反応による非特異的増幅産物を減少させる方法であって、
前記方法は:
複数の標的特異的プライマーの対を使用して、複数の標的核酸を増幅する工程であって、前記増幅工程は、複数の標的特異的増幅産物及び複数の非特異的増幅産物を生じさせる、工程;
異常なDNA構造を認識するリゾルバーゼを導入する工程;並びに
前記非特異的増幅産物をリゾルバーゼで切断して、前記複数の標的特異的増幅産物のかなりの割合を維持しつつ、複数の切断された非特異的増幅産物を生じさせる工程
を含み、
前記リゾルバーゼは、T4エンドヌクレアーゼVII又はT7エンドヌクレアーゼIのうちの一方である、方法。
〔付記2〕
前記切断された非特異的増幅産物を除去し、前記複数の標的特異的増幅産物のかなりの割合を残す工程を更に含む、付記1に記載の方法。
〔付記3〕
前記標的特異的増幅産物を分析する工程を更に含む、付記1に記載の方法。
〔付記4〕
前記分析工程は、次世代シーケンシング反応を含む、付記3に記載の方法。
〔付記5〕
前記増幅工程は、マルチプレックスポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を含む、付記1に記載の方法。
〔付記6〕
前記標的核酸は、DNA又はRNAを含む、付記1に記載の方法。
〔付記7〕
前記標的核酸は、ゲノムDNA又はcDNAである、付記1に記載の方法。
〔付記8〕
前記標的特異的プライマーは、少なくとも10対の前記標的特異的プライマーを含む、付記1に記載の方法。
〔付記9〕
前記標的特異的プライマーは、10対〜1000対の前記標的特異的プライマーを含む、付記1に記載の方法。
〔付記10〕
前記標的特異的プライマーは、1,000〜約100,000対の前記標的特異的プライマーを含む、付記1に記載の方法。
〔付記11〕
前記標的特異的プライマーは、100,000超の前記標的特異的プライマーを含む、付記1に記載の方法。
〔付記12〕
前記リゾルバーゼは、ホリデー構造若しくはジャンクション、分岐したDNA、Y構造、十字部、ヘテロデュブレックスループ、かさ高い付加物、一本鎖突出、DNAミスマッチ、又は完全にはマッチしていないDNAのうちの少なくとも1つを含む、異常なDNA構造を認識する、付記1に記載の方法。
〔付記13〕
前記リゾルバーゼは、T4エンドヌクレアーゼVIIである、付記1に記載の方法。
〔付記14〕
前記非特異的増幅産物をエキソヌクレアーゼで切断する工程を更に含む、付記1に記載の方法。
〔付記15〕
前記非特異的増幅産物をエキソヌクレアーゼで切断する工程を更に含み、
前記非特異的増幅産物をエキソヌクレアーゼで切断する前記工程は、前記複数の標的特異的増幅産物及び前記複数の非特異的増幅産物上で末端修復を行った後に、ラムダエキソヌクレアーゼ又は大腸菌(E. coli)エキソヌクレアーゼIのうちの少なくとも一方を含むエキソヌクレアーゼで前記非特異的増幅産物を切断する工程を含む、付記1に記載の方法。
〔付記16〕
前記複数の標的特異的増幅産物及び前記複数の非特異的増幅産物上で末端修復を行う工程を更に含む、付記1に記載の方法。
〔付記17〕
前記リゾルバーゼを導入する前記工程の前に、前記複数の標的特異的増幅産物及び前記複数の非特異的増幅産物上で末端修復を行う工程を更に含む、付記1に記載の方法。
〔付記18〕
前記リゾルバーゼを導入する前記工程の後に、前記複数の標的特異的増幅産物の前記かなりの割合に対してアダプターを連結させる工程を更に含む、付記1に記載の方法。
〔付記19〕
前記アダプターは、少なくとも3個の連続するホスホロチオエートを含む、付記18に記載の方法。
〔付記20〕
前記リゾルバーゼで前記非特異的増幅産物を切断する前記工程は、前記非特異的増幅産物及び前記複数の標的特異的増幅産物を、約0.2U〜1000Uのリゾルバーゼに対して、0.5分〜60分、16℃〜37℃で曝露する工程を含む、付記1に記載の方法。
〔付記21〕
前記複数の標的特異的増幅産物の前記かなりの割合は、前記複数の標的特異的増幅産物の50%超を含む、付記1に記載の方法。
〔付記22〕
鋳型依存性プライマー伸張反応による非特異的増幅産物を減少させる方法であって、
前記方法は:
複数の標的特異的プライマーの対を使用して、複数の標的核酸を増幅することにより、複数の標的特異的増幅産物及び複数の非特異的増幅産物を含む混合物を形成する工程;
異常なDNA構造を認識するリゾルバーゼを前記混合物に導入し、前記複数の非特異的増幅産物を前記リゾルバーゼで切断して、前記複数の標的特異的増幅産物のかなりの割合を維持しつつ、複数の切断された非特異的増幅産物を生じさせる工程であって、前記リゾルバーゼは、T4エンドヌクレアーゼVII又はT7エンドヌクレアーゼIのうちのである、工程;並びに
前記切断された非特異的増幅産物を除去し、前記複数の標的特異的増幅産物のかなりの割合を残す工程
を含む、方法。
〔付記23〕
鋳型依存性プライマー伸張反応による非特異的増幅産物を減少させる方法であって、
前記方法は:
複数の標的特異的プライマーの対を使用して、複数の標的核酸を増幅することにより、複数の標的特異的増幅産物及び複数の非特異的増幅産物を含む混合物を形成する工程;
T4エンドヌクレアーゼVIIを前記混合物に導入する工程であって、前記T4エンドヌクレアーゼVIIは、前記非特異的増幅産物上の異常なDNA構造を認識する、工程;
前記複数の非特異的増幅産物を前記T4エンドヌクレアーゼVIIで切断して、前記複数の標的特異的増幅産物の50%超を維持しつつ、複数の切断された非特異的増幅産物を生じさせる工程;並びに
前記切断された非特異的増幅産物を除去し、前記複数の標的特異的増幅産物のかなりの割合を残す工程
を含む、方法。
〔付記24〕
鋳型依存性プライマー伸張反応による非特異的増幅産物を減少させる方法であって、
前記方法は:
複数の標的特異的プライマーの対を使用して、複数の標的核酸を増幅することにより、複数の標的特異的増幅産物及び複数の非特異的増幅産物を含む混合物を形成する工程;
異常なDNA構造を認識するリゾルバーゼを前記混合物に導入し、前記複数の非特異的増幅産物を前記リゾルバーゼで切断して、前記複数の標的特異的増幅産物のかなりの割合を維持しつつ、複数の切断された非特異的増幅産物を生じさせる工程であって、前記リゾルバーゼはT4エンドヌクレアーゼVII又はT7エンドヌクレアーゼIのうちの一方である、工程;
前記切断された非特異的増幅産物を除去し、前記複数の標的特異的増幅産物のかなりの割合を残す工程;並びに;
前記標的特異的増幅産物を再増幅する工程
を含む、方法。
〔付記25〕
前記標的特異的増幅産物上のニックをDNAリガーゼで修復する工程を更に含む、付記24に記載の方法。
〔付記26〕
非特異的増幅産物を選択的に除去する鋳型依存性プライマー伸張反応用のキットであって、
前記キットは:
ポリメラーゼ;
複数の標的特異的プライマー対;
増幅緩衝液;リゾルバーゼ緩衝液;
異常なDNA構造を有するポリヌクレオチドを認識して切断する少なくとも1種のリゾルバーゼ;及び
前記リゾルバーゼを使用した増幅後に、増幅反応による非特異的増幅産物を除去する為の前記キットの使用についての説明書
を含む、キット。
〔付記27〕
少なくとも1つの核酸アダプターを更に含む、付記26に記載のキット。
〔付記28〕
少なくとも1つの核酸アダプターを更に含み、
前記少なくとも1つの核酸アダプターは、少なくとも3個のホスホロチオエートを含む、付記26に記載のキット。
〔付記29〕
前記標的特異的プライマーは、少なくとも10対の標的特異的プライマーを含む、付記26に記載のキット。
〔付記30〕
前記標的特異的プライマーは、約1,000〜約100,000の前記標的特異的プライマーを含む、付記26に記載のキット。
〔付記31〕
前記標的特異的プライマーは、100,000超の前記標的特異的プライマーを含む、付記26に記載のキット。
〔付記32〕
前記リゾルバーゼは、ホリデー構造若しくはジャンクション、分岐したDNA、Y構造、十字部、ヘテロデュブレックスループ、かさ高い付加物、一本鎖突出、DNAミスマッチ、又は完全にはマッチしていないDNAのうちの少なくとも1つを含む、異常なDNA構造を認識する、付記26に記載のキット。
〔付記33〕
前記リゾルバーゼは、T4エンドヌクレアーゼVIIである、付記26に記載のキット。
〔付記34〕
前記非特異的増幅産物を切断するためのエキソヌクレアーゼを更に含む、付記26に記載のキット。
〔付記35〕
前記非特異的増幅産物を切断するためのエキソヌクレアーゼを更に含み、
前記エキソヌクレアーゼは、ラムダエキソヌクレアーゼ又は大腸菌(E. coli)エキソヌクレアーゼIを含む、付記26に記載のキット。
〔付記36〕
非特異的増幅産物を選択的に除去する鋳型依存性プライマー伸張反応用のキットであって、
前記キットは:
ポリメラーゼ;
複数の標的特異的プライマー対;
増幅緩衝液;
リゾルバーゼ緩衝液;
異常なDNA構造を有するポリヌクレオチドを認識して切断する少なくとも1種のリゾルバーゼ;
前記標的特異的アンプリコンを再増幅するための再増幅PCRプライマー対;及び
リゾルバーゼを使用した増幅後に増幅反応による非特異的増幅産物を除去する為の前記キットの使用についての説明書
を含む、キット。
〔付記37〕
前記標的特異的プライマーは、少なくとも10対の標的特異的プライマーを含む、付記36に記載のキット。
〔付記38〕
前記標的特異的プライマーは、約1,000〜約100,000の前記標的特異的プライマーを含む、付記36に記載のキット。
〔付記39〕
前記標的特異的プライマーは、100,000超の前記標的特異的プライマーを含む、付記36に記載のキット。
〔付記40〕
前記リゾルバーゼは、ホリデー構造若しくはジャンクション、分岐したDNA、Y構造、十字部、ヘテロデュブレックスループ、かさ高い付加物、一本鎖突出、DNAミスマッチ、又は完全にはマッチしていないDNAのうちの少なくとも1つを含む、異常なDNA構造を認識する、付記36に記載のキット。
〔付記41〕
前記リゾルバーゼは、T4エンドヌクレアーゼVIIである、付記36に記載のキット。
〔付記42〕
鋳型依存性プライマー伸張反応による非特異的増幅産物を減少させる方法であって、
前記方法は:
複数の標的特異的プライマーの対を使用して、複数の標的核酸を増幅することにより、複数の標的特異的増幅産物及び複数の非特異的増幅産物を含む混合物を形成する工程;
複数の標的特異的増幅産物のかなりの割合を維持しつつ、前記非特異的増幅産物を除去する為に異常なDNA構造を有するポリヌクレオチドを認識し、それに結合するタンパク質に対して前記混合物を導入する工程であって、前記異常なDNA構造は、ホリデー構造若しくはジャンクション、分岐したDNA、Y構造、十字部、ヘテロデュブレックスループ、かさ高い付加物、一本鎖突出、DNAミスマッチ、又は完全にはマッチしていないDNAのうちの少なくとも1つを含む、工程
を含む、方法。
〔付記43〕
前記異常なDNA構造を有するポリヌクレオチドを認識し、それに結合する前記タンパク質は、MutSである、付記42に記載の方法。
〔付記44〕
前記異常なDNA構造を有するポリヌクレオチドを認識し、それに結合する前記タンパク質は、基体に連結される、付記42に記載の方法。
〔付記45〕
前記標的特異的増幅産物を分析する工程を更に含む、付記42に記載の方法。
〔付記46〕
前記標的特異的増幅産物を分析する工程を更に含み、
前記分析工程は、次世代シーケンシング反応を含む、付記42に記載の方法。
〔付記47〕
前記増幅工程は、マルチプレックスポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を含む、付記42に記載の方法。
〔付記48〕
前記標的核酸は、DNA又はRNAを含む、付記42に記載の方法。
〔付記49〕
前記標的核酸は、ゲノムDNA又はcDNAである、付記42に記載の方法。
〔付記50〕
前記標的特異的プライマーは、少なくとも10対の前記標的特異的プライマーを含む、付記42に記載の方法。
〔付記51〕
前記標的特異的プライマーは、約1,000〜約100,000の前記標的特異的プライマーを含む、付記42に記載の方法。
〔付記52〕
前記標的特異的プライマーは、100,000超の前記標的特異的プライマーを含む、付記42に記載の方法。
〔付記53〕
前記異常なDNA構造を有するポリヌクレオチドを認識し、それに結合するタンパク質に対して、前記混合物を導入する前記工程は、前記非特異的増幅産物及び前記複数の標的特異的増幅産物を、0.5分〜20分、20℃〜40℃で、インキュベートする工程を含む、付記42に記載の方法。
〔付記54〕
前記複数の標的特異的増幅産物の前記かなりの割合は、前記複数の標的特異的増幅産物の50%超を含む、付記42に記載の方法。
Claims (14)
- 鋳型依存性プライマー伸張反応による非特異的増幅産物を減少させる方法であって、
前記方法は:
少なくとも10対の標的特異的プライマーを含む複数の標的特異的プライマーの対を使用して、複数の標的核酸を増幅する工程であって、前記増幅工程は、複数の標的特異的増幅産物及び複数の非特異的増幅産物を生じさせる、工程;
異常なDNA構造を認識するリゾルバーゼを導入する工程;並びに
前記非特異的増幅産物をリゾルバーゼで切断して、前記複数の標的特異的増幅産物のかなりの割合を維持しつつ、複数の切断された非特異的増幅産物を生じさせる工程
を含み、
前記リゾルバーゼは、T4エンドヌクレアーゼVII又はT7エンドヌクレアーゼIのうちの一方である、方法。 - 前記切断された非特異的増幅産物を除去し、前記複数の標的特異的増幅産物のかなりの割合を残す工程を更に含む、請求項1に記載の方法。
- 前記増幅工程は、マルチプレックスポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を含む、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記標的核酸は、DNA、RNA、ゲノムDNA、又はcDNAを含む、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的特異的プライマーは、100,000超の前記標的特異的プライマーを含む、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記リゾルバーゼは、ホリデー構造若しくはジャンクション、分岐したDNA、Y構造、十字部、ヘテロデュブレックスループ、かさ高い付加物、一本鎖突出、DNAミスマッチ、又は完全にはマッチしていないDNAのうちの少なくとも1つを含む、異常なDNA構造を認識する、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記リゾルバーゼは、T4エンドヌクレアーゼVIIである、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記非特異的増幅産物をエキソヌクレアーゼで切断する工程を更に含む、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の標的特異的増幅産物及び前記複数の非特異的増幅産物上で末端修復を行った後に、ラムダエキソヌクレアーゼ又は大腸菌(E. coli)エキソヌクレアーゼIのうちの少なくとも一方を含むエキソヌクレアーゼで前記非特異的増幅産物を切断する工程を含む、請求項8に記載の方法。
- 前記リゾルバーゼを導入する前記工程の前に、前記複数の標的特異的増幅産物及び前記複数の非特異的増幅産物上で末端修復を行う工程を更に含む、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記リゾルバーゼを導入する前記工程の後に、前記複数の標的特異的増幅産物の前記かなりの割合に対してアダプターを連結させる工程を更に含む、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記リゾルバーゼで前記非特異的増幅産物を切断する前記工程は、前記非特異的増幅産物及び前記複数の標的特異的増幅産物を、約0.2U〜1000Uのリゾルバーゼに対して、0.5分〜60分、16℃〜37℃で曝露する工程を含む、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の標的特異的増幅産物の前記かなりの割合は、前記複数の標的特異的増幅産物の50%超を含む、請求項1から12のいずれか一項に記載の方法。
- 非特異的増幅産物を選択的に除去する鋳型依存性プライマー伸張反応用のキットであって、
前記キットは:
ポリメラーゼ;
少なくとも10対の標的特異的プライマーを含む複数の標的特異的プライマー対;
増幅緩衝液;リゾルバーゼ緩衝液;
異常なDNA構造を有するポリヌクレオチドを認識して切断する少なくとも1種のリゾルバーゼ;及び
請求項1から13のいずれか一項に記載の方法を用いて、前記リゾルバーゼを使用した増幅後に、増幅反応による非特異的増幅産物を除去する為の前記キットを使用するための説明書
を含む、キット。
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