CN103080310A - 使用光的核酸的扩增抑制方法和高灵敏度的选择性核酸扩增方法 - Google Patents

使用光的核酸的扩增抑制方法和高灵敏度的选择性核酸扩增方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供在核酸样品中，检测野生型核酸组中微量混杂的突变型核酸时，快速而简便、且兼具高特异性和灵敏度的方法。在本发明方法中，使具有靶位点的核酸、与包含具有与靶位点互补的序列的光连接性核酸类的发夹探针共存，通过光照射使该具有靶位点的核酸与该发夹探针进行光连接，抑制由核酸扩增法引起的包含靶位点的检测区的扩增。

Description

使用光的核酸的扩增抑制方法和高灵敏度的选择性核酸扩增方法
技术领域
本发明涉及使用包含光连接性核酸类的发夹探针(clamp probe)选择性地检测例如野生型核酸中混杂的突变型核酸的方法和试剂盒、以及具有350～380nm范围的波长的光照射功能的核酸扩增装置。
背景技术
人基因组序列解读完毕后，将所解读的基因信息有效用于诊断等医疗领域的活动进行活跃。解读基因组序列之后，接下来所关注的是基因表达模式分析或基因中的单碱基替换(一塩基置換) (SNPs)的分析等。研究在各种条件下表达的基因的表达量或基因突变，由此基因的功能或基因与疾病或药物感受性的关联日益明朗，因此与所累积的基因有关的信息不仅被用于疾病的诊断，还被用于治疗方法的选择。
其中，单核苷酸多态性(一塩基多型)或突变成为疾病诊断或风险判定等基因检查中的重要目标，在涉及糖尿病、风湿病、恶性肿瘤、精神疾病、心脏病等多个方面的领域应用。作为该单碱基替换的检测方法，迄今为止开发了各种方法。具体而言，作为快速且高通量地进行分析的方法，可以列举：Invader法、Sniper法、TaqMan PCR法、杂交探针法、SNPIT法、焦磷酸微测序法(Pyrominisequencing法)、变性高效液相色谱(DHPLC)法、MALDI-TOF/MS法、NanoChip法等。
在恶性肿瘤领域，狙击体内的特定分子以抑制其功能的分子靶向治疗药的开发在积极进行，选择治疗方法时，在确定分子靶向治疗药的使用上，单碱基替换的检测被定位成重要的检查。例如，推荐在使用抗癌药前实施EGFR基因或KRAS基因的突变分析检查。其原因在于：根据是否存在突变，在药效上存在差异，因此考虑突变以指导给药。另外，通过事先研究是否存在这样的突变，与药物的有效性相比，还存在着选择发生严重的副作用的危险性大、给药效果差的患者的目标。根据这样的理由，在恶性肿瘤领域，特别是单碱基替换的检测被视为重要的检查。
但是，在恶性肿瘤这样的后发突变的检测中，由于以来自占据多半检体材料的正常细胞的野生型核酸分子为背景(background)，因此在上述的分析方法中，往往无法检测单碱基替换等的突变。为了解决这个问题，人们开发了Scorpion-ARMS法或PNA-LNA PCR Clamping法(专利文献1)。
Scorpion-ARMS法是指，利用以突变点位于引物的3’末端附近的方式与突变型序列一并制备的该引物和另一个引物的组合，选择性地扩增突变型分子，再通过Scorpion法这种荧光检测法分析该扩增产物的方法。PNA-LNA PCR Clamping法是指，利用设计在突变点上的与野生型序列互补的发夹引物选择性地封闭(block)野生型分子，以突变型LNA作为荧光检测探针，选择性地扩增并检测突变型分子的方法。
上述方法均利用已形成杂交体(ハイブリッド)的引物或探针和模板分子在平衡系统中的热稳定性之差，无论是在引物或探针与模板分子完全互补的情况下形成杂交体、还是在引物或探针与模板分子有1个或多个碱基不互补的情况下形成不完全的杂交体，其不同之处也不过是热稳定性的不同。因此，区别两者的适当的条件根据目标碱基序列而不同，即使在更适当的条件下，使热稳定性发生变化的条件对两者几乎均等地发挥作用。即，只要是仅以平衡系统中的杂交体形成的热稳定性之差作为区别两者的原理，就无法设定在特异性和灵敏度的均衡上妥协的温度条件，而且尚需说明的是，可以设定的温度条件的范围往往非常窄，因此，存在着根据基因序列难以设计探针或引物的情形。
鉴于上述检测技术的状况，目前在恶性肿瘤的突变检测检查中，对检查材料的采集设有严密的限制。具体而言，推荐由癌症组织制作病理标本，再由染色标本鉴定肿瘤部位，之后由连续切片的未染色标本只集中在肿瘤部分(关于大肠癌患者的KRAS基因突变测定的指南)。但是，在肿瘤部位的鉴定中，需要组织形态学的专业知识、且操作繁杂，而且在成本方面负担大。
因此，人们要求确立不怎么受作为检查要件的检查材料的采集或靶基因的碱基序列所带来的限制、且兼具特异性和灵敏度的检测方法。
作为兼具特异性和灵敏度的检测方法，人们开发了利用光连接性核酸类的突变基因的检测方法。例如，专利文献2中记载着：基于使特定的碱基序列的靶核酸与互补链形成杂交体的原理，同时兼具高特异性和灵敏度来进行检测的方法。其依据于下述方法：由与靶核酸互补的光连接性核酸类和在3’末端或5’末端具有可以与该光连接性核酸类进行光连接的碱基部分的被光连接性核酸类构成，且该核酸类中的任一方具有标记部分、而剩下的一方被固定在基材上的方法。根据该方法，位于同一条链上的光连接性核酸类和被光连接性核酸类利用光连接只在形成完全的杂交体时特异性地进行光连接，可以将具有标记部分的核酸分子以共价键固定在基材上，可以在互补的双链发生解离的条件下进行彻底的清洗，可以兼具高特异性和灵敏度(S/N比)。
但是，在检测灵敏度上有限度，该方法的使用目的在于：检测包含在大量的靶核酸中的突变是否存在，但为了检测大量的野生型核酸中混杂的微量突变型核酸，该微量的突变型核酸的存在量往往在检测灵敏度以下，因此无法使用。另外，由于光连接性核酸类与同链的被连接核酸形成共价键，因此还无法扩增想要检测的靶核酸中所含的突变。
另一方面，专利文献3中记载着下述方法：首先，通过PCR扩增包含靶核酸的样品，对于该样品，结合专利文献2的方法，检测核酸样品中的具有1个或2个以上的靶核苷酸序列的核酸。当突变型核酸的比例为微量时，即使通过PCR可以扩增，但与野生型核酸的含有比例也不会发生变化，通过在试管内可以进行检测的范围的扩增，无法将突变型核酸扩增至可以检测的程度。该方法的使用目的在于：检测包含在大量的靶核酸中的突变是否存在，但无法用于检测大量的野生型核酸中混杂的微量突变型核酸。另外，为了通过PCR扩增包含靶核酸的样品，只要在某种程度上提高突变型核酸的含有比例，就有可能检测到突变型核酸，但步骤多、繁杂，无法满足要求快速的检查结果的临床现场的迫切需要。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本专利第4216266号说明书；
专利文献2：WO2007/058326号公报；
专利文献3：日本特开2009-213445号公报。
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的目的在于提供：在核酸样品中，检测野生型核酸组中微量混杂的突变型核酸时，快速而简便，且兼具高特异性和灵敏度的方法。
解决课题的方法
本发明人为了解决上述课题反复进行了深入研究，结果发现：通过将包含光连接性核酸类的发夹探针与具有靶位点序列的野生型核酸进行光连接，可以选择性地阻止野生型核酸的扩增，所述光连接性核酸类具有与具有野生型核酸的序列的靶位点互补的序列。即，通过使用光连接性发夹探针，只在形成完全的杂交体时特异性地进行光连接，在核酸扩增反应中的温度循环的任一个步骤中也保持连接、即处于非平衡状态，从而可以阻止靶分子在核酸扩增反应中作为模板的作用。由此，可以兼具野生型核酸的高聚集(クランピング，clumping) (抑制)效果和突变型核酸的选择性(特异性)核酸扩增。
本发明涉及下述[1]～[15]：
[1] 使具有靶位点的核酸、与包含具有与靶位点互补的序列的光连接性核酸类的发夹探针共存，通过光照射使该具有靶位点的核酸与该发夹探针进行光连接，抑制由核酸扩增法引起的包含靶位点的检测区的扩增的方法；
[2] 突变型核酸检测方法，该方法通过选择性地扩增包含突变型核酸的靶位点的检测区，来检测是否存在该突变型核酸，该方法包括下述步骤：
步骤(a)：使包含光连接性核酸类的发夹探针与核酸样品共存，使发夹探针与具有靶位点的野生型核酸分子特异性地形成杂交体，所述光连接性核酸类具有与具有野生型核酸序列的靶位点互补的序列；
步骤(b)：对已形成杂交体的发夹探针和靶核酸分子进行光照射，使之进行光连接；
步骤(c)：将上述步骤(a)、(b)的反应产物供给核酸扩增反应；
步骤(d)：分析上述扩增产物；
[3] 突变型核酸检测方法，该方法通过选择性地扩增包含突变型核酸的靶位点的检测区，来检测是否存在该突变型核酸，该方法包括下述步骤：
步骤(a)：使包含光连接性核酸类的发夹探针与核酸样品共存，使发夹探针与具有靶位点的野生型核酸分子特异性地形成杂交体，所述光连接性核酸类具有与具有野生型核酸序列的靶位点互补的序列；
步骤(b)：对已形成杂交体的发夹探针和靶核酸分子进行光照射，使之进行光连接；
步骤(c)：在核酸扩增反应中进行上述步骤(a)、(b)；
步骤(d)：分析上述扩增产物；
[4] [1]～[3]中任一项的方法，其中，上述核酸扩增法为PCR法；
[5] [1]～[3]中任一项的方法，其中，上述核酸扩增法为实时PCR法；
[6] [1]～[3]中任一项的方法，其中，上述发夹探针具有与靶核酸分子的有义链和/或反义链互补的序列；
[7] [1]～[6]中任一项的方法，其中，上述发夹探针的链长为7～30；
[8] [1]～[7]中任一项的方法，其中，上述光照射通过350～380nm范围的波长来进行；
[9] [1]～[8]中任一项的方法，其中，上述光照射在通常的互补链彼此之间结合和解离的温度循环中在互补链彼此之间可以结合的温度下进行1次以上；
[10] [1]～[9]中任一项的方法，其中，上述光照射通过赋予了350～380nm范围的波长的光照射功能的核酸扩增装置来进行；
[11] 试剂盒，其中包含发夹探针和扩增包含靶位点的检测区的引物，所述发夹探针包含具有与靶位点互补的序列的光连接性核酸类，该试剂盒抑制由基因扩增法引起的包含靶位点的检测区的扩增；
[12] 突变型核酸检测试剂盒，其中包含发夹探针和扩增包含靶位点的检测区的引物，所述发夹探针包含具有与具有野生型核酸序列的靶位点互补的序列的光连接性核酸类，该试剂盒通过选择性地扩增包含突变型核酸的靶位点的检测区，来检测是否存在该突变型核酸；
[13] 核酸扩增装置，该装置具有350～380nm范围的波长的光照射功能；
[14] 核酸扩增装置，该装置具有350～380nm范围的波长的光照射功能，该装置包括下述步骤：
步骤(a)：使包含光连接性核酸类的发夹探针与核酸样品共存，使发夹探针与具有靶位点的核酸分子特异性地形成杂交体，所述光连接性核酸类具有与靶位点互补的序列；
步骤(b)：对已形成杂交体的发夹探针和靶核酸分子进行光照射，使之进行光连接；
步骤(c)：将上述步骤(a)、(b)的反应产物供给核酸扩增反应；
[15] 核酸扩增装置，该装置具有350～380nm范围的波长的光照射功能，该装置包括下述步骤：
步骤(a)：使包含光连接性核酸类的发夹探针与核酸样品共存，使发夹探针与具有靶位点的核酸分子特异性地形成杂交体，所述光连接性核酸类具有与靶位点互补的序列；
步骤(b)：对已形成杂交体的发夹探针和靶核酸分子进行光照射，使之进行光连接；
步骤(c)：在核酸扩增反应中进行上述步骤(a)、(b)。
发明效果
根据本发明，可以兼具高灵敏度和特异性、且快速及简便地检测核酸样品中是否存在混杂的突变型核酸。
附图说明
图1是3-氰基乙烯基咔唑-1’-β-脱氧核苷(CNVK)的结构式；
图2是显示实施例1中实施的、使用LightCycler确认是否存在由光连接反应引起的野生型基因的PCR扩增抑制的结果的曲线图；
图3是显示实施例2中实施的、使用LightCycler确认是否存在由光连接反应引起的突变型基因的PCR扩增抑制的结果的曲线图；
图4是显示实施例4中实施的、通过琼脂糖凝胶电泳确认在PCR扩增反应时进行光连接反应的情况下是否存在突变型基因的选择性扩增的结果的图。泳道1为标志物(                                               
Figure DEST_PATH_IMAGE001
X174 HaeIII消化液)，泳道2为野生型，泳道3为突变型；
图5是显示实施例5中实施的、使用LightCycler确认作为对照的在PCR扩增反应时未进行光连接反应的情况下突变型基因的检测灵敏度的结果的曲线图；
图6是显示实施例5中实施的、使用LightCycler确认作为比较例的(在PCR扩增反应时未进行光连接反应) PNA-LNA Clamp PCR反应的突变型基因的检测灵敏度的结果的曲线图；
图7是显示实施例5中实施的、使用LightCycler确认在PCR扩增反应时进行光连接反应的情况下突变型基因的检测灵敏度的结果的曲线图。
具体实施方式
本发明中，关于DNA、RNA、核酸、基因、基因表达、编码、互补、模板、启动子、探针、引物、杂交、PCR等用语的定义，与目前分子生物学、遗传学、基因工程学等中通常广泛使用的用语意思相同。
本发明中，对核酸没有特别限定，只要是DNA或RNA、或后述的核苷酸类似物即可，可以是天然的核酸，也可以是合成的核酸。作为天然的核酸，例如有从生物中回收的基因组DNA、mRNA、tRNA、rRNA、hnRNA等。作为合成的核酸，有利用β-氰基乙基亚磷酰胺法、DNA固相合成法等公知的化学合成法合成的DNA、或利用PCR等公知的核酸扩增法合成的核酸、利用逆转录反应合成的cDNA等。
本发明中，“野生型核酸”是指发生突变之前的核酸，其典型的例子为：未发生突变、且包含具有本来的正常功能的遗传信息的核酸。这里所说的遗传信息不仅包括编码mRNA、tRNA、rRNA、snRNA等信息的转录区，还包括启动子等的基因表达所必需的调节区。
本发明中，“突变型核酸”是指发生了突变的核酸。“突变”是指DNA或RNA等的核酸序列的变化，遗传学等中使用的碱基取代(塩基置換)、插入、缺失、逆位、重复、易位等符合。在该突变型核酸中，突变所存在的区域不仅包括转录区，还包括启动子等的基因表达所必需的调节区。需要说明的是，通过突变，突变型核酸未必具有功能上的变化。另外，“突变”既包括先天的突变，也包括后天的突变。
本发明中，“靶位点”是指，核酸序列中作为包含光连接性核酸类的发夹探针的靶的位点，该位点具有与该发夹探针的全部或一部分杂交的核苷酸序列。
在通常的实施方案中，“靶位点”是指突变型核酸中发现突变的碱基所存在的位点，包括野生型核酸，而在本发明中是指作为检测目标的位点。例如，当存在碱基取代时，在野生型核酸、突变型核酸中均为该碱基取代了的碱基符合。当存在插入时，在突变型核酸中，被插入的碱基符合，在野生型基因中，突变型核酸中插入有碱基的位点符合。当存在缺失时，在突变型核酸中，通过缺失而失去了碱基的位点符合，在野生型核酸中，突变型核酸中失去的碱基符合。该靶位点的序列可以是显示出具有编码遗传信息的序列的链(以下称作有义链)的序列，也可以是显示出具有与有义链互补的序列的链(以下称作反义链)的序列。
本发明中，“核酸扩增反应”是指，利用公知的聚合酶反应进行的模板核酸的扩增反应。“核酸扩增装置”是指进行“核酸扩增反应”的装置。
本发明的扩增抑制方法是指，使用可以扩增包含靶位点的检测区的引物实施普通的核酸扩增法时，根据上述靶位点的突变，抑制一种核酸(例如野生型核酸)的扩增，而只选择性地扩增其以外的核酸(例如突变型核酸)的方法。
在本发明中，以野生型核酸或突变型核酸中的任一种作为扩增抑制的对象，或者根据其目的可以适当选择，没有特别限定，但是例如核酸样品中的存在比具有大的偏差时，通过抑制大量存在的核酸(例如野生型核酸)的扩增、而只选择性地扩增微量存在的核酸(例如突变型核酸)，可以检测是否有微量存在的核酸。
以下，关于本发明方法，主要基于本发明的一个方案、即检测是否存在突变型核酸的突变型核酸检测方法进行说明，如上所述，本发明方法的本质在于：使用可以扩增包含靶位点的检测区的引物，在实施普通的核酸扩增法时，基于上述靶位点的突变，只对一种核酸可以抑制其扩增。
作为本发明方法的第1实施方式，涉及突变型核酸检测方法，该方法是通过选择性地扩增包含突变型核酸的靶位点的检测区，来检测是否存在该突变型核酸，该方法包括下述步骤：
步骤(a)：使包含光连接性核酸类的发夹探针与核酸样品共存，使发夹探针与具有靶位点的野生型核酸分子特异性地形成杂交体，所述光连接性核酸类具有与具有野生型核酸的序列的靶位点互补的序列；
步骤(b)：对已形成杂交体的发夹探针和靶核酸分子进行光照射，使之进行光连接；
步骤(c)：将上述步骤(a)、(b)的反应产物供给核酸扩增反应；
步骤(d)：分析上述扩增产物。
作为本发明方法的第2实施方式，涉及突变型核酸检测方法，该方法是通过选择性地扩增包含突变型核酸的靶位点的检测区，来检测是否存在该突变型核酸，该方法包括下述步骤：
步骤(a)：使包含光连接性核酸类的发夹探针与核酸样品共存，使发夹探针与具有靶位点的野生型核酸分子特异性地形成杂交体，所述光连接性核酸类具有与具有野生型核酸的序列的靶位点互补的序列；
步骤(b)：对已形成杂交体的发夹探针和靶核酸分子进行光照射，使之进行光连接；
步骤(c)：在核酸扩增反应中进行上述步骤(a)、(b)；
步骤(d)：分析上述扩增产物。
通过上述步骤，抑制野生型核酸的扩增，选择性地扩增突变型核酸，从而可以高灵敏度地检测突变型核酸。
以下，对每一个步骤进行说明。需要说明的是，除步骤(c)以外，第1实施方式与第2实施方式相同，所以以下在主要按照第1实施方式进行说明后，关于第2实施方式，列举与第1实施方式的不同点进行说明。
在步骤(a)中，使包含光连接性核酸类的发夹探针与核酸样品共存，使发夹探针与具有野生型核酸序列的靶核酸分子特异性地形成杂交体，所述光连接性核酸类具有与具有野生型核酸的序列的靶位点互补的序列。该反应可以在适合形成杂交体的通常条件(温度、pH、盐浓度、缓冲液等)下进行，但通过在反应液中加入二甲基亚砜(DMSO)或甲酰胺等，还可以促进发夹探针与野生型核酸特异性地形成杂交体。但优选避免混入阻碍之后或同时进行的核酸扩增反应的物质。特别是与核酸扩增反应同时进行时，优选为适合核酸扩增反应的反应组成。
步骤(a)中使用的“核酸样品”，只要是含有核酸、且有可能含有包含靶位点的核酸的样品即可，没有特别限定，但优选有可能含有具有靶位点的野生型核酸或其突变型核酸的至少一种的样品，进一步优选为有可能含有上述两者的样品。例如，以血液或组织等作为样品，由样品中的全细胞得到的基因组DNA或RNA符合。该核酸的提取可以通过苯酚/氯仿法等公知的方法进行。此时，作为检测对象的靶核酸中的突变型的存在率没有限定。例如，可以100%为野生型，也可以50%为野生型、剩下的50%为突变型。另外，该核酸样品可以是由细胞得到的基因组DNA，也可以是由细胞制备的mRNA，还可以是以mRNA为模板进行逆转录反应得到的cDNA。而且，可以是将克隆化的多个基因进行人工混合得到的样品，还可以是通过核酸扩增反应人工扩增的核酸或它们的混合物。
作为本发明中可以使用的光连接性核酸类，只要是通过光连接可以与靶位点的核酸或靶位点附近的核酸交联即可。例如可以使用：补骨脂素衍生物(Chang, E.等人. Biochemistry 1991, 30, 8283)或氨基嘌呤衍生物(日本特开2001-206896)或4-硫尿嘧啶等。上述补骨脂素衍生物具有与作为5’-AT-3’的碱基序列的胸腺嘧啶进行特异性反应的性质，另外，氨基嘌呤衍生物虽然不存在序列依赖性，但却是胞苷特异性，因此适用范围存在一定的限制，所以更优选不存在上述限制的下述光连接性核酸类。
作为优选使用的第1光连接性核酸类，可以列举具有式I所表示的基团作为碱基部分的核酸类(Org. Lett., 第10卷, No. 15, 2008，日本特开2009-254279)：
[化学式1]
Figure 865353DEST_PATH_IMAGE002
(式中，Ra为氰基、酰胺基、羧基、C2～C7的烷氧基羰基或氢，R1和R2各自独立表示氰基、酰胺基、羧基、C2～C7的烷氧基羰基或氢)。当所结合的核酸为DNA时，如式I(a)所示，该式I所表示的取代咔唑基在β位与2-脱氧核糖的1位的碳原子(C)结合：
[化学式2]
Figure DEST_PATH_IMAGE003
作为具体例子，可以列举：3-氰基乙烯基咔唑-1’-β-脱氧核苷[3-cyanovinylcarbazole-1’-β-deoxyriboside (CNVK)]。
作为优选使用的第2光连接性核酸类，可以列举具有式II所表示的基团的核酸类(Organic & Biomolecular Chemistry 2007, 5, 2583、Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 15 (2005) 1299-1301，日本特开2005-348645)：
[化学式3]
Figure 720176DEST_PATH_IMAGE004
(式中，R为-CN、-CONR1R2或-COOR3，所述的R1～R3各自独立表示氢原子或烷基CnH2n+1 (n≧1)。这里，对n的上限没有特别限定，例如n为1～7，优选为1～5)。当所结合的核酸为DNA时，如式II(a)所示，该式II所表示的取代苯氧基在α位与2-脱氧核糖的1位碳原子(C)结合。优选R为-CN、-COOH、-COOMe的取代苯氧基，特别优选R为-COOH或-COOMe的取代苯氧基：
[化学式4]
Figure DEST_PATH_IMAGE005
。
通过具有上述式I或式II所表示的基团，可以成为具备光连接性的核酸类。该光连接性的赋予可能是DNA也可能是RNA，还可能是核苷酸类似物。上述光连接性核酸类可以根据通常的核酸制备方法进行制备。
步骤(a)中使用的“发夹探针”是指，具有与靶位点互补的序列、且包含上述光连接性核酸类的核酸类探针。该发夹探针可以包含具有上述式I和式II所表示的基团的光连接性核酸类，但优选包含具有式I所表示的基团的光连接性核酸类。该发夹探针可以是DNA也可以是RNA，还可以是核苷酸类似物。在本发明的突变型核酸检测方法中，其特征在于：该发夹探针所具有的光连接性核酸类为与野生型核酸的靶位点互补的序列。对该发夹探针的碱基序列和光连接性核酸类的位置或数目没有特别限定，只要与靶位点的一部分或全部进行特异性杂交即可。发夹探针的长度只要能够进行特异性杂交即可，没有特别限定，但例如优选为7碱基～30碱基。
上述“核苷酸类似物”是指非天然的核苷酸，其与作为天然核苷酸的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)具有相同的功能。即，核苷酸类似物与核苷酸一样，可以通过磷酸二酯键形成链，并且使用核苷酸类似物形成的引物或探针与只使用核苷酸形成的引物或探针一样，可用于PCR或杂交。作为这样的核苷酸类似物，例如有PNA (聚酰胺核苷酸衍生物)、LNA (BNA)、ENA (2’-O，4’-C-亚乙基-桥联核酸)以及它们的复合体等。这里，PNA是指，将DNA或RNA的由磷酸与5碳糖构成的主链取代成聚酰胺链的化合物。LNA (BNA)是指具有核糖核苷的2’位的氧原子和4’位的碳原子经由亚甲基结合而得到的两个环状结构的化合物。
关于步骤(a)中使用的发夹探针，不仅针对有义链、还可以针对反义链来制备使用。特别是在步骤(a)的核酸样品中的核酸为双链DNA时，通过同时使用针对两条链制备的发夹探针，使之与两条链的靶位点进行光连接，在之后的步骤(c)中可以增强野生型核酸的核酸扩增抑制效果。针对有义链和反义链的发夹探针，优选将光连接性核酸类导入到彼此的发夹探针之间不进行光连接的位置。
在步骤(b)中，通过对已形成杂交体的发夹探针和互补链的野生型核酸分子进行光照射，使之进行光连接。该光连接通过人工碱基部分的光反应，在光连接性核酸类分子与靶核酸分子之间形成并产生分子间的共价键，因此相当于分子间的交联。如此地形成交联的分子与分子不是只凭借简单的热稳定性而缔合，因此即使在被置于互补的双链发生解离的条件下时也不会解离，而是结合在一起。
步骤(b)中的光连接反应可以在包含具有缓冲作用的盐的反应溶液中进行。作为具有缓冲作用的盐，可以列举：卡可基酸盐、磷酸盐、Tris盐。具有缓冲作用的盐的浓度优选处于5～250mmol/L的范围。另外，优选包含碱金属和/或碱土金属的盐。作为碱金属和/或碱土金属，可以列举：氯化钠和氯化镁。通过进一步在反应液中加入DMSO或甲酰胺等有机溶剂，还可以促进发夹探针与野生型核酸的特异性光结合反应。但是，优选避免混入阻碍之后或同时进行的核酸扩增反应的物质。特别是与核酸扩增反应同时进行时，优选为适于核酸扩增反应的反应组成。
步骤(b)中的光照射通常优选包含350～380nm的范围、优选366nm的波长的光，特别优选为366nm的单波长的激光。在优选实施方案中，通过光照射进行的光反应优选进行1秒～数秒以内。但是，考虑到容器和溶液的透光性，还可以进一步花时间进行。
如上所述，步骤(b)中的光连接即使在普通的杂交体形成中互补的双链解离的条件下也可以维持结合，因此通过设置普通的互补链彼此之间结合和解离的温度循环，并在互补链彼此之间可以结合的温度下反复进行光照射，可以蓄积与发夹探针交联(连接)的互补链的野生型核酸分子。
步骤(a)、(b)中使用的核酸样品为mRNA等RNA时，可以与发夹探针进行光连接，之后进行cDNA合成并供给PCR等扩增反应，还可以通过一步PCR等进行基因扩增。另外，还可以进行cDNA合成，之后利用体外转录法进行RNA扩增。
步骤(a)、(b)中使用的核酸样品为cDNA等单链DNA时，可以与发夹探针进行光连接反应，之后供给PCR等扩增反应，还可以利用体外转录法进行RNA扩增。
步骤(a)、(b)中使用的核酸样品为染色体DNA等双链DNA时，可以在热变性或酸性条件等变性条件下处理该双链DNA的杂交，形成单链DNA，之后与上述单链DNA的情形同样地实施步骤(a)。
在步骤(c)中，以实施了光结合反应的核酸样品为模板，使用扩增引物进行核酸扩增法(例如PCR)，从而扩增包含靶位点的检测区。步骤(c)中使用的扩增引物可以是扩增包含突变型核酸的靶位点的检测区的引物，同时，其还可以是在与发夹探针进行光连接之前的野生型核酸中扩增包含野生型核酸的靶位点的检测区的引物。具有野生型序列的分子通过光照射与发夹探针交联(连接)，因此从已交联的碱基向3’末侧的伸长反应没有进行，不被扩增。另一方面，具有突变型序列的分子的大部分不与发夹探针交联(连接)，因此发生伸长反应，其结果，选择性的核酸扩增得以完成。
核酸扩增法为PCR时，步骤(c)中使用的扩增引物是通过PCR能够扩增包含1个或2个以上的靶核苷酸序列的核苷酸序列(扩增用核苷酸序列)的引物，是夹持扩增用核苷酸序列的两种引物。例如，可以是由具有与扩增用核苷酸序列的上游端区域相同的核苷酸序列的正向引物和具有与扩增用核苷酸序列的下游端区域互补的核苷酸序列的反向引物构成的两种引物。需要说明的是，PCR中使用的该两种引物的各浓度只要是可以得到作为PCR产物的双链核酸的浓度比即可，没有特别限定，但优选以相同浓度进行使用。
PCR中使用的这些引物，可以根据包含靶核苷酸序列的核苷酸序列的序列信息，利用常规方法进行设计、合成。
PCR中使用的这些引物由选自核苷酸和核苷酸类似物的一种以上通过磷酸二酯键连接而成。关于引物的长度，可以考虑引物的Tm值、扩增核苷酸序列的种类等适当确定，但优选由10个～100个分子连接而成。
可以按照常规用量使用通常使用的试剂，基于通常使用的操作规程，利用常规方法进行PCR。需要说明的是，PCR中使用的DNA聚合酶只要是通常PCR中使用的DNA聚合酶即可，没有特别限定，但优选为耐热性聚合酶。
通过光照射与靶分子交联，从而阻碍聚合酶的伸长反应，所以发夹探针自身不必对核酸酶活性具有抵抗性。因此，也可以使用具有核酸酶活性的聚合酶。但是，将起到引物的作用且能够发生聚合酶的伸长反应的核酸类用于发夹探针时，优选考虑Tm值，使其在发生聚合酶的伸长反应的温度下从靶分子上解离；或者通过修饰在发夹探针的3’末端阻碍伸长反应的物质，使其不能起到扩增引物的作用。
在步骤(d)中，作为分析步骤(c)的扩增产物的方法，可以列举下述公知的方法。例如，作为使用步骤(c)中得到的扩增产物的方法，当该扩增产物中所含的突变型核酸为已知的突变时，可以利用微列阵这样的基板测定来判定是否存在突变型核酸。当采用RFLP法时，存在下述情形：根据是否存在通过限制酶进行的消化，可以判定是否存在突变型核酸。或者，当认为靶位点存在未知的突变型核酸时，关于检测区的扩增产物，通过确定碱基序列，可以判定是否存在突变型核酸。
另一方面，例如，当想要判定的突变型核酸是已知的突变时，通过在步骤(c)中进行公知的实时PCR，还可以判定是否存在突变型核酸或者进行定量。如上所述，通过同时进行步骤(c)和步骤(d)，可以迅速且简便地判定是否存在突变型核酸，因此优选。作为通过实时PCR来同时实施突变型核酸的扩增和判定的方法，可以参考专利文献1。
接下来，关于第2实施方式，列举与第1实施方式的不同之处并加以说明。
与第1实施方式的不同之处在于：在步骤(c)的核酸扩增反应中进行步骤(a)和步骤(b)。具体而言，例如在进行PCR时，通过在靶分子和发夹探针能够形成杂交体的温度条件时(所谓的步骤(a))照射光，使靶核酸与发夹探针所具有的光连接核酸类结合(所谓的步骤(b))，直接且选择性地实施突变型核酸的扩增。
光的照射进行1次以上即可，但通过在每个扩增循环反复进行光照射，可以更确实地抑制野生型核酸的扩增，因此优选在每个PCR循环反复实施光照射。可以在所有的扩增循环均照射光，也可以从任意的扩增循环起开始或结束照射。
进行步骤(c)中的PCR反应时，也可以按照适合通常的PCR扩增反应的反应组成来实施。为了进一步促进突变型核酸的选择性扩增反应，还可以在反应液中加入DMSO或甲酰胺等对杂交条件产生影响的物质。
本发明的试剂盒包含发夹探针和引物，所述发夹探针包含具有与具有野生型核酸的序列的靶位点互补的序列的光连接性核酸类，所述引物扩增包含靶位点的检测区，该试剂盒通过选择性地扩增包含突变型核酸的靶位点的检测区，检测是否存在该突变型核酸。还可以进一步包含缓冲液或基因扩增用的聚合酶等。
本发明的装置是具有350～380nm范围的波长的光照射功能的核酸扩增装置。作为上述核酸扩增装置，只要可以实施本发明的反应、且具备公知的核酸扩增功能即可，可以优选使用可以定量已扩增的核酸的实时PCR装置等。这样的装置只要具备350～380nm范围的波长的光照射功能即可。
本发明的装置优选可以包含下述程序：
可以实施本发明的第1实施方式的步骤(a)～(c)的程序：
步骤(a)：使包含具有与靶位点互补的序列的光连接性核酸类的发夹探针与核酸样品共存，使发夹探针与具有靶位点的核酸分子特异性地形成杂交体；
步骤(b)：对已形成杂交体的发夹探针和靶核酸分子进行光照射，使之进行光连接；以及
步骤(c)：将上述步骤(a)、(b)的反应产物供给核酸扩增反应，和/或
可以实施本发明的第2实施方式的步骤(a)～(c)的程序：
步骤(a)：使包含具有与靶位点互补的序列的光连接性核酸类的发夹探针与核酸样品共存，使发夹探针与具有靶位点的核酸分子特异性地形成杂交体；
步骤(b)：对已形成杂交体的发夹探针和靶核酸分子进行光照射，使之进行光连接；以及
步骤(c)：在核酸扩增反应中进行上述步骤(a)、(b)。
实施例
以下，通过实施例来具体说明本发明，但这些实施例并不限定本发明的范围。
《实施例1》
验证针对野生型基因的PCR扩增抑制
(材料和方法)
1. 光连接性发夹探针的制备
以KRAS基因上的突变点Gly12和Gly13作为靶位点，设计与有义链互补的发夹探针，所述有义链与具有野生型序列的靶位点杂交。同时还设计针对反义链的发夹探针，将作为光应答性核酸的3-氰基乙烯基咔唑-1’-β-脱氧核苷(CNVK) (利用日本特开2009-254279记载的方法制备。从北陆先端大科学技术大学院大学、材料科学研究科、藤本研究室获取。)导入到彼此的发夹探针之间不发生光连接的位置进行制备。发夹探针的合成委托给FASMAC公司。上述发夹探针的序列见表1。另外，CNVK的结构式见图1。
[表1]
发夹探针名称 序列 备注
ODN09 GCCTACNVKGCCACCAGC 与野生型KRAS序列的有义链互补
ODN10 TTGGACNVKCTGGTGGCG 与野生型KRAS序列的反义链互补
2. 野生型KRAS基因片段的制备
利用常规方法由健康人的末梢血制备人基因组DNA，以其为模板，使用引物F1和R1，按照通常的PCR反应条件扩增包含突变点Gly12和Gly13的KRAS外显子2的区域。PCR反应中使用的引物序列如下：
F1：5’-AAAGGTACTGGTGGAGTATTTG-3’ (SEQ ID NO: 1)；
R1：5’-TGAAAATGGTCAGAGAAACC-3’ (SEQ ID NO: 2)。
按照附录的操作规程(protocol)，将所得的PCR扩增产物插入pGEMT easy载体(Promega)内进行克隆。将其作为野生型质粒。接下来，以该质粒为模板，使用上述引物组F1和R1，按照通常的PCR反应条件进行扩增，得到直链状的KRAS野生型基因片段。使用PCR纯化试剂盒(QIAGEN)进行纯化，之后在后续的实验中将其作为模板使用。
3. 发夹探针与野生型KRAS基因片段的光连接反应
向1.5mL的管中加入2μL 1nmol/L的野生型KRAS基因片段和各2μL的10μmol/L的野生型有义链用发夹探针(ODN09)和野生型反义链用发夹探针(ODN10)，以1×PCR缓冲液(10mmol/L的Tris-HCl (pH8.3)、50mmol/L的KCl、1.5mmol/L的MgCl2、0.001% (W/V)的明胶)的终浓度使总量达到20μL。另外，准备未添加两种ODN、且将其份量置换成灭菌水的样品。在加热至95℃的恒温加热器中加热处理3分钟，之后在加热至55℃的恒温加热器中静置3分钟，使用UV-LED照射5秒钟366nm的光。尚需说明的是，同时准备未照射366nm的光的样品作为对照。
4. 使用LightCycler确认PCR扩增反应
向上述的各20μL制备液中分别加入80μL灭菌水，充分混合，之后分别以其中的5μL为模板，利用引物NF1和NR1，使用LightCycler (LightCycler；Roche)进行PCR反应。PCR反应试剂中使用Light Cycler Fast Start DNA Master SYBER GreenI (Roche)。尚需说明的是，引物的序列如下：
NF1：5’-AACCTTATGTGTGACATGTTCTAA-3’ (SEQ ID NO: 3)；
NR1：5’-GTCCTGCACCAGTAATATGC-3’ (SEQ ID NO: 4)。
(结果、考察)
其结果见图2。曲线图的纵轴为荧光强度，横轴表示PCR的循环数。
比较添加ODN并进行了光照射的模板样品(4)和添加ODN而未进行光照射的模板样品(3)的扩增曲线时，进行了光照射的模板样品的CP (交叉)值增加。另外，将未添加ODN的模板样品的扩增曲线与进行了光照射的(2)或未进行光照射的(1)进行比较时，两者的CP值为相同程度，而且，将未进行光照射的模板样品的扩增曲线与添加了ODN的(3)或未添加ODN的(1)进行比较时，两者的CP值为相同程度。由此可知：仅凭单独实施ODN的添加或366nm的光照射，并不能抑制通过PCR进行的基因扩增反应，仅通过在ODN的存在下进行366nm的光照射即形成发夹，其结果，实现KRAS基因片段的扩增抑制。还确认到：在PCR反应前，通过针对模板分子形成发夹，可以抑制基因扩增，因此在通常的杂交体形成中，即使是发生解离的温度条件，一度结合的ODN和模板分子也不会解离，即处于非平衡状态。尚需说明的是，由CP值的相对比较可以推测：通过光连接反应，当初的模板量的约97%与ODN发生光连接。
《实施例2》
验证针对突变型基因的PCR扩增抑制
(材料和方法)
1. 突变型KRAS基因片段的制备
使用PrimeSTAR(注册商标)诱变Basal试剂盒(PrimeSTAR Mutagenesis Basal Kit) (TaKaRa Bio)，将Gly12Ser的突变导入到实施例1制备的野生型质粒中。即，利用该方法，使Kras基因的第34位的碱基“G”突变成“A”。将其作为突变型质粒。接下来，以该质粒为模板，使用实施例1之2中记载的引物组F1和R1，按照通常的PCR反应条件进行扩增，得到直链状的Kras突变型基因片段。使用PCR纯化试剂盒(PCR Purification Kit) (QIAGEN)进行纯化，之后在后续的实验中将其作为模板使用。
2. 发夹探针与突变型KRAS基因片段的光连接反应
向1.5mL的管中加入2μL 1nmol/L的突变型KRAS基因片段和各2μL的10μmol/L的ODN09和ODN10，以1×PCR缓冲液的终浓度使总量达到20μL。发夹探针的序列与实施例1中记载的序列相同。另外，在与实施例1之3相同的条件下进行光连接反应。尚需说明的是，准备未进行366nm的光照射的样品作为对照。
3. 使用LightCycler确认PCR扩增反应
与实施例1之4同样地实施。
(结果、考察)
其结果见图3。曲线图的纵轴为荧光强度，横轴表示PCR的循环数。
在ODN共存下进行了光照射的样品和未进行光照射的样品的CP值为相同程度，所以几乎没有确认到PCR扩增抑制。即，野生型序列的ODN几乎没有与突变型基因片段进行光连接，由此暗示：可以选择性地扩增突变型基因片段。
《实施例3》
突变型选择性核酸扩增的确认
(材料和方法)
1. KRAS野生型和突变型混合样品的制备
将实施例1和2中制备的KRAS野生型基因片段和突变型基因片段以99:1的比例进行混合，制备107拷贝/μL的KRAS基因混合样品。
2. 与发夹探针的光连接反应
向1.5mL的管中分别注入2μL所制备的混合样品，再分别加入各2μL的10μmol/L的ODN09和ODN10作为发夹探针，以1×PCR缓冲液的终浓度使总量达到20μL。尚需说明的是，发夹探针的序列与实施例1中记载的序列相同。另外，在与实施例1之3相同的条件下进行光连接反应。
3. 光连接反应后的PCR和PCR产物的克隆
向上述得到的20μL光连接反应液中加入80μL灭菌水，以其中的5μL为模板，利用实施例1之4中记载的引物NF1和NR1，在通常的条件下进行35个循环的PCR反应。按照附录的操作规程，将该PCR产物插入pGEMT easy载体(Promega)内进行克隆。转化到HB101感受态细胞(TaKaRa Bio)中，在LB氨苄青霉素板上培养一夜，形成大肠杆菌集落。
4. 通过确定碱基序列来确认野生型/突变型的混杂比
以100个集落为模板，使用利用了载体序列的引物M13F和M13R，在通常条件下进行PCR反应。以该PCR产物为模板，利用直接测序法确定各克隆的碱基序列。尚需说明的是，供给测序反应的引物为SP6和T7，测序反应试剂使用了BigDye终止子V1.1循环序列试剂盒(BigDye Terminator V1.1 cycle sequence Kit) (Applied Biosystems)。
各引物的碱基序列如下所示：
M13F：5’-CAGGGTTTTCCCAGTCACGA-3’ (SEQ ID NO: 5)；
M13R：5’-TCACACAGGAAACAGCTATG-3’ (SEQ ID NO: 6)；
SP6　：5’-ATTTAGGTGACACTATAGAA-3’ (SEQ ID NO: 7)；
T7　 ：5’-AATACGACTCACTATAGGG-3’ (SEQ ID NO: 8)。
(结果、考察)
确认到：光照射前的混杂比为野生型99/突变型1的样品，在光照射后上升至野生型87/突变型13。
《实施例4》
在PCR扩增反应时进行光连接的情况下突变型基因的选择性扩增的确认
(材料和方法)
1. PCR反应溶液的制备
作为基因扩增用反应液，制备并使用以下的PCR用反应液：
PCR缓冲液(10mmol/L的Tris-HCl (pH8.3)、50mmol/L的KCl、1.5mmol/L的MgCl2、0.001% (W/V)的明胶)；
200μmol/L的各dNTP (=dATP、dTTP、dCTP、dGTP)；
0.75U/μL的AmpliTaq Gold (Applied Biosystems公司)。
在上述基因扩增用反应液中，分别添加0.2μmol/L的NF1和NR1作为扩增引物。再分别添加0.4μmol/L的ODN09和ODN10作为发夹探针。尚需说明的是，扩增引物和发夹探针的序列与实施例1记载的序列相同。在该基因扩增用反应液中，将各1μL的100pmol/L的野生型KRAS基因片段和突变型KRAS基因片段添加到个别的管中作为模板，用于PCR反应。本反应中作为模板使用的基因片段相当于107拷贝。
2. 伴有光连接反应的PCR反应的实施
将上述反应溶液和模板基因片段装入0.2mL的PCR用管中，实施PCR。PCR反应在94℃、10分钟+(94℃、30秒/55℃、30秒/72℃、30秒)×35循环+72℃、3分钟的条件下实施。在所有的35个循环中，每次55℃、30秒的退火都使用UV-LED照射366nm的光5秒钟，形成发夹。对于PCR后的反应液，使用3%琼脂糖凝胶进行电泳，利用溴化乙锭进行染色后，使用透照仪进行扩增产物的确认。
(结果、考察)
其结果见图4。关于来自野生型基因片段的PCR扩增产物，电泳后利用溴化乙锭染色无法确认它的存在，但对于来自突变型基因片段的PCR扩增产物，可以确认它的存在。由此可知：利用野生型用发夹探针进行的光连接反应，识别单碱基替换等微量突变的存在，在针对野生型和突变型序列的PCR的核酸扩增量上产生差异。认为通过利用该具备高特异性的发夹探针，可以确立选择性地且高灵敏度地检测突变型的方法。
《实施例5》
在PCR扩增反应时进行光连接的情况下突变型基因的检测灵敏度的确认
(材料和方法)
1. 光连接性发夹探针的制备
以EGFR基因上的突变点Leu858作为靶位点，设计与有义链互补的发夹探针，所述有义链与具有野生型序列的靶位点杂交。同时还设计针对反义链的发夹探针，将实施例1中记载的光应答性核酸即CNVK导入到彼此的发夹探针之间不发生光连接的位置进行制备。发夹探针的合成委托给FASMAC公司。上述发夹探针的序列见表2。
[表2]
发夹探针名称 序列 备注
ODN11 CACNVKTTTGGCCAGCCC 与野生型EGFR序列的有义链互补
ODN12 GACNVKTTTGGGCTGGCCA 与野生型EGFR序列的反义链互补
2. EGFR外显子21区域中的野生型和突变型基因片段的制备
利用常规方法，由健康人的末梢血制备人基因组DNA，以其为模板，使用引物组EGFR外显子21F和EGFR外显子21R，利用通常的PCR反应条件扩增包含突变点Leu858的EGFR外显子21的区域。PCR反应中使用的引物序列如下：
EGFR外显子21F：5’-GCATGAACTACTTGGAGGAC-3’ (SEQ ID NO: 9)；
EGFR外显子21R：5’-ACCTAAAGCCACCTCCTTAC-3’ (SEQ ID NO: 10)。
按照附录的操作规程，将所得的PCR扩增产物插入pGEMT easy载体(Promega)内进行克隆。将其作为野生型质粒。接下来，使用PrimeSTAR (注册商标)诱变Basal试剂盒(TaKaRa Bio)，将Leu858Arg的突变导入到该野生型质粒中。即，利用该方法使EGFR基因的第2573位碱基“T”突变成“G”。将其作为突变型质粒。
以上述质粒为模板，使用上述引物组EGFR外显子21F和EGFR外显子21R，按照通常的PCR反应条件进行扩增，得到直链状的EGFR外显子21的野生型和突变型基因片段。使用PCR纯化试剂盒(QIAGEN)进行纯化。
使用NanoDrop分光光度计(NanoDrop spectrophtometer) (Thermo Scientific)测定已纯化的EGFR外显子21的野生型和突变型基因片段的重量浓度，考虑扩增片段的长度，算出各基因片段的拷贝数。如表3所示混合野生型和突变型的基因片段，在后续的实验中将其作为模板使用。
[表3]
野生型/突变型 样品a 样品b 样品c
混合量(拷贝数/4μL) 106/104 106/103 106/0
混合比 100:1 1000:1 1:0
3. 通过伴有光连接反应的PCR进行的扩增反应
按照与实施例4相同的组成制备基因扩增用反应液，向其中分别添加0.2μmol/L的EGFR外显子21NF和EGFR外显子21NR作为扩增引物。该引物序列如下：
EGFR外显子21NF：5’-CTTGGAGGACCGTCGCTTG-3’ (SEQ ID NO: 11)
EGFR外显子21NR：5’-CCACCTCCTTACTTTGCCTC-3’ (SEQ ID NO: 12)
再向基因扩增用反应液中分别添加0.4μmol/L的上述ODN11和ODN12作为发夹探针。
向0.2mL的PCR用管的个别的管中分别注入4μL各混合比的模板基因片段，再加入上述基因扩增用反应液，实施PCR。PCR反应在94℃、10分钟+(94℃、30秒/55℃、30秒/72℃、30秒)×35循环+72℃、3分钟的条件下实施。在所有的35个循环中，每次55℃、30秒的退火都使用UV-LED照射366nm的光5秒钟。尚需说明的是，同时准备未照射366nm的光的样品作为对照。
4. 使用LightCycler确认PCR反应的拷贝数
分取3. 项中得到的各PCR扩增产物的一部分，向其中加入灭菌水，制备稀释了100～100000倍的样品。分别以5μL的上述样品为模板，利用引物EGFR外显子21NF和EGFR外显子21NR，使用LightCycler (LightCycler；Roche)进行PCR反应。此时，准备野生型基因片段的稀释系列(拷贝数＝103～108)，以其为标准，同时供给PCR反应。PCR反应试剂中使用了Light Cycler Fast Start DNA Master SYBER GreenI (Roche)。
PCR反应后，由标准的扩增曲线制作标准曲线，再由各样品的CP值算出样品原液的拷贝数。根据该值，用灭菌水稀释调整3. 项中得到的各PCR扩增产物，使分别达到106拷贝/4μL。
5. 实时定量PCR用反应液的制备
作为实时定量PCR用反应液，混合以下的试剂进行制备。
向12.5μL 2×Premix Ex Taq (注册商标) (TaKaRa Bio)中分别添加5pmol的EGFR外显子21NF和EGFR外显子21NR作为扩增引物。再添加2.5pmol进行了末端荧光标记的突变检测探针。该突变检测探针的序列如下：
L858R检测探针：5’-(6-FAM)tttggccCgcccaa(BHQ1)-3’
这里，序列的小文字表示DNA，大文字C表示LNA，6-FAM表示荧光色素，BHQ1表示荧光抑制物质。该突变检测探针的合成委托给IDT公司。尚需说明的是，这里记载的本反应液的容量是每一个样品的容量，将其制备成必要量份(必要量分)。
6. PNA-LNA Clamp PCR用反应液的制备
向5. 项制备的实时定量PCR用反应液中添加12.5pmol的PNA(L858c)作为L858R用的发夹探针，作为PNA-LNA Clamp PCR用反应液。PNA(L858c)的序列如下：
PNA(L858c)：NH2-TTTGGCCAGCCCAA-CONH2
PNA(L858c)的合成委托给Panagene公司。
尚需说明的是，这里记载的本反应液的容量是每一个样品的容量，将其制备成必要量份。
7. 通过实时定量PCR确认突变型基因检测灵敏度
在5. 项制备的实时定量PCR反应液中，将3. 项中进行了366nm的光照射的PCR扩增产物按照4. 项记载的方法稀释调整成106拷贝/4μL，作为模板向每个孔中分别添加4μL。用灭菌蒸馏水调整使最终液量达到25μL，之后使用LightCycler LC480 (Roche)进行实时定量PCR。作为对照，按照4. 项记载的方法将3. 项中未进行366nm的光照射的PCR扩增产物稀释调整成106拷贝/4μL，也对其进行实时定量PCR。
另外，作为比较例，在6. 项制备的PNA-LNA Clamp PCR用反应液中，将3. 项中未进行366nm的光照射的PCR扩增产物按照4. 项记载的方法稀释调整成106拷贝/4μL，作为模板在个别的孔中分别添加4μL。用灭菌蒸馏水调整使最终液量达到25μL，之后同时进行实时定量PCR。尚需说明的是，本反应在95℃、10秒+(95℃、3秒/56℃、30秒)×45循环的条件下实施。
(结果、考察)
其结果见图5～图7。各曲线图的纵轴为荧光强度，横轴表示PCR的循环数。图5是PCR扩增反应时未实施光连接反应的样品(对照)，图6是对PCR扩增反应时未实施光连接反应的样品实施了PNA-LNA Clamp PCR反应的样品(比较例)，图7是实施了光连接反应的样品(本发明)。a～c表示各PCR反应的模板中使用的野生型基因与突变型基因的混合比。即，a为100:1、b为1000:1、c只有野生型基因。如图5所示，在未实施光连接反应也未实施PNA-LNA Clamp PCR反应的样品中，即使突变型基因的混杂量为1/100量(a)，也几乎看不到与单独的野生型基因(c)的信号(背景)的区别，无法检测突变型基因。在图6的进行了PNA-LNA Clamp PCR反应的样品中，突变型基因的混杂量为1/100量(a)时可以检测，但在1/1000量(b)时看不到与单独的野生型基因(c)的信号的区别。即，突变基因的检测灵敏度为1%。另一方面，在图7的通过366nm的光照射进行了光连接反应的样品中，即使突变型基因的混杂量为1/1000量(d)，也可以进行充分的检测，可以确认到0.1%的检测灵敏度。
由以上的结果可知：根据利用了光连接反应的本发明，即使EGFR的基因库中混杂的点突变基因的混杂比例为0.1%，也可以进行检测。若考虑到在DNA印迹或直接测序法等现有方法中可靠性高的检测灵敏度的界限为约10%、而作为比较例同时进行的PNA-LNA Clamp PCR法的本突变点的检测灵敏度为1%，则可以说本发明的突变基因检测方法具有非常高的检测灵敏度。
PNA-LNA Clamp PCR法是利用PNA (发夹探针)与LNA (突变检测探针)的竞争效果来提高突变检测灵敏度。即，同时进行发夹形成和检测反应，相对于此，利用光连接反应时，如本实施例所示，可以独立进行发夹形成和检测反应，即使是未利用竞争反应的普通实时定量PCR等，也可以进行高灵敏度的突变检测。如之前的实施例所示，通过使光连接性发夹探针与模板分子的结合处于非平衡状态，可以说使上述情形首次成为可能，显示出本发明的优越性。
产业实用性
根据本发明，可以兼具高特异性和灵敏度来检测野生型基因组中混杂的微量突变基因。通过以被认作是癌症的发病原因的已知突变或暗示与药效有关的已知突变为目标实施本发明，可以早期发现癌症或者通过药效评价进行个别化医疗。而且，根据本发明，还可以从只存在微量的突变型核酸分子的癌症患者的血液样品等中进行检测。迄今为止，只使用通过外科手术得到的癌症组织或活组织检查样品等侵袭性高的检查材料，因此可以进行现实中难以进行的疗效的确认或监测检查，在产业上有用。
以上，按照特定方式说明了本发明，但本领域技术人员所自明的变形或改良也包含在本发明的范围之内。
序列表自由文本
序列表的SEQ ID NO: 5～SEQ ID NO: 8的各碱基序列为引物序列。
Figure IDA00002897489300011
Figure IDA00002897489300021
Figure IDA00002897489300031

Claims (15)

1. 使具有靶位点的核酸、与包含具有与靶位点互补的序列的光连接性核酸类的发夹探针共存，通过光照射使该具有靶位点的核酸与该发夹探针进行光连接，抑制由核酸扩增法引起的包含靶位点的检测区的扩增的方法。
2. 突变型核酸的检测方法，该方法是通过选择性地扩增包含突变型核酸的靶位点的检测区，来检测是否存在该突变型核酸，该方法包括下述步骤：
步骤(a)：使包含光连接性核酸类的发夹探针与核酸样品共存，使发夹探针与具有靶位点的野生型核酸分子特异性地形成杂交体，所述光连接性核酸类具有与具有野生型核酸序列的靶位点互补的序列；
步骤(b)：对已形成杂交体的发夹探针和靶核酸分子进行光照射，使之进行光连接；
步骤(c)：将上述步骤(a)、(b)的反应产物供给核酸扩增反应；
步骤(d)：分析上述扩增产物。
3. 突变型核酸检测方法，该方法是通过选择性地扩增包含突变型核酸的靶位点的检测区，来检测是否存在该突变型核酸，该方法包括下述步骤：
步骤(a)：使包含光连接性核酸类的发夹探针与核酸样品共存，使发夹探针与具有靶位点的野生型核酸分子特异性地形成杂交体，所述光连接性核酸类具有与具有野生型核酸序列的靶位点互补的序列；
步骤(b)：对已形成杂交体的发夹探针和靶核酸分子进行光照射，使之进行光连接；
步骤(c)：在核酸扩增反应中进行上述步骤(a)、(b)；
步骤(d)：分析上述扩增产物。
4. 权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，上述核酸扩增法为PCR法。
5. 权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，上述核酸扩增法为实时PCR法。
6. 权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，上述发夹探针具有与靶核酸分子的有义链和/或反义链互补的序列。
7. 权利要求1～6中任一项所述的方法，其中，上述发夹探针的链长为7～30。
8. 权利要求1～7中任一项所述的方法，其中，上述光照射通过350～380nm范围的波长来进行。
9. 权利要求1～8中任一项所述的方法，其中，上述光照射在通常的互补链彼此之间结合和解离的温度循环中在互补链彼此之间可以结合的温度下进行1次以上。
10. 权利要求1～9中任一项所述的方法，其中，上述光照射通过赋予了350～380nm范围的波长的光照射功能的核酸扩增装置来进行。
11. 试剂盒，其中包含发夹探针和引物，所述发夹探针包含具有与靶位点互补的序列的光连接性核酸类，所述引物扩增包含靶位点的检测区，该试剂盒抑制由基因扩增法引起的包含靶位点的检测区的扩增。
12. 突变型核酸检测试剂盒，其中包含发夹探针和引物，所述发夹探针包含具有与具有野生型核酸序列的靶位点互补的序列的光连接性核酸类，所述引物扩增包含靶位点的检测区，该试剂盒通过选择性地扩增包含突变型核酸的靶位点的检测区，来检测是否存在该突变型核酸。
13. 核酸扩增装置，该装置具有350～380nm范围的波长的光照射功能。
14. 核酸扩增装置，该装置具有350～380nm范围的波长的光照射功能，该装置包括下述步骤：
步骤(a)：使发夹探针与核酸样品共存，使发夹探针与具有靶位点的核酸分子特异性地形成杂交体，所述发夹探针包含具有与靶位点互补的序列的光连接性核酸类；
步骤(b)：对已形成杂交体的发夹探针和靶核酸分子进行光照射，使之进行光连接；
步骤(c)：将上述步骤(a)、(b)的反应产物供给核酸扩增反应。
15. 核酸扩增装置，该装置具有350～380nm范围的波长的光照射功能，该装置包括下述步骤：
步骤(a)：使发夹探针与核酸样品共存，使发夹探针与具有靶位点的核酸分子特异性地形成杂交体，所述发夹探针包含具有与靶位点互补的序列的光连接性核酸类；
步骤(b)：对已形成杂交体的发夹探针和靶核酸分子进行光照射，使之进行光连接；
步骤(c)：在核酸扩增反应中进行上述步骤(a)、(b)。
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