JP2015195736A - 核酸中の塩基を変換する方法、及び核酸塩基変換剤 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】イノシンと、光応答性修飾ヌクレオシドが導入された光応答性修飾核酸と、光応答性修飾核酸と相補的な塩基配列を有しイノシンに対応する相補的な位置にシトシン(C)を有する標的核酸とを、ハイブリダイズして二重鎖を形成する工程、形成された二重鎖に対して光照射して、光応答性修飾核酸と標的核酸の間に光架橋を形成する工程、光架橋が形成された二重鎖をインキュベーションして、標的核酸中のシトシン(C)をウラシル(U)へと塩基変換する工程を含む方法。
【選択図】なし
Description
(1)
次の式I:
R1は、水素を表し、
R2は、水酸基を表し、
R3は、水素又は水酸基である)
で表されるイノシンが、式IでR1に結合しているOと一体となって形成されたリン酸基によってリン酸ジエステル結合して導入され、次の式II:
R12及びR13は、それぞれ独立に、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、C2〜C7のアルコキシカルボニル基、又は水素であり、
R4は、水素を表し、
R5は、水酸基を表し、
R6は、水素又は水酸基である)
で表される光応答性修飾ヌクレオシドが、塩基配列中において上記イノシンの3’側に隣接した位置に、式IIでR4に結合しているOと一体となって形成されたリン酸基によってリン酸ジエステル結合して導入された、光応答性修飾核酸と、
上記光応答性修飾核酸と相補的な塩基配列を有し、塩基配列中の上記イノシンに対応する相補的な位置に、核酸塩基としてシトシン(C)を有する、標的核酸とを、
ハイブリダイズして二重鎖を形成する工程、
形成された二重鎖に対して光照射して、光応答性修飾核酸と標的核酸の間に光架橋を形成する工程、
光架橋が形成された二重鎖をインキュベーションして、標的核酸中のシトシン(C)をウラシル(U)へと塩基変換する工程、
を含む、標的核酸中のシトシン(C)をウラシル(U)へと塩基変換する方法。
(2)
光架橋が形成された二重鎖をインキュベーションして、標的核酸中のシトシン(C)をウラシル(U)へと塩基変換する工程、の後に、さらに、
光架橋が形成された二重鎖に対して、光照射して、光架橋を開裂させる工程、
を含む、(1)に記載の方法。
(3)
光架橋が形成された二重鎖をインキュベーションして、標的核酸中のシトシン(C)をウラシル(U)へと塩基変換する工程が、
光架橋が形成された二重鎖を、20℃〜40℃の範囲の温度でインキュベーションして行われる、(1)〜(2)のいずれかに記載の方法。
(4)
光架橋が形成された二重鎖をインキュベーションして、標的核酸中のシトシン(C)をウラシル(U)へと塩基変換する工程が、
光架橋が形成された二重鎖を、1時間〜10日間の範囲でインキュベーションして行われる、(1)〜(3)のいずれかに記載の方法。
(5)
光架橋が形成された二重鎖をインキュベーションして、標的核酸中のシトシン(C)をウラシル(U)へと塩基変換する工程が、
光架橋が形成された二重鎖を、pH6.2〜7.8の範囲のpHでインキュベーションして行われる、(1)〜(4)のいずれかに記載の方法。
(6)
形成された二重鎖に対して、光照射して、光応答性修飾核酸と標的核酸の間に光架橋を形成する工程が、
形成された二重鎖に対して、340nm〜380nmの範囲の波長を含む光を、光照射して行われる、(1)〜(5)のいずれかに記載の方法。
(7)
形成された二重鎖に対して、光照射して、光応答性修飾核酸と標的核酸の間に光架橋を形成する工程が、
形成された二重鎖に対して、0.1秒〜30秒の範囲で光照射して行われる、(1)〜(6)のいずれかに記載の方法。
(8)
光架橋が形成された二重鎖に対して、光照射して、光架橋を開裂させる工程が、
形成された二重鎖に対して、300nm〜330nmの範囲の波長を含む光を、光照射して行われる、(2)〜(7)のいずれかに記載の方法。
(9)
光架橋が形成された二重鎖に対して、光照射して、光架橋を開裂させる工程が、
形成された二重鎖に対して、0.1秒〜30秒の範囲で光照射して行われる、(2)〜(8)のいずれかに記載の方法。
(10)
光架橋が形成された二重鎖に対して、光照射して、光架橋を開裂させる工程の後に、さらに、
光架橋が開裂した二重鎖を解離して、シトシン(C)をウラシル(U)へと塩基変換された標的核酸の鎖を得る工程、
を含む、(2)〜(9)のいずれかに記載の方法。
(11)
(1)〜(10)のいずれかに記載の方法によって、シトシン(C)をウラシル(U)へと塩基変換された標的核酸を製造する方法。
(21)
次の式I:
R1は、水素を表し、
R2は、水酸基を表し、
R3は、水素又は水酸基である)
で表されるイノシンが、式IでR1に結合しているOと一体となって形成されたリン酸基によってリン酸ジエステル結合して導入され、次の式II:
R12及びR13は、それぞれ独立に、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、C2〜C7のアルコキシカルボニル基、又は水素であり、
R4は、式IIでR4に結合しているOと一体となって形成されたリン酸基を表し、
R5は、水酸基を表し、
R6は、水素又は水酸基である)
で表される光応答性修飾ヌクレオシドが、塩基配列中において上記イノシンの3’側に隣接した位置に、式IIでR4に結合しているOと一体となって形成されたリン酸基によってリン酸ジエステル結合して導入された、光応答性修飾核酸。
(22)
(21)に記載の光応答性修飾核酸からなる、核酸塩基変換剤。
(23)
(21)に記載の光応答性修飾核酸の、核酸塩基変換のための使用。
(24)
(21)に記載の光応答性修飾核酸と、
上記光応答性修飾核酸と相補的な塩基配列を有し、塩基配列中の上記イノシンに対応する相補的な位置に、核酸塩基としてシトシン(C)を有する、標的核酸とを、
ハイブリダイズして二重鎖を形成する工程、
形成された二重鎖に対して光照射して、光応答性修飾核酸と標的核酸の間に光架橋を形成する工程、
を含む、光架橋を形成する方法。
(25)
形成された二重鎖に対して、光照射して、光応答性修飾核酸と標的核酸の間に光架橋を形成する工程が、
形成された二重鎖に対して、340nm〜380nmの範囲の波長を含む光を、光照射して行われる、(24)に記載の方法。
(26)
形成された二重鎖に対して、光照射して、光応答性修飾核酸と標的核酸の間に光架橋を形成する工程が、
形成された二重鎖に対して、0.1秒〜30秒の範囲で光照射して行われる、(24)〜(25)のいずれかに記載の方法。
(27)
(24)〜(26)のいずれかに記載の方法によって、光架橋が形成された核酸を製造する方法。
(28)
(21)に記載の光応答性修飾核酸からなる、核酸光架橋剤。
(29)
(21)に記載の光応答性修飾核酸の、核酸光架橋のための使用。
本発明によれば、
式Iで表されるイノシンが、リン酸ジエステル結合して導入され、式IIで表される光応答性修飾ヌクレオシドが、塩基配列中において上記イノシンの3’側に隣接した位置に、リン酸ジエステル結合して導入された、光応答性修飾核酸と、
上記光応答性修飾核酸と相補的な塩基配列を有し、塩基配列中の上記イノシンに対応する相補的な位置に、核酸塩基としてシトシン(C)を有する、標的核酸とを、
ハイブリダイズして二重鎖を形成する工程、
形成された二重鎖に対して光照射して、光応答性修飾核酸と標的核酸の間に光架橋を形成する工程、
光架橋が形成された二重鎖をインキュベーションして、標的核酸中のシトシン(C)をウラシル(U)へと塩基変換する工程、
を含む方法によって、標的核酸中のシトシン(C)をウラシル(U)へと塩基変換することができる。
標的核酸は、一塩基変換の標的となる塩基を有する核酸である。標的となる塩基は、シトシン(C)であり、これがウラシル(U)へと一塩基変換される。すなわち、本発明の一塩基変換によれば、標的核酸の塩基配列中にリン酸ジエステル結合されたシチジンがウリジンへと変換され、あるいは、リン酸ジエステル結合されたデオキシシチジンがデオキシウリジンへと変換され、結果として特異的な一塩基置換が実現される。標的核酸の塩基長に特に制約はないが、例えば、6塩基長以上、7塩基長以上、8塩基長以上、9塩基長以上、とすることができ、例えば、1000塩基長以下、100塩基長以下、50塩基長以下、20塩基長以下、16塩基長以下、12塩基長以下、とすることができる。標的核酸は、DNAであってもよく、RNAであってもよい。
光応答性修飾核酸は、一塩基置換の標的となる塩基を有する標的核酸と相補的な塩基配列を有し、ただし、標的核酸の塩基配列中で標的となるシトシンに対して相補的な位置には、式Iのイノシン(すなわち、イノシン又はデオキシイノシン)が導入されて位置しており、イノシンの3’側に隣接して、式IIの光応答性修飾ヌクレオシドが導入されて位置している。なお、標的核酸の塩基配列中において、光応答性修飾ヌクレオシドに対して相補的な位置には、任意の塩基(ヌクレオシド)が位置することができ、例えば、グアニンが位置することができる。光応答性修飾核酸の塩基長に特に制約はないが、例えば、6塩基長以上、7塩基長以上、8塩基長以上、9塩基長以上、とすることができ、例えば、1000塩基長以下、100塩基長以下、50塩基長以下、20塩基長以下、16塩基長以下、12塩基長以下、とすることができる。光応答性修飾核酸は、DNAであってもよく、RNAであってもよい。
光応答性修飾核酸の塩基配列中に導入されたイノシンは、次の式Iで表されるイノシンである:
光応答性修飾核酸の塩基配列中に導入された光応答性修飾ヌクレオシドは、次の式IIで表される光応答性修飾ヌクレオシドである:
R12及びR13は、それぞれ独立に、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、C2〜C7のアルコキシカルボニル基、又は水素を表し、
R4は、水素を表し、
R5は、水酸基を表し、
R6は、水素又は水酸基を表す。
光応答性修飾核酸と標的核酸は、上述のように、相補的な塩基配列を有しているので、公知の条件下で、ハイブリダイズさせて二重鎖を形成することができる。
光応答性修飾ヌクレオシドは、二重鎖を形成した後に、光照射によって光反応して、イノシンに対して相補的な位置に位置するシトシン(すなわち、塩基変換の標的となるシトシン)と、光架橋を形成する。光照射は、例えば、340nm〜380nmの範囲、360nm〜370nmの範囲の波長を含む光、例えば、366nmの波長を含む光の照射によって行うことができる。好適な実施の態様において、単波長光、例えば366nmの波長の単波長光を、使用することができる。光照射は、例えば、0.1秒〜30秒、1秒〜20秒、5秒〜15秒の範囲の照射時間によって行うことができる。光照射は、例えば、0℃〜40℃、0℃〜30℃、0℃〜20℃、0℃〜10℃の範囲の温度で、例えば、氷冷下で、行うことができる。
光架橋が形成された二重鎖をインキュベーションすると、標的核酸中のシトシン(C)をウラシル(U)へと塩基変換される。このインキュベーションは、90℃といった高温に加熱する必要はなく、高濃度の化合物を投入する必要もなく、常温常圧で生理的な塩濃度とpHで、行うことができる。このために、操作は簡易であり、また核酸あるいは共存する生体分子を損傷する可能性は最小であり、インビトロ及びインビボの広い応用が期待される。
塩基変換された後の二重鎖に対して、光照射して、光架橋を開裂させることができる。開裂に使用される光照射は、例えば、300nm〜330nm、310nm〜320nmmの範囲の波長を含む光、例えば312nmの波長を含む光の照射によって行うことができる。好適な実施の態様において、単波長光、例えば312nmの波長の単波長光を、使用することができる。開裂に使用される光照射は、例えば、1分〜60分、5分〜30分、10分〜20分の範囲の照射時間によって行うことができる。開裂の光照射は、例えば、0℃〜40℃、10℃〜40℃、15℃〜35℃、20℃〜30℃の範囲の温度で、例えば、室温下で、行うことができる。
光架橋が開裂した後の二重鎖は、核酸のアニーリングの条件として、公知の条件下とすることによって、単鎖へと解離することができる。すなわち、塩基変換された標的核酸は、光応答性修飾核酸と分離して、回収することができる。二重鎖の解離の条件下で、光架橋の開裂を行ってもよい。
本発明によれば標的核酸は、温度やpHなどを含めて、生理的な条件に近い穏和な条件下で、塩基変換される。そのために、核酸分子、あるいは他の生体分子に、与える損傷は最小のものとなるために、インビトロにとどまらず、インビボでの広い応用が期待されるものである。
図1に、塩基変換方法のスキームをまとめて示す。図1の右側は、実施例による塩基変換方法の実験操作を示す流れ図である。イノシン(I)と隣接するCNVKを有する光応答性修飾核酸とイノシンと相補的な位置にあるシトシン(C)を有する標的核酸とで、二重鎖を形成させた(図1の右側の上から一段目)。これに対して366nmの光照射をすると、わずか10秒の照射で、CとCNVKの間に光架橋が形成され(図1の右側の上から二段目)、これを37℃でインキュベーションするとCがUへと塩基変換した(図1の右側の上から三段目)。これに対して312nmの光照射をすると、UとCNVKの間の光架橋が開裂して、塩基変換された標的核酸が得られた。
核酸塩基の塩基部分に代えてビニルカルバゾール骨格構造を備えて、デオキシリボース部分にはデオキシリボースを備えた、光反応性修飾ヌクレオシドとして、次式:
2重鎖DNA(15μM)及びdU(75μM)を緩衝液(50mMカコジル酸ナトリウム、100mMNaCl、pH7.4)に溶解して、氷浴下、LED光源(366nm、1600mW/cm2)を用いて光照射を行った。光照射後のサンプルをUPLC(50mMギ酸アンモニウム/アセトニトリル、(アセトニトリル1%から15%/10分))により分析し、各ピークの比から光架橋効率を算出した。得られた結果を、図3に示す。
HPLCにより生成した光架橋後2重鎖DNA(5μM)を緩衝液(50mMカコジル酸ナトリウム、100mMNaCl、pH7.4)に溶解し、37℃でインキュベートした。312nm光照射(トランスイルミネータ)による開裂(25℃、15分)を行った後、UPLC(50mMギ酸アンモニウム/アセトニトリル、(アセトニトリル1%から10%/15分)による分析を行い、各ピークの比から塩基変換効率を算出した。得られた結果を、図4に示す。
ODN(IK): 5’−TGCI CNVKACG−3’
ODN(C): 5’−ACGTGCGCA−3’
ODN(GK): 5’−TGCG CNVKACG−3’
図3の5’−TGCXCNVKACG−3’のうち、XがIとなったODNが上記ODN(IK),XがGとなったODNが上記ODN(GK)である。ODN(C)は、これらと二重らせんを形成可能な相補性のODNである。図3の左側のチャートは、ODN(IK)、ODN(GK)が、それぞれODN(C)と光架橋された二重らせん(★印のピーク)を形成していくことを示している。図3の右側のグラフは、このチャートを、横軸を光照射時間(秒)、縦軸光架橋反応率(%)としてまとめたグラフである。ODN(IK)とODN(C)の光架橋形成は、ODN(GK)とODN(C)の光架橋形成と比較して、速やかに進行し、例えば、ODN(GK)では光照射後約30秒間を要した光架橋率(約95%)に、ODN(IK)では光照射後10秒間で到達した。(すなわち、GをIに変更することで光架橋反応が3倍に加速された。)
Claims (16)
- 次の式I:
R1は、水素を表し、
R2は、水酸基を表し、
R3は、水素又は水酸基である)
で表されるイノシンが、式IでR1に結合しているOと一体となって形成されたリン酸基によってリン酸ジエステル結合して導入され、次の式II:
R12及びR13は、それぞれ独立に、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、C2〜C7のアルコキシカルボニル基、又は水素であり、
R4は、水素を表し、
R5は、水酸基を表し、
R6は、水素又は水酸基である)
で表される光応答性修飾ヌクレオシドが、塩基配列中において上記イノシンの3’側に隣接した位置に、式IIでR4に結合しているOと一体となって形成されたリン酸基によってリン酸ジエステル結合して導入された、光応答性修飾核酸と、
上記光応答性修飾核酸と相補的な塩基配列を有し、塩基配列中の上記イノシンに対応する相補的な位置に、核酸塩基としてシトシン(C)を有する、標的核酸とを、
ハイブリダイズして二重鎖を形成する工程、
形成された二重鎖に対して光照射して、光応答性修飾核酸と標的核酸の間に光架橋を形成する工程、
光架橋が形成された二重鎖をインキュベーションして、標的核酸中のシトシン(C)をウラシル(U)へと塩基変換する工程、
を含む、標的核酸中のシトシン(C)をウラシル(U)へと塩基変換する方法。 - 光架橋が形成された二重鎖をインキュベーションして、標的核酸中のシトシン(C)をウラシル(U)へと塩基変換する工程、の後に、さらに、
光架橋が形成された二重鎖に対して、光照射して、光架橋を開裂させる工程、
を含む、請求項1に記載の方法。 - 光架橋が形成された二重鎖をインキュベーションして、標的核酸中のシトシン(C)をウラシル(U)へと塩基変換する工程が、
光架橋が形成された二重鎖を、20℃〜40℃の範囲の温度でインキュベーションして行われる、請求項1〜2のいずれかに記載の方法。 - 光架橋が形成された二重鎖をインキュベーションして、標的核酸中のシトシン(C)をウラシル(U)へと塩基変換する工程が、
光架橋が形成された二重鎖を、1時間〜10日間の範囲でインキュベーションして行われる、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。 - 光架橋が形成された二重鎖をインキュベーションして、標的核酸中のシトシン(C)をウラシル(U)へと塩基変換する工程が、
光架橋が形成された二重鎖を、pH6.2〜7.8の範囲のpHでインキュベーションして行われる、請求項1〜4のいずれかに記載の方法。 - 形成された二重鎖に対して、光照射して、光応答性修飾核酸と標的核酸の間に光架橋を形成する工程が、
形成された二重鎖に対して、340nm〜380nmの範囲の波長を含む光を、光照射して行われる、請求項1〜5のいずれかに記載の方法。 - 形成された二重鎖に対して、光照射して、光応答性修飾核酸と標的核酸の間に光架橋を形成する工程が、
形成された二重鎖に対して、0.1秒〜30秒の範囲で光照射して行われる、請求項1〜6のいずれかに記載の方法。 - 光架橋が形成された二重鎖に対して、光照射して、光架橋を開裂させる工程が、
形成された二重鎖に対して、300nm〜330nmの範囲の波長を含む光を、光照射して行われる、請求項2〜7のいずれかに記載の方法。 - 光架橋が形成された二重鎖に対して、光照射して、光架橋を開裂させる工程が、
形成された二重鎖に対して、0.1秒〜30秒の範囲で光照射して行われる、請求項2〜8のいずれかに記載の方法。 - 光架橋が形成された二重鎖に対して、光照射して、光架橋を開裂させる工程の後に、さらに、
光架橋が開裂した二重鎖を解離して、シトシン(C)をウラシル(U)へと塩基変換された標的核酸の鎖を得る工程、
を含む、請求項2〜9のいずれかに記載の方法。 - 請求項1〜10のいずれかに記載の方法によって、シトシン(C)をウラシル(U)へと塩基変換された標的核酸を製造する方法。
- 次の式I:
R1は、水素を表し、
R2は、水酸基を表し、
R3は、水素又は水酸基である)
で表されるイノシンが、式IでR1に結合しているOと一体となって形成されたリン酸基によってリン酸ジエステル結合して導入され、次の式II:
R12及びR13は、それぞれ独立に、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、C2〜C7のアルコキシカルボニル基、又は水素であり、
R4は、水素を表し、
R5は、水酸基を表し、
R6は、水素又は水酸基である)
で表される光応答性修飾ヌクレオシドが、塩基配列中において上記イノシンの3’側に隣接した位置に、式IIでR4に結合しているOと一体となって形成されたリン酸基によってリン酸ジエステル結合して導入された、光応答性修飾核酸。 - 請求項12に記載の光応答性修飾核酸からなる、核酸塩基変換剤。
- 請求項12に記載の光応答性修飾核酸と、
上記光応答性修飾核酸と相補的な塩基配列を有し、塩基配列中の上記イノシンに対応する相補的な位置に、核酸塩基としてシトシン(C)を有する、標的核酸とを、
ハイブリダイズして二重鎖を形成する工程、
形成された二重鎖に対して光照射して、光応答性修飾核酸と標的核酸の間に光架橋を形成する工程、
を含む、光架橋を形成する方法。 - 請求項14に記載の方法によって、光架橋が形成された核酸を製造する方法。
- 請求項12に記載の光応答性修飾核酸からなる、核酸光架橋剤。
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