WO2014014106A1 - 光応答性核酸類を含むプローブを用いた光連結方法 - Google Patents

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nucleic acids
photoresponsive
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宏武 若松
玲 柳原
寺崎　浩司
信剛 畚野
島津　光伸
健造 藤本
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三菱化学メディエンス株式会社
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    • C12Q2527/143—Concentration of primer or probe

Definitions

  • the present invention relates to a method for photoligation using a probe containing photoresponsive nucleic acids.
  • SNPs single nucleotide polymorphisms
  • the SNPs are already known to be useful in clarifying the relationship with various diseases and drug responses. It is also known that haplotype analysis using a plurality of SNPs is useful for analyzing disease susceptibility.
  • photoresponsive nucleic acids is disclosed as a particularly effective analysis technique replacing the above-described method.
  • the hybridized photoresponsive nucleic acids and the target nucleic acid can form a photoligation by irradiating with light of a specific wavelength. This photoligation is caused by the formation of a covalent bond between the photoresponsive nucleic acid molecule and the target nucleic acid molecule by the photoreaction of the artificial base moiety. Molecules and molecules that are photoligated in this way are not simply associated with thermal stability, so they can bind without dissociation even when they are subjected to conditions where the complementary duplex is dissociated. (Patent Document 1).
  • Patent Document 2 An analysis method for detecting a mutant gene is disclosed (Patent Document 2).
  • Patent Documents 1 and 2 disclose the identification of SNPs using photoresponsive nucleic acids, but photoligation occurs when a probe containing photoresponsive nucleic acids hybridizes with a target site having a complementary sequence. Based on this finding, only examples are disclosed where the use of photoresponsive nucleic acids is useful for selective amplification of mutant genes.
  • the photoligation it is necessary for the photoligation to hybridize a probe containing photoresponsive nucleic acids and a target site having a complementary sequence thereof. Since the responsive nucleic acids are formed by the binding of the target site or the target nucleic acid in the vicinity of the target site, the photoresponsive nucleic acids can only have a target sequence having a complementary sequence or a target nucleic acid sequence in the vicinity of the target site. It was thought not to combine.
  • a probe containing photoresponsive nucleic acids that is, a photoligation probe
  • the present inventors can only photoligate to a certain ratio regardless of the amount of the target nucleic acid, I found out that the optical connection would stagnate.
  • a probe containing photoresponsive nucleic acids is irradiated with light for photoligation with a target nucleic acid, so that the probe itself is within its own sequence. I found that it was optically coupled.
  • the photoresponsive nucleic acids in the probe and the base photocoupled with the photoresponsive nucleic acids associate and photocouple, the probe that cannot hybridize with the target site and / or cannot be photocoupled with the target nucleic acid is irradiated with light. It was estimated that it was accumulated in a time (energy) -dependent manner, and as a result, the photoligation to the target nucleic acid was stagnated.
  • the present inventors not only photocoupled to the target nucleic acid even when irradiated with light having a wavelength capable of photoligation (365 nm), but the probe photocoupled to the target nucleic acid It has been found that a part of the photocleavage reaction occurs due to a photocleavage reaction that does not occur. In other words, it was considered that the state of photoequilibrium in which the reaction of photoligation and the reaction of cleaving the photoligation occur in parallel is a factor that stagnates photoligation to the target nucleic acid.
  • An object of the present invention is to provide a method and kit for overcoming the problem of stagnant photoligation with a target nucleic acid using a probe containing photoresponsive nucleic acids and improving photoligation efficiency.
  • the present inventors have conducted photoligation within a self-sequence of a probe containing photoresponsive nucleic acids in a reaction solution in order to avoid stagnation of photoligation efficiency.
  • the hybridization is promoted by increasing the substantial concentration of the probe containing photoresponsive nucleic acids locally in the vicinity of the target site. It was found that can be improved.
  • the present invention relates to the following contents.
  • a target site present in a nucleic acid sample is hybridized with a first probe having a sequence complementary to the target site and containing photoresponsive nucleic acids in a reaction solution, A method of photoligation by irradiation, wherein self-association caused by the photoresponsive nucleic acids in the first probe is suppressed.
  • a method of photoligation by irradiation wherein self-association caused by the photoresponsive nucleic acids in the first probe is suppressed.
  • Suppressing self-association caused by the photoresponsive nucleic acids in the first probe by allowing a second probe having high complementarity to coexist with the first probe.
  • the optical coupling method according to [1] which is characterized.
  • the high complementarity means that the first probe and the second probe are complementary to each other, and the photoresponsive nucleic acid in the first probe under a predetermined photoligation condition
  • the photoligation method according to [1] or [2], wherein a base that is photoligated in the self of the species is hybridized with the second probe.
  • the photoligation method comprises photoligation between a target nucleic acid of a target site present in the nucleic acid sample and the photoresponsive nucleic acids of the first probe.
  • the optical connection method in any one of.
  • the first probe and the second probe include photoresponsive nucleic acids, and in the non-complementary region of the first probe and the second probe, the first probe and / or the The first probe and / or the third probe having a sequence complementary to the second probe is used so that the photoresponsive nucleic acids present in the second probe cannot be photoligated within itself. , [1] to [5].
  • a target site present in a nucleic acid sample a first probe having a sequence complementary to the target site and containing photoresponsive nucleic acids, and a sequence complementary to the target site
  • the fourth probe containing the target nucleic acid so as to be arranged adjacent to each other in the reaction solution, and the target nucleic acid present in the fourth probe and the first probe in the first probe by light irradiation.
  • the light according to [1] wherein the second probe having high complementarity is coexistent with the first probe, thereby suppressing light coupling within the self of the first probe. Consolidation method.
  • nucleic acid amplification method according to [14], wherein the presence or absence of the mutant nucleic acid is detected by selectively amplifying the nucleotide sequence for amplification including the target site of the mutant nucleic acid.
  • Nucleic acid detection method [16] A first probe containing photoresponsive nucleic acids having a sequence complementary to a target site in a nucleic acid sample, and a second probe having high complementarity to the first probe An optical coupling kit characterized by the above. [17] The photoligation kit according to [16], wherein the first probe is photoligated with a target nucleic acid at a target site in a nucleic acid sample.
  • the second probe is a photoresponsive The photoligation kit according to any one of [16] to [18], comprising a functional nucleic acid.
  • the first probe is obtained by replacing a nucleic acid that self-associates with photoresponsive nucleic acids in the probe with a nucleic acid that is not photoligated with the photoresponsive nucleic acids.
  • the present invention in the gene analysis method using photoresponsive nucleic acids, it is possible to improve the efficiency of photoligation between the target site and the probe containing the photoresponsive nucleic acids. That is, since it can be specifically and efficiently photoligated to a target nucleic acid, it is effective in a method for analyzing a target gene that requires high sensitivity and specificity.
  • FIG. 1 is a structural formula of 3-cyanovinylcarbazole (CNVK) which is an example of a photoresponsive nucleic acid.
  • FIG. 2 shows a light designed by inserting a part of exon 21 (ex.21) region on the EGFR gene as a target of photoligation and inserting CNVK, which is a photoresponsive nucleic acid, at a position close to the 5 ′ end. It is the result of having confirmed the sample which performed light irradiation of the light connection formation wavelength and light irradiation of the light connection cleavage wavelength by electrophoresis about a connection probe.
  • FIG. 21 3-cyanovinylcarbazole
  • FIG. 3 shows that a part of exon 21 (ex.21) region on the EGFR gene is a target for photoligation formation, and the insertion position of CNVK, which is a photoresponsive nucleic acid, is inserted closer to the center than the 5 ′ end. It is the result of having confirmed the sample which performed light irradiation of the light connection formation wavelength and light irradiation of the light connection cleavage wavelength by electrophoresis about the designed light connection probe.
  • FIG. 4 shows that a part of exon 21 (ex.21) region on the EGFR gene is a target for photoligation formation, and the insertion position of CNVK, which is a photoresponsive nucleic acid, is inserted closer to the center than the 3 ′ end.
  • FIG. 5 shows a light designed by inserting a part of exon 21 (ex.21) region on the EGFR gene into a photoligation target and inserting the insertion position of CNVK, which is a photoresponsive nucleic acid, at a position close to the 3 ′ end. It is the result of having confirmed the sample which performed light irradiation of the light connection formation wavelength and light irradiation of the light connection cleavage wavelength by electrophoresis about a connection probe.
  • FIG. 5 shows a light designed by inserting a part of exon 21 (ex.21) region on the EGFR gene into a photoligation target and inserting the insertion position of CNVK, which is a photoresponsive nucleic acid, at a position close to the 3 ′ end.
  • FIG. 6 shows the result of confirming by electrophoresis the sample that was irradiated with light at the photoligation-forming wavelength for a photoligation probe composed only of adenine (A) that is not a target nucleic acid of CNVK.
  • FIG. 7 shows the result of confirming by electrophoresis the sample subjected to light irradiation of the photoligation-forming wavelength for the photoligation probe composed only of guanine (G) which is not a target nucleic acid of CNVK.
  • G guanine
  • FIG. 8 shows the results of confirming by electrophoresis the sample that was irradiated with light at the photoligation-forming wavelength for a photoligation probe composed of only adenine (A) and guanine (G) that are not CNVK target nucleic acids.
  • FIG. 9 shows a photoligation probe designed with three mutations in the EGFR gene as target sites. Specifically, (1) has a nucleic acid sequence encoding 861st leucine (L861) as a target site, (2) has a nucleic acid sequence corresponding to 790th threonine (T790) as a target site, (3) FIG.
  • FIG. 5 is a view showing a photoligation probe designed for each of the sense strand and the antisense strand and their complementarity with the nucleic acid sequence corresponding to the 858th leucine (L858) as the target site.
  • FIG. 10 shows light irradiation at a photoligation-forming wavelength when a photoligation probe is designed for each of the sense strand and the antisense strand, using the nucleic acid sequence encoding the 861st leucine (L861) of the EGFR gene as a target site. It is the result of having confirmed the sample which performed light irradiation of the photoligation cleavage wavelength by electrophoresis.
  • FIG. 10 shows light irradiation at a photoligation-forming wavelength when a photoligation probe is designed for each of the sense strand and the antisense strand, using the nucleic acid sequence encoding the 861st leucine (L861) of the EGFR gene as a target site. It is
  • FIG. 11 shows light irradiation at a photoligation-forming wavelength when a photoligation probe is designed for each of the sense strand and the antisense strand with the nucleic acid sequence encoding the 790th threonine (T790) of the EGFR gene as a target site. It is the result of having confirmed the sample which performed light irradiation of the photoligation cleavage wavelength by electrophoresis.
  • FIG. 12 shows light irradiation at a photoligation-forming wavelength when a photoligation probe is designed for each of the sense strand and the antisense strand with the nucleic acid sequence encoding the 858th leucine (L858) of the EGFR gene as the target site.
  • FIG. 13 shows that when a photoligation probe is designed for each of the sense strand and the antisense strand with the nucleic acid sequence encoding the 790th threonine (T790) of the EGFR gene as a target site, the hybridization temperature is changed. It is a figure showing the optical connection formation efficiency at the time of carrying out optical connection formation.
  • T790 790th threonine
  • FIG. 14 shows polyacrylic acid as a hybridization accelerator when a photoligation probe is designed for each of the sense strand and the antisense strand with the nucleic acid sequence encoding the 790th threonine (T790) of the EGFR gene as the target site. It is a figure showing the photoligation formation efficiency at the time of adding an acid and making it hybridize at 4 degreeC and carrying out photoligation formation.
  • FIG. 15 shows polyacrylic acid as a hybridization accelerator when a photoligation probe is designed for each of the sense strand and the antisense strand with the nucleic acid sequence encoding the 790th threonine (T790) of the EGFR gene as the target site.
  • FIG. 16 is a diagram showing quantitative PCR measurement results when gene mutation detection is performed using a nucleic acid sequence encoding the 790th threonine (T790) of the EGFR gene as a target site.
  • FIG. 17 shows that a part of exon 21 (ex.21) region on the EGFR gene is a target for photoligation formation, and the insertion position of CNVK, which is a photoresponsive nucleic acid, is inserted at a position close to the 5 ′ end.
  • FIG. 18 shows Example 8-1 of EGFR gene. It is a figure showing the optical connection formation efficiency at the time of carrying out the optical connection formation of the optical connection probe designed in FIG.
  • FIG. 19 shows a photoligation probe designed for each of the sense strand and the antisense strand, with the nucleic acid sequence encoding the 861st leucine (L861) in the exon 21 (ex.21) region on the EGFR gene as a target site. It is the figure shown about the complementarity.
  • FIG. 20 shows Example 10-1 of the EGFR gene. It is a figure showing the optical connection formation efficiency at the time of carrying out the optical connection formation of the optical connection probe designed in FIG.
  • definitions of terms such as DNA, RNA, gene expression, code, template, promoter, primer, PCR, sequence, etc. are currently widely used in molecular biology, genetics, genetic engineering, etc. It has the same meaning as the term.
  • the nucleic acid is not particularly limited as long as it is DNA, RNA, or a nucleotide analog described later, and may be natural or synthesized.
  • natural nucleic acids include genomic DNA, mRNA, tRNA, rRNA, hnRNA and the like recovered from an organism.
  • synthesized nucleic acids DNA synthesized by a known chemical synthesis method such as ⁇ -cyanoethyl phosphoramidite method, DNA solid phase synthesis method, nucleic acid synthesized by a known nucleic acid amplification method such as PCR, Examples include cDNA synthesized by reverse transcription reaction.
  • the nucleic acid sample is not particularly limited as long as it is a sample containing a nucleic acid and may contain a target site.
  • genomic DNA or RNA obtained from all cells in the sample using blood or tissue as a sample is applicable.
  • the extraction of the nucleic acid can be performed by a known method such as a phenol / chloroform method. At this time, the presence rate of the mutant type in the nucleic acid sample does not matter.
  • the nucleic acid sample may be genomic DNA obtained from a cell, mRNA prepared from a cell, or cDNA obtained by performing a reverse transcription reaction using mRNA as a template. Also good. Furthermore, it may be a mixture of a number of cloned genes artificially, a nucleic acid artificially amplified by a nucleic acid amplification reaction, or a mixture thereof.
  • the wild-type nucleic acid means a nucleic acid before a mutation occurs, and a typical example thereof is a nucleic acid that does not have a mutation and includes genetic information having an original normal function.
  • genetic information includes not only a transcription region encoding information such as mRNA, tRNA, rRNA, snRNA, but also a regulatory region necessary for gene expression such as a promoter.
  • the mutant nucleic acid is a nucleic acid having a mutation. Mutations are changes in nucleic acid sequences such as DNA and RNA, and include base substitutions, insertions, deletions, inversions, duplications, translocations and the like used in genetics.
  • the region where the mutation is present includes not only a transcription region but also a regulatory region necessary for gene expression such as a promoter. It is not necessary for the mutant nucleic acid to have a functional change due to mutation. Mutations include innate and acquired ones.
  • a target site is a site where a probe hybridizes in a nucleic acid sequence present in a nucleic acid sample. It is not necessary for the probe to hybridize to contain photoresponsive nucleic acids, and hybridization between the nucleic acid sequence and the probe means to hybridize with all or part of the sequence.
  • the target nucleic acid means a site having a nucleic acid sequence to which photoresponsive nucleic acids are bonded and photoligated.
  • photoligation means that a probe containing photoresponsive nucleic acids and a target nucleic acid are covalently bonded. It is already known that there are a plurality of types of covalent bonds to be formed depending on the type of photoresponsive nucleic acids. However, it is assumed that all of them are included, particularly when a cross-link type covalent bond is formed, and ligation. Both include the formation of covalent bonds of the type.
  • the photoresponsive nucleic acid may have a property of reacting with light to form a covalent bond with other nucleic acids to be linked.
  • nucleic acids represented by formulas I to VII described later are used. be able to. All of the photoresponsive nucleic acids of formulas I to VII described below have the property of covalently binding to a pyrimidine base, but are not particularly limited as long as they are covalently bonded to the photoresponsive nucleic acids.
  • a base that forms a carbon-carbon double bond is a naturally occurring base
  • a sequence containing cytosine, thymine, uracil and the like can be preferably used as the target nucleic acid.
  • the target nucleic acid may be present in the target site, or may be designed and used so as to be present in a probe other than the photoligation probe used in the present invention.
  • the target site in the present invention is a site where a base in which mutation is found in the mutant nucleic acid is present, and is a site to be subjected to the gene analysis method in the present invention, including wild type nucleic acid.
  • a site to be subjected to the gene analysis method in the present invention including wild type nucleic acid.
  • both the wild-type nucleic acid and the mutant nucleic acid correspond to the base-substituted base.
  • the inserted base corresponds to the mutant nucleic acid
  • the site where the base is inserted into the mutant nucleic acid corresponds to the wild type gene.
  • the mutant nucleic acid corresponds to the site where the base is lost due to the deletion, and the wild-type nucleic acid corresponds to the base lost with the mutant nucleic acid.
  • the target site can be a final analysis target in the present invention.
  • it may indicate a strand having a sequence encoding genetic information (hereinafter referred to as a sense strand), or a strand having a sequence complementary to the sense strand (hereinafter referred to as an antisense strand). May be shown. It also includes nucleic acid sequence changes in sequences that are not directly related to genetic information.
  • the base sequence of the photoligation probe and the position and number of photoresponsive nucleic acids are not particularly limited as long as they can specifically hybridize with part or all of the target site.
  • the photoligation probe can be designed so that the target site matches the target site according to the situation such as the mutation site, the type of base, the length of the photoligation probe, etc.
  • a probe can be designed by setting a target site in the site. When the target site and the target site match, only a part of the site can be overlapped, or the entire site can be overlapped.
  • the photoresponsive nucleic acid that can be used in the present invention is not limited as long as it can be linked to the target nucleic acid by light irradiation.
  • psoralen derivatives Chang, E. et al. Biochemistry 1991, 30, 8283
  • aminopurine derivatives Japanese Patent Laid-Open No. 2001-206896
  • 4-thiouracil and the like can be used.
  • the psoralen derivative has the property of reacting specifically with a thymine having a base sequence of 5′-AT-3 ′, and the aminopurine derivative is cytidine-specific although it is not sequence-dependent. Because of certain limitations, the following photoresponsive nucleic acids without such limitations are more preferred.
  • the base moiety As the first photoresponsive nucleic acids that are preferably used, as the base moiety, (In the formula, Ra is a cyano group, an amide group, a carboxyl group, a C2-C7 alkoxycarbonyl group, or hydrogen, and R 1 and R 2 are each independently a cyano group, an amide group, a carboxyl group, A C2-C7 alkoxycarbonyl group or hydrogen) And nucleic acids having a group represented by the formula (Org. Lett., Vol. 10, No. 15, 2008, JP-A-2009-254279).
  • the substituted carbazolyl group represented by the formula I is represented by the formula I (a): As shown in the figure, it is bonded at the ⁇ -position to the carbon atom (C) at the 1-position of 2-deoxyribose.
  • a specific example is 3-cyanovinylcarbazole-1′- ⁇ -deoxyriboside [3-cyanovinylcarbazole-1′- ⁇ -deoxyriboside ( CNV K)].
  • the formula II (In the formula, R is —CN, —CONR 1 R 2 , or —COOR 3 , and R 1 to R 3 are each independently a hydrogen atom or an alkyl group C n H 2n + 1 (n ⁇ 1
  • the upper limit of n is not particularly limited, but, for example, n can be 1 to 7, and preferably 1 to 5.
  • the substituted phenoxy group represented by formula II is represented by formula II (a): As shown in the figure, it is bonded to the carbon atom (C) at the 1-position of 2-deoxyribose at the ⁇ -position.
  • R is preferably —CN, —COOH, or —COOMe, and particularly preferably —COOH or —COOMe.
  • nucleic acids having photoconnectivity can be obtained. This photoconnectivity can be imparted to DNA, RNA, or even a nucleotide analog. These photoresponsive nucleic acids can be produced according to the usual method for producing nucleic acids.
  • the photoresponsive nucleic acids have the following formula III as a base moiety:
  • Z represents O or NH
  • at least one of X and Y represents an electron-withdrawing group selected from the group consisting of a carboxyl group, a lower alkoxycarbonyl group, a substituted amide group and a cyano group.
  • X and Y represent a hydrogen atom).
  • alkyl group in the alkoxycarbonyl group include lower alkyl groups having 1 to 10, preferably 1 to 5 carbon atoms.
  • the substituents X and Y may be the same or different electron withdrawing groups at the same time, or only one of the substituents X and Y may be an electron withdrawing group and the other may be a hydrogen atom.
  • Z is O
  • X is a hydrogen atom
  • Y is a carboxyl group, a lower alkoxycarbonyl group, a substituted amide group or a cyano group.
  • Particularly preferred base moieties include 5-vinyl-2′-deoxyuridine and 5-carboxyvinyl-2′-deoxyuridine. In particular, 5-carboxyvinyl-2′-deoxyuridine is preferable.
  • the photoresponsive nucleic acids have the following formula IV as the base moiety: (In the formula IV, R 1 is a hydrogen atom, and at least one of R 2 and R 3 is a carboxyl group, a lower alkoxycarbonyl group, a lower alkenyl group, a lower alkynyl group, a substituted amide group, an amide group, a cyano group, A group selected from the group consisting of a group and a hydrogen atom, and the remaining groups of R 2 and R 3 represent a hydrogen atom or a cyano group.
  • a carboxyl group is preferable, and a combination of a carboxyl group and a hydrogen atom is preferable as a combination of R 2 and R 3 .
  • a lower alkoxycarbonyl group is preferable, and an alkyl moiety in the lower alkoxycarbonyl group has 1 to 10 carbon atoms, preferably 1 to 5 carbon atoms, more preferably 1 to 3 carbon atoms, and still more preferably 1
  • a lower alkyl having 1 to 2 carbon atoms, particularly preferably 1 is mentioned. That is, preferred examples of the lower alkoxycarbonyl group include a methoxycarbonyl group, an ethoxycarbonyl group, a propoxycarbonyl group, and a butoxycarbonyl group, and a methoxycarbonyl group, an ethoxycarbonyl group, and a propoxycarbonyl group are more preferable.
  • a methoxycarbonyl group and an ethoxycarbonyl group are more preferable, and a methoxycarbonyl group is particularly preferable.
  • a combination of a lower alkoxycarbonyl group and a hydrogen atom, particularly a combination of a methoxycarbonyl group and a hydrogen atom is preferred as the combination of R 2 and R 3 .
  • a lower alkenyl group is preferable, and the lower alkenyl group preferably has 2 to 10 carbon atoms, preferably 2 to 5 carbon atoms, more preferably 2 to 3 carbon atoms, and particularly preferably a carbon number. 2 lower alkenyl groups.
  • a combination of a lower alkenyl group and a hydrogen atom, particularly a combination of a vinyl group and a hydrogen atom is preferred as the combination of R 2 and R 3 .
  • a lower alkynyl group is preferable, and the lower alkynyl group has 2 to 10 carbon atoms, preferably 2 to 5 carbon atoms, more preferably 2 to 3 carbon atoms, and particularly preferably a carbon number. 2 lower alkenyl groups.
  • a combination of a lower alkynyl group and a hydrogen atom, particularly a combination of an ethynyl group and a hydrogen atom is preferable as the combination of R 2 and R 3 .
  • a substituted amide is preferable, and examples of the substituted amide include mono-substituted N-substituted amides, and preferable examples include N-alkyl amides and N-aminoalkyl amides. Can do. Such N-alkylamides and N-aminoalkylamides are those having 1 to 10 carbon atoms, preferably 1 to 5 carbon atoms, more preferably 1 to 3 carbon atoms, and particularly preferably 3 carbon atoms. N-aminoalkylamide is particularly preferred. A combination of a substituted amide and a hydrogen atom, particularly a combination of an N-amino (C1-C3 alkyl) amide and a hydrogen atom is preferred as the combination of R 2 and R 3 .
  • an amide group is preferable, and a combination of an amide group and a hydrogen atom is preferable as a combination of R 2 and R 3 .
  • a cyano group is preferable, and a combination of a cyano group and a cyano group, and a combination of a cyano group and a hydrogen atom are preferable as a combination of R 2 and R 3 .
  • a hydrogen atom is preferable, and a combination including at least one hydrogen atom and a combination of a hydrogen atom and a hydrogen atom are preferable as a combination of R 2 and R 3 .
  • the photoresponsive nucleic acids have the following formula V as the base moiety: (In the formula V, R 4 is a hydrogen atom or a lower alkyl group, and at least one of R 5 and R 6 is a carboxyl group, a lower alkoxycarbonyl group, a lower alkenyl group, a lower alkynyl group, a substituted amide group, A group selected from the group consisting of an amide group, a cyano group, and a hydrogen atom, and the remaining groups of R 5 and R 6 each represent a hydrogen atom or a cyano group.
  • R 4 a hydrogen atom is particularly preferable.
  • R 4 is preferably a lower alkyl group, and the lower alkyl group has 1 to 5 carbon atoms, preferably 1 to 3 carbon atoms, more preferably 1 to 2 carbon atoms, and particularly preferably 1 carbon atom.
  • Examples of such a lower alkyl group include a methyl group, an ethyl group, and a propyl group. A methyl group and an ethyl group are preferable, and a methyl group is particularly preferable.
  • a carboxyl group is preferable, and a combination of a carboxyl group and a hydrogen atom is preferable as a combination of R 5 and R 6 .
  • a lower alkoxycarbonyl group is preferable, and an alkyl moiety in the lower alkoxycarbonyl group has 1 to 10 carbon atoms, preferably 1 to 5 carbon atoms, more preferably 1 to 3 carbon atoms, and still more preferably 1
  • a lower alkyl having 1 to 2 carbon atoms, particularly preferably 1 is mentioned. That is, preferred examples of the lower alkoxycarbonyl group include a methoxycarbonyl group, an ethoxycarbonyl group, a propoxycarbonyl group, and a butoxycarbonyl group, and a methoxycarbonyl group, an ethoxycarbonyl group, and a propoxycarbonyl group are more preferable.
  • a methoxycarbonyl group and an ethoxycarbonyl group are more preferable, and a methoxycarbonyl group is particularly preferable.
  • a combination of a lower alkoxycarbonyl group and a hydrogen atom, particularly a combination of a methoxycarbonyl group and a hydrogen atom is preferable as the combination of R 5 and R 6 .
  • a lower alkenyl group is preferable, and the lower alkenyl group preferably has 2 to 10 carbon atoms, preferably 2 to 5 carbon atoms, more preferably 2 to 3 carbon atoms, and particularly preferably a carbon number. 2 lower alkenyl groups.
  • a combination of a lower alkenyl group and a hydrogen atom, particularly a combination of a vinyl group and a hydrogen atom is preferable as the combination of R 5 and R 6 .
  • a lower alkynyl group is preferable, and the lower alkynyl group has 2 to 10 carbon atoms, preferably 2 to 5 carbon atoms, more preferably 2 to 3 carbon atoms, and particularly preferably carbon number. 2 lower alkenyl groups.
  • a combination of a lower alkynyl group and a hydrogen atom, particularly a combination of an ethynyl group and a hydrogen atom is preferred as the combination of R 5 and R 6 .
  • a substituted amide is preferable, and examples of the substituted amide include monosubstituted N-substituted amides, and preferable examples include N-alkylamides and N-aminoalkylamides. Can do. Such N-alkylamides and N-aminoalkylamides are those having 1 to 10 carbon atoms, preferably 1 to 5 carbon atoms, more preferably 1 to 3 carbon atoms, and particularly preferably 3 carbon atoms. N-aminoalkylamide is particularly preferred. A combination of a substituted amide and a hydrogen atom, particularly a combination of an N-amino (C1-C3 alkyl) amide and a hydrogen atom is preferable as the combination of R 5 and R 6 .
  • an amide group is preferable, and a combination of an amide group and a hydrogen atom is preferable as a combination of R 5 and R 6 .
  • a cyano group is preferable, and a combination of a cyano group and a cyano group, and a combination of a cyano group and a hydrogen atom are preferable as a combination of R 5 and R 6 .
  • a hydrogen atom is preferable, and a combination including at least one hydrogen atom and a combination of a hydrogen atom and a hydrogen atom are preferable as a combination of R 5 and R 6 .
  • the photoresponsive nucleic acids have the following formula VI as the base moiety: (In the formula VI, R 7 is a hydrogen atom or a lower alkyl group, and at least one of R 8 and R 9 is a carboxyl group, a lower alkoxycarbonyl group, a lower alkenyl group, a lower alkynyl group, a substituted amide group, A group selected from the group consisting of an amide group, a cyano group and a hydrogen atom, and the remaining groups of R 8 and R 9 are a hydrogen atom or a cyano group.
  • R 7 a hydrogen atom is particularly preferable.
  • R 7 is preferably a lower alkyl group, and the lower alkyl group has 1 to 5 carbon atoms, preferably 1 to 3 carbon atoms, more preferably 1 to 2 carbon atoms, and particularly preferably 1 carbon atom.
  • Examples of such a lower alkyl group include a methyl group, an ethyl group, and a propyl group. A methyl group and an ethyl group are preferable, and a methyl group is particularly preferable.
  • a carboxyl group is preferable, and a combination of a carboxyl group and a hydrogen atom is preferable as a combination of R 8 and R 9 .
  • a lower alkoxycarbonyl group is preferable, and an alkyl moiety in the lower alkoxycarbonyl group has 1 to 10 carbon atoms, preferably 1 to 5 carbon atoms, more preferably 1 to 3 carbon atoms, and still more preferably 1
  • a lower alkyl having 1 to 2 carbon atoms, particularly preferably 1 is mentioned. That is, preferred examples of the lower alkoxycarbonyl group include a methoxycarbonyl group, an ethoxycarbonyl group, a propoxycarbonyl group, and a butoxycarbonyl group, and a methoxycarbonyl group, an ethoxycarbonyl group, and a propoxycarbonyl group are more preferable.
  • a methoxycarbonyl group and an ethoxycarbonyl group are more preferable, and a methoxycarbonyl group is particularly preferable.
  • a combination of a lower alkoxycarbonyl group and a hydrogen atom, particularly a combination of a methoxycarbonyl group and a hydrogen atom is preferable as the combination of R 8 and R 9 .
  • a lower alkenyl group is preferable, and the lower alkenyl group preferably has 2 to 10 carbon atoms, preferably 2 to 5 carbon atoms, more preferably 2 to 3 carbon atoms, and particularly preferably a carbon number. 2 lower alkenyl groups.
  • a combination of a lower alkenyl group and a hydrogen atom, particularly a combination of a vinyl group and a hydrogen atom is preferable as the combination of R 8 and R 9 .
  • a lower alkynyl group is preferable, and the lower alkynyl group has 2 to 10 carbon atoms, preferably 2 to 5 carbon atoms, more preferably 2 to 3 carbon atoms, and particularly preferably carbon number. 2 lower alkenyl groups.
  • a combination of a lower alkynyl group and a hydrogen atom, particularly a combination of an ethynyl group and a hydrogen atom is preferred as the combination of R 8 and R 9 .
  • a substituted amide is preferable, and examples of the substituted amide include mono-substituted N-substituted amides, and preferable examples include N-alkyl amides and N-aminoalkyl amides. Can do. Such N-alkylamides and N-aminoalkylamides are those having 1 to 10 carbon atoms, preferably 1 to 5 carbon atoms, more preferably 1 to 3 carbon atoms, and particularly preferably 3 carbon atoms. N-aminoalkylamide is particularly preferred. A combination of a substituted amide and a hydrogen atom, particularly a combination of an N-amino (C1-C3 alkyl) amide and a hydrogen atom is preferred as the combination of R 8 and R 9 .
  • an amide group is preferable, and a combination of an amide group and a hydrogen atom is preferable as a combination of R 8 and R 9 .
  • a cyano group is preferable, and a combination of a cyano group and a cyano group, and a combination of a cyano group and a hydrogen atom are preferable as a combination of R 8 and R 9 .
  • a hydrogen atom is preferable, and a combination including at least one hydrogen atom and a combination of a hydrogen atom and a hydrogen atom are preferable as a combination of R 8 and R 9 .
  • the photoresponsive nucleic acids have the following formula VII as the base moiety:
  • R 10 is a hydrogen atom or a lower alkyl group
  • at least one of R 11 and R 12 is a carboxyl group, a lower alkoxycarbonyl group, a lower alkenyl group, a lower alkynyl group, a substituted amide group
  • R 10 a hydrogen atom is particularly preferable.
  • R 10 is preferably a lower alkyl group, and the lower alkyl group has 1 to 5 carbon atoms, preferably 1 to 3 carbon atoms, more preferably 1 to 2 carbon atoms, and particularly preferably 1 carbon atom.
  • Examples of such a lower alkyl group include a methyl group, an ethyl group, and a propyl group. A methyl group and an ethyl group are preferable, and a methyl group is particularly preferable.
  • R 11 and R 12 As at least one of R 11 and R 12 , a carboxyl group is preferable, and a combination of a carboxyl group and a hydrogen atom is preferable as a combination of R 11 and R 12 .
  • a lower alkoxycarbonyl group is preferable, and an alkyl moiety in the lower alkoxycarbonyl group has 1 to 10 carbon atoms, preferably 1 to 5 carbon atoms, more preferably 1 to 3 carbon atoms, and still more preferably 1
  • a lower alkyl having 1 to 2 carbon atoms, particularly preferably 1 is mentioned. That is, preferred examples of the lower alkoxycarbonyl group include a methoxycarbonyl group, an ethoxycarbonyl group, a propoxycarbonyl group, and a butoxycarbonyl group, and a methoxycarbonyl group, an ethoxycarbonyl group, and a propoxycarbonyl group are more preferable.
  • a methoxycarbonyl group and an ethoxycarbonyl group are more preferable, and a methoxycarbonyl group is particularly preferable.
  • a combination of a lower alkoxycarbonyl group and a hydrogen atom, particularly a combination of a methoxycarbonyl group and a hydrogen atom is preferred as the combination of R 11 and R 12 .
  • a lower alkenyl group is preferable, and the lower alkenyl group preferably has 2 to 10 carbon atoms, preferably 2 to 5 carbon atoms, more preferably 2 to 3 carbon atoms, and particularly preferably a carbon number. 2 lower alkenyl groups.
  • a combination of a lower alkenyl group and a hydrogen atom, particularly a combination of a vinyl group and a hydrogen atom is preferred as the combination of R 11 and R 12 .
  • a lower alkynyl group is preferable, and the lower alkynyl group has 2 to 10 carbon atoms, preferably 2 to 5 carbon atoms, more preferably 2 to 3 carbon atoms, and particularly preferably carbon number. 2 lower alkenyl groups.
  • a combination of a lower alkynyl group and a hydrogen atom, particularly a combination of an ethynyl group and a hydrogen atom is preferable as the combination of R 11 and R 12 .
  • a substituted amide is preferable, and examples of the substituted amide include monosubstituted N-substituted amides, and preferable examples include N-alkylamides and N-aminoalkylamides. Can do. Such N-alkylamides and N-aminoalkylamides are those having 1 to 10 carbon atoms, preferably 1 to 5 carbon atoms, more preferably 1 to 3 carbon atoms, and particularly preferably 3 carbon atoms. N-aminoalkylamide is particularly preferred. A combination of a substituted amide and a hydrogen atom, particularly a combination of an N-amino (C1-C3 alkyl) amide and a hydrogen atom is preferred as the combination of R 11 and R 12 .
  • an amide group is preferable, and a combination of an amide group and a hydrogen atom is preferable as a combination of R 11 and R 12 .
  • a cyano group is preferable, and a combination of a cyano group and a cyano group, and a combination of a cyano group and a hydrogen atom are preferable as a combination of R 11 and R 12 .
  • a hydrogen atom is preferable, and a combination including at least one hydrogen atom and a combination of a hydrogen atom and a hydrogen atom are preferable as a combination of R 11 and R 12 .
  • Suitable structural formulas for such a base are exemplified below.
  • the base that can be used in the present invention is not limited to the following examples.
  • the probe means a known polymer having two or more nucleoside subunits or nucleobase subunits bonded together, and includes DNA and / or RNA or an analog thereof.
  • An analog is a non-natural nucleotide and has the same function as deoxyribonucleotide (DNA) or ribonucleotide (RNA), which are natural nucleotides. That is, nucleotide analogs can form chains by phosphodiester bonds in the same way as nucleotides, and primers and probes formed using nucleotide analogs are primers and probes formed using only nucleotides. Similarly, it can be used for PCR and hybridization.
  • DNA deoxyribonucleotide
  • RNA ribonucleotide
  • nucleotide analogs examples include PNA (polyamide nucleotide derivatives), LNA (BNA), ENA (2'-O, 4'-C-Ethylene-bridged nucleic acids), and complexes thereof.
  • PNA polyamide nucleotide derivatives
  • LNA BNA
  • ENA 2'-O, 4'-C-Ethylene-bridged nucleic acids
  • complexes thereof PNA is obtained by substituting a main chain composed of phosphoric acid and pentose of DNA or RNA with a polyamide chain.
  • LNA is a compound having two cyclic structures in which an oxygen atom at the 2 'site of a ribonucleoside and a carbon atom at the 4' site are bonded via methylene.
  • any probe may be used as long as the probe is complementary to the target site under hybridization assay conditions and can be stably hybridized.
  • the complementary sequence means having a base sequence capable of forming a stable hydrogen bond under hybridization conditions, and perfect match between the nucleic acids of each probe is not required.
  • the probe containing the photoresponsive nucleic acids of the present invention is a probe containing at least one photoresponsive nucleic acid in the probe, and the probe containing the photoresponsive nucleic acids is: It has a sequence complementary to the target site.
  • the first probe (hereinafter sometimes referred to as a photoligation probe) refers to a nucleic acid probe having a sequence complementary to a target site and containing the photoresponsive nucleic acids.
  • the photoligation probe only needs to contain photoresponsive nucleic acids having groups represented by the above formulas I to VII.
  • the photoligation method of the present invention comprises a target site existing in a nucleic acid sample and a first probe having a sequence complementary to the target site and containing photoresponsive nucleic acids in a reaction solution.
  • the first probe suppresses self-association (that is, photoligation within the self) caused by the photoresponsive nucleic acids.
  • a target site in a nucleic acid sample and a first probe containing photoresponsive nucleic acids having a sequence complementary to the target site in a reaction solution In the cross-linking type photoligation method in which the target nucleic acid existing in the target site and the photoresponsive nucleic acid in the first probe are photoligated by hybridization and light irradiation, An optical coupling method that suppresses optical coupling within the self of the first probe by coexisting a second probe having high complementarity with one probe can be mentioned.
  • the first probe self-associates and The formation of the next structure is prevented, and the light coupling within the self of the first probe due to light irradiation is suppressed.
  • the unreacted first probe that was not photocoupled with the target nucleic acid present in the target site maintains the photoligation ability, it is possible to continue light irradiation for a long time, or to perform denaturation or annealing.
  • Light connection efficiency can be improved by repeating light irradiation a plurality of times in the temperature control cycle.
  • the high complementarity means that the first probe containing the photoresponsive nucleic acids and the second probe are in a complementary relationship with each other, and are in the first probe under predetermined photoligation conditions.
  • the second probe may be in a completely complementary relationship, and is preferably complementary to the first probe. However, if the second probe can hybridize with the first probe under predetermined photoligation conditions, the second probe is completely complementary.
  • This complementary relationship is not necessarily required. For example, when a location involved in self-photoligation is identified among nucleic acid bases constituting the first probe from information such as the sequence type or length of the first probe, the relevant location The bases other than the bases are not necessarily complementary.
  • the photoresponsive nucleic acids in the first probe are photoligated with the target nucleic acid in the target site, naturally the photoresponsive nucleic acids do not photocouple with the second probe. It is necessary to design to. Therefore, it is also preferable to design the second probe so as not to inhibit photoligation of the photoresponsive nucleic acids with the target nucleic acid.
  • the second probe can be designed not to lose the binding ability of the photoresponsive nucleic acids while suppressing the self-association of the first probe containing the photoresponsive nucleic acids by hybridization. Can be mentioned.
  • the bases to which photoresponsive nucleic acids can be photoligated are known or can be identified by those skilled in the art without trial and error.
  • the photoresponsive nucleic acids represented by Formula I or II are known to be photoligated with pyrimidine bases such as cytosine, thymine, and uracil
  • the second probe is a pyrimidine base within the first probe. It can be designed and used to be a complementary sequence. Note that the second probe does not have to be complementary to all bases in which the photoresponsive nucleic acids in the first probe can be photocoupled within itself, and at least a predetermined photoligation It is sufficient that the photoresponsive nucleic acids in the first probe are complementary to a base that is photoligated within itself under conditions.
  • the second probe requires a continuous base in order to hybridize to the first probe, the second probe is It is self-evident that the photoresponsive nucleic acids in the first probe require complementation other than the bases of the nucleic acids that are photoligated within themselves.
  • the second probe can suppress photoligation within the first probe itself as a single continuous sequence, and photoresponsive nucleic acids present in the first probe can be photoligated. It can also be used as a plurality of non-contiguous sequences having complementarity with other nucleic acids.
  • a person skilled in the art can use either a single sequence or a plurality of non-consecutive sequences in accordance with a known method and considering the base sequence and chain length that can be hybridized according to the analysis method and photoligation conditions. It is possible to design and use as appropriate.
  • the photoresponsive nucleic acids can be arranged near the center of the probe containing the photoresponsive nucleic acids, but can also be arranged on the terminal side of the first probe.
  • the chain length of the first probe that can be used is limited in the analysis system to be used (for example, the minimum chain length that can be hybridized)
  • the photoresponsive nucleic acids are placed on the terminal side of the first probe.
  • the second probe can be designed to stably hybridize with the first probe.
  • photoresponsive nucleic acids By placing photoresponsive nucleic acids at the ends, it becomes insufficient to bring the distance from the nucleic acid that photolinks the terminal bases by hybridization due to steric hindrance of the photoresponsive nucleic acids.
  • the probe has no complementary sequence other than the target site, and a complementary sequence in the probe is used to prevent the probe from forming a secondary structure in the self sequence.
  • a complementary sequence in the probe is used to prevent the probe from forming a secondary structure in the self sequence.
  • the first probe having a sequence complementary to the target site and complementary to the first probe that is in a competitive relationship with the target site with respect to the first probe containing photoresponsive nucleic acids. It is an unexpected effect that the optical coupling efficiency could be improved by using the second probe having high performance.
  • a person skilled in the art can appropriately select and use a known method as to whether or not the first probe containing the photoresponsive nucleic acids can be photocoupled within itself. For example, it is possible to predict the secondary structure of the photoligation probe from the calculation of base adjacency or calculation of the free energy of a given structure using software, and select the nucleic acid involved in self-photoligation. is there. Further, as in the embodiments described later, it is possible to examine whether or not to perform optical coupling within itself under predetermined optical coupling conditions.
  • photoresponsive nucleic acids can be included in the second probe, the function of suppressing self-association as the second probe, and photoligation as the first probe (photocoupled probe) containing the photoresponsive nucleic acids. It can also be designed and used so that it has the function to do.
  • a probe containing photoresponsive nucleic acids may be referred to as a first probe when it exhibits an action of photoligation, and may be referred to as a second probe when it exhibits an action of suppressing self-association.
  • the antisense strand probe is the second when the sense strand probe is the first probe.
  • the sense strand probe functions as the second probe.
  • the second probe can be cross-linked photoligated with the target nucleic acid of the antisense strand of the target site.
  • the method of suppressing self-association is not limited to the above method, and the optical coupling method of the present invention can be appropriately modified and used in various analysis methods.
  • the photoresponsive nucleic acid when the sequence is single-stranded (for example, mRNA or the like), the photoresponsive nucleic acid may be contained in at least the first probe, but when the target site is double-stranded (for example, dsDNA or the like)
  • the photoresponsive nucleic acids are preferably contained not only in the first probe but also in the second probe.
  • both the sense strand and the antisense strand of the wild type sequence It is possible to detect and identify a mutant sequence with higher sensitivity by photoligating to.
  • the third probe can be designed and used in the same manner as the second probe.
  • a target site in a nucleic acid sample, a first probe containing photoresponsive nucleic acids having a sequence complementary to the target site, and the target site A target nucleic acid present in the fourth probe by hybridization with a fourth probe having a sequence complementary to the target and containing the target nucleic acid so as to be arranged adjacent to each other in the reaction solution and irradiating with light
  • a second probe having high complementarity is allowed to coexist with the first probe.
  • a second probe having a sequence complementary to the first probe By using a second probe having a sequence complementary to the first probe, it binds to a base existing at the end opposite to the end into which the photoresponsive nucleic acids are inserted, and within the self-sequence. It is also possible to suppress the meeting.
  • the method described in WO 2007/058326 can be incorporated into the present application and used.
  • a person skilled in the art can easily implement the second aspect by appropriately modifying the first aspect of the optical coupling method of the present invention except that the optical coupling method is the ligation type. it can.
  • the first probe has photoresponsive nucleic acids at its 3 ′ end or 5 ′ end, and the above-mentioned first probe is present at the target site.
  • the photoresponsive nucleic acids and the pyrimidine base in the first probe are prevented from associating and photoligating when they are closer to each other in a spatial arrangement. Usage is also possible.
  • the ligation type optical coupling method will be described in detail below.
  • the first probe containing the photoresponsive nucleic acids and the fourth probe containing the target nucleic acid are arranged so as to be adjacently hybridized at a predetermined target site and can be photoligated by light irradiation.
  • the photoresponsive nucleic acids and the target nucleic acid are arranged adjacent to each other.
  • the photoresponsive nucleic acids are preferably designed so as to be located at the end of the first probe.
  • the fourth probe is preferably designed so that the end adjacent to the first probe is a target nucleic acid that can be photoligated.
  • first probe and the fourth probe are close to each other with no gap of one base, and can form a continuous single nucleic acid sequence linked by photoligation when both probes are irradiated with light. Is preferred.
  • the first probe containing photoresponsive nucleic acids and the fourth probe containing the target nucleic acid are linked by light irradiation to generate a base sequence complementary to the base sequence of a more stable target site. To do.
  • CVU 5-carboxyvinyl-2′-deoxyuridine
  • this CVU is photoligated with a pyrimidine base that is a target nucleic acid. And forms a carbon-carbon double bond with the base moiety of thymine.
  • the nucleic acid sequence to be detected that is the target site, the first probe containing the CVU, and the fourth probe containing the target nucleic acid are mixed and hybridized. Then, according to the complementarity of the base sequence, the first probe and the fourth probe are aligned adjacent to each other so that they can be photoligated to the target site. When light irradiation is performed in this state, it is photocoupled by a photoreaction, and CVU and the pyrimidine base that is the target nucleic acid are covalently linked to one.
  • photoresponsive nucleic acids that can be photocoupled at the respective terminal sides of the first probe and the fourth probe may be used.
  • responsive nucleic acids compounds represented by the formulas III to VII can be used.
  • the first embodiment or the second embodiment can be carried out independently, but the second embodiment can be carried out in combination with the first embodiment.
  • a method in which a first probe containing photoresponsive nucleic acids performs cross-link photoligation and a second probe containing photoresponsive nucleic acids performs ligation photoligation, or photoresponsive nucleic acid examples include a method in which a first probe including a ligation type photoligation and a second probe including a photoresponsive nucleic acid performs a crosslink type photoligation.
  • the photoligation probe self-associates with the photoresponsive nucleic acid in the photoligation probe under predetermined photoligation conditions as long as hybridization with the target site is possible. It is also possible to design the photoligation probe in which the nucleic acid to be replaced is replaced with a nucleic acid that is not photoligated with the photoresponsive nucleic acids, and to suppress photoligation within itself. In addition, in order to prevent the sense strand probe and the antisense strand probe from being photocoupled between the probes, the probe is designed by substituting with a nucleic acid that is not photocoupled to the photoresponsive nucleic acids, thereby suppressing photoligation between the probes. It can also be made.
  • the photoresponsive nucleic acid when the photoresponsive nucleic acid is CNVK, it can be carried out by substituting a pyrimidine base with a purine base such as adenine, guanine or inosine.
  • a pyrimidine base with a purine base such as adenine, guanine or inosine.
  • the number of bases to be substituted can be appropriately set according to the number of pyrimidine bases present in the target site or probe.
  • a synthetic base obtained by artificially converting a pyrimidine ring of cytosine or thymine, which is a base that can be photoligated can also be used.
  • synthetic bases that can be used in this case include, for example, 5-azo-thymine, 6-azo-thymine, 5-azo-cytosine, and 6-azo-cytosine in which the carbon at the 5- or 6-position of the pyrimidine ring is substituted with nitrogen.
  • the third aspect can be carried out alone, but can also be carried out in combination with the first aspect and / or the second aspect.
  • a person skilled in the art considers the base such as which base the photoresponsive nucleic acids used from known information are targeted and what kind of chemical reaction mechanism is used for photoligation, and determines the target base. Substitution or modification can be performed on the base, and a synthetic base can be used as appropriate.
  • the photoligation method of the present invention can be performed in a reaction solution containing a salt having a buffering action.
  • the salt having a buffering action include cacodylate, phosphate, and tris salt.
  • the concentration of the salt having a buffering action is preferably in the range of 5 to 250 mmol / L. Further, it preferably contains an alkali metal and / or alkaline earth metal salt. Examples of the alkali metal and / or alkaline earth metal include sodium chloride and magnesium chloride.
  • an organic solvent such as DMSO or formamide
  • a specific photobinding reaction between the probe containing the photoresponsive nucleic acids and the target site can be promoted. However, it is preferable to avoid contamination with substances that inhibit the gene analysis method performed thereafter or simultaneously.
  • the reaction composition is preferably suitable for the nucleic acid amplification reaction.
  • the light irradiation in the optical coupling method of the present invention is generally a light having a wavelength in the range of 350 to 380 nm, preferably a wavelength of 365 nm, particularly preferably a single wavelength laser beam of 365 nm.
  • the photoreaction by light irradiation is preferably within 1 second to several seconds. However, it can be performed over a longer time in consideration of the light transmittance of the container and the solution.
  • the light irradiation may be performed once or more, but the light coupling efficiency can be increased by repeating the light irradiation a plurality of times.
  • a person skilled in the art can select and implement appropriately according to the gene analysis method to be used. For example, amplification of wild-type nucleic acid can be more reliably suppressed by repeating light irradiation for each amplification cycle in the PCR method.
  • Light may be irradiated in the entire amplification cycle, or irradiation may be started or ended from any amplification cycle.
  • the association between the probe and the target site can be efficiently and rapidly increased by locally increasing the probe concentration. Can be improved.
  • nucleic acid is negatively charged in the reaction solution
  • an anionic substance can locally increase the substantial density and improve the photoligation efficiency.
  • Negatively charged substances such as anionic substances can promote hybridization and enhance the photoligation effect compared to non-charged nonionic polymers such as polyethylene glycol and dextran.
  • a known anionic substance can be used, and for example, polyacrylic acid, polymethacrylic acid, or a salt thereof can be used.
  • the anionic substance only needs to be present in the reaction solution in which photoligation is performed.
  • the anionic substance should be selected so as not to affect reactions other than photoligation. If it is a trader, an appropriate concentration range can be appropriately determined after examination.
  • the polyacrylate is preferably in the range of about 0.2 to 10% (expressed in terms of weight percentage (w / v) relative to the capacity, the same shall apply hereinafter), and more preferably about 0.5 to 5%.
  • polymethacrylate it is preferably in the range of about 1.0 to 50%, more preferably about 5 to 25%.
  • the molecular weight of these polymers varies over a wide range, but is preferably about 5,000 to 100,000 daltons, and more preferably about 5,000 to 10,000 daltons.
  • various equivalent acrylate polymers and various homopolymers and copolymers of acrylate, which have hybridization promoting properties. Compounds that are expected to have can be used.
  • the efficiency of optical coupling can be improved by efficiently and speeding up the association between the optical coupling probe and the target site.
  • the photoligation efficiency can be improved by increasing the concentration of the photoligation probe containing photoresponsive nucleic acids regardless of the abundance of the nucleic acid sequence containing the target site in the nucleic acid sample.
  • the probe concentration at the time of photoligation is preferably about 0.1 ⁇ mol / L or more, more preferably about 1 ⁇ mol / L or more, and most preferably about 10 ⁇ mol / L or more.
  • the photoligation probe containing photoresponsive nucleic acids suppresses photoligation within the self-sequence, or the concentration of the photoligation probe is locally increased to effectively hybridize with the target site. As a result, the optical coupling efficiency can be improved.
  • the photoligation method in the present invention can be used in a known gene analysis method for analyzing a target gene in a nucleic acid sample. It is within the scope of design changes for those skilled in the art to include not only the presence or absence of the gene of interest and its sequence, but also purification and selective recovery of the gene. Examples of the purification and selective recovery include purification of the gene and a pretreatment step of selectively collecting a nucleic acid containing a target nucleic acid in a nucleic acid sample. Use in these pretreatment steps is extremely effective in the gene analysis method described below. Therefore, it is possible to achieve highly sensitive and accurate analysis in the gene analysis method and gene detection method that are carried out after the pretreatment, which is preferable.
  • gene analysis methods that can be used in the present invention
  • known gene detection methods, nucleic acid amplification methods, and the like can be used.
  • Various methods are known as a gene detection method and a nucleic acid amplification method.
  • the MALDI-TOF / MS method, NanoChip method and the like can be cited as methods for rapid and high-throughput analysis.
  • the nucleotide sequence of the amplified product in the detection region is determined to determine the mutant nucleic acid. The presence or absence of can be determined.
  • a fluorescently labeled photoligation probe complementary to a target site and containing photoresponsive nucleic acids is hybridized, and the target nucleic acid and the photoligation probe are irradiated by light irradiation.
  • a person skilled in the art can implement the photoligation method of the present invention by appropriately changing according to the purpose of gene analysis, and can be easily used for a known gene detection method.
  • the nucleic acid amplification method refers to a template nucleic acid amplification reaction using a known polymerase reaction.
  • a known polymerase reaction for example, in the known nucleic acid amplification suppression method disclosed in WO2012 / 033190, the photoligation of the present invention. The method can be used.
  • the photoligation method of the present invention can be used when a known nucleic acid amplification method is performed using a primer capable of amplifying a nucleic acid sequence (amplification nucleotide sequence) to be detected including a target site.
  • a primer capable of amplifying a nucleic acid sequence (amplification nucleotide sequence) to be detected including a target site.
  • the amplification of a certain nucleic acid sequence for example, wild type nucleic acid
  • only the other nucleic acid sequence for example, mutant type nucleic acid
  • Which of the wild-type nucleic acid and the mutant nucleic acid is to be subjected to amplification suppression can be appropriately selected according to the purpose, and is not particularly limited.
  • the abundance ratio in the nucleic acid sample is large. If there is a bias, the amplification of nucleic acids that exist in large quantities (for example, wild-type nucleic acids) is suppressed, and only nucleic acids that are present in minute quantities (for example, mutant nucleic acids) are selectively amplified, so that nucleic acids that are present in trace quantities The presence or absence of can be detected.
  • a wild-type nucleic acid (having a target site) that is an amplification suppression target has a sequence complementary to the target site, and includes a photoresponsive nucleic acid.
  • Hybridization of the probe and photoligation of the target nucleic acid and the first probe by light irradiation suppresses amplification of the wild-type nucleic acid and selectively amplifies only the mutant nucleic acid to be detected. To do.
  • the base in the sequence may be labeled with a fluorescent substance or a quenching substance as necessary.
  • a detection probe such as a TaqMan probe for the mutant nucleic acid, not only the target nucleic acid but also the quantification can be performed.
  • the method for suppressing amplification of a specific nucleic acid by the photoligation method of the present invention can be performed simultaneously with other nucleic acid amplification methods, or can be performed as a pretreatment stage of the nucleic acid amplification method.
  • a person skilled in the art can implement the photoligation method of the present invention by appropriately changing according to the purpose of gene analysis, and can be easily used for a known gene amplification method.
  • the primer used for the selective nucleic acid amplification is a primer capable of amplifying the nucleotide sequence for amplification of the mutant nucleic acid, and at the same time, in the wild-type nucleic acid before the probe having photoresponsive nucleic acids is photoligated.
  • the extension reaction from the cross-linked base to the 3 'end does not proceed and is not amplified.
  • an extension reaction occurs, resulting in selective nucleic acid amplification.
  • An amplification primer that can be used in the nucleic acid amplification method is a primer that can amplify an amplification nucleotide sequence containing one or more target sites by PCR, and is two types of primers sandwiching the amplification nucleotide sequence.
  • two types of primers consisting of a forward primer having a nucleotide sequence homologous to the upstream end region of the amplification nucleotide sequence and a reverse primer having a nucleotide sequence complementary to the downstream end region of the amplification nucleotide sequence, Also good.
  • the concentration of the two kinds of primers used in PCR is not particularly limited as long as it is a concentration ratio that can obtain a double-stranded nucleic acid as a PCR product, but is preferably used at an equal concentration.
  • primers used for PCR can be designed and synthesized by conventional methods from sequence information of nucleotide sequences including the nucleotide sequence for amplification.
  • These primers used for PCR are those in which one or more selected from the group consisting of nucleotides and nucleotide analogs are linked by a phosphodiester bond.
  • the length of the primer can be appropriately determined in consideration of the Tm value of the primer, the type of the amplified nucleotide sequence, and the like, but it is preferably one linked with 10 to 100 molecules.
  • Protocols such as the type, amount, preparation method, and reaction conditions of reagents used in the PCR reaction can be performed according to conventional methods.
  • the DNA polymerase used in PCR is not particularly limited as long as it is a DNA polymerase usually used in PCR, but is preferably a heat-resistant polymerase.
  • the probe having photoresponsive nucleic acids inhibits the elongation reaction of polymerase by photoligation with a target site by light irradiation, the probe itself having photoresponsive nucleic acids does not need resistance to nuclease activity. Therefore, it is possible to use a polymerase having nuclease activity.
  • the Tm value should be considered so as to dissociate from the target molecule at the temperature at which the polymerase elongation reaction occurs, or the photoresponse It is preferable not to function as an amplification primer by modifying a substance that inhibits the extension reaction at the 3 ′ end of the probe having a functional nucleic acid.
  • these probes should not function as amplification primers as well. It is preferable to modify the substance that inhibits the elongation reaction at the 3 ′ end in consideration of the Tm value.
  • the PCR reaction can be performed with a reaction composition suitable for a normal PCR amplification reaction. Furthermore, in order to promote the selective amplification reaction, it is also possible to add substances that affect the hybridization conditions, such as DMSO and formamide, to the reaction solution.
  • substances that affect the hybridization conditions such as DMSO and formamide
  • the optical coupling kit of the present invention is configured so that the optical coupling method of the present invention can be implemented. Specifically, the first aspect, the second aspect, and the third aspect of the optical coupling method of the present invention are implemented.
  • the first probe, the second probe, the third probe, and the fourth probe constituting the optical coupling kit are the first probe, the second probe, and the third probe in the optical coupling method of the present invention. Means the same as the fourth probe.
  • the first photoligation kit of the present invention includes at least a photoresponsive nucleic acid having a sequence complementary to a target site in a nucleic acid sample and photoligating with the target nucleic acid in the target site.
  • One probe (photocoupled probe) and a second probe having high complementarity to the first probe are included.
  • the second probe containing photoresponsive nucleic acids can also be included.
  • the second probe also functions as an optical coupling probe.
  • it can also include a third probe having a sequence complementary to the first probe and / or the second probe, which functions as a photoligation probe.
  • the second photoligation kit of the present invention includes at least a first probe (photoligation probe) containing photoresponsive nucleic acids having a sequence complementary to a target site in a nucleic acid sample, A fourth probe containing a target nucleic acid that is photoligated with the photoresponsive nucleic acids of the probe, and a second probe having high complementarity to the first probe.
  • the second probe containing photoresponsive nucleic acids can also be included.
  • the second probe also functions as an optical coupling probe.
  • it can also include a third probe having a sequence complementary to the first probe and / or the second probe, which functions as a photoligation probe.
  • the third photoligation kit of the present invention includes at least a first probe (photoligation probe) containing photoresponsive nucleic acids having a sequence complementary to a target site in a nucleic acid sample,
  • the ligation probe suppresses photoligation within the photoligation probe by replacing the nucleic acid that self-associates with the photoresponsive nucleic acid in the photoligation probe with a nucleic acid that is not photoligated with the photoresponsive nucleic acid. It is a thing.
  • the photoligation kit of the present invention may contain a reaction solution, a labeling enzyme, a polymerase for nucleic acid amplification, a primer for nucleic acid amplification, and the like depending on the gene analysis method to be used. Those skilled in the art can select and design appropriately according to the structure of a known kit.
  • CNVK is used as the photoresponsive nucleic acid of the photoligation probe, and a detailed explanation will be given, taking as an example the case where a part of the epidermal growth factor receptor (EGFR) gene sequence is the target site.
  • EGFR epidermal growth factor receptor
  • the scope of the present invention is not limited to this. It will be apparent to those skilled in the art that any changes, improvements, or modifications can be made without departing from the spirit of the invention.
  • the wild type was further substituted in addition to the original amino acid position letter notation and the amino acid position number.
  • the amino acid single letter code is used in combination, it represents a mutant type.
  • Example 1 Confirmation of optical coupling within self-alignment of optical coupling probe
  • Example 1-1 Preparation of photoligation probe
  • SEQ ID NO: 1 100mer oligonucleotide: 5'-AGCCAGGAACGTACTGGTGGAAAACACCGCAGCATGTCAAGATCAGAATTTTGGGCTGGCCAAACTGCTGGGTGGCGGGAAGAAAAGAATATACCATGCAGAA-3 '(SEQ ID NO: 1)
  • a 16-mer photoligated probe capable of hybridizing with this synthetic oligonucleotide was prepared as follows.
  • photoligation probes four types of photoresponsive probes (photo-reactive probes) were designed by changing the introduction position of 3-cyanovinylcarbazole-1′- ⁇ -deoxyriboside (CNVK), which is a photoresponsive nucleic acid ( SEQ ID NO: 2-5).
  • CNVK 3-cyanovinylcarbazole-1′- ⁇ -deoxyriboside
  • SEQ ID NO: 2-5 photoresponsive nucleic acid
  • the sequences of these PREPs are shown in Table 1.
  • the position of CNVK introduction into PREP is indicated as n.
  • CNVK was prepared according to the method described in JP-A-2009-254279, and probe synthesis was outsourced to Fasmac.
  • the structural formula of CNVK is shown in FIG.
  • Example 1-2 Light Irradiation Treatment to Optically Coupled Probe Example 1-1.
  • Each PREP synthesized in (1) was dissolved in TE at 100 ⁇ mol / L, and each 200 pmol was separated into separate 0.2 mL tubes.
  • Each sample was irradiated with light under the following conditions.
  • a UV-LED irradiator ZUV-C30H: OMRON
  • a UV transilluminator Funakoshi
  • Condition 1 No light irradiation No light irradiation is performed on each PREP.
  • Condition 2 Light-coupled light irradiation Each PREP is irradiated with 365 nm light for 1 minute at room temperature.
  • Condition 3 Photo-coupled light irradiation + photo-coupled cleavage light irradiation Each PREP subjected to the light irradiation of Condition 2 is irradiated with 312 nm light at room temperature for 5 minutes.
  • Example 1-3 Evaluation by electrophoresis
  • Example 1-2 Each PREP treated under the above conditions was diluted to 10 ⁇ mol / L with sterilized water, and then subjected to microchip electrophoresis using MultiNA (Shimadzu Corporation). The gel images are shown in FIGS.
  • the band of electrophoresis was shifted to the low molecular side by irradiating with light of the photocoupled wavelength. This clearly suggests that the PREP conformation has changed.
  • the band shifted to the low molecule side is the position of the band before irradiating light of photo-coupled wavelength (ie, no light is irradiated). Confirmed to return to. This is considered that the photoligation formed in the self arrangement was cleaved and returned to the original state. Since this phenomenon was similarly confirmed in all four types of PREP, it was considered that this phenomenon occurred regardless of the introduction position of CNVK, which is a photoligation site.
  • Example 2 Evaluation of optical coupling efficiency of optical coupling probe subjected to light irradiation treatment
  • Example 2-1 Preparation of photoligation probe
  • the photoligation probe to be evaluated was prepared in Example 1-2. PREPA. ⁇ PREP d. It was used.
  • Example 2-2 Photoligation reaction of photoligation probe 2 ⁇ L of 100 pmol / L synthetic oligonucleotide was taken as a target site in a 0.2 mL tube, and 10 ⁇ mol / L PREP (treated under the conditions described in Example 1-2) 2 ⁇ L is added, and the total amount is 1 ⁇ PCR buffer (10 mmol / L Tris-HCl (pH 8.3), 50 mmol / L KCl, 1.5 mmol / L MgCl 2 , 0.001% (W / V) gelatin).
  • a sample not irradiated with light was prepared at the same time.
  • Example 2-3 Preparation of quantitative PCR reaction solution and reaction conditions
  • Example 2-2 80 ⁇ L of sterilized water was added to 20 ⁇ L of each of the prepared solutions (including the control sample) and mixed well, and then 5 ⁇ L of each was used as a template for primer EGFR Ex. 21F and Ex. Quantitative PCR reactions were performed with a 21R using a Light Cycler (Roche).
  • EGFR ex. 21F 5′-GAACGTACTGGTGGAAAACACC-3 ′ (SEQ ID NO: 6)
  • EGFR ex. 21R 5′-GCATGGTTATTCTTTCTCTTCC-3 ′ (SEQ ID NO: 7)
  • Example 2-4 Evaluation of optical coupling efficiency
  • the sample subjected to the photoligation treatment in Example 1 and the control sample not subjected to the photoligation treatment were used as templates, respectively.
  • the quantitative PCR reaction was performed under the conditions described above.
  • the target site to which the PREP is photoligated does not function as a template for the amplification reaction because the elongation reaction of the polymerase stops at the site where it is crosslinked by a covalent bond. Therefore, in the quantitative PCR reaction, a fluorescent signal rises in a cycle that is usually slower than the control sample that was not subjected to the photoligation treatment. Therefore, the amount of the target site photocoupled by PREP can be calculated according to the following formula and expressed as the photoligation efficiency.
  • Example 3 Confirmation of photoligation within a self-sequence in a photoligation probe composed only of purine bases
  • Synthesize PREP composed only of purine bases that are not photolinked with CNVK, which is a photoresponsive nucleic acid, and that each synthesized PREP is not photolinked within its own sequence even when irradiated with light of a photocoupled wavelength. confirmed.
  • Example 3-1 Preparation of photoligation probes
  • the following three types of PREP composed only of a purine base, adenine (A) or guanine (G), were prepared.
  • the sequence of the synthesized PREP is shown in Table 3.
  • Example 3-2 Light Irradiation Treatment to Optically Coupled Probe Example 3-1.
  • Each PREP synthesized in (1) was dissolved in TE at 100 ⁇ mol / L, and each 200 pmol was separated into separate 0.2 mL tubes. Each sample was irradiated with light under the following conditions.
  • the UV-LED irradiator was used for light irradiation of 365 nm which is a light coupling wavelength.
  • Condition 1 No light irradiation No light irradiation is performed on each PREP.
  • Condition 2 Light-coupled light irradiation Each PREP is irradiated with 365 nm light at 4 ° C. for 3 minutes.
  • Example 3-3 Evaluation by electrophoresis
  • Example 3-2 Each PREP treated under the above conditions was diluted to 10 ⁇ mol / L with sterilized water and then subjected to microchip electrophoresis using MultiNA. The gel images are shown in FIGS.
  • Example 4 Suppression of photoligation within self-alignment of photoligation probe using complementary sequence
  • Example 4-1 Preparation of photoligation probe The nucleic acid sequence corresponding to the 790th threonine (T790), the 858th leucine (L858), and the 861th leucine (L861) on the EGFR gene, which is a wild type sequence, was used as a target site.
  • PREP which is a photoligation probe of an antisense strand (AS chain) that hybridizes to a coding strand, that is, a sense strand, and at the same time, a photoligation probe of a sense strand (S chain) that hybridizes to the antisense strand of the EGFR gene
  • AS chain antisense strand
  • S chain sense strand
  • L861 Examples of combinations with low complementarity L861 AS chain: 5′-CTCTCTCGCACCCAnCAG-3 ′ (SEQ ID NO: 11) L861 S chain: 5′-TTGGGCTGGCCAAnCTGC-3 ′ (SEQ ID NO: 12) (2) T790: Example of combination with high complementarity T790 AS chain: 5′-TGAnCTGCGTGATGAG-3 ′ (SEQ ID NO: 13) T790 S chain: 5′-CAnCTCATCACGCAGC-3 ′ (SEQ ID NO: 14) (3) L858: an example of an intermediate combination of complementarity (1) and (3) L858 AS chain: 5′-CAnTTTGGCCCGCCC-3 ′ (SEQ ID NO: 15) L858 S chain: 5′-CAnTTTGGGCTGGCCA-3 ′ (SEQ ID NO: 16)
  • Example 4-2. Light irradiation treatment to the light coupling probe The light irradiation treatment to the light coupling probe was performed according to the following conditions.
  • Condition 1 AS chain, no light irradiation Example 4-1.
  • Condition 1 was prepared by preparing PRE of the AS chain that hybridizes to the sense chain of the EGFR gene synthesized in step 1 to 10 ⁇ mol / L with TE.
  • Condition 2 AS chain, light irradiation PRES of each AS chain prepared in the same manner as in condition 1 was adjusted to 4 ° C. with a thermal cycler (manufactured by Applied), and then 365 nm light was irradiated with a UV-LED irradiator. What was irradiated for minutes was made into the condition 2.
  • Condition 3 S chain, unirradiated with light Example 1-1.
  • Condition 3 was prepared by preparing PRE of the S chain that hybridizes to the antisense strand of the EGFR gene synthesized in step 1 to 10 ⁇ mol / L with TE.
  • Condition 4 S chain, light irradiation Each S chain prepared in the same manner as in condition 3 was heated to 4 ° C. with a thermal cycler and then irradiated with 365 nm light for 3 minutes with a UV-LED irradiator. Condition 4 was set.
  • Condition 5 S chain + AS chain light unirradiated Example 4-1.
  • the AS chain PREP that hybridizes to the sense strand of the EGFR gene synthesized in the above and the S chain PREP that hybridizes to the antisense strand of the EGFR gene are mixed in a final concentration of 10 ⁇ mol / L.
  • Condition 6 S-chain + AS-chain light irradiation Conditions 6 were prepared by subjecting each PREP solution mixed in the same manner as condition 5 to 4 ° C. with a thermal cycler and then irradiating with a UV-LED irradiator for 3 minutes. .
  • Example 4-3 Evaluation by electrophoresis Example 4-2.
  • the PREP sample prepared under the above conditions was subjected to microchip electrophoresis using MultiNA.
  • the gel images are shown in FIGS.
  • FIG. 10 shows the result of (1) PREP combination using L861 as a target site
  • FIG. 11 shows the result of (2) T790
  • FIG. 12 shows the result of (3) L858.
  • condition 5 where the PREP for the sense strand and the PREP for the antisense strand are mixed, the same positions as in the case of the PREP alone for the sense strand and the case of the PREP alone for the antisense strand, as seen in the conditions 1 and 3, Since a band was observed, it was considered that PREP for the sense strand and PREP for the antisense strand were not hybridized. Furthermore, even in condition 6 where light was irradiated by mixing PREP for the sense strand and PREP for the antisense strand, the bands of condition 2 where light was applied to PREP for the sense strand and conditions 4 where light was applied to PREP for the antisense strand A band was found at the same position.
  • the polymer side band (upper band) was recognized at a position different from the self-association-derived band in the case of PREP alone for the sense strand and in the case of PREP alone for the antisense strand. From this, it was considered that although the hybridization between PREP for the sense strand and PREP for the antisense strand was maintained, photoligation was performed at the base portion where hybridization was impossible, and the band was shifted.
  • both PREP for the sense strand and PREP for the antisense strand are used individually, or when each PREP is used in combination.
  • PREP photocoupled within its own sequence.
  • pyrimidine bases such as cytosine or thymine that can be photoligated to CNVK are present in the non-hybridized bases. It was suggested that photoligation would occur within the self sequence. From this, it was considered effective to increase the complementarity between the photocoupled probes in order to suppress the photocoupled probes from being photocoupled within their own sequence. In addition, it was considered effective to prevent the pyrimidine base that can be photoligated with CNVK from being covered with a complementary chain and present in a state capable of binding to CNVK.
  • Example 5-1 Preparation of photoligation probe Example 4-1 using T790 as target site.
  • PREP which is a highly complementary combination prepared in (2), was used.
  • Example 5-2 Preparation of wild-type gene fragment in EGFR exon 20 (ex.20) region Human genomic DNA was prepared from peripheral blood of a healthy person by a conventional method, and this was used as a template for primer set EGFR ex. 20F and EGFR ex. The region of EGFR exon 20 (ex. 20) that wraps the nucleic acid sequence corresponding to T790 was amplified using 20R under normal PCR reaction conditions.
  • the primer sequences used for the PCR reaction are as follows.
  • EGFR ex. 20F 5′-CAGAAGCCTACGTGATGG-3 ′ (SEQ ID NO: 17)
  • EGFR ex. 20R 5′-ACCTTTGCGATCTGCACAC-3 ′ (SEQ ID NO: 18)
  • the obtained PCR amplification product was inserted into pGEMT easy Vector (Promega) and cloned according to the attached protocol.
  • the primer set EGFR ex. 20F and EGFR ex. 20R is used for amplification under normal PCR reaction conditions, and purified using PCR Purification Kit (Qiagen) to produce linear EGFR ex. 20 wild type gene fragments were obtained (SEQ ID NO: 19).
  • the weight concentration of 20 wild-type gene fragments was measured using NanoDrop spectrophotometer (Thermo Scientific), and the copy number of each gene fragment was calculated in consideration of the length of the amplified fragment. Used as a mold.
  • Example 5-3 Reagent composition during photoligation reaction To a 0.2 mL tube, Example 5-2. The target nucleic acid (1 ⁇ 10 7 copies / ⁇ L) prepared in step 1 was prepared at 2 ⁇ L and 10 ⁇ mol / L, Example 4-1. Add 2 ⁇ L each of PREP of T790 AS chain (SEQ ID NO: 3) and T790 S chain (SEQ ID NO: 4) targeting the nucleobase corresponding to T790 shown in (2), and add 1 ⁇ PCR buffer (10 mmol / L Tris). The final volume of HCl (pH 8.3), 50 mmol / L KCl, 1.5 mmol / L MgCl 2 , 0.001% (W / V) gelatin) was 20 ⁇ L in total.
  • HCl pH 8.3
  • 50 mmol / L KCl 1.5 mmol / L MgCl 2
  • Example 5-4 Conditions for the photoligation reaction Example 5-3.
  • the nucleic acid sample solution prepared in (1) was irradiated with light having a wavelength of 365 nm, which is a light coupling wavelength, under two temperature conditions. As a control, a sample not irradiated with light was prepared at the same time.
  • Condition 1 Light irradiation at 50 ° C. After heat treatment at 95 ° C. for 3 minutes, the mixture was allowed to stand at 50 ° C. for 30 seconds, and then irradiated at 50 ° C. for 30 seconds.
  • Condition 2 Light irradiation at 4 ° C. After heat treatment at 95 ° C. for 3 minutes, after standing at 4 ° C. for 1 minute, light irradiation was performed at 4 ° C. for 30 seconds.
  • Example 5-5 Confirmation of photoligation amount by quantitative PCR
  • Example 5-4 After adding 80 ⁇ L of sterilized water to each 20 ⁇ L of the reaction solution subjected to the photoligation reaction in step 5 and mixing well, a quantitative PCR reaction was performed using a light cycler (LC 480 Ver2: Roche) using 5 ⁇ L of each as a template. .
  • the reaction solution for quantitative PCR was prepared by mixing the following reagents, and sterilized water was added so that the final solution amount per sample was 25 ⁇ L. To 12.5 ⁇ L of 2 ⁇ Premix Ex Taq (registered trademark) (Takara Bio), EGFR ex. 20F and EGFR ex. 20 p each was added in an amount of 5 pmol.
  • ⁇ Ct When light is irradiated at 365 nm, which is the optical coupling wavelength at 50 ° C., ⁇ Ct is about 4 and is almost constant even when irradiated multiple times (black circle in FIG. 13). It was confirmed that ⁇ Ct increased each time light was irradiated (black triangle in FIG. 13). This means that the light coupling amount does not increase at 50 ° C. even when the light is irradiated a plurality of times, whereas the light coupling amount increases at each light irradiation at 4 ° C. ing.
  • the complementarity of the complementary strands of the photocoupled probes is increased and the complementary photocoupled probes are complementary (or complementary to the photocoupled probes).
  • the second probe must be irradiated with light at a temperature that can sufficiently form hybridization.
  • Example 6 Investigation of additives for promoting hybridization
  • Example 6-1 Preparation of photoligation probe Example 4-1 targeting a nucleic acid sequence corresponding to T790.
  • PREP which is a highly complementary combination prepared in (2), was used.
  • Example 6-2 Preparation of wild-type gene fragment in EGFR exon 20 (ex.20) region
  • Example 5-2 EGFR ex. Wild type gene fragments in 20 regions were prepared.
  • Example 6-3 Reagent composition during photoligation reaction
  • Example 6-2 Prepared in ex. 20 wild-type gene fragments (1 ⁇ 10 7 copies) were prepared at 2 ⁇ L and 10 ⁇ mol / L, Example 4-1. 2 ⁇ L and 10% (w / w) each of TREP AS chain (SEQ ID NO: 3) and T790 S chain (SEQ ID NO: 4) photoligation probes targeting the nucleic acid sequence corresponding to T790 shown in (2) w) 2 ⁇ L of polyacrylic acid (pAAc) was added and 1 ⁇ PCR buffer (10 mmol / L Tris-HCl (pH 8.3), 50 mmol / L KCl, 1.5 mmol / L MgCl 2 , 0.001% (W / V) ) The final amount of gelatin) was 20 ⁇ L.
  • Example 6-4 Conditions for the photoligation reaction Example 5-3.
  • the nucleic acid sample solution prepared in (1) was irradiated with light under the following conditions. As a control, a sample not irradiated with 365 nm light was prepared at the same time.
  • Condition 1 A nucleic acid sample solution added with polyacrylic acid (pAAc) was irradiated with light at 4 ° C.
  • Condition 2 A nucleic acid sample solution not added with polyacrylic acid (pAAc) was irradiated with light at 4 ° C.
  • Condition 3 The nucleic acid sample solution added with polyacrylic acid (pAAc) was irradiated with light at 50 ° C.
  • Condition 4 A nucleic acid sample solution without polyacrylic acid (pAAc) was irradiated with light at 50 ° C.
  • Example 6-5 Confirmation of photoligation amount by quantitative PCR
  • Example 5-4 Quantitative PCR was performed on the sample photoligated by light irradiation. The conditions for quantitative PCR were the same as in Example 5. For each sample, the photoligation efficiency was evaluated from the ⁇ Ct value calculated by quantitative PCR as in Example 2. The result of light irradiation at 4 ° C. is shown in FIG. 14, and the result of light irradiation at 50 ° C. is shown in FIG.
  • ⁇ Ct in one light irradiation cycle was increased by adding pAAc (black triangle in FIG. 14). This is because by adding pAAc, PREP can be more effectively hybridized to the template, and the amount of photoligation per light irradiation is increased. That is, pAAc promotes hybridization between PREP and the template.
  • Example 7 Confirmation of gene mutation detection sensitivity
  • Example 7-1 Preparation of mutant EGFR gene fragment
  • Example 5-2 the T790M mutation was introduced into the wild-type plasmid prepared in (1) using PrimeSTAR (registered trademark) Mutagenesis Basal Kit (Takara Bio). That is, by this method, the 2639th base of the EGFR gene was mutated from cytosine (C) to thymine (T). This was designated as a mutant plasmid.
  • Example 7-2 Preparation of mutant-contaminated sample Example 5-2. And wild type nucleic acid prepared in Example 7-1. Three types (mutation 1%, mutation 0.1%, mutation 0.01%) were prepared by changing the mixing ratio of the mutant nucleic acid prepared in 1. and used as a sample for detecting the mutant nucleic acid. Table 4 shows the mixing ratio of the wild-type nucleic acid and the mutant nucleic acid used. A sample not mixed with the mutant nucleic acid was used as a sample with 0% mutation. The mixed type indicates the number of copies per 1 ⁇ L.
  • Example 7-3 Preparation of photoligation probe Example 1-1. Targeting a nucleic acid sequence corresponding to T790.
  • the photoligation probe which is a highly complementary combination prepared in (2), was used.
  • Example 7-4 Reagent composition during photoligation reaction Into a 0.2 mL tube, Example 7-2. Prepared in Example 4-1. Targeting the nucleic acid sequence corresponding to T790 shown in (2), the PREP of T790 AS chain (SEQ ID NO: 13) and T790 S chain (SEQ ID NO: 14) was 2 ⁇ L and 10% (w / w) polyacrylic acid, respectively. 2 ⁇ L of (pAAc) was added, and the end of 1 ⁇ PCR buffer (10 mmol / L Tris-HCl (pH 8.3), 50 mmol / L KCl, 1.5 mmol / L MgCl 2 , 0.001% (W / V) gelatin) was added. The total amount was 20 ⁇ L in terms of concentration.
  • 1 PCR buffer (10 mmol / L Tris-HCl (pH 8.3), 50 mmol / L KCl, 1.5 mmol / L MgCl 2 , 0.001% (W /
  • Example 7-5 Conditions for the photoligation reaction Example 7-4.
  • the sample prepared in (1) was irradiated with light having a wavelength of 365 nm, which is a light coupling wavelength, by a UV-LED. After heat treatment at 95 ° C. for 3 minutes, maintained at 95 ° C. for 30 seconds, allowed to stand at 50 ° C. for 5 seconds, and then irradiated with light at 50 ° C. for 30 seconds as one cycle, repeated a total of 10 times .
  • Example 7-6 Confirmation of photoligation amount by quantitative PCR
  • Example 7-5 80 ⁇ L of sterilized water was added to 20 ⁇ L of each of the preparation solutions and mixed well. Then, 5 ⁇ L of the solution was taken and 45 ⁇ L of sterilized water was added. A quantitative PCR reaction was performed using a light cycler with 5 ⁇ L each as a template. The quantitative PCR was performed under the same conditions as in Example 5 and Example 6.
  • FIG. 16 a shows the result of 1% mutation, b shows 0.1% mutation, c shows 0.01% mutation, and d shows 0% mutation.
  • the vertical axis of the graph is a logarithmic display value of fluorescence intensity, and the horizontal axis is the number of PCR cycles.
  • the fluorescence signal is higher when the mutation is mixed.
  • mutation was detected in a concentration-dependent manner from mutation 1% to mutation 0.01%. This seems to be due to the fact that the photoligation efficiency with respect to the wild type sequence was improved by suppressing the photoligation within the self-sequence of PREP.
  • Example 8-1 Preparation of photoligation probe (PREP)
  • PREP photoligation probe
  • Examples 1-1 The oligonucleotide which consists of 100mer of the same arrangement
  • Three types of 16-mer PREPs capable of hybridizing with this synthetic oligonucleotide were designed by changing the inosine introduction position (SEQ ID NOs: 23 to 25). One was designed as a control for comparison, PREP without introducing inosine (SEQ ID NO: 22). The sequences of these PREPs are shown in Table 5.
  • the introduction position of CNVK, which is a photoligating nucleic acid, into PREP is denoted by n
  • the introduction position of inosine is denoted by I.
  • Example 8-2 Light irradiation treatment to PREP Example 8-1.
  • Each PREP synthesized in (1) was dissolved in TE at 100 ⁇ mol / L, and each 200 pmol was separated into separate 0.2 mL tubes. Each sample was irradiated with light under the following conditions.
  • a UV-LED irradiator ZUV-C30H: OMRON
  • Condition 1 No light irradiation No light irradiation is performed on each PREP.
  • Condition 2 Clamp forming light irradiation Each PREP is irradiated with light of 365 nm at 4 ° C. for 3 minutes.
  • Example 8-3 Evaluation by electrophoresis
  • Example 8-2 Each PREP treated under the above conditions was diluted to 10 ⁇ mol / L with sterilized water, and then subjected to microchip electrophoresis using MultiNA (Shimadzu Corporation). The gel image is shown in FIG. PREP without introducing inosine (PREP e.), PREP with one inosine introduced (PREP f.), The band after UV irradiation is shifted to the low molecular side, whereas two inosines, In the case of three introduced PREPs (PREP g., PREP h.), No band shift was observed after UV irradiation.
  • Example 9-1 Preparation of photoligation probe (PREP) PREP to be evaluated was prepared in Example 8-1. PREP prepared in e. And PREP h. It was used.
  • PREP photoligation probe
  • Example 9-2 PREP photoligation reaction (clamp formation reaction) To a 0.2 mL tube, 2 ⁇ L of 100 ⁇ mol / L synthetic oligonucleotide as a nucleic acid sequence having a target site was fractionated, and 2 ⁇ L of 100 ⁇ mol / L PREP (treated under the conditions described in Example 8-2.) Was added. 20 ⁇ L of total volume at a final concentration of 1 ⁇ PCR buffer (10 mmol / L Tris-HCl (pH 8.3), 50 mmol / L KCl, 1.5 mmol / L MgCl 2 , 0.001% (W / V) gelatin) It was. This was heat-treated at 95 ° C.
  • 1 PCR buffer 10 mmol / L Tris-HCl (pH 8.3), 50 mmol / L KCl, 1.5 mmol / L MgCl 2 , 0.001% (W / V) gelatin
  • Example 9-3 Preparation of quantitative PCR reaction solution and reaction conditions
  • Example 9-2 80 ⁇ L of sterilized water was added to 20 ⁇ L of each of the prepared solutions (including the control sample) and mixed well, and 5 ⁇ L of each was further mixed with 45 ⁇ L of sterilized water.
  • Quantitative PCR reaction was performed using a light cycler (LC 480 Ver2: manufactured by Roche) using 5 ⁇ L of the mixed sample as a template.
  • the reaction solution for quantitative PCR was prepared by mixing the following reagents, and sterilized water was added so that the final solution amount per sample was 25 ⁇ L. In 12.5 ⁇ L of 2 ⁇ Premix Ex Taq (registered trademark) (manufactured by Takara Bio Inc.), EGFR ex.
  • 21F (SEQ ID NO: 6) and EGFR ex. 21 p (SEQ ID NO: 7) was added in an amount of 5 pmol each. Furthermore, 2.5 pmol of detection probe labeled with terminal fluorescence was added.
  • the sequence of this detection probe is as follows. Total LNA probe: 5'-Cy5 / CAGCATGT + CAAGA + TCACAGA / BHQ_2-3 '(SEQ ID NO: 26) In the sequence, + indicates that the subsequent base is LNA, Cy5 indicates a fluorescent dye, and BHQ2 indicates a fluorescence inhibitor.
  • the synthesis of the detection probe was outsourced to IDT. The quantitative PCR reaction was performed under the conditions of 95 ° C., 10 seconds + (95 ° C., 3 seconds / 56 ° C., 30 seconds) ⁇ 45 cycles.
  • EGFR ex. 21F 5′-GAACGTACTGGTGGAAAACACC-3 ′ (SEQ ID NO: 6)
  • EGFR ex. 21R 5′-GCATGGTTATTCTTTCTCTTCC-3 ′ (SEQ ID NO: 7)
  • PREP not introducing inosine e.
  • ⁇ Ct is about 4 and ⁇ Ct is about 4 and UV is irradiated multiple times, it is almost constant (triangle mark in FIG. 18). It can be seen that ⁇ Ct increases as the number of UV irradiations increases (square mark in FIG. 19). This is because PREP in which inosine has not been introduced caused clamp formation within the self-sequence of PREP, and the amount of clamp formation with respect to the template of PREP did not increase even when irradiated with light multiple times.
  • the introduced PREP is considered to have increased the amount of clamp formation according to the number of times of UV irradiation because the formation of clamp within the self-arrangement of PREP was suppressed, so that PREP could be sufficiently clamped to the mold.
  • the amount can be increased.
  • Example 10-1 Preparation of photoligation probe (PREP)
  • Example 8-1 Using a nucleic acid sequence corresponding to 861 leucine (L861) on the EGFR gene which is a wild type sequence as a target site.
  • PREP designed in e. Is the EGFR gene coding strand, ie, the antisense strand (AS strand) PREP that hybridizes to the sense strand (SEQ ID NO: 22), and simultaneously the sense strand (S strand) that hybridizes to the antisense strand of the EGFR gene.
  • PREP was also designed (SEQ ID NO: 27). The introduction position of CNVK is shown as n.
  • L861 S chain: 5′-CTGnCCAAACTGCTGG-3 ′ SEQ ID NO: 27
  • the complement of the sense strand PREP and the antisense strand PREP is completely complementary, and CNVK is arranged at a position where the PREPs are not photocoupled with each other, and the CNVK of each PREP is originally photocoupled PREP was designed in which the possible target nucleic acid was replaced with inosine.
  • the introduction position of CNVK is denoted by n, and the introduction position of inosine is denoted by I.
  • FIG. 19 shows a schematic diagram of the sequence of PREP actually used as a clamp probe and its complementarity.
  • Example 10-2 Preparation of wild-type gene fragment in EGFR exon 21 (ex. 21) region Human genomic DNA was prepared from peripheral blood of a healthy person by a conventional method, and this was used as a template for primer set EGFR ex. 21F and EGFR ex. 21R was used to amplify the region of EGFR exon 21 (ex. 21) enclosing the nucleic acid sequence corresponding to L861 under normal PCR reaction conditions.
  • the primer sequences used for the PCR reaction are as follows.
  • the primer set EGFR ex. 21F and EGFR ex. 21R is used for amplification under normal PCR reaction conditions and purified using PCR Purification Kit (manufactured by Qiagen) to produce linear EGFR ex. 21 wild-type gene fragments were obtained (SEQ ID NO: 32). EGFR ex. Purified using PCR Purification Kit (Qiagen). The weight concentration of 21 wild-type gene fragments was measured using NanoDrop Spectrophotometer (Thermo Scientific), and the copy number of each gene fragment was calculated in consideration of the length of the amplified fragment. Used as a mold.
  • Example 10-3 Reagent composition during photoligation reaction To a 0.2 mL tube, Example 5-2.
  • the target nucleic acid (1 ⁇ 10 7 copies / ⁇ L) prepared in Step 1 was prepared at 2 ⁇ L and 100 ⁇ mol / L, Example 10-1.
  • 2 ⁇ L each of the L861 AS chain (SEQ ID NO: 28) and the L861 S chain (SEQ ID NO: 29), each targeting a nucleobase corresponding to L861 is added in 1 ⁇ PCR buffer (10 mmol / L Tris-HCl ( pH 8.3), 50 mmol / L KCl, 1.5 mmol / L MgCl 2 , 0.001% (W / V) gelatin) and the total amount was 20 ⁇ L.
  • Example 10-4 Conditions for the photoligation reaction Example 10-3.
  • the nucleic acid sample solution prepared in (5) was heat-treated at 95 ° C. for 5 minutes, allowed to stand at 45 ° C. for 5 seconds, and then irradiated with light of 365 nm at 45 ° C. using a UV-LED for 30 seconds. As a control, a sample not irradiated with light was prepared at the same time.
  • Example 10-5 Confirmation of clamp amount by quantitative PCR
  • Example 10-4 80 ⁇ L of sterilized water was added to each 20 ⁇ L of the reaction solution subjected to the photoligation reaction in and mixed well, and 5 ⁇ L of each was further mixed with 45 ⁇ L of sterile water. Quantitative PCR reaction was performed using a light cycler (LC 480 Ver2: manufactured by Roche) using 5 ⁇ L of the mixed sample as a template. The reaction solution for quantitative PCR was prepared by mixing the following reagents, and sterilized water was added so that the final solution amount per sample was 25 ⁇ L. In 12.5 ⁇ L of 2 ⁇ Premix Ex Taq (registered trademark) (manufactured by Takara Bio Inc.), EGFR ex.
  • LC 480 Ver2 manufactured by Roche
  • the present invention relates to a method for improving photoligation efficiency using a probe containing photoresponsive nucleic acids, and can analyze genes with high sensitivity and high accuracy. For example, it can be used to selectively detect a mutated gene present in a trace amount mixed with a large amount of wild-type gene. In addition, it enables gene detection from a nucleic acid sample in which only a very small amount of target nucleic acid is difficult to detect by conventional evaluation methods. In addition, the fact that analysis as described above is possible is not limited to highly invasive test materials such as tissues or biopsy materials that have been removed by surgery. Because it is possible to handle samples that exist only in materials, it is possible to confirm difficult therapeutic effects and to perform monitoring tests.
  • Each base sequence of SEQ ID NOs: 2 to 5 in the sequence listing is an artificially synthesized probe sequence. (6th n is CNVK), PREPb. (8th n is CNVK), PREPc. (10th n is CNVK), PREPd. (12th n is CNVK).
  • Each base sequence of SEQ ID NOs: 8 to 10 is an artificially synthesized probe sequence, PREP-A (third n is CNVK), PREP-G (third n is CNVK), PREP-AG, respectively. (The third n is CNVK).
  • the base sequences of SEQ ID NOs: 11 to 16 are artificially synthesized probe sequences, which are probe L861 AS (15th n is CNVK), probe L861 S (14th n is CNVK), probe T790 AS. (Fourth n is CNVK), probe T790 S (third n is CNVK), probe L858 AS (third n is CNVK), and probe L858 S (third n is CNVK).
  • the base sequence of SEQ ID NO: 20 is an artificially synthesized probe sequence, and is a Total LNA probe (4th C, 8th T, 11th C is LNA).
  • Each base sequence of SEQ ID NOs: 22 to 25 is an artificially synthesized probe sequence.
  • the fourth n is CNVK
  • PREPf. (4th n is CNVK, 14th n is inosine
  • PREPg. (4th n is CNVK, 13th to 14th n is inosine
  • PREPh (The fourth n is CNVK, and the 12th to 14th n are inosine).
  • the base sequence of SEQ ID NO: 26 is an artificially synthesized probe sequence, and is a Total LNA probe (9th C, 14th T is LNA).
  • Each base sequence of SEQ ID NOs: 27 to 29 is an artificially synthesized probe sequence, and probe L861 S (fourth n is CNVK), probe T861 AS (fourth n is CNVK, thirteenth n, respectively) Is inosine) and probe T861 S (the fifth n is CNVK and the 14th n is inosine).

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Abstract

　光応答性核酸類を含むプローブを使用した標的核酸との光連結が停滞してしまうという問題を克服し、光連結効率を向上させる光連結方法、及び光連結キットを提供する。　前記光連結方法は、核酸サンプル中に存在する標的部位と、該標的部位に対して相補的な配列を有し、光応答性核酸類を含む第一のプローブと、を反応溶液中でハイブリダイゼーションし、光照射することにより光連結させる方法であって、該第一のプローブ内の該光応答性核酸類に起因する自己会合を抑制させることを特徴とする。前記光連結キットは、核酸サンプル中の標的部位に対して相補的な配列を有する光応答性核酸類を含む第一のプローブ、該第一のプローブに対して、高い相補性を有する第二のプローブを含むことを特徴とする。

Description

光応答性核酸類を含むプローブを用いた光連結方法
　本発明は、光応答性核酸類を含むプローブを用いて光連結する方法に関する。
　近年、個々の患者についてオーダーメイドの治療法である個別化医療を確立するために、該患者の特定の遺伝子多型と、薬剤感受性や薬剤応答性との関連を明らかにする研究が提案されている。
　特に、ゲノム科学の進歩により、薬物動態の解明、および薬物の反応性に関与する酵素、蛋白質等の遺伝子多型の解明が急速になされている。ヒトゲノム解析において、一塩基多型（Ｓｉｎｇｌｅ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ：ＳＮＰｓ）が、最も頻度の高い遺伝子多型マーカーとして注目されつつある。該ＳＮＰｓは、種々の疾患や薬剤応答との関連を明らかにする上で有用であることが既に知られている。また、複数のＳＮＰｓを用いたハプロタイプ解析が、疾患感受性を解析する上で有用であることも知られている。
　特に医療現場においては、ＳＮＰｓの検出結果を用いた病気罹患率の診断、効果的な投与薬剤の選択、副作用の予測などへの利用等が考えられ、治療効果の増大だけでなく患者のＱＯＬの向上にもつながるものとして期待されている。
このようなＳＮＰｓ部位の塩基を判別する、いわゆるタイピングについては多くの手法が報告されている。ＤＮＡの一塩基多型をタイピングする技術としては、ＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ法やＩｎｖａｄｅｒ法などが、一塩基の置換を識別できるほどの高い配列選択性をもつ技術として知られている。
　しかし、悪性腫瘍のような後発変異の検出においては、検体材料の多くを占める正常細胞に由来する野生型の核酸分子がバックグラウンドとなることから、上記のような解析手法では一塩基置換等の変異を高感度に検出できない場合が多い。
　そのため、上記方法に代わる特に有効な解析手法として、光応答性核酸類の使用が開示されている。ハイブリダイゼーションした光応答性核酸類と標的核酸は、特定の波長の光照射を行うことによって、光連結を形成させることができる。この光連結は、人工塩基部分の光反応によって、光応答性核酸類分子と標的核酸分子との間に、分子間の共有結合が形成されて生じる。このように光連結された分子と分子は、単なる熱的な安定性のみで会合しているのではないので、相補的二重鎖が解離する条件におかれた場合でも、解離することなく結合している（特許文献１）。
　また、光応答性核酸類の性質として、光連結反応は１秒程度で極めて迅速に進行すること、完全にハイブリダイゼーションしないと光連結しないという知見に立脚して、光応答性核酸類を使用した変異型遺伝子を検出する解析手法が開示されている（特許文献２）。
　特許文献１および２では光応答性核酸類を使用したＳＮＰｓの特定について開示されているが、光応答性核酸類を含むプローブが、相補的な配列を持つ標的部位とハイブリダイゼーションしたときに光連結するという知見に基づいて、光応答性核酸類の使用が変異型遺伝子の選択的増幅に有用である例を開示しているのみである。
　従って、このような従来の技術常識を鑑みれば、光連結には光応答性核酸類を含むプローブとその相補的な配列をもつ標的部位とがハイブリダイゼーションする必要があり、更に、光連結は光応答性核酸類と標的部位又は標的部位近傍の標的核酸とが結合することによって形成されることから、光応答性核酸類は相補的な配列をもつ標的部位又は標的部位近傍の標的核酸配列としか結合しないと考えられていた。
特開２００９－２５４２７９号公報 ＷＯ２０１２／０３３１９０号公報
　本発明者らは、光応答性核酸類を含むプローブ（すなわち、光連結プローブ）が標的核酸に対して光連結する反応において、標的核酸の量に関係なく一定の割合までしか光連結できない、すなわち、光連結が停滞してしまうことを見出した。この事実を受け鋭意検討した結果、光連結が停滞してしまう要因として、光応答性核酸類を含むプローブが、標的核酸と光連結するための光照射によって、該プローブ自身が自己の配列内で光連結してしまう事を見出した。すなわち、プローブ内の光応答性核酸類と該光応答性核酸類と光連結する塩基が会合し光連結することから、標的部位とハイブリダイゼーション及び／又は標的核酸と光連結できないプローブが光照射の時間（エネルギー）依存的に蓄積され、その結果、標的核酸に対する光連結を停滞させているものと推察された。
　更に、従来の技術常識に基づいて考えると、野生型遺伝子を選択的に増幅抑制し、変異型遺伝子を選択的に増幅する場合において、特許文献２のような光応答性核酸類を使用した光連結方法の最大の優位性は、一度、光によって光連結した標的核酸はＰＣＲ反応工程における熱変性工程において開裂しない点、すなわち、一度、光によって光連結した標的核酸を非平衡系に持ち込むことができる点にあった。
　しかしながら、本発明者らは、光連結可能な波長（３６５ｎｍ）の光を照射した場合においても、標的核酸に対して光連結されるだけでなく、該標的核酸に対して光連結したプローブが、本来生じることの無い光開裂反応により一部、外れてしまうことを見出した。つまり、光連結する反応と光連結を開裂させる反応とが並行して起こる光平衡の状態が、標的核酸に対する光連結を停滞させている要因と考えられた。
　本発明の目的は、光応答性核酸類を含むプローブを使用した標的核酸との光連結が停滞してしまうという問題を克服し、光連結効率を向上させる方法、キットを提供することにある。
　本発明者らは、上記課題を解決する手段を鋭意検討した結果、光連結効率の停滞を回避するために、反応溶液中において、光応答性核酸類を含むプローブの自己配列内での光連結を抑制することにより、該プローブの有効濃度を保つこと、また、局所的に標的部位付近における光応答性核酸類を含むプローブの実質的な濃度を高めることでハイブリダイゼーションを促進し、光連結効率を向上させることができることを見出した。
　すなわち、本発明は以下の内容に関する。
［１］核酸サンプル中に存在する標的部位と、該標的部位に対して相補的な配列を有し、光応答性核酸類を含む第一のプローブと、を反応溶液中でハイブリダイゼーションし、光照射することにより光連結させる方法であって、該第一のプローブ内の該光応答性核酸類に起因する自己会合を抑制させることを特徴とする、光連結方法。
［２］前記第一のプローブに対して、高い相補性を有する第二のプローブを共存させることにより、該第一のプローブ内の該光応答性核酸類に起因する自己会合を抑制させることを特徴とする、［１］の光連結方法。
［３］前記高い相補性とは、前記第一のプローブと前記第二のプローブとが互いに相補的な関係にあり、所定の光連結条件下で該第一のプローブ中の該光応答性核酸類の自己内で光連結する塩基が、第二のプローブとハイブリダイゼーションしている、［１］又は［２］の光連結方法。
［４］前記光連結させる方法が、前記核酸サンプル中に存在する標的部位が有する標的核酸と、前記第一のプローブの光応答性核酸類との間で光連結させる、［１］～［３］のいずれかの光連結方法。
［５］前記第二のプローブが光応答性核酸類を含む、［１］～［４］のいずれかの光連結方法。
［６］前記第一のプローブ及び前記第二のプローブが光応答性核酸類を含み、該第一のプローブと該第二のプローブの非相補性領域において、該第一のプローブ及び／又は該第二のプローブ内に存在する光応答性核酸類が自己内で光連結できないように、該第一のプローブ及び／又は該第二のプローブに相補的な配列を有する第三のプローブを使用する、［１］～［５］のいずれかの光連結方法。
［７］核酸サンプル中に存在する標的部位と、該標的部位に対して相補的な配列を有し光応答性核酸類を含む第一のプローブと、該標的部位に対して相補的な配列を有し標的核酸を含む第四のプローブと、を反応溶液中で隣接して配置するようにハイブリダイゼーションさせ、光照射によって該第四のプローブに存在する標的核酸と該第一のプローブ中の該光応答性核酸類との間で光連結する方法において、
該第一のプローブに対して、高い相補性を有する第二のプローブを共存させることで、該第一のプローブの自己内での光連結を抑制させることを特徴とする、［１］の光連結方法。
［８］前記第一のプローブ内において光応答性核酸類と自己会合する核酸を、該光応答性核酸類と光連結しない核酸に置換した該第一のプローブを使用することを特徴とする、該第一のプローブの自己内での光連結を抑制させることを特徴とする、［１］～［７］のいずれかの光連結方法。
［９］前記光応答性核酸類と光連結しない核酸がプリン塩基である、［８］の光連結方法。
［１０］前記光応答性核酸類と光連結しない核酸が、ピリミジン環を人工的に変換した合成塩基である、［８］の光連結方法。
［１１］反応溶液中にアニオン性物質が存在する、［１］～［１０］のいずれかの光連結方法。
［１２］少なくとも一種類の光連結プローブが、反応溶液中に０．１μｍｏｌ／Ｌ以上の濃度で存在することを特徴とする、［１］～［１１］のいずれかの光連結方法。
［１３］［１］～［１２］のいずれかの光連結方法を使用する遺伝子解析方法。
［１４］前記遺伝子解析方法が、遺伝子検出方法又は核酸増幅方法である、［１３］の遺伝子解析方法。
［１５］［１４］の核酸増幅方法が、変異型核酸の標的部位を含む増幅用ヌクレオチド配列を選択的に増幅させることで、該変異型核酸の有無を検出することを特徴とする、変異型核酸検出方法。
［１６］核酸サンプル中の標的部位に対して相補的な配列を有する光応答性核酸類を含む第一のプローブ、該第一のプローブに対して、高い相補性を有する第二のプローブを含むことを特徴とする、光連結キット。
［１７］前記第一のプローブが、核酸サンプル中の標的部位の標的核酸と光連結するものである、［１６］の光連結キット。
［１８］更に、該第一のプローブの該光応答性核酸類と光連結する標的核酸を含む第四のプローブを含む、［１６］の光連結キット
［１９］前記第二のプローブが光応答性核酸類を含む、［１６］～［１８］のいずれかの光連結キット。
［２０］前記第一のプローブが、該プローブ内において光応答性核酸類と自己会合する核酸を、該光応答性核酸類と光連結しない核酸に置換したものである、［１６］～［１９］のいずれかの光連結キット。
　本発明によれば、光応答性核酸類を使用した遺伝子の解析方法において、標的部位と光応答性核酸類を含むプローブ間の光連結効率を向上させることが可能である。すなわち、標的核酸に対して特異的かつ効率よく光連結できるため、高い感度と特異性を必要とする、対象とする遺伝子の解析方法において効果的である。
図１は、光応答性核酸の一例である３－シアノビニルカルバゾール（ＣＮＶＫ）の構造式である。 図２は、ＥＧＦＲ遺伝子上のエクソン２１（ｅｘ．２１）領域の一部を光連結形成対象として、光応答性核酸であるＣＮＶＫの挿入位置を５’末端に近い位置に挿入して設計した光連結プローブについて、光連結形成波長の光照射と光連結開裂波長の光照射を行ったサンプルを電気泳動にて確認した結果である。 図３は、ＥＧＦＲ遺伝子上のエクソン２１（ｅｘ．２１）領域の一部を光連結形成対象として、光応答性核酸であるＣＮＶＫの挿入位置を５’末端よりも中心に近い位置に挿入して設計した光連結プローブについて、光連結形成波長の光照射と光連結開裂波長の光照射を行ったサンプルを電気泳動にて確認した結果である。 図４は、ＥＧＦＲ遺伝子上のエクソン２１（ｅｘ．２１）領域の一部を光連結形成対象として、光応答性核酸であるＣＮＶＫの挿入位置を３’末端よりも中心に近い位置に挿入して設計した光連結プローブについて、光連結形成波長の光照射と光連結開裂波長の光照射を行ったサンプルを電気泳動にて確認した結果である。 図５は、ＥＧＦＲ遺伝子上のエクソン２１（ｅｘ．２１）領域の一部を光連結形成対象として、光応答性核酸であるＣＮＶＫの挿入位置を３’末端に近い位置に挿入して設計した光連結プローブについて、光連結形成波長の光照射と光連結開裂波長の光照射を行ったサンプルを電気泳動にて確認した結果である。 図６は、ＣＮＶＫの標的核酸とならないアデニン（Ａ）のみで構成した光連結プローブについて、光連結形成波長の光照射を行ったサンプルを電気泳動にて確認した結果である。 図７は、ＣＮＶＫの標的核酸とならないグアニン（Ｇ）のみで構成した光連結プローブについて、光連結形成波長の光照射を行ったサンプルを電気泳動にて確認した結果である。 図８は、ＣＮＶＫの標的核酸とならないアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）のみで構成した光連結プローブについて、光連結形成波長の光照射を行ったサンプルを電気泳動にて確認した結果である。 図９は、ＥＧＦＲ遺伝子の３箇所の変異を目的部位として設計した光連結プローブである。具体的には、（１）は８６１番目のロイシン（Ｌ８６１）をコードする核酸配列を目的部位として、（２）は７９０番目のスレオニン（Ｔ７９０）に該当する核酸配列を目的部位として、（３）は８５８番目のロイシン（Ｌ８５８）に該当する核酸配列を目的部位として、センス鎖、アンチセンス鎖それぞれに対して設計した光連結プローブとその相補性について示した図である。 図１０は、ＥＧＦＲ遺伝子の８６１番目のロイシン（Ｌ８６１）をコードする核酸配列を目的部位として、センス鎖、アンチセンス鎖それぞれに対して光連結プローブを設計した場合に、光連結形成波長の光照射と光連結開裂波長の光照射を行ったサンプルを電気泳動にて確認した結果である。 図１１は、ＥＧＦＲ遺伝子の７９０番目のスレオニン（Ｔ７９０）をコードする核酸配列を目的部位として、センス鎖、アンチセンス鎖それぞれに対して光連結プローブを設計した場合に、光連結形成波長の光照射と光連結開裂波長の光照射を行ったサンプルを電気泳動にて確認した結果である。 図１２は、ＥＧＦＲ遺伝子の８５８番目のロイシン（Ｌ８５８）をコードする核酸配列を目的部位として、センス鎖、アンチセンス鎖それぞれに対して光連結プローブを設計した場合に、光連結形成波長の光照射と光連結開裂波長の光照射を行ったサンプルを電気泳動にて確認した結果である。 図１３は、ＥＧＦＲ遺伝子の７９０番目のスレオニン（Ｔ７９０）をコードする核酸配列を目的部位として、センス鎖、アンチセンス鎖それぞれに対して光連結プローブを設計した場合に、ハイブリダイゼーション温度を変化させて光連結形成させた場合の光連結形成効率を表した図である。 図１４は、ＥＧＦＲ遺伝子の７９０番目のスレオニン（Ｔ７９０）をコードする核酸配列を目的部位として、センス鎖、アンチセンス鎖それぞれに対して光連結プローブを設計した場合に、ハイブリダイゼーション促進剤としてポリアクリル酸を添加して４℃でハイブリダイゼーションさせて光連結形成させた場合の光連結形成効率を表した図である。 図１５は、ＥＧＦＲ遺伝子の７９０番目のスレオニン（Ｔ７９０）をコードする核酸配列を目的部位として、センス鎖、アンチセンス鎖それぞれに対して光連結プローブを設計した場合に、ハイブリダイゼーション促進剤としてポリアクリル酸を添加して５０℃でハイブリダイゼーションさせて光連結形成させた場合の光連結形成効率を表した図である。 図１６は、ＥＧＦＲ遺伝子の７９０番目のスレオニン（Ｔ７９０）をコードする核酸配列を目的部位として、遺伝子変異検出を行った際の定量ＰＣＲ測定結果を表した図である。 図１７は、ＥＧＦＲ遺伝子上のエクソン２１（ｅｘ．２１）領域の一部を光連結形成対象として、光応答性核酸であるＣＮＶＫの挿入位置を５’末端に近い位置に挿入し、更にＣＮＶＫが光連結形成可能なピリミジン塩基をイノシンに置換した光連結プローブについて、光連結形成波長の光照射と光連結開裂波長の光照射を行ったサンプルを電気泳動にて確認した結果である。 図１８は、ＥＧＦＲ遺伝子の実施例８－１．において設計した光連結プローブを光連結形成させた場合の光連結形成効率を表した図である。 図１９は、ＥＧＦＲ遺伝子上のエクソン２１（ｅｘ．２１）領域の８６１番目のロイシン（Ｌ８６１）をコードする核酸配列を目的部位として、センス鎖、アンチセンス鎖それぞれに対して設計した光連結プローブとその相補性について示した図である。 図２０は、ＥＧＦＲ遺伝子の実施例１０－１．において設計した光連結プローブを光連結形成させた場合の光連結形成効率を表した図である。
　以下において、本発明の実施形態について適宜図面を参照しながら詳細に説明するが、利用方法やキットの態様についてはこれに限定されるものではない。
　本発明において、ＤＮＡ、ＲＮＡ、遺伝子発現、コード、鋳型、プロモーター、プライマー、ＰＣＲ、配列等の用語の定義に関しては、現在、分子生物学、遺伝学、遺伝子工学等で広く一般的に使用されている用語と同じ意味である。
　本発明において、核酸とは、ＤＮＡ、ＲＮＡ又は、後述のヌクレオチドアナログであれば特に限定されるものではなく、天然のものであってもよく、合成されたものであってもよい。天然の核酸として、例えば、生物から回収されたゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ等がある。また、合成された核酸として、β－シアノエチルホスフォロアミダイト法、ＤＮＡ固相合成法等の公知の化学的合成法により合成されたＤＮＡや、ＰＣＲ等の公知の核酸増幅法により合成された核酸、逆転写反応により合成されたｃＤＮＡ等がある。
　本発明において核酸サンプルとは、核酸を含有するサンプルであって、標的部位を含有する可能性のあるサンプルであれば、特に限定されるものではない。例えば、標的部位を含む野生型核酸又はその変異型核酸の少なくとも一方を含有する可能性のあるサンプル、好ましくは、その両方を含有する可能性のあるサンプルである。例えば、血液や組織等を試料として試料中の全細胞から得られるゲノムＤＮＡやＲＮＡが該当する。この核酸の抽出は、フェノール／クロロホルム法等の公知の手法により行うことができる。このとき、核酸サンプル中における変異型の存在率は問わない。例えば、１００％が野生型であってもよいし、５０％が野生型で残り５０％が変異型であってもよい。また、当該核酸サンプルは、細胞から得られるゲノムＤＮＡであってもよいし、細胞から調製されたｍＲＮＡであってもよいし、ｍＲＮＡを鋳型にして逆転写反応を行って得られるｃＤＮＡであってもよい。さらにはクローン化された多数の遺伝子を人工的に混合したものであってもよいし、核酸増幅反応によって人工的に増幅させた核酸、又はそれらの混合物であってもよい。
　本発明において野生型核酸とは、変異を生じる前の核酸を意味するものとし、その典型的な例は、変異を生じておらず、本来の正常な機能を有する遺伝情報を含む核酸である。ここで言う遺伝情報とは、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ等の情報をコードする転写領域だけでなく、プロモーター等の遺伝子発現上必要な調節領域を含むものとする。
　本発明において変異型核酸とは、変異を生じた核酸である。変異とはＤＮＡやＲＮＡ等の核酸配列の変化であり、遺伝学等で使用される塩基置換、挿入、欠失、逆位、重複、転座等が該当する。当該変異型核酸において、変異の存在する領域は転写領域だけでなく、プロモーター等の遺伝子発現上必要な調節領域を含むものとする。なお、変異により変異型核酸が機能上の変化を有する必要はない。また、変異には、先天的なものも後天的なものも含まれる。
　本発明において標的部位とは、核酸サンプル中に存在する核酸配列において、プローブがハイブリダイゼーションする部位である。ハイブリダイゼーションするプローブが光応答性核酸類を含むことは必要とせず、該核酸配列とプローブ間のハイブリダイゼーションはその配列の全部又は一部とハイブリダイゼーションすることを意味する。また、標的核酸とは光応答性核酸類が結合して、光連結する核酸配列を有する部位を意味する。ここで光連結とは、光応答性核酸類を含むプローブと標的核酸とが共有結合することを意味する。形成される共有結合の型は、光応答性核酸類の種類によって複数存在することが既に公知であるが、そのいずれをも含むものとし、特に、クロスリンク型の共有結合を形成する場合と、ライゲーション型の共有結合を形成する場合の両方が含まれる。
　また光応答性核酸類としては、光に反応して他の核酸類と共有結合を形成して連結する性質を有すれば良く、例えば、後述する式Ｉ～ＶＩＩによって示される核酸類を使用することができる。後述する式Ｉ～ＶＩＩの光応答性核酸類はいずれもピリミジン塩基と共有結合する性質をもつが、該光応答性核酸類と共有結合するものであれば、特に限定されない。このような、炭素－炭素二重結合を形成する塩基としては、天然に存在するものである場合には、好ましくは、シトシン、チミン、ウラシルなどを含む配列が標的核酸となりうる。標的核酸は、標的部位中に存在していてもよいし、本発明において使用される光連結プローブ以外のプローブ中に存在するように設計されて使用してもよい。
　また、本発明において目的部位とは、変異型核酸において変異が見られる塩基が存在する部位であり、野生型核酸を含め、本発明における遺伝子解析方法の対象となる部位である。例えば、塩基置換があった場合には野生型核酸、変異型核酸共に当該塩基置換した塩基が該当する。また挿入があった場合には変異型核酸においては挿入された塩基が該当し、野生型遺伝子においては変異型核酸で塩基が挿入された部位が該当する。また欠失があった場合には変異型核酸においては欠失によって塩基が失われた部位が該当し、野生型核酸においては変異型核酸で失われた塩基が該当する。また、当該目的部位は、本発明において最終的な解析対象ともなりうる。例えば、遺伝情報をコードする配列を有する鎖（以下、センス鎖とする）を示すものであってもよいし、センス鎖に対して相補的な配列を有する鎖（以下、アンチセンス鎖とする）を示すものであってもよい。また、遺伝情報に直接関与しない配列における核酸配列の変化も含まれるものとする。
　当該光連結プローブの塩基配列及び光応答性核酸類の位置や数は標的部位の一部、又は全部と特異的にハイブリダイゼーションすることが可能であれば、特に限定はされない。
　また、変異箇所や塩基の種類、光連結プローブの長さ等の状況に応じて、標的部位と目的部位とが一致するように光連結プローブを設計することもできるし、目的部位とは頃なる部位に標的部位を設定してプローブを設計することもできる。標的部位と目的部位とが一致する場合には、一部の部位のみを重複させることも可能であるし、全部を重複させて設計することも可能である。
　本発明に使用できる光応答性核酸類としては、標的核酸と光照射により連結可能であれば良い。
　例えば、ソラレン誘導体（Chang, E. et al. Biochemistry 1991, 30, 8283）やアミノプリン誘導体（特開２００１－２０６８９６）や４－チオウラシル等が使用できる。前記ソラレン誘導体は５’－ＡＴ－３’である塩基配列のチミン特異的に反応する性質があり、また、アミノプリン誘導体には配列依存性はないもののシチジン特異的であることから、適用範囲に一定の制約があるため、そのような制限のない下記の光応答性核酸類がより好ましい。
　使用が好ましい第１の光応答性核酸類として、塩基部分として、式Ｉ：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
 （式中、Ｒａは、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２～Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素であり、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２～Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素である）
で表される基を有する核酸類（Org. Lett., Vol. 10, No. 15, 2008、特開２００９－２５４２７９号公報）を挙げることができる。結合される核酸がＤＮＡの場合、この式Ｉで表される置換カルバゾリル基は、式Ｉ（ａ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
 で示すように、２－デオキシリボースの１位の炭素原子（Ｃ）に、β位で結合している。具体的な例としては、３－シアノビニルカルバゾール－１’－β－デオキシリボシド〔３－ｃｙａｎｏｖｉｎｙｌｃａｒｂａｚｏｌｅ－１’－β－ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｓｉｄｅ（ＣＮＶＫ）〕が挙げられる。
　また、使用が好ましい第２の光応答性核酸類として、式ＩＩ：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
 （式中、Ｒは、－ＣＮ、－ＣＯＮＲ１Ｒ２、又は－ＣＯＯＲ３であって、かかるＲ１～Ｒ３は、それぞれ独立して、水素原子又はアルキル基ＣｎＨ２ｎ＋１（ｎ≧１）である。ここでｎの上限は特に限定されるものではないが、例えば、ｎは１～７、好ましくは１～５であることができる）
で表される基を有する核酸類（Organic & Biomolecular Chemistry 2007, 5, 2583、Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 15 (2005), 1299-1301、特開２００５－３４８６４５）を挙げることができる。結合される核酸がＤＮＡの場合、この式ＩＩで表される置換フェノキシ基は、式ＩＩ（ａ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 で示すように、２－デオキシリボースの１位の炭素原子（Ｃ）に、α位で結合している。Ｒが－ＣＮ、－ＣＯＯＨ、－ＣＯＯＭｅであるものが好ましく、特には、－ＣＯＯＨ又は－ＣＯＯＭｅであるものが好ましい。
　これらの式Ｉや式ＩＩで表される基を有することで光連結性を備えた核酸類となる。この光連結性の付与はＤＮＡであってもＲＮＡであっても、さらにはヌクレオチドアナログであっても可能である。これらの光応答性核酸類は通常の核酸の製造方法に準じて製造することができる。
　また、本発明の好ましい実施の態様において、光応答性核酸類は、塩基部分として次の式ＩＩＩ：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 （ただし、式ＩＩＩにおいて、ＺはＯ又はＮＨを示し、Ｘ及びＹの少なくとも一方は、カルボキシル基、低級アルコキシカルボニル基、置換アミド基及びシアノ基からなる群より選択された電子吸引性基を示し、Ｘ及びＹの残りの基は水素原子を示す）で表される基を有している。アルコキシカルボニル基におけるアルキル基としては、炭素数１から１０、好ましくは１から５の低級アルキル基が挙げられる。置換基Ｘ、Ｙは、両方が同時に同一又は異なる電子吸引基であってもよく、また置換基Ｘ、Ｙの一方だけが電子吸引基であり、他方が水素原子であってもよい。式ＩＩＩにおいて、ＺがＯで、Ｘが水素原子で、Ｙがカルボキシル基、低級アルコキシカルボニル基、置換アミド基又はシアノ基であることが好ましい。特に好ましい塩基部分として、５－ビニル－２’－デオキシウリジン、及び５－カルボキシビニル－２’－デオキシウリジンをあげることができる。特に５－カルボキシビニル－２’－デオキシウリジンが好ましい。
　好ましい実施の別な態様において、光応答性核酸類は、塩基部分として次の式ＩＶ：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 （ただし、式ＩＶにおいて、Ｒ１は、水素原子であり、Ｒ２及びＲ３の少なくとも一方は、カルボキシル基、低級アルコキシカルボニル基、低級アルケニル基、低級アルキニル基、置換アミド基、アミド基、シアノ基及び水素原子からなる群より選択された基を示し、Ｒ２及びＲ３の残りの基は水素原子又はシアノ基を示す）で表される基を有している。
　Ｒ２及びＲ３の少なくとも一方として、カルボキシル基は好ましく、カルボキシル基と水素原子の組み合わせは、Ｒ２及びＲ３の組み合わせとして好ましい。
　Ｒ２及びＲ３の少なくとも一方として、低級アルコキシカルボニル基は好ましく、低級アルコキシカルボニル基におけるアルキル部分としては、炭素数１～１０、好ましくは１～５、さらに好ましくは１～３、さらに好ましくは１～２、特に好ましくは炭素数１の低級アルキルが挙げられる。すなわち、好ましい低級アルコキシカルボニル基の例としては、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、プロポキシカルボニル基、及びブトキシカルボニル基等を挙げることができ、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基及びプロポキシカルボニル基がさらに好ましく、メトキシカルボニル基及びエトキシカルボニル基がさらに好ましく、メトキシカルボニル基が特に好ましい。低級アルコキシカルボニル基と水素原子の組み合わせ、特にメトキシカルボニル基と水素原子の組み合わせは、Ｒ２及びＲ３の組み合わせとして好ましい。
　Ｒ２及びＲ３の少なくとも一方として、低級アルケニル基は好ましく、低級アルケニル基としては、炭素数２～１０、好ましくは炭素数２～５、さらに好ましくは炭素数２～３、特に好ましくは炭素数２の低級アルケニル基が挙げられる。低級アルケニル基と水素原子の組み合わせ、特にビニル基と水素原子の組み合わせは、Ｒ２及びＲ３の組み合わせとして好ましい。
　Ｒ２及びＲ３の少なくとも一方として、低級アルキニル基は好ましく、低級アルキニル基としては、炭素数２～１０、好ましくは炭素数２～５、さらに好ましくは炭素数２～３、特に好ましくは炭素数２の低級アルケニル基が挙げられる。低級アルキニル基と水素原子の組み合わせ、特にエチニル基と水素原子の組み合わせは、Ｒ２及びＲ３の組み合わせとして好ましい。
　Ｒ２及びＲ３の少なくとも一方として、置換アミドは好ましく、置換アミドとしては、１置換のＮ－置換アミドを挙げることができ、好ましい例として、Ｎ－アルキルアミド、Ｎ－アミノアルキルアミドを挙げることができる。このようなＮ－アルキルアミド、Ｎ－アミノアルキルアミドとしては、炭素数１～１０、好ましくは炭素数１～５、さらに好ましくは炭素数１～３、特に好ましくは炭素数３のものであり、Ｎ－アミノアルキルアミドが特に好ましい。置換アミドと水素原子の組み合わせ、特にＮ－アミノ（Ｃ１～Ｃ３アルキル）アミドと水素原子の組み合わせは、Ｒ２及びＲ３の組み合わせとして好ましい。
　Ｒ２及びＲ３の少なくとも一方として、アミド基は好ましく、アミド基と水素原子の組み合わせは、Ｒ２及びＲ３の組み合わせとして好ましい。Ｒ２及びＲ３の少なくとも一方として、シアノ基は好ましく、シアノ基とシアノ基の組み合わせ、及びシアノ基と水素原子の組み合わせは、Ｒ２及びＲ３の組み合わせとして好ましい。
　Ｒ２及びＲ３の少なくとも一方として、水素原子は好ましく、水素原子を少なくとも１個含む組み合わせ、及び水素原子と水素原子の組み合わせは、Ｒ２及びＲ３の組み合わせとして好ましい。
　好ましい実施の別な態様において、光応答性核酸類は、塩基部分として次の式Ｖ：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 （ただし、式Ｖにおいて、Ｒ４は、水素原子又は低級アルキル基であり、Ｒ５及びＲ６の少なくとも一方は、カルボキシル基、低級アルコキシカルボニル基、低級アルケニル基、低級アルキニル基、置換アミド基、アミド基、シアノ基及び水素原子からなる群より選択された基を示し、Ｒ５及びＲ６の残りの基は水素原子又はシアノ基を示す）で表される基を有している。
　Ｒ４としては、水素原子は特に好ましい。
　Ｒ４としては、低級アルキル基は好ましく、低級アルキル基としては、炭素数１～５、好ましくは炭素数１～３、さらに好ましくは炭素数１～２、特に好ましくは炭素数１のものである。このような低級アルキル基としては、メチル基、エチル基及びプロピル基等を挙げることができ、メチル基及びエチル基は好ましく、特にメチル基が好ましい。
　Ｒ５及びＲ６の少なくとも一方として、カルボキシル基は好ましく、カルボキシル基と水素原子の組み合わせは、Ｒ５及びＲ６の組み合わせとして好ましい。
　Ｒ５及びＲ６の少なくとも一方として、低級アルコキシカルボニル基は好ましく、低級アルコキシカルボニル基におけるアルキル部分としては、炭素数１～１０、好ましくは１～５、さらに好ましくは１～３、さらに好ましくは１～２、特に好ましくは炭素数１の低級アルキルが挙げられる。すなわち、好ましい低級アルコキシカルボニル基の例としては、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、プロポキシカルボニル基、及びブトキシカルボニル基等を挙げることができ、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基及びプロポキシカルボニル基がさらに好ましく、メトキシカルボニル基及びエトキシカルボニル基がさらに好ましく、メトキシカルボニル基が特に好ましい。低級アルコキシカルボニル基と水素原子の組み合わせ、特にメトキシカルボニル基と水素原子の組み合わせは、Ｒ５及びＲ６の組み合わせとして好ましい。
　Ｒ５及びＲ６の少なくとも一方として、低級アルケニル基は好ましく、低級アルケニル基としては、炭素数２～１０、好ましくは炭素数２～５、さらに好ましくは炭素数２～３、特に好ましくは炭素数２の低級アルケニル基が挙げられる。低級アルケニル基と水素原子の組み合わせ、特にビニル基と水素原子の組み合わせは、Ｒ５及びＲ６の組み合わせとして好ましい。
　Ｒ５及びＲ６の少なくとも一方として、低級アルキニル基は好ましく、低級アルキニル基としては、炭素数２～１０、好ましくは炭素数２～５、さらに好ましくは炭素数２～３、特に好ましくは炭素数２の低級アルケニル基が挙げられる。低級アルキニル基と水素原子の組み合わせ、特にエチニル基と水素原子の組み合わせは、Ｒ５及びＲ６の組み合わせとして好ましい。
　Ｒ５及びＲ６の少なくとも一方として、置換アミドは好ましく、置換アミドとしては、１置換のＮ－置換アミドを挙げることができ、好ましい例として、Ｎ－アルキルアミド、Ｎ－アミノアルキルアミドを挙げることができる。このようなＮ－アルキルアミド、Ｎ－アミノアルキルアミドとしては、炭素数１～１０、好ましくは炭素数１～５、さらに好ましくは炭素数１～３、特に好ましくは炭素数３のものであり、Ｎ－アミノアルキルアミドが特に好ましい。置換アミドと水素原子の組み合わせ、特にＮ－アミノ（Ｃ１～Ｃ３アルキル）アミドと水素原子の組み合わせは、Ｒ５及びＲ６の組み合わせとして好ましい。
　Ｒ５及びＲ６の少なくとも一方として、アミド基は好ましく、アミド基と水素原子の組み合わせは、Ｒ５及びＲ６の組み合わせとして好ましい。
　Ｒ５及びＲ６の少なくとも一方として、シアノ基は好ましく、シアノ基とシアノ基の組み合わせ、及びシアノ基と水素原子の組み合わせは、Ｒ５及びＲ６の組み合わせとして好ましい。
　Ｒ５及びＲ６の少なくとも一方として、水素原子は好ましく、水素原子を少なくとも１個含む組み合わせ、及び水素原子と水素原子の組み合わせは、Ｒ５及びＲ６の組み合わせとして好ましい。
　好ましい実施の別な態様において、光応答性核酸類は、塩基部分として次の式ＶＩ：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 （ただし、式ＶＩにおいて、Ｒ７は、水素原子又は低級アルキル基であり、Ｒ８及びＲ９の少なくとも一方は、カルボキシル基、低級アルコキシカルボニル基、低級アルケニル基、低級アルキニル基、置換アミド基、アミド基、シアノ基及び水素原子からなる群より選択された基を示し、Ｒ８及びＲ９の残りの基は水素原子又はシアノ基を示す）で表される基を有している。
　Ｒ７としては、水素原子は特に好ましい。
　Ｒ７としては、低級アルキル基は好ましく、低級アルキル基としては、炭素数１～５、好ましくは炭素数１～３、さらに好ましくは炭素数１～２、特に好ましくは炭素数１のものである。このような低級アルキル基としては、メチル基、エチル基及びプロピル基等を挙げることができ、メチル基及びエチル基は好ましく、特にメチル基が好ましい。
　Ｒ８及びＲ９の少なくとも一方として、カルボキシル基は好ましく、カルボキシル基と水素原子の組み合わせは、Ｒ８及びＲ９の組み合わせとして好ましい。
　Ｒ８及びＲ９の少なくとも一方として、低級アルコキシカルボニル基は好ましく、低級アルコキシカルボニル基におけるアルキル部分としては、炭素数１～１０、好ましくは１～５、さらに好ましくは１～３、さらに好ましくは１～２、特に好ましくは炭素数１の低級アルキルが挙げられる。すなわち、好ましい低級アルコキシカルボニル基の例としては、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、プロポキシカルボニル基、及びブトキシカルボニル基等を挙げることができ、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基及びプロポキシカルボニル基がさらに好ましく、メトキシカルボニル基及びエトキシカルボニル基がさらに好ましく、メトキシカルボニル基が特に好ましい。低級アルコキシカルボニル基と水素原子の組み合わせ、特にメトキシカルボニル基と水素原子の組み合わせは、Ｒ８及びＲ９の組み合わせとして好ましい。
　Ｒ８及びＲ９の少なくとも一方として、低級アルケニル基は好ましく、低級アルケニル基としては、炭素数２～１０、好ましくは炭素数２～５、さらに好ましくは炭素数２～３、特に好ましくは炭素数２の低級アルケニル基が挙げられる。低級アルケニル基と水素原子の組み合わせ、特にビニル基と水素原子の組み合わせは、Ｒ８及びＲ９の組み合わせとして好ましい。
　Ｒ８及びＲ９の少なくとも一方として、低級アルキニル基は好ましく、低級アルキニル基としては、炭素数２～１０、好ましくは炭素数２～５、さらに好ましくは炭素数２～３、特に好ましくは炭素数２の低級アルケニル基が挙げられる。低級アルキニル基と水素原子の組み合わせ、特にエチニル基と水素原子の組み合わせは、Ｒ８及びＲ９の組み合わせとして好ましい。
　Ｒ８及びＲ９の少なくとも一方として、置換アミドは好ましく、置換アミドとしては、１置換のＮ－置換アミドを挙げることができ、好ましい例として、Ｎ－アルキルアミド、Ｎ－アミノアルキルアミドを挙げることができる。このようなＮ－アルキルアミド、Ｎ－アミノアルキルアミドとしては、炭素数１～１０、好ましくは炭素数１～５、さらに好ましくは炭素数１～３、特に好ましくは炭素数３のものであり、Ｎ－アミノアルキルアミドが特に好ましい。置換アミドと水素原子の組み合わせ、特にＮ－アミノ（Ｃ１～Ｃ３アルキル）アミドと水素原子の組み合わせは、Ｒ８及びＲ９の組み合わせとして好ましい。
　Ｒ８及びＲ９の少なくとも一方として、アミド基は好ましく、アミド基と水素原子の組み合わせは、Ｒ８及びＲ９の組み合わせとして好ましい。
　Ｒ８及びＲ９の少なくとも一方として、シアノ基は好ましく、シアノ基とシアノ基の組み合わせ、及びシアノ基と水素原子の組み合わせは、Ｒ８及びＲ９の組み合わせとして好ましい。
　Ｒ８及びＲ９の少なくとも一方として、水素原子は好ましく、水素原子を少なくとも１個含む組み合わせ、及び水素原子と水素原子の組み合わせは、Ｒ８及びＲ９の組み合わせとして好ましい。
　好ましい実施の別な態様において、光応答性核酸類は、塩基部分として次の式ＶＩＩ：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 （ただし、式ＶＩＩにおいて、Ｒ１０は、水素原子又は低級アルキル基であり、Ｒ１１及びＲ１２の少なくとも一方は、カルボキシル基、低級アルコキシカルボニル基、低級アルケニル基、低級アルキニル基、置換アミド基、アミド基、シアノ基及び水素原子からなる群より選択された基を示し、Ｒ１１及びＲ１２の残りの基は水素原子又はシアノ基を示す）で表される基を有している。
　Ｒ１０としては、水素原子は特に好ましい。
　Ｒ１０としては、低級アルキル基は好ましく、低級アルキル基としては、炭素数１～５、好ましくは炭素数１～３、さらに好ましくは炭素数１～２、特に好ましくは炭素数１のものである。このような低級アルキル基としては、メチル基、エチル基及びプロピル基等を挙げることができ、メチル基及びエチル基は好ましく、特にメチル基が好ましい。
　Ｒ１１及びＲ１２の少なくとも一方として、カルボキシル基は好ましく、カルボキシル基と水素原子の組み合わせは、Ｒ１１及びＲ１２の組み合わせとして好ましい。
　Ｒ１１及びＲ１２の少なくとも一方として、低級アルコキシカルボニル基は好ましく、低級アルコキシカルボニル基におけるアルキル部分としては、炭素数１～１０、好ましくは１～５、さらに好ましくは１～３、さらに好ましくは１～２、特に好ましくは炭素数１の低級アルキルが挙げられる。すなわち、好ましい低級アルコキシカルボニル基の例としては、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、プロポキシカルボニル基、及びブトキシカルボニル基等を挙げることができ、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基及びプロポキシカルボニル基がさらに好ましく、メトキシカルボニル基及びエトキシカルボニル基がさらに好ましく、メトキシカルボニル基が特に好ましい。低級アルコキシカルボニル基と水素原子の組み合わせ、特にメトキシカルボニル基と水素原子の組み合わせは、Ｒ１１及びＲ１２の組み合わせとして好ましい。
　Ｒ１１及びＲ１２の少なくとも一方として、低級アルケニル基は好ましく、低級アルケニル基としては、炭素数２～１０、好ましくは炭素数２～５、さらに好ましくは炭素数２～３、特に好ましくは炭素数２の低級アルケニル基が挙げられる。低級アルケニル基と水素原子の組み合わせ、特にビニル基と水素原子の組み合わせは、Ｒ１１及びＲ１２の組み合わせとして好ましい。
　Ｒ１１及びＲ１２の少なくとも一方として、低級アルキニル基は好ましく、低級アルキニル基としては、炭素数２～１０、好ましくは炭素数２～５、さらに好ましくは炭素数２～３、特に好ましくは炭素数２の低級アルケニル基が挙げられる。低級アルキニル基と水素原子の組み合わせ、特にエチニル基と水素原子の組み合わせは、Ｒ１１及びＲ１２の組み合わせとして好ましい。
　Ｒ１１及びＲ１２の少なくとも一方として、置換アミドは好ましく、置換アミドとしては、１置換のＮ－置換アミドを挙げることができ、好ましい例として、Ｎ－アルキルアミド、Ｎ－アミノアルキルアミドを挙げることができる。このようなＮ－アルキルアミド、Ｎ－アミノアルキルアミドとしては、炭素数１～１０、好ましくは炭素数１～５、さらに好ましくは炭素数１～３、特に好ましくは炭素数３のものであり、Ｎ－アミノアルキルアミドが特に好ましい。置換アミドと水素原子の組み合わせ、特にＮ－アミノ（Ｃ１～Ｃ３アルキル）アミドと水素原子の組み合わせは、Ｒ１１及びＲ１２の組み合わせとして好ましい。
　Ｒ１１及びＲ１２の少なくとも一方として、アミド基は好ましく、アミド基と水素原子の組み合わせは、Ｒ１１及びＲ１２の組み合わせとして好ましい。
　Ｒ１１及びＲ１２の少なくとも一方として、シアノ基は好ましく、シアノ基とシアノ基の組み合わせ、及びシアノ基と水素原子の組み合わせは、Ｒ１１及びＲ１２の組み合わせとして好ましい。
　Ｒ１１及びＲ１２の少なくとも一方として、水素原子は好ましく、水素原子を少なくとも１個含む組み合わせ、及び水素原子と水素原子の組み合わせは、Ｒ１１及びＲ１２の組み合わせとして好ましい。
　このような塩基の好適な構造式を以下に例示する。本発明において使用可能な塩基は以下の例示に限定されるものではない。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
　本発明においてプローブとは、公知の一緒に結合された二つ以上のヌクレオシドサブユニット又は核酸塩基サブユニットを有するポリマーを意味し、ＤＮＡおよび／もしくはＲＮＡ又はそのアナログを含む。
　アナログとは、非天然のヌクレオチドであり、天然のヌクレオチドであるデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）やリボヌクレオチド（ＲＮＡ）と同様の機能を有するものをいう。すなわち、ヌクレオチドアナログは、ヌクレオチドと同様にリン酸ジエステル結合により鎖を形成することができ、かつ、ヌクレオチドアナログを用いて形成されたプライマーやプローブは、ヌクレオチドのみを用いて形成されたプライマーやプローブと同様に、ＰＣＲやハイブリダイゼーションに用いることができる。
　このようなヌクレオチドアナログとして、例えば、ＰＮＡ（ポリアミドヌクレオチド誘導体）、ＬＮＡ（ＢＮＡ）、ＥＮＡ（２’－Ｏ，４’－Ｃ－Ｅｔｈｙｌｅｎｅ－ｂｒｉｄｇｅｄｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄｓ）、及びこれらの複合体等がある。ここで、ＰＮＡは、ＤＮＡやＲＮＡのリン酸と５炭糖からなる主鎖をポリアミド鎖に置換したものである。また、ＬＮＡ（ＢＮＡ）は、リボヌクレオシドの２’部位の酸素原子と４’部位の炭素原子がメチレンを介して結合している２つの環状構造を持つ化合物である。
　上記のアナログに限定されず、そのプローブがハイブリダイゼーションアッセイ条件下で標的部位と相補的であり、安定にハイブリダイゼーションし得るものであればよい。ここで、相補的な配列とは、ハイブリダイゼーション条件下で安定な水素結合を形成し得る塩基配列を有することを意味し、各プローブの核酸間の完全な一致は必要とされない。
　本発明の光応答性核酸類を含むプローブ（すなわち、光連結プローブ）とは、前記プローブにおいて、少なくとも一つの光応答性核酸類を含むプローブであり、該光応答性核酸類を含むプローブは、標的部位に対して相補的な配列をもつ。
　本発明において第一のプローブ（以下、光連結プローブと称する場合がある）とは、標的部位対して相補的な配列を有し、かつ、前記光応答性核酸類を含む核酸類プローブをいう。当該光連結プローブは前記の式Ｉ～ＶＩＩで表される基を有した光応答性核酸類を含んでいればよい。
　本発明の光連結方法は、核酸サンプル中に存在する標的部位と、該標的部位に対して相補的な配列を有し、光応答性核酸類を含む第一のプローブと、を反応溶液中でハイブリダイゼーションさせ、光照射することにより光連結させる方法において、該第一のプローブが該光応答性核酸類に起因する自己会合（すなわち、自己内での光連結）を抑制させることを特徴とする、光連結方法である。
　本発明の光連結方法の第一の態様としては、核酸サンプル中の標的部位と、該標的部位に対して相補的な配列を有する光応答性核酸類を含む第一のプローブを反応溶液中でハイブリダイゼーションさせ、光照射することによって該標的部位中に存在する標的核酸と該第一のプローブ中の該光応答性核酸類との間で光連結するクロスリンク型の光連結方法において、該第一のプローブに対して、高い相補性を有する第二のプローブを共存させることで、該第一のプローブの自己内での光連結を抑制させる光連結方法が挙げられる。
　これにより、該標的部位中に存在する標的核酸と該第一のプローブ間の光連結効率を向上させることができる。例えば、所定の光連結条件下で、標的部位とハイブリダイゼーションしなかった未反応の該第一のプローブに該第二のプローブをハイブリダイゼーションさせることで、該第一のプローブが自己会合して二次構造を形成することを防ぎ、光照射による該第一のプローブの自己内での光連結を抑制する。その結果、標的部位中に存在する標的核酸と光連結しなかった未反応の該第一のプローブは光連結能を維持しているため、長時間光照射を継続すること、又は変性やアニーリングの温調サイクルにおいて光照射を複数回繰り返すことで、光連結効率を向上させることができる。
　前記の高い相補性とは、光応答性核酸類を含む該第一のプローブと該第二のプローブとが互いに相補的な関係にあり、所定の光連結条件下で該第一のプローブ中の該光応答性核酸類が自己内で光連結する塩基が、相補的な該第二のプローブとハイブリダイゼーションしている状態を意味する。該第二のプローブは完全相補な関係であってもよく、該第一のプローブに対して相補的であることが好ましいが、所定の光連結条件下において該第一のプローブとハイブリダイゼーションできれば完全な相補関係は必ずしも必要とはされない。例えば、該第一のプローブの配列の種類や長さ等の情報から、該第一のプローブを構成する核酸類塩基のうち、自己内の光連結に関与する箇所が特定される場合、該当箇所の塩基以外は必ずしも相補的である必要はない。
　ここで、該第一のプローブ中の光応答性核酸類は標的部位中の標的核酸と光連結するものであるから、当然に該光応答性核酸類は該第二のプローブと光連結しないように設計することが必要である。よって、該光応答性核酸類の標的核酸との光連結を阻害しないように、該第二のプローブを設計することも好ましい。例えば、該第二のプローブがハイブリダイゼーションすることで該光応答性核酸類を含む第一のプローブの自己会合を抑制しつつ、光応答性核酸類の結合能を失わないように設計することが挙げられる。
　光応答性核酸類が光連結することが可能な塩基は公知であるか、当業者であれば試行錯誤なく同定することができる。例えば、式Ｉ又はＩＩで示される光応答性核酸類はシトシン、チミンやウラシルといったピリミジン塩基と光連結することが公知であることから、該第二のプローブは該第一のプローブ内のピリミジン塩基と相補的な配列となるように設計して使用することができる。なお、第二のプローブは、該第一のプローブ中の該光応答性核酸類が自己内で光連結することが可能なすべての塩基と相補的である必要は無く、少なくとも、所定の光連結条件下で、該第一のプローブ中の該光応答性核酸類が自己内で光連結する塩基と相補的であれば良い。
　但し、該第二のプローブが該第一のプローブに対してハイブリダイゼーションするためには、連続した塩基を必要とすることは公知であることから、該第二のプローブが必要に応じて、該第一のプローブ内の光応答性核酸類が自己内で光連結する核酸類の塩基以外とも相補性を必要とすることは自明である。
　また、第二のプローブは、連続した単数の配列として前記第一のプローブの自己内の光連結を抑制することもできるし、第一のプローブ内に存在する光応答性核酸類が光連結可能な核酸と相補性を有する、非連続な複数の配列として使用することもできる。当業者であれば、公知の方法に従って、解析方法や光連結条件に応じて、ハイブリダーゼンション可能な塩基配列や鎖長などを考慮して、連続した単数の配列でも非連続な複数の配列でも、適宜、設計して使用することが可能である。
　光応答性核酸類は前記光応答性核酸類を含むプローブの中央付近に配置することも可能であるが、該第一のプローブの末端側に配置することもできる。利用する解析系において、使用可能な該第一のプローブの鎖長が制限される場合（例えば、ハイブリダイゼーション可能な最小の鎖長など）、光応答性核酸類を該第一のプローブの末端側に配置することにより、該第一のプローブと安定的にハイブリダイゼーションするように前記第二のプローブを設計することができる。
　なお、光応答性核酸類を末端に配置することによって、該光応答性核酸類の立体障害のため、ハイブリダイゼーションによって該末端塩基を光連結する核酸との距離を接近させることが不十分になり、標的部位と光連結できない可能性が考えられる場合には、該光応答性核酸類を、末端よりも内側に導入することがより好ましく、更には末端から２～５塩基目に導入することがより好ましい。
　従来の技術常識では、プローブは、標的部位以外とは相補的配列を有しないようにすること、及び、プローブが自己配列内において二次構造を形成することを防ぐためにプローブ内に相補的配列を有しないようにすることはもちろん、２つ以上のプローブを使用する場合、それらのプローブ間で相補的配列が少ないことがプローブ設計にあたり重要であるとされていた。
　しかし本発明の光連結方法では、標的部位に相補的な配列を有し、光応答性核酸類を含む第一のプローブに対して、標的部位と競合関係にある、該第一のプローブと相補性が高い第二のプローブを利用することで、光連結効率を向上させることができたのは意外な効果である。
　当業者であれば、前記光応答性核酸類を含む第一のプローブが自己内で光連結することが可能か否かについて、公知の方法を適宜選択して使用することができる。例えば、ソフトウェアを使用して塩基の隣接計算や所与の構造の遊離エネルギー計算から、前記光連結プローブの二次構造を予測し、自己内の光連結に関与する核酸を選定することも可能である。更に、後述する実施例のように、所定の光連結条件下において、自己内で光連結するか否か検討することもできる。
　また、第二のプローブに光応答性核酸類を含めることもでき、第二のプローブとして自己会合を抑制する機能と、光応答性核酸類を含む第一のプローブ（光連結プローブ）として光連結する機能を有するように設計して使用することもできる。
　光応答性核酸類を含むプローブは、光連結する作用を示す場合には第一のプローブとして、また、自己会合を抑制する作用を示す場合には第二のプローブとして称される場合がある。例えば、標的部位のセンス鎖プローブ、該標的部位のアンチセンス鎖プローブがともに光応答性核酸類を含む場合、該センス鎖プローブを第一のプローブとした場合には該アンチセンス鎖プローブは第二のプローブとなり、該アンチセンス鎖プローブが第一のプローブである場合には、該センス鎖プローブは第二のプローブとして機能する。
　この場合、該第二のプローブは、該標的部位のアンチセンス鎖の標的核酸と、クロスリンク型の光連結をすることができる。
　また、自己会合を抑制する方法であれば上記の方法に限定されることなく、多様な解析方法において本発明の光連結方法を適宜変更して使用することが可能である。
　例えば、配列が一本鎖である場合（例えばｍＲＮＡ等）は、光応答性核酸類は少なくとも第一のプローブに含有されていれば良いが、標的部位が二本鎖である場合（例えばｄｓＤＮＡ等）は、光応答性核酸類は第一のプローブだけでなく、第二のプローブにも含有されていることが好ましい。例えば、野生型配列を光連結し、変異型配列を高感度に検出する場合であって、さらに核酸増幅反応を伴う遺伝子解析である場合は、野生型配列のセンス鎖およびアンチセンス鎖の両鎖に光連結することで更に高感度に変異型配列を検出、同定することができる。
　また、第一のプローブ及び第二のプローブが共に光応答性核酸類を有する（すなわち、光連結プローブとして機能する）場合、第一のプローブと第二のプローブの非相補性領域において、第一のプローブ及び／又は第二のプローブ内に存在する光応答性核酸類が自己内で光連結できないように、第一のプローブ及び／又は第二のプローブに相補的な配列を有する第三のプローブを使用することもできる。第三のプローブは、前記第二のプローブの態様と同様に設計し、使用することができる。
　本発明の光連結方法の第二の態様としては、核酸サンプル中の標的部位と、該標的部位に対して相補的な配列を有する光応答性核酸類を含む第一のプローブと、該標的部位に対して相補的な配列を有し標的核酸を含む第四のプローブとを反応溶液中で隣接して配置するようにハイブリダイゼーションさせ、光照射することによって該第四のプローブに存在する標的核酸と該第一のプローブ中の該光応答性核酸類との間で光連結するライゲーション型の光連結方法において、該第一のプローブに対して、高い相補性を有する第二のプローブを共存させることで、該第一のプローブの自己内での光連結を抑制させる光連結方法が挙げられる。
　該第一のプローブに相補的な配列をもつ、第二のプローブの使用によって、光応答性核酸類が挿入された末端とは反対側の末端に存在する塩基と結合して自己配列内での会合を抑制することも可能である。
　該ライゲーション型の光連結方法としては、ＷＯ２００７／０５８３２６号公報に記載の方法を本願に取り込んで使用することができる。当業者であれば、光連結方法が該ライゲーション型であることを除いて、本発明の光連結方法の第一の態様を、適宜改変して、該第二の態様を容易に実施することができる。このようなライゲーション型の光応答性核酸類を使用した方法では、該第一のプローブはその３’末端又は５’末端に光応答性核酸類を有しており、標的部位に上記の該第一プローブ及び該第四プローブがハイブリダイゼーションした場合以外にも、該第一のプローブ内の光応答性核酸類とピリミジン塩基とが空間的配置により近接した場合に会合して光連結することを防ぐ使用方法も可能である。
　以下にライゲーション型の光連結方法について詳述する。
　光応答性核酸類を含む第一のプローブと標的核酸を含む第四のプローブは、所定の標的部位において、隣接してハイブリダイゼーションするように配置され、且つ、光照射によって光連結可能なように隣接して該光応答性核酸類と該標的核酸とが配置される。
　このとき、該光応答性核酸類は第一のプローブの末端に位置するように設計されることが好ましい。また、第四のプローブは第一のプローブと隣接する側の末端が光連結可能な標的核酸となるように設計することが好ましい。
　また、該第一のプローブと第四のプローブとが１塩基分の間隙も無く近接し、両プローブに光照射された際に光連結によって結合した連続した一本の核酸配列を構成しうることが好ましい。
　光応答性核酸類を含む該第一のプローブと標的核酸を含む該第四のプローブとが光照射によって連結されることによって、更に安定的な標的部位の塩基配列と相補的な塩基配列を生成する。
　例えば、光応答性核酸類として、５－カルボキシビニル－２’－デオキシウリジン（ＣＶＵと表記する）を有する第一のプローブを使用した場合、このＣＶＵは、標的核酸であるピリミジン塩基と光連結性を示し、チミンの塩基部分と炭素－炭素二重結合を形成する。
　標的部位である検出対象である核酸配列と、該ＣＶＵを含む該第一のプローブと、標的核酸を含む該第四のプローブと、を混合しハイブリダイゼーションさせる。すると、塩基配列の相補性に従って、標的部位に対して該第一のプローブと該第四のプローブとが光連結可能になるように隣接して整列する。この状態で光照射を行うと、光反応により光連結されて、ＣＶＵと標的核酸であるピリミジン塩基とが共有結合で１本に連結された状態となる。
　このようなライゲーション型の光連結方法には、上記のように第一のプローブと第四のプローブのそれぞれ末端側で光連結可能な光応答性核酸類を使用すれば良いが、例えば、該光応答性核酸類として式ＩＩＩ～ＶＩＩで示される化合物が使用できる。
　前記第一の態様又は前記第二の態様はそれぞれ単独で実施することもできるが、該第二の態様は該第一の態様と組み合わせて実施することもできる。例えば、光応答性核酸類を含む第一のプローブがクロスリンク型の光連結を行い、光応答性核酸類を含む第二のプローブがライゲーション型の光連結を行う方法、又は、光応答性核酸類を含む第一のプローブがライゲーション型の光連結を行い、光応答性核酸類を含む第二のプローブがクロスリンク型の光連結を行う方法などが挙げられる。
　本発明の光連結方法の第三の態様としては、前記光連結プローブは、標的部位とハイブリダイゼーション可能な限り、所定の光連結条件下において、光連結プローブ内の光応答性核酸類が自己会合する核酸を、該光応答性核酸類と光連結しない核酸に置換した該光連結プローブを設計し、自己内の光連結を抑制させることも可能である。また、センス鎖プローブとアンチセンス鎖プローブとがプローブ間で光連結することを防ぐために該光応答性核酸類と光連結しない核酸に置換してプローブを設計し、プローブ間での光連結を抑制させることもできる。例えば、該光応答性核酸類がＣＮＶＫである場合はピリミジン塩基からアデニン、グアニンやイノシンのようなプリン塩基に置換して実施することも可能である。置換する塩基の数は、標的部位或いはプローブ内に存在するピリミジン塩基数に応じて適宜設定することができる。
　また、光応答性核酸類がＣＮＶＫである場合、光連結可能な塩基である、シトシンやチミンのピリミジン環を人工的に変換した合成塩基を使用することもできる。この場合、光照射による［２＋２］付加環化反応が起きないようにすることで、光連結プローブが自己配列内で光連結することを抑制することができる。この場合使用可能な合成塩基としては、例えば、ピリミジン環の５位もしくは６位の炭素を窒素に置換した５－アゾ－チミン、６－アゾ－チミン、５－アゾ－シトシン、６－アゾ－シトシン等の合成塩基等が挙げられる。
　該第三の態様は単独で実施することもできるが、前記第一の態様及び／又は前記第二の態様と組み合わせて実施することもできる。
当業者であれば、公知の情報から使用する光応答性核酸類がどの塩基を標的とするか、どのような化学反応機構により光連結を行うか等の性質を考慮し、標的となる塩基に対して置換もしくは修飾を実施して、合成塩基を適宜使用することが可能である。
　本発明の光連結方法は、緩衝作用のある塩を含む反応溶液中で行うことができる。緩衝作用のある塩としてはカコジル酸塩、リン酸塩、トリス塩をあげることができる。緩衝作用のある塩の濃度は、５～２５０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲にあることが好ましい。また、アルカリ金属及び／又はアルカリ土類金属の塩を含むことが好ましい。アルカリ金属及び／又はアルカリ土類金属として塩化ナトリウム、及び塩化マグネシウムをあげることができる。さらに反応溶液中にＤＭＳＯやホルムアミド等の有機溶剤を加えることで光応答性核酸類を含むプローブと標的部位との特異的な光結合反応を促すこともできる。但し、その後又は同時に行われる遺伝子解析方法を阻害するような物質の混入を避けることが好ましい。特に核酸増幅反応と同時に行う場合は核酸増幅反応に適した反応組成であることが好ましい。
　本発明の光連結方法における光照射は、一般に３５０～３８０ｎｍの範囲、好ましくは３６５ｎｍの波長を含む光が好ましく、特に好ましくは３６５ｎｍの単波長のレーザー光である。好適な実施の様態において光照射による光反応は１秒～数秒以内が好ましい。但し、容器および溶液の光透過性を考慮してさらに時間をかけて行うこともできる。
　また、前記光の照射は１回以上行えばよいが、複数繰り返すことにより、光連結効率を高めることができる。当業者であれば、利用する遺伝子解析方法に応じて、適宜、選択して実施することができる。例えば、ＰＣＲ法において増幅サイクル毎に光照射を繰り返すことによって、より確実に野生型核酸の増幅を抑制することができる。全増幅サイクルで光を照射してもよいし、任意の増幅サイクルから照射を開始又は終了してもよい。
　また、標的核酸に対して一度光連結した光連結プローブが、光照射による光平衡反応により開裂しないように、光照射時の波長の選択および出力の選択をすることも重要である。光照射時の波長の選択および出力の選択に関しては、当業者であれば過度の検討を実施せず選択可能である。
　また、別の好適な実施の態様によれば、局所的に前記プローブ濃度を高めることで前記プローブと前記標的部位との会合を効率的かつ迅速化することができ、その結果、光連結効率を向上させることができる。
　例えば、核酸は反応溶液中で負に帯電することから、アニオン性物質を共存させることにより、局所的に実質的な密度を高め、光連結効率を向上させることができる。アニオン性物質のように負に帯電した物質は、ポリエチレングリコールやデキストランのような帯電していない非イオン性ポリマーに比べて、ハイブリダイゼーションを促進し光連結効果をあげることが可能である。
　このようなハイブリダイゼーション促進剤としては、公知のアニオン性物質が使用可能であり、例えば、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、又はその塩を使用することができる。アニオン性物質は光連結が行われる反応溶液中に存在していれば良く、核酸サンプル中の対象とする遺伝子を解析する遺伝子解析方法において、光連結以外の反応に影響を及ぼさないように、当業者であれば、適切な濃度範囲を適宜検討の上決定して使用することができる。例えば、ポリアクリル酸塩は、約０．２～１０％（容量に対する重量百分率（ｗ／ｖ）で表す、以下同じ）の範囲が好ましく、０．５～５％程度がより好ましい。ポリメタクリル酸塩では、約１．０～５０％の範囲が好ましく、５～２５％程度がより好ましい。
　これらのポリマーの分子量は、広い範囲にわたるが、約５，０００～１００，０００ダルトンであることが好ましく、分子量約５，０００～１０，０００ダルトンであることがより好ましい。本発明におけるハイブリダイゼーション促進を意図して、同等の種々のアクリル酸塩重合体を使用することも可能であり、アクリル酸塩の様々な単独重合体および共重合体であって、ハイブリダイゼーション促進特性を有することが予期される化合物を使用することができる。
　なお、上記のハイブリダイゼーション効率の向上方法は、光連結条件下における、標的部位と光応答性核酸類を含むプローブのハイブリダイゼーションだけではなく、あらゆるハイブリダイゼーションにおいて有用なことは、当業者であれば自明である。
　また、本発明の光連結において、前記光連結プローブと前記標的部位との会合を効率的かつ迅速化することで光連結効率を向上させることができる。
　例えば、核酸サンプル中の標的部位を含む核酸配列の存在量に関わらず、光応答性核酸類を含む光連結プローブの濃度を高くすることで、光連結効率を向上させることができる。その場合、光連結時におけるプローブ濃度は約０．１μｍｏｌ／Ｌ以上であることが好ましく、約１μｍｏｌ／Ｌ以上であることがより好ましく、約１０μｍｏｌ／Ｌ以上であることが最も好ましい。
　このように光応答性核酸類を含む光連結プローブが、自己配列内で光連結することを抑制したり、局所的に光連結プローブの濃度を高めて標的部位と効果的にハイブリダイゼーションしたりすることで、光連結効率を向上させることが可能である。
　本発明における光連結方法は、公知の、核酸サンプル中の対象とする遺伝子を解析する遺伝子解析方法に使用することができる。これは、対象とする遺伝子の有無やその配列を同定するだけでなく、該遺伝子の精製や選択的回収も含まれることは、当業者であれば設計変更の範囲内である。
　上記の精製や選択的回収の例としては、該遺伝子の精製や核酸サンプル中の標的核酸類を含む核酸を選択的に収集する前処理工程が挙げられる。これらの前処理工程における使用は、下記に述べる遺伝子解析方法において極めて有効である。従って、該前処理の後に続いて実施される遺伝子解析方法、遺伝子検出方法において高感度で正確な解析を達成することが可能となり、好ましい。
　また、本発明で使用可能な遺伝子解析方法としては、公知の遺伝子検出方法や核酸増幅方法等が使用できる。遺伝子検出方法や核酸増幅方法としては、様々な方法が知られているが、Invader法、Sniper法、TaqMan PCR法、Hybridization Probe法、SNPIT法、Pyrominisequencing法、Denaturing High Performance Liquid Chromatography (DHPLC)法、MALDI－TOF／MS法、NanoChip法などが迅速且つハイスループットで解析する方法として挙げられる。また、本発明で使用可能な別の遺伝子解析方法としては、例えば、標的部位に未知の変異型核酸があると思われる場合に、検出領域の増幅産物について塩基配列を決定することで変異型核酸の有無を判定することができる。
　本発明の遺伝子検出方法の利用としては、標的部位に対して相補的で光応答性核酸類を含む光連結プローブを蛍光標識したものをハイブリダイゼーションさせ、光照射により該標的核酸と該光連結プローブ間で光連結させ、蛍光を検出することにより、該遺伝子を検出する方法が挙げられる。当業者であれば、本発明の光連結方法を、遺伝子解析の目的に応じて適宜変更して実施することができ、また、公知の遺伝子検出方法に容易に使用することができる。
　本発明において核酸増幅方法とは、公知のポリメラーゼ反応を利用した鋳型核酸の増幅反応をいい、例えば、ＷＯ２０１２／０３３１９０号公報に開示されている公知の核酸の増幅抑制方法において、本発明の光連結方法を利用することができる。
　核酸の増幅方法における本発明の光連結方法の利用としては、標的部位を含む検出対象である核酸配列（増幅用ヌクレオチド配列）を増幅可能なプライマーを用いて、公知の核酸増幅方法を実施する際に、検出対象である遺伝子の核酸の変異に基づいて、ある核酸配列（例えば、野生型核酸）の増幅を抑制する一方、それ以外の核酸配列（例えば、変異型核酸）のみを選択的に増幅させる方法における利用が挙げられる。
　野生型核酸又は変異型核酸のいずれを増幅抑制の対象とするかは、その目的に応じて適宜選択することができ、特に限定されるものではないが、例えば、核酸サンプル中の存在比に大きな偏りがある場合、大量に存在する核酸（例えば、野生型核酸）の増幅を抑制し、微量に存在する核酸（例えば、変異型核酸）のみを選択的に増幅することにより、微量に存在する核酸の有無を検出することができる。
　例えば、本発明の光連結方法により、増幅抑制対象である野生型核酸（標的部位を有する）に対して、該標的部位に相補的な配列を有し、光応答性核酸類を含む第一のプローブをハイブリダイゼーションさせ、光照射により該標的核酸と該第一のプローブとで光連結させることにより、該野生型核酸の増幅を抑制して、検出対象である変異型核酸のみを選択的に増幅する。
　また、ＴａｑＭａｎ法によって使用されるＴａｑＭａｎプローブのように、必要に応じて蛍光物質や消光物質で配列中の塩基を標識してもよい。変異型核酸に対するＴａｑＭａｎプローブ等の公知の検出用プローブを利用することにより、対象核酸の検出だけでなく定量を行うこともできる。
　また、本発明の光連結方法による特定の核酸の増幅抑制方法は、他の核酸増幅方法と同時に行うこともできるし、核酸増幅方法の前処理段階として実施することもできる。当業者であれば、本発明の光連結方法を、遺伝子解析の目的に応じて適宜変更して実施することができ、また、公知の遺伝子増幅方法に容易に使用することができる。
　前記選択的核酸増幅に用いるプライマーは、変異型核酸の増幅用ヌクレオチド配列を増幅することのできるプライマーであり、それは同時に、光応答性核酸類を有するプローブが光連結される前の野生型核酸において、野生型核酸の増幅用ヌクレオチド配列も増幅できるプライマーである。
　野生型配列を有する分子は光照射によって光応答性核酸類を有する光連結プローブと光連結しているため、架橋された塩基より３’末側への伸長反応が進まず増幅されない。一方、変異型配列を有する分子の大部分は光応答性核酸類を有する光連結プローブと光連結していないため、伸長反応が起こり、その結果、選択的な核酸増幅が成される。
　核酸増幅法に使用可能な増幅プライマーは、１又は２以上の標的部位を含む増幅用ヌクレオチド配列をＰＣＲにより増幅し得るプライマーであり、増幅用ヌクレオチド配列を挟む２種類のプライマーである。例えば、増幅用ヌクレオチド配列の上流端領域と相同的なヌクレオチド配列を有するフォワードプライマーと、増幅用ヌクレオチド配列の下流端領域と相補的なヌクレオチド配列を有するリバースプライマーとからなる２種類のプライマーであってもよい。なお、ＰＣＲにおいて用いられる該２種類のプライマーの各濃度は、ＰＣＲ産物として二本鎖核酸を得ることができる濃度比であれば特に限定されるものではないが、等濃度で用いることが好ましい。
　ＰＣＲに用いられるこれらのプライマーは増幅用ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列の配列情報から常法により設計、合成することができる。ＰＣＲに用いられるこれらのプライマーは、ヌクレオチド及びヌクレオチドアナログからなる群より選択される１以上がリン酸ジエステル結合により連結したものである。プライマーの長さは、プライマーのＴｍ値、増幅ヌクレオチド配列の種類等を考慮して適宜決定することができるが、１０～１００分子連結したものであることが好ましい。
　ＰＣＲ反応に使用される試薬の種類、量、調製方法および反応条件等のプロトコルは常法に従って行うことができる。なお、ＰＣＲに用いられるＤＮＡポリメラーゼは、通常ＰＣＲにおいて用いられるＤＮＡポリメラーゼであれば特に限定されるものではないが、耐熱性ポリメラーゼであることが好ましい。
　光応答性核酸類を有するプローブは、光照射により標的部位との光連結によってポリメラーゼの伸長反応を阻害することから、光応答性核酸類を有するプローブ自体にヌクレアーゼ活性に対する抵抗性は必要としない。従って、ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼの使用も可能である。但し、光応答性核酸類を有するプローブがプライマーとして機能し、ポリメラーゼの伸長反応が生じ得る場合は、ポリメラーゼによる伸長反応が起こる温度で標的分子から解離するようにＴｍ値を考慮するか、光応答性核酸類を有するプローブの３’末端に伸長反応を阻害する物質を修飾することによって増幅プライマーとして機能しないようにすることが好ましい。また、本発明の光連結方法のために第一のプローブ、第二のプローブ、第三のプローブ、第四のプローブを使用する場合、これらのプローブについても同様に、増幅プライマーとして機能しないようにＴｍ値の考慮ならびに３’末端に伸長反応を阻害するような物質を修飾することが好ましい。
　また、ＰＣＲ反応において、通常のＰＣＲ増幅反応に適した反応組成で実施できる。さらに選択的増幅反応を促すために反応液中にＤＭＳＯやホルムアミド等、ハイブリダイゼーション条件に影響を与える物質を加えることも可能である。
　本発明の光連結キットは、本発明の光連結方法が実施できるように構成される。具体的には、前記本発明の光連結方法の第一の態様、前記第二の態様、前記第三の態様などが実施される。該光連結キットを構成する第一のプローブ、第二のプローブ、第三のプローブ、第四のプローブとは、本発明の光連結方法における第一のプローブ、第二のプローブ、第三のプローブ、第四のプローブと同じものを意味する。
　本発明の第一の光連結キットとしては、少なくとも、核酸サンプル中の標的部位に対して相補的な配列を有し、該標的部位中の標的核酸と光連結する光応答性核酸類を含む第一のプローブ（光連結プローブ）と、該第一のプローブに対して、高い相補性を有する第二のプローブを含む。
　また、光応答性核酸類を含む該第二のプローブを含むこともできる。この場合、前記第二のプローブは光連結プローブとしても機能する。
　更に、光連結プローブとして機能する、前記第一のプローブ及び／又は前記第二のプローブに相補的な配列を有する第三のプローブを含むこともできる。
　本発明の第二の光連結キットとしては、少なくとも、核酸サンプル中の標的部位に対して相補的な配列を有する光応答性核酸類を含む第一のプローブ（光連結プローブ）と、該第一のプローブの該光応答性核酸類と光連結する標的核酸を含む第四のプローブと、該第一のプローブに対して、高い相補性を有する第二のプローブを含む。
　また、光応答性核酸類を含む該第二のプローブを含むこともできる。この場合、前記第二のプローブは光連結プローブとしても機能する。
　更に、光連結プローブとして機能する、前記第一のプローブ及び／又は前記第二のプローブに相補的な配列を有する第三のプローブを含むこともできる。
　本発明の第三の光連結キットとしては、少なくとも、核酸サンプル中の標的部位に対して相補的な配列を有する光応答性核酸類を含む第一のプローブ（光連結プローブ）を含み、該光連結プローブは、該光連結プローブ内の光応答性核酸類が自己会合する核酸を、該光応答性核酸類と光連結しない核酸に置換して該光連結プローブの自己内の光連結を抑制されたものである。
　本発明の光連結キットには、利用する遺伝子解析方法に応じて、反応溶液、標識酵素、核酸増幅用のポリメラーゼ、核酸増幅用のプライマー等を含むこともできる。当業者であれば、公知のキットの構成に応じて、適宜、選択して設計することができる。
　以下では、光連結プローブの光応答性核酸類としてＣＮＶＫを使用し、上皮成長因子受容体（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＥＧＦＲ）遺伝子配列の一部を標的部位とした場合を例に詳細な説明をするが、本発明の範囲はこれに限定されるものではない。本発明の精神から離れることなく、いかなる変更、改良又は改変を加えることができることは当業者には自明である。
　また、本実施例中において、アミノ酸一文字表記と該アミノ酸の位置番号とで示された表記の場合には野生型を、元のアミノ酸位置文字表記と該アミノ酸位置番号に加えて、更に置換されたアミノ酸一文字表記を組合せて表記される場合には変異型をあらわすものとする。
［実施例１：光連結プローブの自己配列内での光連結確認］
実施例１－１．光連結プローブの調製
　ＥＧＦＲ遺伝子上のエクソン２１（ｅｘ．２１）領域の一部と同配列の１００ｍｅｒからなるオリゴヌクレオチドを合成し（配列番号１）、光連結対象の鋳型とした。
［配列番号１］　１００ｍｅｒオリゴヌクレオチド：
５’－ＡＧＣＣＡＧＧＡＡＣＧＴＡＣＴＧＧＴＧＡＡＡＡＣＡＣＣＧＣＡＧＣＡＴＧＴＣＡＡＧＡＴＣＡＣＡＧＡＴＴＴＴＧＧＧＣＴＧＧＣＣＡＡＡＣＴＧＣＴＧＧＧＴＧＣＧＧＡＡＧＡＧＡＡＡＧＡＡＴＡＣＣＡＴＧＣＡＧＡＡ－３’（配列番号１）
　この合成オリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーション可能な１６ｍｅｒからなる光連結プローブは以下のように調製した。光連結プローブとして、光応答性プローブ（ｐｈｏｔｏ－ｒｅａｃｔｉｖｅ　ｐｒｏｂｅ）を光応答性核酸類である３－シアノビニルカルバゾール－１’－β－デオキシリボシド（ＣＮＶＫ）の導入位置を変えて４種類設計した（配列番号２～５）。これらＰＲＥＰの配列を表１に示す。なお、ＣＮＶＫのＰＲＥＰへの導入位置をｎとして示す。
　ＣＮＶＫは特開２００９－２５４２７９号公報に記載の方法に従って調製し、プローブの合成はファスマック社に委託した。また、ＣＮＶＫの構造式を図１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
実施例１－２．光連結プローブへの光照射処理
　実施例１－１．にて合成した各ＰＲＥＰをＴＥにて１００μｍｏｌ／Ｌに溶解し、各２００ｐｍｏｌを別々の０．２ｍＬチューブに分取した。それぞれのサンプルに対して以下の条件にて光照射を実施した。なお、光連結波長である３６５ｎｍの光照射はＵＶ－ＬＥＤ照射器（ＺＵＶ－Ｃ３０Ｈ：オムロン）を、開裂波長である３１２ｎｍの光照射はＵＶトランスイルミネーター（フナコシ）を使用した。
　条件１：光未照射
　　各ＰＲＥＰに対して光照射を行わない。
　条件２：光連結光照射
　　各ＰＲＥＰに３６５ｎｍの光を室温にて１分間照射する。
　条件３：光連結光照射＋光連結開裂光照射
　　条件２の光照射を施した各ＰＲＥＰに、３１２ｎｍの光を室温にて５分間照射する。
実施例１－３．電気泳動による評価
　光照射処理の影響を見るため、実施例１－２．の条件で処理した各々のＰＲＥＰを滅菌水で１０μｍｏｌ／Ｌに希釈後、ＭｕｌｔｉＮＡ（島津製作所）を用いてマイクロチップ電気泳動を行った。そのゲルイメージを図２～図５に示す。
　４種類すべてのＰＲＥＰにおいて、光連結波長の光を照射することにより電気泳動のバンドが低分子側にシフトした。これは、明らかにＰＲＥＰのコンフォメーションが変化したことを示唆している。
　また、光連結波長の光を照射した後に光連結開裂波長の光を照射すると、低分子側にシフトしたバンドが、光連結波長の光を照射する前（すなわち、光未照射）のバンドの位置に戻ることが確認された。これは、自己の配列内で形成していた光連結が開裂し元の状態に戻ったものと考えられる。
　この現象は、４種類すべてのＰＲＥＰにおいて同様に確認されたことから、光連結部位であるＣＮＶＫの導入位置に関係なく起こると考えられた。
［実施例２：光照射処理をした光連結プローブの光連結効率の評価］
実施例２－１．光連結プローブの調製
　評価対象の光連結プローブは、実施例１－２．で調製したＰＲＥＰａ．～ＰＲＥＰｄ．を使用した。
実施例２－２．光連結プローブの光連結反応
　０．２ｍＬチューブに、標的部位として１００ｐｍｏｌ／Ｌの合成オリゴヌクレオチド２μＬを分取し、１０μｍｏｌ／ＬのＰＲＥＰ（実施例１－２．記載の各条件で処理したもの）２μＬを加え、１×ＰＣＲバッファー（１０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．３），５０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＫＣｌ，１．５ｍｍｏｌ／Ｌ　ＭｇＣｌ２，０．００１％（Ｗ／Ｖ）　ｇｅｌａｔｉｎ）の終濃度で総量を２０μＬとした。
　これを９５℃にて５分間加熱処理し、５０℃にて５秒間静置した後、５０℃でＵＶ－ＬＥＤにより３６５ｎｍの光を３０秒間照射した。なお、対照として光を照射しないサンプルを同時に用意した。
実施例２－３．定量ＰＣＲ反応溶液の調製と反応条件
　実施例２－２．で調製したサンプル（対照サンプルを含む）の各調製液２０μＬに８０μＬの滅菌水をそれぞれ加えよく混合した後、その内５μＬずつを鋳型としてプライマーＥＧＦＲ　Ｅｘ．２１ＦおよびＥｘ．２１Ｒによりライトサイクラー（Ｌｉｇｈｔ　Ｃｙｃｌｅｒ：ロッシュ）を使用して定量ＰＣＲ反応を実施した。
　ＰＣＲ反応試薬にはＬｉｇｈｔ　Ｃｙｃｌｅｒ　Ｆａｓｔ　Ｓｔａｒｔ　ＤＮＡ　Ｍａｓｔｅｒ　ＳＹＢＥＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｉ（ロッシュ）を使用した。なお、プライマーの配列は以下の通りである。
ＥＧＦＲ　ｅｘ．２１Ｆ：５’－ＧＡＡＣＧＴＡＣＴＧＧＴＧＡＡＡＡＣＡＣＣ－３’（配列番号６）
ＥＧＦＲ　ｅｘ．２１Ｒ：５’－ＧＣＡＴＧＧＴＡＴＴＣＴＴＴＣＴＣＴＴＣＣ－３’（配列番号７）
実施例２－４．光連結効率の評価
　実施例２－２．で光連結処理を実施したサンプルと光連結処理を実施しなかった対照のサンプルを鋳型として、それぞれ実施例２－３．の条件にて定量ＰＣＲ反応を実施した。ＰＲＥＰが光連結した標的部位は、共有結合により架橋された箇所でポリメラーゼの伸長反応が止まるため、増幅反応の鋳型として機能しなくなる。従って、定量ＰＣＲ反応において、光連結処理を実施しなかった対照サンプルよりも通常遅いサイクルにて蛍光シグナルが立ち上がってくる。そのため、ＰＲＥＰにより光連結された標的部位の量を以下の式に従い算出し、光連結効率として表記することができる。
ΔＣｔ＝光連結処理後の標的部位のＣｔ値－光連結未処理の標的部位のＣｔ値
光連結効率（％）＝（１－２ΔＣｔ）×１００
　このようにして、各ＰＲＥＰの標的部位への光連結効率を評価した結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　その結果、いずれのＰＲＥＰにおいても、光連結波長を１分間照射した後においては著しく光連結効率が低下していることが確認された。また、開裂波長を５分間照射することによって、一度失われた光連結効率が再び回復し、光連結可能な状態になっていることが確認された。
　この結果から、ＰＲＥＰに対して光連結波長が照射されると、ＰＲＥＰの自己配列内で光連結され、その結果、ＰＲＥＰの光連結能が消失したことで、標的部位に対する光連結効率が大きく低下したと考えられる。
　さらに、自己の配列内で光連結してしまったＰＲＥＰに対して光連結開裂波長である３１２ｎｍの光を照射することで、自己配列内で形成していた光連結が開裂し元の状態に戻ったために、低下していた光連結効率が回復したと考えられる。
　また、いずれのＰＲＥＰにおいても光連結能の消失および回復が認められることからＰＲＥＰに対するＣＮＶＫの導入位置に関わらずＰＲＥＰの自己内での光連結および開裂が起こることが示唆された。
　これらの結果は、実施例１において光連結反応後の電気泳動バンドがシフトし、光連結開裂波長の光を照射した後には電気泳動バンドが元の位置に戻った事実とも一致するものである。
［実施例３：プリン塩基のみで構成される光連結プローブにおける自己配列内での光連結確認］
　光応答性核酸類であるＣＮＶＫとは光連結しない、プリン塩基のみで構成されたＰＲＥＰを合成し、合成した各ＰＲＥＰが光連結波長の光を照射しても自己配列内で光連結しないことを確認した。
実施例３－１．光連結プローブの調製
　光連結プローブとして、プリン塩基であるアデニン（Ａ）もしくは、グアニン（Ｇ）のみで構成した以下の３種のＰＲＥＰを調製した。合成したＰＲＥＰの配列を表３に示す。その際、光応答性核酸類であるＣＮＶＫの導入位置（Ｘ）および鎖長（１６ｍｅｒ）は統一とした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
実施例３－２．光連結プローブへの光照射処理
　実施例３－１．にて合成した各ＰＲＥＰをＴＥにて１００μｍｏｌ／Ｌに溶解し、各２００ｐｍｏｌを別々の０．２ｍＬチューブに分取した。それぞれのサンプルに対して以下の条件にて光照射を実施した。
　なお、光連結波長である３６５ｎｍの光照射はＵＶ－ＬＥＤ照射器を使用した。
　条件１：光未照射
　　各ＰＲＥＰに対して光照射を行わない。
　条件２：光連結光照射
　　各ＰＲＥＰに３６５ｎｍの光を４℃にて３分間照射する。
実施例３－３．電気泳動による評価
　光照射処理の影響をみるために、実施例３－２．の条件で処理した各々のＰＲＥＰを滅菌水で１０μｍｏｌ／Ｌに希釈後、ＭｕｌｔｉＮＡを用いてマイクロチップ電気泳動を行った。そのゲルイメージを図６～図８に示す。
　３種類いずれのＰＲＥＰにおいても、光連結波長の光を照射する前後で、電気泳動のバンドに移動度の違いは見られなかった。このことから、プリン塩基のみで構成されたＰＲＥＰは、光応答性核酸類であるＣＮＶＫと結合可能な塩基がプローブの配列内に存在していないため、自己の配列内で光連結しなかったことが推察された。
［実施例４：相補配列を利用した光連結プローブの自己配列内での光連結抑制］
実施例４－１．光連結プローブの調製
　野生型配列であるＥＧＦＲ遺伝子上の７９０番目のスレオニン（Ｔ７９０）、８５８番目のロイシン（Ｌ８５８）および８６１番目のロイシン（Ｌ８６１）に該当する核酸配列を標的部位として、ＥＧＦＲ遺伝子のコード鎖、すなわち、センス鎖にハイブリダイゼーションするアンチセンス鎖（ＡＳ鎖）の光連結プローブであるＰＲＥＰを設計し、同時にＥＧＦＲ遺伝子のアンチセンス鎖にハイブリダイゼーションするセンス鎖（Ｓ鎖）の光連結プローブであるＰＲＥＰも設計した。その際に、センス鎖のＰＲＥＰとアンチセンス鎖のＰＲＥＰの相補性を以下の組み合わせのように変化させ、お互いの光連結プローブ同士が光連結しない位置に実施例１で記載したＣＮＶＫを配した。図９に光連結プローブとして実際に使用したＰＲＥＰの配列とその相補性についての模式図を示す。図中のＡＳ鎖は野生型ＥＧＦＲ遺伝子配列のセンス鎖と相補的であることを意味し、Ｓ鎖は野生型ＥＧＦＲ遺伝子配列のアンチセンス鎖と相補的であることを意味するものとする。
（１）Ｌ８６１：　相補性が低い組み合わせの例
Ｌ８６１　ＡＳ鎖：５’－ＣＴＣＴＴＣＣＧＣＡＣＣＣＡｎＣＡＧ－３’（配列番号１１）
Ｌ８６１　Ｓ鎖　：５’－ＴＴＧＧＧＣＴＧＧＣＣＡＡｎＣＴＧＣ－３’（配列番号１２）
（２）Ｔ７９０：　相補性が高い組み合わせの例
Ｔ７９０　ＡＳ鎖：５’－ＴＧＡｎＣＴＧＣＧＴＧＡＴＧＡＧ－３’（配列番号１３）
Ｔ７９０　Ｓ鎖　：５’－ＣＡｎＣＴＣＡＴＣＡＣＧＣＡＧＣ－３’（配列番号１４）
（３）Ｌ８５８：　相補性が（１）及び（３）の中間的な組み合わせの例
Ｌ８５８　ＡＳ鎖：５’－ＣＡｎＴＴＴＧＧＣＣＡＧＣＣＣ－３’（配列番号１５）
Ｌ８５８　Ｓ鎖　：５’－ＣＡｎＴＴＴＧＧＧＣＴＧＧＣＣＡ－３’（配列番号１６）
実施例４－２．光連結プローブへの光照射処理
　光連結プローブへの光照射処理は、以下の条件に従って実施した。
　条件１：ＡＳ鎖、光未照射
　　実施例４－１．にて合成したＥＧＦＲ遺伝子のセンス鎖にハイブリダイゼーションするＡＳ鎖のＰＲＥＰを各々、ＴＥにより１０μｍｏｌ／Ｌに調製したものを条件１とした。
　条件２：ＡＳ鎖、光照射
　　条件１と同様に調製した各々のＡＳ鎖のＰＲＥＰを、サーマルサイクラー（アプライド社製）にて４℃にした後、ＵＶ－ＬＥＤ照射器にて３６５ｎｍの光を３分間照射したものを条件２とした。
　条件３：Ｓ鎖、光未照射
　　実施例１－１．にて合成したＥＧＦＲ遺伝子のアンチセンス鎖にハイブリダイゼーションするＳ鎖のＰＲＥＰを各々、ＴＥにより１０μｍｏｌ／Ｌに調製したものを条件３とした。
　条件４：Ｓ鎖、光照射
　　条件３と同様に調製した各々のＳ鎖のＰＲＥＰを、サーマルサイクラーにて４℃にした後、ＵＶ－ＬＥＤ照射器にて３６５ｎｍの光を３分間照射したものを条件４とした。
　条件５：Ｓ鎖＋ＡＳ鎖光未照射
　　実施例４－１．にて合成したＥＧＦＲ遺伝子のセンス鎖にハイブリダイゼーションするＡＳ鎖のＰＲＥＰと、ＥＧＦＲ遺伝子のアンチセンス鎖にハイブリダイゼーションするＳ鎖のＰＲＥＰを、それぞれが終濃度で１０μｍｏｌ／Ｌになるように混合したものを条件５とした。
　条件６：Ｓ鎖＋ＡＳ鎖光照射
　　条件５と同様に混合した各ＰＲＥＰ溶液を、サーマルサイクラーにて４℃にした後、ＵＶ－ＬＥＤ照射器にて光を３分間照射したものを条件６とした。
実施例４－３．電気泳動による評価
　実施例４－２．の条件にて調製したＰＲＥＰ試料を、ＭｕｌｔｉＮＡを用いてマイクロチップ電気泳動を行った。そのゲルイメージを、図１０～図１２に示す。図１０は（１）Ｌ８６１を標的部位としたＰＲＥＰの組み合わせ、図１１は（２）Ｔ７９０、図１２は（３）Ｌ８５８の結果である。
（１）Ｌ８６１：相補性が低い組み合わせ
　電気泳動の結果より、相補性が低い組み合わせでは、センス鎖に対するＰＲＥＰ単独の場合、アンチセンス鎖に対するＰＲＥＰ単独の場合のいずれも光照射処理後にバンドシフトが認められ、自己の配列内で光連結されていることが示唆された（図１０のレーン１～４）。
　また、センス鎖に対するＰＲＥＰとアンチセンス鎖に対するＰＲＥＰを混合した条件５においては、条件１および条件３において見られた、センス鎖に対するＰＲＥＰ単独の場合及びアンチセンス鎖に対するＰＲＥＰ単独の場合と同じ位置にバンドが認められたことから、センス鎖に対するＰＲＥＰとアンチセンス鎖に対するＰＲＥＰとはハイブリダイゼーションしていないと考えられた。
さらに、センス鎖に対するＰＲＥＰとアンチセンス鎖に対するＰＲＥＰを混合し光照射した条件６においても、センス鎖に対するＰＲＥＰに光照射処理した条件２とアンチセンス鎖に対するＰＲＥＰに光照射処理した条件４のバンドと同じ位置にバンドが認められた。
（２）Ｔ７９０：相補性が高い組み合わせ
　電気泳動の結果より、相補性が高い組み合わせにおいても、センス鎖に対するＰＲＥＰ単独の場合、アンチセンス鎖に対するＰＲＥＰ単独の場合のいずれも光照射処理後にバンドシフトが認められ、自己の配列内で光連結していることが示唆された（図１１のレーン１～４）。
　また、センス鎖に対するＰＲＥＰとアンチセンス鎖に対するＰＲＥＰを混合した条件５においては、光照射を行っていない条件１のセンス鎖に対するＰＲＥＰ単独の場合と、光照射を行っていない条件３のアンチセンス鎖に対するＰＲＥＰ単独の場合とは、異なる位置に一本のバンドが認められたことから、センス鎖に対するＰＲＥＰとアンチセンス鎖に対するＰＲＥＰがハイブリダイゼーションしていることが推察された。
　さらに、センス鎖に対するＰＲＥＰとアンチセンス鎖に対するＰＲＥＰを混合したものに光照射を行った条件６においては、光照射する前と同じ位置にバンドが認められ、センス鎖に対するＰＲＥＰ、アンチセンス鎖に対するＰＲＥＰの光照射による自己の配列内で光連結した場合に検出される位置には、バンドが認められなかった。
　このことから、光照射時にセンス鎖に対するＰＲＥＰとアンチセンス鎖に対するＰＲＥＰがハイブリダイゼーションしていれば、自己の配列内で光連結は起こらないことが示唆された。
（３）Ｌ８５８：相補性が（１）及び（２）の中間的な組み合わせ
　電気泳動の結果より、相補性が中間的な組み合わせにおいても、センス鎖に対するＰＲＥＰ単独の場合、アンチセンス鎖に対するＰＲＥＰ単独の場合のいずれも光照射後にバンドシフトが認められ自己の配列内で光連結していることが示唆された（図１２のレーン１～４）。
　また、センス鎖に対するＰＲＥＰとアンチセンス鎖に対するＰＲＥＰを混合した条件５においては、光照射を行っていない条件１のセンス鎖に対するＰＲＥＰ単独の場合と、光照射を行っていない条件３のアンチセンス鎖に対するＰＲＥＰの単独の場合とは、異なる位置にバンドが認められたことから、センス鎖に対するＰＲＥＰとアンチセンス鎖に対するＰＲＥＰがハイブリダイゼーションしていることが推察された。
　さらに、センス鎖に対するＰＲＥＰとアンチセンス鎖に対するＰＲＥＰを混合したものに光照射を行った条件６においては、光照射する前とは異なる位置に２本のバンドが確認された。
　低分子側のバンド（下のバンド）はセンス鎖に対するＰＲＥＰ単独の場合、又はアンチセンス鎖に対するＰＲＥＰ単独の場合に光照射し自己の配列内で光連結された場合のバンドの位置と同じであることから、センス鎖に対するＰＲＥＰ又はアンチセンス鎖に対するＰＲＥＰの自己会合に由来するバンドと考えられた。
　また、高分子側のバンド（上のバンド）は、センス鎖に対するＰＲＥＰ単独の場合、アンチセンス鎖に対するＰＲＥＰ単独の場合の、自己会合由来のバンドとも異なる位置に認められた。このことから、センス鎖に対するＰＲＥＰとアンチセンス鎖に対するＰＲＥＰとのハイブリダイゼーションは維持されているが、ハイブリダイゼーション出来ない塩基の部分にて光連結が行われ、バンドがシフトしたものと考えられた。
　以上より、相補性が低いＰＲＥＰを混合して使用した場合においては、センス鎖に対するＰＲＥＰ又はアンチセンス鎖に対するＰＲＥＰをそれぞれ単独で使用した場合にも、各々のＰＲＥＰを混合させて使用した場合にも、ＰＲＥＰが自己の配列内で光連結することが確認された。
　また、センス鎖に対するＰＲＥＰとアンチセンス鎖に対するＰＲＥＰとが中程度の相補性がある場合でも、ハイブリダイゼーションしていない塩基中にＣＮＶＫと光連結可能なシトシン又はチミンのようなピリミジン塩基が存在していると、自己の配列内において光連結してしまうことが示唆された。
　このことから、光連結プローブが自己の配列内で光連結することを抑制するためには、光連結プローブ間の相補性を高くすることが効果的であると考えられた。また、ＣＮＶＫと光連結可能なピリミジン塩基が相補鎖によって覆われ、ＣＮＶＫと結合可能な状態で存在しないようにすることが効果的であると考えられた。
［実施例５：相補性の高い光連結プローブを用いた光連結の確認］
実施例５－１．光連結プローブの調製
　Ｔ７９０を標的部位とした、実施例４－１．（２）で調製した相補性の高い組合せであるＰＲＥＰを使用した。
実施例５－２．ＥＧＦＲエクソン２０（ｅｘ．２０）領域における野生型遺伝子断片の調製
　健常者の末梢血から通常の方法によりヒトゲノムＤＮＡを調製し、これを鋳型としてプライマーセットＥＧＦＲ　ｅｘ．２０Ｆ及びＥＧＦＲ　ｅｘ．２０Ｒを使用してＴ７９０に該当する核酸配列を包むＥＧＦＲエクソン２０（ｅｘ．２０）の領域を通常のＰＣＲ反応条件により増幅した。ＰＣＲ反応に用いたプライマー配列は以下の通りである。
ＥＧＦＲ　ｅｘ．２０Ｆ：５’－ＣＡＧＡＡＧＣＣＴＡＣＧＴＧＡＴＧＧ－３’（配列番号１７）
ＥＧＦＲ　ｅｘ．２０Ｒ：５’－ＡＣＣＴＴＴＧＣＧＡＴＣＴＧＣＡＣＡＣ－３’（配列番号１８）
　得られたＰＣＲ増幅産物をｐＧＥＭＴ　ｅａｓｙ　Ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ）内に、添付のプロトコルに従って挿入しクローニングした。
　このプラスミドを鋳型として、前記プライマーセットＥＧＦＲ　ｅｘ．２０Ｆ及びＥＧＦＲ　ｅｘ．２０Ｒを使用して通常のＰＣＲ反応条件によって増幅を行い、ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（キアゲン）を用いて精製することで、直鎖状のＥＧＦＲ　ｅｘ．２０の野生型遺伝子断片を得た（配列番号１９）。
　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて精製したＥＧＦＲ　ｅｘ．２０の野生型遺伝子断片の重量濃度をＮａｎｏＤｒｏｐ　ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｔｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて測定し、増幅断片長を考慮して各遺伝子断片のコピー数を算出したものを、野生型核酸として以下の反応の検討鋳型として用いた。
［配列番号１９］　ＥＧＦＲ　ｅｘ．２０野生型断片
５’－ＣＡＧＡＡＧＣＣＴＡＣＧＴＧＡＴＧＧＣＣＡＧＣＧＴＧＧＡＣＡＡＣＣＣＣＣＡＣＧＴＧＴＧＣＣＧＣＣＴＧＣＴＧＧＧＣＡＴＣＴＧＣＣＴＣＡＣＣＴＣＣＡＣＣＧＴＧＣＡＧＣＴＣＡＴＣＡＣＧＣＡＧＣＴＣＡＴＧＣＣＣＴＴＣＧＧＣＴＧＣＣＴＣＣＴＧＧＡＣＴＡＴＧＴＣＣＧＧＧＡＡＣＡＣＡＡＡＧＡＣＡＡＴＡＴＴＧＧＣＴＣＣＣＡＧＴＡＣＣＴＧＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＧＴＧＣＡＧＡＴＣＧＣＡＡＡＧＧＴ－３’（配列番号：１９）
実施例５－３．光連結反応時の試薬組成
　０．２ｍＬチューブに、実施例５－２．で調製した標的核酸（１×１０７コピー／μＬ）を２μＬと、１０μｍｏｌ／Ｌに調製した、実施例４－１．（２）に示すＴ７９０に該当する核酸塩基を標的とした、Ｔ７９０　ＡＳ鎖（配列番号３）及びＴ７９０　Ｓ鎖（配列番号４）のＰＲＥＰをそれぞれ２μＬずつ加え、１×ＰＣＲバッファー（１０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．３），５０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＫＣｌ，１．５ｍｍｏｌ／Ｌ　ＭｇＣｌ２，０．００１％（Ｗ／Ｖ）　ｇｅｌａｔｉｎ）の終濃度で総量を２０μＬとした。
実施例５－４．光連結反応時の条件
　実施例５－３．で調製した核酸サンプル溶液に対して、２つの温度条件にて光連結波長である３６５ｎｍの光照射を実施した。なお、対照として光を照射しないサンプルを同時に用意した。
　条件１：５０℃において光照射
　　９５℃にて３分間加熱処理後、５０℃にて３０秒間静置した後、５０℃で光を３０秒間照射した。
　条件２：４℃において光照射
　　９５℃にて３分間加熱処理後、４℃にて１分間静置した後、４℃で３０秒間光照射した。
実施例５－５．定量ＰＣＲによる光連結量の確認
　実施例５－４．で光連結反応を実施した各反応液２０μＬに８０μＬの滅菌水をそれぞれ加えよく混合した後、その内５μＬずつを鋳型としてライトサイクラー（ＬＣ　４８０　Ｖｅｒ２：ロッシュ）を使用して定量ＰＣＲ反応を実施した。
　定量ＰＣＲ用反応液としては、以下の試薬を混合して調製し、１サンプルあたりの最終液量が２５μＬになるように滅菌水を加えて調製した。１２．５μＬの２×Ｐｒｅｍｉｘ　Ｅｘ　Ｔａｑ（登録商標）（タカラバイオ）に、増幅プライマーとしてＥＧＦＲ　ｅｘ．２０Ｆ及びＥＧＦＲ　ｅｘ．２０Ｒをそれぞれ５ｐｍｏｌずつ添加した。
　さらに末端蛍光標識した検出プローブを２．５ｐｍｏｌ添加した。この検出プローブの配列は以下の通りである。
Ｔｏｔａｌ　ＬＮＡプローブ：５’－Ｃｙ５／ＣＴＴ＋ＣＧＧＣ＋ＴＧＣ＋ＣＴＣ／ＢＨＱ２－３’（配列番号２０）
　なお、配列中の＋はそれに続く塩基がＬＮＡであることを示し、Ｃｙ５はクエンチャーとなる蛍光色素を、ＢＨＱ２は蛍光抑制物質を、それぞれ示す。当該検出プローブの合成はＩＤＴ社に委託した。
　また、定量ＰＣＲ反応は９５℃，１０秒＋（９５℃，３秒／５８℃，３０秒）×４５サイクルの条件で実施した。
　各々の試料について、光連結効率は実施例２と同様に定量ＰＣＲで算出したΔＣｔ値から評価した。その結果を図１３に示す。
　５０℃で光連結波長である３６５ｎｍの光照射をした場合、ΔＣｔが４程度で光を複数回照射してもほぼ一定であるのに対して（図１３における黒丸）、４℃で実施した場合には光を照射するたびにΔＣｔが上昇することが確認された（図１３における黒三角形）。この事は、５０℃においては、光を複数回照射しても光連結量が増加しないのに対して、４℃においては光を照射するたびに光連結量が増加していることを意味している。
　従って、４℃においては、ＰＲＥＰ相補鎖間のハイブリダイゼーション形成が維持され、ＰＲＥＰの自己配列内での光連結が抑制されたため、光を複数回照射するたびに光連結量が増加したのに対し、５０℃においては、ＰＲＥＰ相補鎖間のハイブリダイゼーションが十分に維持されず、ＰＲＥＰが自己の配列内で光連結したことにより、ＰＲＥＰが鋳型に対して光連結できなくなったために、光を複数回照射しても光連結量が増加しないものと考えられた。
　つまり、光連結プローブの自己の配列内での光連結を抑制するためには、光連結プローブの相補鎖の相補性を高めることと、相補的な光連結プローブ同士（又は光連結プローブと相補的な第二のプローブと）が十分にハイブリダイゼーションを形成できる温度条件で光を照射する必要がある。
［実施例６：ハイブリダイゼーション促進のための添加剤検討］
　実施例５の結果から、５０℃にて光を照射した際には相補的な光連結プローブ同士のハイブリダイゼーションが維持できていないことが示唆された。そこで、光連結プローブ間のハイブリダイゼーションを促進可能な添加剤に関して検討を実施した。種々検討を実施したが、その中でも効果が高かった陰性荷電を持つ高分子（ポリアクリル酸：ｐＡＡｃ）に関しての結果を示す。
実施例６－１．光連結プローブの調製
　Ｔ７９０に該当する核酸配列を標的とした、実施例４－１．（２）で調製した相補性の高い組合せであるＰＲＥＰを使用した。
実施例６－２．ＥＧＦＲエクソン２０（ｅｘ．２０）領域における野生型遺伝子断片の調製
　健常者の末梢血を材料として、実施例５－２．と同じ方法でＥＧＦＲ　ｅｘ．２０領域における野生型遺伝子断片を調製した。
実施例６－３．光連結反応時の試薬組成
　０．２ｍＬチューブに、実施例６－２．で調製したｅｘ．２０の野生型遺伝子断片（１×１０７コピー）を２μＬと、１０μｍｏｌ／Ｌに調製した、実施例４－１．（２）に示すＴ７９０に該当する核酸配列を標的とした、Ｔ７９０　ＡＳ鎖（配列番号３）及びＴ７９０　Ｓ鎖（配列番号４）の光連結プローブであるＰＲＥＰをそれぞれ２μＬと、１０％（ｗ／ｗ）ポリアクリル酸（ｐＡＡｃ）を２μＬ加え、１×ＰＣＲバッファー（１０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．３），５０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＫＣｌ，１．５ｍｍｏｌ／Ｌ　ＭｇＣｌ２，０．００１％（Ｗ／Ｖ）　ｇｅｌａｔｉｎ）の終濃度で総量を２０μＬとした。
実施例６－４．光連結反応時の条件
　実施例５－３．で調製した核酸サンプル溶液に対して以下の条件で光照射を実施した。なお、対照として３６５ｎｍの光を照射しないサンプルを同時に用意した。
　条件１：ポリアクリル酸（ｐＡＡｃ）添加した核酸サンプル溶液について、４℃で光照射した。
　条件２：ポリアクリル酸（ｐＡＡｃ）未添加の核酸サンプル溶液について、４℃で光照射した。
　条件３：ポリアクリル酸（ｐＡＡｃ）添加の核酸サンプル溶液について、５０℃で光照射した。
　条件４：ポリアクリル酸（ｐＡＡｃ）未添加の核酸サンプル溶液について、５０℃で光照射した。
実施例６－５．定量ＰＣＲによる光連結量の確認
　実施例５－４．で光照射により光連結させた試料について、定量ＰＣＲを行った。定量ＰＣＲの条件は実施例５と同一の条件で実施した。
　各々の試料について、光連結効率は実施例２と同様に定量ＰＣＲで算出したΔＣｔ値から評価した。４℃で光照射した結果については図１４に、５０℃で光照射した結果については図１５に示す。
　光連結波長である３６５ｎｍの光照射処理を４℃で行った場合には、ｐＡＡｃを添加することで光照射１サイクルでのΔＣｔが増加していた（図１４における黒三角形）。これは、ｐＡＡｃを添加したことで鋳型に対してＰＲＥＰがより効果的にハイブリダイゼーション可能になり、光照射１回あたりの光連結量を増加させたためである。つまり、ｐＡＡｃはＰＲＥＰと鋳型のハイブリダイゼーションを促進させている。
　また、光連結波長である３６５ｎｍの光照射処理を５０℃で行った場合においても、ｐＡＡｃを添加することでΔＣｔが大きく増加していた（図１５における黒三角形）。これは、光連結波長である３６５ｎｍの光照射処理を４℃で行った場合の結果と同様に、ｐＡＡｃによって鋳型に対してＰＲＥＰがより効果的にハイブリダイゼーション可能になったことに加え、ＰＲＥＰ相補鎖間でのハイブリダイゼーションが促進されたため、ＰＲＥＰの相補鎖間で十分なハイブリダイゼーションの形成が可能となり、その結果、ＰＲＥＰの自己配列内での光連結が抑制されたものと考えられた。
　このことからも、光連結波長である３６５ｎｍの光照射時に光連結プローブ相補鎖間のハイブリダイゼーションを維持し、光連結プローブの自己配列内での光連結を抑制し、光連結プローブを光連結可能な状態に維持することが光連結効率を向上させることに効果的であることが確認された。
［実施例７：遺伝子変異検出感度の確認］
　これまでの実施例に示した通り、光連結プローブの自己配列内での光連結を抑制することで、標的部位との光連結効率を向上することが可能であることが分かった。この事を踏まえ、遺伝子変異検出感度への効果を検証するため、ＥＧＦＲ遺伝子のＴ７９０Ｍを標的として遺伝子変異検出を行った。
実施例７－１．変異型ＥＧＦＲ遺伝子断片の調製
　実施例５－２．で調製した野生型プラスミドに、公知の方法に従い、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｂａｓａｌ　Ｋｉｔ（タカラバイオ）を用いてＴ７９０Ｍの変異を導入した。すなわち、当該方法により、ＥＧＦＲ遺伝子の２６３９番目の塩基をシトシン（Ｃ）からチミン（Ｔ）に変異させた。これを変異型プラスミドとした。
　次に、このプラスミドを鋳型として、実施例４に記載のプライマーセットＥＧＦＲ　ｅｘ．２０Ｆ及びＥＧＦＲ　ｅｘ．２０Ｒを使用して通常のＰＣＲ反応条件によって増幅を行い、直鎖状のＥＧＦＲ変異型遺伝子断片を得た。得られた変異型遺伝子断片をＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔを用いて精製した後、重量濃度をＮａｎｏＤｒｏｐ　ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｔｏｍｅｔｅｒを用いて測定し、増幅断片長を考慮して各遺伝子断片のコピー数を算出したものを変異型核酸とし、以下の検討の鋳型として用いた（配列番号２１）。
ＥＧＦＲ　ｅｘ．２０　変異型断片
５’－ＣＡＧＡＡＧＣＣＴＡＣＧＴＧＡＴＧＧＣＣＡＧＣＧＴＧＧＡＣＡＡＣＣＣＣＣＡＣＧＴＧＴＧＣＣＧＣＣＴＧＣＴＧＧＧＣＡＴＣＴＧＣＣＴＣＡＣＣＴＣＣＡＣＣＧＴＧＣＡＡＣＴＣＡＴＣＡＴＧＣＡＧＣＴＣＡＴＧＣＣＣＴＴＣＧＧＣＴＧＣＣＴＣＣＴＧＧＡＣＴＡＴＧＴＣＣＧＧＧＡＡＣＡＣＡＡＡＧＡＣＡＡＴＡＴＴＧＧＣＴＣＣＣＡＧＴＡＣＣＴＧＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＧＴＧＣＡＧＡＴＣＧＣＡＡＡＧＧＴ－３’（配列番号：２１）
実施例７－２．変異型混入サンプルの調製
　実施例５－２．で調整した野生型核酸と実施例７－１．で調製した変異型核酸の混合比率を変えて３種類（変異１％、変異０．１％、変異０．０１％）調製し、変異型核酸検出用の試料として用いた。使用した野生型核酸と変異型核酸の混合比を表４に示す。また、変異型核酸を混合しない試料を変異０％の試料とした。また、混合型は１μＬあたりのコピー数を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
実施例７－３．光連結プローブの調製
　Ｔ７９０に該当する核酸配列を標的とした、実施例１－１．（２）で調製した相補性の高い組合せである光連結プローブを使用した。
実施例７－４．光連結反応時の試薬組成
　０．２ｍＬチューブに、実施例７－２．で調製した実施例４－１．（２）に示すＴ７９０に該当する核酸配列を標的とした、Ｔ７９０　ＡＳ鎖（配列番号１３）及びＴ７９０　Ｓ鎖（配列番号１４）のＰＲＥＰをそれぞれ２μＬと、１０％（ｗ／ｗ）ポリアクリル酸（ｐＡＡｃ）を２μＬ加え、１×ＰＣＲバッファー（１０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．３），５０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＫＣｌ，１．５ｍｍｏｌ／Ｌ　ＭｇＣｌ２，０．００１％　（Ｗ／Ｖ）　ｇｅｌａｔｉｎ）の終濃度で総量を２０μＬとした。
実施例７－５．光連結反応時の条件
　実施例７－４．で調製したサンプルに対して、ＵＶ－ＬＥＤにより光連結波長である３６５ｎｍの光照射を実施した。９５℃にて３分間加熱処理後、９５℃にて３０秒間維持し、５０℃にて５秒間静置した後、５０℃で光を３０秒間照射する工程を１サイクルとし、合計１０回繰り返した。
実施例７－６．定量ＰＣＲによる光連結量の確認
　実施例７－５．の各調製液２０μＬに８０μＬの滅菌水をそれぞれ加えよく混合した後、その内５μＬを取り４５μＬの滅菌水を加えた。この内５μＬずつを鋳型としてライトサイクラーを使用して定量ＰＣＲ反応を実施した。なお、定量ＰＣＲは実施例５及び実施例６と同一の条件で実施した。
　その結果を図１６に示す。図１６において、ａは変異１％、ｂは変異０．１％、ｃは変異０．０１％、ｄは変異０％の結果を示す。グラフの縦軸は蛍光強度の対数表示値であり、横軸はＰＣＲサイクル数である。変異型０％（野生型のみ）に比して、変異が混入している場合は蛍光シグナルが高くなっている。その結果、変異１％から変異０．０１％まで濃度依存的に変異を検出していることが確認された。これは、ＰＲＥＰの自己配列内で光連結を抑制することで、野生型配列に対する光連結効率が向上したことに起因すると思われる。
　光連結プローブの自己配列内での光連結を抑制することで、これまで非常に難しかった変異０．０１％の存在比においても変異型核酸を選択的かつ効果的に増幅することが可能となった。
　以上より、本法は高感度かつ高精度に変異遺伝子を検出可能であることが示された。
［実施例８：イノシンを導入したＰＲＥＰの評価］
実施例８－１．光連結プローブ（ＰＲＥＰ）の調製
　光連結対象の鋳型としては、実施例１－１．で調製した、ＥＧＦＲ遺伝子上のエクソン２１（ｅｘ．２１）領域の一部と同配列の１００ｍｅｒからなるオリゴヌクレオチドを使用した。
　この合成オリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーション可能な１６ｍｅｒからなるＰＲＥＰをイノシンの導入位置を変えて３種類設計した（配列番号２３～２５）。１つは、イノシンを導入しないＰＲＥＰを比較対象用のコントロールとして設計した（配列番号２２）。これらＰＲＥＰの配列を表５に示す。尚、光連結性核酸類であるＣＮＶＫのＰＲＥＰへの導入位置をｎとし、イノシンの導入位置をＩとして示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
実施例８－２．ＰＲＥＰへの光照射処理
　実施例８－１．にて合成した各ＰＲＥＰをＴＥにて１００μｍｏｌ／Ｌに溶解し、各２００ｐｍｏｌを別々の０．２ｍＬチューブに分取した。それぞれのサンプルに対して以下の条件にて光照射を実施した。尚、クランプ形成波長である３６５ｎｍの光照射はＵＶ－ＬＥＤ照射器（ＺＵＶ-Ｃ３０Ｈ：オムロン）を使用した。
　条件１：光未照射
　　各ＰＲＥＰに対して光照射を行わない。
　条件２：クランプ形成光照射
　　各ＰＲＥＰに３６５ｎｍの光を４℃にて３分間照射する。
実施例８－３．電気泳動による評価
　光照射処理の影響を見るため、実施例８－２．の条件で処理した各々のＰＲＥＰを滅菌水で１０μｍｏｌ／Ｌに希釈後、ＭｕｌｔｉＮＡ（島津製作所）を用いてマイクロチップ電気泳動を行った。そのゲルイメージを図１７に示す。
　イノシンを導入していないＰＲＥＰ（ＰＲＥＰ　ｅ．）、イノシンを１箇所導入したＰＲＥＰ（ＰＲＥＰ　ｆ．）はＵＶ照射後のバンドが低分子側にシフトしているのに対して、イノシンを２個、３個導入したＰＲＥＰ（ＰＲＥＰ　ｇ．、ＰＲＥＰ　ｈ．）はＵＶ照射後のバンドシフトが見られなくなった。これは、イノシンを導入していないＰＲＥＰ、イノシンを１個しか導入していないＰＲＥＰは、ＵＶ照射により明らかなＰＲＥＰのコンフォメーション変化が生じているのに対して、イノシンを２個、３個導入することでＰＲＥＰのコンフォメーション変化を抑制したことを示している。
　このことから、ＰＲＥＰ内のクロスリンクターゲットとなるピリミジン塩基をイノシンのようなクロスリンクターゲットとならない塩基に置き換えることで、ＰＲＥＰの自己配列内でのクランプ形成を抑制可能であることが示された。
［実施例９：光照射処理をしたＰＲＥＰのクランプ形成効率の評価］
実施例９－１．光連結プローブ（ＰＲＥＰ）の調製
　評価対象のＰＲＥＰは、実施例８－１．で調製したＰＲＥＰ　ｅ．とＰＲＥＰ　ｈ．を使用した。
実施例９－２．ＰＲＥＰの光連結反応（クランプ形成反応）
　０．２ｍＬチューブに、標的部位を有する核酸配列として１００ｐｍｏｌ／Ｌの合成オリゴヌクレオチド２μＬを分取し、１００μｍｏｌ／ＬのＰＲＥＰ（実施例８－２．記載の各条件で処理したもの）２μＬを加え、１×ＰＣＲバッファー（１０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．３），５０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＫＣｌ，１．５　ｍｍｏｌ／Ｌ　ＭｇＣｌ２，０．００１％（Ｗ／Ｖ）ｇｅｌａｔｉｎ）の終濃度で総量を２０μＬとした。
　これを９５℃にて５分間加熱処理し、４５℃にて５秒間静置した後、４５℃でＵＶ－ＬＥＤにより３６５ｎｍの光を３０秒間照射した。尚、対照として光を照射しないサンプルを同時に用意した。
実施例９－３．定量ＰＣＲ反応溶液の調製と反応条件
　実施例９－２．で調製したサンプル（対照サンプルを含む）の各調製液２０μＬに８０μＬの滅菌水をそれぞれ加えよく混合した後、更にその内５μＬずつを４５μＬの滅菌水に混合した。混合したサンプルの内５μＬを鋳型としてライトサイクラー（ＬＣ　４８０Ｖｅｒ２：ロッシュ社製）を使用して定量ＰＣＲ反応を実施した。
　定量ＰＣＲ用反応液としては、以下の試薬を混合して調製し、１サンプルあたりの最終液量が２５μＬになるように滅菌水を加えて調製した。１２．５μＬの２×Ｐｒｅｍｉｘ　Ｅｘ　Ｔａｑ（登録商標）（タカラバイオ社製）に、増幅プライマーとしてＥＧＦＲ　ｅｘ．２１Ｆ（配列番号：６）及びＥＧＦＲ　ｅｘ．２１Ｒ（配列番号：７）をそれぞれ５ｐｍｏｌずつ添加した。
　さらに末端蛍光標識した検出プローブを２．５ｐｍｏｌ添加した。この検出プローブの配列は以下の通りである。
Ｔｏｔａｌ　ＬＮＡプローブ：５’－Ｃｙ５／ＣＡＧＣＡＴＧＴ＋ＣＡＡＧＡ＋ＴＣＡＣＡＧＡ／ＢＨＱ＿２－３’（配列番号２６）
　尚、配列中の＋はそれに続く塩基がＬＮＡであることを示し、Ｃｙ５は蛍光色素を、ＢＨＱ２は蛍光抑制物質を、それぞれ示す。当該検出プローブの合成はＩＤＴ社に委託した。
　また、定量ＰＣＲ反応は９５℃，１０秒＋（９５℃，３秒／５６℃，３０秒）×４５サイクルの条件で実施した。
　各々の試料について、クランプ形成効率は実施例２と同様に定量ＰＣＲで算出したΔＣｔ値から評価した。その結果を図１８に示す。
　尚、プライマーの配列は以下の通りである。
ＥＧＦＲ　ｅｘ．２１Ｆ：５’－ＧＡＡＣＧＴＡＣＴＧＧＴＧＡＡＡＡＣＡＣＣ－３’（配列番号６）
ＥＧＦＲ　ｅｘ．２１Ｒ：５’－ＧＣＡＴＧＧＴＡＴＴＣＴＴＴＣＴＣＴＴＣＣ－３’（配列番号７）
　イノシンを導入していないＰＲＥＰ　ｅ．を用いた場合、ΔＣｔが４程度でＵＶを複数回照射してもほぼ一定であるのに対して（図１８中三角印）、イノシンを導入したＰＲＥＰ　ｈ．を用いた場合、ＵＶの照射回数を増やすごとにΔＣｔが増加する（図１９の四角印）ことが分かる。
　これは、イノシンを導入していないＰＲＥＰは、ＰＲＥＰの自己配列内でのクランプ形成が起き、光を複数回照射してもＰＲＥＰの鋳型に対するクランプ形成量が増加しなかったのに対し、イノシンを導入したＰＲＥＰは、ＰＲＥＰの自己配列内でのクランプ形成が抑制されたため、ＰＲＥＰが鋳型に対して十分にクランプ形成可能となったためＵＶ照射回数に応じてクランプ形成量が増加したものと考えられる。
　つまり、ＰＲＥＰの自己の配列内でのクロスリンクターゲット塩基をイノシンのような光連結の標的核酸とならない塩基に置換することで、ＰＲＥＰの自己配列内での光連結を抑制でき、ＰＲＥＰのクランプ形成量を増加可能であることが示された。
［実施例１０：相補性の高いＰＲＥＰを用いたクランプ形成の確認］
実施例１０－１．光連結プローブ（ＰＲＥＰ）の調製
　野生型配列であるＥＧＦＲ遺伝子上の８６１番目のロイシン（Ｌ８６１）に該当する核酸配列を標的部位として、実施例８－１．で設計したＰＲＥＰ　ｅ．の配列をＥＧＦＲ遺伝子のコード鎖、即ちセンス鎖にハイブリダイゼーションするアンチセンス鎖（ＡＳ鎖）のＰＲＥＰとし（配列番号２２）、同時にＥＧＦＲ遺伝子のアンチセンス鎖にハイブリダイゼーションするセンス鎖（Ｓ鎖）のＰＲＥＰも設計した（配列番号２７）。ＣＮＶＫの導入位置をｎとして示す。
Ｌ８６１　ＡＳ鎖：５’－ＧＣＡｎＣＣＡＧＣＡＧＴＴＴＧＧ－３’（配列番号２２）
Ｌ８６１　Ｓ鎖　：５’－ＣＴＧｎＣＣＡＡＡＣＴＧＣＴＧＧ－３’（配列番号２７）
　また、センス鎖のＰＲＥＰとアンチセンス鎖のＰＲＥＰの相補性とが完全相補の関係であって、お互いのＰＲＥＰ同士が光連結しない位置にＣＮＶＫを配し、且つ、各ＰＲＥＰのＣＮＶＫが本来光連結できる標的核酸をイノシンに置換したＰＲＥＰを設計した。ＣＮＶＫの導入位置をｎとし、イノシンの導入位置をＩとして示す。
Ｌ８６１　ＡＳ鎖：５’－ＧＣＡｎＣＣＡＧＣＡＧＴＩＴＧＧ－３’（配列番号２８）
Ｌ８６１　Ｓ鎖　：５’－ＣＣＡＡｎＣＴＧＣＴＧＧＧＩＧＣ－３’（配列番号２９）
　図１９にクランププローブとして実際に使用したＰＲＥＰの配列とその相補性についての模式図を示す。
実施例１０－２．ＥＧＦＲエクソン２１（ｅｘ．２１）領域における野生型遺伝子断片の調製
　健常者の末梢血から通常の方法によりヒトゲノムＤＮＡを調製し、これを鋳型としてプライマーセットＥＧＦＲ　ｅｘ．２１Ｆ及びＥＧＦＲ　ｅｘ．２１Ｒを使用してＬ８６１に該当する核酸配列を包むＥＧＦＲエクソン２１（ｅｘ．２１）の領域を通常のＰＣＲ反応条件により増幅した。ＰＣＲ反応に用いたプライマー配列は以下の通りである。
ＥＧＦＲ　ｅｘ．２１Ｆ（ｏｕｔ）：５’－ＧＣＡＴＧＡＡＣＴＡＣＴＴＧＧＡＧＧＡＣ－３’（配列番号３０）
ＥＧＦＲ　ｅｘ．２１Ｒ（ｏｕｔ）：５’－ＡＣＣＴＡＡＡＧＣＣＡＣＣＴＣＣＴＴＡＣ－３’（配列番号３１）
　得られたＰＣＲ増幅産物をｐＧＥＭＴ　ｅａｓｙ　Ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ）内に、添付のプロトコルに従って挿入しクローニングした。
　このプラスミドを鋳型として、前記プライマーセットＥＧＦＲ　ｅｘ．２１Ｆ及びＥＧＦＲ　ｅｘ．２１Ｒを使用して通常のＰＣＲ反応条件によって増幅を行い、ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて精製することで、直鎖状のＥＧＦＲ　ｅｘ．２１の野生型遺伝子断片を得た（配列番号３２）。
　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて精製したＥＧＦＲ　ｅｘ．２１の野生型遺伝子断片の重量濃度をＮａｎｏＤｒｏｐ　ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｔｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて測定し、増幅断片長を考慮して各遺伝子断片のコピー数を算出したものを、野生型核酸として以下の反応の検討鋳型として用いた。
［配列番号３２］　ＥＧＦＲ　ｅｘ．２１野生型断片
５’－ＧＣＡＴＧＡＡＣＴＡＣＴＴＧＧＡＧＧＡＣＣＧＴＣＧＣＴＴＧＧＴＧＣＡＣＣＧＣＧＡＣＣＴＧＧＣＡＧＣＣＡＧＧＡＡＣＧＴＡＣＴＧＧＴＧＡＡＡＡＣＡＣＣＧＣＡＧＣＡＴＧＴＣＡＡＧＡＴＣＡＣＡＧＡＴＴＴＴＧＧＧＣＴＧＧＣＣＡＡＡＣＴＧＣＴＧＧＧＴＧＣＧＧＡＡＧＡＧＡＡＡＧＡＡＴＡＣＣＡＴＧＣＡＧＡＡＧＧＡＧＧＣＡＡＡＧＴＡＡＧＧＡＧＧＴＧＧＣＴＴＴＧＧＴ－３’（配列番号３２）
実施例１０－３．光連結反応時の試薬組成
　０．２ｍＬチューブに、実施例５－２．で調製した標的核酸（１×１０７コピー／μＬ）を２μＬと、１００μｍｏｌ／Ｌに調製した、実施例１０－１．に示すＬ８６１に該当する核酸塩基を標的とした、Ｌ８６１　ＡＳ鎖（配列番号２８）及びＬ８６１　Ｓ鎖（配列番号２９）のＰＲＥＰをそれぞれ２μＬずつ加え、１×ＰＣＲバッファー（１０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．３），５０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＫＣｌ，１．５ｍｍｏｌ／Ｌ　ＭｇＣｌ２，０．００１％（Ｗ／Ｖ）ｇｅｌａｔｉｎ）の終濃度で総量を２０μＬとした。
実施例１０－４．光連結反応時の条件
　実施例１０－３．で調製した核酸サンプル溶液に対して、９５℃にて５分間加熱処理し、４５℃にて５秒間静置した後、４５℃でＵＶ－ＬＥＤにより３６５ｎｍの光を３０秒間照射した。尚、対照として光を照射しないサンプルを同時に用意した。
実施例１０－５．定量ＰＣＲによるクランプ量の確認
　実施例１０－４．で光連結反応を実施した各反応液２０μＬに８０μＬの滅菌水をそれぞれ加えよく混合した後、更にその内５μＬずつを４５μLの滅菌水に混合した。混合したサンプルの内５μＬを鋳型としてライトサイクラー（ＬＣ　４８０Ｖｅｒ２：ロッシュ社製）を使用して定量ＰＣＲ反応を実施した。
　定量ＰＣＲ用反応液としては、以下の試薬を混合して調製し、１サンプルあたりの最終液量が２５μＬになるように滅菌水を加えて調製した。１２．５μＬの２×Ｐｒｅｍｉｘ　Ｅｘ　Ｔａｑ（登録商標）（タカラバイオ社製）に、増幅プライマーとしてＥＧＦＲ　ｅｘ．２１Ｆ及びＥＧＦＲ　ｅｘ．２１Ｒをそれぞれ５ｐｍｏｌずつ添加した。さらに末端蛍光標識した検出プローブを２．５ｐｍｏｌ添加した。検出プローブには、実施例９に記載のプローブ（配列番号２６）と同じものを使用し、定量ＰＣＲ反応は実施例９－２．と同じ条件で行った。
　各々の試料について、クランプ形成効率は実施例２と同様に定量ＰＣＲで算出したΔＣｔ値から評価した。その結果を図２０に示す。
　既存の設計手法により設計したＰＲＥＰ（三角印）は、ＵＶを複数回照射してもΔＣｔがある一定のところで飽和してしまうが、イノシンを導入し完全相補で設計したＰＲＥＰを用いることでＵＶ複数回照射するごとにΔＣｔを増加させることができることが分かる。
　これは、ＰＲＥＰ内にイノシンを導入し、かつＰＲＥＰの相補性を高めたことでＰＲＥＰの自己配列内でのクランプ形成を抑制出来たためと考えられる。このことからもクランプ形成波長である３６５ｎｍの光照射時にＰＲＥＰ相補鎖間のハイブリダイゼーションを維持し、ＰＲＥＰの自己配列内でのクランプ形成を抑制し、ＰＲＥＰをクランプ形成可能な状態に維持することがクランプ形成効率を向上させることに効果的であることが確認された。
　本発明は、光応答性核酸類を含むプローブを用いた、光連結効率を向上させる方法に関するものであり、高感度かつ高精度に遺伝子を解析することができる。例えば、大量に存在する野生型遺伝子に混在する微量に存在する変異型遺伝子を選択的に検出する際に使用できる。また、従来の評価方法では検出が困難であった標的とする核酸が微量にしか存在しない核酸サンプルからの遺伝子検出も可能にするものである。
　また、以上のような解析が可能になることは、手術により摘出された組織や生検材料のような侵襲性の高い検査材料に限定されず、例えば血液試料のような標的とする核酸が微量にしか存在しない試料をも材料として扱えるため、困難であった治療効果の確認やモニタリング検査を可能にする。これらは、癌の早期発見や、個々の患者について薬剤感受性や薬剤応答性をはじめとした薬効評価等に適用することで、個別化医療の実現を可能とするものである。
　以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
　配列表の配列番号２～５の各塩基配列は、人工的に合成したプローブ配列であり、それぞれ、ＰＲＥＰａ．（６番目のｎはＣＮＶＫ）、ＰＲＥＰｂ．（８番目のｎはＣＮＶＫ）、ＰＲＥＰｃ．（１０番目のｎはＣＮＶＫ）、ＰＲＥＰｄ．（１２番目のｎはＣＮＶＫ）である。配列番号８～１０の各塩基配列は、人工的に合成したプローブ配列であり、それぞれ、ＰＲＥＰ－Ａ（３番目のｎはＣＮＶＫ）、ＰＲＥＰ－Ｇ（３番目のｎはＣＮＶＫ）、ＰＲＥＰ－ＡＧ（３番目のｎはＣＮＶＫ）である。配列番号１１～１６の各塩基配列は、人工的に合成したプローブ配列であり、それぞれ、プローブＬ８６１　ＡＳ（１５番目のｎはＣＮＶＫ）、プローブＬ８６１　Ｓ（１４番目のｎはＣＮＶＫ）、プローブＴ７９０　ＡＳ（４番目のｎはＣＮＶＫ）、プローブＴ７９０　Ｓ（３番目のｎはＣＮＶＫ）、プローブＬ８５８　ＡＳ（３番目のｎはＣＮＶＫ）、プローブＬ８５８　Ｓ（３番目のｎはＣＮＶＫ）である。配列番号２０の塩基配列は、人工的に合成したプローブ配列であり、Ｔｏｔａｌ　ＬＮＡプローブ（４番目のＣ、８番目のＴ、１１番目のＣはＬＮＡ）である。配列番号２２～２５の各塩基配列は、人工的に合成したプローブ配列であり、それぞれ、ＰＲＥＰｅ．（４番目のｎはＣＮＶＫ）、ＰＲＥＰｆ．（４番目のｎはＣＮＶＫ、１４番目のｎはイノシン）、ＰＲＥＰｇ．（４番目のｎはＣＮＶＫ、１３～１４番目のｎはイノシン）、ＰＲＥＰｈ．（４番目のｎはＣＮＶＫ、１２～１４番目のｎはイノシン）である。配列番号２６の塩基配列は、人工的に合成したプローブ配列であり、Ｔｏｔａｌ　ＬＮＡプローブ（９番目のＣ、１４番目のＴはＬＮＡ）である。配列番号２７～２９の各塩基配列は、人工的に合成したプローブ配列であり、それぞれ、プローブＬ８６１　Ｓ（４番目のｎはＣＮＶＫ）、プローブＴ８６１　ＡＳ（４番目のｎはＣＮＶＫ、１３番目のｎはイノシン）、プローブＴ８６１　Ｓ（５番目のｎはＣＮＶＫ、１４番目のｎはイノシン）である。

Claims (20)

  1. 　核酸サンプル中に存在する標的部位と、該標的部位に対して相補的な配列を有し、光応答性核酸類を含む第一のプローブと、を反応溶液中でハイブリダイゼーションし、光照射することにより光連結させる方法であって、該第一のプローブ内の該光応答性核酸類に起因する自己会合を抑制させることを特徴とする、光連結方法。
  2. 　前記第一のプローブに対して、高い相補性を有する第二のプローブを共存させることにより、該第一のプローブ内の該光応答性核酸類に起因する自己会合を抑制させることを特徴とする、請求項１に記載の光連結方法。
  3. 　前記高い相補性とは、前記第一のプローブと前記第二のプローブとが互いに相補的な関係にあり、所定の光連結条件下で該第一のプローブ中の該光応答性核酸類の自己内で光連結する塩基が、第二のプローブとハイブリダイゼーションしている、請求項１又は２に記載の光連結方法。
  4. 　前記光連結させる方法が、前記核酸サンプル中に存在する標的部位が有する標的核酸と、前記第一のプローブの光応答性核酸類との間で光連結させる、請求項１乃至３のいずれか一項に記載の光連結方法。
  5. 　前記第二のプローブが光応答性核酸類を含む、請求項１乃至４のいずれか一項に記載の光連結方法。
  6. 　前記第一のプローブ及び前記第二のプローブが光応答性核酸類を含み、該第一のプローブと該第二のプローブの非相補性領域において、該第一のプローブ及び／又は該第二のプローブ内に存在する光応答性核酸類が自己内で光連結できないように、該第一のプローブ及び／又は該第二のプローブに相補的な配列を有する第三のプローブを使用する、請求項１乃至５のいずれか一項に記載の光連結方法。
  7. 　核酸サンプル中に存在する標的部位と、該標的部位に対して相補的な配列を有し光応答性核酸類を含む第一のプローブと、該標的部位に対して相補的な配列を有し標的核酸を含む第四のプローブと、を反応溶液中で隣接して配置するようにハイブリダイゼーションさせ、光照射によって該第四のプローブに存在する標的核酸と該第一のプローブ中の該光応答性核酸類との間で光連結する方法において、
    該第一のプローブに対して、高い相補性を有する第二のプローブを共存させることで、該第一のプローブの自己内での光連結を抑制させることを特徴とする、請求項１に記載の光連結方法。
  8. 　前記第一のプローブ内において光応答性核酸類と自己会合する核酸を、該光応答性核酸類と光連結しない核酸に置換した該第一のプローブを使用することを特徴とする、該第一のプローブの自己内での光連結を抑制させることを特徴とする、請求項１乃至７のいずれか一項に記載の光連結方法。
  9. 　前記光応答性核酸類と光連結しない核酸がプリン塩基である、請求項８に記載の光連結方法。
  10. 　前記光応答性核酸類と光連結しない核酸が、ピリミジン環を人工的に変換した合成塩基である、請求項８に記載の光連結方法。
  11. 　反応溶液中にアニオン性物質が存在する、請求項１乃至１０のいずれか一項に記載の光連結方法。
  12. 　少なくとも一種類の光連結プローブが、反応溶液中に０．１μｍｏｌ／Ｌ以上の濃度で存在することを特徴とする、請求項１乃至１１のいずれか一項に記載の光連結方法。
  13. 　請求項１～１２のいずれか一項に記載の光連結方法を使用する遺伝子解析方法。
  14. 　前記遺伝子解析方法が、遺伝子検出方法又は核酸増幅方法である、請求項１３の遺伝子解析方法。
  15. 　請求項１４に記載の核酸増幅方法が、変異型核酸の標的部位を含む増幅用ヌクレオチド配列を選択的に増幅させることで、該変異型核酸の有無を検出することを特徴とする、変異型核酸検出方法。
  16. 　核酸サンプル中の標的部位に対して相補的な配列を有する光応答性核酸類を含む第一のプローブ、該第一のプローブに対して、高い相補性を有する第二のプローブを含むことを特徴とする、光連結キット。
  17. 　前記第一のプローブが、核酸サンプル中の標的部位の標的核酸と光連結するものである、請求項１６に記載の光連結キット。
  18. 　更に、該第一のプローブの該光応答性核酸類と光連結する標的核酸を含む第四のプローブを含む、請求項１６に記載の光連結キット
  19. 　前記第二のプローブが光応答性核酸類を含む、請求項１６乃至１８のいずれか一項に記載の光連結キット。
  20. 　前記第一のプローブが、該プローブ内において光応答性核酸類と自己会合する核酸を、該光応答性核酸類と光連結しない核酸に置換したものである、請求項１６乃至１９のいずれか一項に記載の光連結キット。
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