CN107400716A

CN107400716A - 人braf基因v600e突变的pcr检测方法、引物、探针及试剂盒

Info

Publication number: CN107400716A
Application number: CN201710737536.5A
Authority: CN
Inventors: 徐祎春; 韩峻松; 袁箐; 周佳菁
Original assignee: SHANGHAI BIOCHIP CO Ltd
Current assignee: SHANGHAI BIOCHIP CO Ltd
Priority date: 2017-08-24
Filing date: 2017-08-24
Publication date: 2017-11-28

Abstract

本发明公开了一种人BRAF基因V600E突变的PCR检测方法，步骤包括：1)提取样本DNA并纯化；2)以该DNA为模板，加入内参基因，用特异性检测人BRAF基因V600E位点突变状态的引物对和探针，以及检测内参基因的引物对和探针，进行PCR反应；3)判断样本BRAF基因V600E位点的突变状态。本发明还公开了用于上述方法的特异性检测人BRAF基因V600E位点突变状态的引物对和探针以及包含上述引物对和探针的试剂盒。本发明通过设计特异性检测人BRAF基因V600E号位点的引物对和探针，实现了V600E位点突变状态的快速、准确、灵敏检测。

Description

人BRAF基因V600E突变的PCR检测方法、引物、探针及试剂盒

技术领域

本发明涉及生物检测领域，特别是涉及人BRAF基因V600E突变状态的检测。

背景技术

鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌同源体B1(v-raf murine sacoma viral oncogenehomolog B1,BRAF)是迅速加速纤维肉瘤(rapidly Accelerated Fibrosarcoma，RAF)家族中的成员之一，是丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号通路中鼠类肉瘤病毒癌基因(kirsten rat sarcoma viral oncogene，KRAS)下游的核心分子，是MEK/ERK激活途径中关键的激活因子，在调节细胞的生长、增殖和凋亡方面具有重要作用。

BRAF基因位于人染色体7q34，包含18个外显子，编码蛋白质分子全长约94Kd。BRAF主要有三个保守区，分别是CR1、CR2和CR3。其中CR3区为激酶的结构域，含甘氨酸环，是ATP的结合位点和主要激活区域，而且这区域的两个位点T598和S601的磷酸化对激活BRAF蛋白起着至关重要的作用。几乎BRAF基因上所有的突变都处于激酶结构域，主要是第600位密码子产生突变，包括V600E、V600K、V600R、V600D、V600M和V600L等，另外还有1798_1799ins、1799_1801del等。其中，V600E占据所有突变的80％左右。BRAF基因V600E突变可致使BRAF蛋白结构中V600E的氨基酸突变，使BRAF激酶发生持续性活化，激活MAPK通路，导致癌变。

BRAF基因突变与各种癌症相关，包括非霍奇金淋巴瘤、结直肠癌、恶性黑色素瘤、甲状腺癌、非小细胞肺癌和肺腺癌等。在66％的恶性肿瘤中都存在BRAF基因的错义突变。其中恶性黑色素瘤、结直肠癌、甲状腺癌中发现了较大比例的BRAF突变。黑色素瘤中BRAF基因的突变率最高，约40％～68％转移性黑色素瘤发生BRAF突变。另外5％～8％结肠癌也发生BRAF突变。BRAF在甲状腺癌中突变率约为5％～20％，其中，在甲状腺乳头状癌亚型中突变率最高，为30％～70％。

2011年，首个BRAF V600E靶向抑制剂维罗非尼(Vemurafenib，Zelboraf)被FDA批准上市，用于治疗BRAF V600E突变的晚期黑色素瘤患者，有效延长了患者无进展生存期及总生存期，取得了突破性的治疗效果。2013年，FDA批准了达拉非尼(Dabrafenib，Tafinlar)用于治疗转移性黑色素瘤和不适合做手术治疗的黑色素瘤病人。达拉非尼是FDA继维罗非尼之后的第二个针对BRAFV600E突变的靶向分子药物。同年，FDA批准曲美替尼(Trametinib，Mekinist)治疗伴有BRAF V600E或V600K突变的不可切除或转移性黑色素瘤。曲美替尼是一个靶向MEK1和MEK2(mitogen-activated protein kinase)的激酶抑制剂。2014年，美国FDA批准曲美替尼与达拉非尼联用治疗晚期黑色素瘤皮肤癌。此外，BRAF基因V600E突变的群体还受益于多靶点药物索拉非尼(Sorafenib)和瑞格非尼(Regorafenib)。索拉非尼是一种针对CRAF和野生型以及V600E突变的BRAF的有效抑制剂。瑞格非尼是一种针对KIT、RET、RAF-1、BRAF等多靶点的激酶抑制剂。

目前普遍应用的BRAF基因V600E位点突变方法为TaqMan探针法和DNA直接测序等。TaqMan探针法是利用Taq酶3’>5’外切核酸酶活性，切断探针，释放荧光信号的方法。但是TaqMan探针法存在成本高昂、前期预实验周期较长的缺点。DNA直接测序是基于双脱氧核糖核酸链末端终止的原理，获得DNA碱基序列。该方法的缺点：检测周期较长，花费昂贵，非闭管操作，难以避免交叉污染，通量不高。因此，以上两种方法都难适用于临床检测。而临床迫切需要开发一种快速、准确、操作简便和避免交叉污染的BRAF基因V600E位点突变检测技术，满足临床用药和检测诊断方面的时效性要求。

锁核酸(Locked nucleic acid，LNA)是一种类寡核苷酸衍生物，结构中β-D-呋喃核糖的2'-O、4'-C位通过缩水作用形成刚性的结构。与传统DNA探针相比，LNA具有以下优点：(1)和DNA、RNA互补的双链有很强的热稳定性(ΔTm＝3～8℃)，而同时遵守沃森-克里克(Watson-Crick)的碱基配对原则；(2)抗3′脱氧核苷酸酶降解的稳定性；(3)LNA-DNA杂交物能激活RNase H；(4)水溶性好，能自由穿入细胞膜，易被机体吸收；(5)体内无毒性作用；(6)高效的自动寡聚化作用，合成方法相对简单。

突变扩增系统(amplification refractory mutation system，ARMS)又称等位基因特异性扩增法(allele specific amplification，ASA)，基本原理是：如果引物的3′端碱基与模板碱基不互补，则用一般耐热DNA聚合酶无法延伸。ARMS PCR具有以下优点：(1)实验周期短；(2)实验成本低；(3)灵敏性较高。

发明内容

本发明要解决的技术问题之一是提供一对特异性检测人BRAF基因V600E位点突变状态的引物对，它可以用于特异、灵敏地检测人BRAF基因V600E位点的突变状态。

为解决上述技术问题，所述特异性检测人BRAF基因V600E位点突变状态的引物对包括上游引物和下游引物，其中，上游引物具有与SEQ ID NO:1所示序列80％以上相同的序列，下游引物具有与SEQ ID NO:2所示序列80％以上相同的序列。

较佳的，所述上游引物的序列优选为SEQ ID NO:1所示的序列；所述下游引物的序列优选为SEQ ID NO:2所示的序列。

较佳的，可以在所述上游引物的序列3’端的最后一个碱基上标记锁核酸，以提高PCR反应的特异性。

本发明要解决的技术问题之二是提供一条特异性检测人BRAF基因V600E位点突变状态的探针，所述探针具有与SEQ ID NO:3所示序列80％以上相同的序列。

较佳的，所述探针的序列优选为SEQ ID NO:3所示的序列。

本发明要解决的技术问题之三是提供一种检测人BRAF基因V600E突变的PCR反应试剂盒，该试剂盒包含有上述特异性检测人BRAF基因V600E位点突变状态的引物对和探针。

所述试剂盒中还可以包含有内参基因，以及用于检测内参基因的引物对和探针。所述内参基因可以选择人GAPDH基因，也可以选择其他合适的基因作为内参。检测人GAPDH内参基因的引物对包括上游引物和下游引物，其中，上游引物具有与SEQ ID NO:4所示序列80％以上相同的序列(优选SEQ ID NO:4所示序列)，下游引物具有与SEQ ID NO:5所示序列80％以上相同的序列(优选SEQ ID NO:5所示序列)。检测人GAPDH内参基因的探针具有与SEQ ID NO:6所示序列80％以上相同的序列(优选SEQ ID NO:6所示序列)。

进一步的，上述试剂盒中还可以包含有人BRAF基因V600E野生型和突变型的基因组DNA标准品，分别用作阴性对照和阳性对照。所述人BRAF基因V600E突变型基因组DNA标准品可以选用人恶性黑色素瘤细胞A375基因组DNA。所述人BRAF基因V600E野生型基因组DNA标准品可以选用人胃癌细胞HGC27基因组DNA。

当上述PCR反应试剂盒为荧光定量PCR反应试剂盒时，所述特异性检测人BRAF基因V600E位点突变状态的引物和探针的浓度优选为0.1～0.5μM；所述试剂盒中还可以包含有PCR反应缓冲液Tris-HCl、taqDNA聚合酶、ROX II、氯化钾、硫酸铵、氯化镁等。

当所述PCR反应试剂盒为数字PCR反应试剂盒时，所述特异性检测人BRAF基因V600E位点突变状态的引物的浓度优选为0.5～0.9μM，探针的浓度优选为0.1～0.5μM；所述试剂盒中还可以包含有ddPCR Supermix for Probes、微滴发生油、微滴读取油和Cartridge&Gasket等。

本发明要解决的技术问题之四是提供一种人BRAF基因V600E突变的PCR检测方法，它可以快速、准确、灵敏地检测人BRAF基因的突变状态。

为解决上述技术问题，本发明的人BRAF基因V600E突变的PCR检测方法，包括以下步骤：

1)提取样本DNA并纯化；

2)以步骤1)所得DNA为模板，加入内参基因以及检测该内参基因的引物对和探针，使用上述特异性检测人BRAF基因V600E位点突变状态的引物对和探针，进行PCR扩增反应；

3)判断样本BRAF基因V600E位点的突变状态。

所述内参基因可以选择人GAPDH基因。所述PCR优选为ARMS-PCR。所述PCR可以采用荧光定量PCR方法，也可以采用数字PCR方法。

当采用荧光定量PCR方法时，步骤1)纯化后的DNA浓度优选为0.6～20ng/μL。步骤2)引物和探针的浓度优选为0.1～0.5μM，PCR反应条件优选为：92～97℃预变性0.5～10min；92～97℃变性10～30s，55～60℃退火10～60s，40～50个循环。步骤3)根据CT值判断样本BRAF基因V600E位点的突变状态，具体的判断方法为：CT值≥36时，判为不表达；CT值＜36，判为表达；当FAM通道中表达，HEX通道中同时表达时，判断BRAF V600E存在突变；当FAM通道中不表达，HEX通道中表达时，判断BRAF V600E不存在突变。

当采用数字PCR方法时，步骤1)纯化后的DNA浓度优选为0.04～20ng/μL。步骤2)引物的浓度优选为0.5～0.9μM，探针的浓度优选为0.1～0.5μM，PCR反应条件优选为：92～97℃预变性0.5～10min；92～97℃变性10～30s，56～60℃退火10～60s，40～50个循环；98℃灭活10min。步骤3)根据阳性拷贝数判断样本BRAF基因V600E位点的突变状态，具体的判断方法为：阳性拷贝数>0.5拷贝/μL时，判为表达，反之为不表达；当FAM通道中表达，HEX通道中同时表达时，判断BRAF V600E存在突变；当FAM通道中不表达，HEX通道中同时表达时，判断BRAF V600E不存在突变。

本发明通过设计特异性检测人BRAF基因V600E号位点的引物对和探针，并在上游引物的3’端的最后一个碱基上标记LNA，实现了BRAF基因上V600E位点突变状态的特异性检测。与现有BRAF基因V600E突变检测方法相比，本发明的方法具有以下优点和有益效果：

1、可在同一管中检测BRAF V600E的突变状态，检测方便快捷，准确性高；

2、灵敏度高，特异性强；

3、适用面广，可运用于普通荧光定量PCR平台和数字PCR平台；

4、操作简单，检测速度快，成本低。

附图说明

图1为本发明基于荧光定量PCR平台检测细胞HGC27基因组DNA样本的BRAF基因V600E位点阴性PCR扩增图。

图2为本发明基于荧光定量PCR平台检测细胞HGC27基因组DNA样本的GAPDH内参基因阳性PCR扩增图。

图3为本发明基于荧光定量PCR平台检测细胞A375基因组DNA样本的BRAF基因V600E位点阳性PCR扩增图。

图4为本发明基于荧光定量PCR平台检测细胞A375基因组DNA样本的GAPDH内参基因阳性PCR扩增图。

图5为本发明基于荧光定量PCR平台检测NTC(No Template Control，空白对照)样本的BRAF基因V600E位点阴性PCR扩增图。

图6为本发明基于荧光定量PCR平台检测NTC样本的GAPDH内参基因阴性PCR扩增图。

图7为本发明基于荧光定量PCR平台不同突变率样本FAM通道的扩增曲线。

图8为本发明基于荧光定量PCR平台不同突变率样本的线性回归图。

图9为本发明基于数字PCR平台不同突变率样本的阳性微滴的一维分布图。

图10为本发明基于数字PCR平台不同突变率样本的线性回归图。

图11为本发明基于数字PCR平台检测细胞A375基因组DNA样本、细胞HGC27基因组DNA样本和NTC样本的BRAF基因V600E位点FAM通道的微滴一维分布图。

图12为本发明基于数字PCR平台检测细胞A375基因组DNA样本、细胞HGC27基因组DNA样本和NTC样本的BRAF基因V600E位点HEX通道的微滴一维分布图。

具体实施方式

为对本发明的技术内容、特点与功效有更具体的了解，现结合附图及具体实施例，对本发明的技术方案详述如下。

实施例1设计并合成特异性引物和探针

根据NCBI数据库公布的人BRAF基因的DNA序列，设计特异性检测人BRAF V600E位点的上、下游引物和探针。其中，上游引物的3’末端为突变位点(c.1799T>A)，在该位点上标记LNA。

根据NCBI数据库公布的人GAPDH基因的DNA序列，设计特异性检测人GAPDH基因的上、下游引物和探针。

设计得到的4条引物和2条探针的核苷酸序列(5’-3’)如下：

BRAF上游引物：GTGATTTTGGTCTAGCTACAG+A(SEQ ID NO:1)

BRAF下游引物：ATCCAGACAACTGTTCAAACTGATG(SEQ ID NO:2)

BRAF探针：FAM-CTCGATGGAGTGGGTC-MGB(SEQ ID NO:3)

GAPDH上游引物：CTGCCAGCCTAGCGTTGAC(SEQ ID NO:4)

GAPDH下游引物：CCAATCCTCCCGGTGACAT(SEQ ID NO:5)

GAPDH探针：HEX-ACCCCAAAGGCCAGG-MGB(SEQ ID NO:6)

其中，序列中的“+”表示BRAF上游引物3’末端的碱基A上标记有LNA，一旦该引物上的“+A”与模板链上的碱基不互补，PCR的非特异性扩增就会降低，PCR反应的特异性就会增加。

实施例2引物和探针的特异性、灵敏度和线性回归实验(基于荧光定量PCR平台)

分别以仅含BRAF基因V600E野生型的基因组DNA和仅含BRAF基因V600E突变型的基因组DNA为模板，用荧光定量PCR平台检测上述BRAF基因V600E位点的引物和探针的特异性和灵敏度。检测体系如表1所示：

表1引物和探针的特异性和灵敏度检测体系(荧光定量PCR平台)

成分	体积(μL)
		MgCl₂	0.4
KCl	2
		(NH4)₂SO₄	2
Tris-Hcl	2
		ROX II	0.2
Taq酶	0.2
		BRAF-F	0.4
BRAF-R	0.4
		GAPDH-F	0.4
GAPDH-R	0.4
		BRAF探针	0.3
GAPDH探针	0.3
		模板+水	11
总体积	20

特异性和灵敏度检测方法为：按表1配制好荧光定量PCR的检测体系，放入ABI7500仪内进行PCR扩增反应，反应完成后进行数据分析。PCR扩增反应条件为：95℃30秒；95℃5秒，60℃34秒，40个循环；98℃10分钟；4℃持续。

特异性检测结果如表2所示：

表2引物和探针的特异性检测结果(荧光定量PCR平台)

样本名称	上样量	FAM通道CT值	HEX通道CT值	判定结果
					HGC27基因组DNA	20ng/20μL	未检测到	30.39	阴性
A375基因组DNA	20ng/20μL	27.29	30.38	阳性

注：未检测到荧光信号的CT值视为40

根据表2的特异性检测结果发现：HGC27基因组DNA，经测序确定无BRAF基因V600E突变，仅含BRAF基因V600E野生型的基因组DNA，FAM通道未检测到荧光信号，HEX通道的CT值为30.39，即显示此样本无BRAF V600E突变；A375基因组DNA，经测序确定为仅含BRAF基因V600E突变型的基因组DNA，FAM通道的CT值为27.29，HEX通道的CT值为30.38，即显示此样本存在BRAF V600E突变。可见，BRAF基因V600E特异性引物可以特异性的识别BRAFV600E的突变位点。

灵敏度的检测，包括上样量和突变率的检出阈值的检测。

上样量检出阈值的检测结果如表3所示：

表3上样量检出阈值结果(荧光定量PCR平台)

样本名称	上样量	FAM通道CT值	HEX通道CT值	判定结果
					HGC27基因组DNA	0.625ng/20μL	未检测到	32.85	阴性
A375基因组DNA	0.625ng/20μL	29.44	33.19	阳性

注：未检测到荧光信号的CT值视为40

根据表3的检测结果发现：HGC27基因组DNA，经测序确定无BRAF基因V600E突变，即仅含BRAF基因V600E野生型的基因组DNA，在终浓度为0.625ng/20μL时，FAM通道未检测到荧光信号，HEX通道的CT值为32.85，即显示此样本无BRAF V600E突变；仅含BRAF基因V600E突变型的基因组DNA终浓度为0.625ng/20μL时，FAM通道的CT值为29.44，HEX通道的CT值为33.19，即显示此样本存在BRAF V600E突变。可见，BRAF基因V600E特异性引物可以在基因组DNA终浓度低至0.625ng/20μL时，仍能特异性识别BRAF基因V600E位点的突变状态。

突变率检出阈值的检测方法为：将BRAF基因V600E突变型(A375)基因组DNA和野生型(HGC27)基因组DNA按一定比例混合，使突变型样本在总样本中的占比分别为20％、10％、7.5％、5％、2.5％、1.25％，用荧光定量PCR平台对本发明的突变检出效率进行检测，检测结果如表4所示。

表4突变率检出阈值结果(荧光定量PCR平台)

结果显示：当突变型样本占比为1.25％时，FAM通道CT值为35.11，HEX通道CT值为29.14，即显示此样本存在BRAF V600E突变，因此，本发明基于荧光定量PCR平台对突变率的检出阈值为1.25％。

线性回归实验方法为：将BRAF基因V600E突变型基因组DNA和野生型基因组DNA按一定比例混合，使突变型样本在总样本中的占比分别为80％、40％、20％、10％、5％、2.5％，用荧光定量PCR方法检测本发明的突变检出效率，然后用2^-△CT值作线性回归曲线。结果如图8所示，线性回归曲线的R²为0.9966，呈现良好的线性。

实施例3引物和探针的特异性、灵敏度和线性回归实验(基于数字PCR平台)

分别以仅含BRAF基因V600E野生型的基因组DNA和仅含BRAF基因V600E突变型的基因组DNA为模板，使用数字PCR平台，检测上述BRAF基因V600E位点的引物和探针的特异性和灵敏度。检测体系如表5所示：

表5引物和探针的特异性和灵敏度检测体系(数字PCR平台)

成分	体积(μL)
		2*ddPCR Supermix for Probes	10
BRAF-F	1.8
		BRAF-R	1.8
GAPDH-F	1.8
		GAPDH-R	1.8
BRAF探针	0.5
		GAPDH探针	0.5
模板+水	1.8
		ddH₂O	20

特异性和灵敏度检测方法为：按表5配制好数字PCR检测体系，然后将数字PCR反应液转移到DG8微滴发生卡中的样品槽，再加入微滴发生专用油，然后放入QX200DropletGenerator中进行微滴发生反应，反应完成后，将生成好的微滴到转移到96孔板中，然后盖上PCR金属封箔片，并使用热封仪进行封板。随后转移至BIORAD PCR仪进行扩增反应，扩增反应条件为95℃10分钟；94℃30秒，60℃1分钟，40个循环；98℃10分钟；4℃持续。反应完成后放入QX200Droplet Reader进行信号读取；随后进行数据分析。

特异性检测结果如表6所示：

表6引物和探针的特异性检测结果(数字PCR平台)

根据表6的特异性检测结果发现：HGC27基因组DNA，经测序确定无BRAF基因V600E突变，仅含BRAF基因V600E野生型的基因组DNA，FAM通道的阳性拷贝数为0copies/μL，HEX通道的阳性拷贝数为76copies/μL，即显示此样本无BRAF V600E突变；A375基因组DNA，经测序确定为仅含BRAF基因V600E突变型的基因组DNA，FAM通道的阳性拷贝数为102copies/μL，HEX通道的阳性拷贝数为109copies/μL，即显示此样本存在BRAF V600E突变。可见，BRAF基因V600E特异性引物可以特异性的识别BRAF V600E的突变位点。

灵敏度的检测，包括上样量和突变率的检出阈值的检测。

上样量检出阈值的检测结果如表7所示：

表7上样量检出阈值结果(数字PCR平台)

根据表7的检测结果发现：HGC27基因组DNA，经测序确定无BRAF基因V600E突变，即仅含BRAF基因V600E野生型的基因组DNA，在终浓度为0.039ng/20μL时，FAM通道的阳性拷贝数为0copies/μL，HEX通道的阳性拷贝数为6copies/μL，即显示此样本无BRAF V600E突变；仅含BRAF基因V600E突变型的基因组DNA终浓度为0.039ng/20μL时，FAM通道的阳性拷贝数为7copies/μL，HEX通道的阳性拷贝数为6copies/μL，即显示此样本存在BRAF V600E突变。可见，BRAF基因V600E特异性引物，在基因组DNA终浓度低至0.039ng/20μL时，仍能特异性识别BRAF基因V600E位点的突变状态。

突变率的检出阈值的检测方法为：将BRAF基因V600E突变型(A375)基因组DNA和野生型(HGC27)基因组DNA按一定比例混合，使突变型样本在总样本中的占比分别为10％、5％、2.5％、1.25％、0.625％、0.3125％、0.078％，用数字PCR平台对本发明的突变检出效率进行检测，检测结果如表8所示。

表8突变率检出阈值结果(数字PCR平台)

根据表8的检测结果显示：当突变型基因组DNA和野生型基因组DNA按一定比例混合，突变型样本占比为0.078％时，数字PCR平台的检出FAM通道的阳性拷贝数为1copies/μL，HEX通道的阳性拷贝数为140copies/μL，即显示此样本存在BRAF V600E突变。因此，本发明基于数字PCR平台对突变率的检出阈值为0.078％。

线性回归实验方法：将BRAF基因V600E突变型基因组DNA和野生型基因组DNA按一定比例混合，使突变型样本占比分别为10％、5％、2.5％、1.25％、0.625％、0.3125％、0.078％，用数字PCR平台检测本发明的突变检出效率，然后用阳性拷贝数作线性回归曲线。结果如图10所示，线性回归曲线的R²为0.9973，呈现良好的线性。

实施例4基于实时荧光定量PCR平台检测人BRAF基因V600E位点的突变状态

本实施例使用实时荧光定量PCR平台，检测人BRAF基因V600E位点的突变状态，具体方法包括以下步骤：

1)提取样本DNA并纯化。所述DNA提取自外周血细胞、组织、体液或腔道的脱落物，纯化后的DNA浓度为0.6～20ng/μL。

2)以步骤1)所得DNA为模板，使用实施例1设计的特异性检测人BRAF基因V600E位点突变状态的引物对(SEQ ID NO:1～2)和探针(SEQ ID NO:3)，在同一个PCR反应管内，进行实时荧光定量PCR扩增反应。PCR反应条件为92～97℃预变性0.5～10min；92～97℃变性10～30s，55～60℃退火10～60s，40～50个循环。

3)根据CT值判断样本BRAF基因V600E位点的突变状态。判断方法为：CT值≥36时，判为不表达；CT值＜36，判为表达；当FAM通道中表达，HEX通道中同时表达时，判断BRAFV600E存在突变；当FAM通道中不表达，HEX通道中表达时，判断BRAF V600E不存在突变。

实施例5基于数字PCR平台检测人BRAF基因V600E位点的突变状态

本实施例使用数字PCR平台，检测人BRAF基因V600E位点的突变状态，具体方法包括以下步骤：

1)提取样本DNA并纯化。所述DNA提取自外周血细胞、组织、体液或腔道的脱落物，纯化后的DNA浓度为0.04～20ng/μL。

2)以步骤1)所得DNA为模板，使用实施例1设计的特异性检测人BRAF基因V600E位点突变状态的引物对(SEQ ID NO:1～2)和探针(SEQ ID NO:3)，在同一个PCR反应管内，进行数字PCR反应。PCR反应条件为92～97℃预变性0.5～10min；92～97℃变性10～30s，56～60℃退火10～60s，40～50个循环；98℃灭活10min。

3)根据阳性拷贝数判断样本BRAF基因V600E位点的突变状态。判断方法为：阳性拷贝数>0.5copies/μL时，判为表达，反之为不表达；当FAM通道中表达，HEX通道中同时表达时，判断BRAF V600E存在突变；当FAM通道中不表达，HEX通道中同时表达时，判断BRAFV600E不存在突变。

序列表

<110> 上海生物芯片有限公司

<120> 人BRAF基因V600E突变的PCR检测方法、引物、探针及试剂盒

<130> CPC-NP-17-100585

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 1

gtgattttgg tctagctaca ga 22

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 2

atccagacaa ctgttcaaac tgatg 25

<210> 3

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<223> 探针

<400> 3

ctcgatggag tgggtc 16

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 4

ctgccagcct agcgttgac 19

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 5

ccaatcctcc cggtgacat 19

<210> 6

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<223> 探针

<400> 6

accccaaagg ccagg 15

Claims

1.人BRAF基因V600E突变的PCR检测方法，其特征在于，步骤包括：

1)提取样本DNA并纯化；

2)以步骤1)所得DNA为模板，加入内参基因以及检测该内参基因的引物对和探针，使用特异性检测人BRAF基因V600E位点突变状态的引物对和探针，进行PCR扩增反应；

所述检测人BRAF基因V600E位点突变状态的引物对的上游引物具有与SEQ ID NO:1所示序列80％以上相同的序列，下游引物具有与SEQ ID NO:2所示序列80％以上相同的序列；

所述检测人BRAF基因V600E位点突变状态的探针具有与SEQ ID NO:3所示序列80％以上相同的序列；

3)判断样本BRAF基因V600E位点的突变状态。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述检测人BRAF基因V600E位点突变状态的引物对的上游引物的序列如SEQ ID NO:1所示，下游引物的序列如SEQ ID NO:2所示；所述上游引物的序列3’端的最后一个碱基上标记有锁核酸；所述检测人BRAF基因V600E位点突变状态的探针的序列如SEQ ID NO:3所示。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述内参基因为人GAPDH基因，所述检测内参基因的引物对的上游引物的序列如SEQ ID NO:4所示，下游引物的序列如SEQ ID NO:5所示，探针的序列如SEQ ID NO:6所示。

4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述PCR为荧光定量PCR；步骤1)纯化后的DNA浓度为0.6～20ng/μL；步骤2)检测人BRAF基因V600E位点突变状态的引物和探针的浓度为0.1～0.5μM；PCR反应条件为：92～97℃预变性0.5～10min；92～97℃变性10～30s，55～60℃退火10～60s，40～50个循环；步骤3)根据CT值判断样本BRAF基因V600E位点的突变状态。

5.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述PCR为数字PCR；步骤1)纯化后的DNA浓度为0.04～20ng/μL；步骤2)检测人BRAF基因V600E位点突变状态的引物的浓度为0.5～0.9μM，探针的浓度为0.1～0.5μM；PCR反应条件为：92～97℃预变性0.5～10min；92～97℃变性10～30s，56～60℃退火10～60s，40～50个循环；98℃灭活10min；步骤3)根据阳性拷贝数判断样本BRAF基因V600E位点的突变状态。

6.特异性检测人BRAF基因V600E位点突变状态的引物对，包括上游引物和下游引物，其特征在于，所述上游引物具有与SEQ ID NO:1所示序列80％以上相同的序列；所述下游引物具有与SEQ ID NO:2所示序列80％以上相同的序列。

7.根据权利要求6所述的引物对，其特征在于，所述上游引物的序列如SEQ ID NO:1所示；所述下游引物的序列如SEQ ID NO:2所示。

8.根据权利要求6所述的引物对，其特征在于，所述上游引物的序列3’端的最后一个碱基上标记有锁核酸。

9.特异性检测人BRAF基因V600E位点突变状态的探针，其特征在于，所述探针具有与SEQ ID NO:3所示序列80％以上相同的序列。

10.根据权利要求9所述的探针，其特征在于，所述探针的序列如SEQ ID NO:3所示。

11.检测人BRAF基因V600E突变的PCR反应试剂盒，其特征在于，包含有权利要求6-8任一项所述的引物对，以及权利要求9或10所述的探针。

12.根据权利要求11所述的试剂盒，其特征在于，还包含有内参基因，以及检测内参基因的引物对和探针，所述检测内参基因的引物对的上游引物的序列如SEQ ID NO:4所示，下游引物的序列如SEQ ID NO:5所示，探针的序列如SEQ ID NO:6所示。