JP5425780B2 - 光応答性ヌクレオチド分子、及び該光応答性ヌクレオチド分子を使用して光応答性修飾核酸類を製造する方法 - Google Patents
光応答性ヌクレオチド分子、及び該光応答性ヌクレオチド分子を使用して光応答性修飾核酸類を製造する方法 Download PDFInfo
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Description
本発明は、光応答性ヌクレオチド分子、該光応答性ヌクレオチド分子を使用して光応答性修飾核酸類を製造する方法、及び該方法によって製造された光応答性修飾核酸類に関する。
遺伝子工学において重要な基本技術に、核酸の連結と切断がある。近年、核酸の連結と切断を光化学反応によって容易に行うことができる、光応答性の修飾核酸が提案されている（特許文献１，２，３）。この光応答性修飾核酸は、ＤＮＡ合成機等を使用して、光応答性の人工ヌクレオチド分子を核酸へ導入することによって得られるものである。このようにして得られた光応答性修飾核酸は、核酸の連結と切断を生かして、遺伝子工学において様々な応用が可能である。
既に提案されている光応答性の人工ヌクレオチド分子は、ＤＮＡ合成機を使用して、化学合成の手法によって核酸へ導入して光応答性修飾核酸を得るものであった。しかし、ＤＮＡ合成機を使用した場合には、修飾核酸は、その化学合成の工程中で、ヨウ素酸化、アンモニアによる脱保護など、生体高分子にとって厳しい条件にさらされて、鎖長が伸びるほど、収率は低いものとなり、その精製も困難となる。そのために、ＤＮＡ合成機を使用した場合には、長鎖の光応答性修飾核酸を得ることは実質的に不可能であった。
従って、本発明の目的は、ＤＮＡ合成機を使うことなく、光応答性修飾核酸類を製造する方法を提供することにある。また、本発明の目的は、ＤＮＡ合成機では実質的に合成不可能であった、長鎖の光応答性修飾核酸類を製造する方法を提供することにもある。さらに、本発明の目的は、上記製造方法に使用可能な、光応答性人工ヌクレオチド分子を提供することにもある。
また、ＤＮＡ合成機を使用して、通常の化学合成の手法、例えば固相法ホスホアミダイト法によってＤＮＡの合成を行う場合には、よく知られているように、３’末端を固定して５’末端に新たに塩基を付加してＤＮＡ鎖を伸長してゆく。３’末端に光応答性の修飾塩基（人工核酸塩基）を有する光応答性修飾核酸を得ようとする場合には、３’末端を直接に固定して合成を行うことができないために、いったんは光応答性の修飾塩基（人工核酸塩基）ではない塩基を３’末端に配置して、ＤＮＡ鎖の伸長を行った後に、これを化学的に切断して、光応答性の修飾塩基（人工核酸塩基）を、３’末端に露出させて、３’末端に光応答性の修飾塩基（人工核酸塩基）を有する光応答性修飾核酸を得る。この方法による合成の際には、 １） 1,2エタンジオール骨格を有する例えばＲＮＡモノマー誘導体が固定化されたＣＰＧ（ガラス支持担体）を使用して、 ２） ３'末端ではなく３'末端から２番目に修飾塩基を含むオリゴＤＮＡを合成して、 ３） 合成後、過ヨウ素酸処理(ＮａＩＯ４)することによってジオール骨格部分で解裂させて、 ４） アルカリ処理をして３'末端にリン酸がついた修飾塩基を含むオリゴＤＮＡに変換して、 ５） アルカリフォスファターゼを用いて３'末端リン酸基を除去して、 ６） ３'末端に修飾塩基を含むオリゴＤＮＡを精製する、という６段階もの工程が必要とされる。この工程は熟練者が行ってもなお複雑で時間を要し、過ヨウ素酸処理のような厳しい条件を含むために、収率も低い。さらに、このような工程で光応答性修飾核酸を得る場合には、３’末端に導入すべき光応答性修飾塩基（人工核酸塩基）以外の塩基配列が所望の配列となっている核酸を既に用意している場合であっても、３’末端に導入すべき光応答性修飾塩基（人工核酸塩基）から５’末端方向に塩基を付加して鎖を伸長することによって、塩基配列の全体を化学合成しなければならないという非効率があった。さらに、合成しようとする光応答性修飾核酸の鎖長が長くなるほどこの欠点は顕著となるために、３’末端に光応答性の修飾塩基（人工核酸塩基）を有する光応答性修飾核酸であって、長鎖の光応答性修飾核酸を得ることは実質的に不可能であった。
従って、本発明の目的は、ＤＮＡ合成機を使うことなく、簡便且つ効率よく、３’末端に光応答性の修飾塩基（人工核酸塩基）を有する光応答性修飾核酸類を製造する方法を提供することにもある。また、本発明の目的は、ＤＮＡ合成機を使うことなく、簡便且つ効率よく、３’末端に光応答性の修飾塩基（人工核酸塩基）を有する光応答性修飾核酸類を製造する方法であって、長鎖の光応答性修飾核酸類を製造できる方法を提供することにもある。さらに、本発明の目的は、このような製造方法に使用可能な、光応答性人工ヌクレオチド分子を提供することにもある。
本発明者等は、光応答性の修飾核酸の研究を鋭意進めてきた。その結果、光応答性のα−ジデオキシリボヌクレオチド分子を使用すれば上記目的を達成できること、すなわち、ＤＮＡ合成機を使うことなく、酵素反応によって所望の配列の核酸類の３’末端に光応答性の修飾塩基（人工核酸塩基）を付加して、長鎖の光応答性修飾核酸類を製造することができることを見出して、本発明に到達した。
従って、本発明は、次の［１］〜［２１］にある。
［１］
次の式Ｉ：
（式Ｉ）
（ただし、式Ｉ中、Ｂａｓｅは、次の式ＩＩ、式ＩＩＩ、式ＩＶ、又は式Ｖ：
［１］
次の式Ｉ：
（式Ｉ）
（ただし、式Ｉ中、Ｂａｓｅは、次の式ＩＩ、式ＩＩＩ、式ＩＶ、又は式Ｖ：
（式ＩＩ）
（ただし、式ＩＩ中、Ｘは、Ｏ、ＳまたはＮＨを示し、
Ｒ１は、水素原子、シアノ基、カルボキサミド基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、又は、置換若しくは無置換の芳香族化合物の一価基を示し、
Ｒ２は、水素原子、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ６のアルコキシ基、シアノ基、又はＣ１〜Ｃ６のアシル基を示す。）
Ｒ１は、水素原子、シアノ基、カルボキサミド基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、又は、置換若しくは無置換の芳香族化合物の一価基を示し、
Ｒ２は、水素原子、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ６のアルコキシ基、シアノ基、又はＣ１〜Ｃ６のアシル基を示す。）
（式ＩＩＩ）
（ただし、式ＩＩＩ中、Ｒ１は、水素原子、シアノ基、カルボキサミド基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、又は、置換若しくは無置換の芳香族化合物の一価基を示し、
Ｒ２は、水素原子、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ６のアルコキシ基、シアノ基、又はＣ１〜Ｃ６のアシル基を示す。）
Ｒ２は、水素原子、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ６のアルコキシ基、シアノ基、又はＣ１〜Ｃ６のアシル基を示す。）
（式ＩＶ）
（ただし、式ＩＶ中、Ｙは、Ｏ、ＳまたはＮＨを示し、
Ｚは、ＹがＯまたはＳであるときＮＨ２を示し、ＹがＮＨであるときは水素原子を示し、
Ｒ１は、水素原子、シアノ基、カルボキサミド基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、又は、置換若しくは無置換の芳香族化合物の一価基を示し、
Ｒ２は、水素原子、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ６のアルコキシ基、シアノ基、又はＣ１〜Ｃ６のアシル基を示す。）
Ｚは、ＹがＯまたはＳであるときＮＨ２を示し、ＹがＮＨであるときは水素原子を示し、
Ｒ１は、水素原子、シアノ基、カルボキサミド基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、又は、置換若しくは無置換の芳香族化合物の一価基を示し、
Ｒ２は、水素原子、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ６のアルコキシ基、シアノ基、又はＣ１〜Ｃ６のアシル基を示す。）
式（Ｖ）
（ただし、式Ｖ中、Ｒ１は、水素原子、シアノ基、カルボキサミド基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、又は、置換若しくは無置換の芳香族化合物の一価基を示し、
Ｒ２は、水素原子、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ６のアルコキシ基、シアノ基、又はＣ１〜Ｃ６のアシル基を示す。）
で表される修飾核酸塩基の基を表す。）
で表される、光応答性α−ジデオキシリボヌクレオシド。
Ｒ２は、水素原子、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ６のアルコキシ基、シアノ基、又はＣ１〜Ｃ６のアシル基を示す。）
で表される修飾核酸塩基の基を表す。）
で表される、光応答性α−ジデオキシリボヌクレオシド。
［２］
式Ｉ中のＢａｓｅが、式ＩＩで表される修飾核酸塩基である、［１］に記載の光応答性α−ジデオキシリボヌクレオシド。
［３］
式Ｉ中のＢａｓｅが、式ＩＩＩで表される修飾核酸塩基である、［１］に記載の光応答性α−ジデオキシリボヌクレオシド。
［４］
式Ｉ中のＢａｓｅが、式ＩＶで表される修飾核酸塩基である、［１］に記載の光応答性α−ジデオキシリボヌクレオシド。
［５］
式Ｉ中のＢａｓｅが、式Ｖで表される修飾核酸塩基である、［１］に記載の光応答性α−ジデオキシリボヌクレオシド。
式Ｉ中のＢａｓｅが、式ＩＩで表される修飾核酸塩基である、［１］に記載の光応答性α−ジデオキシリボヌクレオシド。
［３］
式Ｉ中のＢａｓｅが、式ＩＩＩで表される修飾核酸塩基である、［１］に記載の光応答性α−ジデオキシリボヌクレオシド。
［４］
式Ｉ中のＢａｓｅが、式ＩＶで表される修飾核酸塩基である、［１］に記載の光応答性α−ジデオキシリボヌクレオシド。
［５］
式Ｉ中のＢａｓｅが、式Ｖで表される修飾核酸塩基である、［１］に記載の光応答性α−ジデオキシリボヌクレオシド。
［６］
ヌクレオシド部分として、［１］〜［５］の何れかに記載の光応答性α−ジデオキシリボヌクレオシドを有する、光応答性α−ジデオキシリボヌクレオチド。
［７］
α−ジデオキシリボヌクレオチド三リン酸である、［６］に記載の光応答性α−ジデオキシリボヌクレオチド。
［８］
［６］又は［７］に記載の光応答性α−ジデオキシリボヌクレオチドが導入されてなる、光応答性修飾核酸類（ただし、核酸類には、核酸、及びペプチド核酸が含まれる。）。
［９］
２０塩基以上の長さである、［８］に記載の光応答性修飾核酸類。
ヌクレオシド部分として、［１］〜［５］の何れかに記載の光応答性α−ジデオキシリボヌクレオシドを有する、光応答性α−ジデオキシリボヌクレオチド。
［７］
α−ジデオキシリボヌクレオチド三リン酸である、［６］に記載の光応答性α−ジデオキシリボヌクレオチド。
［８］
［６］又は［７］に記載の光応答性α−ジデオキシリボヌクレオチドが導入されてなる、光応答性修飾核酸類（ただし、核酸類には、核酸、及びペプチド核酸が含まれる。）。
［９］
２０塩基以上の長さである、［８］に記載の光応答性修飾核酸類。
［１０］
［６］又は［７］に記載の光応答性α−ジデオキシリボヌクレオチドを、核酸類に導入して、光応答性修飾核酸類を製造する方法。
［１１］
［６］又は［７］に記載の光応答性α−ジデオキシリボヌクレオチドを核酸類に導入して、核酸類に光応答性を付与する方法。
［１２］
酵素の反応によって、光応答性α−ジデオキシリボヌクレオチドを核酸類に導入する、［１０］又は［１１］に記載の方法。
［１３］
酵素が、ターミナル デオキシヌクレオチジル トランスフェラーゼ、Ｔ４ ＲＮＡ リガーゼ、クローンド クレノー フラグメント、又は、Ｔ４ ＤＮＡ ポリメラーゼである、［１２］に記載の方法。
［１４］
核酸類が、２０塩基以上の長さの核酸類である、［１０］〜［１３］の何れかに記載の方法。
［６］又は［７］に記載の光応答性α−ジデオキシリボヌクレオチドを、核酸類に導入して、光応答性修飾核酸類を製造する方法。
［１１］
［６］又は［７］に記載の光応答性α−ジデオキシリボヌクレオチドを核酸類に導入して、核酸類に光応答性を付与する方法。
［１２］
酵素の反応によって、光応答性α−ジデオキシリボヌクレオチドを核酸類に導入する、［１０］又は［１１］に記載の方法。
［１３］
酵素が、ターミナル デオキシヌクレオチジル トランスフェラーゼ、Ｔ４ ＲＮＡ リガーゼ、クローンド クレノー フラグメント、又は、Ｔ４ ＤＮＡ ポリメラーゼである、［１２］に記載の方法。
［１４］
核酸類が、２０塩基以上の長さの核酸類である、［１０］〜［１３］の何れかに記載の方法。
［１５］
［６］又は［７］に記載の光応答性α−ジデオキシリボヌクレオチドからなる、核酸類用光応答性付与剤。
［１６］
［６］又は［７］に記載の光応答性α−ジデオキシリボヌクレオチドの、核酸類に光応答性を付与するための使用。
［１７］
［１］〜［５］の何れかに記載の光応答性α−ジデオキシリボヌクレオシドからなる、光連結剤。
［１８］
［６］又は［７］に記載の光応答性α−ジデオキシリボヌクレオチドからなる、光連結剤。
［１９］
［８］又は［９］に記載の光応答性修飾核酸類からなる、光連結剤。
［２０］
２０塩基以上の長さである、［１９］に記載の光連結剤。
［２１］
［８］又は［９］に記載の光応答性修飾核酸類を使用して、光連結を行う方法。
［６］又は［７］に記載の光応答性α−ジデオキシリボヌクレオチドからなる、核酸類用光応答性付与剤。
［１６］
［６］又は［７］に記載の光応答性α−ジデオキシリボヌクレオチドの、核酸類に光応答性を付与するための使用。
［１７］
［１］〜［５］の何れかに記載の光応答性α−ジデオキシリボヌクレオシドからなる、光連結剤。
［１８］
［６］又は［７］に記載の光応答性α−ジデオキシリボヌクレオチドからなる、光連結剤。
［１９］
［８］又は［９］に記載の光応答性修飾核酸類からなる、光連結剤。
［２０］
２０塩基以上の長さである、［１９］に記載の光連結剤。
［２１］
［８］又は［９］に記載の光応答性修飾核酸類を使用して、光連結を行う方法。
本発明によれば、ＤＮＡ合成機を使うことなく、酵素反応を利用して、光応答性修飾核酸類を製造することができる。これによって、ＤＮＡ合成機では実質的に合成不可能であったほどの長鎖の光応答性修飾核酸類を、得ることができる。
さらに、本発明によれば、簡便且つ効率よく、３’末端に光応答性の修飾塩基（人工核酸塩基）を有する光応答性修飾核酸類を製造することができる。同時に、長鎖の光応答性修飾核酸類とすることができる。
さらに、本発明によれば、このように従来不可能であったほどの長鎖の光応答性修飾核酸類を得ることができるために、このように光応答性（光連結性）が付与された長鎖の修飾核酸類を使用して、光連結を行うことによって、従来のリガーゼ等の酵素だけでは合成が不可能であった修飾生体高分子を合成することができる。
さらに、本発明によれば、所望の配列の長鎖の核酸類を予め用意していれば、この核酸類の３’末端へ光応答性修飾塩基（人工核酸塩基）を簡単且つ効率よく導入（付加）して、光応答性修飾核酸類を製造することができるので、その都度、塩基配列の全体を化学合成する必要がない。従って、ＤＮＡ合成機や有機化学合成の設備及び有機化学合成の熟練者を必要とすることなく、光応答性修飾核酸類を、準備することができる。すなわち、本発明によれば、光応答性修飾核酸類の利用技術を、万全の設備と研究者を擁する施設にとどまらず、より広範囲の検査機関、医療機関などで、検出、検査、診断などのために、広く利用可能な技術とすることができる。
以下に実施の形態を挙げて、本発明を詳細に説明する。本発明は、以下の実施の形態に限定されるものではない。特許文献１（ＷＯ ２００７／０５８３２６ Ａ１）、特許文献２（ＷＯ ２００１／６６５５６ Ａ１）、及び特許文献３（ＷＯ ２００１／１６１５１ Ａ１）の内容は、本明細書の一部として取り込む。
本発明は、次の式Ｉ：
（式Ｉ）
（ただし、式Ｉ中、Ｂａｓｅは、次の式ＩＩ、式ＩＩＩ、式ＩＶ、又は式Ｖ：
（式ＩＩ）
（式Ｉ）
（ただし、式Ｉ中、Ｂａｓｅは、次の式ＩＩ、式ＩＩＩ、式ＩＶ、又は式Ｖ：
（式ＩＩ）
Ｒ１は、水素原子、シアノ基、カルボキサミド基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、又は、置換若しくは無置換の芳香族化合物の一価基を示し、
Ｒ２は、水素原子、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ６のアルコキシ基、シアノ基、又はＣ１〜Ｃ６のアシル基を示す。）
（式ＩＩＩ）
Ｒ２は、水素原子、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ６のアルコキシ基、シアノ基、又はＣ１〜Ｃ６のアシル基を示す。）
（式ＩＶ）
Ｚは、ＹがＯまたはＳであるときＮＨ２を示し、ＹがＮＨであるときは水素原子を示し、
Ｒ１は、水素原子、シアノ基、カルボキサミド基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、又は、置換若しくは無置換の芳香族化合物の一価基を示し、
Ｒ２は、水素原子、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ６のアルコキシ基、シアノ基、又はＣ１〜Ｃ６のアシル基を示す。）
式（Ｖ）
Ｒ２は、水素原子、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ６のアルコキシ基、シアノ基、又はＣ１〜Ｃ６のアシル基を示す。）
で表される修飾核酸塩基の基を表す。）
で表される、光応答性α−ジデオキシリボヌクレオシドにある。
上記α−ジデオキシリボヌクレオシドは、式Ｉで表されているように、リボース部分がジデオキシ化されていると同時に、Ｂａｓｅと表される人工核酸塩基部分がリボース部分とα結合している構造（リボースのα体の位置の水酸基と置換した構造）を有している。
このα−ジデオキシリボヌクレオシドは、Ｂａｓｅで表される人工核酸塩基（修飾核酸塩基）部分によって光応答性（光連結性）を有すると同時に、リン酸基が結合したα−ジデオキシリボヌクレオチドとなることによって、酵素の反応を使用して、核酸類に導入可能なものとなっている。
式Ｉ中のＢａｓｅは、次の式ＩＩ、式ＩＩＩ、式ＩＶ、又は式Ｖで表される修飾核酸塩基（人工核酸塩基）の基を表す。好適な実施の一の態様において、式ＩＩ中のＸはＯを示し、式ＩＶ中のＹはＯを示し且つＺはＮＨ２を示す。式中のＲ１は、水素原子、シアノ基、カルボキサミド基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、又は、置換若しくは無置換の芳香族化合物の一価基を示し、Ｒ２は、水素原子、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ６のアルコキシ基、シアノ基、又はＣ１〜Ｃ６のアシル基を示す。
Ｒ１は、水素原子、シアノ基、カルボキサミド基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、又は、置換若しくは無置換の芳香族化合物の一価基とすることができ、好ましくは水素原子、シアノ基、カルボキサミド基、カルボキシル基、Ｃ２〜Ｃ６のアルコキシカルボニル基とすることができる。アルコキシカルボニル基としては、一般にＣ２〜Ｃ６、好ましくはＣ２〜Ｃ４のアルコキシカルボニル基を使用することができ、具体的にはメトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、プロポキシカルボニル基、ブトキシカルボニル基を例示することができ、特にメトキシカルボニル基及びエトキシカルボニル基が好ましい。置換若しくは無置換の芳香族化合物の一価基は、置換若しくは無置換の複素環式化合物の一価基であってもよい。好適な実施の一の態様において、Ｒ１として、シアノ基、カルボキシル基、カルボキサミド基、又はメトキシカルボニル基を、使用することができる。
Ｒ２は、水素原子、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ６のアルコキシ基、シアノ基、又はＣ１〜Ｃ６のアシル基とすることができ、好ましくは水素原子、Ｃ１〜Ｃ３のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ３のアルコキシ基、シアノ基、又はＣ１〜Ｃ３のアシル基とすることができる。
好適な実施の態様において、置換若しくは無置換の芳香族化合物の一価基は、一般に１〜１０個、好ましくは１〜８個、さらに好ましくは１〜６個、さらに好ましくは１〜４個、特に好ましくは１〜３個の範囲にある環を含んでおり、これらは、複素環式化合物の一価基であってもよい。好適な実施の態様において、置換若しくは無置換の芳香族化合物の一価基は、一般には４〜８員環、好ましくは４〜７員環、さらに好ましくは４〜６員環、さらに好ましくは５〜６員環から形成されており、これらは、複素環式化合物の一価基であってもよい。好適な実施の態様において、置換若しくは無置換の芳香族化合物の一価基は、５〜６員環を、１〜３個含み、１個以上の環が複素環である化合物の一価基が使用される。
本発明は、上記α−ジデオキシリボヌクレオシドを含んでなる光応答性α−ジデオキシリボヌクレオチドにもあり、α−ジデオキシリボヌクレオチド三リン酸の態様で好適に使用することができる。
好ましい実施の態様において、次の式ＶＩ、式ＶＩＩ、式ＶＩＩＩ、及び式ＩＸ：
式（ＶＩ） 式（ＶＩＩ）
式（ＶＩＩＩ） 式（ＩＸ）
式（ＶＩ） 式（ＶＩＩ）
式（ＶＩＩＩ） 式（ＩＸ）
式ＶＩ、式ＶＩＩ、式ＶＩＩＩ、及び式ＩＸの中のＲで表される基としては、−ＣＮ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯＣＨ３、又は−ＣＯＮＨ２を好適に使用することができるが、上述した式ＩＩ、式ＩＩＩ、式ＩＶ、又は式Ｖの中のＲ１で表される基として例示した基を使用することもできる。また、式ＶＩ、式ＶＩＩ、式ＶＩＩＩ、及び式ＩＸの中で、Ｒで表される基が結合する炭素原子と同じ炭素原子に結合している水素原子に代えて、上述した式ＩＩ、式ＩＩＩ、式ＩＶ、又は式Ｖの中のＲ２で表される基として例示した基を使用することもできる。
核酸類には、核酸、及びペプチド核酸が含まれる。核酸には、ＲＮＡ及びＤＮＡが含まれる。好ましい核酸類として、ＤＮＡを挙げることができる。
本発明のα−ジデオキシリボヌクレオチドは、酵素の反応を利用して核酸類へ導入することができるために、従来のＤＮＡ合成機では不可能であったほどの長鎖の核酸類へと導入して、長鎖の光応答性（光連結性）の修飾核酸類（人工核酸類）を製造することができる。ここでいう長鎖とは、従来のＤＮＡ合成機では合成困難なほどに大きな塩基長であって、酵素によれば容易に導入可能な程度の大きさの塩基長の鎖をいう。好適に使用可能な核酸類の鎖長として、好ましくは１０塩基（１０ｍｅｒ）以上、さらに好ましくは２０塩基（２０ｍｅｒ）以上、さらに好ましくは３０塩基（３０ｍｅｒ）以上、さらに好ましくは４０塩基（４０ｍｅｒ）以上、さらに好ましくは５０塩基（５０ｍｅｒ）以上、さらに好ましくは６０塩基（６０ｍｅｒ）以上、さらに好ましくは７０塩基（７０ｍｅｒ）以上、さらに好ましくは８０塩基（８０ｍｅｒ）以上、さらに好ましくは９０塩基（９０ｍｅｒ）以上、さらに好ましくは１００塩基（１００ｍｅｒ）以上、さらに好ましくは１１０塩基（１１０ｍｅｒ）以上、さらに好ましくは１２０塩基（１２０ｍｅｒ）以上、さらに好ましくは１３０塩基（１３０ｍｅｒ）以上、さらに好ましくは１４０塩基（１４０ｍｅｒ）以上を挙げることができ、特に好ましくは１００塩基（１００ｍｅｒ）以上、さらに好ましくは１１０塩基（１１０ｍｅｒ）以上、さらに好ましくは１２０塩基（１２０ｍｅｒ）以上、さらに好ましくは１３０塩基（１３０ｍｅｒ）以上、さらに好ましくは１４０塩基（１４０ｍｅｒ）以上を挙げることができる。ＤＮＡ合成機による合成とは異なり、酵素による処理であるので、好適に処理可能な核酸類の鎖長の上限には、特に制限はない。しかし、ハイブリッドによって所望の塩基配列の核酸を検出するための試薬として使用する場合などには、一般に、５０００塩基（５０００ｍｅｒ）以下、３０００塩基（３０００ｍｅｒ）以下、１０００塩基（１０００ｍｅｒ）以下、あるいは５００塩基（５００ｍｅｒ）以下の鎖長で使用することができる。
光応答性修飾核酸類の製造に使用可能な酵素としては、本発明に係る光応答性α−ジデオキシリボヌクレオチドを核酸類に導入可能な酵素であれば、使用することができる。このような酵素として、核酸類の３’末端にヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドを付加する酵素を挙げることができ、例えば、ＴｄＴ（ターミナル デオキシヌクレオチジル トランスフェラーゼ）、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ、クローンド クレノー フラグメント、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼを挙げることができる。本発明に係る光応答性α−ジデオキシリボヌクレオチドを長鎖の核酸類に導入するために、ＴｄＴ（ターミナル デオキシヌクレオチジル トランスフェラーゼ）は、特に好適に使用可能である。ＴｄＴ（Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）は、２本鎖および１本鎖ＤＮＡの３’−ＯＨ末端へ鋳型に依存せずに１分子のジデオキシリボヌクレオチドを付加する反応を触媒することができる。Ｔ４ ＲＮＡリガーゼは、５’−Ｐ末端のオリゴヌクレオチドと３’−ＯＨ末端のオリゴヌクレオチドを結合させる酵素で補酵素としてＡＴＰを要する。Ｔ４ ＲＮＡリガーゼは、１本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡの３’−ＯＨ末端の標識に好適に使用できる。クローンド クレノー フラグメント（Ｃｌｏｎｅｄ Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔ）は、鋳型、プライマー存在下でｄＮＴＰを基質とし、鋳型に相補的なＤＮＡを５’→３’方向に合成する。Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼは、鋳型、プライマー存在下でｄＮＴＰを基質とし、鋳型に相補的なＤＮＡを５’→３’方向に合成する。
本発明に係る光応答性α−ジデオキシリボヌクレオチドは、核酸類（好ましい実施の態様においては長鎖の核酸類）へと、上記酵素を使用して、各酵素の公知の反応条件を使用して酵素反応させて、導入することができる。好適な実施の一態様において、酵素としてＴｄＴを使用することができる。酵素は、添加量の全量を１回で添加することができ、２回又はそれ以上の回数に分けて添加することもできる。
本発明において、光連結（光ライゲーション）とは、光照射を行って、光反応を生じさせて、核酸類等を光反応によって連結することである。このような光連結反応を生じる能力を光連結性又は光連結能と呼び、あるいは光応答性と呼ぶ。本発明において、光反応によって生じた連結（結合）は可逆的である。光反応によって生じた連結（結合）に対して適切な光照射を行うことによって、その連結（結合）を開裂（切断）することができる。すなわち、本発明における光連結性、光連結能、光応答性は、可逆的光連結性、可逆的光連結能、可逆的光応答性である。本発明の光連結剤は、可逆的光連結剤である。本発明の光応答性付与剤は、可逆的光応答性付与剤である。
光連結のための光照射に使用される光としては、一般に３３０〜３８０ｎｍの範囲、好ましくは３５０〜３８０ｎｍの範囲、さらに好ましくは３５０〜３７０ｎｍの範囲、さらに好ましくは３６０〜３７０ｎｍの範囲、さらに好ましくは３６６ｎｍの波長を含む光が好ましく、特に好ましくは、３６６ｎｍの単波長のレーザー光である。好適な実施の態様において、光照射の照射時間は、１秒以上、１０秒以上、３０秒以上、１分間以上、５分間以上、１０分間以上、又は１５分間以上の時間とすることができ、６０分間以下、４５分間以下、又は３０分間以下の時間とすることができる。好適な実施の一態様において、光照射の照射時間は、１分間〜６０分間、好ましくは１分間〜４５分間、さらに好ましくは５分間〜４５分間、さらに好ましくは５分間〜３０分間、さらに好ましくは１０分間〜３０分間、さらに好ましくは１５分間〜３０分間の時間とすることができる。照射時間は操作上の観点からは短時間であるほうが好ましく、光反応の完全な進行の観点からは長時間であるほうが好ましい。
好適な実施の一態様において、光連結は、鋳型核酸類の存在下で行われる。本発明に係る光応答性α−ジデオキシリボヌクレオチドが導入された核酸類（光応答性修飾核酸類）は、光応答性α−ジデオキシリボヌクレオチドのＢａｓｅで表される人工核酸塩基（修飾核酸塩基）部分を介して、連結相手となる核酸類（被連結核酸類）の末端とタンデム（直列）に連結することができる。好適な実施の態様において、光応答性修飾核酸類の３’末端の位置に、Ｂａｓｅで表される人工核酸塩基を含む光応答性α−ジデオキシリボヌクレオチドが導入されており、これが、被連結核酸類の５’末端の位置にある核酸塩基と光連結される。光連結反応に先立って、光応答性α−ジデオキシリボヌクレオチドのＢａｓｅで表される人工核酸塩基（修飾核酸塩基）部分と、連結相手となる核酸類（被連結核酸類）の末端の核酸塩基部分とが、連結可能に適切に配置されるように、連結部分付近の光応答性修飾核酸類の塩基配列、及び連結部分付近の被連結核酸類の塩基配列に対して、相補的である塩基配列を有する鋳型核酸類を使用することができる。相補的である塩基配列を有する鋳型核酸類をハイブリダイズ（ハイブリッド形成）することによって、光応答性α−ジデオキシリボヌクレオチドのＢａｓｅで表される人工核酸塩基（修飾核酸塩基）部分と、連結相手となる核酸類（被連結核酸類）の末端の核酸塩基部分とを、連結可能に適切に配置することができる。好適な実施の態様において、鋳型核酸類は、光応答性修飾核酸類に含まれる光応答性α−ジデオキシリボヌクレオチドのＢａｓｅで表される人工核酸塩基に対して、その人工核酸塩基の相補的な塩基が配置される位置の塩基として、Ｂａｓｅが式ＩＩで表される修飾核酸塩基の基である場合にはＡが、Ｂａｓｅが式ＩＩＩで表される修飾核酸塩基の基である場合にはＧが、Ｂａｓｅが式ＩＶで表される修飾核酸塩基の基である場合にはＣが、Ｂａｓｅが式Ｖで表される修飾核酸塩基の基である場合にはＴ又はＵが、それぞれ配置されていることが好ましい。好適な実施の一態様において、本発明による光連結は、光応答性修飾核酸類、被連結核酸類、及び鋳型核酸類とのハイブリッド形成（ハイブリダイズ）を行い、形成されたハイブリッドに対して光照射を行って光連結させることによって行うことができる。
使用される鋳型核酸類の鎖長は、光応答性修飾核酸類及び被連結核酸類の連結後の全長を含む鎖長とすることもできるが、連結部分付近の配列を含んだ適切な鎖長とすることもできる。好適に使用可能な鋳型核酸類の鎖長として、例えば、２０塩基（２０ｍｅｒ）以上、好ましくは２２塩基（２２ｍｅｒ）以上、さらに好ましくは２４塩基（２４ｍｅｒ）以上、さらに好ましくは２６塩基（２６ｍｅｒ）以上、さらに好ましくは２８塩基（２８ｍｅｒ）以上、さらに好ましくは３０塩基（３０ｍｅｒ）以上、さらに好ましくは３２塩基（３２ｍｅｒ）以上、さらに好ましくは３３塩基（３３ｍｅｒ）以上の鎖長を挙げることができる。好適に使用可能な鋳型核酸類の鎖長に特に上限はないが、一般に、５００塩基（５００ｍｅｒ）以下、３００塩基（３００ｍｅｒ）以下、１００塩基（１００ｍｅｒ）以下、あるいは５０塩基（５０ｍｅｒ）以下の鎖長で使用することができる。鋳型核酸類の鎖長は、短いほど鋳型核酸類の調製が容易な点で有利であり、長いほどハイブリッド形成の特異性が高い点で有利である。
光応答性修飾核酸類、被連結核酸類、及び鋳型核酸類とのハイブリッド形成（ハイブリダイズ）は、通常の温度、ｐＨ、塩濃度、緩衝液等の条件下で行うことができるが、光連結反応を行う溶液と同一の溶液で行うことが好ましい。ハイブリッド形成は、緩衝作用のある塩を含む反応溶液の中で行われることが好ましい。反応溶液のｐＨが６．５〜８．５の範囲、特にｐＨ６．７〜７．７の範囲にあることが好ましい。緩衝作用のある塩の濃度が５〜２５０ｍＭの範囲にあることが好ましく、特に１０〜１００ｍＭの範囲に有ることが好ましい。緩衝作用のある塩としては、カコジル酸塩、リン酸塩、トリス塩をあげることができるが、カコジル酸塩であることが好ましい。アルカリ金属及び／又はアルカリ土類金属の塩を含むことが好ましく、アルカリ金属及び／又はアルカリ土類金属の塩として、例えば塩化ナトリウム及び／又は塩化マグネシウムを含むことが好ましい。
以下に実施例を挙げて、本発明を詳細に説明する。本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
［1. １’-α-２’，３’-ジデオキシ-５-シアノビニルウリジン-５’-トリリン酸の合成］
次のScheme 1に従い合成を進めた。
次のScheme 1に従い合成を進めた。
［1’-α，β- 2’-deoxy-3’, 5’-di-O-p-toluoyl-uridine (1)］
Urasil (2.22 g, 20 mmol)を脱水トルエン(250 ml)に溶解し、acetamide (118 mg, 2.0 mmol)と硫酸アンモニウム(264 mg, 2.0 mmol)とHMDS(250 ml, 1.19 mmol)を加え、窒素雰囲気下、130℃で３時間撹拌した。溶媒を減圧留去し、真空ポンプで３時間乾燥させた。残渣に脱水アセトニトリルを加え、Sugar-Cl(9.5 g, 22 mmol)とヨウ化銅(4.19 g, 22.1 mmol)を加えて窒素雰囲気下、室温で一晩撹拌した。反応液をセライト濾過し、溶媒を減圧留去した。残渣にCHCl3／MeOHを加えて完全に溶解させた後、シリカゲルを加えて再度、溶媒を除去した。まぶしシリカゲルカラムクロマトグラフィー(Hex : AcOEt = 2 : 1)で精製し、白色固体として1 (7.02 g, 76%)を得た。
1: 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ7.89-7.94 (m,4H, α-3’O Tol), 7.89-7.94 (m,4H, β-3’O Tol), 7.88 (d, 1H, J = 8.25 Hz, β-H6), 7.77 (d, 1H, J = 8.25 Hz, α-H6), 7.70 (d, 1H, J = 8.25 Hz, α-H5), 7.51 (d, 1H, J = 8.25 Hz, β-H5), 7.21-7.27 (m, 4H, α-5’O Tol), 7.21-7.27 (m, 4H, β-5’O Tol), 6.38 (dd, 1H, J = 8.49, 5.76 Hz, β-H1’), 6.29 (d, 1H, J = 5.49 Hz, α-H1’), 5.68-5.72 (m, 2H, β-H5’), 5.58-5.60 (m, 2H, α-H2’), 4.85(t, 1H, J=4.11 Hz, α-H3’), 4.67-4.70(1H, m, β-H3’), 4.52-4.54 (m, 1H, α-H4’), 4.52-4.54 (m, 1H, β-H4’), 2.89-2.98 (m, 1H, α-H2’), 2.70-2.76 (m, 1H, β-H2’), 2.52 (d, 1H, J = 14.8 Hz, α-H2’), 2.42(s, 6H, α-(CH3)2), 2.40 (s, 6H, β-(CH3)2), 2.23-2.33 (m, 1H, β-H2’).
Urasil (2.22 g, 20 mmol)を脱水トルエン(250 ml)に溶解し、acetamide (118 mg, 2.0 mmol)と硫酸アンモニウム(264 mg, 2.0 mmol)とHMDS(250 ml, 1.19 mmol)を加え、窒素雰囲気下、130℃で３時間撹拌した。溶媒を減圧留去し、真空ポンプで３時間乾燥させた。残渣に脱水アセトニトリルを加え、Sugar-Cl(9.5 g, 22 mmol)とヨウ化銅(4.19 g, 22.1 mmol)を加えて窒素雰囲気下、室温で一晩撹拌した。反応液をセライト濾過し、溶媒を減圧留去した。残渣にCHCl3／MeOHを加えて完全に溶解させた後、シリカゲルを加えて再度、溶媒を除去した。まぶしシリカゲルカラムクロマトグラフィー(Hex : AcOEt = 2 : 1)で精製し、白色固体として1 (7.02 g, 76%)を得た。
1: 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ7.89-7.94 (m,4H, α-3’O Tol), 7.89-7.94 (m,4H, β-3’O Tol), 7.88 (d, 1H, J = 8.25 Hz, β-H6), 7.77 (d, 1H, J = 8.25 Hz, α-H6), 7.70 (d, 1H, J = 8.25 Hz, α-H5), 7.51 (d, 1H, J = 8.25 Hz, β-H5), 7.21-7.27 (m, 4H, α-5’O Tol), 7.21-7.27 (m, 4H, β-5’O Tol), 6.38 (dd, 1H, J = 8.49, 5.76 Hz, β-H1’), 6.29 (d, 1H, J = 5.49 Hz, α-H1’), 5.68-5.72 (m, 2H, β-H5’), 5.58-5.60 (m, 2H, α-H2’), 4.85(t, 1H, J=4.11 Hz, α-H3’), 4.67-4.70(1H, m, β-H3’), 4.52-4.54 (m, 1H, α-H4’), 4.52-4.54 (m, 1H, β-H4’), 2.89-2.98 (m, 1H, α-H2’), 2.70-2.76 (m, 1H, β-H2’), 2.52 (d, 1H, J = 14.8 Hz, α-H2’), 2.42(s, 6H, α-(CH3)2), 2.40 (s, 6H, β-(CH3)2), 2.23-2.33 (m, 1H, β-H2’).
［1’-α，β-2’-deoxyuridine (2)］
1’-α，β- 2’-deoxy-3’,5’-di-O-p-toluoyl-uridine 1 (5.52 g, 11.8 mmol)をメタノール (125 ml)に溶解し、28%アンモニウム水溶液 (125 ml)を加えて3日間撹拌した。真空ポンプでアンモニアを除去した後、溶媒を減圧留去した。残渣をフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィー (CHCl3 /MeOH) で精製し、白色固体として2 (2.59g, 97%)を得た。
2: 1H NMR (DMSO-d6) δ11.2 (s, 1H, α-NH), 11.2 (s, 1H, β-NH), 7.86 (d, 1H, J = 7.98 Hz, β-H6), 7.84 (d, 1H, J = 7.98 Hz, α-H6), 6.14 (t, 1H, J = 7.17 Hz, β-H1’), 6.09 (dd, 1H, J = 2.49, 7.71 Hz, α-H1’), 5.62 (d, 1H, J = 7.98 Hz, α-H5), 5.47 (d, 1H, J = 8.25 Hz, β-H5), 5.34 (d, 1H, J = 3.00 Hz, β-3’OH), 5.25 (d, 1H, J = 4.11 Hz, α-3’OH), 5.02 (t, 1H, J = 5.08 Hz, α-5’OH), 4.86 (t, 1H, J = 5.50 Hz, β-5’OH), 4.19-4.26 (br, 2H, α-H5’), 4.08-4.16 (m, 1H, α-H3’), 4.08-4.16 (m, 1H, β-H3’), 3.75-3.79 (m, 1H, β-H4’), 3.52-3.36 (m, 2H, β-H5’), 3.30-3.36 (m, 2H, α-H2’), 3.30-3.36 (m, 2H, β-H2’).
1’-α，β- 2’-deoxy-3’,5’-di-O-p-toluoyl-uridine 1 (5.52 g, 11.8 mmol)をメタノール (125 ml)に溶解し、28%アンモニウム水溶液 (125 ml)を加えて3日間撹拌した。真空ポンプでアンモニアを除去した後、溶媒を減圧留去した。残渣をフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィー (CHCl3 /MeOH) で精製し、白色固体として2 (2.59g, 97%)を得た。
2: 1H NMR (DMSO-d6) δ11.2 (s, 1H, α-NH), 11.2 (s, 1H, β-NH), 7.86 (d, 1H, J = 7.98 Hz, β-H6), 7.84 (d, 1H, J = 7.98 Hz, α-H6), 6.14 (t, 1H, J = 7.17 Hz, β-H1’), 6.09 (dd, 1H, J = 2.49, 7.71 Hz, α-H1’), 5.62 (d, 1H, J = 7.98 Hz, α-H5), 5.47 (d, 1H, J = 8.25 Hz, β-H5), 5.34 (d, 1H, J = 3.00 Hz, β-3’OH), 5.25 (d, 1H, J = 4.11 Hz, α-3’OH), 5.02 (t, 1H, J = 5.08 Hz, α-5’OH), 4.86 (t, 1H, J = 5.50 Hz, β-5’OH), 4.19-4.26 (br, 2H, α-H5’), 4.08-4.16 (m, 1H, α-H3’), 4.08-4.16 (m, 1H, β-H3’), 3.75-3.79 (m, 1H, β-H4’), 3.52-3.36 (m, 2H, β-H5’), 3.30-3.36 (m, 2H, α-H2’), 3.30-3.36 (m, 2H, β-H2’).
［1’-α，β- 5’-O-(t-butyldimethylsilyl)- 2’-deoxyuridine (3)］
1’-α，β- 2’-deoxyuridine 2 (2.59 g, 11.4 mmol)とTBDMSCl (1.86 g, 12,4 mmol)、Imidazole (1.66 g, 24.5 mmol)をDMF (11 ml)に溶解し、室温で一晩撹拌した。酢酸エチルで抽出後、飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した後減圧留去した。残渣をフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィー (CHCl3 /MeOH) で精製し白色固体として3 (3.8g, 99%)を得た。
3: 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ7.95 (s, 1H, α-NH), 7.95 (s, 1H, β-NH), 7.87 (d, 1H, J = 7.98 Hz, α-H6), 7.68 (dd, 1H, J = 1.38, 7.98 Hz, β-H6), 6.27-6.31 (m, 1H, β-H1’), 6.08 (d, 1H, J = 6.87 Hz, α-H1’), 5.63 (d, 1H, J = 7.98 Hz, α-H5), 5.61 (d, 1H, J = 7.98 Hz, β-H5), 4.36-4.46 (br, 1H, α-H4’), 4.36-4.46 (br, 1H, β-H4’), 4.31-4.34 (m, 1H, α-H3’), 3.97-4.03 (m, 1H, β-H3’), 3.70-3.88 (m, 2H, β-H5’), 3.56-3.70 (m, 2H, α-H5’), 2.57-2.70 (m, 1H, α-H2’), 2.31-2.42 (m, 1H, β-H2’), 2.14 (d, 1H, J = 14.8 Hz, α-H2’), 2.02-2.12 (m, 1H, β-H2’), 0.85 (s, 9H, α- (CH3)3), 0.85 (s, 9H, β- (CH3)3), 0.05 (s, 6H, β- (CH3)2), 0.02 (s, 6H, α- (CH3)2),
13C NMR (500 MHz, CDCl3) δ162.64(α), 162.64(β), 150.49(α), 150.49(β), 141.59(β), 140.31(α), 102.14(β), 100.94(α), 90.02(β), 88.37(α), 87.39(β), 85.29(α), 72.14(β), 71.63(α), 63.90(β), 63.20(α), 36.51(β), 31.43(α), 18.23(β), 18.16(α), 5.68(α), 5.54(β), HRMS (MALDI): calc. for C15H26N2O5Si)[M+Na]+) 365.1509, found 365.1540.
1’-α，β- 2’-deoxyuridine 2 (2.59 g, 11.4 mmol)とTBDMSCl (1.86 g, 12,4 mmol)、Imidazole (1.66 g, 24.5 mmol)をDMF (11 ml)に溶解し、室温で一晩撹拌した。酢酸エチルで抽出後、飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した後減圧留去した。残渣をフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィー (CHCl3 /MeOH) で精製し白色固体として3 (3.8g, 99%)を得た。
3: 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ7.95 (s, 1H, α-NH), 7.95 (s, 1H, β-NH), 7.87 (d, 1H, J = 7.98 Hz, α-H6), 7.68 (dd, 1H, J = 1.38, 7.98 Hz, β-H6), 6.27-6.31 (m, 1H, β-H1’), 6.08 (d, 1H, J = 6.87 Hz, α-H1’), 5.63 (d, 1H, J = 7.98 Hz, α-H5), 5.61 (d, 1H, J = 7.98 Hz, β-H5), 4.36-4.46 (br, 1H, α-H4’), 4.36-4.46 (br, 1H, β-H4’), 4.31-4.34 (m, 1H, α-H3’), 3.97-4.03 (m, 1H, β-H3’), 3.70-3.88 (m, 2H, β-H5’), 3.56-3.70 (m, 2H, α-H5’), 2.57-2.70 (m, 1H, α-H2’), 2.31-2.42 (m, 1H, β-H2’), 2.14 (d, 1H, J = 14.8 Hz, α-H2’), 2.02-2.12 (m, 1H, β-H2’), 0.85 (s, 9H, α- (CH3)3), 0.85 (s, 9H, β- (CH3)3), 0.05 (s, 6H, β- (CH3)2), 0.02 (s, 6H, α- (CH3)2),
13C NMR (500 MHz, CDCl3) δ162.64(α), 162.64(β), 150.49(α), 150.49(β), 141.59(β), 140.31(α), 102.14(β), 100.94(α), 90.02(β), 88.37(α), 87.39(β), 85.29(α), 72.14(β), 71.63(α), 63.90(β), 63.20(α), 36.51(β), 31.43(α), 18.23(β), 18.16(α), 5.68(α), 5.54(β), HRMS (MALDI): calc. for C15H26N2O5Si)[M+Na]+) 365.1509, found 365.1540.
［1’-α，β- 5’-O-(t-butyldimethylsilyl)-3’-O-phenpxythiocarbonyl-deoxyuridine (4)］
1’-α，β- O-(t-butyldimethylsilyl)- 2’-deoxyuridine 3 (3.8g, 11.3 mmol)をMeCN (11ml) に溶解し、DMAP (2.83 g, 23.1 mmol)とPTC-Cl (2.14 g, 12.4 mmol)を加えて一晩撹拌した。酢酸エチルで抽出し、1N塩酸、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去した後、残渣をフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィー (Hexane /AcOEt) で精製し、α，β混合体4 (1.452g, 27%)を得た
4:1HNMR(300MHz,CDCl3) δ8.16-8.32 (br, 1H, β-NH), 8.15-8.38(br, 1H, α-NH), 7.93 (d, 1H, J = 7.89 Hz, β-H6), 7.46 (d, 1H, J = 6.33 Hz, α-H6), 7.09-7.46 (m, 5H, β-OPTC), 7.05-7.50 (m, 5H, α-OPTC), 6.45-6.50 (m, 1H, β-H1’), 6.35 (dd, 1H, J = 1.92, 7.41 Hz, α-H1’), 5.77 (d, 1H, J = 6.33 Hz, α-H5), 5.74 (br, 1H, β-H5), 5.71-5.74 (m, 1H, α-H3’), 4.67 (br, 1H, α-H4’), 4.42 (s, 1H, β-H4’), 3.95-4.04 (m, 2H, β-H5’), 3.80-3.94 (m, 2H, α-H5’), 2.93-3.00 (m, 1H, α-H2’), 2.70-2.76 (m, 1H, β-H2’), 2.38 (d, 1H, J = 15.3 Hz, α-H2’), 2.22-2.31(m, 1H, β-H2’), 0.93 (s, 9H, α-(CH3)3), 0.92 (s, 9H, β-(CH3)3), 0.13 (s, 6H, β-(CH3)2), 0.11 (s, 6H, α-(CH3)2).
1’-α，β- O-(t-butyldimethylsilyl)- 2’-deoxyuridine 3 (3.8g, 11.3 mmol)をMeCN (11ml) に溶解し、DMAP (2.83 g, 23.1 mmol)とPTC-Cl (2.14 g, 12.4 mmol)を加えて一晩撹拌した。酢酸エチルで抽出し、1N塩酸、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去した後、残渣をフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィー (Hexane /AcOEt) で精製し、α，β混合体4 (1.452g, 27%)を得た
4:1HNMR(300MHz,CDCl3) δ8.16-8.32 (br, 1H, β-NH), 8.15-8.38(br, 1H, α-NH), 7.93 (d, 1H, J = 7.89 Hz, β-H6), 7.46 (d, 1H, J = 6.33 Hz, α-H6), 7.09-7.46 (m, 5H, β-OPTC), 7.05-7.50 (m, 5H, α-OPTC), 6.45-6.50 (m, 1H, β-H1’), 6.35 (dd, 1H, J = 1.92, 7.41 Hz, α-H1’), 5.77 (d, 1H, J = 6.33 Hz, α-H5), 5.74 (br, 1H, β-H5), 5.71-5.74 (m, 1H, α-H3’), 4.67 (br, 1H, α-H4’), 4.42 (s, 1H, β-H4’), 3.95-4.04 (m, 2H, β-H5’), 3.80-3.94 (m, 2H, α-H5’), 2.93-3.00 (m, 1H, α-H2’), 2.70-2.76 (m, 1H, β-H2’), 2.38 (d, 1H, J = 15.3 Hz, α-H2’), 2.22-2.31(m, 1H, β-H2’), 0.93 (s, 9H, α-(CH3)3), 0.92 (s, 9H, β-(CH3)3), 0.13 (s, 6H, β-(CH3)2), 0.11 (s, 6H, α-(CH3)2).
［1’-α-5’-O-(t-butyldimethylsilyl)- 1’-α- 2’-O-3’-O-dideoxyuridine (5)］
1’-α，β-5’-O-(t-butyldimethylsilyl)-3’-O-phenpxythiocarbonyl-deoxyuridine 4 (420 mg, 0.87 mmol, α：β = 2 : 1)を脱水トルエン (30 ml) に溶解し、加熱還流した。予め混合しておいたnBu3SnHとAIBNのトルエン溶液 (8 ml) を還流中に１時間かけて滴下し、２時間加熱還流して反応を行った。溶媒を減圧留去し、残渣をフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィー (Hexane /AcOEt)で精製し、α，β体をそれぞれ175mg (61%)、106 mg (37%)を得た。
5: 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8.26-8.46 (br, 1H, NH), 7.35 (d, 1H, J = 8.22 Hz, H6), 6.02-6.06 (m, 1H, H1’), 5.70 (dd, 1H, J = 8.22, 2.19 Hz, H5), 4.38-4.42 (m, 1H, H4’), 3.59-3.71 (m, 2H, H5’), 2.44-2.56 (m, 1H, H2’), 1.94-2.04 (m, 3H, H2’, H3’), 0.90 (s, 9H, (CH3)3), 0.09 (s, 6H, (CH3)2).
1’-α，β-5’-O-(t-butyldimethylsilyl)-3’-O-phenpxythiocarbonyl-deoxyuridine 4 (420 mg, 0.87 mmol, α：β = 2 : 1)を脱水トルエン (30 ml) に溶解し、加熱還流した。予め混合しておいたnBu3SnHとAIBNのトルエン溶液 (8 ml) を還流中に１時間かけて滴下し、２時間加熱還流して反応を行った。溶媒を減圧留去し、残渣をフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィー (Hexane /AcOEt)で精製し、α，β体をそれぞれ175mg (61%)、106 mg (37%)を得た。
5: 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8.26-8.46 (br, 1H, NH), 7.35 (d, 1H, J = 8.22 Hz, H6), 6.02-6.06 (m, 1H, H1’), 5.70 (dd, 1H, J = 8.22, 2.19 Hz, H5), 4.38-4.42 (m, 1H, H4’), 3.59-3.71 (m, 2H, H5’), 2.44-2.56 (m, 1H, H2’), 1.94-2.04 (m, 3H, H2’, H3’), 0.90 (s, 9H, (CH3)3), 0.09 (s, 6H, (CH3)2).
［1’-α-5’-O-(t-butyldimethylsilyl)- 1’-α- 2’-O-3’-O-dideoxy-5-iodo-uridine (6)］
5’-O-(t-butyldimethylsilyl)- 1’-α- 2’-O-3’-O-dideoxyuridine 5 (170 mg, 0.52 mmol) をDMF 2mlに溶解し、NIS (234 mg, 1.04 mmol) を加えてマイクロウェーブ (30w, 60℃で３分間で2回反応した。酢酸エチルで抽出し、飽和チオ硫酸ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去した後、残渣をフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィー (Hexane /AcOEt ) で精製し、白色アモルファスとして6 (124 mg, 53%)を得た。
6: 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ8.32-8.42 (br, 1H, NH), 7.71 (s 1H, H6), 6.00-6.03 (m, 1H, H1’), 4.43-4.49 (m, 1H, H4’), 3.57-3.74 (m, 2H, H5’), 2.50-2.60 (m, 3H, H2’), 1.96-2.06 (m, 3H, H2’, H3’), 0.91 (s, 9H, (CH3)3), 0.09 (s, 6H, (CH3)2).
5’-O-(t-butyldimethylsilyl)- 1’-α- 2’-O-3’-O-dideoxyuridine 5 (170 mg, 0.52 mmol) をDMF 2mlに溶解し、NIS (234 mg, 1.04 mmol) を加えてマイクロウェーブ (30w, 60℃で３分間で2回反応した。酢酸エチルで抽出し、飽和チオ硫酸ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去した後、残渣をフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィー (Hexane /AcOEt ) で精製し、白色アモルファスとして6 (124 mg, 53%)を得た。
6: 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ8.32-8.42 (br, 1H, NH), 7.71 (s 1H, H6), 6.00-6.03 (m, 1H, H1’), 4.43-4.49 (m, 1H, H4’), 3.57-3.74 (m, 2H, H5’), 2.50-2.60 (m, 3H, H2’), 1.96-2.06 (m, 3H, H2’, H3’), 0.91 (s, 9H, (CH3)3), 0.09 (s, 6H, (CH3)2).
［1’-α-5’-O-(t-butyldimethylsilyl)-1’-α-2’,3’-dideoxy-5-cyanovinyl-uridine (7)］
Plladium acetate (12mg, 0.052 mmol)、triphenylphosphine (41 mg, 0.15 mmol)、 triethylamine (0.087 ml, 0.62 mmol)をジオキサン(3 ml) に溶解し、濃赤色になるまで加熱還流した。5’-O-(t-butyldimethylsilyl)- 1’-α- 2’-O-3’-O-dideoxy-5-iodo-uridine 6 (236 mg, 0.53 mmol)とacrylonitrile (0.05 ml, 1.04 mmol)を加えて３時間加熱還流した。溶媒を減圧留去し、フラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィー (Hexane /AcOEt) で精製し、白色固体として7 (trans体 :112 mg, 57%, cis体 : 31 mg , 16%)を得た。
7: 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ8.12-8.21 (br, 1H, NH), 7.55 (s 1H, H6), 6.90 (d, 1H, J=16.2 Hz, CH=CH), 6.70 (d, 1H, J=16.2 Hz, CH=CH), 6.00-6.03 (m, 1H, H1’), 4.39-4.51 (m, 1H, H4’), 3.61-3.75 (m, 2H, H5’), 2.57-2.61 (m, 1H, H2’), 2.00-2.02 (m, 3H, H2’, H3’), 0.90 (s, 9H, (CH3)3), 0.08 (s, 6H, (CH3)2).
Plladium acetate (12mg, 0.052 mmol)、triphenylphosphine (41 mg, 0.15 mmol)、 triethylamine (0.087 ml, 0.62 mmol)をジオキサン(3 ml) に溶解し、濃赤色になるまで加熱還流した。5’-O-(t-butyldimethylsilyl)- 1’-α- 2’-O-3’-O-dideoxy-5-iodo-uridine 6 (236 mg, 0.53 mmol)とacrylonitrile (0.05 ml, 1.04 mmol)を加えて３時間加熱還流した。溶媒を減圧留去し、フラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィー (Hexane /AcOEt) で精製し、白色固体として7 (trans体 :112 mg, 57%, cis体 : 31 mg , 16%)を得た。
7: 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ8.12-8.21 (br, 1H, NH), 7.55 (s 1H, H6), 6.90 (d, 1H, J=16.2 Hz, CH=CH), 6.70 (d, 1H, J=16.2 Hz, CH=CH), 6.00-6.03 (m, 1H, H1’), 4.39-4.51 (m, 1H, H4’), 3.61-3.75 (m, 2H, H5’), 2.57-2.61 (m, 1H, H2’), 2.00-2.02 (m, 3H, H2’, H3’), 0.90 (s, 9H, (CH3)3), 0.08 (s, 6H, (CH3)2).
［1’-α-2’,3’-dideoxy-5-cyanovinyl-uridine (8)］
5’-O-(t-butyldimethylsilyl)-2’-O-3’-O-dideoxy-5-cyanovinyl-uridine 7 (110 mg, 0.29 mmol) をTHF (2 ml) に溶解し、0℃で氷冷後、1M TBAFのTHF溶液 (0.43 ml, 0.43 mmol) を滴下しアルミホイルで遮光して2時間撹拌した。TLCで出発物質の消失を確認した後、溶媒を減圧留去した。残渣をフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィー (Hexane /AcOEt) で精製し、目的物 8 (44 mg, 57%)を白色固体として得た。
8: 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ8.72-8.74 (br, 1H, NH), 7.58 (s 1H, H6), 6.93 (d, 1H, J=16.2 Hz, CH=CH), 6.71 (d, 1H, J=16.2 Hz, CH=CH), 6.03-6.07 (m, 1H, H1’), 4.48-4.55 (m, 1H, H4’), 3.75-3.80 (m, 1H, H5’), 3.56-3.65 (m, 1H, H5’), 2.50-2.58 (m, 1H, H2’), 1.94-2.12 (m, 3H, H2’, H3’).
5’-O-(t-butyldimethylsilyl)-2’-O-3’-O-dideoxy-5-cyanovinyl-uridine 7 (110 mg, 0.29 mmol) をTHF (2 ml) に溶解し、0℃で氷冷後、1M TBAFのTHF溶液 (0.43 ml, 0.43 mmol) を滴下しアルミホイルで遮光して2時間撹拌した。TLCで出発物質の消失を確認した後、溶媒を減圧留去した。残渣をフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィー (Hexane /AcOEt) で精製し、目的物 8 (44 mg, 57%)を白色固体として得た。
8: 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ8.72-8.74 (br, 1H, NH), 7.58 (s 1H, H6), 6.93 (d, 1H, J=16.2 Hz, CH=CH), 6.71 (d, 1H, J=16.2 Hz, CH=CH), 6.03-6.07 (m, 1H, H1’), 4.48-4.55 (m, 1H, H4’), 3.75-3.80 (m, 1H, H5’), 3.56-3.65 (m, 1H, H5’), 2.50-2.58 (m, 1H, H2’), 1.94-2.12 (m, 3H, H2’, H3’).
［1’-α-2’,3’-dideoxy-5-cyanovinyl-uridine-5’-triphosphate (9)］
真空ポンプで1日以上乾燥させた2’,3’-dideoxy-5-cyanovinyl-uridine 8 (5 mg, 0.018 mmol)とProton Sponge : N,N,N’,N’-Tetramethyl-1,8-naphtalenediamine (9 mg, 0.043 mmol)をTriethoxyphosphine (0.25 ml)に溶解し、0℃でオキシ塩化リン(0.003 ml, 0.037 mmol)を加えて2時間撹拌した。1M Tributhylammonium pyrophosphateの DMF溶液 (0.08mmol, 0.08 mmol) を加えてから2分後にTributhylamine (0.061 ml, 0.51 mmol)を加え、1分間撹拌した後、Triethylammonium bicabonate buffer (1.5 ml)で反応を停止させ、2本に分けて一晩凍結乾燥した。混合物をMilliQに溶解し、HPLC(0(0 min)-0(5 min)-20(40 min)CH3CN in 0.1M TEA-bicarbonate, pH 7.5)でα-ddUTPの分取精製を行った。
9: 1H NMR (500 MHz, D2O with 50 mM Tris, 2 mM EDTA) δ 3.94-4.13 (m, 4H, H-2', 3'), 6.09-6.15 (br, 1H, H-1’), 6.50 (d, 1H, J=10.3 Hz, CH=CH), 6.69-6.77 (m, 2H, H-5’), 6.90-7.10 (m, 1H, H-4’), 7.26 (d, 1H, J=10.3 Hz, CH=CH), 7.92 (s, 1H, H-6) .
31P NMR (500 MHz, D2O with 50 mM Tris, 2 mM EDTA) δ-9.76 (d, αphosphate), -21.16 (t, β phosphate), -5.06 (d, γ phosphate).
真空ポンプで1日以上乾燥させた2’,3’-dideoxy-5-cyanovinyl-uridine 8 (5 mg, 0.018 mmol)とProton Sponge : N,N,N’,N’-Tetramethyl-1,8-naphtalenediamine (9 mg, 0.043 mmol)をTriethoxyphosphine (0.25 ml)に溶解し、0℃でオキシ塩化リン(0.003 ml, 0.037 mmol)を加えて2時間撹拌した。1M Tributhylammonium pyrophosphateの DMF溶液 (0.08mmol, 0.08 mmol) を加えてから2分後にTributhylamine (0.061 ml, 0.51 mmol)を加え、1分間撹拌した後、Triethylammonium bicabonate buffer (1.5 ml)で反応を停止させ、2本に分けて一晩凍結乾燥した。混合物をMilliQに溶解し、HPLC(0(0 min)-0(5 min)-20(40 min)CH3CN in 0.1M TEA-bicarbonate, pH 7.5)でα-ddUTPの分取精製を行った。
9: 1H NMR (500 MHz, D2O with 50 mM Tris, 2 mM EDTA) δ 3.94-4.13 (m, 4H, H-2', 3'), 6.09-6.15 (br, 1H, H-1’), 6.50 (d, 1H, J=10.3 Hz, CH=CH), 6.69-6.77 (m, 2H, H-5’), 6.90-7.10 (m, 1H, H-4’), 7.26 (d, 1H, J=10.3 Hz, CH=CH), 7.92 (s, 1H, H-6) .
31P NMR (500 MHz, D2O with 50 mM Tris, 2 mM EDTA) δ-9.76 (d, αphosphate), -21.16 (t, β phosphate), -5.06 (d, γ phosphate).
［2. １’-α-２’，３’-ジデオキシ-５-シアノビニルウリジン-５’-トリリン酸の酵素的導入法］
ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ (ＴｄＴ) は２本鎖および１本鎖ＤＮＡの３’-ＯＨ末端へ鋳型に依存せずにいくつかのｄＮＴＰやｄｄＮＴＰを付加する反応を触媒する酵素である。ＴｄＴは放射性標識やビオチン標識されたヌクレオチドの導入にも利用できることから、光反応素子のＯＤＮの導入に際し、この手法に着目した。 そこでＴｄＴを用いて、1.で合成した１’-α-２’，３’-ジデオキシ-５-シアノビニルウリジン-５’-トリリン酸 (α-ddCUTP) の22merの３’-OH末端への導入反応を行なった (次のScheme 2参照)。このような導入は、３’-OH末端がＡＴＣＧのいずれであっても行うことができた。
ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ (ＴｄＴ) は２本鎖および１本鎖ＤＮＡの３’-ＯＨ末端へ鋳型に依存せずにいくつかのｄＮＴＰやｄｄＮＴＰを付加する反応を触媒する酵素である。ＴｄＴは放射性標識やビオチン標識されたヌクレオチドの導入にも利用できることから、光反応素子のＯＤＮの導入に際し、この手法に着目した。 そこでＴｄＴを用いて、1.で合成した１’-α-２’，３’-ジデオキシ-５-シアノビニルウリジン-５’-トリリン酸 (α-ddCUTP) の22merの３’-OH末端への導入反応を行なった (次のScheme 2参照)。このような導入は、３’-OH末端がＡＴＣＧのいずれであっても行うことができた。
［α-ddCUTP導入反応］
22 merのODN 1 : 5’-CATACGACTCACTATAGGTACG-3’ (最終濃度25μM)とα-ddCUTP（最終濃度2.5 mM）をTdT reaction buffer, 5X conc.（1 M Pottassium cacodylate, 125 mM Tris-HCl, 1.25 mg.ml BSA, pH 6.6 at 25℃, Roche）と25 mM CoCl2 solution（最終濃度5 mM）に溶解し、rTdT（Terminal Transferase, recombinant. Enzyme storage buffer: 60 mM K-phosphate (pH 7.2 at 4℃), 150 mM KCl, 1 mM 2-Mercaptoethanol, 0.5% Triton X-100, 50% glycerol, Roche）を400U / reaction 加え、恒温槽を用いて37℃で30分間インキュベートした。さらにrTdTを400U / reaction 加え、37℃で30分間インキュベートした（図１（Figure 1））。PCR装置を用いて90℃、5分間で反応を停止させ、キャピラリーゲル電気泳動で取り込みを確認した。その結果、α-ddCUTP は酵素TdTの基質となり、30分間で約49%、さらにTdTを加えて30分間で約85%の収率で22 merへのα-ddCUTP取り込み反応が進行した（図２（Figure 2））。HPLC（3%(0 min)-20%(30 min) MeCN in 50 mM ammonium formate）によりα-ddCUを取り込んだODN 2： (22 + ddCU) merを分取精製し、MALDI Tof Massを測定したところ理論値と測定値が一致したことから、α-ddCUTP導入反応が進行したことを確認した（HRMS (MALDI): calc. for CATACGACTCACTATAGGTACGddcU [(M + H)+] 7029.59, found 7029.37）。
22 merのODN 1 : 5’-CATACGACTCACTATAGGTACG-3’ (最終濃度25μM)とα-ddCUTP（最終濃度2.5 mM）をTdT reaction buffer, 5X conc.（1 M Pottassium cacodylate, 125 mM Tris-HCl, 1.25 mg.ml BSA, pH 6.6 at 25℃, Roche）と25 mM CoCl2 solution（最終濃度5 mM）に溶解し、rTdT（Terminal Transferase, recombinant. Enzyme storage buffer: 60 mM K-phosphate (pH 7.2 at 4℃), 150 mM KCl, 1 mM 2-Mercaptoethanol, 0.5% Triton X-100, 50% glycerol, Roche）を400U / reaction 加え、恒温槽を用いて37℃で30分間インキュベートした。さらにrTdTを400U / reaction 加え、37℃で30分間インキュベートした（図１（Figure 1））。PCR装置を用いて90℃、5分間で反応を停止させ、キャピラリーゲル電気泳動で取り込みを確認した。その結果、α-ddCUTP は酵素TdTの基質となり、30分間で約49%、さらにTdTを加えて30分間で約85%の収率で22 merへのα-ddCUTP取り込み反応が進行した（図２（Figure 2））。HPLC（3%(0 min)-20%(30 min) MeCN in 50 mM ammonium formate）によりα-ddCUを取り込んだODN 2： (22 + ddCU) merを分取精製し、MALDI Tof Massを測定したところ理論値と測定値が一致したことから、α-ddCUTP導入反応が進行したことを確認した（HRMS (MALDI): calc. for CATACGACTCACTATAGGTACGddcU [(M + H)+] 7029.59, found 7029.37）。
［3. 1’-α-2’, 3’-ジデオキシ-5-シアノビニルウリジンを導入したODNを用いた光ライゲーション反応］
α-ddCUを導入したODN と鋳型存在下、光ライゲーション反応を行なった。ポリアクリルアミドゲル電気泳動で反応の追跡を行なうためにCy3（Cyanine 3、最大励起波長：547 nm、最大蛍光波長：563 nm）入りのODN : Cy3- 22 merにα-ddCUを導入し、Cy3-(22 + ddCU)merを用いて鋳型存在下、光ライゲーション反応を行なった（Scheme 3）。
α-ddCUを導入したODN と鋳型存在下、光ライゲーション反応を行なった。ポリアクリルアミドゲル電気泳動で反応の追跡を行なうためにCy3（Cyanine 3、最大励起波長：547 nm、最大蛍光波長：563 nm）入りのODN : Cy3- 22 merにα-ddCUを導入し、Cy3-(22 + ddCU)merを用いて鋳型存在下、光ライゲーション反応を行なった（Scheme 3）。
α-ddCU導入ODN 2 : 5’-Cy3-CATACGACTCACTATAGGTACGddCU-3’ (最終濃度2.5 μM)と光連結相手のODN 3: 5’-TGAGTGACCTGCTATT-3’(最終濃度50 μM),ODN4:5’-CCAGTAGTGAAATAGCAGGTCACTCAACGTACCTATAGTGAGTCGTATGGATGACCGC-3’（最終濃度5μM）を200 mM Sodium Cacodylate bufferと2M NaCl solutionを混合した（図３（Figure 3））。366 nmの光を5分、15分、30分間照射し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて展開後、フルオロイメージャーで光ライゲーション反応を追跡したところ、ODN 2は鋳型ODN 4存在下、目的のODN 3 と光連結した（図４（Figure 4））。蛍光度より収率を算出したところ、5分間で39%、15分間で40%、30分間で42%の収率で光ライゲーション反応が進行した。
［4. 長鎖ODN (100 mer) への1’-α-2’, 3’-ジデオキシ-5-シアノビニルウリジンの導入反応及び光ライゲーション反応］
長鎖ODNへのα-ddCUTP導入の有無を確認する為に、TdTを用いて1.で合成したα-ddCUTPの100 merへの導入反応を行なった (Scheme 4)。このような導入は、3’-OH末端がＡＴＣＧのいずれであっても行うことができた。
長鎖ODNへのα-ddCUTP導入の有無を確認する為に、TdTを用いて1.で合成したα-ddCUTPの100 merへの導入反応を行なった (Scheme 4)。このような導入は、3’-OH末端がＡＴＣＧのいずれであっても行うことができた。
［α-ddCUTP導入反応］
100 merのODN 6 : 5’-GGAGTGGCCGGGAGTTGGGCGAGTACGGGCTGCAGG CATACACTAAAGTGAAAACTGTGAGTGTGGGACCTGCTGGGGGCTCAGGGCCTGTTGGGGCTTG-3’ (最終濃度25 μM)とα-ddCUTP（最終濃度2.5 mM）をTdT reaction buffer, 5X conc.（1 M Pottassium cacodylate, 125 mM Tris-HCl, 1.25 mg.ml BSA, pH 6.6 at 25℃, Roche）と25 mM CoCl2 solution（最終濃度5 mM）に溶解し、rTdT（Terminal Transferase, recombinant. Enzyme storage buffer: 60 mM K-phosphate (pH 7.2 at 4℃), 150 mM KCl, 1 mM 2-Mercaptoethanol, 0.5% Triton X-100, 50% glycerol, Roche）を400U / reaction 加え、恒温槽を用いて37℃で30分間インキュベートした。さらにrTdTを400U / reaction 加え、37℃で30分間インキュベートした（図５（Figure 5））。PCR装置を用いて90℃、5分間で反応を停止させ、キャピラリーゲル電気泳動で取り込みを確認した。その結果、α-ddCUTP は酵素TdTの基質となり、100 merへのα-ddCUTP導入反応が進行した（図６（Figure 6））。
100 merのODN 6 : 5’-GGAGTGGCCGGGAGTTGGGCGAGTACGGGCTGCAGG CATACACTAAAGTGAAAACTGTGAGTGTGGGACCTGCTGGGGGCTCAGGGCCTGTTGGGGCTTG-3’ (最終濃度25 μM)とα-ddCUTP（最終濃度2.5 mM）をTdT reaction buffer, 5X conc.（1 M Pottassium cacodylate, 125 mM Tris-HCl, 1.25 mg.ml BSA, pH 6.6 at 25℃, Roche）と25 mM CoCl2 solution（最終濃度5 mM）に溶解し、rTdT（Terminal Transferase, recombinant. Enzyme storage buffer: 60 mM K-phosphate (pH 7.2 at 4℃), 150 mM KCl, 1 mM 2-Mercaptoethanol, 0.5% Triton X-100, 50% glycerol, Roche）を400U / reaction 加え、恒温槽を用いて37℃で30分間インキュベートした。さらにrTdTを400U / reaction 加え、37℃で30分間インキュベートした（図５（Figure 5））。PCR装置を用いて90℃、5分間で反応を停止させ、キャピラリーゲル電気泳動で取り込みを確認した。その結果、α-ddCUTP は酵素TdTの基質となり、100 merへのα-ddCUTP導入反応が進行した（図６（Figure 6））。
［光ライゲーション反応］
α-ddCUを導入したODN 7と鋳型存在下、光ライゲーション反応を行なった。（Scheme 5）。ポリアクリルアミドゲル電気泳動で反応の追跡をする上で、今回はSYBR Gold (Invitrogen)を用いてポリアクリルアミドゲルを染色したのち、フルオロイメージャーで反応の追跡を行なった。
α-ddCUを導入したODN 7と鋳型存在下、光ライゲーション反応を行なった。（Scheme 5）。ポリアクリルアミドゲル電気泳動で反応の追跡をする上で、今回はSYBR Gold (Invitrogen)を用いてポリアクリルアミドゲルを染色したのち、フルオロイメージャーで反応の追跡を行なった。
α-ddCU導入ODN 7 : 5’-GGAGTGGCCGGGAGTTGGGCGAGTACGGGCTGCAGG CATACACTAAAGTGAAAACTGTGAGTGTGGGACCTGCTGGGGGCTCAGGGCCTGTTGGGGCTTGddCU-3’ (最終濃度2.5 μM)と光連結相手のODN 8: 5’-TGAGTGACCTGCTATT-3’（最終濃度50 μM）とODN 9 :5’-AATAGCAGGTACCTCAACAAGCCCCAACAGGCC-3’（最終濃度5 μM）を200 mM Sodium Cacodylate bufferと2M NaCl solutionを混合した（図７（Figure 7））。366 nmの光を5分、15分、30分間照射し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて展開後、SYBR Gold (Invitrogen)を用いて暗室で40分間染色した後、フルオロイメージャーで光ライゲーション反応を追跡したところ、ODN 7は鋳型ODN 9存在下、目的のODN 8 と光連結した（図８（Figure 8））。また、鋳型ODN 9非存在下では光ライゲーション反応が進行しないことも確認した。
［5. 1’-α-2’, 3’-ジデオキシ-5-シアノビニルウリジン-5’-トリリン酸の酵素的導入法（末端A）］
ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ (TdT) は2本鎖および1本鎖DNAの3’-OH末端へ鋳型に依存せずにいくつかのdNTPやddNTPを付加する反応を触媒する酵素である。TdTは放射性標識やビオチン標識されたヌクレオチドの導入にも利用できることから、光反応素子のODNの導入に際し、この手法に着目した。 そこでTdTを用いて、1.で合成した1’-α-2’,3’-ジデオキシ-5-シアノビニルウリジン-5’-トリリン酸 (α-ddCUTP) の22merの3’-OH末端への導入反応を行なった (Scheme 6)。
ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ (TdT) は2本鎖および1本鎖DNAの3’-OH末端へ鋳型に依存せずにいくつかのdNTPやddNTPを付加する反応を触媒する酵素である。TdTは放射性標識やビオチン標識されたヌクレオチドの導入にも利用できることから、光反応素子のODNの導入に際し、この手法に着目した。 そこでTdTを用いて、1.で合成した1’-α-2’,3’-ジデオキシ-5-シアノビニルウリジン-5’-トリリン酸 (α-ddCUTP) の22merの3’-OH末端への導入反応を行なった (Scheme 6)。
［α-ddCUTP導入反応］
22 mer（末端A）のODN 1 : 5’-CATACGACTCACTATAGGTACA-3’ (最終濃度25 μM)とα-ddCUTP（最終濃度2.5 mM）をTdT reaction buffer, 5X conc.（1 M Pottassium cacodylate, 125 mM Tris-HCl, 1.25 mg.ml BSA, pH 6.6 at 25℃, Roche）と25 mM CoCl2 solution（最終濃度5 mM）に溶解し、rTdT（Terminal Transferase, recombinant. Enzyme storage buffer: 60 mM K-phosphate (pH 7.2 at 4℃), 150 mM KCl, 1 mM 2-Mercaptoethanol, 0.5% Triton X-100, 50% glycerol, Roche）を800U / reaction 加え、恒温槽を用いて37℃で15分、30分間それぞれインキュベートした（図９（Figure 9））。PCR装置を用いて90℃、5分間で反応を停止させ、キャピラリーゲル電気泳動で取り込みを確認した。その結果、α-ddCUTP は酵素TdTの基質となり、15分間で約85%、 30分間で約99%の収率で22 merへのα-ddCUTP導入反応が進行した（図１０（Figure 10））。
22 mer（末端A）のODN 1 : 5’-CATACGACTCACTATAGGTACA-3’ (最終濃度25 μM)とα-ddCUTP（最終濃度2.5 mM）をTdT reaction buffer, 5X conc.（1 M Pottassium cacodylate, 125 mM Tris-HCl, 1.25 mg.ml BSA, pH 6.6 at 25℃, Roche）と25 mM CoCl2 solution（最終濃度5 mM）に溶解し、rTdT（Terminal Transferase, recombinant. Enzyme storage buffer: 60 mM K-phosphate (pH 7.2 at 4℃), 150 mM KCl, 1 mM 2-Mercaptoethanol, 0.5% Triton X-100, 50% glycerol, Roche）を800U / reaction 加え、恒温槽を用いて37℃で15分、30分間それぞれインキュベートした（図９（Figure 9））。PCR装置を用いて90℃、5分間で反応を停止させ、キャピラリーゲル電気泳動で取り込みを確認した。その結果、α-ddCUTP は酵素TdTの基質となり、15分間で約85%、 30分間で約99%の収率で22 merへのα-ddCUTP導入反応が進行した（図１０（Figure 10））。
本発明によれば、ＤＮＡ合成機を使うことなく、酵素反応を利用して、光応答性修飾核酸類を製造することができる。これによって、ＤＮＡ合成機では実質的に合成不可能であったほどの長鎖の光応答性修飾核酸類を得ることができる。また、本発明によれば、光応答性（光連結性）が付与された長鎖の修飾核酸類を使用して、光連結を行うことによって、従来のリガーゼ等の酵素だけでは合成が不可能であった修飾生体高分子を合成することができる。従って、本発明は、遺伝子工学に新たな基本技術を提供するものであり、産業上有用な発明である。
Claims (5)
- 次の式Ｉ：
（式Ｉ）
（式ＩＩ）
Ｒ１は、水素原子、シアノ基、カルボキサミド基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、又は、置換若しくは無置換の芳香族化合物の一価基を示し、
Ｒ２は、水素原子、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ６のアルコキシ基、シアノ基、又はＣ１〜Ｃ６のアシル基を示す。）
（式ＩＩＩ）
Ｒ２は、水素原子、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ６のアルコキシ基、シアノ基、又はＣ１〜Ｃ６のアシル基を示す。）
（式ＩＶ）
Ｚは、ＹがＯまたはＳであるときＮＨ２を示し、ＹがＮＨであるときは水素原子を示し、
Ｒ１は、水素原子、シアノ基、カルボキサミド基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、又は、置換若しくは無置換の芳香族化合物の一価基を示し、
Ｒ２は、水素原子、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ６のアルコキシ基、シアノ基、又はＣ１〜Ｃ６のアシル基を示す。）
（式Ｖ）
Ｒ２は、水素原子、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ６のアルコキシ基、シアノ基、又はＣ１〜Ｃ６のアシル基を示す。）
で表される修飾核酸塩基の基を表す。）
で表される、光応答性α−ジデオキシリボヌクレオシドをヌクレオシド部分として有する光応答性α−ジデオキシリボヌクレオチドを、ターミナル デオキシヌクレオチジル トランスフェラーゼの反応によって核酸類の３’末端に導入して、光応答性修飾核酸類を製造する方法（ただし、核酸類には、核酸、及びペプチド核酸が含まれる。）。 - 核酸類が、２０塩基以上の長さの核酸類である、請求項１に記載の方法。
- 請求項１に記載の光応答性α−ジデオキシリボヌクレオチドを、核酸類に導入して、核酸類に光応答性を付与する方法（ただし、核酸類には、核酸、及びペプチド核酸が含まれる。）であって、
光応答性α−ジデオキシリボヌクレオチドを、ターミナル デオキシヌクレオチジル トランスフェラーゼの反応によって核酸類の３’末端に導入する、方法。 - 核酸類が、２０塩基以上の長さの核酸類である、請求項４に記載の方法。
- 光応答性が、光連結性である、請求項１、２、４、６の何れかに記載の方法。
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| JP2005350386A (ja) * | 2004-06-09 | 2005-12-22 | Japan Science & Technology Agency | デオキシウリジン誘導体および光応答性ヌクレオチド |
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| JPN6009044907; Ｄｍｉｔｒｙ Ｇ． Ｓｅｍｉｚａｒｏｖ ｅｔ ａｌ．: 'Ｓｔｅｒｅｏｉｓｏｍｅｒｓ ｏｆ Ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ５'-Ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ ａｓ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ ｆｏｒ Ｔｅｍｐｌａｔｅ-ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｄ -ｉｎｄｅｐｅｎｄ' Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖｏｌ．２７２ ， Ｎｏ．１４, 1997, ｐｐ．９５５６-９５６０ * |
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