JP2002179696A - 光連結性ヌクレオシド含有ｄｎａを用いて塩基を点変異する方法 - Google Patents
光連結性ヌクレオシド含有ｄｎａを用いて塩基を点変異する方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 本発明は、簡便で確実でかつ特異的であっ
て、さらに低コストで無公害の点変異法を提供するもの
であり、実用化の可能な新規な遺伝子操作法を提供する
ものである。 【解決手段】 本発明は、変換したい塩基を有するＤＮ
Ａ、ＲＮＡ、ＰＮＡなどの核酸類を、光連結性ヌクレオ
シドを含有するＤＮＡの存在下で、光照射して変換した
い塩基と光連結性ヌクレオシドとを結合させ、変換した
い塩基を化学的に変性させた後、光照射して変換したい
塩基と光連結性ヌクレオシドとを解裂させることからな
る核酸類中の特定の塩基を点変異させる方法、及びその
方法により点変異した核酸類を製造する方法に関する。
て、さらに低コストで無公害の点変異法を提供するもの
であり、実用化の可能な新規な遺伝子操作法を提供する
ものである。 【解決手段】 本発明は、変換したい塩基を有するＤＮ
Ａ、ＲＮＡ、ＰＮＡなどの核酸類を、光連結性ヌクレオ
シドを含有するＤＮＡの存在下で、光照射して変換した
い塩基と光連結性ヌクレオシドとを結合させ、変換した
い塩基を化学的に変性させた後、光照射して変換したい
塩基と光連結性ヌクレオシドとを解裂させることからな
る核酸類中の特定の塩基を点変異させる方法、及びその
方法により点変異した核酸類を製造する方法に関する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、
ＰＮＡなどの核酸類中の特定の位置の塩基を、他の塩基
に点変異させる方法、及びその方法により点変異した核
酸類を製造する方法に関する。より詳細には、本発明
は、核酸類中の特定の位置の塩基を、光連結性ヌクレオ
シドを含有するＤＮＡの存在下で、光化学反応を利用し
て酵素の不存在下で他の塩基に変換することからなる核
酸類中の特定の位置の塩基を点変異させる方法、及びそ
の方法により点変異した核酸類を製造する方法に関す
る。
ＰＮＡなどの核酸類中の特定の位置の塩基を、他の塩基
に点変異させる方法、及びその方法により点変異した核
酸類を製造する方法に関する。より詳細には、本発明
は、核酸類中の特定の位置の塩基を、光連結性ヌクレオ
シドを含有するＤＮＡの存在下で、光化学反応を利用し
て酵素の不存在下で他の塩基に変換することからなる核
酸類中の特定の位置の塩基を点変異させる方法、及びそ
の方法により点変異した核酸類を製造する方法に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】ＤＮＡやＰＮＡ（ペプチド核酸）などの
核酸類中の特定の位置の塩基を他の塩基に変換する方法
は、点変異（ポイントミューテーション）として変異し
た核酸類を調製したり、核酸類の機能解析のための技術
として重要視されてきている。しかし、従来の点変異の
技術は酵素反応を用いるために特異性や確実性の点にお
いて充分ではなく、その効率も必ずしも充分ではなかっ
た。また、酵素反応を用いた方法では、後処理の必要な
化学活性化剤を使用しなければならず、コストがかか
り、かつ反応条件の至適化や制御が難しく、実用化が困
難であった。また、任意の位置のシトシンのみをウラシ
ルへと点変異させることは従来はできなかった。シトシ
ンからウラシルへの変換は、任意の位置ではないが、同
じ鎖内でピリミジンダイマー生成、デアミネーション、
及びフォトリアーゼによる光解裂によりシトシンをウラ
シルへと変異させた例があるが、この方法では酵素を用
いる点、他のサイトとの競争反応がある点、及び効率が
低い点等において改良の余地があった。
核酸類中の特定の位置の塩基を他の塩基に変換する方法
は、点変異（ポイントミューテーション）として変異し
た核酸類を調製したり、核酸類の機能解析のための技術
として重要視されてきている。しかし、従来の点変異の
技術は酵素反応を用いるために特異性や確実性の点にお
いて充分ではなく、その効率も必ずしも充分ではなかっ
た。また、酵素反応を用いた方法では、後処理の必要な
化学活性化剤を使用しなければならず、コストがかか
り、かつ反応条件の至適化や制御が難しく、実用化が困
難であった。また、任意の位置のシトシンのみをウラシ
ルへと点変異させることは従来はできなかった。シトシ
ンからウラシルへの変換は、任意の位置ではないが、同
じ鎖内でピリミジンダイマー生成、デアミネーション、
及びフォトリアーゼによる光解裂によりシトシンをウラ
シルへと変異させた例があるが、この方法では酵素を用
いる点、他のサイトとの競争反応がある点、及び効率が
低い点等において改良の余地があった。
【０００３】一方、本発明者らは、先に光化学反応によ
り光連結性ヌクレオシドを含有するＤＮＡと、炭素−炭
素二重結合を有する塩基を有する核酸類（ＤＮＡやＰＮ
Ａなど）を光化学反応により連結と開裂を特異的に行う
ことができることを見出してきた（特願２０００−６７
５１９号参照）。
り光連結性ヌクレオシドを含有するＤＮＡと、炭素−炭
素二重結合を有する塩基を有する核酸類（ＤＮＡやＰＮ
Ａなど）を光化学反応により連結と開裂を特異的に行う
ことができることを見出してきた（特願２０００−６７
５１９号参照）。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、簡便で確実
でかつ特異的であって、さらに低コストで無公害の点変
異法を提供するものであり、低コスト、無公害、簡便
性、正解性を併せ持った新技術を用いた実用化可能な遺
伝子操作法の開発を目指している。すなわち、本発明
は、光化学反応を利用した新規な点変異技術を提供する
ものである。
でかつ特異的であって、さらに低コストで無公害の点変
異法を提供するものであり、低コスト、無公害、簡便
性、正解性を併せ持った新技術を用いた実用化可能な遺
伝子操作法の開発を目指している。すなわち、本発明
は、光化学反応を利用した新規な点変異技術を提供する
ものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために光化学反応により光連結性ヌクレオシ
ドを含有するＤＮＡと、炭素−炭素二重結合を有する塩
基を有する核酸類（ＤＮＡやＰＮＡなど）を光化学反応
により連結と開裂を特異的に行うことができることに着
目し、これを利用して酵素反応を利用すること無く光化
学反応により特異的な点変異を行うことができることを
見出した。より詳細には、５位にビニル誘導体置換基を
導入したピリジミンを有する核酸に対して光照射を行
い、対象ＤＮＡ、及びＲＮＡ上の任意のシトシンに対し
光連結を行い枝分かれ核酸構造を形成させることで、他
のシトシンとの分別化を行い、加熱処理を用いてデアミ
ネーションを促進させ、最終的には短波長光照射による
解裂によってウラシルへと特異的、高効率で点変異させ
ることに成功した。
を解決するために光化学反応により光連結性ヌクレオシ
ドを含有するＤＮＡと、炭素−炭素二重結合を有する塩
基を有する核酸類（ＤＮＡやＰＮＡなど）を光化学反応
により連結と開裂を特異的に行うことができることに着
目し、これを利用して酵素反応を利用すること無く光化
学反応により特異的な点変異を行うことができることを
見出した。より詳細には、５位にビニル誘導体置換基を
導入したピリジミンを有する核酸に対して光照射を行
い、対象ＤＮＡ、及びＲＮＡ上の任意のシトシンに対し
光連結を行い枝分かれ核酸構造を形成させることで、他
のシトシンとの分別化を行い、加熱処理を用いてデアミ
ネーションを促進させ、最終的には短波長光照射による
解裂によってウラシルへと特異的、高効率で点変異させ
ることに成功した。
【０００６】すなわち、本発明は、変換したい塩基を有
する核酸類を、光連結性ヌクレオシドを含有するＤＮＡ
の存在下で、光照射して変換したい塩基と光連結性ヌク
レオシドとを結合させ、変換したい塩基を化学的に変性
させた後、光照射して変換したい塩基と光連結性ヌクレ
オシドとを解裂させることからなる核酸類中の特定の塩
基を点変異させる方法、及びその方法により点変異した
核酸類を製造する方法に関する。また、本発明は、核酸
類中の特定の位置の塩基を、光連結性ヌクレオシドを含
有するＤＮＡの存在下で、光化学反応を利用して酵素の
不存在下で他の塩基に変換することからなる核酸類中の
特定の位置の塩基を点変異させる方法、及びその方法に
より点変異した核酸類を製造する方法に関する。
する核酸類を、光連結性ヌクレオシドを含有するＤＮＡ
の存在下で、光照射して変換したい塩基と光連結性ヌク
レオシドとを結合させ、変換したい塩基を化学的に変性
させた後、光照射して変換したい塩基と光連結性ヌクレ
オシドとを解裂させることからなる核酸類中の特定の塩
基を点変異させる方法、及びその方法により点変異した
核酸類を製造する方法に関する。また、本発明は、核酸
類中の特定の位置の塩基を、光連結性ヌクレオシドを含
有するＤＮＡの存在下で、光化学反応を利用して酵素の
不存在下で他の塩基に変換することからなる核酸類中の
特定の位置の塩基を点変異させる方法、及びその方法に
より点変異した核酸類を製造する方法に関する。
【０００７】より詳細には、本発明は、前記した本発明
の方法において、光連結性ヌクレオシドとして、ビニル
基を導入したピリジミンを有する核酸、好ましくは５位
にビニル誘導体置換基を導入したピリジミンを有する核
酸を含有するものを用いる方法に関する。さらに詳細に
は、本発明は前記した本発明の方法において、光連結性
ヌクレオシドとして、
の方法において、光連結性ヌクレオシドとして、ビニル
基を導入したピリジミンを有する核酸、好ましくは５位
にビニル誘導体置換基を導入したピリジミンを有する核
酸を含有するものを用いる方法に関する。さらに詳細に
は、本発明は前記した本発明の方法において、光連結性
ヌクレオシドとして、
【０００８】
【化２】
【０００９】（式中、ＺはＯ又はＮＨを示し、Ｘ及びＹ
の少なくとも一方は電子吸引性基を示し、Ｘ及びＹの残
りの基は水素原子を示す。）で表される基を有するヌク
レオシドを用いる方法に関する。
の少なくとも一方は電子吸引性基を示し、Ｘ及びＹの残
りの基は水素原子を示す。）で表される基を有するヌク
レオシドを用いる方法に関する。
【００１０】また、本発明は、前記した本発明の方法に
おいて、核酸類中の変換したい塩基として炭素−炭素二
重結合、好ましくは非縮合環系の炭素−炭素二重結合を
有する塩基、例えばシトシンを点変異させる方法に関す
る。本発明の方法を核酸類中の変換したい塩基としてシ
トシンを例にして具体的に説明する。図１は本発明の方
法によりシトシンをウラシルに変換する方法を例示した
ものである。まず、ステップ１においてシトシンを含有
する核酸類のシトシンの直前までをテンプレートにハイ
ブリダイズさせて固定し、ビニル基含有の光連結性ヌク
レオシドを含有するＤＮＡを同様にテンプレートに固定
する。ステップ２においてこれに光（例えば、波長３６
６ｎｍの光）を照射してシトシンと光連結性ヌクレオシ
ドのビニル基とでシクロブタン環を形成させる。ステッ
プ３において、水などの酸素を含有する物質の存在下に
加熱処理してシトシンの脱アミノ化を行う。脱アミノ化
が終了したら、ステップ４においてシクロブタン環を解
裂させるための光（例えば、波長３０２ｎｍの光）を照
射して両者を切り放すとシトシンがウラシルに変換され
た核酸類を得ることができる。
おいて、核酸類中の変換したい塩基として炭素−炭素二
重結合、好ましくは非縮合環系の炭素−炭素二重結合を
有する塩基、例えばシトシンを点変異させる方法に関す
る。本発明の方法を核酸類中の変換したい塩基としてシ
トシンを例にして具体的に説明する。図１は本発明の方
法によりシトシンをウラシルに変換する方法を例示した
ものである。まず、ステップ１においてシトシンを含有
する核酸類のシトシンの直前までをテンプレートにハイ
ブリダイズさせて固定し、ビニル基含有の光連結性ヌク
レオシドを含有するＤＮＡを同様にテンプレートに固定
する。ステップ２においてこれに光（例えば、波長３６
６ｎｍの光）を照射してシトシンと光連結性ヌクレオシ
ドのビニル基とでシクロブタン環を形成させる。ステッ
プ３において、水などの酸素を含有する物質の存在下に
加熱処理してシトシンの脱アミノ化を行う。脱アミノ化
が終了したら、ステップ４においてシクロブタン環を解
裂させるための光（例えば、波長３０２ｎｍの光）を照
射して両者を切り放すとシトシンがウラシルに変換され
た核酸類を得ることができる。
【００１１】本発明の方法をシトシンからウラシルへの
変異を例としてさらに具体的に説明する。シトシンを含
有するＴＧＴＧＣの部分配列を有する核酸（ＯＤＮ
１）を、その相補配列であるＡＣＡＣＧ及びＡＣＧＣＡ
Ｃの塩基配列を有するテンプレート（ＯＤＮ ２）に配
置する。次にビニル基含有の光連結性ヌクレオシドを含
有するＤＮＡとして５−カルボキシビニルウラシルを塩
基（下記化学式中ではＸで示されている。）を有するＸ
ＧＣＧＴＧ・・・の塩基配列を有するＤＮＡ（ＯＤＮ
３）を配置する（ステップ１）。このときの各ＤＮＡの
配置を次の化学式、
変異を例としてさらに具体的に説明する。シトシンを含
有するＴＧＴＧＣの部分配列を有する核酸（ＯＤＮ
１）を、その相補配列であるＡＣＡＣＧ及びＡＣＧＣＡ
Ｃの塩基配列を有するテンプレート（ＯＤＮ ２）に配
置する。次にビニル基含有の光連結性ヌクレオシドを含
有するＤＮＡとして５−カルボキシビニルウラシルを塩
基（下記化学式中ではＸで示されている。）を有するＸ
ＧＣＧＴＧ・・・の塩基配列を有するＤＮＡ（ＯＤＮ
３）を配置する（ステップ１）。このときの各ＤＮＡの
配置を次の化学式、
【００１２】
【化３】
【００１３】に示す。式中のＯＤＮ１、ＯＤＮ２及びＯ
ＤＮ３は前記したＤＮＡである。このようにして、対象
遺伝子のシトシン（Ｃ）の塩基までをテンプレート（Ｏ
ＤＮ ２）に固定化し、当該シトシンに隣接して光連結
性ヌクレオシドを含有するＤＮＡ（ＯＤＮ３）を配置し
て光を照射すると、対象遺伝子と本発明の核酸が連結す
る（ステップ２）。この連結した状態のときに、シトシ
ンの４位のアミノ基を酸素又は水などの酸素含有物の存
在下の水酸基に置換することができる。例えば、連結し
た状態で空気中で穏やかに温度を上げてゆくと空気酸化
されて、シトシンのピリミジン環の４位のアミノ基が水
酸基に置換される（ステップ３）。そして、再度光を照
射して、連結を開裂させると、シトシンがウラシルに変
換されることになる（ステップ４）。
ＤＮ３は前記したＤＮＡである。このようにして、対象
遺伝子のシトシン（Ｃ）の塩基までをテンプレート（Ｏ
ＤＮ ２）に固定化し、当該シトシンに隣接して光連結
性ヌクレオシドを含有するＤＮＡ（ＯＤＮ３）を配置し
て光を照射すると、対象遺伝子と本発明の核酸が連結す
る（ステップ２）。この連結した状態のときに、シトシ
ンの４位のアミノ基を酸素又は水などの酸素含有物の存
在下の水酸基に置換することができる。例えば、連結し
た状態で空気中で穏やかに温度を上げてゆくと空気酸化
されて、シトシンのピリミジン環の４位のアミノ基が水
酸基に置換される（ステップ３）。そして、再度光を照
射して、連結を開裂させると、シトシンがウラシルに変
換されることになる（ステップ４）。
【００１４】図２はこの結果を示したＨＰＬＣのチャー
トである。図２の横軸はリテンション時間（分）であ
り、図２の最上段は光照射前のステップ１の段階のチャ
ートであり、図２の最上段の左からＯＤＮ３、ＯＤＮ
２、ＯＤＮ１の各ピークが示されている。図２の上から
２段目は波長３６６ｎｍの光を１時間照射した後のチャ
ートである。光を照射した後も図２の最上段の左から２
番目のＯＤＮ２のピーク（テンプレートのピーク）は光
照射前と後で変化は無い。しかし図２の最上段の左側の
ＯＤＮ３のピーク及び右側のＯＤＮ１のピークは消失し
て新たにより右側にピークが出現してきている。この新
たに出現したピークはＯＤＮ１とＯＤＮ３が連結した１
７量体のものであり、このピークのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ
ＭＡＳＳによる測定値が５２４８．７４（計算値５２
４９．５５（Ｍ−Ｈ））であったことにより確認され
た。
トである。図２の横軸はリテンション時間（分）であ
り、図２の最上段は光照射前のステップ１の段階のチャ
ートであり、図２の最上段の左からＯＤＮ３、ＯＤＮ
２、ＯＤＮ１の各ピークが示されている。図２の上から
２段目は波長３６６ｎｍの光を１時間照射した後のチャ
ートである。光を照射した後も図２の最上段の左から２
番目のＯＤＮ２のピーク（テンプレートのピーク）は光
照射前と後で変化は無い。しかし図２の最上段の左側の
ＯＤＮ３のピーク及び右側のＯＤＮ１のピークは消失し
て新たにより右側にピークが出現してきている。この新
たに出現したピークはＯＤＮ１とＯＤＮ３が連結した１
７量体のものであり、このピークのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ
ＭＡＳＳによる測定値が５２４８．７４（計算値５２
４９．５５（Ｍ−Ｈ））であったことにより確認され
た。
【００１５】得られた１７量体をテンプレートから分離
し、９０℃で２時間加熱した後のチャートが図２の上か
ら３段目のものである。最も左のピークは内部標準とし
て用いたチミンのピークであり、右側のピークがデアミ
ネーションされた１７量体のものである。このものはＭ
ＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＡＳＳによる測定値が５２５２．
１（計算値５２５０．５（Ｍ−Ｈ））であったことによ
り確認された。得られたデアミネーションされた１７量
体に波長３０２ｎｍの光を１時間照射し、ポリＡを含む
断片を酵素処理した結果のＨＰＬＣのチャートが図２の
最下段に示されている。左側にｄＵのピークを確認する
ことができた。ｄＣのピークは消失し、ｄＵ：ｄＧ：ｄ
Ｔ：ｄＡ＝１：２：２：６であった。
し、９０℃で２時間加熱した後のチャートが図２の上か
ら３段目のものである。最も左のピークは内部標準とし
て用いたチミンのピークであり、右側のピークがデアミ
ネーションされた１７量体のものである。このものはＭ
ＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＡＳＳによる測定値が５２５２．
１（計算値５２５０．５（Ｍ−Ｈ））であったことによ
り確認された。得られたデアミネーションされた１７量
体に波長３０２ｎｍの光を１時間照射し、ポリＡを含む
断片を酵素処理した結果のＨＰＬＣのチャートが図２の
最下段に示されている。左側にｄＵのピークを確認する
ことができた。ｄＣのピークは消失し、ｄＵ：ｄＧ：ｄ
Ｔ：ｄＡ＝１：２：２：６であった。
【００１６】シトシンがウラシルに変換されたＤＮＡ
を、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼで処理すると、この
ウラシルの位置で特異的に切断することができる。した
がって、ＤＮＡの任意のシトシンの位置を本発明の方法
によりウラシル化することにより、ＤＮＡを任意の位置
での特異的に切断することも可能となる。前記の実験結
果をウラシルＤＮＡグリコシラーゼで処理により、ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動で分析した結果を図３に、
図面に代わる写真で示す。図３のＡの位置はウラシルの
位置で切断された断片を示している。レーン１は反応前
のものである。レーン２は３６６ｎｍの光照射を１時間
行った後のものである。レーン３はレーン２の後に９０
度加熱を２時間行ったものである。レーン４はレーン３
の後に３０２ｎｍの光照射を１時間行ったものである。
レーン５はレーン４の後にウラシルＤＮＡグリコシラー
ゼで処理（３７℃で１時間）して、ピペリジンで９０度
加熱を３０分間行ったものである。レーン６はレーン２
の後に９０度加熱を行わずに、３０２ｎｍの光照射を１
時間行ったものであり、シトシンはウラシルに変換され
ていないものである。レーン７はレーン６の後にウラシ
ルＤＮＡグリコシラーゼで処理（３７℃で１時間）し
て、ピペリジンで９０度加熱を３０分間行ったものであ
り、ウラシルに変換されていないために切断された断片
は得られていない。レーン８は対照として５'−３２Ｐ
−ＴＧＴＧＵＡＡＡＡＡＡをウラシルＤＮＡグリコシラ
ーゼで処理（３７℃で１時間）して、ピペリジンで９０
度加熱を３０分間行ったものである。
を、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼで処理すると、この
ウラシルの位置で特異的に切断することができる。した
がって、ＤＮＡの任意のシトシンの位置を本発明の方法
によりウラシル化することにより、ＤＮＡを任意の位置
での特異的に切断することも可能となる。前記の実験結
果をウラシルＤＮＡグリコシラーゼで処理により、ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動で分析した結果を図３に、
図面に代わる写真で示す。図３のＡの位置はウラシルの
位置で切断された断片を示している。レーン１は反応前
のものである。レーン２は３６６ｎｍの光照射を１時間
行った後のものである。レーン３はレーン２の後に９０
度加熱を２時間行ったものである。レーン４はレーン３
の後に３０２ｎｍの光照射を１時間行ったものである。
レーン５はレーン４の後にウラシルＤＮＡグリコシラー
ゼで処理（３７℃で１時間）して、ピペリジンで９０度
加熱を３０分間行ったものである。レーン６はレーン２
の後に９０度加熱を行わずに、３０２ｎｍの光照射を１
時間行ったものであり、シトシンはウラシルに変換され
ていないものである。レーン７はレーン６の後にウラシ
ルＤＮＡグリコシラーゼで処理（３７℃で１時間）し
て、ピペリジンで９０度加熱を３０分間行ったものであ
り、ウラシルに変換されていないために切断された断片
は得られていない。レーン８は対照として５'−３２Ｐ
−ＴＧＴＧＵＡＡＡＡＡＡをウラシルＤＮＡグリコシラ
ーゼで処理（３７℃で１時間）して、ピペリジンで９０
度加熱を３０分間行ったものである。
【００１７】この結果、コントロールのレーン８と、光
反応実験で得られたレーン５のバンド（ウラシルでの切
断）が一致した。レーン６、７のように９０度加熱を行
わないと酵素で切断されないので、加熱によって、シト
シンがウラシルに変換されていることがわかった。この
ように９０℃での加熱を行わないとデアミネーションが
進行せず、シトシンがウラシルに変換されないことがわ
かった。
反応実験で得られたレーン５のバンド（ウラシルでの切
断）が一致した。レーン６、７のように９０度加熱を行
わないと酵素で切断されないので、加熱によって、シト
シンがウラシルに変換されていることがわかった。この
ように９０℃での加熱を行わないとデアミネーションが
進行せず、シトシンがウラシルに変換されないことがわ
かった。
【００１８】そこで、デアミネーションの条件について
検討した。その結果のポリアクリルアミドゲル電気泳動
で分析を図４に、図面に代わる写真で示す。レーン１は
反応前のものである。レーン２は３６６ｎｍの光照射を
１時間行った後のものである。レーン３はレーン２の後
に９０度加熱を行わず、３０２ｎｍ光照射１時間、ウラ
シルＤＮＡグリコシラーゼ処理（３７度・１時間）、ピ
ペリジン処理（９０度加熱・３０分）を行ったものであ
る。レーン４はレーン２の後に９０度加熱を１５分行
い、それ以外はレーン３と同じものである。レーン５は
レーン２の後に９０度加熱を３０分行い、それ以外はレ
ーン３と同じものである。レーン６はレーン２の後に９
０℃加熱を４５分行い、それ以外はレーン３と同じもの
である。レーン７はレーン２の後に９０度加熱を６０分
行い、それ以外はレーン３と同じものである。レーン８
はレーン２の後に９０度加熱を７５分行い、それ以外は
レーン３と同じものである。レーン９はレーン２の後に
９０度加熱を９０分行い、それ以外はレーン３と同じも
のである。レーン１０はレーン２の後に９０度加熱を１
０５分行い、それ以外はレーン３と同じものである。レ
ーン１１はレーン２の後に９０度加熱を１２０分行い、
それ以外はレーン３と同じものである。レーン１２は対
照として５'−３２Ｐ−ＴＧＴＧＵＡＡＡＡＡＡをウラ
シルＤＮＡグリコシラーゼで処理（３７度・１時間）し
て、ピペリジンで９０度加熱を３０分間行ったものであ
る。
検討した。その結果のポリアクリルアミドゲル電気泳動
で分析を図４に、図面に代わる写真で示す。レーン１は
反応前のものである。レーン２は３６６ｎｍの光照射を
１時間行った後のものである。レーン３はレーン２の後
に９０度加熱を行わず、３０２ｎｍ光照射１時間、ウラ
シルＤＮＡグリコシラーゼ処理（３７度・１時間）、ピ
ペリジン処理（９０度加熱・３０分）を行ったものであ
る。レーン４はレーン２の後に９０度加熱を１５分行
い、それ以外はレーン３と同じものである。レーン５は
レーン２の後に９０度加熱を３０分行い、それ以外はレ
ーン３と同じものである。レーン６はレーン２の後に９
０℃加熱を４５分行い、それ以外はレーン３と同じもの
である。レーン７はレーン２の後に９０度加熱を６０分
行い、それ以外はレーン３と同じものである。レーン８
はレーン２の後に９０度加熱を７５分行い、それ以外は
レーン３と同じものである。レーン９はレーン２の後に
９０度加熱を９０分行い、それ以外はレーン３と同じも
のである。レーン１０はレーン２の後に９０度加熱を１
０５分行い、それ以外はレーン３と同じものである。レ
ーン１１はレーン２の後に９０度加熱を１２０分行い、
それ以外はレーン３と同じものである。レーン１２は対
照として５'−３２Ｐ−ＴＧＴＧＵＡＡＡＡＡＡをウラ
シルＤＮＡグリコシラーゼで処理（３７度・１時間）し
て、ピペリジンで９０度加熱を３０分間行ったものであ
る。
【００１９】この結果を定量化して示したものが図５で
ある。図５の横軸は時間（分）であり、縦軸はデアミネ
ーションされていないシトシンタイプの残量を％で示し
ている。このデアミネーションされていないシトシンタ
イプの半減期は４０分（９０℃）であることがわかっ
た。このように、本発明の方法によれば、光連結性ヌク
レオシド含有ＤＮＡの光照射により、対象シトシンに対
するシクロブタン反応を行い枝分かれ核酸を形成させ、
加熱処理、及び化学反応処理を行うことでシトシンの脱
アミノ化を促進し、最終的に光解裂を行い、ＤＮＡ、及
びＲＮＡ上の任意のシトシンをウラシルへと誘導が可能
になる。この技術はフォトブランチング技術との組み合
わせにより、ｉ）光転写制御、ii）光翻訳制御、iii）
光誘導型変異蛋白の生産等への利用が期待される。
ある。図５の横軸は時間（分）であり、縦軸はデアミネ
ーションされていないシトシンタイプの残量を％で示し
ている。このデアミネーションされていないシトシンタ
イプの半減期は４０分（９０℃）であることがわかっ
た。このように、本発明の方法によれば、光連結性ヌク
レオシド含有ＤＮＡの光照射により、対象シトシンに対
するシクロブタン反応を行い枝分かれ核酸を形成させ、
加熱処理、及び化学反応処理を行うことでシトシンの脱
アミノ化を促進し、最終的に光解裂を行い、ＤＮＡ、及
びＲＮＡ上の任意のシトシンをウラシルへと誘導が可能
になる。この技術はフォトブランチング技術との組み合
わせにより、ｉ）光転写制御、ii）光翻訳制御、iii）
光誘導型変異蛋白の生産等への利用が期待される。
【００２０】本発明の方法は、後処理の必要な化学活性
化剤や使用条件に制限がかかる酵素を全く用いずに、光
をトリガーとして用いるシトシンからウラシルへの点変
異技術であり、環境にやさしい２１世紀型のバイオテク
ノロジー技術である。任意の位置のシトシンをウラシル
へと点変異させる技術としても有用である。
化剤や使用条件に制限がかかる酵素を全く用いずに、光
をトリガーとして用いるシトシンからウラシルへの点変
異技術であり、環境にやさしい２１世紀型のバイオテク
ノロジー技術である。任意の位置のシトシンをウラシル
へと点変異させる技術としても有用である。
【００２１】
【発明の実施の形態】本発明の光連結性ヌクレオシド
は、塩基部分に次式、
は、塩基部分に次式、
【００２２】
【化４】
【００２３】（式中、ＺはＯ又はＮＨを示し、Ｘ及びＹ
の少なくとも一方は電子吸引性基を示し、Ｘ及びＹの残
りの基は水素原子を示す。）で表される基を有すること
が好ましい。置換基Ｘ、Ｙにおける電子吸引基として
は、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、シアノ
基、ニトロ基などが挙げられるがこれらの例示したもの
に限定されるものではなく、細胞系への適合を考慮して
適宜電子吸引基を選択することができる。好ましい電子
吸引基としては、カルボキシル基、アルコキシカルボニ
ル基、シアノ基などが挙げられる。アルコキシカルボニ
ル基におけるアルキル基としては、炭素数１から１０、
好ましくは１から５の低級アルキル基が挙げられる。置
換基Ｘ、Ｙは、両方が同時に同一または異なる電子吸引
基であってもよく、また置換基Ｘ、Ｙの一方だけが電子
吸引基であり、他方が水素原子であってもよい。
の少なくとも一方は電子吸引性基を示し、Ｘ及びＹの残
りの基は水素原子を示す。）で表される基を有すること
が好ましい。置換基Ｘ、Ｙにおける電子吸引基として
は、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、シアノ
基、ニトロ基などが挙げられるがこれらの例示したもの
に限定されるものではなく、細胞系への適合を考慮して
適宜電子吸引基を選択することができる。好ましい電子
吸引基としては、カルボキシル基、アルコキシカルボニ
ル基、シアノ基などが挙げられる。アルコキシカルボニ
ル基におけるアルキル基としては、炭素数１から１０、
好ましくは１から５の低級アルキル基が挙げられる。置
換基Ｘ、Ｙは、両方が同時に同一または異なる電子吸引
基であってもよく、また置換基Ｘ、Ｙの一方だけが電子
吸引基であり、他方が水素原子であってもよい。
【００２４】本発明の核酸類としては、ＤＮＡ、ＲＮ
Ａ、ＰＮＡなどのいずれであってもよく、天然又は合成
のＤＮＡやＲＮＡなどと塩基対を形成し得るものが好ま
しい。また、本発明の核酸類は、変換させる塩基だけを
有するモノヌクレオチドであってもよいが、他の核酸と
共にオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドになって
いるものが好ましい。オリゴヌクレオチド又はポリヌク
レオチドにおける塩基数は特に制限はないが、好ましく
は１から１００００、より好ましくは１から３０００、
さらに好ましくは１から１０００程度である。また、本
発明の光連結性ヌクレオシドを含有するＤＮＡは、ＤＮ
Ａであっても、ＲＮＡであっても、またＰＮＡであって
もよいが、その鎖中に少なくとも１個の光連結性ヌクレ
オシドを含有するものである。光連結性ヌクレオシドを
含有する位置としては反応性に影響が無ければ特に制限
は無いが、通常は５’又は３’末端が好ましい。本発明
の光連結性ヌクレオシドを含有するＤＮＡの長さも特に
制限はないが、入手のし易さや取扱いの簡便さから、余
り長くないのが好ましい。好ましい長さとしては、例え
ば、塩基数で１〜５０、１〜２５、５〜１５程度であ
る。
Ａ、ＰＮＡなどのいずれであってもよく、天然又は合成
のＤＮＡやＲＮＡなどと塩基対を形成し得るものが好ま
しい。また、本発明の核酸類は、変換させる塩基だけを
有するモノヌクレオチドであってもよいが、他の核酸と
共にオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドになって
いるものが好ましい。オリゴヌクレオチド又はポリヌク
レオチドにおける塩基数は特に制限はないが、好ましく
は１から１００００、より好ましくは１から３０００、
さらに好ましくは１から１０００程度である。また、本
発明の光連結性ヌクレオシドを含有するＤＮＡは、ＤＮ
Ａであっても、ＲＮＡであっても、またＰＮＡであって
もよいが、その鎖中に少なくとも１個の光連結性ヌクレ
オシドを含有するものである。光連結性ヌクレオシドを
含有する位置としては反応性に影響が無ければ特に制限
は無いが、通常は５’又は３’末端が好ましい。本発明
の光連結性ヌクレオシドを含有するＤＮＡの長さも特に
制限はないが、入手のし易さや取扱いの簡便さから、余
り長くないのが好ましい。好ましい長さとしては、例え
ば、塩基数で１〜５０、１〜２５、５〜１５程度であ
る。
【００２５】本発明の光連結性ヌクレオシドは、通常の
核酸の製造方法に準じて製造することができる。例え
ば、５−置換ビニルウリジンのＤＭＴｒ体にアミダイド
化剤を作用させてアミダイド化し、次いで保護基を切断
して、これを通常のＤＮＡ合成法によりオリゴヌクレオ
チドとすることができる。５−置換ビニルシトシン誘導
体又は５−置換ビニルウラシル誘導体は、以下に示す具
体例の方法によってもよいが、他の通常の有機合成法に
よっても製造することができる。
核酸の製造方法に準じて製造することができる。例え
ば、５−置換ビニルウリジンのＤＭＴｒ体にアミダイド
化剤を作用させてアミダイド化し、次いで保護基を切断
して、これを通常のＤＮＡ合成法によりオリゴヌクレオ
チドとすることができる。５−置換ビニルシトシン誘導
体又は５−置換ビニルウラシル誘導体は、以下に示す具
体例の方法によってもよいが、他の通常の有機合成法に
よっても製造することができる。
【００２６】本発明の方法における、変換させる塩基と
しては、炭素−炭素二重結合を有する塩基であるが、縮
合環を形成している炭素−炭素二重結合は好ましくな
く、単環式の炭素−炭素二重結合又は環に置換している
炭素−炭素二重結合が好ましい。好ましい炭素−炭素二
重結合を有する塩基としては、天然のものではシトシ
ン、チミン又はウラシルなどが挙げられる。炭素−炭素
二重結合を有する塩基を有する核酸類としては、ＤＮ
Ａ、ＲＮＡ、ＰＮＡなどのいずれのものであってもよ
い。
しては、炭素−炭素二重結合を有する塩基であるが、縮
合環を形成している炭素−炭素二重結合は好ましくな
く、単環式の炭素−炭素二重結合又は環に置換している
炭素−炭素二重結合が好ましい。好ましい炭素−炭素二
重結合を有する塩基としては、天然のものではシトシ
ン、チミン又はウラシルなどが挙げられる。炭素−炭素
二重結合を有する塩基を有する核酸類としては、ＤＮ
Ａ、ＲＮＡ、ＰＮＡなどのいずれのものであってもよ
い。
【００２７】本発明の方法における光としては、反応に
必要なエネルギーを有する波長のものであればよいが、
紫外線が好ましい。一般に、連結させるときは、比較的
長波長側でよく、開裂させる場合には比較的短波長側の
光が好ましい。より具体的には、連結させるときの波長
としては、３３０ｎｍ以上、好ましくは３５０ｎｍ以
上、より好ましくは３６０ｎｍ以上の波長が好ましい。
また、開裂させるときの波長としては、３２０ｎｍ以
下、好ましくは３１０ｎｍ以下の波長が好ましい。好ま
しい波長としては、連結させるときの波長が３６６ｎｍ
で、開裂させるときの波長が３０２ｎｍである場合が挙
げられる。
必要なエネルギーを有する波長のものであればよいが、
紫外線が好ましい。一般に、連結させるときは、比較的
長波長側でよく、開裂させる場合には比較的短波長側の
光が好ましい。より具体的には、連結させるときの波長
としては、３３０ｎｍ以上、好ましくは３５０ｎｍ以
上、より好ましくは３６０ｎｍ以上の波長が好ましい。
また、開裂させるときの波長としては、３２０ｎｍ以
下、好ましくは３１０ｎｍ以下の波長が好ましい。好ま
しい波長としては、連結させるときの波長が３６６ｎｍ
で、開裂させるときの波長が３０２ｎｍである場合が挙
げられる。
【００２８】本発明の方法は、溶液中のように自由に流
動できる状態で行うこともできるが、より選択性を挙げ
るためにはテンプレートに固定して反応させる方法が好
ましい。テンプレートとしては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮ
Ａなどの塩基対を形成し得るものであればよい。テンプ
レートの長さは特に制限はないが、３塩基以上、好まし
くは５塩基以上がテンプレート上で塩基対を形成できる
長さのものが好ましい。テンプレートは１本鎖のもので
あってよいが、前述してきたようにテンプレートとして
二本鎖ＤＮＡを使用することもできる。
動できる状態で行うこともできるが、より選択性を挙げ
るためにはテンプレートに固定して反応させる方法が好
ましい。テンプレートとしては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮ
Ａなどの塩基対を形成し得るものであればよい。テンプ
レートの長さは特に制限はないが、３塩基以上、好まし
くは５塩基以上がテンプレート上で塩基対を形成できる
長さのものが好ましい。テンプレートは１本鎖のもので
あってよいが、前述してきたようにテンプレートとして
二本鎖ＤＮＡを使用することもできる。
【００２９】本発明の方法における、変換させる塩基を
含有する核酸類としては、前記したテンプレートに固定
化できるものであればどのようなものであってもよい。
目的のシトシンの位置から上流又は下流側の３〜１０塩
基程度の塩基配列を調べて、それの相補的な塩基配列を
有するものをテンプレートとして使用することができ
る。本発明の化学的に変性する方法としては、加水分
解、酸化反応、還元反応、アミノ化反応などの各種の化
学反応が挙げられる。例えば、シトシンのアミノ基を加
水分解して水酸基にする方法などが挙げられる。この方
法における、酸素又は水などの酸素含有物としては、空
気中の酸素や加水分解のための水などを使用することが
できる。この方法によって得られたウラシル化されたＤ
ＮＡは、常法によるウラシルＤＮＡグリコシラーゼ処理
をすることができる。
含有する核酸類としては、前記したテンプレートに固定
化できるものであればどのようなものであってもよい。
目的のシトシンの位置から上流又は下流側の３〜１０塩
基程度の塩基配列を調べて、それの相補的な塩基配列を
有するものをテンプレートとして使用することができ
る。本発明の化学的に変性する方法としては、加水分
解、酸化反応、還元反応、アミノ化反応などの各種の化
学反応が挙げられる。例えば、シトシンのアミノ基を加
水分解して水酸基にする方法などが挙げられる。この方
法における、酸素又は水などの酸素含有物としては、空
気中の酸素や加水分解のための水などを使用することが
できる。この方法によって得られたウラシル化されたＤ
ＮＡは、常法によるウラシルＤＮＡグリコシラーゼ処理
をすることができる。
【００３０】
【実施例】次に実施例により本発明をより詳細に説明す
るが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではな
い。５−シアノビニルデオキシウリジンを含有する核酸
の製造例の反応式を次に示す。以下の説明においては、
この反応式に示される化合物番号を使用する。
るが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではな
い。５−シアノビニルデオキシウリジンを含有する核酸
の製造例の反応式を次に示す。以下の説明においては、
この反応式に示される化合物番号を使用する。
【００３１】
【化５】
【００３２】実施例１ ５−シアノビニルデオキシウリ
ジン（４）の製造 （１） 化合物（２）の製造 ５−ヨード−デオキシウリジン（ＩＤＵ）（１）をピリ
ジン５ｍＬと３回共沸し、ＴＢＤＭＳ−Ｃｌ（１．７１
７ｇ，１１．４０ｍｍｏｌ）と共に窒素置換し、ピリジ
ン５ｍＬを加え均一溶液とした。これにイミダゾール
（０．７７６ｇ，１１．３９ｍｍｏｌ）のピリジン溶液
（５ｍＬ）を加え、室温で１２時間攪拌した。薄層クロ
マト（ＴＬＣ）で原料の消失を確認後、ピリジンを減圧
で留去し、残留物を酢酸エチル（２０ｍＬｘ３）と水
（２０ｍＬ）を用いて抽出した。得られた有機層を硫酸
マグネシウムで乾燥し、溶媒を除去した後、カラムクロ
マトグラフィー（シリカゲル、溶出溶媒 ヘキサン/酢
酸エチル＝４：１）により目的の化合物（２）を白色固
体（１．６６１ｇ，９６．５％）として得た。１ Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：0.04-0.
14 (m,12H,CH3Six4), 0.88 (s,9H,t-BuSi),0.93(s,9H,t
-BuSi), 1.96 (m,1H,H-2β'), 2.28 (m,1H,H-2α'),3.7
4 (dd,J=11.2Hz,J=2.4Hz,1H,H-5'),3.87 (dd,J=11.2Hz,
J=2.4Hz,1H,H-5'),3.97 (m,1H,H-4'), 4.38 (m,1H,H-
3'), 6.25 (t,1H,H-1'),8.07 (s,1H,H-6), 8.09(br,1H,
NH)
ジン（４）の製造 （１） 化合物（２）の製造 ５−ヨード−デオキシウリジン（ＩＤＵ）（１）をピリ
ジン５ｍＬと３回共沸し、ＴＢＤＭＳ−Ｃｌ（１．７１
７ｇ，１１．４０ｍｍｏｌ）と共に窒素置換し、ピリジ
ン５ｍＬを加え均一溶液とした。これにイミダゾール
（０．７７６ｇ，１１．３９ｍｍｏｌ）のピリジン溶液
（５ｍＬ）を加え、室温で１２時間攪拌した。薄層クロ
マト（ＴＬＣ）で原料の消失を確認後、ピリジンを減圧
で留去し、残留物を酢酸エチル（２０ｍＬｘ３）と水
（２０ｍＬ）を用いて抽出した。得られた有機層を硫酸
マグネシウムで乾燥し、溶媒を除去した後、カラムクロ
マトグラフィー（シリカゲル、溶出溶媒 ヘキサン/酢
酸エチル＝４：１）により目的の化合物（２）を白色固
体（１．６６１ｇ，９６．５％）として得た。１ Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：0.04-0.
14 (m,12H,CH3Six4), 0.88 (s,9H,t-BuSi),0.93(s,9H,t
-BuSi), 1.96 (m,1H,H-2β'), 2.28 (m,1H,H-2α'),3.7
4 (dd,J=11.2Hz,J=2.4Hz,1H,H-5'),3.87 (dd,J=11.2Hz,
J=2.4Hz,1H,H-5'),3.97 (m,1H,H-4'), 4.38 (m,1H,H-
3'), 6.25 (t,1H,H-1'),8.07 (s,1H,H-6), 8.09(br,1H,
NH)
【００３３】（２） 化合物（３）の製造 Ｐｄ（ＯＡｃ）２（０．０１９ｇ，０．０８５ｍｍｏ
ｌ），ＰＰｈ３（０．０４５ｇ，０．１７０ｍｍｏｌ）
を窒素雰囲気下で、ＤＭＦ（２．５ｍＬ）中に加えた
後、さらにＮＥｔ３（０．９３ｍＬ，６．６７２ｍｍｏ
ｌ）を加え、６０℃の水浴中で攪拌した。溶液が濃赤色
になった後に、前記（１）で得た化合物（２）（０．４
９８ｇ，０．８５４ｍｍｏｌ）、アクリルニトリル
（０．７ｍＬ，１０．６３ｍｍｏｌ）をＤＭＦ溶液とし
て加え一晩攪拌した。減圧でＤＭＦを除去した後、酢酸
エチル（１５ｍＬｘ３）、水（１５ｍＬ）で抽出し、得
られた有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し再び溶媒を除
去した。残留物に対してカラムクロマトグラフィー（シ
リカゲル、溶出溶媒 ヘキサン/酢酸エチル＝４：１）
により目的の化合物（３）を黄色固体（０．４３４ｇ，
５３．７％）として単離した。１ Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：0.03-0.
14 (m,12H,CH3Six4), 0.88 (s,9H,t-BuSi),0.91 (s,9H,
t-BuSi), 2.00 (m,1H,H-2'β), 2.39 (m,1H,H-2'α),3.
76 (dd,1H,H-5'), 3.87 (dd,1H,H-5'), 4.00 (m,1H,H-
4'),4.37 (m,1H,H-3'), 6.23 (t,1H,H-1'),6.67 (dd,J=
16.4Hz,1H,vinylic H-1''),6.85 (dd,J=16.2Hz,1H,viny
lic H-2''), 7.96 (s,1H,H-6),7.98 (br,1H,NH)
ｌ），ＰＰｈ３（０．０４５ｇ，０．１７０ｍｍｏｌ）
を窒素雰囲気下で、ＤＭＦ（２．５ｍＬ）中に加えた
後、さらにＮＥｔ３（０．９３ｍＬ，６．６７２ｍｍｏ
ｌ）を加え、６０℃の水浴中で攪拌した。溶液が濃赤色
になった後に、前記（１）で得た化合物（２）（０．４
９８ｇ，０．８５４ｍｍｏｌ）、アクリルニトリル
（０．７ｍＬ，１０．６３ｍｍｏｌ）をＤＭＦ溶液とし
て加え一晩攪拌した。減圧でＤＭＦを除去した後、酢酸
エチル（１５ｍＬｘ３）、水（１５ｍＬ）で抽出し、得
られた有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し再び溶媒を除
去した。残留物に対してカラムクロマトグラフィー（シ
リカゲル、溶出溶媒 ヘキサン/酢酸エチル＝４：１）
により目的の化合物（３）を黄色固体（０．４３４ｇ，
５３．７％）として単離した。１ Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：0.03-0.
14 (m,12H,CH3Six4), 0.88 (s,9H,t-BuSi),0.91 (s,9H,
t-BuSi), 2.00 (m,1H,H-2'β), 2.39 (m,1H,H-2'α),3.
76 (dd,1H,H-5'), 3.87 (dd,1H,H-5'), 4.00 (m,1H,H-
4'),4.37 (m,1H,H-3'), 6.23 (t,1H,H-1'),6.67 (dd,J=
16.4Hz,1H,vinylic H-1''),6.85 (dd,J=16.2Hz,1H,viny
lic H-2''), 7.96 (s,1H,H-6),7.98 (br,1H,NH)
【００３４】（３） 化合物（４）の製造 前記の（２）で得られた化合物（３）（０．２３３ｇ，
０．４５９ｍｍｏｌ）にＴＢＡＦ（in ＴＨＦ，１ｍｍ
ｏｌ／ｌ）２．０ｍＬを加え室温で４５分攪拌した後、
溶媒を除去した。残留物に対してカラムクロマトグラフ
ィー（シリカゲル、溶出溶媒 ５％ＭｅＯＨ in ＣＨ
Ｃｌ３）により目的の化合物（４）を淡黄色固体（０．
１２８ｇ，７５％）として単離した。１ Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：2.1
5 (m,2H,H-2'αβ), 3.57 (m,1H,H-5'), 3.65 (m,1H,H-
5'),3.80 (m,1H,H-4'), 4.23 (m,1H,H-3'), 5.10 (t,1
H,OH-5'),5.26 (d,1H,OH-3'), 6.08 (t,J=6.4Hz,1H,H-
1'),6.50 (dd,J=1.6Hz,J=14Hz,1H,vinylic H-1''),7.22
(dd,J=1.6Hz,J=14Hz,1H,vinylic H-2''), 8.33 (s,1H,
H-6),11.72 (br,1H,NH)
０．４５９ｍｍｏｌ）にＴＢＡＦ（in ＴＨＦ，１ｍｍ
ｏｌ／ｌ）２．０ｍＬを加え室温で４５分攪拌した後、
溶媒を除去した。残留物に対してカラムクロマトグラフ
ィー（シリカゲル、溶出溶媒 ５％ＭｅＯＨ in ＣＨ
Ｃｌ３）により目的の化合物（４）を淡黄色固体（０．
１２８ｇ，７５％）として単離した。１ Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：2.1
5 (m,2H,H-2'αβ), 3.57 (m,1H,H-5'), 3.65 (m,1H,H-
5'),3.80 (m,1H,H-4'), 4.23 (m,1H,H-3'), 5.10 (t,1
H,OH-5'),5.26 (d,1H,OH-3'), 6.08 (t,J=6.4Hz,1H,H-
1'),6.50 (dd,J=1.6Hz,J=14Hz,1H,vinylic H-1''),7.22
(dd,J=1.6Hz,J=14Hz,1H,vinylic H-2''), 8.33 (s,1H,
H-6),11.72 (br,1H,NH)
【００３５】実施例２ ５−シアノビニルデオキシウリ
ジンを含有する核酸（７）の製造 （１） 化合物（５）の製造 前記した実施例１で得られた化合物（４）（０．０９６
ｇ，０．３４４ｍｍｏｌ）をピリジン２ｍＬとの供沸操
作を３回行った後、ＤＭＴｒ−Ｃｌ（０．１３３ｇ，
０．３９２ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（０．０２５ｇ，０．
２０３ｍｍｏｌ）と共に窒素雰囲気下とした。ピリジン
（１ｍＬ）を加え攪拌し、均一溶液とした。さらにここ
へＮＥｔ３（０．０５ｍＬ，０．３５９ｍｍｏｌ）を加
え室温で２０時間攪拌した。減圧でピリジンを除去した
後、クロロホルム（１０ｍＬｘ３）と水（１０ｍＬ）で
抽出し、得られた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、溶
媒を除去した。残留物に対しカラムクロマトグラフィー
（シリカゲル、溶出溶媒３％ＭｅＯＨ in ＣＨＣｌ３）
により目的の化合物（５）を黄色固体（０．０９６ｇ，
４７．９％）として得た。１ Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：2.38
(m,1H,H-2'β), 2.49 (m,1H,H-2'α),3.43 (dd,J=10.4H
z,J=2.4Hz,1H,H-5'),3.52 (dd,J=2.4Hz,J=10.4Hz,1H,H-
5'), 3.80 (s,6H,OCH3x2),4.11 (m,1H,H-4'), 4.68 (m,
1H,H-3'),6.50 (d,J=14Hz,1H,vinylic H-1''), 6.08
(t,J=6.4Hz,1H,H-1'),7.22 (d,J=14Hz,1H,vinylic H-
2''),6.84-6.87 (m,4H,H-β to OCH3x4), 7.20-7.33
(m,9H,phenyl),7.98 (br,1H,NH), 8.00 (s,1H,H-6)
ジンを含有する核酸（７）の製造 （１） 化合物（５）の製造 前記した実施例１で得られた化合物（４）（０．０９６
ｇ，０．３４４ｍｍｏｌ）をピリジン２ｍＬとの供沸操
作を３回行った後、ＤＭＴｒ−Ｃｌ（０．１３３ｇ，
０．３９２ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（０．０２５ｇ，０．
２０３ｍｍｏｌ）と共に窒素雰囲気下とした。ピリジン
（１ｍＬ）を加え攪拌し、均一溶液とした。さらにここ
へＮＥｔ３（０．０５ｍＬ，０．３５９ｍｍｏｌ）を加
え室温で２０時間攪拌した。減圧でピリジンを除去した
後、クロロホルム（１０ｍＬｘ３）と水（１０ｍＬ）で
抽出し、得られた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、溶
媒を除去した。残留物に対しカラムクロマトグラフィー
（シリカゲル、溶出溶媒３％ＭｅＯＨ in ＣＨＣｌ３）
により目的の化合物（５）を黄色固体（０．０９６ｇ，
４７．９％）として得た。１ Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：2.38
(m,1H,H-2'β), 2.49 (m,1H,H-2'α),3.43 (dd,J=10.4H
z,J=2.4Hz,1H,H-5'),3.52 (dd,J=2.4Hz,J=10.4Hz,1H,H-
5'), 3.80 (s,6H,OCH3x2),4.11 (m,1H,H-4'), 4.68 (m,
1H,H-3'),6.50 (d,J=14Hz,1H,vinylic H-1''), 6.08
(t,J=6.4Hz,1H,H-1'),7.22 (d,J=14Hz,1H,vinylic H-
2''),6.84-6.87 (m,4H,H-β to OCH3x4), 7.20-7.33
(m,9H,phenyl),7.98 (br,1H,NH), 8.00 (s,1H,H-6)
【００３６】（２） 化合物（７）の製造 前記の（１）で得られた化合物（５）をアセトニトリル
を用いてゴムシールドボトルへ移した後、減圧し溶媒を
除去し、アルゴン雰囲気下とした。アセトニトリル（１
ｍＬ）を加え固体を溶解させた後、アミダイト化剤（５
０ｕＬ）、テトラゾール（０．５Ｍ，３６０ｕＬ）を順
に加え９０分攪拌した。あらかじめＮａＨＣＯ３水溶液
で洗浄した酢酸エチルと、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液を用
いて抽出操作を行い、得られた有機層を硫酸ナトリウム
で乾燥し溶媒を除去した。得られた固体をアセトニトリ
ルを用いてゴムシールドボトルへ移し、減圧し溶媒を除
去した。さらにアセトニトリルとの供沸操作を２回行っ
た。これ以上の精製はせず、このままＤＮＡ合成機へ取
り付けオリゴマー合成を行った。ＤＮＡ合成機を用いて
オリゴマー（５’−ＣＮＵＧＣ ＧＴＧ）を合成し、Ｈ
ＰＬＣを用いて精製を行った。 Ｍａｓｓスペクトル：計算値 Ｃ６１Ｈ７４Ｎ２３Ｏ３６Ｐ５ 1859.3354 実測値 1859.4003
を用いてゴムシールドボトルへ移した後、減圧し溶媒を
除去し、アルゴン雰囲気下とした。アセトニトリル（１
ｍＬ）を加え固体を溶解させた後、アミダイト化剤（５
０ｕＬ）、テトラゾール（０．５Ｍ，３６０ｕＬ）を順
に加え９０分攪拌した。あらかじめＮａＨＣＯ３水溶液
で洗浄した酢酸エチルと、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液を用
いて抽出操作を行い、得られた有機層を硫酸ナトリウム
で乾燥し溶媒を除去した。得られた固体をアセトニトリ
ルを用いてゴムシールドボトルへ移し、減圧し溶媒を除
去した。さらにアセトニトリルとの供沸操作を２回行っ
た。これ以上の精製はせず、このままＤＮＡ合成機へ取
り付けオリゴマー合成を行った。ＤＮＡ合成機を用いて
オリゴマー（５’−ＣＮＵＧＣ ＧＴＧ）を合成し、Ｈ
ＰＬＣを用いて精製を行った。 Ｍａｓｓスペクトル：計算値 Ｃ６１Ｈ７４Ｎ２３Ｏ３６Ｐ５ 1859.3354 実測値 1859.4003
【００３７】前記した実施例２と同様の方法により、次
の反応式に示される化合物（９）〜化合物（１１）を製
造した。以下の説明においては、この反応式に示される
化合物番号を使用する。
の反応式に示される化合物（９）〜化合物（１１）を製
造した。以下の説明においては、この反応式に示される
化合物番号を使用する。
【００３８】
【化６】
【００３９】実施例３ 化合物（９）の製造 ＤＮＡ自動合成機に市販のアミダイト（７）を装着しフ
ォスフォロアミダイト法によりＤＮＡを合成した。固相
担体よりアンモニア処理を６５℃、４時間の条件で行う
ことでＤＮＡを切り出しかつ脱保護を行った。アンモニ
ア留去後、ＨＰＬＣにより精製を行い、目的のＤＮＡ
（５’−ＶＣＵＧＣＧＴＧ−３’）を得た。
ォスフォロアミダイト法によりＤＮＡを合成した。固相
担体よりアンモニア処理を６５℃、４時間の条件で行う
ことでＤＮＡを切り出しかつ脱保護を行った。アンモニ
ア留去後、ＨＰＬＣにより精製を行い、目的のＤＮＡ
（５’−ＶＣＵＧＣＧＴＧ−３’）を得た。
【００４０】実施例４ 化合物（１０）の製造 ＤＮＡ自動合成機に市販のアミダイト（７）を装着し、
緩和条件で脱保護可能なアミダイトを用いて、フォスフ
ォロアミダイト法によりＤＮＡを合成した。固相担体よ
りアンモニア処理を３７℃、１時間の条件で行うことで
ＤＮＡを切り出しかつ脱保護を行った。アンモニア留去
後、ＨＰＬＣにより精製を行い、目的のＤＮＡ（５’−
ＶＭＵＧＣＧＴＧ−３’）を得た。
緩和条件で脱保護可能なアミダイトを用いて、フォスフ
ォロアミダイト法によりＤＮＡを合成した。固相担体よ
りアンモニア処理を３７℃、１時間の条件で行うことで
ＤＮＡを切り出しかつ脱保護を行った。アンモニア留去
後、ＨＰＬＣにより精製を行い、目的のＤＮＡ（５’−
ＶＭＵＧＣＧＴＧ−３’）を得た。
【００４１】実施例５ 化合物（１１）の製造 ＤＮＡ自動合成機に市販のアミダイト（７）を装着し、
フォスフォロアミダイト法によりＤＮＡを合成した。固
相担体より２Ｎのトリメリレンジアミンのメタノール溶
液で密封条件下６５℃、４時間加熱することで、ＤＮＡ
を修飾、切り出しそして脱保護を行った。１Ｎ酢酸で中
和後、メタノール及び水を留去し、ＨＰＬＣにより精製
を行い、目的のＤＮＡ（５’−ＶＡＵＧＣＧＴＧ−
３’）を得た。
フォスフォロアミダイト法によりＤＮＡを合成した。固
相担体より２Ｎのトリメリレンジアミンのメタノール溶
液で密封条件下６５℃、４時間加熱することで、ＤＮＡ
を修飾、切り出しそして脱保護を行った。１Ｎ酢酸で中
和後、メタノール及び水を留去し、ＨＰＬＣにより精製
を行い、目的のＤＮＡ（５’−ＶＡＵＧＣＧＴＧ−
３’）を得た。
【００４２】実施例６ 枝分かれ構造の調製 ２０μＭの５’−ＴＧＴＧＣＡＡＡＡＡＡ−３’（ＯＤ
Ｎ １）及び、２０μＭの５’−ＶＣＵＧＣＧＴＧ−
３’（ＯＤＮ ３）を、２０μＭの鋳型ＤＮＡ５’−Ｃ
ＡＣＧＣＡＧＧＣＡＣＡ−３’（ＯＤＮ ２）の存在下
に、３６６ｎｍの光照射を０℃で１時間行い、目的の枝
分かれ構造を有するＤＮＡを９８％の収率で得た。ＨＰ
ＬＣによって単離した枝分かれＤＮＡを測定することで
同定を行った。 ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＡＳＳ： 計算値 5249.90 実測値 5250.12
Ｎ １）及び、２０μＭの５’−ＶＣＵＧＣＧＴＧ−
３’（ＯＤＮ ３）を、２０μＭの鋳型ＤＮＡ５’−Ｃ
ＡＣＧＣＡＧＧＣＡＣＡ−３’（ＯＤＮ ２）の存在下
に、３６６ｎｍの光照射を０℃で１時間行い、目的の枝
分かれ構造を有するＤＮＡを９８％の収率で得た。ＨＰ
ＬＣによって単離した枝分かれＤＮＡを測定することで
同定を行った。 ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＡＳＳ： 計算値 5249.90 実測値 5250.12
【００４３】実施例７ ＤＮＡ鎖内部のシトシンをウラ
シルに変換（ＨＰＬＣ） ２０μＭ ＯＤＮ−１、２０μＭ ＯＤＮ−２、２０μＭ
ＯＤＮ−３、５０ｍＭカコジル酸ナトリウム（ｐＨ
７．０）、１００ｍＭ ＮａＣｌを含む水溶液５０μＬ
を石英チューブに加え、氷上で３６６ｎｍの光照射を１
時間行った後、ＨＰＬＣで、新しく現れた連結体のピー
クを分離精製した（６−１４％ acetonitrile、６０mi
n、５０ｍＭ ギ酸アンモニウムバッファー、５Ｃ１８
ＭＳ column）。次に、この連結体８μＭ、５０ｍＭカ
コジル酸ナトリウム（ｐＨ７．０）を含む水溶液５０μ
Ｌを９０℃で２時間加熱し、新しく現れた、デアミネー
ション生成物を分離精製した（６−１４％ acetonitril
e、６０min、５０ｍＭ ギ酸アンモニウムバッファー、
５Ｃ１８−ＭＳ column）。このデアミネーションした
連結体７μＭ、５０ｍＭカコジル酸ナトリウム（ｐＨ
７．０）を含む水溶液２０μＬを石英チューブを用い
て、室温で３０２ｎｍの光照射を１時間行った後、ＨＰ
ＬＣでウラシルを含んだピークを分離精製した（６−１
４％ acetonitrile、６０min、５０ｍＭ ギ酸アンモニ
ウムバッファー）。単離したウラシルを含むＤＮＡ ７
μＭを５μＬとって、ヘビ毒ホスホジエステラーゼ（sn
ake venom phosphodiesterase）とアルカリホスファタ
ーゼ（alkaline phosphatase）をそれぞれ１μＬ（１un
it）加えて、３７℃で１時間加温し、ＨＰＬＣで分析し
た（３−２０％ アセトニトリル、２０分、５０ｍＭ ギ
酸アンモニウムバッファー、５Ｃ１８−ＭＳ colum
n）。
シルに変換（ＨＰＬＣ） ２０μＭ ＯＤＮ−１、２０μＭ ＯＤＮ−２、２０μＭ
ＯＤＮ−３、５０ｍＭカコジル酸ナトリウム（ｐＨ
７．０）、１００ｍＭ ＮａＣｌを含む水溶液５０μＬ
を石英チューブに加え、氷上で３６６ｎｍの光照射を１
時間行った後、ＨＰＬＣで、新しく現れた連結体のピー
クを分離精製した（６−１４％ acetonitrile、６０mi
n、５０ｍＭ ギ酸アンモニウムバッファー、５Ｃ１８
ＭＳ column）。次に、この連結体８μＭ、５０ｍＭカ
コジル酸ナトリウム（ｐＨ７．０）を含む水溶液５０μ
Ｌを９０℃で２時間加熱し、新しく現れた、デアミネー
ション生成物を分離精製した（６−１４％ acetonitril
e、６０min、５０ｍＭ ギ酸アンモニウムバッファー、
５Ｃ１８−ＭＳ column）。このデアミネーションした
連結体７μＭ、５０ｍＭカコジル酸ナトリウム（ｐＨ
７．０）を含む水溶液２０μＬを石英チューブを用い
て、室温で３０２ｎｍの光照射を１時間行った後、ＨＰ
ＬＣでウラシルを含んだピークを分離精製した（６−１
４％ acetonitrile、６０min、５０ｍＭ ギ酸アンモニ
ウムバッファー）。単離したウラシルを含むＤＮＡ ７
μＭを５μＬとって、ヘビ毒ホスホジエステラーゼ（sn
ake venom phosphodiesterase）とアルカリホスファタ
ーゼ（alkaline phosphatase）をそれぞれ１μＬ（１un
it）加えて、３７℃で１時間加温し、ＨＰＬＣで分析し
た（３−２０％ アセトニトリル、２０分、５０ｍＭ ギ
酸アンモニウムバッファー、５Ｃ１８−ＭＳ colum
n）。
【００４４】結果を図２に示す。図２の最上段は反応前
のチャートであり、上から２段目は波長３６６ｎｍの光
を１時間照射した後のチャートであり、上から３段目は
連結した１７量体を分離して９０℃で２時間加熱した後
のものであり、最下段は波長３０２ｎｍの光を１時間照
射し酵素分解した後のチャートである。
のチャートであり、上から２段目は波長３６６ｎｍの光
を１時間照射した後のチャートであり、上から３段目は
連結した１７量体を分離して９０℃で２時間加熱した後
のものであり、最下段は波長３０２ｎｍの光を１時間照
射し酵素分解した後のチャートである。
【００４５】実施例８ ＤＮＡ鎖内部のシトシンをウラ
シルに変換（ゲル電気泳動） １μＭ ＯＤＮ−１、７μＭ ＯＤＮ−２、７μＭ ＯＤ
Ｎ−３、５０ｍＭカコジル酸ナトリウム（ｐＨ７．
０）、１００ｍＭ ＮａＣｌを含む水溶液５０μＬを石
英チューブに加え、氷上で、３６６ｎｍの光照射を１時
間行った。次に、この反応液をエッペンドルフチューブ
に移し、９０℃で２時間加熱した後、再度、石英チュー
ブを用いて、室温で３０２ｎｍの光照射を１時間行っ
た。さらに、反応液にウラシルＤＮＡグリコシラーゼを
１μＬ（１unit）加えて、３７℃で１時間加温した後、
ピペリジンを５μＬ加えて９０℃で３０分加熱した。反
応溶液をスピードバックで留去し、ローディングバッフ
ァーを加えて、７Ｍ 尿素（urea）を含んだ１５％ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動によって分析した。泳動結
果をＸ線フィルムで視覚化するため、−８０℃で一晩保
存した。
シルに変換（ゲル電気泳動） １μＭ ＯＤＮ−１、７μＭ ＯＤＮ−２、７μＭ ＯＤ
Ｎ−３、５０ｍＭカコジル酸ナトリウム（ｐＨ７．
０）、１００ｍＭ ＮａＣｌを含む水溶液５０μＬを石
英チューブに加え、氷上で、３６６ｎｍの光照射を１時
間行った。次に、この反応液をエッペンドルフチューブ
に移し、９０℃で２時間加熱した後、再度、石英チュー
ブを用いて、室温で３０２ｎｍの光照射を１時間行っ
た。さらに、反応液にウラシルＤＮＡグリコシラーゼを
１μＬ（１unit）加えて、３７℃で１時間加温した後、
ピペリジンを５μＬ加えて９０℃で３０分加熱した。反
応溶液をスピードバックで留去し、ローディングバッフ
ァーを加えて、７Ｍ 尿素（urea）を含んだ１５％ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動によって分析した。泳動結
果をＸ線フィルムで視覚化するため、−８０℃で一晩保
存した。
【００４６】結果を図３に示す。図３中の各レーンは次
のとおりである。 レーン１：反応前 レーン２：３６６ｎｍの光照射を１時間行った。 レーン３：レーン２の後に９０度加熱を２時間行った。 レーン４：レーン３の後に３０２ｎｍの光照射を１時間
行った。 レーン５：レーン４の後にウラシルＤＮＡグリコシラー
ゼで処理（３７℃で１時間）して、ピペリジンで９０度
加熱を３０分間行った。 レーン６：レーン２の後に９０度加熱を行わずに、３０
２ｎｍの光照射を１時間行った。 レーン７：レーン６の後にウラシルＤＮＡグリコシラー
ゼで処理（３７℃で１時間）して、ピペリジンで９０度
加熱を３０分間行った。 レーン８：５'−３２Ｐ−ＴＧＴＧＵＡＡＡＡＡＡをウ
ラシルＤＮＡグリコシラー ゼで処理（３７℃
で１時間）して、ピペリジンで９０度加熱を３０分
間行った。 この結果、コントロールのレーン８と、光反応実験で得
られたレーン５のバンド（ウラシルでの切断）が一致し
た。レーン６、７のように９０度加熱を行わないと酵素
で切断されないので、加熱によって、シトシンがウラシ
ルに変換されていることがわかる。
のとおりである。 レーン１：反応前 レーン２：３６６ｎｍの光照射を１時間行った。 レーン３：レーン２の後に９０度加熱を２時間行った。 レーン４：レーン３の後に３０２ｎｍの光照射を１時間
行った。 レーン５：レーン４の後にウラシルＤＮＡグリコシラー
ゼで処理（３７℃で１時間）して、ピペリジンで９０度
加熱を３０分間行った。 レーン６：レーン２の後に９０度加熱を行わずに、３０
２ｎｍの光照射を１時間行った。 レーン７：レーン６の後にウラシルＤＮＡグリコシラー
ゼで処理（３７℃で１時間）して、ピペリジンで９０度
加熱を３０分間行った。 レーン８：５'−３２Ｐ−ＴＧＴＧＵＡＡＡＡＡＡをウ
ラシルＤＮＡグリコシラー ゼで処理（３７℃
で１時間）して、ピペリジンで９０度加熱を３０分
間行った。 この結果、コントロールのレーン８と、光反応実験で得
られたレーン５のバンド（ウラシルでの切断）が一致し
た。レーン６、７のように９０度加熱を行わないと酵素
で切断されないので、加熱によって、シトシンがウラシ
ルに変換されていることがわかる。
【００４７】実施例９ デアミネーションの時間変化の
実験 １μＭ ＯＤＮ−１、７μＭ ＯＤＮ−２、７μＭ ＯＤ
Ｎ−３、５０ｍＭカコジル酸ナトリウム（ｐＨ７．
０）、１００ｍＭ ＮａＣｌを含む水溶液５０μＬを石
英チューブに加え、氷上で、３６６ｎｍの光照射を１時
間行った。次に、この反応液をエッペンドルフチューブ
に移し、９０℃で１５分間隔で２時間まで加熱した後、
それぞれの時間の反応液を、石英チューブを用いて、室
温で３０２ｎｍの光照射を１時間行い、反応液にウラシ
ルＤＮＡグリコシラーゼを１μＬ（１unit）加えて、３
７℃で１時間加温し、ピペリジンを５μＬ加えて９０℃
で３０分加熱した。反応溶液をスピードバックで留去
し、ローディングバッファーを加えて、７Ｍ ureaを含
んだ１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分
析した。泳動結果をＸ線フィルムで視覚化するため、−
８０℃で一晩保存し、デンシトメーターを用いてバンド
を定量化した。結果を図４及び図５に示す。図４の各レ
ーンは次のとおりである。 レーン１：反応前 レーン２：３６６ｎｍの光照射を１時間行った。 レーン３：レーン２の後に９０度加熱を行わず、３０２
ｎｍ光照射１時間、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ処理
（３７℃で１時間）、ピペリジン処理（９０度加熱・３
０分）を行った。 レーン４：レーン２の後に９０度加熱を１５分行った。
それ以外はレーン３と同じ。 レーン５：レーン２の後に９０度加熱を３０分行った。
それ以外はレーン３と同じ。 レーン６：レーン２の後に９０℃加熱を４５分行った。
それ以外はレーン３と同じ。 レーン７：レーン２の後に９０度加熱を６０分行った。
それ以外はレーン３と同じ。 レーン８：レーン２の後に９０度加熱を７５分行った。
それ以外はレーン３と同じ。 レーン９：レーン２の後に９０度加熱を９０分行った。
それ以外はレーン３と同じ。 レーン１０：レーン２の後に９０度加熱を１０５分行っ
た。それ以外はレーン３と同じ。 レーン１１：レーン２の後に９０度加熱を１２０分行っ
た。それ以外はレーン３と同じ。 レーン１２：５'−３２Ｐ−ＴＧＴＧＵＡＡＡＡＡＡを
ウラシルＤＮＡグリコシラ ーゼで処理（３
７℃で１時間）して、ピペリジンで９０度加熱を３
０分間行った。
実験 １μＭ ＯＤＮ−１、７μＭ ＯＤＮ−２、７μＭ ＯＤ
Ｎ−３、５０ｍＭカコジル酸ナトリウム（ｐＨ７．
０）、１００ｍＭ ＮａＣｌを含む水溶液５０μＬを石
英チューブに加え、氷上で、３６６ｎｍの光照射を１時
間行った。次に、この反応液をエッペンドルフチューブ
に移し、９０℃で１５分間隔で２時間まで加熱した後、
それぞれの時間の反応液を、石英チューブを用いて、室
温で３０２ｎｍの光照射を１時間行い、反応液にウラシ
ルＤＮＡグリコシラーゼを１μＬ（１unit）加えて、３
７℃で１時間加温し、ピペリジンを５μＬ加えて９０℃
で３０分加熱した。反応溶液をスピードバックで留去
し、ローディングバッファーを加えて、７Ｍ ureaを含
んだ１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分
析した。泳動結果をＸ線フィルムで視覚化するため、−
８０℃で一晩保存し、デンシトメーターを用いてバンド
を定量化した。結果を図４及び図５に示す。図４の各レ
ーンは次のとおりである。 レーン１：反応前 レーン２：３６６ｎｍの光照射を１時間行った。 レーン３：レーン２の後に９０度加熱を行わず、３０２
ｎｍ光照射１時間、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ処理
（３７℃で１時間）、ピペリジン処理（９０度加熱・３
０分）を行った。 レーン４：レーン２の後に９０度加熱を１５分行った。
それ以外はレーン３と同じ。 レーン５：レーン２の後に９０度加熱を３０分行った。
それ以外はレーン３と同じ。 レーン６：レーン２の後に９０℃加熱を４５分行った。
それ以外はレーン３と同じ。 レーン７：レーン２の後に９０度加熱を６０分行った。
それ以外はレーン３と同じ。 レーン８：レーン２の後に９０度加熱を７５分行った。
それ以外はレーン３と同じ。 レーン９：レーン２の後に９０度加熱を９０分行った。
それ以外はレーン３と同じ。 レーン１０：レーン２の後に９０度加熱を１０５分行っ
た。それ以外はレーン３と同じ。 レーン１１：レーン２の後に９０度加熱を１２０分行っ
た。それ以外はレーン３と同じ。 レーン１２：５'−３２Ｐ−ＴＧＴＧＵＡＡＡＡＡＡを
ウラシルＤＮＡグリコシラ ーゼで処理（３
７℃で１時間）して、ピペリジンで９０度加熱を３
０分間行った。
【００４８】
【発明の効果】本発明は、光による可逆的な核酸類の連
結・解裂を利用した新規な点変異法を提供するものであ
り、本発明の方法は特定の位置の塩基を簡便な方法によ
り特異的に点変異させることができる。本発明の方法
は、酵素反応を使用する必要が無く、光を用いたユニー
クな構造を持つ核酸を合成するため、環境にもやさしい
方法である。また、本発明の方法によれば、光連結性ヌ
クレオシド含有ＤＮＡの光照射により、対象シトシンに
対するシクロブタン反応を行い枝分かれ核酸を形成さ
せ、加熱処理、及び化学反応処理を行うことでシトシン
の脱アミノ化を促進し、最終的に光解裂を行い、ＤＮ
Ａ、及びＲＮＡ上の任意のシトシンをウラシルへと誘導
することが可能になる。本発明の方法により得られたウ
ラシル体は、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ処理を行う
ことで任意の位置で特異的に切断することができる。こ
のような変換はＤＮＡのみならず、ｍＲＮＡ上のシトシ
ンをウラシルへ特異的に変換し、ｍＲＮＡの遺伝情報を
特異的に変更することができる。さらに、本発明の方法
は、フォトブランチング技術との組み合わせにより、
ｉ）光転写制御、ii）光翻訳制御、iii）光誘導型変異
蛋白の生産等への利用が期待される。このように本発明
の方法は、後処理の必要な化学活性化剤や使用条件に制
限がかかる酵素を全く用いずに、光をトリガーとして用
いるシトシンからウラシルへの点変異技術であり、環境
にやさしい２１世紀型のバイオテクノロジー技術であ
る。任意の位置のシトシンをウラシルへと点変異させる
技術としても有用である。
結・解裂を利用した新規な点変異法を提供するものであ
り、本発明の方法は特定の位置の塩基を簡便な方法によ
り特異的に点変異させることができる。本発明の方法
は、酵素反応を使用する必要が無く、光を用いたユニー
クな構造を持つ核酸を合成するため、環境にもやさしい
方法である。また、本発明の方法によれば、光連結性ヌ
クレオシド含有ＤＮＡの光照射により、対象シトシンに
対するシクロブタン反応を行い枝分かれ核酸を形成さ
せ、加熱処理、及び化学反応処理を行うことでシトシン
の脱アミノ化を促進し、最終的に光解裂を行い、ＤＮ
Ａ、及びＲＮＡ上の任意のシトシンをウラシルへと誘導
することが可能になる。本発明の方法により得られたウ
ラシル体は、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ処理を行う
ことで任意の位置で特異的に切断することができる。こ
のような変換はＤＮＡのみならず、ｍＲＮＡ上のシトシ
ンをウラシルへ特異的に変換し、ｍＲＮＡの遺伝情報を
特異的に変更することができる。さらに、本発明の方法
は、フォトブランチング技術との組み合わせにより、
ｉ）光転写制御、ii）光翻訳制御、iii）光誘導型変異
蛋白の生産等への利用が期待される。このように本発明
の方法は、後処理の必要な化学活性化剤や使用条件に制
限がかかる酵素を全く用いずに、光をトリガーとして用
いるシトシンからウラシルへの点変異技術であり、環境
にやさしい２１世紀型のバイオテクノロジー技術であ
る。任意の位置のシトシンをウラシルへと点変異させる
技術としても有用である。
【図１】図１は、本発明の方法によりシトシンをウラシ
ルに変換する方法を化学反応式により具体的に説明する
ものである。
ルに変換する方法を化学反応式により具体的に説明する
ものである。
【図２】図２は、本発明の方法によりＤＮＡ中のシトシ
ンをウラシルに変換したときの各ステップにおけるＨＰ
ＬＣのチャートを示したものである。図２の上から、反
応前のチャート、波長３６６ｎｍの光を１時間照射した
後のチャート、連結した１７量体を分離して９０℃で２
時間加熱した後のチャート、最下段は波長３０２ｎｍの
光を１時間照射し酵素分解した後のチャートである。
ンをウラシルに変換したときの各ステップにおけるＨＰ
ＬＣのチャートを示したものである。図２の上から、反
応前のチャート、波長３６６ｎｍの光を１時間照射した
後のチャート、連結した１７量体を分離して９０℃で２
時間加熱した後のチャート、最下段は波長３０２ｎｍの
光を１時間照射し酵素分解した後のチャートである。
【図３】図３は、本発明の方法によりＤＮＡ中のシトシ
ンをウラシルに変換したときの各ステップにおける電気
泳動の結果を示す、図面に代わる写真である。
ンをウラシルに変換したときの各ステップにおける電気
泳動の結果を示す、図面に代わる写真である。
【図４】図４は、本発明の方法によりＤＮＡ中のシトシ
ンをウラシルに変換する際の、デアミネーション反応を
種々の反応時間で行った場合の電気泳動の結果を示す、
図面に代わる写真である。レーン３は０分、レーン４か
らレーン１１はそれぞれ反応時間を１５分ずつ長くした
ものである。
ンをウラシルに変換する際の、デアミネーション反応を
種々の反応時間で行った場合の電気泳動の結果を示す、
図面に代わる写真である。レーン３は０分、レーン４か
らレーン１１はそれぞれ反応時間を１５分ずつ長くした
ものである。
【図５】図５は、本発明の方法によりＤＮＡ中のシトシ
ンをウラシルに変換する際の、デアミネーション反応に
おけるシトシン体の減少率（％）とウラシル体の生成率
（％）を時間（分）に対してプロットしたグラフであ
る。
ンをウラシルに変換する際の、デアミネーション反応に
おけるシトシン体の減少率（％）とウラシル体の生成率
（％）を時間（分）に対してプロットしたグラフであ
る。
Claims (14)
- 【請求項１】 変換したい塩基を有する核酸類を、光連
結性ヌクレオシドを含有するＤＮＡの存在下で、光照射
して変換したい塩基と光連結性ヌクレオシドとを結合さ
せ、変換したい塩基を化学的に変性させた後、光照射し
て変換したい塩基と光連結性ヌクレオシドとを解裂させ
ることからなる核酸類中の塩基が点変異した核酸類を製
造する方法。 - 【請求項２】 光連結性ヌクレオシドが、ＤＮＡの末端
に位置しているＤＮＡである請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 光連結性ヌクレオシドが、ビニル基を導
入したピリジミンを有する核酸を含有するものである請
求項１又は２に記載の方法。 - 【請求項４】 光連結性ヌクレオシドが、 【化１】 （式中、ＺはＯ又はＮＨを示し、Ｘ及びＹの少なくとも
一方は電子吸引性基を示し、Ｘ及びＹの残りの基は水素
原子を示す。）で表される基を有するヌクレオシドであ
る請求項１〜３のいずれかに記載の方法。 - 【請求項５】 電子吸引性基が、カルボキシル基、低級
アルコキシカルボニル基、置換アミド基又はシアノ基で
ある請求項４に記載の方法。 - 【請求項６】 ＺがＯで、Ｘが水素原子で、Ｙがカルボ
キシル基、低級アルコキシカルボニル基、置換アミド基
又はシアノ基である請求項４又は５に記載の方法。 - 【請求項７】 変換したい塩基が、シトシンである請求
項１〜６のいずれかに記載の方法。 - 【請求項８】 化学的に変性させる方法が、脱アミノ化
である請求項１〜７のいずれかに記載の方法。 - 【請求項９】 核酸類の一部を固定化させるためのテン
プレートを用いる請求項１〜８のいずれかに記載の方
法。 - 【請求項１０】 核酸類が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はＰＮ
Ａである請求項１〜９のいずれかに記載の方法。 - 【請求項１１】 核酸類中の特定の位置の塩基を、光連
結性ヌクレオシドを含有するＤＮＡの存在下で、光化学
反応を利用して酵素の不存在下で他の塩基に変換するこ
とからなる核酸類中の特定の位置の塩基が点変異した核
酸類を製造する方法。 - 【請求項１２】 光連結性ヌクレオシドが、ビニル基を
導入したピリジミンを有する核酸を含有するものである
請求項１２に記載の方法。 - 【請求項１３】 変換される塩基がシトシンである請求
項１１又は１２に記載の方法。 - 【請求項１４】 核酸類が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はＰＮ
Ａである請求項１１〜１３のいずれかに記載の方法。
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|---|---|---|---|---|
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| JP2012121899A (ja) * | 2007-11-19 | 2012-06-28 | Japan Advanced Institute Of Science & Technology Hokuriku | 光クロスリンク能を有する光応答性人工ヌクレオチド |
| JP2015195736A (ja) * | 2014-03-31 | 2015-11-09 | 国立大学法人北陸先端科学技術大学院大学 | 核酸中の塩基を変換する方法、及び核酸塩基変換剤 |
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2000
- 2000-12-15 JP JP2000382283A patent/JP3753938B2/ja not_active Expired - Fee Related
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