JP2005023050A - 新規核酸誘導体、及びそのフォスフォロアミダイト体、トリリン酸体の製造及び使用 - Google Patents

Abstract

【課題】 新規核酸誘導体、及びそのフォスフォロアミダイト体、トリリン酸体の製造及び使用、すなわち新規な１−デアザデオキシヌクレオシドである１−デアザ−２’−デオキシグアノシン、１−デアザ−２’−デオキシグアノシンフォスフォロアミダイト体および１−デアザ−２’−デオキシグアノシントリリン酸体ならびにそれらの製造法および使用の提供。
【解決手段】 式（１）
【化１】

（式中、R₁およびR_1'は水素原子または水酸基の保護基を示し、R₂は水素原子またはC₁〜C₄のアルキル基であり、C₁〜C₄アルコキシ基で置換されていてもよい）で表される１−デアザ−２’−デオキシグアノシン誘導体。
【選択図】 なし

Description

本発明は、新規なヌクレオシドアナログである１−デアザ−２’−デオキシグアノシン、１−デアザ−２’−デオキシグアノシンフォスフォロアミダイト体、１−デアザ−２’−デオキシグアノシントリリン酸体、それらの製造方法、およびそれらの使用に関する。

デアザプリンヌクレオシド類はヌクレオシド塩基部の環内窒素原子が炭素に置き換わった構造を持っている。このうち、７−デアザプリンヌクレオシド、３−デアザプリンヌクレオシド類は元来天然界に微量成分として存在している化合物であるが、優れた生物活性を示すことから古くから注目され、誘導体合成や生物活性についての研究が行われてきた。１−デアザプリンヌクレオシドに関しては、１−デアザアデノシン誘導体に関する研究がいくつか報告されているが、１−デアザグアノシン誘導体の誘導体合成や生物活性についての研究はほとんどない。

一方、近年の核酸化学の発展により、デアザプリンヌクレオシド誘導体の生物化学分野での応用が発展した。特にこれらのヌクレオシド誘導体を合成核酸に導入する技術の開発により、従来の天然型核酸にはない新たな性質、特徴を有する核酸の合成が可能となった。７−デアザ−２_’−デオキシグアノシン、７−デアザ−２_’−デオキシアデノシンについては現在、ＤＮＡ合成用アミダイト試薬が市販されている(Glen Research社、VA, USAなど)。また、ＤＮＡ塩基配列決定法において、７−デアザ−２_’−デオキシグアノシンのトリリン酸体が広く用いられている（Amersham Biosciences社、NJ, USAなどで配列決定キットが市販されている）（米国特許第4,804,748号公報、米国特許第5,480,980号公報、特開2000-119296号公報、Journal of Organic Chemistry, 1983, Vol.48, 3119-3122, Nucleic Acids Research, 1996, Vol.24, No.15, 2974-2980）。

３−デアザヌクレオシド誘導体についてもその製造法（特開昭60-109594号公報、特開平6-184185号公報、Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 1996, Vol.40, 288-295）が公開されている。また３−デアザ−２’−デオキシグアノシンを鋳型ＤＮＡに導入したもの、およびトリリン酸誘導体を用いたＤＮＡポリメラーゼによる核酸の認識研究についても報告されている。（Biochemistry, 2001, Vol.40, No.9, 2647-2652）。

１−デアザプリンヌクレオシドの例としては、１−デアザ−２’−デオキシアデノシンの製造法、核酸自動合成機によるオリゴヌクレオチド配列への導入、およびＲＮＡ酵素への応用が報告されている（特開昭59-42398号公報、Nucleic Acids Research, 1998, Vol.26, No.4, 1010-1018）。また、１−デアザグアノシンの合成についても報告されている。（Journal of Heterocyclic Chemistry, 1978, Vol.15, 839-847, Tetrahedron, 2000, Vol.56, Issue 40, 7909-7914）。

以上のように、従来技術において、１−デアザグアノシン誘導体については、リボ体の合成技術は確立されているものの、２’−デオキシリボ体、即ち１−デアザ−２’−デオキシグアノシンについては、現在までに製造は試みられていなかった。

一方、塩基部の酸素原子がメチル化されているO⁶−メチル−１−デアザ−２_’−デオ
キシグアノシンの製造、フォスフォロアミダイト体の合成、および合成核酸への導入については報告されている（Biochemistry, 1994, Vol.33, No.37, 11364-11371, Biochemistry, 1999, Vol.38, No.21, 6801-6806）。該O⁶−メチル−１−デアザ−２_’−デオキシグアノシンは、ＤＮＡ認識酵素であるO⁶-Alkylguanine−DNA alkyltransferaseの構造活性相関研究に用いられていた。
米国特許第4,804,748号公報 米国特許第5,480,980号公報 特開2000-119296号公報 特開昭60-109594号公報 特開平6-184185号公報 特開昭59-42398号公報 Journal of Organic Chemistry, 1983, Vol.48, 3119-3122 Nucleic Acids Research.1996, Vol.24, No.15, 2974-2980 Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 1996, Vol.40, 288-295 Biochemistry, 2001, Vol.40, No.9, 2647-2652 Nucleic Acids Research.1998, Vol.26, No.4, 1010-1018 Journal of Heterocyclic Chemistry, 1978, Vol.15, 839-847 Journal of the American Chemical Society, 1957, Vol.79, 670-672 Biochemistry, 1994, Vol.33, No.37, 11364-11371 Biochemistry, 1999, Vol.38, No.21, 6801-6806

本発明は、従来存在しなかった新規な１−デアザデオキシヌクレオシド誘導体である１−デアザ−２’−デオキシグアノシンを合成し、さらに該化合物から１−デアザ−２’−デオキシグアノシンフォスフォロアミダイト体および１−デアザ−２’−デオキシグアノシントリリン酸体を合成し、提供することを目的とする。さらに、本発明は１−デアザ−２’−デオキシグアノシンフォスフォロアミダイト体を用いる事で合成できる１−デアザ−２’−デオキシグアノシンを導入した合成核酸、ＤＮＡ、オリゴヌクレオチド、および１−デアザ−２’−デオキシグアノシントリリン酸体を用い、これを酵素的に取込むことで得られる核酸、ＤＮＡ、オリゴヌクレオチドをも提供することを目的とする。

上述のように、現在までに種々のデオキシプリンヌクレオシド誘導体合成が報告されている。これらのうちの多くはさらに核酸合成機により短鎖核酸配列へと導入され、核酸-蛋白質相互作用解析などの研究に用いられている。また対応するトリリン酸体へと変換され、一部の化合物についてはＤＮＡ／ＲＮＡポリメラーゼを用いた配列決定法などで広く用いられている。

本発明者らは、従来知られていなかった１−デアザヌクレオシド誘導体の合成法について鋭意検討の結果、特定のイミダゾールヌクレオシド化合物を原料として用い、閉環反応を行わせることによる、現在までに未開発であった新規な核酸誘導体、１−デアザ−２’−デオキシグアノシンの製造法を確立した。さらに、本発明者らは該１−デアザ−２’−デオキシグアノシンをフォスフォロアミダイト体へと変換して核酸自動合成機により短鎖核酸配列へと導入した。さらに１−デアザ−２’−デオキシグアノシントリリン酸体の製造方法をも確立した。これらの化合物、および１−デアザ−２’−デオキシグアノシンを導入した短鎖核酸配列を利用した酵素-核酸相互作用解析への応用として、ＤＮＡポリメラーゼを用いた鎖伸長反応等が挙げられる。そしてこの反応により、１−デアザ−２’−デオキシグアノシントリリン酸体を用いて、酵素的に１−デアザ−２’−デオキシグアノシンを核酸配列へと導入できることを示した。また、同様に１−デアザ−２’−デオキシグアノシンを導入した短鎖核酸配列を利用した核酸構造解析への応用として、１−デアザ−２’−デオキシグアノシンが二本鎖構造の熱的安定性に及ぼす影響の測定が挙げられる。

すなわち、本発明は以下の通りである。
[１] 式（１）

（式中、R₁およびR_1'は水素原子または水酸基の保護基を示し、R₂は水素原子またはC₁〜C₄のアルキル基であり、C₁〜C₄アルコキシ基で置換されていてもよい）で表される１−デアザ−２’−デオキシグアノシン誘導体、

[２] 式（１）

（式中、R₁およびR_1'は水素原子または水酸基の保護基を示し、R₂は水素原子またはC₁〜C₄のアルキル基であり、C₁〜C₄アルコキシ基で置換されていてもよい）で表される１−デアザ−２’−デオキシグアノシン誘導体の製造法であって、式（２）

（式中、R₁およびR_1'は水素原子または水酸基の保護基を示す）
で表される化合物を出発原料とし、該化合物を縮合閉環反応に付すことを特徴とする、１−デアザ−２’−デオキシグアノシン誘導体の製造法、

[３] 式（１３）

（式中、R₄はアミノ基の保護基であり、R₅は水素または水酸基の保護基であり、R₆は水酸基の保護基であり、R₇はリン酸保護基であり、R₈は窒素原子上に炭素数１から５の同一のもしくは異なるアルキル基が２つ結合したジアルキルアミノ基またはモルホリン−１−イル基を表し、２つのアルキル基は互いに結合して環を形成していてもよく、R₂は水素原子またはC₁〜C₄のアルキル基であり、C₁〜C₄アルコキシ基で置換されていてもよい）で表される１−デアザ−２’−デオキシグアノシン誘導体のフォスフォロアミダイト体、

[４] R₄がN,N-ジ-n-ブチルホルムアミジノ基であり、R₅がN,N-ジフェニルカルバモイル基であり、R₆がジメトキシトリチル基であり、R₇が2-シアノエチル基であり、R₈がジイソプロピルアミノ基である請求項３記載の１−デアザ−２’−デオキシグアノシン誘導体のフォスフォロアミダイト体、

[５] [３]または[４]の１−デアザ−２’−デオキシグアノシン誘導体のフォスフォロアミダイト体の製造法であって、式（７）で表される化合物

（式中、R₁およびR_1'は水酸基の保護基を示し、R₂は水素原子またはC₁〜C₄のアルキル基であり、C₁〜C₄アルコキシ基で置換されていてもよい）のアミノ基を保護、あるいはアミノ基および水酸基を保護することを特徴とする、１−デアザ−２’−デオキシグアノシン誘導体のフォスフォロアミダイト体の製造法、

[６] １−デアザ−２’−デオキシグアノシン誘導体のフォスフォロアミダイト体を用いて製造した核酸、ＤＮＡまたはオリゴヌクレオチド、
[７] １−デアザ−２’−デオキシグアノシン誘導体を含む核酸、ＤＮＡまたはオリゴヌクレオチド、
[８] １−デアザ−２’−デオキシグアノシン誘導体のフォスフォロアミダイトを用いて核酸、ＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドを製造する方法、

[９] 式（１５）

（R₂は水素原子またはC₁〜C₄のアルキル基であり、C₁〜C₄アルコキシ基で置換されていてもよい）で表される１−デアザ−２’−デオキシグアノシン誘導体のトリリン酸体。

[１０] 式（１５）

（R₂は水素原子またはC₁〜C₄のアルキル基であり、C₁〜C₄アルコキシ基で置換されていてもよい）で表される１−デアザ−２’−デオキシグアノシン誘導体のトリリン酸体の製造法であって、
式（１０）

（式中、R₄は水素またはアミノ基の保護基であり、R₅は水素または水酸基の保護基であり、R₂は水素原子またC₁〜C₄のアルキル基であり、C₁〜C₄アルコキシ基で置換されていてもよい）で表される化合物からリン酸化反応により5'位をトリリン酸化することを特徴とする製造法、ならびに
[１１] [９]のトリリン酸体をＤＮＡ合成酵素または逆転写酵素を用いて酵素的に取込ませた核酸、ＤＮＡまたはオリゴヌクレオチド。

本発明の製造法により、従来存在しなかった１−デアザデオキシヌクレオシドである１−デアザ−２’−デオキシグアノシンが提供される。１−デアザ−２’−デオキシグアノシンから１−デアザ−２’−デオキシグアノシンフォスフォロアミダイト体が製造でき、１−デアザ−２’−デオキシグアノシンを含む合成ＤＮＡを得ることができる。また、１−デアザ−２’−デオキシグアノシントリリン酸も提供される。これらの１−デアザ−２’−デオキシグアノシンおよびその誘導体は、核酸の構造解析、核酸と核酸との相互作用解析、タンパク質と核酸との相互作用解析等に用い得る。

１−デアザ−２_’−デオキシグアノシンはヌクレオシドレベルでの構造解析等に使用で
きる。
１−デアザ−２_’−デオキシグアノシンフォスフォロアミダイト体は１−デアザ−２_’
−デオキシグアノシンを合成短鎖ＤＮＡの任意の配列、場所に導入する方法を提供し、ＤＮＡレベルでの核酸・蛋白質相互作用解析などに広く利用可能である。

１−デアザ−２_’−デオキシグアノシン−５_’−トリリン酸体は種々の核酸合成酵素な
どの機能解析などに利用できる。また、１−デアザ−２_’−デオキシグアノシン−５_’−
トリリン酸体を用いて、ＤＮＡ合成酵素、逆転写酵素などにより、酵素的にこれを取込ませた核酸、ＤＮＡ、オリゴヌクレオチドを提供する。

以下、本発明を詳細に説明する。
１． １−デアザ−２’−デオキシグアノシンの合成法
本発明は、式（１）

（式中、R₁およびR_1'は水素原子または水酸基の保護基を示し、R₂は水素原子またはC₁〜C₄のアルキル基であり、C₁〜C₄アルコキシ基で置換されていてもよい）で表される１−デアザ−２’−デオキシグアノシン誘導体の合成法であって、式（２）

（式中、R₁およびR_1'は水素原子または水酸基の保護基を示す）
で表される化合物（ＡＩＣＡデオキシリボシド）を出発原料とする合成法である。式（２）で表される化合物は、容易に合成できる他、市販のものを入手することができる。

式（１）で表される化合物中、R₁およびR_1'はヌクレオシドおよびヌクレオチドの糖部水酸基の保護基として常用されている基であり、水素またはトリイソプロピルシリル（TIPS）、ジエチルイソプロピルシリル、ジメチルテキシルシリル、t-ブチルジメチルシリル、t-ブチルジフェニルシリル、トリフェニルシリルなどのシリル系保護基等、ベンジル、フェネチル、アリルエーテル、p-メトキシベンジル、トリフェニルメチル等が挙げられる。この中でもトリイソプロピルシリル基が望ましい。合成の最初の反応では、式（２）で表される化合物のイミダゾール部５位アミノ基と４位カルボキシアミド基をt-ブチルオキシカルボニル基等でアルキルオキシカルボニル化する。t-ブチルオキシカルボニル化はジ-t-ブチルジカーボネートと反応させればよい。この際、1,2-ジクロロエタン等の適当な有機溶媒中で反応を行えばよい。反応は、室温から８０℃で１時間〜３日間行えばよい。次いで、テトラヒドロフラン等の適当な有機溶媒中で、ブチルリチウム等の有機金属試薬とアセトニトリル等のカルボニトリル（RCN、Rは炭化水素鎖を表す）を−７８〜０℃で３０分〜２時間反応させた反応混液中に添加し、−７８〜０℃で３０分〜２時間反応させる。カルボニトリルと反応させた後に、５位アミノ基に１つまたは２つののアルキルオキシカルボニル基（R₃）が残り、これを除去する。これらの一連の反応により、式（３−１）および式（４−１）で表される中間体化合物

（式中、R₁およびR_1'は水素原子または水酸基の保護基を示し、R₃はアルキルオキシカルボニル保護基を表す）

（式中、R₁およびR_1'は水素原子または水酸基の保護基を示し、R₂は水素原子またはC₁〜C₄のアルキル基であり、C₁〜C₄アルコキシ基で置換されていてもよい、R₃はアルキルオキシカルボニル保護基を示す）を経て、出発原料の４位のカルボキシアミド基がシアノアセチル基（COCHR₂CN）に置換された式（５）で表される化合物が生成する。R₃のアルキルオキシカルボニル系保護基としては、t-ブチルオキシカルボニル（Boc）、ベンジルオキシカルボニル、イソニコチルオキシカルボニル、アリルオキシカルボニルなどが挙げられる。なお、アルキルオキシカルボニル保護基の種類によっては、式（３）で表される化合物から式（５）で表される化合物に至るまでの中間体である式（４）で表される化合物の構造が異なってくる。すなわち、例えばt-ブチルオキシカルボニル基を用いた場合、アセトニトリルアニオンとの反応により、反応部位ではない５位アミノ基のt-ブチルオキシカルボニル基は１つ外れ、１つ残るが、保護基によっては２つ共に残ることが予測される。残った保護基が１つでも２つでも、この保護基はカルボニトリルアニオンとの反応の後に脱保護することにより、式（５）で表される化合物が得られる。t-ブチルオキシカルボニル基を用いた場合、１つ残ったこの保護基は化合物をシリカゲル上で加熱することにより除去できる。

（式中、R₁およびR_1'は水素原子または水酸基の保護基を示し、R₂は水素原子またはC₁〜C₄のアルキル基であり、C₁〜C₄アルコキシ基で置換されていてもよい）なお、式（３−１）で表される化合物のうち、アルキルオキシカルボニル保護基としてt-ブチルオキシカルボニル基を用いた場合の化合物を式（３−２）で表す。

さらに、式（４−１）で表される化合物のN(R₃)₂は式（４−２）で表される化合物のように、NHR₃であってもよい。

ここで、R₁またはR_1'がシリル系の水酸基保護基である場合、フッ化テトラブチルアンモニウム等により、これを除去して水素原子に置換し、式（６）で表される化合物を得る。

（式中、R₂は水素原子またC₁〜C₄のアルキル基であり、C₁〜C₄アルコキシ基で置換されていてもよい）

次いで、式（５）または式（６）で表される化合物をアルカリ処理に付すことにより式（７）で表される１−デアザ−２’−デオキシグアノシン誘導体を得ることができる。

（式中、R₁およびR_1'は水素原子または水酸基の保護基を示し、R₂は水素原子またはC₁〜C₄のアルキル基であり、C₁〜C₄アルコキシ基で置換されていてもよい。）

この際、アルカリ処理は炭酸ナトリウム、炭酸カリウム等の炭酸塩の水溶液とエタノール、メタノール等のアルコール類との混合液中で、５０〜１００℃で１〜５時間加熱すればよい。

２． １−デアザ−２’−デオキシグアノシン誘導体のフォスフォロアミダイト体の合成
式（７）で表される化合物を出発原料として、１−デアザ−２’−デオキシグアノシンのフォスフォロアミダイト体を合成する。

R₁またはR_1'が水酸基の保護基である式（７）で表される化合物の塩基部５位のアミノ基および７位の水酸基を順次保護し、R₁またはR_1'が水酸基の保護基である式（８）で表される化合物を経て、R₁またはR_1'が水酸基の保護基である式（９）で表される化合物を得る。この際、７位の水酸基には保護基を導入しなくてもよいが、導入したほうが望ましい。

さらに、水酸基の保護基がシリル系の保護基である場合、フッ化テトラブチルアンモニウム等により、これを除去して水素原子に置換し、式（１０）で表される化合物を得る。

式（８）、式（９）および式（１０）中、R₄は、ヌクレオシドおよびヌクレオチドの塩基部アミノ基の保護基として常用されているものであり、N,N-ジ-n-ブチルホルムアミジン、N,N-ジメチルホルムアミジン、N,N-ジエチルホルムアミジン、N,N-ジイソプロピルホルムアミジン、N,N-ジイソブチルホルムアミジン、N,N-ジメチルアセトアミジン、N-メチルピロリジンなどのアミジン系保護基、アセチル、ベンゾイル、イソブチル、フェノキシアセチル、4-(t-ブチル)フェノキシアセチル、p-トルオイル、p-アニソイルなどのアシル基が挙げられる。R₅は、水素または水酸基の保護基であり、水酸基の保護基としてはヌクレオシドおよびヌクレオチドの塩基部水酸基の保護基として常用されているものであり、N,N-ジフェニルカルバモイル、N,N-ジメチルカルバモイル、N,N-ジフェニルチオカルバモイルなどのカルバモイル基、アセチル、ベンゾイル、イソブチリル、フェノキシアセチル、４-(t-ブチル)フェノキシアセチル、p-トルオイル、p-アニソイルなどのアシル基が挙げられる。R₂は水素原子またはC₁〜C₄のアルキル基であり、C₁〜C₄アルコキシ基で置換されていてもよい。

次いで、糖部５'位水酸基を保護し、式（１１）で表される化合物を得る。

式（１１）中、R₂、R₄およびR₅は上記定義と同じであり、R₆はＤＮＡまたはＲＮＡの化学合成において、ヌクレオシド糖部５'位水酸基の保護基として常用されているものであり、ジメトキシトリチル（DMTr）、モノメトキシトリチル、トリメトキシトリチル、トリチルなどのトリチル基が挙げられる。

次いで、式（１１）で表される化合物を、式（１２−１）または式（１２−２）で表される化合物と反応させる。式（１２−１）で表される化合物との反応では、塩化メチレン等の適当な有機溶媒中で有機塩基の存在下、０℃〜室温で１０分〜３時間反応させる。存在させる有機塩基は限定されないが、例えばN,N-ジイソプロピルエチルアミンを用いればよい。

また、式（１２−２）で表される化合物との反応では、塩化メチレン、アセトニトリル等の適当な有機溶媒中で活性化剤の存在下、０℃〜室温で１０分〜２４時間反応させる。存在させる活性化剤は限定されないが、例えば１H-テトラゾール、ジイソプロピルアンモニウムテトラゾール、4,5-ジシアノイミダゾール、ヒドロキシベンズトリアゾール等を用いればよい。

式（１２−１）および式（１２−２）中、R₇はＤＮＡまたはＲＮＡの合成において、フォスフォロアミダイトのリン酸部の保護基として常用されているものであり、2-シアノエチル、アリル、N-(トリフルオロアセチル)アミノブチル、4-オキシペンチル、2-[(ナフチル)カルバモイルオキシ]エチル、トリメチルシリルエチル、ジフェニルメチルシリルエチルなどが挙げられる。R₈は窒素原子上に炭素数１から５の同一、もしくは異なるアルキル基が２つ結合したジアルキルアミノ基またはモルホリン-1-イル基を表し、２つのアルキル基は互いに結合して環を形成していてもよい。このようなジアルキルアミノ基として、ジイソプロピルアミノ基、ジメチルアミノ基等が挙げられる。式（１２−１）で表される化合物として、2-シアノエチル-ジイソプロピルクロロフォスフォロアミダイト、2-シアノエチル-ジメチルクロロフォスフォロアミダイト等が挙げられ、式（１２−２）で表される化合物として、2-シアノエチルテトライソプロピルフォスフォロジアミダイト等が挙げられる。

糖部３'位水酸基に式（１２−１）または式（１２−２）で表される化合物が結合した式（１３）で表されるフォスフォロアミダイト体を得ることができる。

式（１３）中、R₂、R₄、R₅、R₆、R₇およびR₈は上に定義したのと同じである。

３． １−デアザ−２’−デオキシグアノシン誘導体のＤＮＡへの導入
このようにして得られたフォスフォロアミダイト体を用いて、１−デアザ−２’−デオキシグアノシン誘導体を有する核酸、ＤＮＡ、オリゴヌクレオチドを合成することができる。ＤＮＡの合成は公知のフォスフォロアミダイト法で行うことができ、市販のＤＮＡ自動合成機、および市販のＤＮＡ自動合成機用の試薬や溶媒を用いて行えばよい。例えば、フォスフォロアミダイト法によるＤＮＡ合成は以下のようにして行なう。糖部５'位の水酸基が保護されているヌクレオシドの糖部３'位水酸基を介して、ＣＰＧやポリスチレン等の固相担体に結合させ、脱保護試薬により糖部５'位水酸基に結合している保護基を取り除き５'位を水酸基に変える。次いでヌクレオシドフォスフォロアミダイト体を添加し、フォスフォロアミダイト体と担体に結合したヌクレオシドの５'位水酸基の部分をリン酸結合により連結させる。新たに生じた糖部５'位水酸基の脱保護、新たなヌクレオシドフォスフォロアミダイト体との縮合反応を繰り返し、ＤＮＡ鎖を伸長させる。目的とするＤＮＡ配列合成後、合成ＤＮＡを固相担体から切り出し、１−デアザ−２’−デオキシグアノシン誘導体およびその他のヌクレオシの塩基部保護基、リン酸部保護基を除去する。ＤＮＡ自動合成機としては、例えばApplied Biosystems社のモデル394等がある。また、合成したＤＮＡは逆相ＨＰＬＣ等により精製すればよい。ＤＮＡの合成は例えば、新生化学実験講座２ 核酸III 組換えDNA技術 日本生化学会編 東京化学同人 1992年10月5日発行 の記載に従って行うことができる。

４． １−デアザ−２’−デオキシグアノシン誘導体のトリリン酸体の合成
化学式（１０）で表される化合物を出発物質として、糖部５'位水酸基にリン酸基を結合させ、保護した塩基部水酸基およびアミノ基を脱保護することにより、式（１４）で表される中間体を経て、式（１５）で表される１−デアザ−２’−デオキシグアノシン誘導体の５'位トリリン酸体を合成する。リン酸基の結合および脱保護は公知の方法により行うことができる。なお、塩基部のアミノ基および水酸基に保護基を導入しない、またはアミノ基の保護基のみでもトリリン酸体を合成することが可能である。リン酸基の結合は、溶媒としてのリン酸トリメチル内のリン酸化反応剤、例えばオキシ塩化リンを用いてリン酸化反応を行い、モノリン酸中間体を得て、さらに、ジメチルホルムアミド等の適当な溶媒に溶解させたトリス(テトラブチルアンモニウム)ハイドロゲンピロリン酸等と縮合することにより製造する。

式（１４）および式（１５）中、R₂、R₄およびR₅は上記定義と同じである。

５．1-デアザ-2'-デオキシグアノシン誘導体、そのフォスフォロアミダイト体およびトリリン酸体の使用
上記のようにして合成した１−デアザ−２’−デオキシグアノシンを含む鋳型ＤＮＡを用いて、鋳型中の１−デアザ−２’−デオキシグアノシンに対する、ＤＮＡ合成酵素（ＤＮＡポリメラーゼ等）による天然型ヌクレオシドトリリン酸体の取り込み（導入）の検討を行うことができる。

また、天然型核酸である鋳型とプライマーを用いて、上記の１−デアザ−２’−デオキシグアノシン−５’−トリリン酸体のプライマー鎖へのＤＮＡ合成酵素（ＤＮＡポリメラーゼ等）による取込み（導入）の検討を行うことができる。この方法により、製造したトリリン酸体を用いて、ＤＮＡ合成酵素、逆転写酵素などにより、酵素的にこれを取込ませた核酸、ＤＮＡ、オリゴヌクレオチドを得ることができる。

さらに、ＤＮＡ二本鎖内に導入した１−デアザ−２’−デオキシグアノシン誘導体が二本鎖の熱的安定性、および二本鎖の高次構造に与える影響を解析することができる。
さらに、上記の方法により合成した核酸、ＤＮＡおよびオリゴヌクレオチドを利用して核酸・蛋白質相互作用の解析を行うことができ、上記１−デアザ−２’−デオキシグアノシン−５’−トリリン酸体を用いても同様に、ヌクレオシドトリリン酸体を認識する酵素に与える影響を調べることができる。
また、フォスフォロアミダイト体およびトリリン酸体を用いて合成した核酸、ＤＮＡおよびオリゴヌクレオチドを利用したＸ線構造解析などの核酸構造解析研究にも応用できる。

本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。

１-（２’-デオキシ-３’,５’-ジ-Ｏ-トリイソプロピルシリル-β-Ｄ-リボフラノシル）-５-［Ｎ,Ｎ-ジ-（ｔ-ブトキシカルボニル）］アミノイミダゾール-４-［Ｎ,Ｎ-ジ-（ｔ-ブトキシカルボニル）］カルボキシアミド（図１の化合物Ｂ）
アルゴン雰囲気下、１-（２’-デオキシ-３’,５’-ジ-Ｏ-トリイソプロピルシリル-β-Ｄ-リボフラノシル）-５-アミノイミダゾール-４-カルボキシアミド２.４５ｇ（４.４５ｍｍｏｌ）を１,２-ジクロロエタン６０ｍｌに溶解し、ジ-ｔ-ブチルジカーボネート６.１３ｍｌ（６当量）、トリエチルアミン２.５０ｍｌ（４当量）、４-ジメチルアミノピリジン１１０ｍｇ（０.２当量）を加えて７５℃で１時間加熱撹拌した。反応液を室温まで冷ました後、溶媒を留去し残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：酢酸エチル−ヘキサン）により精製して標記化合物３.３０ｇ（収率７８％）を得た（図１のＡ→Ｂ）。

FAB-MS (LR): m/z 955 (MH⁺)
¹H NMR (270 MHz, DMSO-d₆ ) δ: 7.99 (s, 1 H), 5.78 (t, 1 H, J = 6.3 Hz), 4.64 (td, 1 H, J = 3.6, 4.3 Hz), 3.94 (ddd, 1 H, J = 3.3, 3.6, 4.0 Hz), 3.85 (dd, 1 H, J = 4.0, 12.9 Hz), 3.83 (dd, 1 H, J = 3.3, 12.9 Hz), 2.35 (dd, 2 H, J = 4.3, 6.3 Hz), 1.39 (s, 18 H), 1.34 (s, 18 H), 1.05 - 1.00 (m, 42 H).
¹³C NMR (67.8 MHz, DMSO-d₆) δ: 162.05 (C), 149.46 (C), 148.45 (C), 148.19 (C), 132.55 (CH), 131.69 (C), 127.58 (C), 87.21 (CH), 83.48 (CH), 83.37 (C), 83.30 (C), 83.21 (C), 71.03 (CH), 62.45 (CH₂), 41.63 (CH₂), 27.19 (CH₃), 27.16 (CH₃), 17.77 (CH₃), 17.72 (CH₃), 11.55 (CH), 11.31 (CH).

５-アミノ-４-シアノアセチル-１-（２’-デオキシ-３’,５’-ジ-Ｏ-トリイソプロピルシリル-β-Ｄ-リボフラノシル）イミダゾール（図１の化合物Ｄ）
アルゴン雰囲気下、−７８℃に冷却したｎ-ブチルリチウム溶液２.５２ｍｌ（１.６３Ｍ，５当量）のテトラヒドロフラン（１５ｍｌ）溶液に、アセトニトリル０.２４ｍｌ（５.５当量）を１５分かけてゆっくりと滴下し、同温度で３０分撹拌した。この反応液に１-（２’-デオキシ-３’,５’-ジ-Ｏ-トリイソプロピルシリル-β-Ｄ-リボフラノシル）-５-［Ｎ,Ｎ-ジ-（ｔ-ブトキシカルボニル）］アミノイミダゾール-４-［Ｎ,Ｎ-ジ-（ｔ-ブトキシカルボニル）］カルボキシアミド７８０ｍｇ（０.８２ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（７.０ｍｌ）溶液をゆっくりと滴下し、−７８℃で１.５時間撹拌した。飽和塩化アンモニウム水溶液４ｍｌを加えて反応を止めた後室温に戻し、酢酸エチル８０ｍｌを加え、水３０ｍｌで２回、飽和食塩水３０ｍｌで１回洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムにより乾燥した。溶液を減圧下濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：酢酸エチル-ヘキサン）により精製し、５-［Ｎ-（ｔ-ブトキシカルボニル）］アミノ-４-シアノアセチル-１-（２’-デオキシ-３’,５’-ジ-Ｏ-トリイソプロピルシリル-β-Ｄ-リボフラノシル）イミダゾール［FAB-MS (LR): m/z 679 (MH⁺)］を得た（図１の化合物Ｃ）。この化合物をクロロホルム５ｍｌに溶解し、シリカゲル１２ｇを加えてロータリーエバポレーターにより溶媒を減圧留去し乾燥した。このシリカゲルを減圧下、８０℃で２.５時間過熱することで、ｔ-ブトキシカルボニル基を除去し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：酢酸エチル−ヘキサン）により精製して標記化合物１９４ｍｇ（収率２工程４１％）を得た（図１のＢ→Ｃ→Ｄ）。

FAB-MS (LR): m/z 579 (MH⁺)
¹H NMR (270 MHz, DMSO-d₆) δ: 7.38 (s, 1 H), 6.99 (br s, 2 H), 6.01 (dd, 1 H, J = 5.9, 7.6 Hz), 4.60 (m, 1 H), 4.13 (s, 2 H), 3.91 (m, 1 H), 3.80 (dd, 1 H, J = 4.6, 11.2 Hz), 3.74 (dd, 1 H, J = 4.3, 11.2 Hz), 2.51 (ddd, 1 H, J = 6.3, 7.6, 13.3 Hz), 2.31 (ddd, 1 H, J = 2.6, 5.9, 13.3 Hz), 1.08 - 0.99 (m, 42 H).
¹³C NMR (67.8 MHz, DMSO-d₆) δ: 179.96 (C), 146.48 (C), 128.75 (CH), 117.88 (C), 116.32 (C), 87.35 (CH), 82.29 (CH), 71.91 (CH), 62.92 (CH₂), 39.74 (CH₂), 27.21 (CH₂), 17.69 (CH₃), 17.63 (CH₃), 11.42 (CH), 11.19 (CH).

５-アミノ-３-（２’-デオキシ-３’,５’-ジ-Ｏ-トリイソプロピルシリル-β-Ｄ-リボフラノシル）イミダゾ［４,５-ｂ］ピリジン-７-オン（図１の化合物Ｅ）
５-アミノ-４-シアノアセチル-１-（２’-デオキシ-３’,５’-ジ-Ｏ-トリイソプロピルシリル-β-Ｄ-リボフラノシル）イミダゾール５２０ｍｇ（０.９０ｍｍｏｌ）をエタノール-５％炭酸ナトリウム水混合溶液（３：１）４０ｍｌに溶解し、９０℃で３.５時間過熱撹拌した。減圧下溶媒を留去した後、残渣を酢酸エチル８０ｍｌに溶解し、水３０ｍｌで２回、飽和食塩水３０ｍｌで１回洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムにより乾燥した。溶液を減圧下濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：酢酸エチル−ヘキサン）により精製して標記化合物４４７ｍｇ（収率８６％）を得た（図１のＤ→Ｅ）。

FAB-MS (LR): m/z 579 (MH⁺)
¹H NMR (270 MHz, DMSO-d₆) δ: 10.53 (br s, 1 H), 7.94 (s, 1 H), 6.27 (dd, 1 H, J = 5.9, 6.6 Hz), 5.79 (s, 1 H), 5.66 (br s, 2 H), 4.66 (ddd, 1 H, J = 1.9, 2.3, 5.3 Hz), 3.91 (ddd, 1 H, J = 1.9, 4.3, 5.6 Hz), 3.86 (dd, 1 H, J = 5.6, 10.6 Hz), 3.72 (dd, 1 H, J = 4.3, 10.6 Hz), 2.81 (ddd, 1 H, J = 5.3, 8.6, 13.2 Hz), 2.26 (ddd, 1 H, J = 2.3, 5.9, 13.2 Hz), 1.10 - 0.99 (m, 42 H).
¹³C NMR (67.8 MHz, DMSO-d₆) δ: 157.91 (C), 156.50 (C), 146.99 (C), 135.20 (CH), 118.40 (C), 89.40 (CH), 86.97 (CH), 81.97 (CH), 72.51 (CH), 63.25 (CH₂), 38.95 (CH₂), 17.72 (CH₃), 17.65 (CH₃), 11.44 (CH), 11.22 (CH).

５-アミノ-４-シアノアセチル-１-（２’-デオキシ-β-D-リボフラノシル）イミダゾール（図１の化合物Ｆ）
アルゴン雰囲気下、５-アミノ-４-シアノアセチル-１-（２’-デオキシ-３’,５’-ジ-Ｏ-トリイソプロピルシリル-β-Ｄ-リボフラノシル）イミダゾール５０３ｍｇ（０.８７ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン１０ｍｌに溶解し、氷冷下フッ化テトラブチルアンモニウム溶液２.１７ｍｌ（１.０Ｍ−テトラヒドロフラン溶液、２.５当量）を加え、室温に戻し１時間撹拝した。酢酸０.１２ｍｌ（２.５当量）を加えて中和した後、反応液を減圧下濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：エタノール−クロロホルム）により精製して標記化合物１７４ｍｇ（収率７５％）を得た（図１のＤ→Ｆ）。

FAB-MS (LR): m/z 267 (MH⁺)
¹H NMR (270 MHz, DMSO-d₆) δ: 7.43 (s, 1 H), 7.04 (br s, 2 H), 6.00 (dd, 1 H, J = 6.1, 7.6 Hz), 5.29 (br m, 2 H), 4.32 (ddd, 1 H, J = 2.6, 3.0, 5.9 Hz), 4.13 (s, 2 H), 3.84 (m, 1 H), 3.55 (m, 2 H), 2.38 (ddd, 1 H, J = 5.9, 7.6, 13.2 Hz), 2.15 (ddd, 1 H, J = 2.6, 6.1, 13.2 Hz).
¹³C NMR (67.8MHz, DMSO-d₆) δ: 179.85 (C), 146.30 (C), 129.93 (CH), 117.95 (C), 116.39 (C), 87.37 (CH), 83.42 (CH), 70.40(CH), 61.10 (CH₂), 39.26 (CH₂), 27.16 (CH₂).

５-アミノ-３- (２’-デオキシ-β-D-リボフラノシル)イミダゾ[４，５-ｂ]ピリジン-７-オン〔１-デアザ-２’-デオキシグアノシン〕（図１の化合物Ｇ）
５-アミノ-４-シアノアセチル-１-（２’-デオキシ-β-D-リボフラノシル）イミダゾール１７０ｍｇ（０.６４ｍｍｏｌ）をエタノール−５％炭酸ナトリウム水混合溶液（２：１）１５ｍｌに溶解し、９０℃で３時間過熱撹絆した。減圧下反応溶液を濃縮した後、水50m1に溶解し、飽和塩化アンモニウム水溶液を加えて溶液のｐＨを８とした。この溶液に活性炭３.０ｇを加えて１５分間攪拌し、カラムクロマトグラフィー用のガラス管に移した。活性炭に水２００ｍｌを流して洗浄した後、エタノール／濃アンモニア水（２：１）１００ｍｌにより溶出し、溶媒を留去することにより標記化合物９８ｍｇ（収率５８％）を得た（図１のＦ→Ｇ）。

FAB-MS (LR): m/z 267 (MH⁺)
1H NMR (270 MHz, DMSO-d₆) δ: 10.57 (br s, 1 H), 7.98(s, 1H), 6.26(dd, 1H J = 5.9, 8.3 Hz), 5.81 (s, 1 H), 5.64 (br s, 2 H), 5.31 (br s, 1 H), 5.25 (br s, 1 H), 4.36 (ddd, 1 H, J = 2.3, 3.2, 5.6Hz), 3.84 (ddd, 1H, J = 2.7, 3.2, 4.3 Hz), 3.59 (dd, 1 H, J = 4.3, 11.9 Hz), 3.51 (dd, 1 H, J = 2.7, 11.9 Hz), 2.61 (ddd, 1 H, J = 5.6, 8.3, 13.1 Hz), 2.61 (ddd, 1 H, J = 2.3, 5.9, 13.1 Hz).
¹³C NMR (67.8 MHz, DMSO-d₆) δ: 157.87 (C), 156.83(C), 146.80 (C), 136.02 (CH), 118.72 (C), 89.43 (CH), 87.50 (CH), 83.06 (CH), 71.07 (CH), 62.04 (CH₂), 39.34 (CH₂).

３-（２’-デオキシ-３’,５’-ジ-Ｏ-トリイソプロピルシリル-β-Ｄ-リボフラノシル）-５-（Ｎ,Ｎ-ジ-ｎ-ブチルホルムアミジノ）アミノ-７-（Ｎ,Ｎ-ジフェニルカルバモイル）オキシイミダゾ［４,５-ｂ］ピリジン（図２の化合物Ｈ）
アルゴン雰囲気下、５-アミノ-３-（２’-デオキシ-３’,５’-ジ-Ｏ-トリイソプロピルシリル-β-Ｄ-リボフラノシル）イミダゾ［４,５-ｂ］ピリジン-７-オン１.００ｇ（１.７３ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド３０ｍｌに溶解し、Ｎ,Ｎ-ジ-ｎ-ブチルホルムアミドジメチルアセタール０.８３ｍｌ（２当量）を加えて室温で３時間撹拌した。反応液に酢酸エチル３００ｍｌを加え、水１００ｍｌで４回、飽和食塩水１００ｍｌで１回洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムにより乾燥した。溶媒を留去後減圧下乾燥し、３-（２’-デオキシ-３’,５’-ジ-Ｏ-トリイソプロピルシリル-β-Ｄ-リボフラノシル）-５-（Ｎ,Ｎ-ジ-ｎ-ブチルホルムアミジノ）アミノイミダゾ［４,５-ｂ］ピリジン-７-オンを粗精製物として得た。この化合物をアルゴン雰囲気下ピリジン３０ｍｌに溶解し、ジイソプロピルエチルアミン０.４５ｍｌ（１.５当量）、塩化ジフェニルカルバモイル１.２０ｇ（３当量）を加え、室温で２時間撹拌した。エタノール２ｍｌを加えて反応を止めた後、減圧下溶媒を留去した。残渣を酢酸エチル１５０ｍｌに溶解し、水５０ｍｌで２回、飽和食塩水５０ｍｌで１回洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムにより乾燥した。溶液を減圧下濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（中性シリカゲル、溶出溶媒：酢酸エチル−ヘキサン）により精製して標記化合物１.６７ｇ（収率９７％）を得た（図２のＥ→Ｈ）。

FAB-MS (LR): m/z 913 (MH⁺)
¹H NMR (270 MHz, DMSO-d₆) δ: 8.39 (s, 1 H), 8.33 (s, 1 H), 7.50 - 7.25 (m, 10 H), 6.64 (s, 1 H), 6.45 (dd, 1 H, J = 5.9, 8.2 Hz), 4.70 (ddd, 1 H, J = 1.8, 2.0, 5.4 Hz), 3.96 (ddd, 1 H, J = 1.8, 4.9, 6.0 Hz), 3.83 (dd, 1 H, J = 6.0, 10.9 Hz), 3.75 (dd, 1 H, J = 4.9, 10.9 Hz), 3.44 (t, 2 H, J = 7.3 Hz), 3.30 (t, 2 H, J = 7.3 Hz), 3.00 (ddd, 1 H, J = 5.4, 8.2, 13.5 Hz), 2.35 (ddd, 1 H, J = 2.0, 5.9, 13.5 Hz), 1.59 - 1.51 (m, 4 H), 1.35 - 1.22 (m, 4 H), 1.07 - 0.98 (m, 48 H).
¹³C NMR (67.8 MHz, DMSO-d₆) δ: 159.53 (C), 154.32 (CH), 151.03 (C), 149.47 (C), 146.83 (C), 141.80 (C), 140.63 (CH), 128.88 (CH), 126.75 (CH), 123.73 (C), 105.83 (CH), 87.36 (CH), 82.96 (CH), 72.83 (CH), 63.39 (CH₂), 50.44 (CH₂), 44.27 (CH₂), 38.67 (CH₂), 30.58 (CH₂), 28.80 (CH₂), 19.45 (CH₂), 19.07 (CH₂), 17.70 (CH₃), 17.68 (CH₃), 17.62 (CH₃), 17.59 (CH₃), 13.68 (C), 13.39 (C), 11.47 (CH), 11.20 (CH).

３-（２’-デオキシ-β-Ｄ-リボフラノシル）-５-（Ｎ,Ｎ-ジ-ｎ-ブチルホルムアミジノ）アミノ-７-（Ｎ,Ｎ-ジフェニルカルバモイル）オキシイミダゾ［４,５-ｂ］ピリジン（図２の化合物Ｉ）
アルゴン雰囲気下、３-（２’-デオキシ-３’,５’-ジ-Ｏ-トリイソプロピルシリル-β-Ｄ-リボフラノシル）-５-（Ｎ,Ｎ-ジ-ｎ-ブチルホルムアミジノ）アミノ-７-（Ｎ,Ｎ-ジフェニルカルバモイル）オキシイミダゾ［４,５-ｂ］ピリジン１.４５ｇ（１.５９ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン５０ｍｌに溶解し、氷冷下フッ化テトラブチルアンモニウム溶液４.７７ｍｌ（１.０Ｍテトラヒドロフラン溶液，３当量）を加え、室温に戻し１時間撹拌した。酢酸０.２７ｍｌ（１当量）を加えて中和した後、反応液を減圧下濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（中性シリカゲル、溶出溶媒：エタノール−クロロホルム）により精製して標記化合物８３０ｍｇ（収率８７％）を得た（図２のＨ→Ｉ）。

FAB-MS (LR): m/z 601 (MH⁺)
¹H NMR (270 MHz, DMSO-d₆) δ: 8.42 (s, 1 H), 8.39 (s, 1 H), 7.50 - 7.27 (m, 10 H), 6.63 (s, 1 H), 6.42 (dd, 1 H, J = 5.9, 6.6 Hz), 5.32 (br s, 1 H), 4.97 (br s, 1 H), 4.43 (br ddd, 1 H, J = 1.9, 3.3, 5.9 Hz), 3.86 (ddd, 1 H, J = 1.9, 4.6, 5.0 Hz), 3.60 (br dd, 1 H, J = 4.6, 11.5 Hz), 3.52 (br dd, 1 H, J = 5.0, 11.5 Hz), 3.44 (t, 2 H, J = 7.3 Hz), 3.35 (t, 2 H, J = 7.2 Hz), 2.78 (ddd, 1 H, J = 5.9, 7.2, 13.2 Hz), 2.28 (ddd, 1 H, J = 3.3, 6.3, 13.2 Hz), 1.63 - 1.50 (m, 4 H), 1.38 - 1.22 (m, 4 H), 0.92 (t, 3 H, J = 7.3 Hz), 0.91 (t, 3 H, J = 7.3 Hz).
¹³C NMR (67.8 MHz, DMSO-d₆) δ: 15958 (C), 154.61 (CH), 151.06 (C), 149.44 (C), 146.80 (C), 141.78 (C), 140.84 (CH), 128.89 (CH), 126.72 (CH), 126.49 (CH), 123.66 (C), 105.72 (CH), 87.48 (CH), 83.04 (CH), 70.74 (CH), 61.72 (CH₂), 50.42 (CH₂), 44.11 (CH₂), 39.26 (CH₂), 30.57 (CH₂), 28.57 (CH₂), 19.56 (CH₂), 19.07 (CH₂), 13.67 (CH₃), 13.50 (CH₃).

３-［２’-デオキシ-５’-Ｏ-（４,４-ジメトキシトリチル）-β-Ｄ-リボフラノシル］-５-（Ｎ,Ｎ-ジ-ｎ-ブチルホルムアミジノ）アミノ-７-（Ｎ,Ｎ-ジフェニルカルバモイル）オキシイミダゾ［４,５-ｂ］ピリジン（図２の化合物Ｊ）
アルゴン雰囲気下、３-（２’-デオキシ-β-Ｄ-リボフラノシル）-５-（Ｎ,Ｎ-ジ-ｎ-ブチルホルムアミジノ）アミノ-７-（Ｎ,Ｎ-ジフェニルカルバモイル）オキシイミダゾ［４,５-ｂ］ピリジン４２０ｍｇ（０.７０ｍｍｏｌ）をピリジン１０ｍｌに溶解し、塩化ジメトキシトリチル４７５ｍｇ（２当量）を加え、室温で１時間撹拌した。エタノール１ｍｌを加えて反応を止めた後、減圧下溶媒を留去した。残渣を酢酸エチル１００ｍｌに溶解し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液３０ｍｌで１回、水３０ｍｌで３回、飽和食塩水３０ｍｌで１回洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムにより乾燥した。溶液を減圧下濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（中性シリカゲル、溶出溶媒：酢酸エチル−ヘキサン）により精製して標記化合物４７０ｍｇ（収率７４％）を得た（図２のＩ→Ｊ）。

FAB-MS (LR): m/z 903 (MH⁺)
¹H NMR (270 MHz, DMSO-d₆) δ: 8.36 (s, 1 H), 8.29 (s, 1 H), 7.50 - 7.40 (m, 8 H), 7.33 - 7.26 (m, 4 H), 7.22 - 7.14 (m, 7 H), 6.80 - 6.72 (m, 4 H), 6.64 (s, 1 H), 6.45 (t, 1 H, J = 6.6 Hz), 5.35 (d, 1 H, J = 4.6 Hz), 4.43 (tdd, 1 H, J = 4.3 4.6, 6.6 Hz), 3.95 (ddd, 1 H, J = 3.3, 4.3, 6.6 Hz), 3.67 (s, 3 H), 3.65 (s, 3H), 3.43 (t, 2 H, J = 7.3 Hz), 3.25 (t, 2 H, J = 7.2 Hz), 3.22 (dd, 1 H, J = 6.6, 9.9 Hz), 3.11 (dd, 1 H, 3.3, 9.9 Hz), 2.85 (td, 1 H, J = 6.6, 13.2 Hz), 2.35 (ddd, 1 H, J = 4.6, 6.6, 13.2 Hz), 1.62 - 1.43 (m, 4 H), 1.37 - 1.17 (m, 4 H), 0.92 (t, 3 H, J = 7.4 Hz), 0.85 (t, 3 H, J = 7.2 Hz).
¹³C NMR (67.8 MHz, DMSO-d₆) δ: 159.52 (C), 157.59 (C), 157.54 (C), 154.42 (CH), 151.05 (C), 149.42 (C), 146.77 (C), 144.54 (C), 141.79 (C), 140.69 (CH), 135.20 (C), 135.14 (C), 129.31 (CH), 129.21 (CH), 128.88 (CH), 127.38 (CH), 127.27 (CH), 126.72 (CH), 126.48 (CH), 126.23 (CH), 123.68 (C), 112.76 (CH), 105.90 (CH), 85.37 (CH), 85.12 (C), 82.53 (CH), 70.54 (CH), 64.13 (CH₂), 59.54 (CH₂), 54.73 (CH), 54.68 (CH), 50.43 (CH₂), 44.13 (CH₂), 38.79 (CH₂), 30.51 (CH₂), 28.57 (CH₂), 19.57 (CH₂), 19.05 (CH₂), 13.67 (CH₃), 13.46 (CH₃).

３-［２’-デオキシ-５’-Ｏ-（４,４-ジメトキシトリチル）-β-Ｄ-リボフラノシル-３’-Ｏ-（２-シアノエチル-Ｎ,Ｎ-ジイソプロピルフォスフォロアミダイト）］-５-（Ｎ,Ｎ-ジ-ｎ-ブチルホルムアミジノ）アミノ-７-（Ｎ,Ｎ-ジフェニルカルバモイル）オキシイミダゾ［４,５-ｂ］ピリジン（図２の化合物Ｋ）
アルゴン雰囲気下、３-［２’-デオキシ-５’-Ｏ-（４,４-ジメトキシトリチル）-β-Ｄ-リボフラノシル］-５-（Ｎ,Ｎ-ジ-ｎ-ブチルホルムアミジノ）アミノ-７-（Ｎ,Ｎ-ジフェニルカルバモイル）オキシイミダゾ［４,５-ｂ］ピリジン４４０ｍｇ（０.４９ｍｍｏｌ）を塩化メチレン１５ｍｌに溶解し、Ｎ,Ｎ-ジイソプロピルエチルアミン０.２６ｍｌ（３当量）、２-シアノエチル-Ｎ,Ｎ-ジイソプロピルクロロフォスフォロアミダイト０.２２ｍｌ（２当量）を加え、室温で２０分撹拌した。反応液にクロロホルム６０ｍｌを加え、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液２５ｍｌで１回、水２５ｍｌで１回、飽和食塩水２５ｍｌで１回洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムにより乾燥した。溶液を減圧下濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（中性シリカゲル、溶出溶媒：酢酸エチル−ヘキサン）により精製して標記化合物４１８ｍｇ（収率７０％）を得た（図２のＪ→Ｋ）。

FAB-MS (LR): m/z 1103 (MH⁺)
¹H NMR (270 MHz, DMSO-d₆) δ: 8.36, 8.33 (each s, each 0.5 H), 8.31, 8.29 (each s, each 0.5 H), 7.50 - 7.39 (m, 8 H), 7.32 - 7.26 (m, 4 H), 7.23 - 7.15 (m, 7 H), 6.80 - 6.70 (m, 4 H), 6.65 (s, 1 H) 6.45, 6.44 (each t, each 0.5 H, J = 6.2 Hz), 4.75 (m, 1 H), 4.08 (m, 1 H), 3.68, 3.67, 3.66, 3.65 (each s, each 1.5 H), 3.73 - 3.20 (m, 10 H), 3.03 (m, 1 H), 2.74, 2.63 (each t, each 1 H, J = 5.9 Hz), 2.49 (m, 1 H), 1.58 - 1.45 (m, 4 H), 1.34 - 1.18 (m, 4 H), 1.20 - 1.08 (m, 9 H), 1.01 - 0.99 (m, 3 H), 0.91 (t, 3 H, J = 7.3 Hz)), 0.86, 0.85 (each t, each 1.5 H, J = 7.3 Hz).
³¹P NMR (109 MHz, DMSO-d₆) δ: 149.01, 148.83.

１-デアザ-２’-デオキシグアノシン-５’-トリリン酸（図３の化合物Ｌ）
アルゴン雰囲気下、３-（２’-デオキシ-β-Ｄ-リボフラノシル）-５-（Ｎ,Ｎ-ジ-ｎ-ブチルホルムアミジノ）アミノ-７-（Ｎ,Ｎ-ジフェニルカルバモイル）オキシイミダゾ［４,５-ｂ］ピリジン６０ｍｇ（０.１０ｍｍｏｌ）、１,８-ビス（ジメチルアミノ）ナフタレン２１ｍｇ（１当量）をリン酸トリメチル０.５ｍｌに溶解して０℃に冷却し、オキシ塩化リン１４μｌ（１.５当量）をゆっくり滴下し、５分間撹拌した。この反応液にトリス（テトラブチルアンモニウム）ハイドロゲンピロリン酸９０２ｍｇ（１０当量）のジメチルホルムアミド溶液（２ｍｌ）とトリブチルアミン２００μｌ（８.４当量）を混合したものを滴下した。０℃で５分間撹拌させた後、１.０Ｍ炭酸トリエチルアミン緩衝液１０ｍｌ（ＴＥＡＢ ｂｕｆｆｅｒ）を加えて反応を止め、室温に戻した。この反応液にメタノール１５ｍｌと酢酸アンモニウム含有（１０ｗ／ｖ％）アンモニア水溶液３５ｍｌを加えて、ガラス容器に移して密封し、６０℃で３時間過熱した。溶液を減圧下濃縮し、さらに水で３回共沸した後、２０％アセトニトリル水溶液１２０ｍｌに溶解し、イオン交換クロマトグラフィー（溶出溶媒：２０％アセトニトリル含有炭酸トリエチルアミン緩衝液０.２〜０.７Ｍ、０.５Ｍで溶出）により精製して凍結乾燥することにより標記化合物１５ｍｇ（収率２５％）を得た（図３のＩ→Ｌ）。

FAB-MS (LR): m/z 507 (MH⁺), 608 (M+Et₃NH)⁺, 709(M-H⁺+2(Et₃NH))^+
1H NMR(270 MHz, DMSO-d₆) δ: 8.25(s, 1 H), 6.29 (dd, 1 H, J = 6.3, 7.2 Hz), 5.83 (s, 1 H, D₂O exchangeable), 4.70 (m, 1 H), 4.17 (m, 1 H), 4.13 - 4.09 (m, 2 H), 2.60 (ddd, 1 H, J = 6.3, 7.2, 14.0 Hz), 2.43 (ddd, 1 H, J = 3.3, 6.3, 14.0 Hz).
³¹P NMR (109 MHz, D₂O - 0.1M TEAB buffer, pH8.0) δ: -7.23(d, J = 19 Hz), -10.70(d, J = 19 Hz), -22.33 (t, J = 19 Hz).

1-デアザ-2'-デオキシグアノシンフォスフォロアミダイト体を用いたオリゴヌクレオチドの合成
1-デアザ-2' -デオキシグアノシンを導入したオリゴヌクレオチドは、全て１μｍｏｌスケールで合成した。自動合成機はＥｘｐｅｄｉｔｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．ＭＡ，ＵＳＡ）を用いた。フォスフォロアミダイト体は全て濃度０.０６Ｍのアセトニトリル溶液とし、縮合時間は天然型フォスフォロアミダイト体が３０秒、1-デアザ-2'-デオキシグアノシンフォスフォロアミダイト体については３００秒とした。合成は通常のＤＮＡ合成プログラムに従い、５’末端のＤＭＴｒ基は樹脂上で脱離させた。合成終了後、ＣＰＧ樹脂に１０％酢酸アンモニウムを含む濃アンモニア水溶液３ｍｌを加えて、６０℃で１６〜２０時間処理し、樹脂からの切り出しおよび脱保護を行った。反応液をＣ１８カートリッジカラムで粗精製した後、逆相の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）［ＳＨＩＳＥＩＤＯ ＣＡＰＣＥＬＬ Ｐａｋ Ｃ１８ φ１０×２５０ｍｍ、溶出液：０.１Ｍ炭酸トリエチルアミン−アセトニトリル溶液］により精製し、高純度のオリゴヌクレオチドを得た。

合成したオリゴヌクレオチドは蛇毒由来ホスホジエステラーゼ、およびアリカリホスファターゼによりヌクレオシドにまで完全に酵素水解し、1-デアザ-2'-デオキシグアノシンを含むヌクレオシド組成をＨＰＬＣ分析により確認した。

１-デアザ-２’-デオキシグアノシン（１-ｄｅａＧ）を導入した鋳型ＤＮＡを用いた各種デオキシヌクレオシドトリリン酸体の取込み実験
１-デアザ-２’-デオキシグアノシンが鋳型ＤＮＡ内に存在する時に、ＤＮＡ合成酵素が１-デアザ-２’-デオキシグアノシンをどのように認識し、対としてどのヌクレオシドトリリン酸体を取込むかを調べる。

３’末端から２１残基目に１-デアザ-２’-デオキシグアノシン（１-ｄｅａＧ）を導入した、全２５残基からなる短鎖ＤＮＡを上記実施例１１の方法により合成した。これと別に、５’末端に、後のゲル電気泳動後の検出に用いるための適当な標識（この実施例では蛍光化合物、フルオレセインを用いた）を施した２０残基からなるプライマーを準備した。これらの鋳型ＤＮＡ（テンプレート）とプライマーを用い、１-デアザ-２’-デオキシグアノシンの対になる部分に取込まれるｄＮＴＰ（天然型ヌクレオシドトリリン酸体）を調べた。

予め３７℃で１時間アニーリングさせた５’-フルオレセインプライマー（０．４μＭ）と１-デアザ-２’-デオキシグアノシン（１-ｄｅａＧ）を導入した鋳型ＤＮＡ（０．８μＭ）の二重鎖を反応用緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１ｍＭ ＤＴＴ、全量５μｌ）中、ｄＡＴＰ、ＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰのいずれかのトリリン酸体（０．２ｍＭ）存在下、ＤＮＡポリメラーゼ（Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｌａｇｍｅｎｔ ｅｘｏ−、０．５Ｕ）で３７℃、３０分反応させた。反応液にｌｏａｄｉｎｇ溶液（１０Ｍ Ｕｒｅａ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ Ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ ｂｌｕｅ、０．０５％ Ｘｙｌｅｎｅ ｃｙａｎｏｌ、５μｌ）を加えて反応を停止させた。これを７Ｍ尿素を含む２０％ポリアクリドアミドゲル電気泳動により解析した。結果を図４に示す。

電気泳動解析の結果、鋳型上の１-デアザ-２’-デオキシグアノシン（１-ｄｅａＧ）に対して、ｄＣＴＰが最もよく取り込まれることが分かった。また、わずかながらｄＧＴＰ、ｄＡＴＰの取込みも見られた。ＴＴＰは全く取込まれていない。天然のグアノシンに対するｄＣＴＰの取込みと比較すると、１-デアザ-２’-デオキシグアノシンに対するｄＣＴＰの取込み効率は低く、速度論解析によりその効率は１％以下であることが分かった。また、同じ条件で、全てのトリリン酸体存在下での鎖伸長反応を行ったところ、１-デアザ-２’-デオキシグアノシンの部分でのわずかな鎖伸長の停止が観察されたが、完全伸長反応が進行することも確認された。

天然型の鋳型ＤＮＡに対する１-デアザ-２’-デオキシグアノシン-５’-トリリン酸体（１-ｄｅａＧＴＰ）の取込み実験
１-デアザ-２’-デオキシグアノシン-５’-トリリン酸体がＤＮＡ合成酵素によって、どのヌクレオシドに対して取込まれるかを調べる。

実施例１２で示した全２５残基からなる鋳型ＤＮＡの３’末端から２１残基目に天然型のヌクレオシドを各々導入したものと、５’末端に標識（この実施例では蛍光化合物、フルオレセイン）を施した２０残基からなるプライマーを準備した。この組み合わせを用い、１-デアザ-２’-デオキシグアノシン-５’-トリリン酸体（１-ｄｅａＧＴＰ）存在下、ＤＮＡポリメラーゼによる１塩基伸長反応を行い、どの天然型塩基に対して１-デアザ-２’-デオキシグアノシンが取込まれるかを調べた。

予め３７℃で１時間アニーリングさせた５’-フルオレセインプライマー（０．４μＭ）と３’末端から２１残基目に天然型のヌクレオシドを導入した鋳型ＤＮＡ（０．８μＭ）の二重鎖を反応用緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１ｍＭ ＤＴＴ、全量５μｌ）中、１-デアザ-２’-デオキシグアノシントリリン酸体（１-ｄｅａＧＴＰ、０．２ｍＭ）存在下、ＤＮＡポリメラーゼ（Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｌａｇｍｅｎｔ ｅｘｏ−、０．５Ｕ）で３７℃、３０分反応させた。反応液にｌｏａｄｉｎｇ溶液（１０Ｍ Ｕｒｅａ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ Ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ ｂｌｕｅ、０．０５％ Ｘｙｌｅｎｅ ｃｙａｎｏｌ、５μｌ）を加えて反応を停止させた。これを７Ｍ尿素を含む２０％ポリアクリドアミドゲル電気泳動により解析した。結果を図５に示す。

電気泳動解析の結果、１-デアザ-２’-デオキシグアノシントリリン酸（１-ｄｅａＧＴＰ）は鋳型上のシチジン、およびグアノシンの対として取込まれる事が分かった。しかしながらこれらの取込み効率は、前述の鋳型上のグアノシンに対するｄＣＴＰの取込み効率の１％以下であった。

１-デアザ-２’-デオキシグアノシン（１-ｄｅａＧ）がＤＮＡ二本鎖の熱的安定性に及ぼす影響の検討
１-デアザ-２’-デオキシグアノシンは天然型のグアノシンやその他の塩基と異なる水素結合能、すなわち異なる塩基対形成能を有している。そのため、ＤＮＡ二本鎖に導入した時には、その塩基選択性、熱的安定性が天然型グアノシンなどとは異なることが予想される。そこで、１-デアザ-２’-デオキシグアノシンがＤＮＡ二本鎖構造に及ぼす影響を、１-デアザ-２’-デオキシグアノシンを導入した合成ＤＮＡを用いて検討した。

本特許の方法により合成したＤＮＡ二本鎖，５’-ｄ（ＴＴＴＧＴＴＸＴＴＧＴＴＴ）-３’／３’-ｄ（ＡＡＡＣＡＡＹＡＡＣＡＡＡ）-５’のＸの部位に１-デアザ-２’-デオキシグアノシン（１-ｄｅａＧ）、Ｙの部位にアデノシン、チミジン、グアノシン、シチジンを各々導入したものを準備した。この二本鎖ＤＮＡ（各３μＭ）について、０．１Ｍの塩化ナトリウム、０．０１Ｍナトリウムカコジレート緩衝溶液（ｐＨ７．９）存在下、熱変性法により５０％融解温度（Ｔｍ、℃）を測定した。結果を表１に示す。

１-デアザ-２’-デオキシグアノシン（１-ｄｅａＧ）と天然型塩基との塩基対を含む二本鎖の融解温度（Ｔｍ値）は、２３.９℃〜２６.８℃である。グアノシンとの組み合わせが熱的に最も安定であり、シチジンとの塩基対は安定化されていない。また、いずれの安定性も、天然型グアノシン：シチジン塩基対、チミジン：アデノシン塩基対と比べて低い値であり、ミスマッチ塩基対と同程度であった。この結果より、１-デアザ-２’-デオキシグアノシンはＤＮＡ二本鎖内では、天然型の塩基に対して特異性がなく、シチジンとも塩基対を形成しないことが分かる。

以上の実施例１２〜１４により、１-デアザ-２’-デオキシグアノシンは修飾前の親化合物である２’-デオキシグアノシンとは大きく異なる性質を示す事が明らかとなった。ＤＮＡポリメラーゼによる鎖伸長反応では鋳型上の１-デアザ-２’-デオキシグアノシンに対しグアノシンと同様にｄＣＴＰが最もよく取込まれたが、その取込み効率は低いものであった。また二本鎖の熱的安定性の測定では、１-デアザ-２’-デオキシグアノシンは天然型の塩基と安定な塩基対を形成しない事が明らかとなった。

以上のように、今回開発した１-デアザ-２’-デオキシグアノシンを用いる事で、グアノシンの１位窒素原子の欠如がＤＮＡの複製や熱的安定性に与える影響を調べる事が可能となった。これらの方法は、ヌクレオシドや短鎖核酸、遺伝子、およびこれらを認識する蛋白質を用いた研究に広く応用することが可能であり、現在、一般に広く提供されている７-デアザヌクレオシド誘導体などと共に、核酸研究に用い得る。

本発明の１−デアザ−２’−デオキシグアノシンおよびその誘導体は、核酸の構造解析、核酸と核酸との相互作用解析、タンパク質と核酸との相互作用解析等に用い得る。
１−デアザ−２_’−デオキシグアノシンはヌクレオシドレベルでの構造解析等に使用で
きる。

１−デアザ−２_’−デオキシグアノシンフォスフォロアミダイト体は１−デアザ−２_’
−デオキシグアノシンを合成短鎖ＤＮＡの任意の配列、場所に導入する方法を提供し、ＤＮＡレベルでの核酸・蛋白質相互作用解析などに広く利用可能である。

１−デアザ−２_’−デオキシグアノシン−５_’−トリリン酸体は種々の核酸合成酵素な
どの機能解析などに利用できる。また、１−デアザ−２_’−デオキシグアノシン−５_’−
トリリン酸体を用いて、ＤＮＡ合成酵素などにより、酵素的にこれを取込ませた核酸、ＤＮＡ、オリゴヌクレオチドを提供する。

１−デアザ−２_’−デオキシグアノシンの合成経路を示す図である。 １−デアザ−２_’−デオキシグアノシンのフォスフォロアミダイト体の合成経路を示す図である。 １−デアザ−２_’−デオキシグアノシンのトリリン酸体の合成経路を示す図である。 １−デアザ−２_’−デオキシグアノシンを導入した鋳型ＤＮＡを用いた各種デオキシヌクレオシドトリリン酸体の取込み実験の結果を示す図である。 天然型の鋳型ＤＮＡに対する１−デアザ−２_’−デオキシグアノシン−５_’−トリリン酸体の取込み実験の結果を示す図である。

配列番号１〜４：合成ＤＮＡ
配列番号３：nは１−デアザ−２_’−デオキシグアノシン
配列番号４：nはＡ、Ｔ、ＣまたはＧ

Claims (11)

1. 式（１）
   

   

   （式中、R₁およびR_1'は水素原子または水酸基の保護基を示し、R₂は水素原子またはC₁〜C₄のアルキル基であり、C₁〜C₄アルコキシ基で置換されていてもよい）で表される１−デアザ-2'-デオキシグアノシン誘導体。
2. 式（１）
   

   

   （式中、R₁およびR_1'は水素原子または水酸基の保護基を示し、R₂は水素原子またはC₁〜C₄のアルキル基であり、C₁〜C₄アルコキシ基で置換されていてもよい）で表される１−デアザ−２’−デオキシグアノシン誘導体の製造法であって、式（２）
   

   

   （式中、R₁およびR_1'は水素原子または水酸基の保護基を示す）
   で表される化合物を出発原料とし、該化合物を縮合閉環反応に付すことを特徴とする１−デアザ−２’−デオキシグアノシン誘導体の製造法。
3. 式（１３）
   

   

   （式中、R₄はアミノ基の保護基であり、R₅は水素または水酸基の保護基であり、R₆は水酸基の保護基であり、R₇はリン酸保護基であり、R₈は窒素原子上に炭素数１から５の同一のもしくは異なるアルキル基が２つ結合したジアルキルアミノ基またはモルホリン−１−イル基を表し、２つのアルキル基は互いに結合して環を形成していてもよく、R₂は水素原子またはC₁〜C₄のアルキル基でありC₁〜C₄アルコキシ基で置換されていてもよい）で表される１−デアザ−２’−デオキシグアノシン誘導体のフォスフォロアミダイト体。
4. R₄がN,N-ジ-n-ブチルホルムアミジノ基であり、R₅がN,N-ジフェニルカルバモイル基であり、R₆がジメトキシトリチル基であり、R₇が２−シアノエチル基であり、R₈がジイソプロピルアミノ基である請求項３記載の１−デアザ−２’−デオキシグアノシン誘導体のフォスフォロアミダイト体。
5. 請求項３または４記載の１−デアザ−２’−デオキシグアノシン誘導体のフォスフォロアミダイト体の製造法であって、式（７）で表される化合物
   

   

   （式中、R₁およびR_1'は水酸基の保護基を示し、R₂は水素原子またはC₁〜C₄のアルキル基であり、C₁〜C₄アルコキシ基で置換されていてもよい）のアミノ基を保護、あるいはアミノ基および水酸基を保護することを特徴とする、１−デアザ−２’−デオキシグアノシン誘導体のフォスフォロアミダイト体の製造法。
6. １−デアザ−２’−デオキシグアノシン誘導体のフォスフォロアミダイト体を用いて製造した核酸、ＤＮＡまたはオリゴヌクレオチド。
7. １−デアザ−２’−デオキシグアノシン誘導体を含む核酸、ＤＮＡまたはオリゴヌクレオチド。
8. １−デアザ−２’−デオキシグアノシン誘導体のフォスフォロアミダイト体を用いて核酸、ＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドを製造する方法。
9. 式（１５）
   

   

   （R₂は水素原子またはC₁〜C₄のアルキル基であり、C₁〜C₄アルコキシ基で置換されていてもよい）で表される１−デアザ−２’−デオキシグアノシン誘導体のトリリン酸体。
10. 式（１５）
    

    

    （R₂は水素原子またはC₁〜C₄のアルキル基であり、C₁〜C₄アルコキシ基で置換されていてもよい）で表される１−デアザ−２’−デオキシグアノシン誘導体のトリリン酸体の製造法であって、
    式（１０）
    

    

    （式中、R₄は水素またはアミノ基の保護基であり、R₅は水素または水酸基の保護基であり、R₂は水素原子またはC₁〜C₄のアルキル基であり、C₁〜C₄アルコキシで置換されていてもよい）で表される化合物からリン酸化反応により糖部５'位水酸基をトリリン酸化することを特徴とする製造法。
11. 請求項９に記載のトリリン酸体をＤＮＡ合成酵素または逆転写酵素を用いて酵素的に取込ませた核酸、ＤＮＡまたはオリゴヌクレオチド。
    .

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