WO2021020561A1 - プライマー及びこれを用いた二本鎖ｄｎａの製造装置並びに二本鎖ｄｎａの製造方法 - Google Patents

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double
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阿部　洋
奈保子 阿部
航介 中本
裕貴 村瀬
康明 木村
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Definitions

  • the present invention relates to a primer, a device for producing double-stranded DNA using the primer, and a method for producing double-stranded DNA.
  • PCR polymerase chain reaction
  • a template DNA containing a target DNA sequence is used, and the template DNA is amplified by repeating heat denaturation and annealing for a plurality of cycles using a primer that binds complementarily to the template DNA.
  • the amplification product of the template DNA amplified by PCR has a blunt end as it is, and it is necessary to perform a process for binding (ligating) this with a host DNA such as a plasmid DNA.
  • a restriction enzyme that cleaves a specific sequence is used as such a treatment, but this method has a problem that it is not versatile because the DNA that can be bound depends on the sequence of the restriction enzyme cleavage site.
  • the 3'end and 5'end of the amplification product are used as adhesive ends (also called adhesive ends, protruding ends, etc.), and the host side also forms adhesive ends and ligates both to vector.
  • adhesive ends also called adhesive ends, protruding ends, etc.
  • the host side also forms adhesive ends and ligates both to vector.
  • the Gibson assembly method, the In-Fusion method, the SLiCE method and the like are known.
  • a homologous sequence of about 15 bp is provided at the end of a double-stranded DNA fragment, one strand in the double strand is digested with exonuclease activity to generate an adhesive terminal, and then the strand is ligated.
  • Taq DNA ligase is used for ligation in vitro
  • the In-Fusion method the repair system in Escherichia coli is used for ligation.
  • a method for preparing DNA having an adhesive end by a chemical method has been developed, and as a primer for PCR for that purpose, the one described in Patent Document 1 is known.
  • the base corresponding to the 3'end in the base sequence of the non-complementary DNA portion is modified with a protecting group.
  • This protecting group has a function of stopping the progress of DNA replication by DNA polymerase, and can be eliminated from the modified base by light irradiation treatment, alkali treatment, or the like.
  • a protecting group is introduced into the base of a primer by using a substituent introducing agent for introducing a protecting group (substituent) into a biomolecule.
  • Patent Document 1 the progress of DNA replication is stopped at the protecting group portion, but the site specificity is low because the single-stranded DNA is not cleaved at a specific site to generate an adhesive end.
  • DNA there are four types of bases, adenine, guanine, cytosine, and thymine, but in Patent Document 1, a protecting group is introduced into the base, so it is necessary to introduce the protecting group by a method according to the type of base. Therefore, it took time and cost to manufacture the primer.
  • the present inventors have conducted extensive research to solve the above problems. As a result, we have developed a primer in which a degradable protecting group is introduced into the sugar portion of the nucleoside via a specific linker. Then, they found that a double-stranded DNA having an adhesive end could be produced by cleaving a single strand at the nucleoside portion by degrading the protecting group, and completed the present invention.
  • the present invention is a primer used for amplification of nucleic acid, which is characterized by having a structure represented by the following formula (1).
  • a 1 indicates -S-, -S-S-, or -Se-
  • B indicates a base
  • R 1 indicates a degradable protecting group. * Indicates the binding of an adjacent nucleotide to the sugar. Means a hand.
  • R 1 is a photodegradable protecting group represented by the following formula (2A).
  • a 2 indicates an alkylene group having 1 to 3 carbon atoms
  • a 3 indicates an alkylene group having 1 to 3 carbon atoms. * Means a bond with A 1.
  • R 1 is a 2-nitrobenzyloxymethyl group represented by the following formula (3A).
  • R 1 is a fluoride-degradable protecting group represented by the following formula (2B).
  • a 4 represents an alkylene group having 1 to 3 carbon atoms
  • R 2 to R 4 represents an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms in a straight chain or a branched chain
  • R 2 to R 4 are identical to each other. may be different even. * means a bond to a 1.
  • R 1 is a triisopropylsilyloxymethyl group represented by the following formula (3B).
  • the present invention is an apparatus for producing double-stranded DNA for producing double-stranded DNA having an adhesive end using the primer described in any of the above, and is an antisense strand of template DNA serving as a template.
  • a forward primer having a structure represented by the above formula (1) and a part of the sequence of the sense strand of the template DNA, which is complementary to a part of the sequence of the above formula (1).
  • a reverse primer having the structure shown in (1), a forward-side extension strand in which the forward primer is extended by performing a polymerase chain reaction (PCR) for a plurality of cycles using the template DNA as a template, and a reverse-side extension strand in which the reverse primer is extended.
  • PCR polymerase chain reaction
  • Amplification means for generating double-stranded DNA having a recessed 3'end by annealing the forward-side extension strand and the reverse-side extension strand, and cleno at the 3'end of the double-stranded DNA.
  • a smoothing means having a blunt end with a fragment, and a deprotective cutting means for deprotecting the R 1 to cleave DNA at the structural portion of the formula (1) to form an adhesive end with a protruding 3'end. It is a double-stranded DNA production apparatus characterized by comprising.
  • the present invention is a method for producing double-stranded DNA for producing double-stranded DNA having an adhesive end using the primer described in any of the above, and the antisense strand of the template DNA as a template.
  • a forward primer having a structure represented by the above formula (1) and a part of the sequence of the sense strand of the template DNA, which is complementary to a part of the sequence of the above formula (1).
  • a preparatory step for preparing a reverse primer having the structure shown by, and a plurality of cycles of a polymerase chain reaction (PCR) using the template DNA as a template are performed, and the forward-side stretched strand in which the forward primer is extended and the reverse primer are
  • R 1 is deprotected by cleaving the DNA at the structural part of formula (1), 3' the three sticky ends which end protrudes It is a method for producing double-stranded DNA, which comprises a deprotection cutting step of DNA.
  • R 1 is a photodegradable protecting group represented by the formula (2A), and the deprotection cutting step deprotects R 1 by light irradiation.
  • R 1 is a fluoride-degradable protecting group represented by the formula (2B), and the deprotection cutting step deprotects R 1 with fluoride.
  • a primer that can specifically cleave a single strand at a specific site and can be produced at low cost. Further, according to the present invention, it is possible to provide an apparatus for producing double-stranded DNA having an adhesive end and a method for producing double-stranded DNA using such a primer.
  • the primer of the present invention is a primer used for amplification of nucleic acid and has a structure represented by the following formula (1).
  • a 1 indicates -S-, -S-S-, or -Se-
  • B indicates a base
  • R 1 indicates a degradable protecting group. * Indicates the binding of an adjacent nucleotide to the sugar. Means a hand.
  • the bonds * the bond on the 3'side of the formula (1) binds to the 5'carbon of the sugar of the adjacent nucleotide on the 3'side, and the bond on the 5'side is on the 5'side. It binds to the 3'carbon of the sugar of the adjacent nucleotide.
  • B is a base, and specifically, in the case of a DNA primer, it is selected from adenine, guanine, cytosine, and thymine, and in the case of an RNA primer, it is selected from adenine, guanine, cytosine, and uracil.
  • the degradable protecting group of R 1 means a protecting group (substituent) that is decomposed by some treatment.
  • the treatment referred to here include light irradiation treatment, reduction treatment, alkali treatment, acid treatment, oxidation treatment, desilylation treatment, heat treatment, esterase treatment, phosphatase treatment and the like.
  • R 1 is a photodegradable protecting group represented by the following formula (2A).
  • a 2 indicates an alkylene group having 1 to 3 carbon atoms
  • a 3 indicates an alkylene group having 1 to 3 carbon atoms. * Means a bond with A 1.
  • alkylene group having 1 to 3 carbon atoms examples include a methylene group, an ethylene group, and a propylene group.
  • R 1 is a 2-nitrobenzyloxymethyl group represented by the following formula (3A).
  • R 1 is a fluoride-degradable protecting group (silyl-based protecting group) represented by the following formula (2B).
  • a 4 represents an alkylene group having 1 to 3 carbon atoms
  • R 2 to R 4 represents an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms in a straight chain or a branched chain
  • R 2 to R 4 are identical to each other. may be different even. * means a bond to a 1.
  • alkyl group having 1 to 4 carbon atoms in the linear or branched chain examples include a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, an isopropyl group, an n-butyl group, a sec-butyl group, an isobutyl group and a tert-butyl group. be able to.
  • R 1 is a triisopropylsilyloxymethyl group represented by the following formula (3B).
  • degradable protecting group that can be eliminated from the modified base by acid treatment include a trityl group.
  • degradable protecting group that can be eliminated from the modified base by the oxidation treatment include an allyloxymethyl group, a dimethoxybenzyloxymethyl group, and a trimethoxybenzyloxymethyl group.
  • Examples of the degradable protecting group that can be desorbed from the modified base by the desilylation treatment include t-butyldimethoxysilyloxymethyl group and t-butyldiphenylsilyloxymethyl group.
  • Examples of the degradable protecting group that can be desorbed from the modified base by heat treatment include an isocyanate group.
  • Examples of the degradable protecting group that can be eliminated from the modified base by esterase treatment include an acetoxymethyl group.
  • Examples of the degradable protecting group that can be eliminated from the modified base by phosphatase treatment include a methyl phosphate group.
  • the primer of the present invention is a single-stranded DNA or single-stranded RNA particularly preferably used in PCR, and is an oligonucleotide or polynucleotide having a structure represented by the above formula (1) in the molecule.
  • the number of base pairs of the primer can be appropriately set according to the sequence of the target DNA or the like, but is generally 20 base pairs or less for oligonucleotides and more than 20 base pairs for polynucleotides.
  • the upper limit of the number of base pairs of the polynucleotide is not particularly limited, but as a commonly used primer, for example, 40 base pairs or less is preferable.
  • the lower limit of the number of base pairs of the oligonucleotide is not particularly limited as long as it can be used as a primer, but for a commonly used primer, for example, 5 base pairs or more is preferable.
  • the primer of the present invention synthesizes a modified nucleoside having the structure of the following formula (4) (hereinafter, may be referred to as a "nucleoside derivative"), and an unmodified nucleotide is added thereto by a phosphoramidite method or the like. It can be produced by linking by a solid phase synthesis method.
  • a 1 and R 1 are as defined by the above formula (1), and B means a base or a modified base.
  • a nucleoside (adenosine in the following team) is prepared as a starting material (Compound 1).
  • the nucleoside is reacted with 1,3-dichloro-1,1,3,3-tetraisopropyldisiloxane in a solvent such as pyridine.
  • a solvent such as pyridine.
  • a cyclic structure of a siloxane bond is formed between the 3'hydroxyl group and the 5'hydroxyl group of the ribose, and the hydroxyl groups at the 3'and 5'positions are protected (Compound 2).
  • N-phenyltrifluoromethanesulfonimide is added, and a nucleophile such as N, N-dimethyl-4-aminopyridine (DMAP) is reacted in a solvent such as dichloromethane (DCM) to cause ribose.
  • DMAP N, N-dimethyl-4-aminopyridine
  • DCM dichloromethane
  • the 2'position of is a trifluorosulfonic acid group (Compound 3).
  • a compound having a thiol group such as potassium thioacetate is reacted in the presence of N, N-dimethylformamide (DMF) or the like to form a thioester at the 2'position of the ribose (Compound 4). ..
  • the thioester group is converted into a thiol group by reacting in an ammonia / methanol solution (Compound 5).
  • TBAF tetra-n-butylammonium fluoride
  • THF tetrahydrofuran
  • the nucleoside derivative is modified in order to produce a primer by linking another nucleotide to the nucleoside derivative by the phosphoramidite method.
  • DMTrCl 4,4'-dimethoxytrityl chloride
  • pyridine pyridine
  • 2-cyanoethyl N, N-diisopropylchlorophosphoramidite is added to THF and DIPEA to bind phosphoramidite to the 3'hydroxyl group of ribose (Compound 10).
  • a primer is synthesized by solid-phase synthesis of nucleotides so as to have a desired sequence by a conventional method.
  • the synthesis scheme up to compound 4 is the same as in the case of synthesis of the nucleoside derivative 1 described above.
  • a fluorine compound such as 3HF-Et 3 N (anhydrous hydrogen fluoride (HF), triethylamine (Et 3 N) having a molar ratio of 3: 1) and THF were added to the 3'position of the ribose.
  • the protecting group at the 5'position are eliminated to form a hydroxyl group (Compound 11).
  • DMTrCl and pyridine are added to attach a 4,4'-dimethoxytrityl chloride group to the 5'hydroxyl group of ribose (Compound 12).
  • silane compound such as chloromethoxytriisopropylsilane (TOMCl) is reacted in the presence of ammonia methanol (NH 3- MeOH), DMF, etc. to place a triisopropylsilyloxymethyl group at the 2'position of the ribose. Bind (Compound 13).
  • the nucleoside derivative is modified in order to produce a primer by linking another nucleotide to the nucleoside derivative by the phosphoramidite method.
  • chlorotrimethylsilane (TMSCl), BzCl, and pyridine are added to bond a benzoyl group to the amino group of the base and trimethylsilane to the 3'hydroxyl group of ribose (Compound 14).
  • HF and pyridine are reacted to make the 3'position of ribose a hydroxyl group (Compound 15).
  • phosphoramidite is bound to the 3'hydroxyl group of ribose (Compound 16).
  • the synthesis scheme up to compound 3 is the same as in the case of synthesis of the nucleoside derivative 1 described above.
  • dip-toroil selenide, piperidine, and DIPEA are reacted in a solvent such as DMF (Compound 17).
  • piperidine, air (Air), NaBH4, 2-nitrobenzylchloromethyl ester are reacted in a solvent such as DMF to bind a sereno compound having a photodegradable protecting group at the 2'position of the ribose. (Compound 18).
  • a primer is produced by linking another nucleotide to the nucleoside derivative by the phosphoramidite method. This is also processed in the same manner as the synthesis scheme of the nucleoside derivative 1, and the compound 21 and the compound 22 are sequentially synthesized.
  • the device for producing double-stranded DNA of the present invention is a device for having an adhesive end using the primer of the present invention.
  • the method for producing double-stranded DNA of the present invention is a method of using a template DNA containing a target DNA sequence and having an adhesive end using the primer of the present invention.
  • the forward primer is complementary to a part of the sequence of the antisense strand of the template DNA and has a structure represented by the formula (1).
  • the reverse primer is complementary to a part of the sequence of the sense strand of the template DNA and has a structure represented by the formula (1).
  • the forward primer and the reverse primer are sequenced so as to sandwich the target DNA sequence to be amplified.
  • the position of the nucleotide having the degradable protecting group of the formula (1) in the primer is 5 of the nucleotide on the most 5'terminal side on the 5'depressed side in the target adhesion terminal sequence ((d) in the figure). 'Design so that it is adjacent to the side. That is, the nucleotide on the 3'side adjacent to the nucleotide having the structure of the formula (1) becomes the nucleotide at the 5'end of the adhesive end.
  • Other reagents include polymerases (such as Taq polymerase), buffers, and dNTPs used for PCR.
  • the sequence of the template DNA is amplified using a PCR device (amplification means) (amplification step).
  • the PCR device performs a polymerase chain reaction (PCR) for a plurality of cycles using the template DNA as a template to generate a forward-side extension strand in which the forward primer is extended and a reverse-side extension strand in which the reverse primer is extended.
  • PCR polymerase chain reaction
  • a double-stranded DNA ((b) in the figure) in which the 3'end is depressed is generated by annealing the extension strand on the reverse side.
  • PCR the sequence of template DNA is amplified by repeating heat denaturation, annealing, and elongation reaction. Although it depends on the PCR conditions, heat denaturation is performed at about 95 ° C. for 1 to 3 minutes, annealing is performed at Tm ⁇ 5 ° C. of the primer, and extension reaction is performed at 1 to 10 minutes.
  • the number of PCR cycles is not particularly limited, but is generally about 24 to 40 cycles.
  • the PCR amplification product contains double-stranded DNA with a depressed 3'end. This is because the degradable protecting group of the formula (1) inhibits the polymerase reaction and stops the reaction when the complementary strand is synthesized using the primer as a template.
  • the depressed 3'end is made a smooth end by a Fill-in reaction by a Klenow fragment (smoothing means) (smoothing step).
  • a Klenow fragment smoothing means
  • the reagent for this reaction include dNPT and buffer in addition to Klenow Fragment (enzyme).
  • the conditions of the Fill-in reaction can be appropriately set, and the enzyme is inactivated at, for example, 37 ° C. for 10 to 30 minutes and then at 70 ° C. for 10 minutes.
  • the predetermined treatment is a treatment for deprotecting R 1, and examples thereof include the above-mentioned light irradiation treatment and reduction treatment.
  • linker A 1 forms a heterocycle consisting of the 2'carbon, 3'carbon and three-membered rings of ribose (eg, the thiirane ring if A 1 is sulfur), which cleaves the phosphate bond of the 3'carbon.
  • ribose eg, the thiirane ring if A 1 is sulfur
  • Examples of the light irradiation treatment include a method of irradiating light having a wavelength of 300 to 400 nm for 1 to 30 minutes with a light source device (deprotection cutting means).
  • a method of treating with fluoride ions such as tetra-n-butylammonium fluoride (TBAF) at 70 to 80 ° C. for 1 to 30 minutes can be mentioned.
  • fluoride ions such as tetra-n-butylammonium fluoride (TBAF) at 70 to 80 ° C. for 1 to 30 minutes
  • TBAF tetra-n-butylammonium fluoride
  • the single-stranded DNA on the 5'end side containing the nucleoside of the primer formula (1) is cleaved, and a double-stranded DNA having a 3'protruding end (5'depressed end) can be synthesized.
  • deprotection and single-strand DNA cleavage are performed using a device that de
  • the adhesive end can be freely designed without using restriction enzymes or the like, DNA having a desired sequence can be freely linked.
  • the sequences of both the target DNA and the vector are designed, and a common adhesive end is formed between them by deprotection cleavage treatment, and ligation is performed to prepare a recombinant DNA, which is cloned, a library is created, and a large amount It can be used for constructing an expression system.
  • a genome build-up reaction can be performed in vitro by linking a plurality of genome sequences having adhesive ends.
  • a genome build-up reaction can be performed intracellularly by introducing double-stranded DNA into the cell in a blunt-ended state and performing deprotective cleavage treatment inside the cell.
  • the present invention will be specifically described based on examples, but these do not limit the object of the present invention. Further, in the following examples, the “%” display is based on mass (mass percent) unless otherwise specified.
  • N 6 -benzoyl-9- [2-deoxy-2- (2-nitrobenzyloxymethyl) thio- ⁇ -D-arabinofuranosyl] adenine (Compound 8) TBAF (1M in THF, 1.2 mL) was added to a solution of compound 7 (0.47 g, 0.59 mmol) in THF (5 mL), and the mixture was stirred at room temperature for 1.5 hours. The reaction mixture was concentrated in vacuo and the resulting residue was purified by silica gel chromatography (CH 2 Cl 2 / EtOAc, 50/1 to 20 / 1v / v) to compound 8 (0.33 g, 0.59 mmol, Quantitative) was obtained.
  • FIG. 2 is a diagram showing an experiment showing that the cleavage reaction of oligonucleotides containing photo-cutting analogs depends on light irradiation and heating.
  • (a) is a chemical formula showing the 20-base-long oligonucleotide sequence used, the structure, and the expected reaction mechanism, and (F) shows modification with a fluorescein group.
  • (B) of this figure is the result of the modified polynucleotide gel electrophoresis analysis of the cleavage reaction, and (c) shows the quantitative result of the cleavage reaction product calculated from the electrophoresis result shown in (b). It is a graph.
  • Oligonucleotide (5'fluorescein-d (ACGACTCA * CATAGGGCGAA), 1 ⁇ M) 10 mM Tris-HCl (pH 8.5), 50 mM It was mixed in a buffer solution containing MgCl 2 , 10 mM dithioslate (DTT).
  • oligonucleotide 10 mM Tris-HCl (pH 8.5), 50 mM MgCl 2 , 10 mM DTT (40 ⁇ L) was irradiated with 365 nm light for 5 minutes at a light intensity of 4 mW / cm 2 , and heated at 72 ° C. for 5 minutes.
  • the sample was desalted and concentrated using a ZipTip ⁇ -C18 resin-filled pipette tip, and MALDI-TOF molecular weight analysis was performed by ultraflex III (Bruker Daltonics). 3-Hydroxypicolinic acid was used as the matrix.
  • the table below shows the detection results of the raw material oligonucleotide (i) shown in (a) of the figure, its deprotected rear body (ii, iii), and the cleavage product (iv, v) by the MALDI-TOF MS method.
  • FIG. 1 shows a method for producing a GFP expression vector using a photocleaving analog.
  • a PCR reaction is carried out using pET21d and pAcGFP1 as templates to obtain a vector fragment and an insert fragment, respectively.
  • Escherichia coli is transformed with a mixture of both to obtain a ligation product as plasmid DNA. The details will be described below.
  • the vector side fragment was prepared as follows. Reaction solution [0.5 ⁇ M primer chains (pET21d_Fw and pET21d_Rev, Table 2), 0.8 ng / ⁇ L pET21d (Novagen), 1 ⁇ PCR Buffer for KOD-Plus-Neo, 1.5 mM 0075 4 , 0.2 mM dNTPs, 0.02 U / ⁇ L KOD-Plus-Neo (Toyobo)] at Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler (95 ° C, 30 seconds ⁇ 50 ° C, 30 seconds ⁇ 72 ° C, 3 minutes) / cycle, 30 cycles Prepared under conditions.
  • Reaction solution 0.5 ⁇ M primer chains (pET21d_Fw and pET21d_Rev, Table 2), 0.8 ng / ⁇ L pET21d (Novagen), 1 ⁇ PCR Buffer for KOD-Plus-Neo, 1.5 mM 0075 4 , 0.2 mM
  • DNA was recovered by centrifugation (20,000 ⁇ g, 20 minutes).
  • the PCR product of interest was purified by agarose gel electrophoresis (0.8% Agarose S (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) including GelRed (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)).
  • DNA was extracted from the excised gel pieces using Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega) (yield 1.27 ⁇ g DNA).
  • the insert side fragment was prepared as follows. Reaction solution [0.5 ⁇ M primer chain (pAcGFP1_Fw and pAcGFP1_Rev, Table 2), 0.8 ng / ⁇ L pAcGFP1 (Takarabio), 1 ⁇ PCR Buffer for KOD-Plus-Neo, 1.5 mM 0073 4 , 0.2 mM dNTPs, 0.02 U / ⁇ L KOD-Plus-Neo)] at Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler (95 ° C, 30 seconds ⁇ 55 ° C, 30 seconds ⁇ 72 ° C, 1 minute) / cycle, 30 cycles. Prepared.
  • DNA was recovered by centrifugation (20,000 ⁇ g, 20 minutes).
  • the PCR product of interest was purified by agarose gel electrophoresis (1.5% Agarose S (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) including GelRed (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)). DNA was extracted from the cut gel pieces using Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega) (yield 5.33 ⁇ g DNA).
  • the post-cleaving PCR primer sequences are shown in the table below. A * in the array indicates a photocut analog (Fig. 2).
  • Vector fragment solution (6 ng / ⁇ L DNA, 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 5 mM MgCl 2 , 10 mM DTT) and insert fragment solution (8.4 ng / ⁇ L DNA, 10 mM Tris-HCl (pH 7.5)), 5 mM MgCl 2 and 10 mM DTT) were added to the wells of the 96-well multi-well plate by 50 ⁇ L each, and 365 nm light was irradiated at about 4 mW / cm 2 for 5 minutes by a handy UV lamp (Funakoshi). Subsequently, the two solutions were collected in one 1.5 mL tube and heated at 72 ° C. for 10 minutes.
  • Fluorine cutting analog 2-1 Synthesis of Fluorine-Cut Analog (A **) The synthesis scheme of Fluorine-Cut Analog is shown below. Hereinafter, the procedure for synthesizing the fluorine-cutting analog will be described according to this synthesis scheme.
  • oligonucleotides were synthesized using a DNA synthesizer based on the phosphoramidite method. 6-FAM amidite (Chemgenes) was used for the fluorescent label at the 5'end. The synthesized amidite of each cleaved analog was prepared into an acetonitrile solution having a final concentration of 50 mM and introduced into the DNA primer using a DNA synthesizer. Deprotection was performed according to a conventional method, each DNA was purified by 20% PAGE, and the structure was confirmed using MALDI-TOF / MS (Bruke). The sequence of the synthesized DNA is shown in the table below.
  • FIG. 4 shows a photograph of the electrophoresis gel. As shown in this figure, it can be seen that the oligonucleotide was cleaved by the cleaving reaction.
  • the resulting sample was diluted 2-fold with formamide loading solution (80 (v / v)% formamide, 50 mM EDTA (pH 8.0)) and then subjected to 15% modified polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) containing 7.5 M urea. ). Oligonucleotides in the gel were stained with SYBR Green II Nucleic Acid Gel Stein and detected using the ChemiDoc XRS + Imaging System (Bio-Rad). The results are shown in FIG. From this result, a cleavage product was observed in the buffer solution by light irradiation for 10 minutes at room temperature.

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Abstract

核酸の増幅に使用されるプライマーであって、下記式（１）で示される構造を有するプライマーである。（ここで、Ａ１は－Ｓ－、－Ｓ－Ｓ－、又は－Ｓｅ－を示し、Ｂは塩基を示し、Ｒ１は分解性保護基を示す。＊は隣接するヌクレオチドの糖との結合手を意味する。）。また、式（１）で示される構造を有するフォワードプライマー及びリバースプライマーと、テンプレートＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを複数サイクル行って３'末端が陥没した二本鎖ＤＮＡを生成するＰＣＲ装置と、３'末端を平滑末端とするクレノウフラグメントと、Ｒ１を脱保護して３'末端が突出した接着末端を形成する光照射手段と、を備える二本鎖ＤＮＡの製造装置である。

Description

プライマー及びこれを用いた二本鎖ＤＮＡの製造装置並びに二本鎖ＤＮＡの製造方法
　本発明は、プライマー及びこれを用いた二本鎖ＤＮＡの製造装置並びに二本鎖ＤＮＡの製造方法に関する。
　分子生物学などの分野では、遺伝子組み換えや形質転換などを行うために、標的ＤＮＡをホストに組み込んだベクターが用いられている。一般に、標的ＤＮＡは、量が少ない場合はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅して使用される。ＰＣＲでは、標的ＤＮＡ配列を含むテンプレートＤＮＡを使用し、これに相補的に結合するプライマーを用いて熱変性とアニーリングを複数サイクル繰り返すことでテンプレートＤＮＡを増幅している。
　ＰＣＲで増幅されたテンプレートＤＮＡの増幅産物は、そのままでは平滑末端であり、これをプラスミドＤＮＡなどのホストＤＮＡと結合（ライゲーション）させるための処理をする必要がある。一般に、そのような処理として、特定の配列を切断する制限酵素を使用するが、この方法では、結合できるＤＮＡが制限酵素の切断部位の配列に依存するため、汎用性に乏しいという問題がある。
　制限酵素を用いない方法として、増幅産物の３’末端及び５’末端を接着末端（粘着末端、突出末端などともいう）とし、ホスト側も同様に接着末端を形成して両者をライゲーションしてベクターを構築する技術がある。例えば、近年では、Ｇｉｂｓｏｎ　ａｓｓｅｍｂｌｙ法、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ法、ＳＬｉＣＥ法などが知られている。これらの方法では、いずれも二本鎖ＤＮＡ断片末端に１５ｂｐ程度の相同配列を持たせ、二本鎖中の片側の鎖をエキソヌクレアーゼ活性で消化し、接着末端を生じさせたのちに連結する。なお、Ｇｉｂｓｏｎ　ａｓｓｅｍｂｌｙ法ではｉｎ　ｖｉｔｒｏでＴａｑ　ＤＮＡ　ｌｉｇａｓｅを用いて連結し、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ法では大腸菌内の修復システムを利用して連結する。
　これらの方法では、酵素であるエキソヌクレアーゼを使用するため、コストがかかるほか、反応条件等によって部位特異性に劣ることがあり、定量的な接着末端形成が困難であるため、連結反応の効率が低いという問題があった。このため、酵素を使用しないシームレスクローニング法が求められていた。
　そこで、化学的手法により接着末端を有するＤＮＡを調製する方法が開発され、そのためのＰＣＲ用のプライマーとして、特許文献１に記載されたものが知られている。この文献のプライマーは、非相補ＤＮＡ部分の塩基配列中の３’末端に相当する塩基が保護基で修飾されている。この保護基は、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ複製の進行を停止させる機能を有しており、光照射処理やアルカリ処理などによって被修飾塩基から脱離しうる。また、本文献では、保護基（置換基）を生体分子に導入するための置換基導入剤を用いて塩基に保護基をプライマーの塩基に導入している。
国際公開第２００９／１１３７０９号（請求項１、請求項２など）
　特許文献１では、保護基の部分でＤＮＡ複製の進行を停止するが、特定の部位で一本鎖ＤＮＡを切断して接着末端を生成するものではないため、部位特異性が低い。また、例えばＤＮＡでは塩基はアデニン、グアニン、シトシン、チミンの４種類あるが、特許文献１では塩基に保護基を導入しているため、塩基の種類に応じた方法で保護基を導入する必要があり、プライマーの製造に手間やコストがかかっていた。
　本発明の目的は、特定の部位で一本鎖を特異的に切断可能で、かつ安価に製造することが可能なプライマーを提供することにある。また、本発明の他の目的は、このようなプライマーを用いた、接着末端を有する二本鎖ＤＮＡの製造装置及び二本鎖ＤＮＡの製造方法を提供することにある。
　本発明者らは、上記問題を解決すべく鋭意研究を重ねた。その結果、ヌクレオシドの糖の部分に特定のリンカーを介して分解性保護基を導入したプライマーを開発した。そして、その保護基を分解することでそのヌクレオシドの部分で一本鎖を切断することで、接着末端を有する二本鎖ＤＮＡを作製することできることを見出し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は、核酸の増幅に使用されるプライマーであって、下記式（１）で示される構造を有することを特徴とするプライマーである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 （ここで、Ａ１は－Ｓ－、－Ｓ－Ｓ－、又は－Ｓｅ－を示し、Ｂは塩基を示し、Ｒ１は分解性保護基を示す。＊は隣接するヌクレオチドの糖との結合手を意味する。）
　この場合において、前記Ｒ１が下記式（２Ａ）で示される光分解性保護基であることが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 （ここで、Ａ２は炭素数１～３のアルキレン基を示し、A３は炭素数１～３のアルキレン基を示す。＊はＡ１との結合手を意味する。）
　さらに、前記Ｒ１が下記式（３Ａ）で示される２－ニトロベンジルオキシメチル基であることが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
　あるいはまた、前記Ｒ１が下記式（２Ｂ）で示されるフッ化物分解性保護基であることが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 （ここで、Ａ４は炭素数１～３のアルキレン基を示し、Ｒ２～Ｒ４は直鎖又は分岐鎖の炭素数１～４のアルキル基を示し、Ｒ２～Ｒ４は互いに同一であっても異なってもよい。＊はＡ１との結合手を意味する。）
　この場合において、前記Ｒ１が下記式（３Ｂ）で示されるトリイソプロピルシリルオキシメチル基であることが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
　また、本発明は、上記のいずれかに記載のプライマーを用いて接着末端を有する二本鎖ＤＮＡを製造するための二本鎖ＤＮＡの製造装置であって、鋳型となるテンプレートＤＮＡのアンチセンス鎖の一部の配列と相補的であり、かつ前記式（１）で示される構造を有するフォワードプライマーと、前記テンプレートＤＮＡのセンス鎖の一部の配列と相補的であり、かつ前記式（１）で示される構造を有するリバースプライマーと、前記テンプレートＤＮＡを鋳型としてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を複数サイクル行い、前記フォワードプライマーが伸長したフォワード側伸長鎖と、前記リバースプライマーが伸長したリバース側伸長鎖とを生成し、前記フォワード側伸長鎖と前記リバース側伸長鎖とをアニーリングして３’末端が陥没した二本鎖ＤＮＡを生成する増幅手段と、前記二本鎖ＤＮＡの前記３’末端をクレノウフラグメントにより平滑末端とする平滑化手段と、前記Ｒ１を脱保護して前記式（１）の構造部分でＤＮＡを切断し、３’末端が突出した接着末端を形成する脱保護切断手段と、を備えることを特徴とする二本鎖ＤＮＡの製造装置である。
　さらに、本発明は、上記のいずれかに記載のプライマーを用いて接着末端を有する二本鎖ＤＮＡを製造するための二本鎖ＤＮＡの製造方法であって、鋳型となるテンプレートＤＮＡのアンチセンス鎖の一部の配列と相補的であり、かつ前記式（１）で示される構造を有するフォワードプライマーと、前記テンプレートＤＮＡのセンス鎖の一部の配列と相補的であり、かつ前記式（１）で示される構造を有するリバースプライマーと、を準備する準備工程と、前記テンプレートＤＮＡを鋳型としてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を複数サイクル行い、前記フォワードプライマーが伸長したフォワード側伸長鎖と、前記リバースプライマーが伸長したリバース側伸長鎖とを生成し、前記フォワード側伸長鎖と前記リバース側伸長鎖とをアニーリングして３’末端が陥没した二本鎖ＤＮＡを生成する増幅工程と、前記二本鎖ＤＮＡの前記３’末端をクレノウフラグメントにより平滑末端とする平滑化工程と、前記Ｒ１を脱保護して前記式（１）の構造部分でＤＮＡを切断し、３’末端が突出した接着末端を形成する脱保護切断工程と、を備えることを特徴とする二本鎖ＤＮＡの製造方法である。
　この場合において、前記Ｒ１が前記式（２Ａ）で示される光分解性保護基であり、脱保護切断工程は光照射により前記Ｒ１を脱保護することが好ましい。
　あるいは、前記Ｒ１が前記式（２Ｂ）で示されるフッ化物分解性保護基であり、脱保護切断工程はフッ化物により前記Ｒ１を脱保護することが好ましい。
　本発明によれば、特定の部位で一本鎖を特異的に切断可能で、かつ安価に製造することが可能なプライマーを提供することが可能となる。また、本発明によれば、このようなプライマーを用いた、接着末端を有する二本鎖ＤＮＡの製造装置及び二本鎖ＤＮＡの製造方法を提供することが可能となる。
接着末端を有する二本鎖ＤＮＡの製造方法及び製造装置を示す模式図である。 光切断アナログを含むオリゴヌクレオチドの切断反応の実験を示す図である。 光切断反応による接着末端形成を利用したクロ－ニング反応の実験を示す図である。 光切断アナログを含むオリゴヌクレオチド切断反応の実験結果を示す図である。 フッ素切断アナログを含むオリゴヌクレオチドの切断反応の実験結果を示す図である。
１．プライマー
　以下、本発明のプライマーについて説明する。本発明のプライマーは、核酸の増幅に使用されるプライマーであって、下記式（１）で示される構造を有する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
 （ここで、Ａ１は－Ｓ－、－Ｓ－Ｓ－、又は－Ｓｅ－を示し、Ｂは塩基を示し、Ｒ１は分解性保護基を示す。＊は隣接するヌクレオチドの糖との結合手を意味する。）。なお、結合手＊のうち、式（１）の３’側の結合手は、３’側において隣接するヌクレオチドの糖の５’炭素に結合し、５’側 の結合手は、５’側において隣接するヌクレオチドの糖の３’炭素に結合する。
　Ｂは塩基であり、具体的には、ＤＮＡプライマーの場合はアデニン、グアニン、シトシン、チミンから選択され、ＲＮＡプライマーの場合はアデニン、グアニン、シトシン、ウラシルから選択される。
　Ｒ１の分解性保護基とは、何らかの処理により分解する保護基（置換基）を意味する。ここでいう処理としては、光照射処理、還元処理、アルカリ処理、酸処理、酸化処理、脱シリル化処理、熱処理、エステラーゼ処理、ホスファターゼ処理などを挙げることができる。
（１）光分解性保護基
　処理が光照射である場合、Ｒ１が下記式（２Ａ）で示される光分解性保護基であることが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
 （ここで、Ａ２は炭素数１～３のアルキレン基を示し、A３は炭素数１～３のアルキレン基を示す。＊はＡ１との結合手を意味する。）
　炭素数１～３のアルキレン基としては、メチレン基、エチレン基、プロピレン基を挙げることができる。
　特に、Ｒ１が下記式（３Ａ）で示される２－ニトロベンジルオキシメチル基であることが好適である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
（２）フッ化物分解性保護基（シリル系保護基）
　処理が還元処理の場合、Ｒ１が下記式（２Ｂ）で示されるフッ化物分解性保護基（シリル系保護基）であることが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
 （ここで、Ａ４は炭素数１～３のアルキレン基を示し、Ｒ２～Ｒ４は直鎖又は分岐鎖の炭素数１～４のアルキル基を示し、Ｒ２～Ｒ４は互いに同一であっても異なってもよい。＊はＡ１との結合手を意味する。）
　直鎖又は分岐鎖の炭素数１～４のアルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基を挙げることができる。
　特に、Ｒ１が下記式（３Ｂ）で示されるトリイソプロピルシリルオキシメチル基であることが好適である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
（３）その他の分解性保護基
　アルカリ処理により被修飾塩基から脱離し得る分解性保護基としては、イソブチリル基、ベンゾイル基、アセトキシメチル基などを挙げることができる。酸処理により被修飾塩基から脱離し得る分解性保護基としては、トリチル基を挙げることができる。酸化処理により被修飾塩基から脱離し得る分解性保護基としては、アリルオキシメチル基、ジメトキシベンジルオキシメチル基、トリメトキシベンジルオキシメチル基などを挙げることができる。脱シリル化処理により被修飾塩基から脱離し得る分解性保護基としては、ｔ－ブチルジメトキシシリルオキシメチル基、ｔ－ブチルジフェニルシリルオキシメチル基などを挙げることができる。熱処理により被修飾塩基から脱離し得る分解性保護基としては、イソシアネート基を挙げることができる。エステラーゼ処理により被修飾塩基から脱離し得る分解性保護基としては、アセトキシメチル基を挙げることができる。ホスファターゼ処理により被修飾塩基から脱離し得る分解性保護基としては、リン酸メチル基を挙げることができる。
　本発明のプライマーは、特にＰＣＲで好適に使用される一本鎖ＤＮＡ又は一本鎖ＲＮＡであり、上記式（１）で示される構造を分子内に有するオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドである。プライマーの塩基対の数は、標的ＤＮＡなどの配列等に応じて適宜設定することができるが、一般にオリゴヌクレオチドでは例えば２０塩基対以下、ポリヌクレオチドでは例えば２０塩基対超である。ポリヌクレオチドの塩基対の数の上限としては特に制限はないが、一般的に使用されるプライマーとしては例えば４０塩基対以下が好ましい。また、オリゴヌクレオチドの塩基対の数の下限としては、プライマーとして使用できる長さであれば特に制限はないが、一般的に使用されるプライマーとしては例えば５塩基対以上が好ましい。
２．プライマーの製造方法
　本発明のプライマーは、下記式（４）の構造を有する修飾ヌクレオシド（以下、「ヌクレオシド誘導体」ということがある）を合成し、これに非修飾のヌクレオチドをホスホロアミダイト法などの固相合成法で連結することで製造することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
 （ここで、Ａ１、Ｒ１は上記式（１）で定義したとおりであり、Ｂは塩基又は修飾塩基を意味する。）
　プライマーの合成方法の概要としては、まずヌクレオシドの３’ヒドロキシル基と５’ ヒドロキシル基を保護し、２’ヒドロキシル基をリンカー元素Ａ１で置換し、このＡ１に分解性保護基Ｒ１を結合させたのち、３’ヒドロキシル基と５’ ヒドロキシル基を脱保護する。その後、ホスホロアミダイトなどを反応させ、固相合成法で非修飾のヌクレオチドを連結させてプライマーを合成する。以下、実施例に掲載したいくつかのプライマーの具体的な製造方法について詳細に説明する。
（ａ）光分解性保護基を有するヌクレオシド誘導体１（※Ａ１が－Ｓ－基、Ｒ１が２－ニトロベンジルオキシメチル基の化合物）及びプライマーの合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
　上記の合成スキ－ムに沿って説明する。以下で説明する合成スキ－ムにおいて、数字は化合物の番号を表す。まず、ヌクレオシド（下記スキ－ムではアデノシン）を出発物質として用意する（化合物１）。次に、ヌクレオシドに１，３－ジクロロ－１，１，３，３－テトライソプロピルジシロキサンをピリジンなどの溶媒中で反応させる。これにより、リボ－スの３’ヒドロキシル基と５’ヒドロキシル基との間でシロキサン結合の環状構造を形成させ、３’位と５’位のヒドロキシル基を保護する（化合物２）。
　次に、Ｎ－フェニルトリフルオロメタンスルホンイミドを添加して、Ｎ，Ｎ－ジメチル－４－アミノピリジン（ＤＭＡＰ）などの求核剤をジクロロメタン（ＤＣＭ）などの溶媒中で反応させて、リボ－スの２’位をトリフルオロスルホン酸基とする（化合物３）。次に、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）などの存在下でチオ酢酸カリウムなどのチオ－ル基を有する化合物を反応させて、リボ－スの２’位にチオエステルを形成させる（化合物４）。さらにアンモニア／メタノ－ル溶液中で反応させることでチオエステル基をチオ－ル基に変換する（化合物５）。
　続いて、２－ニトロベンジルクロロメチルエステル、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）を添加して、分解性保護基である２－ニトロベンジルオキシメチル基をチオールに結合させる（化合物６）。さらに、塩化ベンゾイル（ＢｚＣｌ）、ピリジンを添加し、塩基のアミノ基にベンゾイル基を結合させる（化合物７）。この状態で、フッ化テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）とテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）とを添加してリボ－スの３’位と５’位の保護基を脱離させてヒドロキシル基にする（化合物８）。このようにしてヌクレオシド誘導体（化合物８）を合成することができる。
　次に、ホスホロアミダイト法によりヌクレオシド誘導体に他のヌクレオチドを連結してプライマーを製造するために、ヌクレオシド誘導体を修飾する。まず、ヌクレオシド誘導体に４，４’－ジメトキシトリチルクロリド（ＤＭＴｒＣｌ）、ピリジンを加え、リボースの５’ヒドロキシル基に４，４’－ジメトキシトリチルクロリド基を結合させる（化合物９）。次に、２－シアノエチルＮ，Ｎ－ジイソプロピルクロロホスホルアミダイトを、ＴＨＦ、ＤＩＰＥＡに添加し、リボースの３’ヒドロキシル基にホスホロアミダイトを結合させる（化合物１０）。その後は常法により、所望の配列となるようにヌクレオチドを固相合成してプライマーを合成する。
（ｂ）フッ素分解性保護基を有するヌクレオシド誘導体３（※Ａ１が－Ｓ－基、Ｒ１がトリイソプロピルシリルオキシメチル基の化合物）及びプライマーの合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
　化合物４までの合成スキームは上記のヌクレオシド誘導体１の合成の場合と同じである。次に、３ＨＦ－Ｅｔ３Ｎ（無水フッ化水素（ＨＦ）、トリエチルアミン（Ｅｔ３Ｎ）のモル比が３：１）などのフッ素化合物と、ＴＨＦとを添加してリボ－スの３’位と５’位の保護基を脱離させてヒドロキシル基にする（化合物１１）。続いて、ＤＭＴｒＣｌ、ピリジンを加え、リボースの５’ヒドロキシル基に４，４’－ジメトキシトリチルクロリド基を結合させる（化合物１２）。次に、アンモニアメタノール（ＮＨ３－ＭｅＯＨ）、ＤＭＦなどの存在下でクロロメトキシトリイソプロピルシラン（ＴＯＭＣｌ）などのシラン化合物を反応させて、リボ－スの２’位にトリイソプロピルシリルオキシメチル基を結合させる（化合物１３）。
　次に、ホスホロアミダイト法によりヌクレオシド誘導体に他のヌクレオチドを連結してプライマーを製造するために、ヌクレオシド誘導体を修飾する。まず、クロロトリメチルシラン（ＴＭＳＣｌ）、ＢｚＣｌ、ピリジンを添加し、塩基のアミノ基にベンゾイル基を、リボースの３’ヒドロキシル基にトリメチルシランを結合させる（化合物１４）。次に、ＨＦ、ピリジンを反応させてリボースの３’位をヒドロキシル基にする（化合物１５）。そして、ヌクレオシド誘導体１の合成の場合と同様に、リボースの３’ヒドロキシル基にホスホロアミダイトを結合させる（化合物１６）。
（ｃ）光分解性保護基を有するヌクレオシド誘導体３（※Ａ１が－Ｓｅ－基、Ｒ１が２－ニトロベンジルオキシメチル基の化合物）及びプライマーの合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
　化合物３までの合成スキームは上記のヌクレオシド誘導体１の合成の場合と同じである。次に、ジ－ｐ－トルオイルセレニド、ピペリジン、ＤＩＰＥＡをＤＭＦ等の溶媒中で反応させる（化合物１７）。さらに、ピペリジン、空気（Ａｉｒ）、ＮａＢＨ４、２－ニトロベンジルクロロメチルエステルを、ＤＭＦ等の溶媒中で反応させて、リボ－スの２’位に光分解性保護基を有するセレノ化合物を結合させる（化合物１８）。
　その後はヌクレオシド誘導体１の合成スキームと同様に処理を行い、化合物１９～２０を順次合成する。さらには、ホスホロアミダイト法によりヌクレオシド誘導体に他のヌクレオチドを連結してプライマーを製造する。これも、ヌクレオシド誘導体１の合成スキームと同様に処理を行い、化合物２１及び化合物２２を順次合成する。
３．接着末端を有する二本鎖ＤＮＡの製造方法及び製造装置
　つぎに、接着末端を有する二本鎖ＤＮＡの製造方法及び製造装置について説明する。本発明の二本鎖ＤＮＡの製造装置は、本発明のプライマーを用いて接着末端を有するための装置である。また、本発明の二本鎖ＤＮＡの製造方法は、標的ＤＮＡ配列を含むテンプレートＤＮＡを使用し、本発明のプライマーを用いて接着末端を有する方法である。以下、図１を参照して説明する。
　まず、試薬としてフォワードプライマーとリバースプライマーを含むＰＣＲ増幅用プライマーセットを準備する（準備工程）。フォワードプライマーは、テンプレートＤＮＡのアンチセンス鎖の一部の配列と相補的であり、かつ式（１）で示される構造を有する。また、リバースプライマーは、テンプレートＤＮＡのセンス鎖の一部の配列と相補的であり、かつ式（１）で示される構造を有する。
　図の（ａ）に示すように、フォワードプライマーとリバースプライマーは、増幅したい標的ＤＮＡ配列を挟むように配列を決定する。また、プライマーにおける式（１）の分解性保護基を有するヌクレオチドの位置は、目的とする接着末端の配列（図の（ｄ））において、５’陥没側における最も５’末端側のヌクレオチドの５’側に隣接する位置となるように設計する。すなわち、式（１）の構造のヌクレオチドに隣接する３’側のヌクレオチドが、接着末端の５’末端のヌクレオチドとなるようにする。その他の試薬としては、ＰＣＲに使用するポリメラーゼ（Ｔａｑポリメラーゼなど）、バッファー、ｄＮＴＰなどである。
　次に、ＰＣＲ装置（増幅手段）を用いてテンプレートＤＮＡの配列を増幅する（増幅工程）。ＰＣＲ装置は、テンプレートＤＮＡを鋳型としてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を複数サイクル行い、フォワードプライマーが伸長したフォワード側伸長鎖と、リバースプライマーが伸長したリバース側伸長鎖とを生成し、フォワード側伸長鎖とリバース側伸長鎖とをアニーリングして３’末端が陥没した二本鎖ＤＮＡ（図の（ｂ））を生成する。　
　ＰＣＲでは、熱変性、アニーリング、伸長反応を繰り返して、テンプレートＤＮＡの配列を増幅する。ＰＣＲの条件にもよるが、熱変性は約９５℃、１～３分間、アニーリングはプライマーのＴｍ±５℃、伸長反応は１～１０分間で行う。ＰＣＲのサイクル数は特に制限はないが、一般に２４～４０サイクル程度である。
　図のように、ＰＣＲ増幅産物には３’末端が陥没した二本鎖ＤＮＡが含まれる。これは、プライマーを鋳型として相補鎖が合成される際に、式（１）の分解性保護基がポリメラーゼ反応を阻害し、反応を停止させるためである。
　次に、図の（ｃ）に示すように、クレノウフラグメント（Ｋｌｅｎｏｗ　Ｆｒａｇｍｅｎｔ：平滑化手段）により、この陥没した３’末端をＦｉｌｌ－ｉｎ反応により平滑末端とする（平滑化工程）。この反応の試薬としては、Ｋｌｅｎｏｗ　Ｆｒａｇｍｅｎｔ（酵素）の他に、ｄＮＰＴ、バッファーなどが挙げられる。Ｆｉｌｌ－ｉｎ反応の条件は適宜設定することができるが、例えば３７℃、１０～３０分間とし、その後７０℃、１０分間で酵素を失活させる。
　その後、図の（ｄ）に示すように、所定の処理によりＲ１を脱保護して式（１）の構造部分で一本鎖ＤＮＡを切断し、３’末端が突出した接着末端を形成する（脱保護切断工程）。所定の処理は、Ｒ１を脱保護するための処理であり、上記の光照射処理、還元処理などを挙げることができる。
　以下、切断メカニズムについて説明する。下記式に示すように、所定の処理を施すと、式（１）の分解性保護基Ｒ１が脱離し、リンカーＡ１に水素が結合する。リンカーＡ１はリボースの２’炭素と３’炭素と三員環からなるヘテロ環（例えば、Ａ１が硫黄の場合はチイラン環）を形成し、これにより３’炭素のリン酸結合が切断される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
　光照射処理としては、例えば、光源装置（脱保護切断手段）により３００～４００ｎｍの波長の光を１～３０分間照射する方法を挙げることができる。また、還元処理としては、例えば、フッ化テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）などのフッ化物イオンを用い、例えば７０～８０℃、１～３０分間処理する方法を挙げることができる。これにより、プライマーの式（１）のヌクレオシドを含む５’末端側の一本鎖ＤＮＡが切断され、３’突出末端（５’陥没末端）を有する二本鎖ＤＮＡを合成することができる。その他の処理についても同様に、分解性保護基を脱保護する装置（脱保護切断装置）を使用して脱保護と一本鎖ＤＮＡの切断を行う。
　本発明では、制限酵素などによらずに自由自在に接着末端を設計することができるため、所望の配列を有するＤＮＡを自由に連結することができる。例えば、標的ＤＮＡとベクターの両方の配列を設計し、脱保護切断処理により両者に共通の接着末端を形成させてライゲーションを行って組換えＤＮＡを調製し、これをクローニングやライブラリーの作成、大量発現系の構築などに使用することができる。また、接着末端を有する複数のゲノム配列を連結することで、試験管内でゲノムビルドアップ反応を行うことができる。あるいは、平滑末端の状態で細胞内に二本鎖ＤＮＡを導入し、細胞内で脱保護切断処理を行うことで、細胞内でゲノムビルドアップ反応を行うこともできる。
　以下、本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが、これらは本発明の目的を限定するものではない。また、以下の実施例において「％」表示は特に規定しない限り質量基準（質量パ－セント）である。
１．光切断アナログ（Ｓ）
１－１．光切断アナログ（Ａ＊）の合成
　以下に光切断アナログの合成スキームを示す。以下、この合成スキームに従って、光切断アナログの合成手順を説明する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
（１）３’，５’－Ｏ－（１，１，３，３－テトライソプロピル－１，３－ジシロキサンジイル）アデノシン（化合物２）
　１，３－ジクロロ－１，１，３，３－テトライソプロピルジシロキサン（３．９ｍＬ、１２．３ｍｍｏｌ）を、ピリジン（１１２ｍＬ）中のアデノシン（化合物１、３．００ｇ、１１．２ｍｍｏｌ）溶液に加え、反応混合物を０℃で１時間撹拌した。その後、反応混合物を室温まで温め、５．５時間撹拌した。溶媒を真空中で蒸発させ、残渣をＨ２Ｏ及びＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。有機相を１Ｍ　ＨＣｌ溶液、飽和ＮａＨＣＯ３溶液、食塩水で洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、真空中で濃縮した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィ－（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ、１００／０～９５／５ｖ／ｖ）で精製し、化合物２（５．４３ｇ、１０．６５ｍｍｏｌ、９５％）を得た。
　１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ６）：δ０．９５－１．０７（ｍ，８Ｈ），３．９２（ｄｄ，Ｊ＝１２．８，２．８Ｈｚ，１Ｈ），３．９７－４．０１（ｍ，１Ｈ），４．０５（ｄｄ，Ｊ＝１２．８，３．２Ｈｚ，１Ｈ），４．５１（ｄ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），４．７９（ｄｄ，Ｊ＝８．８，５．２Ｈｚ，１Ｈ），５．６０（ｂｒｓ，１Ｈ），５．８６（ｄ，Ｊ＝１．２Ｈｚ，１Ｈ），７．３０（ｂｒｓ，２Ｈ），８．０６（ｓ，１Ｈ），８．２０（ｓ，１Ｈ）；ＬＲＭＳ（ＥＳＩ＋）ｃａｌｃ．ｍ／ｚ　５１０．２６（Ｍ＋Ｈ＋），５３２．２４（Ｍ＋Ｎａ＋），ｆｏｕｎｄ　ｍ／ｚ　５１０（Ｍ＋Ｈ＋），５３２（Ｍ＋Ｎａ＋）。
（２）３’，５’－Ｏ－（１，１，３，３－テトライソプロピル－１，３－ジシロキサンジイル）－２’－Ｏ－トリフリル－アデノシン（化合物３）
　Ｎ－フェニルトリフルオロメタンスルホンイミド（４．５７ｇ、１２．８ｍｍｏｌ）を、化合物２（５．４３ｇ、１０．７ｍｍｏｌ）の溶液及びＣＨ２Ｃｌ２（１０６ｍＬ）中のＤＭＡＰ（３．９０ｇ、３２．０ｍｍｏｌ）に０℃で加えた。反応混合物を０℃で１時間、室温で２時間撹拌した。混合物を、冷却した０．１ＭのＡｃＯＨ溶液及びＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。有機相を、飽和ＮａＨＣＯ３溶液及び食塩水で洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、真空中で濃縮した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィ－（ヘキサン／ＥｔＯＡｃ、１／１ｖ／ｖ）で精製して化合物３（４．７６ｇ、７．４２ｍｍｏｌ、６９％）を得た。
　１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）：δ０．９８－１．１１（ｍ，２８Ｈ），３．９４－４．０８（ｍ，３Ｈ），５．３７（ｄｄ，Ｊ＝９．６，５．６Ｈｚ，１Ｈ），６．０８（ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，１Ｈ），６．４５（ｓ，１Ｈ），７．４２（ｂｒ　ｓ，２Ｈ），８．０３（ｓ，１Ｈ），８．２６（ｓ，１Ｈ）；ＬＲＭＳ（ＥＳＩ＋）ｃａｌｃ．ｍ／ｚ６４２．２１（Ｍ＋Ｈ＋），６６４．１９（Ｍ＋Ｎａ＋），ｆｏｕｎｄｍ／ｚ　６４２（Ｍ＋Ｈ＋），６６４（Ｍ＋Ｎａ＋）。
（３）９－［３，５－Ｏ－（１，１，３，３－テトライソプロピル－１，３－ジシロキサンジイル）－２－デオキシ－２－アセチルチオ－β－Ｄ－アラビノフラノシル］アデニン（化合物４）
　化合物３（１．０６ｇ、１．６５ｍｍｏｌ）及びＣＨ３ＣＯＯＳＫ（３０２ｍｇ、２．６４ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（４．１ｍＬ）に溶解し、室温で２０時間撹拌した。反応混合物を飽和ＮａＨＣＯ３溶液及びヘキサン／ＥｔＯＡｃ（１／３ｖ／ｖ）で抽出した。有機相を食塩水で洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、真空中で濃縮した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィ－（ヘキサン／ＥｔＯＡｃ、２／１～１／２ｖ／ｖ）で精製し、化合物４（０．５７ｇ、１．００ｍｍｏｌ、６１％）を得た。
　１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）：δ１．０１－１．１８（ｍ，２８Ｈ），２．１９（ｓ，３Ｈ），３．８９－３．９８（ｍ，２Ｈ），４．１７（ｄｄ，Ｊ＝１１．６，６．４Ｈｚ，１Ｈ），４．６２（ｄｄ，Ｊ＝１０，８．０Ｈｚ，１Ｈ），５．２６（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），６．３９（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．３４（ｂｒ　ｓ，２Ｈ），８．０２（ｓ，１Ｈ），８．１０（ｓ，１Ｈ）；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）　ｃａｌｃ．　ｍ／ｚ　５６８．２４（Ｍ＋Ｈ＋），５９０．２３（Ｍ＋Ｎａ＋），ｆｏｕｎｄ　ｍ／ｚ　５６８．２４６７（Ｍ＋Ｈ＋），５９０．２２８６（Ｍ＋Ｎａ＋）。
（４）９－［３，５－Ｏ－（１，１，３，３－テトライソプロピル－１，３－ジシロキサンジイル）－２－デオキシ－２－チオ－β－Ｄ－アラビノフラノシル］アデニン（化合物５）
　ＭｅＯＨ（２５ｍＬ）中の化合物４（２．１１ｇ、３．７２ｍｍｏｌ）の溶液に、触媒量のナトリウムメトキシドの２８％ＭｅＯＨ溶液を加えた。混合物を室温で４時間撹拌し、Ｈ２Ｏ及びＥｔＯＡｃで抽出した。有機相をＨ２Ｏ及び食塩水で洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、真空中で濃縮して化合物５（１．９６ｇ、３．７２ｍｍｏｌ、ｑｕａｎｔ．）を得た。
　１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ１．０４－１．１４（ｍ，２１Ｈ），１．１８（ｓ，７Ｈ），３．８１－３．９２（ｍ，２Ｈ），４．０６（ｄｄ，Ｊ＝１３．２，　３．２Ｈｚ，１Ｈ），４．２２（ｄｄ，Ｊ＝１３．２，　３．６Ｈｚ，１Ｈ），　４．６０－４．６５（ｍ，１Ｈ），５．６４（ｓ，１Ｈ），６．３８（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），８．１０（ｓ，１Ｈ），８．３４（ｓ，１Ｈ）。
（５）９－［３，５－Ｏ－（１，１，３，３－テトライソプロピル－１，３－ジシロキサンジイル）－２－デオキシ－２－（２－ニトロベンジルオキシメチル）チオ－β－Ｄ－アラビノフラノシル］アデニン（化合物６）
　２－ニトロベンジルオキシメチルクロリド（１ｍＬ、１．３０ｍｍｏｌ）の１．３Ｍ溶液を、ＣＨ２Ｃｌ２（４．０ｍＬ）中の化合物５（０．５３ｇ、１．００ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（５２４μＬ、１．３０ｍｍｏｌ）の溶液に０℃で加え、１時間撹拌した。混合物をＨ２Ｏ及びＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。有機相を飽和ＮａＨＣＯ３溶液及び食塩水で洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、真空中で濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィ－（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ、５０／１～２０／１ｖ／ｖ）で精製し、化合物６（０．５７ｇ、０．８２ｍｍｏｌ、８２％）を得た。
　１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３））：δ１．００－１．１１（ｍ　２１Ｈ），１．１７（ｓ，７Ｈ），３．８８－３．９８（ｍ，２Ｈ），４．０４（ｄｄ，Ｊ＝１２．８，２．８Ｈｚ，１Ｈ），４．１９（ｄｄ，Ｊ＝１３．２，４．４Ｈｚ，１Ｈ），４．６７－４．８４（ｍ，５Ｈ），７．４４－７．４８（ｍ，１Ｈ），７．６２－７．７２（ｍ，２Ｈ），７．９４（ｓ，１Ｈ），８．０７（ｄｄ，Ｊ＝８．０，１．２Ｈｚ，１Ｈ），８．２３（ｓ，１Ｈ）。
（６）Ｎ６－ベンゾイル－９－［３，５－Ｏ－（１，１，３，３－テトライソプロピル－１，３－ジシロキサンジイル）－２－デオキシ－２－（２－ニトロベンジルオキシメチル）チオ－β－Ｄ－アラビノフラノシル］アデニン（化合物７）
　ピリジン（５ｍＬ）中の化合物６（０．５６ｇ、０．８１ｍｍｏｌ）の溶液に、塩化ベンゾイル（２８２μＬ、２．４３ｍｍｏｌ）を加え、混合物を室温で３時間撹拌した。混合物を０℃に冷却し、Ｈ２Ｏ（２ｍＬ）を加え、混合物を０．５時間撹拌した。ｃｏｎｃ．　ＮＨ３（水溶液）（２ｍＬ）を加え、混合物を０．５時間撹拌した。反応混合物をＨ２Ｏ及びＥｔＯＡｃで抽出した。有機相を飽和ＮａＨＣＯ３溶液及び食塩水で洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、真空中で濃縮した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィ－（ヘキサン／ＥｔＯＡｃ、１／１ｖ／ｖ）で精製し、化合物７（０．４６ｇ、０．５８ｍｍｏｌ、７２％）を得た。
　１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ　１．０１－１．１０（ｍ，２１Ｈ），１．１８（ｓ，８Ｈ），３．９３－４．０９（ｍ，２Ｈ），４．２１（ｄｄ，Ｊ＝１２．８，３．６Ｈｚ，１Ｈ），４．６９－４．８３（ｍ，５Ｈ），７．４６－７．５６（ｍ，３Ｈ），７．６０－７．６９（ｍ，３Ｈ），７．９６（ｄｄ，Ｊ＝８．０，１．２Ｈｚ，１Ｈ），８．０５－８．１１（ｍ，２Ｈ），８．７３（ｓ，１Ｈ），８．７９（ｄｄ，Ｊ＝５．２，１．６Ｈｚ，１Ｈ）。
（７）Ｎ６－ベンゾイル－９－［２－デオキシ－２－（２－ニトロベンジルオキシメチル）チオ－β－Ｄ－アラビノフラノシル］アデニン（化合物８）
　ＴＨＦ（５ｍＬ）中の化合物７（０．４７ｇ、０．５９ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＢＡＦ（ＴＨＦ中１Ｍ、１．２ｍＬ）を加え、室温で１．５時間撹拌した。反応混合物を真空中で濃縮し、得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィ－（ＣＨ２Ｃｌ２／ＥｔＯＡｃ、５０／１～２０／１ｖ／ｖ）により精製し、化合物８（０．３３ｇ、０．５９ｍｍｏｌ、定量的）を得た。
　１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ３．１６（ｄ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），３．６４－３．７０（ｍ，１Ｈ），３．７３－３．７８（ｍ，１Ｈ），３．８０－３．８４（ｍ，１Ｈ），３．９７（ｄｄ，Ｊ＝７．２，２．８Ｈｚ，１Ｈ），４．３８－４．４５（ｍ，１Ｈ），４．６１－４．８４（ｍ，４Ｈ），５．１２（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），５．８５（ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，１Ｈ），６．６２（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．５３－７．５９（ｍ，３Ｈ），７．６２－７．６７（ｍ，２Ｈ），７．７３－７．７７（ｍ，１Ｈ），８．０２－８．０６（ｍ，３Ｈ），８．６１（ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，２Ｈ），１１．１１（ｓ，１Ｈ）。
（８）Ｎ６－ベンゾイル－９－［５－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－２－デオキシ－２－（２－ニトロベンジルオキシメチル）チオ－β－Ｄ－アラビノフラノシル］アデニン（化合物９）
　ピリジン（４．０ｍＬ）中の化合物８（０．３３ｇ、０．５９ｍｍｏｌ）の溶液に、４，４－ジメトキシトリリルクロリド（０．２４ｇ、０．７１ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で７．５時間撹拌した。混合物をＨ２Ｏ及びＥｔＯＡｃで抽出した。有機相を飽和ＮａＨＣＯ３溶液及び食塩水で洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、真空中で濃縮した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィ－（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ、６０／１～２０／１ｖ／ｖ）で精製し、化合物９（０．３８ｇ、０．４４ｍｍｏｌ、７２％）を得た。
　１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ１．０４（ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，５Ｈ），２．１７（ｓ，１Ｈ），３．１８（ｄ，Ｊ＝３．２Ｈｚ，１Ｈ），３．５６（ｄ，　Ｊ＝４．４Ｈｚ，２Ｈ），３．７８（ｄ，Ｊ＝１．２Ｈｚ，６Ｈ），３．８５（ｄｄ，Ｊ＝７．６，１．６Ｈｚ，１Ｈ），４．０７－４．１１（ｍ，１Ｈ），４．６２－４．７１（ｍ，３Ｈ），４．８４（ｄ，Ｊ＝１２．Ｈｚ，１Ｈ），４．９４（ｄ，Ｊ＝１４．４　Ｈｚ，１Ｈ），６．６５（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），６．８０－６．８３（ｍ，４Ｈ），７．２０－７．３３（ｍ，４Ｈ），７．４２－７．６４（ｍ，７Ｈ），８．０３－８．０６（ｍ，３Ｈ），８．２０（ｓ，１Ｈ），８．７２（ｓ，１Ｈ），９．０７（ｓ，１Ｈ）。
（９）Ｎ６－ベンゾイル－９－｛３－Ｏ－［２－シアノエトキシ（ジイソプロピルアミノ）ホスファニル］－５－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－２－デオキシ－２－（２－ニトロベンジルオキシメチル）チオ－β－Ｄ－アラビノフラノシル｝アデニン（化合物１０）
　２－シアノエチルＮ，Ｎ－ジイソプロピルクロロホスホルアミダイト（２４１μＬ、１．０８ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ（２．５ｍＬ）中の化合物９（０．４２ｇ、０．４９ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（４１７μＬ、２．４５ｍｍｏｌ）の溶液に添加し、室温で１時間撹拌した。反応混合物を飽和ＮａＨＣＯ３溶液及びＥｔＯＡｃで抽出した。有機相を食塩水で洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、真空中で濃縮した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィ－（ヘキサン／ＥｔＯＡｃ、１／２ｖ／ｖ）で精製し、化合物１０（０．４６ｇ、０．４９ｍｍｏｌ、９０％）を得た。３１Ｐ－ＮＭＲ（１５９ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ１５０．４，１５０．７。
１－２．光切断アナログ（Ａ＊）を含むオリゴヌクレオチドの切断反応
　図２は、光切断アナログを含むオリゴヌクレオチドの切断反応が光照射と加熱に依存することを示す実験を示す図である。この図の（ａ）は、用いた２０塩基長のオリゴヌクレオチド配列と構造及び予想される反応機構を示す化学式であり、（Ｆ）はフルオレセイン基による修飾を示す。この図の（ｂ）は、切断反応の変性ポリヌクレオチドゲル電気泳動分析の結果であり、（ｃ）は、（ｂ）に示した電気泳動結果から算出した、切断反応生成物の定量結果を示すグラフである。
　オリゴヌクレオチド（５’ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ－ｄ（ＡＣＧＡＣＴＣＡ＊ＣＴＡＴＡＧＧＧＣＧＡＡ）、１μＭ）を１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、５０ｍＭ
　ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ　ジチオスレイト－ル（ＤＴＴ）を含む緩衝液中に混合した。
　本溶液４０μＬを９６穴マルチウェルプレ－トのウェルに加え、ＭＡＸ－３０５光源装置（朝日分光）により４ｍＷ／ｃｍ２の光量で３６５ｎｍの光を０分、１分、５分、又は１０分間照射した。続いて、同溶液を１０μＬずつチュ－ブに分注し、７２℃で０分、５分、又は１０分間加熱した。氷上で冷却後、１０μＬの２×ホルムアミドロ－ディング溶液（８０（ｖ／ｖ）％ホルムアミド、５０ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））を添加し、７．５Ｍ尿素を含む２０％変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により解析した。ゲル中のオリゴヌクレオチドは５’末に標識した。フルオレセイン基の蛍光によりＣｈｅｍｉＤｏｃ　ＸＲＳ＋イメ－ジングシステム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて検出した。
　１μＭ　オリゴヌクレオチド、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、５０ｍＭ
　ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ　ＤＴＴ（４０μＬ）に４ｍＷ／ｃｍ２の光量で３６５ｎｍ光を５分間照射し、７２℃で５分間加熱した。ＺｉｐＴｉｐ　μ－Ｃ１８レジン充填ピペットチップを用いて脱塩、濃縮したものをサンプルとし、ｕｌｔｒａｆｌｅｘ　ＩＩＩ（Ｂｒｕｋｅｒ　Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）によりＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ分子量解析を行った。マトリクスとしては３－ヒドロキシピコリン酸を使用した。図の（ａ）に示した原料オリゴヌクレオチド（ｉ）とその脱保護後体（ｉｉ，ｉｉｉ）、及び切断産物（ｉｖ，ｖ）のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳ法による検出結果を下記表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000022
　図の（ｂ）、（ｃ）に示すように、光照射５分の条件で切断産物が増えており、光照射１０分の条件では切断産物がより増加していることがわかる。また、図（ｂ）から、特に光照射１０分、加熱時間５分以上の条件で、原料のバンドが薄くなり、切断産物のバンドが濃くなっていることから、この条件が切断反応に好ましいことがわかる。
１－３．光切断反応による接着末端形成を利用したクロ－ニング反応
　以下、図３を参照して、クローニング及び形質転換について説明する。図は、光切断アナログを使用したＧＦＰ発現ベクター作成法を示している。概要としては、まず、ｐＥＴ２１ｄ，ｐＡｃＧＦＰ１を鋳型にしてＰＣＲ反応を行い、それぞれベクター断片、インサート断片を得る。次いで、光照射と加熱により接着断片を生成したのち両者の混合物で大腸菌を形質転換し、連結産物をプラスミドＤＮＡとして得る。以下、詳細に説明する。
　ベクター側断片は以下のようにして調製した。反応液［０．５μＭ　プライマ－鎖（ｐＥＴ２１ｄ＿Ｆｗ及びｐＥＴ２１ｄ＿Ｒｅｖ，表２）、０．８ｎｇ／μＬ　ｐＥＴ２１ｄ（Ｎｏｖａｇｅｎ）、１×ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ　ｆｏｒ　ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｎｅｏ、１．５ｍＭ　ＭｇＳＯ４、　０．２ｍＭ　ｄＮＴＰｓ、　０．０２Ｕ／μＬ　ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｎｅｏ（東洋紡）］をアプライドバイオシステムズ２７２０サ－マルサイクラ－にて（９５℃，３０秒→５０℃，３０秒→７２℃，３分間）／サイクル、３０サイクルの条件で調製した。ＰＣＲ反応後の反応液２００μＬに制限酵素ＤｐｎＩ（１６Ｕ／μＬ、東洋紡）２μＬを添加し３７℃で１時間加温した。これにＴＥ飽和フェノ－ル（ナカライテスク）とクロロホルムの等量混合液２００μＬを加え、激しく混和したのち遠心１４，０００×ｇ、３分間）し、水層を分離した。同様にクロロホルム２００μＬで反応液を抽出したのち、３Ｍ　ＮａＯＡｃ（ｐＨ５．２）２０μＬとイソプロピルアルコ－ル２２０μＬを加えた。－３０℃で１時間冷却した後、遠心（２０，０００×ｇ、２０分間）することでＤＮＡを回収した。目的とするＰＣＲ産物をアガロ－スゲル電気泳動（ＧｅｌＲｅｄ（和光純薬工業）を含む、０．８％　ＡｇａｒｏｓｅＳ（和光純薬工業））により精製した。切り出したゲル片からＷｉｚａｒｄ　ＳＶ　Ｇｅｌ　ａｎｄ　ＰＣＲ　Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ　Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ）を用いてＤＮＡを抽出した（収量１．２７μｇ　ＤＮＡ）。
　インサ－ト側断片は以下のようにして調製した。反応液［０．５μＭ　プライマー鎖（ｐＡｃＧＦＰ１＿Ｆｗ及びｐＡｃＧＦＰ１＿Ｒｅｖ，表２）、０．８ｎｇ／μＬ　ｐＡｃＧＦＰ１（タカラバイオ）、１×ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ　ｆｏｒ　ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－　Ｎｅｏ，１．５ｍＭ　ＭｇＳＯ４，０．２ｍＭ　ｄＮＴＰｓ，０．０２Ｕ／μＬ　ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｎｅｏ）］をアプライドバイオシステムズ２７２０サ－マルサイクラ－にて（９５℃，３０秒→５５℃，３０秒→７２℃，１分間）／サイクル、３０サイクルの条件で調製した。ＰＣＲ反応後の反応液１００μＬに制限酵素ＤｐｎＩ（１６Ｕ／μＬ，東洋紡）１μＬを添加し３７℃で１時間加温した。これにＴＥ飽和フェノ－ル（ナカライテスク）とクロロホルムの等量混合液１００μＬを加え、激しく混和したのち遠心（１４，０００×ｇ，３分間）し、水層を分離した。同様にクロロホルム２００μＬで反応液を抽出したのち、３Ｍ　ＮａＯＡｃ（ｐＨ５．２）１０μＬとイソプロピルアルコ－ル１１０μＬを加えた。－３０℃で１時間冷却した後，遠心（２０，０００×ｇ，２０分間）することでＤＮＡを回収した。目的とするＰＣＲ産物をアガロ－スゲル電気泳動（ＧｅｌＲｅｄ（和光純薬工業）を含む１．５％　Ａｇａｒｏｓｅ　Ｓ（和光純薬工業））により精製した。切り出したゲル片からＷｉｚａｒｄ　ＳＶ　Ｇｅｌ　ａｎｄ　ＰＣＲ　Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ　Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ）を用いてＤＮＡを抽出した（収量５．３３μｇ　ＤＮＡ）。ポスト切断ＰＣＲプライマー配列を下記表に示す。配列中のＡ＊は光切断アナログ（図２）を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000023
　ベクター断片溶液（６ｎｇ／μＬ　ＤＮＡ、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ　ＤＴＴ）及びインサ－ト断片溶液（８．４ｎｇ／μＬ　ＤＮＡ、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ　ＤＴＴ）をそれぞれ５０μＬずつ９６穴マルチウェルプレ－トのウェルに加え、ハンディＵＶランプ（フナコシ）により約４ｍＷ／ｃｍ２で３６５ｎｍ光を５分間照射した。続いて、同溶液２つを１本の１．５ｍＬチュ－ブに回収し、７２℃で１０分間加熱した。３Ｍ　ＮａＯＡｃ（ｐＨ５．２）１０μＬとイソプロピルアルコ－ル１１０μＬを加え、－３０℃で１時間冷却した後、遠心（２０，０００×ｇ，２０分間）してＤＮＡを回収した。ＤＮＡを５μＬの水に溶解し、うち４．７μＬを大腸菌コンピテントセル溶液５０μＬ（ＮＥＢ　５－ａｌｐｈａ　Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｈｉｇｈ　Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）に添加した。これを５０μｇ／ｍＬアンピシリンナトリウムを含むＬＢ寒天培地に塗布し３７℃で一晩培養した。光照射と加熱を行ったサンプルからは９クロ－ンの連結産物を得た。これに対し光照射と加熱を行わなかったコントロ－ルサンプルからは２クロ－ンの連結産物を得た。
２．フッ素切断アナログ
２－１．フッ素切断アナログ（Ａ＊＊）の合成
　以下にフッ素切断アナログの合成スキームを示す。以下、この合成スキームに従って、フッ素切断アナログの合成手順を説明する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
（１）９－［２－デオキシ－２－チオ－β－Ｄ－アラビノフラノシル］アデニン（化合物１１）
　ＴＨＦ（１０ｍＬ）中の化合物４（５７２ｍｇ、１．００ｍｍｏｌ）の溶液に、３ＨＦ－Ｅｔ３Ｎ（４０９μｌ、２．５１ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温で２時間撹拌した。混合物を真空中で濃縮した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィ－（ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ、９２／８ｖ／ｖ）で精製し、化合物１１（２６５ｍｇ、０．８１ｍｍｏｌ、８１％）を得た。
　１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）：δ２．１５（ｓ，３Ｈ），３．６４－３．８７（ｍ，３Ｈ），４．３４（ｄｄ，Ｊ＝１０．０，７．６Ｈｚ，１Ｈ），４．５０（ｄｄ，Ｊ＝１６．８，１０　Ｈｚ，１Ｈ），５．１２（ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，１Ｈ），５．８０（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，１Ｈ），６．４２（ｄ，Ｊ＝７．６　Ｈｚ，１Ｈ），７．３０（ｂｒ　ｓ，２Ｈ），８．１０（ｓ，１Ｈ），８．２２（ｓ，１Ｈ）；ＨＲＭＳ
　（ＥＳＩ＋）ｃａｌｃ．ｍ／ｚ　３２６．０９（Ｍ＋Ｈ＋），３４８．０７（Ｍ＋Ｎａ＋）　ｆｏｕｎｄ　ｍ／ｚ　３２６．３７９８（Ｍ＋Ｈ＋），３４８．０８００（Ｍ＋Ｎａ＋）。
（２）９－［５－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－２－デオキシ－２－チオ－β－Ｄ－アラビノフラノシル］アデニン（化合物１２）
　ピリジン（８．０ｍＬ）中の化合物１１（２６５ｍｇ、０．８１５ｍｍｏｌ）の溶液に、４，４’－ジメトキシトリリルクロリド（４１３ｍｇ、１．２２ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温で２．５時間撹拌した。反応混合物をＨ２Ｏ及びＣＨＣｌ３で抽出した。有機相を飽和ＮａＨＣＯ３溶液及び食塩水で洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、真空中で濃縮した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィ－（ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ、１００／０～９５／５ｖ／ｖ）で精製し、化合物１２（３７１ｍｇ、０．５９ｍｍｏｌ、７２％）を得た。
　１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）：δ２．１７（ｓ，３Ｈ），３．１６（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），３．４５（ｄｄ，Ｊ＝１０．４，　７．６Ｈｚ，１Ｈ），３．６９（ｓ，３Ｈ），３．７１（ｓ，３Ｈ），４．０２－４．０７（ｍ，１Ｈ），４．３７（ｄｄ，Ｊ＝１０．０，　８．０Ｈｚ，１Ｈ），４．６７（ｄｄ，Ｊ＝１６．８，
　８．４Ｈｚ，１Ｈ），５．７７（ｄ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），６．４７（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），６．７２（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），６．７８（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，２Ｈ），７．１４－７．２１（ｍ，７Ｈ），７．２９－７．３３（ｍ，４Ｈ），７．９６（ｓ，１Ｈ），８．１４（ｓ，１Ｈ）；１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ３０．０，　５１．２，　５４．９，　６３．７，　７２．２，　８２．５，　８３．３，　８５．４，　１１２．９，　１１３．０，　１１９．１，　１２６．５，　１２７．６，　１２９．６，　１２９．７，　１３５．４，　１３５．５，　１４０．１，
　１４４．８，　１４８．７，　１５２．３，　１５６．０，　１５７．９，　１５８．０，　１９３．９；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）ｃａｌｃ．ｍ／ｚ　６２８．２２（Ｍ＋Ｈ＋），６５０．２０（Ｍ＋Ｎａ＋），ｆｏｕｎｄ　ｍ／ｚ　６２８．２２１６（Ｍ＋Ｈ＋），６５０．２０５４（Ｍ＋Ｎａ＋）。
（３）９－［５－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－２－デオキシ－２－トリイソプロピルシリルオキシメチルチオ－β－Ｄ－アラビノフラノシル］アデニン（化合物１３）
　ＭｅＯＨ（６．０ｍＬ）中の化合物１２（７４９ｍｇ、１．１９ｍｍｏｌ）の溶液に、ＭｅＯＨ（６．０ｍＬ）中の２８％ＮａＯＭｅを加えた。反応混合物を室温で１５分間撹拌し、真空中で濃縮した。残渣をＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３溶液及び食塩水で洗浄した。有機相を乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、真空中で濃縮した。さらに精製することなく、得られた残渣をＴＨＦ（１２ｍＬ）に溶解した。溶液にＤＩＰＥＡ（１．４ｍＬ、８．３３ｍｍｏｌ）、（トリイソプロピルシロキシ）メチルクロリド（３０４μＬ、１．３１ｍｍｏｌ）を加え、０℃で１６．５時間撹拌した。反応混合物をＨ２Ｏ及びＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。有機相を飽和ＮａＨＣＯ３溶液及び食塩水で洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、真空中で濃縮した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィ－（ヘキサン／ＥｔＯＡｃ、１／１～１／２ｖ／ｖ）で精製し、化合物１３（４９９ｍｇ、０．６５ｍｍｏｌ、５４％）を得た。
　１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ６）：δ０．９５－１．００（ｍ，２１Ｈ），　３．１９（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），３．４５（ｄｄ，Ｊ＝１０．８，　７．６Ｈｚ，１Ｈ），３．７０（ｓ，３Ｈ），３．７１（ｓ，３Ｈ），３．８８（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），３．９７－４．０１（ｍ，１Ｈ），４．４９（ｄｄ，Ｊ＝１４．４，
　８．８Ｈｚ，１Ｈ），４．６７（ｄ，Ｊ＝１０．４Ｈｚ，１Ｈ），４．７６（ｄ，Ｊ＝１０．８Ｈｚ，１Ｈ），５．７５（ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，１Ｈ），６．４９（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），６．７７（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），６．８１（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，２Ｈ），７．１８－７．２６（ｍ，９Ｈ），７．３５－７．３６（ｍ，２Ｈ），８．０２（ｓ，１Ｈ），８．１１（ｓ，１Ｈ）；１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ１１．２，　１７．６，　１７．７，　５２．５，　５４．９，　６３．５，　６３．８，　７４．２，　８２．９，　８４．０，　８５．４，　１１３．０，　１１８．７，　１２６．６，　１２７．７，　１２９．６，　１３５．４，　１３５．５，　１３９．４，　１４４．８，　１４９．０，　１５２．３，　１５５．９，　１５７．９，　１５８．０；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）　ｃａｌｃ．　ｍ／ｚ　７９４．３４（Ｍ＋Ｎａ＋），　ｆｏｕｎｄ　ｍ／ｚ　７９４．３１１３（Ｍ＋Ｎａ＋）。
（４）Ｎ６－Ｎ６－ジベンゾイル－９－［５－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－２－デオキシ－２－トリイソプロピルシリルオキシメチルチオ－３－Ｏ－トリメチルシリル－β－Ｄ－アラビノフラノシル］アデニン（化合物１４）
　ピリジン（７．０ｍＬ）中の化合物１３（４８８ｍｇ、０．６３ｍｍｏｌ）の溶液に、室温でＴＭＳＣｌ（９６μＬ、０．７６ｍｍｏｌ）を加えた。１時間撹拌した後、ＢｚＣｌ（２１８μＬ、１．９０ｍｍｏｌ）を加え、混合物を室温で２時間撹拌した。反応混合物にＨ２Ｏ（１１ｍＬ）を添加し、１０分間撹拌した。次いで、２８％ＮＨ３水溶液（１４ｍＬ）を添加し、混合物を１５分間撹拌した。反応混合物をＨ２Ｏ及びＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。飽和ＮａＨＣＯ３溶液及び食塩水で有機相を洗浄し、乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）し、真空中で濃縮した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィ－（ヘキサン／ＥｔＯＡｃ、３／１～２／１ｖ／ｖ）で精製し、化合物１４（２１１ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ、３２％）を得た。
　１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ６）：δ－０．０５（ｓ，９Ｈ），０．９５－１．０５（ｍ，２１Ｈ），３．２０（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），３．３９（ｄｄ，Ｊ＝１１．２，　６．８Ｈｚ，１Ｈ），３．６８（ｓ，３Ｈ），３．６９（ｓ，３Ｈ），３．９７－４．０２（ｍ，２Ｈ），４．５４－４．６３（ｍ，３Ｈ），６．６８（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），６．７８（ｄ，Ｊ＝３．６Ｈｚ，２Ｈ），６．８１（ｄ，Ｊ＝３．６Ｈｚ，２Ｈ），７．１５－７．２１（ｍ，７Ｈ），７．３２－７．３４（ｍ，２Ｈ），７．４０（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，４Ｈ），７．５５（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ），７．７５（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，４Ｈ），８．６０（ｓ，１Ｈ），８．６５（ｓ，１Ｈ）；１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）：δ０．３，　１１．２，　１７．６，　１７．７，　５２．２，　５５．０，　６５．８，　６９．５，　７４．３，　８２．７，　８４．７，　８５．６，　１１３．１，　１２６．６，　１２７．１，　１２７．７，　１２８．９，　１２９．６，　１２９．７，　１３３．３，　１３３．４，　１３５．２，　１３５．５，　１４４．４，　１４６．１，　１５０．８，　１５１．６，　１５２．４，　１５８．０，　１７８．９；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）　ｃａｌｃ．　ｍ／ｚ　１０５２．４５（Ｍ＋Ｈ＋），　ｆｏｕｎｄ　ｍ／ｚ　１０５２．４４８０（Ｍ＋Ｈ＋）。
（５）Ｎ６－Ｎ６－ジベンゾイル－９－［５－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－２－デオキシ－２－トリイソプロピルシリルオキシメチルチオ－β－Ｄ－アラビノフラノシル］アデニン（化合物１５）
　ピリジン（１．５ｍＬ）中の化合物１４（１６０ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）の溶液に、ピリジン（１１μＬ、０．４２ｍｍｏｌ）中の７０％ＨＦを加え、反応混合物を室温で２時間撹拌した。反応混合物をＨ２Ｏ及びＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。有機相を飽和ＮａＨＣＯ３溶液及び食塩水で洗浄し、乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）し、真空中で濃縮した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィ－（ヘキサン／ＥｔＯＡｃ、２／１ｖ／ｖ）で精製し、化合物１５（９３ｍｇ、０．０９ｍｍｏｌ、６２％）を得た。
　１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ６）：δ０．９４－１．０５（ｍ，２１Ｈ），３．２０（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），３．４６（ｄｄ，Ｊ＝１０．８，　７．６
　Ｈｚ，１Ｈ），３．６８（ｓ，３Ｈ），３．６９（ｓ，３Ｈ），３．９２－４．０５（ｍ，２Ｈ），４．４１（ｄｄ，Ｊ＝１５．２，　８．８Ｈｚ，１Ｈ），４．６５（ｄ，Ｊ＝１０．４Ｈｚ，１Ｈ），４．７６（ｄ，Ｊ＝１０．８Ｈｚ，１Ｈ），６．６４（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），６．７８（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ），６．８０（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），７．１３－７．２１（ｍ，７Ｈ），７．３１－７．３３（ｍ，２Ｈ），７．４２（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，４Ｈ），７．５７（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），７．７５（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，４Ｈ），８．５４（ｓ，１Ｈ），８．５８（ｓ，１Ｈ）；１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）：δ１１．２，　１７．６，　１７．７，　５２．５，　５４．９，　６３．６，　６６．０，　７４．１，　８３．０，　８４．８，　８５．４，　１１３．０，　１２６．６，　１２７．１，　１２７．７，　１２８．９，　１２９．５，　１２９．８，　１３３．３，　１３３．５，　１３５．２，
　１３５．８，　１４４．６，　１４６．０，　１５０．８，　１５１．６，　１５２．４，　１５２．９，　１５８．０，　１７１．９；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）　ｃａｌｃ．　ｍ／ｚ　９８０．４１（Ｍ＋Ｈ＋），　ｆｏｕｎｄ　ｍ／ｚ　９８０．４３３１（Ｍ＋Ｈ＋）。
（６）Ｎ６－Ｎ６－ジベンゾイル－９－｛３－Ｏ－［２－シアノエトキシ（ジイソプロピルアミノ）ホスファニル］－５－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－２－デオキシ－２－トリイソプロピルシリルオキシメチルチオ－β－Ｄ－アラビノフラノシル｝アデニン（化合物１６）
　ＴＨＦ（９５０μＬ）中の化合物１５（９３ｍｇ、０．０１ｍｍｏｌ）の溶液に、２－シアノエチルＮ，Ｎ－ジイソプロピルクロロホスホルアミダイト（４２μＬ、０．１９ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（８０μＬ、０．４７ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間撹拌した。反応混合物をＨ２Ｏ及びＥｔＯＡｃで抽出した。有機相を飽和ＮａＨＣＯ３溶液及び食塩水で洗浄し、乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）し、真空中で濃縮した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィ－（ヘキサン／ＥｔＯＡｃ、２／１ｖ／ｖ）で精製し、化合物１６（８３ｍｇ、０．０７ｍｍｏｌ、７０％）を得た。
　３１Ｐ－ＮＭＲ（１５９ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ６）：δ１４９．１、１４９．９、　ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）ｃａｌｃ．ｍ／ｚ　１１８０．５２（Ｍ＋Ｈ＋）、ｆｏｕｎｄ　ｍ／ｚ　１１８０．５３６３（Ｍ＋Ｈ＋）。
２－２．オリゴヌクレオチドの合成
　オリゴヌクレオチドはホスホロアミダイト法に基づきＤＮＡ合成機を用いて合成した。５’末端の蛍光標識には６－ＦＡＭ　ａｍｉｄｉｔｅ（Ｃｈｅｍｇｅｎｅｓ）を用いた。合成した各切断アナログのアミダイトは終濃度５０ｍＭのアセトニトリル溶液とし、ＤＮＡ合成機を用いてＤＮＡプライマ－内部に導入した。脱保護は定法に従って行い、各ＤＮＡは２０％　ＰＡＧＥにより精製し、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳ（Ｂｒｕｋｅｒ）を用いて構造を確認した。合成したＤＮＡの配列を以下の表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000025
３－３．フッ素切断アナログ（Ａ＊＊）を含むオリゴヌクレオチドの切断反応
　オリゴヌクレオチド（５’ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ－ｄ（ＡＣＧＡＣＴＣＡ＊＊ＣＴＡＴＡＧＧＧＣＧＡＡ），１μＭ）を１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、５０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ　ジチオスレイト－ル（ＤＴＴ）を含む緩衝液中に混合した後、同量の１Ｍ　ＴＢＡＦ　ｉｎ　ＴＨＦ溶液を加え、７２℃で１０分間加熱した。氷上で冷却後、遠心エバポレータより溶媒を除き、１０μＬの２×ホルムアミドロ－ディング溶液（８０（ｖ／ｖ）％　ホルムアミド、５０ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））に再度溶解した。得られたサンプルを７．５Ｍ　尿素を含む２０％変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により解析した。ゲル中のオリゴヌクレオチドは５’末に標識した。フルオレセイン基の蛍光によりＣｈｅｍｉＤｏｃ　ＸＲＳ＋イメ－ジングシステム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて検出した。図４に、電気泳動ゲルの写真を示す。この図に示すように、切断反応によりオリゴヌクレオチドが切断されたことがわかる。
３．光切断アナログ（Ｓｅ）
３－１．光切断Ｓｅアナログ（ＡＳｅ）の合成
　以下に光切断Ｓｅアナログの合成スキームを示す。以下、この合成スキームに従って、光切断アナログの合成手順を説明する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
（１）９－［３，５－Ｏ－（１，１，３，３－テトライソプロピル－１，３－ジシロキサンジイル）－２－デオキシ－２－ｐ－トルオイルセレノ－β－Ｄ－アラビノフラノシル］アデニン（化合物１７）
　ＤＭＦ（１６０ｍＬ）中のジ－ｐ－トルオイルセレニド（１４．８ｇ、４６．７ｍｍｏｌ）の溶液に、ピペリジン（４．３ｍＬ、４３．７ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（８．２ｍＬ、４６．７ｍｍｏｌ）を加え、室温で撹拌した。５分間撹拌した後、化合物３（１０ｇ、１５．６ｍｍｏｌ）を上記混合物に加え、６０℃で１時間撹拌した。ＡｃＯＥｔを反応混合物に加え、１Ｎ　ＨＣｌ水溶液、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で洗浄した。食塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、蒸発させて粗化合物を得た。この粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｈｅｘ／ＡｃＯＥｔ＝１／１～１／４、ｖ／ｖ）で精製し、化合物１７（５．７ｇ、５３％）を得た。
　１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ８．１６（１Ｈ，ｓ），７．９２（１Ｈ，ｓ），７．５６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），７．１５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），６．４７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），６．０９（２Ｈ，ｂｒｓ），５．２５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．０，８．０Ｈｚ），４．７２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．４，　７．６Ｈｚ），４．２７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１２．０，　４．８Ｈｚ），４．０３－４．０１（２Ｈ，ｍ），２．３４（３Ｈ，ｓ），１．１８－０．９９（２８Ｈ，ｍ）；１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ１９２．５，　１５５．２，　１５１．９，　１４９．４，　１４５．３，　１４０．２，　１３５．５，　１２９．６，　１２７．５，　１２０．１，　８５．０，　８４．３，　７３．５，　６２．１，　５０．４，　２１．８，　１７．６，　１７．５，　１７．４，　１７．３，　１７．１，　１３．７，
　１３．２，　１２．９，　１２．５；７７Ｓｅ－ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ５３５．６；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）ｃａｌｃ．ｍ／ｚ　６９２．２１９７［Ｍ＋Ｈ］＋，ｆｏｕｎｄ　ｍ／ｚ　６９２．２２００［Ｍ＋Ｈ］＋。
（２）９－［３，５－Ｏ－（１，１，３，３－テトライソプロピル－１，３－ジシロキサンジイル）－２－デオキシ－２－（２－ニトロベンジルオキシメチル）セレノ－β－Ｄ－アラビノフラノシル］アデニン（化合物１８）
　空気条件下で、ピペリジン（１４３μＬ、１．４ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（４ｍＬ）中の化合物１７（４００ｍｇ、０．５８ｍｍｏｌ）の溶液に添加し、反応混合物を室温で１６時間撹拌した。次いで、雰囲気をアルゴンと交換し、溶液をアルゴンガスで１０分間バブリングし、続いてＮａＢＨ４（５３ｍｇ、１．４ｍｍｏｌ）を加え、室温で撹拌した。１５分後、反応混合物を０℃に冷却し、ＤＭＦ（２ｍＬ）中の２－ニトロベンジルオキシメチルクロリド（０．８７ｍｍｏｌ）の溶液を添加し、０℃で１時間撹拌した。Ｈ２Ｏの添加により反応をクエンチし、ＡｃＯＥｔで抽出し、食塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、蒸発させた。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ＝２５／１、ｖ／ｖ）によって精製し、化合物１８（２２６ｍｇ、５３％）を得た。
　１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ８．１４（１Ｈ，ｓ），８．０１－７．８６（２Ｈ，ｍ），７．６８－７．３２（３Ｈ，ｍ），６．３７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），６．１５（２Ｈ，ｂｒｓ），５．０２（１Ｈ，ｓ，ｄｉａｓｔｅｒｅｏｔｏｐｉｃ），４．９７（１Ｈ，ｓ，ｄｉａｓｔｅｒｅｏｔｏｐｉｃ），４．８６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．０，　８．０Ｈｚ），４．７７（１Ｈ，ｓ，ｄｉａｓｔｅｒｅｏｔｏｐｉｃ），４．７５（１Ｈ，ｓ，ｄｉａｓｔｅｒｅｏｔｏｐｉｃ），４．１３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１２．８，　４．４Ｈｚ），４．０１－３．９４（２Ｈ，ｍ），３．８４－３．８２（１Ｈ，ｍ），１．１１－０．９５（２８Ｈ，ｍ）；１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：１５５．８，　１５２．８，　１４９．６，　１４７．４，　１３９．２，　１３３．７，　１３３．５，　１２９．１，　１２８．４，　１２４．８，　１１９．６，　８４．８，　８４．１，　７４．９，　６９．５，　６７．９，　６１．６，　４８．７，　１７．６，　１７．５，　１７．４，　１７．２，　１７．１，　１７．０，　１３．７，　１３．１，　１３．０，　１２．６；７７Ｓｅ－ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ２３１．７；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）ｃａｌｃ．ｍ／ｚ　７３９．２２０４［Ｍ＋Ｈ］＋，ｆｏｕｎｄ　ｍ／ｚ　７３９．２２０８［Ｍ＋Ｈ］＋。
（３）Ｎ６，Ｎ６－ジベンゾイル－９－［３，５－Ｏ－（１，１，３，３－テトライソプロピル－１，３－ジシロキサンジイル）－２－デオキシ－２－（２－ニトロベンジルオキシメチル）セレノ－β－Ｄ－アラビノフラノシル］アデニン（化合物１９）
　ピリジン（３ｍＬ）中の化合物１８（２００ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）の溶液に、塩化ベンゾイル（１２５μＬ、１．０８ｍｍｏｌ）を加え、混合物を室温で４時間撹拌した。ＡｃＯＥｔを反応混合物に加え、Ｈ２Ｏ及び食塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、蒸発させた。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝２／１から１／２、ｖ／ｖ）で精製し、化合物１９（１２６ｍｇ、４９％）を得た。
　１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ８．５４（１Ｈ，ｓ），８．１３（１Ｈ，ｓ），８．０４－７．２８（１４Ｈ，ｍ），６．４７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），５．０５－４．７９（５Ｈ，ｍ），４．１９－３．８５（４Ｈ，ｍ），１．１３－０．９５（２８Ｈ，ｍ）；１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ１７２．３，　１５２．９，　１５２．０，　１５１．９，　１４７．６，　１４３．８，　１３４．２，　１３３．７，　１３３．２，　１３３．０，　１２９．６，　１２９．３，　１２８．７，　１２８．６，　１２８．０，　１２４．９，　８５．４，　８４．３，　７５．２，　６９．７，　６８．２，　６１．７，　４９．１，　１７．６，　１７．５，　１７．４，　１７．２，　１７．１，　１４．２，　１３．７，　１３．１，　１３．０，
　１２．６；７７Ｓｅ－ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ２３４．４；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）ｃａｌｃ．ｍ／ｚ　９４７．２７２９［Ｍ＋Ｈ］＋，ｆｏｕｎｄ　ｍ／ｚ　９４７．２７２７［Ｍ＋Ｈ］＋。
（４）Ｎ６，Ｎ６－ジベンゾイル－９－［２－デオキシ－２－（２－ニトロベンジルオキシメチル）セレノ－β－Ｄ－アラビノフラノシル］アデニン（化合物２０）
　ＴＨＦ（１ｍＬ）中の化合物１９（１２５ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＢＡＦ（ＴＨＦ中１Ｍ、２９０μＬ）を添加し、室温で１時間撹拌した。反応混合物を真空中で濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ＝２５／１、ｖ／ｖ）によって精製し、化合物２０（６５ｍｇ、７１％）を得た。
　１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ８．５６（１Ｈ，ｓ），８．５１（１Ｈ，ｓ），８．０２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．８１（４Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），７．６０－７．３０（９Ｈ，ｍ），６．５５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），５．０２（２Ｈ，ｓ），４．８３－４．６９（３Ｈ，ｍ），３．９８－３．７５（４Ｈ，ｍ）；１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ　１７２．４，　１５２．６，　１５２．１，　１５１．９，　１４７．７，　１４４．６，　１３３．９，　１３３．８，
　１３３．２，　１３２．７，　１３０．１，　１２９．５，　１２８．９，　１２８．４，　１２７．５，　１２５．０，　８６．２，　８５．１，　７３．５，　６９．５，
　６８．５，　５９．９，　４９．７；７７Ｓｅ－ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ２５０．１。
（５）Ｎ６，Ｎ６－ジベンゾイル－９－［５－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－２－デオキシ－２－（２－ニトロベンジルオキシメチル）セレノ－β－Ｄ－アラビノフラノシル］アデニン（化合物２１）
　ピリジン（０．８ｍＬ）中の化合物２０（６０ｍｇ、０．０８５ｍｍｏｌ）の溶液に、４，４’－ジメトキシトリチルクロリド（３５ｍｇ、０．１０２ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で２時間撹拌した。反応混合物をＡｃＯＥｔで希釈し、飽和Ｈ２Ｏで洗浄した。ＮａＨＣＯ３水溶液。食塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、蒸発させた。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１／１、ｖ／ｖ）によって精製し、化合物２１（４８ｍｇ、５６％）を得た。
　１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ８．５２（１Ｈ，ｓ），８．２１（１Ｈ，ｓ），８．０３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．８３－７．８１（４Ｈ，ｍ），７．５７－７．１５（１８Ｈ，ｍ），６．７９－６．７７（４Ｈ，ｍ），６．６０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），５．０４－４．７２（４Ｈ，ｍ），４．６６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），４．０５－４．０３（１Ｈ，ｍ），３．９３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．８，７．２Ｈｚ），３．７２（６Ｈ，ｓ），３．５２－３．５０（２Ｈ，ｍ）；１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ１７２．３，　１５８．７，　１５２．７，　１５２．２，　１５１．９，　１４７．８，　１４４．４，　１４３．８，　１３５．７，
　１３５．６，　１３４．２，　１３３．８，　１３３．０，　１３２．５，　１３０．１，　１２９．５，　１２９．０，　１２８．７，　１２８．３，　１２８．０，　１２７．０，　１２５．１，　１１３．３，　８６．９，　８５．４，　８３．３，　７６．５，　６９．５，　６８．６，　６２．９，　５５．３，　４９．６；７７Ｓｅ－ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ２５２．０；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）ｃａｌｃ．ｍ／ｚ　１００７．２５１３［Ｍ＋Ｈ］＋，ｆｏｕｎｄ　ｍ／ｚ　１００７．２５３６［Ｍ＋Ｈ］＋。
（６）Ｎ６，Ｎ６－ジベンゾイル－９－｛３－Ｏ－［２－シアノエトキシ（ジイソプロピルアミノ）ホスファニル］－５－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－２－デオキシ－２－（２－ニトロベンジルオキシメチル）セレノ－β－Ｄ－アラビノフラノシル｝アデニン（化合物２２）
　２－シアノエチルＮ，Ｎ－ジイソプロピルクロロホスホルアミダイト（２５μＬ、０．１１ｍｍｏｌ）を、２１（４５ｍｇ、０．０４５ｍｍｏｌ）及びＣＨ２Ｃｌ２（０．５ｍＬ）中の化合物ＤＩＰＥＡ（４７μＬ、０．２７ｍｍｏｌ）の溶液に添加し、０℃で１時間撹拌した。反応混合物をＡｃＯＥｔで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液及び食塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、蒸発させた。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１／１、ｖ／ｖ）によって精製し、化合物２１（４１ｍｇ、７６％）を得た。
　３１Ｐ－ＮＭＲ（１５９ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ１５０．６，　１５０．３；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）ｃａｌｃ．ｍ／ｚ　１２０７．３５９２［Ｍ　＋　Ｈ］＋，ｆｏｕｎｄ　ｍ／ｚ　１２７０７．３６２４［Ｍ　＋　Ｈ］＋。
３－２．オリゴヌクレオチドの合成
　合成した切断アナログＡＳｅのアミダイトは終濃度５０ｍＭのアセトニトリル溶液とし、ホスホロアミダイト法に基づきＤＮＡ合成機を用いてＤＮＡオリゴマーを合成した。脱保護は定法に従って行い、逆相ＨＰＬＣ［日立ハイテクサイエンス社製　ＬａＣｈｒｏｍ
　Ｅｌｉｔｅ；　カラム，ＹＭＣ社製Ｈｙｄｒｏｓｐｈｅｒｅ　Ｃ１８（２５０×１０ｍｍ）］により精製し、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳ（Ｂｒｕｋｅｒ）を用いて構造を確認した。合成したＤＮＡの配列を以下の表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000027
３－３．光切断アナログ（ＡＳｅ）を含むオリゴヌクレオチドの切断反応
　１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．５），　５ｍＭ　ＭｇＣｌ２，　１０ｍＭ　ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む緩衝液中にオリゴヌクレオチド（３μＭ）を混合した後、光照射装置　ＭＡＸ－３０５（朝日分光）により波長３６５ｎｍの光を約４ｍＷ／ｃｍ２で１０分間照射した。得られたサンプルをホルムアミドローディング溶液（８０（ｖ／ｖ）％ホルムアミド，　５０ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））にて２倍希釈した後、７．５Ｍ尿素を含む１５％変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により解析した。ゲル中のオリゴヌクレオチドはＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　ＩＩ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｇｅｌ　Ｓｔａｉｎにより染色し、ＣｈｅｍｉＤｏｃ　ＸＲＳ＋イメージングシステム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて検出した。結果を図５に示す。この結果から、緩衝液中、室温下での１０分間の光照射により、切断産物がみられた。

Claims (9)

  1. 　核酸の増幅に使用されるプライマーであって、下記式（１）で示される構造を有することを特徴とするプライマー。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （ここで、Ａ１は－Ｓ－、－Ｓ－Ｓ－、又は－Ｓｅ－を示し、Ｂは塩基を示し、Ｒ１は分解性保護基を示す。＊は隣接するヌクレオチドの糖との結合手を意味する。）
  2. 　前記Ｒ１が下記式（２Ａ）で示される光分解性保護基であることを特徴とする請求項１に記載のプライマー。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     （ここで、Ａ２は炭素数１～３のアルキレン基を示し、A３は炭素数１～３のアルキレン基を示す。＊はＡ１との結合手を意味する。）
  3. 　前記Ｒ１が下記式（３Ａ）で示される２－ニトロベンジルオキシメチル基であることを特徴とする請求項２に記載のプライマー。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
  4. 　前記Ｒ１が下記式（２Ｂ）で示されるフッ化物分解性保護基であることを特徴とする請求項１に記載のプライマー。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     （ここで、Ａ４は炭素数１～３のアルキレン基を示し、Ｒ２～Ｒ４は直鎖又は分岐鎖の炭素数１～４のアルキル基を示し、Ｒ２～Ｒ４は互いに同一であっても異なってもよい。＊はＡ１との結合手を意味する。）
  5. 　前記Ｒ１が下記式（３Ｂ）で示されるトリイソプロピルシリルオキシメチル基であることを特徴とする請求項４に記載のプライマー。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
  6. 　請求項１～５のいずれかに記載したプライマーを用いて接着末端を有する二本鎖ＤＮＡを製造するための二本鎖ＤＮＡの製造装置であって、
    　鋳型となるテンプレートＤＮＡのアンチセンス鎖の一部の配列と相補的であり、かつ前記式（１）で示される構造を有するフォワードプライマーと、
    　前記テンプレートＤＮＡのセンス鎖の一部の配列と相補的であり、かつ前記式（１）で示される構造を有するリバースプライマーと、
    　前記テンプレートＤＮＡを鋳型としてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を複数サイクル行い、前記フォワードプライマーが伸長したフォワード側伸長鎖と、前記リバースプライマーが伸長したリバース側伸長鎖とを生成し、前記フォワード側伸長鎖と前記リバース側伸長鎖とをアニーリングして３’末端が陥没した二本鎖ＤＮＡを生成する増幅手段と、
    　前記二本鎖ＤＮＡの前記３’末端をクレノウフラグメントにより平滑末端とする平滑化手段と、
    　前記Ｒ１を脱保護して前記式（１）の構造部分でＤＮＡを切断し、３’末端が突出した接着末端を形成する脱保護切断手段と、
    　を備えることを特徴とする二本鎖ＤＮＡの製造装置。
  7. 　請求項１～５のいずれかに記載したプライマーを用いて接着末端を有する二本鎖ＤＮＡを製造するための二本鎖ＤＮＡの製造方法であって、
    　鋳型となるテンプレートＤＮＡのアンチセンス鎖の一部の配列と相補的であり、かつ前記式（１）で示される構造を有するフォワードプライマーと、前記テンプレートＤＮＡのセンス鎖の一部の配列と相補的であり、かつ前記式（１）で示される構造を有するリバースプライマーと、を準備する準備工程と、
    　前記テンプレートＤＮＡを鋳型としてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を複数サイクル行い、前記フォワードプライマーが伸長したフォワード側伸長鎖と、前記リバースプライマーが伸長したリバース側伸長鎖とを生成し、前記フォワード側伸長鎖と前記リバース側伸長鎖とをアニーリングして３’末端が陥没した二本鎖ＤＮＡを生成する増幅工程と、
    　前記二本鎖ＤＮＡの前記３’末端をクレノウフラグメントにより平滑末端とする平滑化工程と、
    　前記Ｒ１を脱保護して前記式（１）の構造部分でＤＮＡを切断し、３’末端が突出した接着末端を形成する脱保護切断工程と、
    　を備えることを特徴とする二本鎖ＤＮＡの製造方法。
  8. 　前記Ｒ１が前記式（２Ａ）で示される光分解性保護基であり、脱保護切断工程は光照射により前記Ｒ１を脱保護することを特徴とする請求項７に記載の二本鎖ＤＮＡの製造方法。
  9. 　前記Ｒ１が前記式（２Ｂ）で示されるフッ化物分解性保護基であり、脱保護切断工程はフッ化物により前記Ｒ１を脱保護することを特徴とする請求項７に記載の二本鎖ＤＮＡの製造方法。
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