KR20140119602A

KR20140119602A - 염기 특이 반응성 프라이머를 이용한 핵산 증폭방법

Info

Publication number: KR20140119602A
Application number: KR1020130049499A
Authority: KR
Inventors: 안성환; 오태정
Original assignee: (주)지노믹트리
Priority date: 2013-04-01
Filing date: 2013-05-02
Publication date: 2014-10-10
Also published as: EP2982762A1; CN105247071A; US10023908B2; US20160194695A1; WO2014163225A1; CN105247071B; DK2982762T3; KR20150088772A; KR20150089987A; EP2982762B1; CN109517888B; ES2693133T3; TR201815755T4; KR101600039B1; KR101557975B1; EP2982762A4; CN109517888A

Abstract

본 발명은 기존의 염기 특이 반응성 PCR(allele-specific PCR)의 문제점을 해결하기 위하여 고안된 염기 특이 반응성 프라이머(Allele-specific reactive primer; ASRP)를 이용한 핵산 증폭방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는, 교정활성(proofreading)을 가지는 DNA 중합효소(DNA polymerase) 및 표적핵산과 상보적인 염기서열을 포함하고, 3' 말단에 비상보적 염기가 존재할 때 상기 DNA 중합효소의 교정활성에 의해 잘려나가는 염기의 5' 방향으로 바로 앞쪽의 염기부터 5' 말단까지의 염기 중의 하나 이상이 중합반응의 시발체로 작용할 수 없도록 변형된 염기 특이 반응성 프라이머 (Allele-specific reactive primer; ASRP)의 존재하에 표적핵산을 증폭시키는 것을 특징으로 하는 표적핵산의 검출방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 대립형질 특이반응성 프라이머를 이용한 검출방법은 ASRP 및 교정반응 DNA 중합효소의 특성상 증폭의 특이도가 매우 높은 기술로서, 단일염기다형성(SNP; Single Nucletide Polymorphism)를 포함하는 돌연변이(점돌연변이, 삽입, 결실)를 효과적으로 검출할 수 있으며, 바이설파이트(bisulfate) 처리 후 CpG 메틸화 유무를 검출하거나, DNA 라이브러리에서 원하는 염기서열로 시작되는 목적 DNA를 증폭하여 검출하는데도 활용할 수 있다.

Description

염기 특이 반응성 프라이머를 이용한 핵산 증폭방법{Method for Amplification Nucleic Acid Using Aelle-Specific Reaction Primers}

본 발명은 기존의 염기 특이 반응성 PCR(allele-specific PCR)의 문제점을 해결하기 위하여 고안된 염기 특이 반응성 프라이머(Allele-specific reactive primer; ASRP)를 이용한 핵산 증폭방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는, 교정활성(proofreading)을 가지는 DNA 중합효소(DNA polymerase) 및 표적핵산과 상보적인 염기서열을 포함하고, 3' 말단에 비상보적 염기가 존재할 때 상기 DNA 중합효소의 교정활성에 의해 잘려나가는 염기의 5' 방향으로 바로 앞쪽의 염기부터 5' 말단까지의 염기 중의 하나 이상이 중합반응의 시발체로 작용할 수 없도록 변형된 염기 특이 반응성 프라이머 (Allele-specific reactive primer; ASRP)의 존재하에 표적핵산을 증폭시키는 것을 특징으로 하는 표적핵산의 검출방법에 관한 것이다.

단일염기서열변이(SNP, Single Nucletide Polymorphism)는 DNA 염기서열에서 하나의 염기서열이 치환되어 나타나는 유전적 변이로, 병의 원인 또는 치료제에 대한 반응 등 사람마다 개인차를 가져온다. 단일염기서열변이의 검출과 확인은 맞춤의약뿐만 아니라 신약개발에도 연결되기 때문에 관심이 집중되고 있다.

단일염기서열 변이의 신속한 검출을 위해서 실시간 PCR 기술을 응용한 다양한 검출 방법이 사용되고 있다. 대표적으로 DNA 인터컬레이팅(intercalating) 형광물질을 사용하여 분석하는 방법, DNA 프로브를 이용하는 방법, 또는 PNA 프로브를 이용하는 방법 등이 있다. 하지만 DNA 인터컬레이팅(intercalating) 형광물질을 사용함에 있어 제약을 가지며, 융해곡선을 분석하기 위한 프로그램 사용해야 한다는 단점을 가진다 (Kirk M. Ririe et al ., Analytical Biochemistry 245:154, 1997; U. Hladnik et al ., Clin Exp Med , 2:105, 2002).

3'->5' 교정(proofreading) 활성을 가지는 엑소-중합효소(exo-polymerase)는 DNA복제과정에 있어서, 높은 정확도를 가지게 하며(Drake, J.W. et . al ., Cold Spring Harb . Symp . Quant . Biol ., 33:339, 1968; Drake, J.W. et . al ., Nature , 221:1128, 1968; Goodman, M.F. et . al .. Genetics , 148:1475, 1998), 3' 엑소뉴클레이즈 기능에 의해 교정활성을 가지는 많은 종류의 중합효소가 발견되었다.

교정활성을 가진 엑소-중합효소는 생체 내에서는 DNA 복제과정에서 높은 정확도를 제공하지만, 종래의 염기특이 프라이머(allele-specific primer)를 이용한 중합반응에 엑소-중합효소를 적용할 경우에는, 3' 부분의 일치하지 않은 염기가(mismatched base) 제거되기 때문에 프라이머와 주형으로 사용되는 DNA와의 완전한 혼성화 또는 불완전한 혼성화와는 상관없이 프라이머의 말단이 신장되는 문제가 있다 (Zhang, J. et al ., Mol . Biotechnol ., 24:105, 2003).

이러한 문제로 인해, 돌연변이 검출을 위한 연구에서는 엑소-중합효소의 기능이 거의 사용되지 않았지만, 최근에는 프라이머의 3' 말단에 라벨을 하거나, 3' 엑소뉴클레이즈 저항 인자를 부착시키는 방법, 3' 말단 염기의 -OH기를 제거하거나 다른 잔기로 치환시키는 방법 등의 3' 말단을 변형시키는 방법을 이용하여, 표적핵산의 돌연변이를 검출하는 방법에 대한 연구가 이루어지고 있다 (Zhang, J. et al., Current Drug Disc ., 9:21, 2001; Bi, W.L. and Stambrook, P.J., Nucleic Acids Res ., 26:3073, 1998).

예를 들어, 프라이머의 3' 말단에 라벨을 하는 경우, 프라이머와 주형 DNA가 상보적으로 결합하면 3' 말단의 라벨이 유지되면서 최종 증폭산물이 생산되지만, 프라이머와 주형 DNA가 불일치하면, 엑소-중합효소의 교정활성에 의해 3' 말단의 라벨이 제거되어 라벨이 없는 최종 증폭산물이 생산되므로, 라벨이 유무에 따라 돌연변이를 검출할 수 있으므로, 이러한 원리를 적용하여, 다양하게 변형된 3' 말단을 가지는 프라이머(allele-specific primer) 및 엑소-중합효소를 이용하여, 리얼타임 PCR(real-time PCR), 멀티-웰 플레이드(multi-well plate) 및 마이크로어레이(microarray) 기술 등을 포함하는 다양한 플랫폼에 적용할 수 있다.

이에 본 발명자들은 3' 말단이 변형된 프라이머 및 교정활성(proofreading)을 가지는 DNA 중합효소(DNA polymerase)를 이용하여 표적핵산을 검출하기 위해 예의 노력한 결과, 3' 말단의 염기가 변형된 염기 특이 반응성 프라이머(Allele-specific reactive primer; ASRP)를 이용하고, 교정활성(proofreading)을 가지는 DNA 중합효소(DNA polymerase) 존재하에 표적핵산이 특이적으로 증폭하는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 표적핵산과 상보적인 염기서열을 포함하고, 3' 말단에 비상보적 염기가 존재할 때 상기 DNA 중합효소의 교정활성에 의해 잘려나가는 염기의 5' 방향으로 바로 앞쪽의 염기부터 5' 말단까지의 염기 중의 하나 이상이 중합반응의 시발체로 작용할 수 없도록 변형된 염기 특이 반응성 프라이머(Allele-specific reactive primer; ASRP)를 이용하여 표적핵산을 검출하는 방법 및 DNA 라이브러리에서 표적핵산을 선택증폭하는 방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 교정활성(proofreading)을 가지는 DNA 중합효소(DNA polymerase) 및 표적핵산과 상보적인 염기서열을 포함하고, 3' 말단에 비상보적 염기가 존재할 때 상기 DNA 중합효소의 교정활성에 의해 잘려나가는 염기의 5' 방향으로 바로 앞쪽의 염기부터 5' 말단까지의 염기 중의 하나 이상이 중합반응의 시발체로 작용할 수 없도록 변형된 염기 특이 반응성 프라이머 (Allele-specific reactive primer; ASRP)의 존재하에 표적핵산을 증폭시키는 것을 특징으로 하는 표적핵산의 검출방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 교정활성(proofreading)을 가지는 DNA 중합효소(DNA polymerase) 및 5' 말단에 DNA 라이브러리의 어댑터(adaptor) 서열과 상보적인 염기서열을 포함하고, 3' 말단에 표적핵산과 상보적인 특정 염기서열 및 상기 DNA 중합효소의 시발체로 작용할 수 없도록 변형된 염기를 포함하는 염기 특이 반응성 프라이머(Allele-specific reactive primer; ASRP)의 존재하에 DNA 라이브러리에서 표적핵산을 증폭시키는 것을 특징으로 하는 DNA 라이브러리에서 특정 염기서열로 시작되는 표적핵산의 증폭방법을 제공한다.

본 발명은 또한, (ⅰ) 5' 말단에 표적핵산과 상보적이지 않은 염기서열을 포함하는 태깅 시퀀스(sequence), 변형된 단일염기 및 표적핵산과 상보적인 염기서열을 포함하고, DNA 중합효소(DNA polymerase)의 시발체로 작용할 수 없도록 변형된 3' 말단을 가지는 염기 특이 반응성 프라이머(Allele-specific reactive primer; ASRP), (ⅱ) 태깅 시퀀스 및 상기 표적핵산과 상보적인 염기서열의 일부를 포함하는 리포터 템플레이트(reporter template) 및 (ⅲ) 5'->3' 엑소뉴클에이즈(exonuclease) 활성을 가지는 DNA 중합효소(DNA polymerase) 존재하에 표적핵산을 증폭시키는 것을 특징으로 하는 표적핵산의 검출방법을 제공한다.

본 발명에 따른 염기 특이 반응성 프라이머(Allele-specific reactive primer; ASRP)를 이용한 검출방법은 ASRP 및 교정반응 DNA 중합효소의 특성상 증폭의 특이도가 매우 높은 기술로서, 단일염기다형성(SNP; Single Nucletide Polymorphism)를 포함하는 돌연변이(점돌연변이, 삽입, 결실)를 효과적으로 검출할 수 있으며, 바이설파이트(bisulfate) 처리 후 CpG 메틸화 유무를 검출하거나, DNA 라이브러리에서 원하는 염기서열로 시작되는 목적 DNA를 증폭하여 검출하는데도 활용할 수 있다.

도 1은 염기 특이 반응성 프라이머(Allele-specific reactive primer; ASRP)를 이용한 검출 시스템에 대한 모식도이다.
도 2는 단일염기변이를 검출하기 위해, 일반 프라이머와 ASRP를 사용하여 PCR 증폭실험을 수행한 결과를 나타낸 데이타이다.
도 3은 메틸화를 검출하기 위해, 일반 프라이머와 ASRP를 사용하여 PCR 증폭실험을 수행한 결과를 나타낸 데이타이다.
도 4는 염기 특이 반응성 프라이머(Allele-specific reactive primer; ASRP)를 이용한 DNA 라이브러리에서 원하는 염기서열로 시작되는 목적 DNA를 증폭하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 5는 태깅 시퀀스(sequence), 변형된 단일염기 및 표적핵산과 상보적인 염기서열(target specific sequence)을 가지는 염기 특이 반응성 프라이머(Allele-specific reactive primer; ASRP) 및 교정활성이 없고 5'->3' 엑소뉴클레이즈(exonuclease) 활성을 갖는 DNA 중합효소를 이용한 검출 시스템에 대한 모식도이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명은 일 관점에서, 교정활성(proofreading)을 가지는 DNA 중합효소(DNA polymerase) 및 표적핵산과 상보적인 염기서열을 포함하고, 3' 말단에 비상보적 염기가 존재할 때 상기 DNA 중합효소의 교정활성에 의해 잘려나가는 염기의 5' 방향으로 바로 앞쪽의 염기부터 5' 말단까지의 염기 중의 하나 이상이 중합반응의 시발체로 작용할 수 없도록 변형된 염기 특이 반응성 프라이머(Allele-specific reactive primer; ASRP)의 존재하에 표적핵산을 증폭시키는 것을 특징으로 하는 표적핵산의 검출방법에 관한 것이다.

본 발명의 '염기 특이 반응성 프라이머(Allele-specific reactive primer, 이하, ASRP)'는 기존의 염기 특이 반응성 PCR(allele-specific PCR)의 문제점을 해결하기 위하여 고안된 것으로, 원하는 대립유전자를 특이적으로 증폭할 수 있도록, 표적핵산과 상보적인 염기서열을 포함하고, 3' 말단에 비상보적 염기가 존재할 때 DNA 중합효소의 교정활성에 의해 잘려나가는 비상보적 염기의 5' 방향으로 바로 앞쪽의 염기부터 5' 말단까지의 염기 중의 하나 이상이 중합반응의 시발체로 작용할 수 없도록 변형시킨 염기 특이 반응성 프라이머와 교정활성(proofreading)을 가지는 DNA 중합효소(DNA polymerase)를 이용하여 표적핵산을 특이적으로 증폭할 수 있다.

본 발명의 '표적핵산'은 검출하고자 하는 핵산서열(DNA 또는 RNA)을 의미하며, 혼성화, 어닐링 또는 증폭 조건 하에서 프라이머 또는 프로브와 어닐링 또는 혼성화된다. '표적핵산'은 본 명세서에서 사용되는 용어 '타겟 핵산', '타겟 핵산서열' 또는 '타겟 서열'과 차이가 없으며, 본 명세서에서 혼용된다.

본 발명의 '혼성화'는 상보적인 단일가닥 핵산들이 이중-가닥 핵산을 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 2개의 핵산 가닥 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match) 일어나거나 또는 일부 부정합(mismatch) 염기가 존재하여도 일어날 수 있다. 혼성화에 필요한 상보성의 정도는 혼성화 조건에 따라 달라질 수 있으며, 특히 온도에 의하여 조절될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 염기 특이 반응성 프라이머의 변형된 염기 3' 쪽에 위치하는 염기가 표적핵산과 상보적이면, DNA 중합효소(DNA polymerase)의 교정활성(proofreading)에 의해 잘려나가지 않고, 상보적이지 않으면 DNA 중합효소(DNA polymerase)의 교정활성(proofreading)에 의해 잘려나가, 3' 말단에 변형된 염기가 남아있는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 교정활성을 가지는 DNA 중합효소는 3'->5' 엑소뉴클레이즈(exonuclase) 활성을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 DNA 중합효소의 시발체로 작용할 수 없는 '변형된 염기'는, 염기가 3'-데옥시뉴클레오타이드(3'-deoxynucletide), 인버티드(리버스) 3'-데옥시뉴클레오타이드(inverted(reverse) 3'-deoxynucleotide) 및 3'-데옥시이노신(3'-deoxyinosine)으로 구성되는 군에서 선택되는 1개 이상의 염기로 치환된 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게, 본 발명에서는 3' 말단의 염기를 3'-데옥시뉴클레오타이드(deoxynucletide)로 치환시킨 ASRP를 사용하였으나, 이에 한정되지 않고, 당업계에 통상적으로 알려진 염기 변형방법이 적용가능하다.

본 발명에 따른 표적핵산의 검출방법은 구체적으로, (a) 표적핵산을 염기 특이 반응성 프라이머(Allele-specific reactive primer; ASRP)와 혼합하여 혼성화 시키는 단계; (b) 교정활성(proofreading)을 가지는 DNA 중합효소(DNA polymerase) 존재하에 상기 혼성화된 산물에서 표적핵산을 증폭시키는 단계; 및 (c) 상기 증폭산물의 유무에 의해 표적핵산을 검출하는 단계를 포함한다.

본 발명의 ASRP를 이용한 표적특이적인 증폭을 위해서는 3'->5' 교정활성(proofreading; 3'->5' 엑소뉴클레이즈)을 가지는 DNA 중합효소(DNA polymerase)를 사용해야하며, 이 효소는 주형에 일반적인 프라이머(general primer)가 결합되었을 때, 프라이머의 3' 말단이 주형 DNA(표적핵산)와 서로 상보적이면 교정반응 없이 그대로 5'->3' 방향으로 DNA 중합반응을 진행시키는(도 1A) 반면, 3' 말단의 염기가 1개 이상 주형과 서로 상보적이지 않으면 상보적이지 않은 염기의 수에 상관없이 이들을 전부 절단하는 교정반응을 수행한 다음, 주형에 상보적인 뉴클레오타이드를 새로 합성하게 된다 (도 1B). 본 발명의 ASRP를 사용하는 경우에는 프라이머의 3' 말단이 주형과 서로 상보적이면 일반 프라이머를 사용할 때와 마찬가지로 교정반응 없이 그대로 5'->3' 방향으로 DNA 중합반응을 진행시키는(도 1C) 반면, 3' 말단의 염기가 주형과 서로 상보적이지 않으면, 염기의 수에 상관없이 교정반응에 의해 상보적이지 않은 뉴클레오타이드를 절단하게 된다 (도 1D). 교정반응이 끝나면 3' 말단에는 3'-데옥시뉴클레오타이드(deoxynucletide)가 남게되며, 이러한 구조를 가지는 ASRP는 DNA 중합반응시 시발체로 작용할 수 없어서 DNA 중합반응이 중지된다. 따라서 교정기능을 갖는 DNA 중합효소와 ASRP를 조합하여 DNA 중합반응을 유도하면 ASRP는 상보적인 주형과 만났을 때만 중합반응을 일으키기 때문에 특정한 서열을 갖는 주형 DNA만을 선택적으로 증폭할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 염기 특이 반응성 프라이머의 농도는 0.1 내지 20M인 것을 특징으로 할 수 있으며, (b) 단계의 증폭은 PCR(polymerase chain reaction)을 통해 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 염기 특이 반응성 프라이머와 표적핵산이 서로 상보적이면 표적핵산의 증폭산물이 생성되고(Match/On), 염기 특이 반응성 프라이머와 표적핵산이 서로 상보적이지 않으면, DNA 중합효소의 교정활성에 의해 일치하지 않은 염기가 제거되고 3' 말단에 남아있는 변형된 염기로 인해 증폭산물이 생성되지 않는(Mismatch/Off) 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 표적핵산은 DNA 또는 RNA인 것을 특징으로 할 수 있으며, 본 발명의 표적핵산의 검출방법을 이용하여, 돌연변이 또는 병원균(pathogen)을 검출할 수 있다.

본 발명의 방법을 이용한 돌연변이 검출은 단일염기다형성뿐만 아니라, 염기가 치환, 결실 또는 삽입되어 변이가 일어난 돌연변이를 검출할 수 있으며, 표적핵산에 돌연변이가 존재하지 않으면 표적핵산의 증폭산물이 생성되고, 표적핵산에 돌연변이가 존재하면 증폭산물이 생성되지 않는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 본 발명의 염기 특이 반응성 프라이머(Allele-specific reactive primer; ASRP)를 이용하여 돌연변이 검출을 하기 위해, 대표적인 암세포 돌연변이인 BRAFV600E 체세포 점돌연변이 검출 실험을 수행하였으며, 그 결과, 일반 프라이머를 사용한 경우에는 BRAFV600E 돌연변이(도 2; lane 2)뿐만 아니라, 야생형BRAF에도 비특이적인 증폭(도 2; lane 1)이 일어나는 것을 확인할 수 있었다. 반면, ASRP를 사용하여 PCR을 수행한 경우에는, 야생형BRAF를 주형으로 사용한 경우에 증폭이 되지 않고(도 2; lane 5) BRAFV600E 돌연변이를 주형으로 사용한 경우에만 증폭이 되는 것을 확인하였다 (도 2; lane 4).

본 발명의 방법을 이용한 병원균 검출방법은, 병원균이 존재하면 표적핵산의 증폭산물이 생성되고, 병원균이 존재하지 않으면 증폭산물이 생성되지 않는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 '병원균(pathogen)'은 질병을 일으키는 미생물로, 병균이라고도 하며, 바이러스, 진정 세균, 균류, 원생 동물 등으로 구성되는 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지않고, 사람이나 동물에 감염되어 질병의 직접 원인이 되는 생물이 포함된다.

또한, 본 발명의 표적핵산의 검출방법을 이용하여 사이토신(cytosine)이 메틸화된 유전자를 검출할 수 있으며, 메틸화된 표적핵산은 증폭산물이 생성되고, 비메틸화된 표적핵산은 증폭산물이 생성되지 않는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 "메틸화"는 사이토신(cytocine) 염기환의 5번째 탄소에 메틸기가 붙어 5-메틸사이토신(5-mC)으로 변형된 것을 의미하며, 5-메틸사이토신은 항상 CG 다이뉴클레오타이드의 C에만 오며(5'-mCG-3'), 이러한 CG를 흔히 CpG라고 표시한다. 이러한 CpG의 메틸화는 알루(alu)나 전이인자(transposon)와 같이 게놈내에 반복되는 염기서열이 발현되지 못하도록 억제하며, 포유류 세포에서 유전자외 변화가 가장 흔히 나타나는 부위이다. 이러한 CpG의 5-mC는 자연히 탈아미노화되어 T로 바뀌며, 이에 따라 포유류 게놈내 CpG는 정상적으로 나타나야 할 빈도(1/4 x 1/4 = 6.25%)보다 훨씬 낮은 1%의 빈도만을 나타낸다.

CpG 중에 예외적으로 밀집되어 나타나는 것들이 있으며, 이를 CpG 섬이라고 한다. CpG 섬은 길이가 0.2~3kb이고, C 및 G염기의 분포백분율이 50%를 넘으며, CpG의 분포백분율이 3.75%이상으로 높게 집중되어 나타나는 부위를 가리킨다. CpG 섬은 전체 인체 유전체에 약 45,000개가 나타나며, 특히 유전자의 발현을 조절하는 프로모터 부위에 집중되어 나타난다. 실제로 인체 유전자 중 약 절반을 차지하는 중요 유전자(housekeeping genes)의 프로모터에는 CpG 섬이 나타난다 (Cross, S. & Bird, A.P., Curr . Opin . Gene Develop., 5:309, 1995).

본 발명의 메틸화된 표적핵산의 검출방법은, 구체적으로, (a) 표적핵산을 화학적 또는 효소적 방법으로 처리하여, 메틸화된 사이토신 염기는 변환시키지 않고, 비메틸화된 사이토신(cytosine) 염기를 우라실(uracil) 또는 다른 염기로 변환시키는 단계; (b) 상기 화학적 또는 효소적 방법으로 처리된 표적핵산을 염기 특이 반응성 프라이머(Allele-specific reactive primer; ASRP)와 혼합하여 혼성화 시킨 다음, 교정활성(proofreading)을 가지는 DNA 중합효소(DNA polymerase) 존재하에 상기 혼성화된 산물에서 표적핵산을 증폭시키는 단계; 및 (c) 상기 증폭산물의 유무에 의해 표적핵산의 메틸화를 검출하는 단계를 포함한다.

본 발명의 ASRP를 이용한 표적핵산의 메틸화 검출은 표적핵산을 화학적 또는 효소적 방법으로 처리하여, 메틸화된 사이토신 염기는 변환시키지 않고, 비메틸화된 사이토신(cytosine) 염기를 우라실(uracil) 또는 다른 염기로 변환시키는 단계가 필요하며, 메틸화된 표적핵산의 검출을 위해서는 3'->5' 교정활성(proofreading; 3'->5' 엑소뉴클레이즈)을 가지는 DNA 중합효소(DNA polymerase)를 사용해야한다.일반적인 프라이머(general primer)가 결합되었을 때, 프라이머의 3' 말단이 메틸화된 표적핵산과 서로 상보적이면 교정반응 없이 그대로 5'->3' 방향으로 DNA 중합반응을 진행시키며, 비메틸화된 사이토신 염기가 유라실 또는 다른 염기로 변환된 경우에는 3' 말단의 염기가 주형과 서로 상보적으로 결합하지 않아도, DNA 중합효소의 교정 반응에 의해, 상보적이지 않은 염기를 절단하는 교정반응을 수행한 다음, 주형에 상보적인 뉴클레오타이드를 새로 합성하게 된다. 본 발명의 ASRP를 사용하는 경우에는 프라이머의 3' 말단이 메틸화된 표적핵산과 서로 상보적이므로 교정반응 없이 그대로 5'->3' 방향으로 DNA 중합반응을 진행시키는 반면, 비메틸화된 사이토신 염기가 우라실 또는 다른 염기로 변환된 경우에는 3' 말단의 염기가 주형과 서로 상보적이지 않으므로, DNA 중합효소의 교정반응에 의해 상보적이지 않은 뉴클레오타이드들을 절단하게 된다. 교정반응이 끝나면 3' 말단에는 3'-데옥시뉴클레오타이드(deoxynucletide)가 남게 되며, 이러한 구조를 가지는 ASRP는 DNA 중합반응시 시발체로 작용할 수 없어서 DNA 중합반응이 중지된다.

본 발명의 다른 실시예에서, 본 발명의 염기 특이 반응성 프라이머(Allele-specific reactive primer; ASRP)를 이용하여 메틸화유전자를 검출하기 위해, 사람의 SDC2 유전자의 메틸화 검출 실험을 수행하였으며, 일반 프라이머를 사용한 경우에는 메틸화 특이적인 프라이머를 사용하더라도 메틸화된 SDC2 (도 3; lane 1)와 비메틸화 SDC2 (도 3; lane 2) 전부에서 증폭산물이 나타난 반면, SDC2 메틸화 특이적인 ASRP를 사용한 경우에는 메틸화 SDC2에는 특이적인 증폭산물이 관찰되지만 (도 3; lane 4), 비메틸화 SDC2에는 증폭이 전혀 일어나지 않는 것 (도 3; lane 5)을 확인하였다.

본 발명에 있어서, 비메틸화된 사이토신(cytosine) 염기를 우라실(uracil) 로 변환시키는 물질은 바이설페이트(bisulfate)인 것을 특징으로 할 수 있으나, 본 발명의 실시예에서 사용한 비메틸화된 SDC2는 사이토신 염기가 우라실로 바뀐 염기서열로 유전자를 합성하여 실험을 수행한 것으로, 바이설페이트 처리과정은 생략하였다.

본 발명은 다른 관점에서, 교정활성(proofreading)을 가지는 DNA 중합효소(DNA polymerase) 및 5' 말단에 DNA 라이브러리의 어댑터(adaptor) 서열과 상보적인 염기서열을 포함하고, 3' 말단에 표적핵산과 상보적인 특정 염기서열 및 상기 DNA 중합효소의 시발체로 작용할 수 없도록 변형된 염기를 포함하는 염기 특이 반응성 프라이머(Allele-specific reactive primer; ASRP)의 존재하에 DNA 라이브러리에서 표적핵산을 증폭시키는 것을 특징으로 하는 DNA 라이브러리에서 특정 염기서열로 시작되는 표적핵산의 증폭방법에 관한 것이다.

본 발명의 "DNA 라이브러리(DNA liblary)"는 특정 생물체 내에 존재하는 모든 단일 유전자를 포함할 만큼 충분한 수의 클론(clone)의 집합체를 말하는 것으로, 지노믹 DNA 라이브러리(genomic DNA liblary)는 전체 세포 DNA를 분리한 후, 부분적으로 절단(partial digestion)하여 생성된 단편들을 벡터에 삽입하여 클로닝을 하게 된다. 벡터(vector)로는 일반적으로 많이 사용되어온 플라스미드도 사용되고 있지만 보다 큰 크기의 유전자 또는 유전자 클러스터(gene cluster)를 클로닝할 수 있는 BAC, YAC, 포스미드(Fosmid), 코스미드(Cosmid) 등이 사용되고 있다.

본 발명에 있어서, DNA 라이브러리에서 표적핵산의 염기서열이 포함된 DNA 절편을 선택적으로 증폭할 수 있으며, 본 발명의 방법은 차세대 시퀀싱(next generation sequencing; NGS) 라이브러리로부터 염기 특이 반응성 프라이머를 이용하여 특정 염기서열을 가지는 표적핵산을 증폭할 수 있다.

본 발명의 DNA 라이브러리에서 특정 염기서열을 가지는 표적핵산을 증폭하는 방법은, 구체적으로, (a) 지노믹(genomic) DNA를 무작위로 절단시킨 다음, 5' 과 3'의 양쪽 말단에 시퀀싱을 위한 어댑터(adaptor) 서열을 연결시켜서 DNA 라이브러리를 제조하는 단계; (b) 상기 DNA 라이브러리와 DNA 라이브러리의 어댑터 서열과 상보적인 염기서열을 포함하고, 3' 말단에 비상보적 염기가 존재할 때 상기 DNA 중합효소의 교정활성에 의해 잘려나가는 염기의 5' 방향으로 바로 앞쪽의 염기부터 5' 말단까지의 염기 중의 하나 이상이 중합반응의 시발체로 작용할 수 없도록 변형된 염기 특이 반응성 프라이머 (Allele-specific reactive primer; ASRP)와 혼합하여 혼성화 시키는 단계; 및 (c) 교정활성(proofreading)을 가지는 DNA 중합효소(DNA polymerase) 존재하에 상기 혼성화된 산물에서 특정 염기서열로 시작되는 증폭시키는 단계를 포함하며, DNA 라이브러리에 표적핵산이 존재하는 경우, 염기 특이 반응성 프라이머와 서로 상보적으로 결합하여 증폭산물이 생성되며, 염기 특이 반응성 프라이머와 서로 상보적이지 않으면, DNA 중합효소의 교정활성에 의해 일치하지 않은 염기가 제거되고 남아있는 변형된 3' 말단의 염기로 인해 증폭산물이 생성되지 않는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 방법을 이용하여, 지노믹 DNA를 무작위로 절편을 만든 다음 5' 과 3'의 양쪽 말단에 시퀀싱을 위한 어댑터(adaptor) 서열을 연결시켜서 제작한 라이브러리로부터 특정 염기서열을 갖는 DNA 절편들만 선택적으로 증폭하여 차세대 시퀀싱(NGS)을 수행할 수 있다. 도 4A에 나타낸 바와 같이, 라이브러리를 제작하고 시퀀싱용 어댑터(adaptor)의 3' 말단에 비상보적 염기가 존재할 때 상기 DNA 중합효소의 교정활성에 의해 잘려나가는 염기의 5' 방향으로 바로 앞쪽의 염기부터 5' 말단까지의 염기 중의 하나 이상의 염기가 비상보적이면 상기 DNA 중합효소의 교정활성에 의해 잘려나도록 제조된 ASRP 존재하에서 라이브러리를 교정활성을 갖는 DNA 중합효소로 증폭시키면 어댑터(adaptor) 서열의 바로 안쪽의 첫 번째 염기 (N; A, T, C, G)가 ASRP와 상보적이면 교정반응이 없이 증폭되고, 상보적이지 않으면 교정반응에 의해 잘리게 되어 중합반응이 일어나지 않으므로, 이러한 과정을 거치면 DNA 라이브러리로부터 특정 염기로 시작되는 지노믹 DNA 절편이 포함되어있는 들어가 있는 DNA 조각들만 선택적으로 증폭이 가능하다.

본 발명에 있어서, DNA 라이브러리로부터 메틸화된 표적핵산을 증폭할 수 있으며, 구체적으로, (a) 지노믹(genomic) DNA를 화학적 또는 효소적 방법으로 처리하여, 메틸화된 사이토신 염기는 변환시키지 않고, 비메틸화된 사이토신(cytosine) 염기를 우라실(uracil) 또는 다른 염기로 변환시키는 단계; (b) 상기 지노믹(genomic) DNA를 무작위로 절단시킨 다음, 5'과 3'의 양쪽 말단에 시퀀싱을 위한 어댑터(adaptor) 서열을 연결시켜서 DNA 라이브러리를 제조하는 단계; (c) 상기 DNA 라이브러리와 DNA 라이브러리의 어댑터 서열과 상보적인 염기서열 및 3' 말단에 사이토신, DNA 중합효소의 시발체로 작용할 수 없도록 변형된 염기가 포함된 특이 반응성 프라이머(Allele-specific reactive primer; ASRP)와 혼합하여 혼성화 시키는 단계; 및 (d) 교정활성(proofreading)을 가지는 DNA 중합효소(DNA polymerase) 존재하에 상기 혼성화된 산물에서 메틸화된 표적핵산의 염기서열을 포함하는 DNA 절편을 증폭시키는 단계를 포함하고, 메틸화된 표적핵산은 증폭되고, 비메틸화된 표적핵산은 증폭되지 않는 것을 특징으로 할 수 있다.

지노믹 DNA를 바이설파이트를 처리하고 차세대 시퀀싱(NGS) 분석을 하고자 할 때, 5'과 3'의 양쪽 말단에 시퀀싱을 위한 어댑터(adaptor) 서열을 연결시켜서 제조된 라이브러리부터, 본 발명의 방법을 사용하여 메틸화된 염기서열을 갖는 DNA 절편들만 선택적으로 증폭하여 차세대 시퀀싱(NGS)을 수행할 수 있다. 도 4B에 나타낸 바와 같이, 바이설파이트가 처리된 지노믹 DNA를 이용하여 제조한 라이브러리를 5' 부위에 어댑터(adaptor)서열을 가지고 있고 3' 말단에는 3'-데옥시뉴클레오타이드로 변형된 염기 및 메틸화된 사이토신(C)서열을 가지도록 제조된 ASRP를 이용하여 교정활성을 갖는 DNA 중합효소로 증폭시키면, DNA 라이브러리에 포함된 DNA 절편의 첫 번째 염기가 메틸화 사이토신이면 교정반응이 없이 증폭이 일어나고, 상보적이지 않으면 교정반응에 의해 잘리게 되어, 3' 말단에 남아있는 변형된 염기로 인해 중합반응이 일어나지 않으므로, 이러한 과정을 거치면 DNA 라이브러리로부터 메틸화된 DNA 절편이 포함된 DNA 조각들만 선택적으로 증폭이 가능하다.

본 발명은 또 다른 관점에서, (ⅰ) 5' 말단에 표적핵산과 상보적이지 않은 염기서열을 포함하는 태깅 시퀀스(sequence), 변형된 단일염기 및 표적핵산과 상보적인 염기서열을 포함하고, DNA 중합효소(DNA polymerase)의 시발체로 작용할 수 없도록 변형된 3' 말단을 가지는 염기 특이 반응성 프라이머(Allele-specific reactive primer; ASRP), (ⅱ) 태깅 시퀀스 및 상기 표적핵산과 상보적인 염기서열의 일부를 포함하는 리포터 템플레이트(reporter template) 및 (ⅲ) 5'->3' 엑소뉴클에이즈(exonuclease) 활성을 가지는 DNA 중합효소(DNA polymerase) 존재하에 표적핵산을 증폭시키는 것을 특징으로 하는 표적핵산의 검출방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 염기 특이 반응성 프라이머의 태깅 시퀀스는 15 내지 30개의 염기로 구성되며, 변형된 단일염기는 DNA 중합효소의 시발체로 작용할 수 없는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 리포터 템플레이트는 3' 말단에 태깅 시퀀스와 결합할 수 있는 염기서열 및 표적핵산과 상보적인 염기서열(target specific sequence)과 상보적으로 결합할 수 있는 1개의 염기(N; A, T, C, G)를 가지고 있으며, 5' 말단에 20bp 이상의 인위적인 염기서열을 포함한다.

본 발명에 따른 표적핵산의 검출방법은 구체적으로, (a) 표적핵산을 (ⅰ) 5' 말단에 표적핵산과 상보적이지 않은 염기서열을 포함하는 태깅 시퀀스(sequence), 변형된 단일염기 및 표적핵산과 상보적인 염기서열을 포함하고, DNA 중합효소(DNA polymerase)의 시발체로 작용할 수 없도록 변형된 3' 말단을 가지는 염기 특이 반응성 프라이머(Allele-specific reactive primer; ASRP), (ⅱ) 태깅 시퀀스 및 상기 표적핵산과 상보적인 염기서열의 일부를 포함하는 리포터 템플레이트(reporter template) 및 (ⅲ) 표적핵산과 상보적인 프라이머와 혼합하여 혼성화 시키는 단계; (b) 5'->3' 엑소뉴클에이즈(exonuclease) 활성을 가지는 DNA 중합효소(DNA polymerase)에 의해 표적핵산과 혼성화 되지 않은 5' 말단의 태깅 시퀀스를 포함하는 염기 특이 반응성 프라이머의 일부분이 절단되어 리포터 템플레이트(reporter template)와 혼성화를 이루는 단계; 및 (c) 혼성화된 리포터 템플레이트(reporter template)를 증폭시키고, 생성된 증폭산물의 유무에 의해 표적핵산을 검출하는 단계를 포함하며, 표적핵산이 존재하지 않거나, 표적핵산에 돌연변이가 포함되어 있으면, 리포터 템플레이트의 증폭산물이 생성되고, 표적핵산이 존재하면, 증폭산물이 생성되지 않는 것을 특징으로 할 수 있다.

도 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명에서는 5'->3' 엑소뉴클레이즈(exonuclease) 활성을 가지는 DNA 중합효소를 이용하여 PCR을 수행할 때, 양 말단의 프라이머 이외에 주형(표적핵산)의 중간에 상보적으로 결합할 수 있는 염기 특이 반응성 프라이머를 제작하였다. 본 발명의 염기 특이 반응성 프라이머는 PCR 반응에서 DNA 중합효소의 시발체로 작용하지 못하도록 3' 말단을 변형시킨 것으로, 5' 말단에 2차 PCR의 주형으로 사용되는 리포터 템플레이트(reporter template)에 결합하여 PCR 시발체로 작용할 수 있는 태깅 시퀀스가 달려있고, 바로 이어서 3'-데옥시뉴클레오타이드(deoxynucleotide(dN; dA, dT, dG, dC))로 변형된 단일염기 및 표적핵산과 상보적인 염기서열(target specific sequence)이 연결되어 있다.

본 발명에서 염기 특이 반응성 프라이머의 변형된 단일염기(dN) 3' 쪽에 위치한 염기(N)가 표적핵산과 일치(Matched)하면 5'->3' 엑소뉴클에이즈(exonuclease) 활성을 가지는 DNA 중합효소(DNA polymerase)에 의해, 태깅 시퀀스 3' 말단에 변형된 단일염기(dN)가 연결된 단편이 만들어지게 되고, 이 단편은 리포터 템플에이트에 상보적으로 결합할 수 있으나 3' 말단의 염기가 3'-데옥시뉴클레오타이드로 변형되어 있기 때문에 중합반응이 일어나지 않게 되고 증폭산물이 만들어지지 않는다. 반면, 염기 특이 반응성 프라이머의 변형된 단일염기(dN) 3' 쪽에 위치한 염기(N)가 표적핵산과 상보적인 염기서열(target specific sequence)의 일부분(도 4의 N 염기에 해당)이 표적핵산의 돌연변이로 인해 표적핵산의 염기서열과 불일치(Mismatched)하면 5'->3' 엑소뉴클에이즈(exonuclease) 활성을 가지는 DNA 중합효소(DNA polymerase)에 의해, 태깅 시퀀스 3' 말단에 변형된 단일염기(dN) 및 변형된 단일염기(dN) 3' 쪽에 위치한 염기(N; A, T, G, C)가 연결된 상태로 잘려지게 되므로 리포터 템플레이트에 상보적으로 결합할 수 있는 단편이 만들어지게 되며, 이 단편은 리포터 템플에이트에 상보적으로 결합하고, 3' 말단이 변형된 염기가 아닌 일반적인 염기(N)가 오게 되므로 중합반응이 일어나게 되어 증폭산물이 만들어지게 된다.

본 발명에 있어서, 상기 표적핵산은 DNA 또는 RNA인 것을 특징으로 할 수 있으며, 본 발명의 표적핵산의 검출방법을 이용하여 돌연변이를 검출할 수 있다.

본 발명의 방법을 이용한 돌연변이 검출은 단일염기다형성뿐만 아니라, 염기가 치환, 결실 또는 삽입되어 변이가 일어난 돌연변이를 검출할 수 있으며, 표적핵산에 돌연변이가 존재하지 않으면 리포터 템플레이트의 증폭산물이 생성되지않고, 표적핵산에 돌연변이가 존재하면 리포터 템플레이트 증폭산물이 생성되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 염기 특이 반응성 프라이머(Allele-specific reactive primer; ASRP)를 함유하는 것을 특징으로 하는 키트를 제조할 수 있으며, 키트는 용도에 따라 다양하게 구성될 수 있으며, 바람직하게는 표적핵산의 돌연변이 검출, 표적핵산의 메틸화 검출 및 DNA 라이브러리에서 표적핵산을 선택적 증폭하는 용도로 사용될 수 있다.

본 발명의 키트는 목적에 따라, 교정활성(proofreading)을 가지는 DNA 중합효소(DNA polymerase) 또는 5'->3' 엑소뉴클에이즈(exonuclease) 활성을 가지는 DNA 중합효소(DNA polymerase)를 포함할 수 있으며, 버퍼, 데옥시리보뉴클레오타이드-5-트리포스페이트와 같은 타겟 증폭 PCR 반응(예컨대, PCR 반응)을 실시하는데 필요한 시약을 선택적으로 포함할 수 있다. 선택적으로, 본 발명의 키트는 또한 다양한 폴리뉴클레오타이드 분자, 다양한 버퍼 및 시약 및 DNA 중합효소 활성을 억제하는 항체를 포함할 수 있다.

또한, 키트는 특정 반응에서 사용되는 시약의 최적량은, 본 명세서에 개시사항을 습득한 당업자에 의해서 용이하게 결정될 수 있다. 전형적으로, 본 발명의 키트는 앞서 언급된 구성성분들을 포함하는 별도의 포장 또는 컴파트먼트(compartment)로 제작된다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

ASRP 를 이용한 BRAFV600E 돌연변이 검출

본 발명의 염기 특이 반응성 프라이머(Allele-specific reactive primer; ASRP)를 이용하여 돌연변이 검출을 하기 위해, 대표적인 암세포 돌연변이인 BRAFV600ET1799A) 체세포 점돌연변이 검출 실험을 수행하였다.

야생형BRAF(B-type Raf kinase; 서열번호 1)의 돌연변이인 BRAFV600E(서열번호 2)를 제조하기 위해, T가 A로 돌연변이된 BRAFV600E의 유전자를 합성하였으며(바이오니아, 한국), TOPcloner TA core kit(엔지노믹스, 한국)을 이용하여, pTOP TA V2 플라스미드 벡터(엔지노믹스, 한국)에 클로닝하였다 (바이오니아, 한국). BRAFV600E 점돌연변이 증폭을 위해 BRAFV600E에 상보적인 서열을 갖는 정방향 일반 프라이머(서열번호 3), BRAFV600E에 상보적인 서열을 가지며, 3'말단에서 2번째 염기가 3'-데옥시구아닌(3'-deoxyguanine; 3'-dG)으로 치환된 정방향 ASRP 프라이머(서열번호 4) 및 BRAFV600E에 상보적인 서열을 갖는 역방향 프라이머(서열번호 5)를 합성하였다 (바이오니아, 한국).

[서열번호 3] 5'-GTGATTTTGGTCTAGCTACAGA-3'

[서열번호 4] 5'-GTGATTTTGGTCTAGCTACA[dG]A-3'

[서열번호 5] 5'-TTCTAGTAACTCAGCAGCATCTC-3'

10⁵ copies의 야생형 BRAF와 BRAFV600E 돌연변이 플라스미드를 PCR 증폭을 위한 주형으로 사용하였으며, 3'->5'으로 교정반응 활성을 가지고 있는 DNA 중합효소(exo-polymerase)는 Pfu 중합효소(HelixAmp™ Power-Pfu Polymerase, 나노헬릭스, 한국)을 사용하였다. PCR은 Veriti® thermal cycler(Applied Biosystems, 싱가폴)을 사용하였으며, PCR 조건은 다음과 같다 : 총 볼륨이 25㎕이 되도록 주형 10⁵ copies, 10X Power-pfu buffer 2.5㎕, dNTP mix (10 mM) 1㎕, 프라이머 (4 pmole/ul) 1㎕ 및 Pfu 중합효소(HelixAmp™ Power-Pfu Polymerase, 1.25 units)을 첨가한 다음, 표 1의 조건으로 PCR을 수행하였다.

PCR 반응 조건

온도	반응시간
95℃	5분	1cycle
95℃	20초	40 cycle
59℃	40초
72℃	40초
72℃	5분	1 cycle

PCR이 완료된 반응물 중 10 ㎕를 5 X DNA loading dye와 섞어 3% 아가로스 젤(agarose gel; SeaKem LE Agarose, 미국)에서 로딩하여, 증폭된 산물의 크기를 확인하였다.

그 결과, 일반 프라이머를 사용한 경우에는 BRAFV600E 돌연변이(도 2; lane 2)뿐만 아니라, 야생형BRAF에도 비특이적인 증폭(도 2; lane 1)이 일어나는 것을 확인할 수 있었다. 반면, ASRP를 사용하여 PCR을 수행한 경우에는, 야생형BRAF을 주형으로 사용한 경우에 증폭이 되지 않고(도 2; lane 5) BRAFV600E 돌연변이를 주형으로 사용한 경우에만 증폭이 되는 것을 확인하였다 (도 2; lane 4).

ASRP 를 이용한 메틸화 검출

본 발명의 염기 특이 반응성 프라이머(Allele-specific reactive primer; ASRP)를 이용하여 메틸화유전자를 검출하기 위해, 사람의 SDC2 유전자의 메틸화 검출 실험을 수행하였다.

메틸화된 SDC2(Syndecan-2)염기서열(서열번호 6) 및 비메틸화 SDC2 염기서열(서열번호 7)을 유전자 합성 방법(바이오니아, 한국)으로 제작하였으며, TOPcloner TA core kit(엔지노믹스, 한국)을 이용하여, pTOP TA V2 플라스미드 벡터(엔지노믹스, 한국)에 클로닝하였다 (바이오니아, 한국). 메틸화된 SDC2 증폭을 위해 메틸화된 SDC2에 상보적인 서열을 갖는 정방향 일반 프라이머(서열번호 8), 메틸화된 SDC2에 상보적인 서열을 가지며, 3'말단에서 2번째 염기가 3'-데옥시구아닌(3'-deoxyguanine; 3'-dG)으로 치환된 정방향 ASRP 프라이머(서열번호 9) 및 메틸화된 SDC2에 상보적인 서열을 갖는 역방향 프라이머(서열번호 10)를 합성하였다.

[서열번호 8] 5'-TAGAAATTAATAAGTGAGAGGGC-3'

[서열번호 9] 5'-TAGAAATTAATAAGTGAGAGG[dG]C-3'

[서열번호 10] 5'-GACTCAAACTCGAAAACTC-3'

10⁵ copies의 메틸화 SDC2와 비메틸화 SDC2 플라스미드를 PCR 증폭을 위한 주형으로 사용하였으며, 3'->5'으로 교정반응 활성을 가지고 있는 DNA 중합효소(exo-polymerase)는 Pfu 중합효소(HelixAmp™ Power-Pfu Polymerase, 나노헬릭스, 한국)을 사용하였다. PCR은 Veriti® thermal cycler(Applied Biosystems, 싱가폴)을 사용하였으며, PCR 조건은 다음과 같다 : 총 볼륨이 25㎕이 되도록 주형 10⁵ copies, 10X Power-pfu buffer 2.5㎕, dNTP mix (10 mM) 1㎕, 프라이머 (4 pmole/ul) 1㎕ 및 Pfu 중합효소(HelixAmp™ Power-Pfu Polymerase, 1.25 units)을 첨가한 다음, 표 2의 조건으로 PCR을 수행하였다.

PCR 반응 조건

그 결과, 일반 프라이머를 사용한 경우에는 메틸화 특이적인 프라이머를 사용하더라도 메틸화된 SDC2 (도 3; lane 1)와 비메틸화 SDC2 (도 3; lane 2) 전부에서 증폭산물이 나타난 반면, SDC2 메틸화 특이적인 ASRP를 사용한 경우에는 메틸화 SDC2에는 특이적인 증폭산물이 관찰되지만 (도 3; lane 4), 비메틸화 SDC2에는 증폭이 전혀 일어나지 않는 것 (도 3; lane 5)을 확인하였다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Genomictree <120> Method for Amplification Nucleic Acid Using Aelle-Specific Reaction Primers <130> P13-B061 <150> 2013/0035343 <151> 2013-04-01 <160> 10 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 352 <212> DNA <213> BRAF(B-type Raf kinase) <400> 1 tatagaaatt agatctctta cctaaactct tcataatgct tgctctgata ggaaaatgag 60 atctactgtt ttcctttact tactacacct cagatatatt tcttcatgaa gacctcacag 120 taaaaatagg tgattttggt ctagctacag tgaaatctcg atggagtggg tcccatcagt 180 ttgaacagtt gtctggatcc attttgtgga tggtaagaat tgaggctatt tttccactga 240 ttaaattttt ggccctgaga tgctgctgag ttactagaaa gtcattgaag gtctcaacta 300 tagtattttc atagttccca gtattcacaa aaatcagtgt tcttattttt ta 352 <210> 2 <211> 352 <212> DNA <213> BRAF(B-type Raf kinase)V600E <400> 2 tatagaaatt agatctctta cctaaactct tcataatgct tgctctgata ggaaaatgag 60 atctactgtt ttcctttact tactacacct cagatatatt tcttcatgaa gacctcacag 120 taaaaatagg tgattttggt ctagctacag agaaatctcg atggagtggg tcccatcagt 180 ttgaacagtt gtctggatcc attttgtgga tggtaagaat tgaggctatt tttccactga 240 ttaaattttt ggccctgaga tgctgctgag ttactagaaa gtcattgaag gtctcaacta 300 tagtattttc atagttccca gtattcacaa aaatcagtgt tcttattttt ta 352 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BRAFV600E forward primer <400> 3 gtgattttgg tctagctaca ga 22 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BRAFV600E forward ASRP <220> <221> misc_difference <222> (21) <223> 3'-deoxyguanine <400> 4 gtgattttgg tctagctaca ga 22 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BRAFV600E reverse primer <400> 5 ttctagtaac tcagcagcat ctc 23 <210> 6 <211> 350 <212> DNA <213> methylation SDC2 <400> 6 aaattagaaa ttgaatttcg gtacgggaaa ggagttcgcg gaggagtaaa attatagtag 60 agtaagaaga gttttagaga gtagtttttt cggagtatta atttcgtgtc gggagtgtag 120 aaattaataa gtgagagggc gtcgcgtttt cggggcgtag ttgcgggcgg cgggagtagg 180 cgtaggagga ggaagcgagc gttttcgagt ttcgagttcg agttttcgag tttgagtcgt 240 aatcgttgcg gtattttgtt tcggattcgt gtgcgcgggt tgcgtcgagc gttgggtagg 300 aggtttcgtt ttgttttggt tgtaagtagc ggttgggagt agtcggtttt 350 <210> 7 <211> 350 <212> DNA <213> unmethylation SDC2 <400> 7 aaattagaaa ttgaattttg gtatgggaaa ggagtttgtg gaggagtaaa attatagtag 60 agtaagaaga gttttagaga gtagtttttt tggagtatta attttgtgtt gggagtgtag 120 aaattaataa gtgagagggt gttgtgtttt tggggtgtag ttgtgggtgg tgggagtagg 180 tgtaggagga ggaagtgagt gtttttgagt tttgagtttg agtttttgag tttgagttgt 240 aattgttgtg gtattttgtt ttggatttgt gtgtgtgggt tgtgttgagt gttgggtagg 300 aggttttgtt ttgttttggt tgtaagtagt ggttgggagt agttggtttt 350 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> methylation SDC2 forward primer <400> 8 tagaaattaa taagtgagag ggc 23 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> methylation SDC2 forward ASRP <220> <221> misc_difference <222> (22) <223> 3'-deoxyguanine <400> 9 tagaaattaa taagtgagag ggc 23 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> methylation SDC2 reverse primer <400> 10 gactcaaact cgaaaactc 19

Claims

교정활성(proofreading)을 가지는 DNA 중합효소(DNA polymerase) 및 표적핵산과 상보적인 염기서열을 포함하고, 3' 말단에 비상보적 염기가 존재할 때 상기 DNA 중합효소의 교정활성에 의해 잘려나가는 염기의 5' 방향으로 바로 앞쪽의 염기부터 5' 말단까지의 염기 중의 하나 이상이 중합반응의 시발체로 작용할 수 없도록 변형된 염기 특이 반응성 프라이머 (Allele-specific reactive primer; ASRP)의 존재하에 표적핵산을 증폭시키는 것을 특징으로 하는 표적핵산의 검출방법.
제1항에 있어서, 상기 교정활성을 가지는 DNA 중합효소는 3'->5' 엑소뉴클레이즈(exonuclase) 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 표적핵산의 검출방법.
제1항에 있어서, 상기 염기 특이 반응성 프라이머의 변형된 염기 3' 쪽에 위치하는 염기가 표적핵산과 상보적이면, DNA 중합효소(DNA polymerase)의 교정활성(proofreading)에 의해 잘려나가지 않고, 상보적이지 않으면 DNA 중합효소(DNA polymerase)의 교정활성(proofreading)에 의해 잘려나가, 3' 말단에 변형된 염기가 남아있는 것을 특징으로 하는 표적핵산의 검출방법.
제1항에 있어서, 상기 변형된 염기는 염기가 3'-데옥시뉴클레오타이드(3'-deoxynucletide), 인버티드(리버스) 3'-데옥시뉴클레오타이드 (inverted (reverse) 3'-deoxynucleotide) 및 3'-데옥시이노신(3'-deoxyinosine)으로 구성되는 군에서 선택되는 1개 이상으로 치환된 것을 특징으로 하는 표적핵산의 검출방법.
제1항에 있어서, 다음의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 표적핵산의 검출방법:
(a) 표적핵산을 염기 특이 반응성 프라이머(Allele-specific reactive primer; ASRP)와 혼합하여 혼성화 시키는 단계;
(b) 교정활성(proofreading)을 가지는 DNA 중합효소(DNA polymerase) 존재하에 상기 혼성화된 산물에서 표적핵산을 증폭시키는 단계; 및
(c) 상기 증폭산물의 유무에 의해 표적핵산을 검출하는 단계.
제5항에 있어서, 상기 염기 특이 반응성 프라이머의 농도는 0.1 내지 20M인 것을 특징으로 하는 표적핵산의 검출방법.
제5항에 있어서, 상기 (b) 단계의 증폭은 PCR(polymerase chain reaction)을 통해 수행하는 것을 특징으로 하는 표적핵산의 검출방법.
제5항에 있어서, 염기 특이 반응성 프라이머와 표적핵산이 서로 상보적이면 표적핵산의 증폭산물이 생성되고, 염기 특이 반응성 프라이머와 표적핵산이 서로 상보적이지 않으면, DNA 중합효소의 교정활성에 의해 일치하지 않은 염기가 제거되고 3' 말단에 남아있는 변형된 염기로 인해 증폭산물이 생성되지 않는 것을 특징으로 하는 표적핵산의 검출방법.
제1항에 있어서, 상기 표적핵산은 DNA 또는 RNA인 것을 특징으로 하는 표적핵산의 검출방법.
제1항 내지 제9항의 어느 한 항에 있어서, 상기 표적핵산은 돌연변이인 것을 특징으로 하는 표적핵산의 검출방법.
제10항에 있어서, 상기 돌연변이는 표적핵산의 염기가 치환, 결실 또는 삽입되어 변이가 일어난 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 표적핵산의 검출방법.
제10항에 있어서, 표적핵산에 돌연변이가 존재하지 않으면 표적핵산의 증폭산물이 생성되고, 표적핵산에 돌연변이가 존재하면 증폭산물이 생성되지 않는 것을 특징으로 하는 표적핵산의 검출방법.
제1항 내지 제9항의 어느 한 항에 있어서, 표적핵산은 병원균(pathogen)인 것을 특징으로 하는 표적핵산의 검출 방법.
제13항에 있어서, 상기 병원균은 바이러스, 세균 및 진균으로 구성되는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 표적핵산의 검출방법.
제13항에 있어서, 병원균이 존재하면 증폭산물이 생성되고, 병원균이 존재하지 않으면 증폭산물이 생성되지 않는 것을 특징으로 하는 표적핵산의 검출방법.
제1항 내지 제9항의 어느 한 항에 있어서, 표적핵산은 사이토신(cytosine)이 메틸화되어 있는 것을 특징으로 하는 표적핵산의 검출방법.
제16항에 있어서, 상기 메틸화된 표적핵산의 검출은 다음 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 표적핵산의 검출방법:
(a) 표적핵산을 화학적 또는 효소적 방법으로 처리하여, 메틸화된 사이토신 염기는 변환시키지 않고, 비메틸화된 사이토신(cytosine) 염기를 우라실(uracil) 또는 다른 염기로 변환시키는 단계;
(b) 상기 화학적 또는 효소적 방법으로 처리된 표적핵산을 염기 특이 반응성 프라이머(Allele-specific reactive primer; ASRP)와 혼합하여 혼성화시킨 다음, 교정활성(proofreading)을 가지는 DNA 중합효소(DNA polymerase) 존재하에 상기 혼성화된 산물에서 표적핵산을 증폭시키는 단계; 및
(c) 상기 증폭산물의 유무에 의해 표적핵산의 메틸화를 검출하는 단계.
제17항에 있어서, 메틸화된 표적핵산은 증폭산물이 생성되고, 비메틸화된 표적핵산은 증폭산물이 생성되지 않는 것을 특징으로 하는 표적핵산의 검출방법.
교정활성(proofreading)을 가지는 DNA 중합효소(DNA polymerase) 및 5' 말단에 DNA 라이브러리의 어댑터(adaptor) 서열과 상보적인 염기서열을 포함하고, 3' 말단에 표적핵산과 상보적인 특정 염기서열 및 상기 DNA 중합효소의 시발체로 작용할 수 없도록 변형된 염기를 포함하는 염기 특이 반응성 프라이머(Allele-specific reactive primer; ASRP)의 존재하에 DNA 라이브러리에서 표적핵산을 증폭시키는 것을 특징으로 하는 DNA 라이브러리에서 특정 염기서열로 시작되는 표적핵산의 증폭방법.
제19항에 있어서, 상기 교정활성을 가지는 DNA 중합효소는 3'->5' 엑소뉴클레이즈(exonuclase) 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 DNA 라이브러리에서 특정 염기서열로 시작되는 표적핵산의 증폭방법.
제19항에 있어서, 상기 염기 특이 반응성 프라이머의 변형된 염기 3' 쪽에 위치하는 염기가 표적핵산과 상보적이면, DNA 중합효소(DNA polymerase)의 교정활성(proofreading)에 의해 잘려나가지 않고, 상보적이지 않으면 DNA 중합효소(DNA polymerase)의 교정활성(proofreading)에 의해 잘려나가, 3' 말단에 변형된 염기가 남아있는 것을 특징으로 하는 DNA 라이브러리에서 특정 염기서열로 시작되는 표적핵산의 증폭방법.
제19항에 있어서, 상기 변형된 염기는 염기가 3'-데옥시뉴클레오타이드(3'-deoxynucletide), 인버티드(리버스) 3'-데옥시뉴클레오타이드 (inverted (reverse) 3'-deoxynucleotide) 및 3'-데옥시이노신(3'-deoxyinosine)으로 구성되는 군에서 선택되는 1개 이상으로 치환된 것을 특징으로 하는 DNA 라이브러리에서 특정 염기서열로 시작되는 표적핵산의 증폭방법.
제19항에 있어서, 다음의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA 라이브러리에서 특정 염기서열로 시작되는 표적핵산의 증폭방법:
(a) 지노믹(genomic) DNA를 무작위로 절단시킨 다음, 5'과 3'의 양쪽 말단에 시퀀싱을 위한 어댑터(adaptor) 서열을 연결시켜서 DNA 라이브러리를 제조하는 단계;
(b) 상기 DNA 라이브러리와 DNA 라이브러리의 어댑터 서열과 상보적인 염기서열을 포함하고, 3' 말단에 비상보적 염기가 존재할 때 상기 DNA 중합효소의 교정활성에 의해 잘려나가는 염기의 5' 방향으로 바로 앞쪽의 염기부터 5' 말단까지의 염기 중의 하나 이상이 중합반응의 시발체로 작용할 수 없도록 변형된 염기 특이 반응성 프라이머 (Allele-specific reactive primer; ASRP)와 혼합하여 혼성화 시키는 단계; 및
(c) 교정활성(proofreading)을 가지는 DNA 중합효소(DNA polymerase) 존재하에 상기 혼성화된 산물에서 특정 염기서열로 시작되는 표적핵산을 증폭시키는 단계.
제23항에 있어서, 상기 염기 특이 반응성 프라이머의 농도는 0.1 내지 20M인 것을 특징으로 하는 DNA 라이브러리에서 특정 염기서열로 시작되는 표적핵산의 증폭방법.
제23항에 있어서, 상기 (c) 단계의 증폭은 PCR(polymerase chain reaction)을 통해 수행하는 것을 특징으로 하는 DNA 라이브러리에서 특정 염기서열로 시작되는 표적핵산의 증폭방법.
제23항에 있어서, DNA 라이브러리에 특정 염기서열로 시작되는 표적핵산은 염기 특이 반응성 프라이머와 서로 상보적으로 결합하여 증폭산물이 생성되며, 염기 특이 반응성 프라이머와 서로 상보적이지 않으면, DNA 중합효소의 교정활성에 의해 일치하지 않은 염기가 제거되고 남아있는 변형된 3' 말단의 염기로 인해 증폭산물이 생성되지 않는 것을 특징으로 하는DNA 라이브러리에서 특정 염기서열로 시작되는 표적핵산의 증폭방법.
제19항에 있어서, 메틸화된 표적핵산만을 증폭시키는 것을 특징으로 하는 DNA 라이브러리에서 특정 염기서열로 시작되는 표적핵산의 증폭방법.
제27항에 있어서, 메틸화된 표적핵산의 증폭은 다음 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA 라이브러리에서 특정 염기서열로 시작되는 표적핵산의 증폭방법:
(a) 지노믹(genomic) DNA를 화학적 또는 효소적 방법으로 처리하여, 메틸화된 사이토신 염기는 변환시키지 않고, 비메틸화된 사이토신(cytosine) 염기를 우라실(uracil) 또는 다른 염기로 변환시키는 단계;
(b) 상기 지노믹(genomic) DNA를 무작위로 절단시킨 다음, 5' 과 3'의 양쪽 말단에 시퀀싱을 위한 어댑터(adaptor) 서열을 연결시켜서 DNA 라이브러리를 제조하는 단계;
(c) 상기 DNA 라이브러리와 DNA 라이브러리의 어댑터 서열과 상보적인 염기서열 및 3' 말단에 사이토신, DNA 중합효소의 시발체로 작용할 수 없도록 변형된 염기가 포함된 특이 반응성 프라이머(Allele-specific reactive primer; ASRP)와 혼합하여 혼성화 시키는 단계; 및
(d) 교정활성(proofreading)을 가지는 DNA 중합효소(DNA polymerase) 존재하에 상기 혼성화된 산물에서 메틸화된 표적핵산의 염기서열을 포함하는 DNA 절편을 증폭시키는 단계.
제28항에 있어서, 메틸화된 표적핵산은 증폭되고, 비메틸화된 표적핵산은 증폭되지 않는 것을 특징으로 하는 DNA 라이브러리에서 특정 염기서열로 시작되는 표적핵산의 증폭방법.
(ⅰ) 5' 말단에 표적핵산과 상보적이지 않은 염기서열을 포함하는 태깅 시퀀스(sequence), 변형된 단일염기 및 표적핵산과 상보적인 염기서열을 포함하고, DNA 중합효소(DNA polymerase)의 시발체로 작용할 수 없도록 변형된 3' 말단을 가지는 염기 특이 반응성 프라이머(Allele-specific reactive primer; ASRP), (ⅱ) 태깅 시퀀스 및 상기 표적핵산과 상보적인 염기서열의 일부를 포함하는 리포터 템플레이트(reporter template) 및 (ⅲ) 5'->3' 엑소뉴클에이즈(exonuclease) 활성을 가지는 DNA 중합효소(DNA polymerase) 존재하에 표적핵산을 증폭시키는 것을 특징으로 하는 표적핵산의 검출방법.
제30항에 있어서, 상기 염기 특이 반응성 프라이머의 태깅 시퀀스는 15 내지 30개의 염기로 구성된 것을 특징으로 하는 표적핵산의 검출방법.
제30항에 있어서, 상기 변형된 염기는 염기가 3'-데옥시뉴클레오타이드(3'-deoxynucletide), 인버티드(리버스) 3'-데옥시뉴클레오타이드 (inverted (reverse) 3'-deoxynucleotide) 및 3'-데옥시이노신(3'-deoxyinosine)으로 구성되는 군에서 선택되는 1개 이상으로 치환된 것을 특징으로 하는 표적핵산의 검출방법.
제30항에 있어서, 다음의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 표적핵산의 검출방법:
(a) 표적핵산을 (ⅰ) 5' 말단에 표적핵산과 상보적이지 않은 염기서열을 포함하는 태깅 시퀀스(sequence), 변형된 단일염기 및 표적핵산과 상보적인 염기서열을 포함하고, DNA 중합효소(DNA polymerase)의 시발체로 작용할 수 없도록 변형된 3' 말단을 가지는 염기 특이 반응성 프라이머(Allele-specific reactive primer; ASRP), (ⅱ) 태깅 시퀀스 및 상기 표적핵산과 상보적인 염기서열의 일부를 포함하는 리포터 템플레이트(reporter template) 및 (ⅲ) 표적핵산과 상보적인 프라이머와 혼합하여 혼성화 시키는 단계;
(b) 5'->3' 엑소뉴클에이즈(exonuclease) 활성을 가지는 DNA 중합효소(DNA polymerase)에 의해 표적핵산과 혼성화 되지 않은 5' 말단의 태깅 시퀀스를 포함하는 염기 특이 반응성 프라이머의 일부분이 절단되어 리포터 템플레이트(reporter template)와 혼성화를 이루는 단계; 및
(c) 혼성화된 리포터 템플레이드(reporter template)를 증폭시키고, 생성된 증폭산물의 유무에 의해 표적핵산을 검출하는 단계.
제33항에 있어서, 상기 (b) 단계에서, 염기 특이 반응성 프라이머의 변형된 단일염기 3' 쪽에 위치하는 염기가 표적핵산과 상보적이면, DNA 중합효소에 의해 5' 말단에 표적핵산과 상보적이지 않은 염기서열을 포함하는 태깅 시퀀스(sequence) 및 변형된 단일염기가 잘려나가고, 표적핵산과 상보적이지 않으면, DNA 중합효소에 의해 5' 말단에 표적핵산과 상보적이지 않은 염기서열을 포함하는 태깅 시퀀스(sequence), 변형된 단일염기 및 변형된 단일염기 3' 쪽에 위치하는 염기가 잘려나가는 것을 특징으로 하는 표적핵산의 검출방법.
제33항에 있어서, 표적핵산이 존재하면 리포터 템플레이트의 증폭산물이 생성되지 않으며, 표적핵산이 존재하지 않으면 리포터 템플레이트의 증폭산물이 생성되는 것을 특징으로 하는 표적핵산의 검출방법.
제30항에 있어서, 상기 표적핵산은 돌연변이인 것을 특징으로 하는 표적핵산의 검출방법.
제36항에 있어서, 상기 돌연변이는 표적핵산의 염기가 치환, 결실 또는 삽입되어 변이가 일어난 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 표적핵산의 검출방법.
제36항에 있어서, 표적핵산에 돌연변이가 존재하지 않으면 리포터 템플레이트의 증폭산물이 생성되지않고, 표적핵산에 돌연변이가 존재하면 리포터 템플레이트 증폭산물이 생성되는 것을 특징으로 하는 표적핵산의 검출방법.