JP2000515382A - 標的核酸配列の増幅方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 標的核酸配列、標的核酸配列に特異的な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマー、１以上の酵素活性、およびヌクレオチドが少なくとも提供され、特に単一の酵素活性または複数の酵素活性に関して適切な条件下で、標的配列を増幅させる、標的核酸配列の増幅方法が開示される。該方法によれば、少なくとも１つのヌクレオチドが、少なくとも１つの予め官能化されたヌクレオチドを含有する増幅産物を付与するために、該ヌクレオチドのベースの少なくとも１つの予め定められた部位において少なくとも１つの保護されていない反応性共有結合性官能基を含有することを少なくとも特徴とする、他のヌクレオチドとは異なる予め官能化されたヌクレオチドである。

Description

【発明の詳細な説明】 標的核酸配列の増幅方法 本発明は、標的核酸配列の増幅方法に関する。 文献：EP-A-0 285 057は、ヌクレオチドの構成要素、すなわち糖、プリンま たはピリミジン塩基およびリン酸エステル基の１つに種々の用途、特に標識の用 途を持つ官能基を導入することからなる核酸処理方法を開示している。このよう に処理されて得られたヌクレオチドは、ポリヌクレオチドに、特にこのヌクレオ チドの存在により不安定になる二重らせんを有することなく二本鎖型へと組み込 むことができた。 しかしながらこの場合、先行技術によれば、ヌクレオチドに結合している官 能基は、立体障害、疎水性相互作用または複合現象などの種々の現象を示し、こ れらが、該処理ヌクレオチドを組み込んだポリヌクレオチドが、該処理ヌクレオ チドが組み込まれていない相当するポリヌクレオチドを認識するであろう大部分 の酵素によって認識されることを妨げるものである。 本発明は、前記の欠点を解消し、特にヌクレオチドの組み込みを妨害せず、 その結果として標的とする増幅反応における収率および／または感受性に有意な 影響を示さず、さらには標識の組み込みに従来付随していた標識の不安定現象を 回避することにより、増幅産物の優れた標識を得ることを可能にする増幅方法を 提供する。 かくして、本発明は、 −標的核酸配列と、標的核酸配列に特異的な少なくとも１つのオリゴヌクレ オチドプライマーと、１以上のヌクレオチド酵素活性とが少なくとも得られ、 −特に単一の酵素活性または複数の酵素活性に関して適切な条件下で、標的 配列を増幅させる、 標的核酸配列の増幅方法であって、 少なくとも１つの予め官能化したヌクレオチドを含む予め官能化した増幅産 物を得るために、少なくとも１つのヌクレオチドが、少なくとも、保護されてお らず、かつ、そのヌクレオチドの塩基の所定の部位の少なくとも１つに配置され ている、少なくとも１つの共有反応官能の存在により、他のヌクレオチドとは異 なる予め官能化したヌクレオチドであることを特徴とする方法に関する。 本発明の有利な方法によれば、この方法はさらに、 −予め官能化したヌクレオチドの反応性官能に特異的な共有結合性の抗反応 官能と官能基を含んでなる試薬が得られ、 −官能化した増幅産物を得るために、予め官能化した増幅産物を該試薬と直 接または間接的に反応させる行程を含んでなる。 本記載中で用いられるいくつかの用語を以下に定義し、その後、本発明を詳 細に説明する。 本発明のヌクレオチドは以下に定義される天然または修飾ヌクレオチド単量 体と理解される。 このように、該ヌクレオチド単量体は、その構成要素が糖と、リン酸エステ ル基と、窒素塩基である天然の核酸ヌクレオチド（その糖はＲＮＡにおいてはリ ボースであり、またＤＮＡにおいては2'-デオキシリボースであり；その核酸が ＤＮＡかＲＮＡかによって、窒素塩基がアデニン、グアニン、ウラシル、シトシ ンおよびチミンから選択されている）であってもよいし；または、３つの構成要 素のうち少なくとも１つで修飾されているヌクレオチドであってもよく（例示す れば、その修飾は、イノシン、メチル-5-デオキシシチジン、デオキシウリジン 、ジメチルアミノ-5-デオキシウリジン、ジアミノ-2,6-プリンまたはブロモ-5- デオキシウリジンなどの修飾生成物、およびハイブリダイゼーションが可能な他 の種々の修飾塩基が生じてもよい塩基のレベルで、糖のレベル、すなわち例えば 少なくとも１つのデオキシリボースでの類似体による置換（例えば：P.E．Niels en et al.，Science，254，1497-1500(1991)）で、リン酸エステル基、例えばボ ロネート、アルカリホスホネートまたはホスホロチオエート誘導体のレベルで起 こってもよい。 保護基は、ヌクレオシド、ヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドの化学合 成において従来より使用される基として理解される（例えば、Chemistry of Nuc leosides and Nucleotides，Leroy B．Townsend編，Plenum Press，New York an d LondonおよびProtocols for Oligonucleotides and Analogs，Synthesis and Properties，Sudhir Agrawal編，Humana Press，Totowa，New Jerseyを参照）。 本発明の標識官能基は検出可能なシグナルを直接的または間接的に生じるこ とができる分子である。この基は特に放射性同位元素、ペルオキシダーゼ、アル カリ性ホスファターゼおよびb-ガラクトシダーゼから選択される酵素、ならびに 発色団、発色、蛍光団、蛍光または発光化学化合物、発色、蛍光または発光基質 を加水分解できる酵素から選択される酵素、ヌクレオチド塩基類似体およびビオ チンなどのリガンドから選択される。 該標識が直接シグナルを生じることができない場合、例えば該標識が酵素で ある場合は、視認化物質、例えば検出可能な複合体、例えば発色化合物または発 光化合物を生じる酵素／基質反応を伴う酵素に対応する基質を加える必要がある 。例示すれば、該視認化試薬はオルト-フェニレンジアミンまたはリン酸4-メチ ルアンベリフェリルであってよい。 この予め官能化したヌクレオチドの共有結合性官能基とこの試薬の抗反応官 能基は、それぞれ求電子性および求核性有機化学官能基であり、この逆であって もよい。 該求電子性有機化学官能基は、有利にはアルデヒド、活性化エステル、カル ボン酸、イソチオシアネート、ハロアシル誘導体および塩化スルフォニル官能基 から選択される。 該求核性有機化学官能基は、有利にはアミノ、チオール、オキシアミノ、ヒ ドラジンおよびヒドラジド官能基から選択され；好ましくはそれはアルコキシア ミノ官能基である。 本発明の１つの変法によれば、修飾されたヌクレオチドの共有結合性官能基 はカップリングアームにより塩基に結合されており、かつ／または該試薬の共有 結合性の抗反応官能基はカップリングアームにより該官能基に結合している。 該カップリングアームは、特に飽和または不飽和ヒドロカーボン鎖から選択 され、適切なところにアミノ、アミドおよびオキシ官能基が挿入されている。 好ましい方法によれば、該共有結合性官能基はオキシアミノ官能基であり、 該試薬の共有結合性抗反応官能基はアルデヒド官能基であり、この後者は蛍光ま たは発光官能基などの標識官能基に結合している。 アルデヒド官能基をカップリングアーム-NH-CS-NH-(CH₂)₃-により官能基に 結合させることが有利であり、この試薬の官能基はフルオレセインである。 予め官能化したヌクレオチド産物は、１以上のヌクレオチドを組み込んだ１ 以上の同一または異なる共有結合性官能基を含んでなればよい。該共有結合性官 能基は１以上の同一または異なる試薬と同時に、あるいは順次に反応させること ができる。官能化された生成物の標識官能官能基は同時に、あるいは順次に検出 することできる。 この標識方法は、特に異なる標的に由来する予め官能化した産物を識別する ために、予め官能化した１以上のヌクレオチド産物に適用され得る。 標識された官能化増幅産物は、均一相または不均一相にて、定性的かつ／も しくは定量的に検出することができる。 均一相において、この試薬と予め官能化したヌクレオチド産物とは、同じ液 体培地中で相互作用する。不均一相においては、この予め官能化した産物は、固 体の支持体に取り込ませる前、または取り込ませた後に試薬と反応させることが でき、すなわち直接的または間接的といわれる。固体支持体への取り込みは、吸 着、共有結合など公知の手段を用いて、特に固体支持体の表面に用いることので きる共有結合性の抗反応官能基を用いて、またはポリヌクレオチド化合物を用い るハイブリダイゼーションにより達成できる。 管、円錐、くぼみ、マイクロ滴定プレート、シート、チップまたは可溶性ポ リマーなどの適した形態の固体支持体はすべて、ポリスチレン、スチレン-ブタ ジエン共重合体、ポリスチレンを配合したスチレン-ブタジエン共重合体、ポリ プロピレン、ポリカーボネート、ポリスチレン-アクリロニトリル共重合体およ びスチレン-メチル＝メチルメタクリレート共重合体から、合成繊維および天然 繊維から、多糖類およびセルロース誘導体から、さらにはガラスおよび珪素およ びそれらの誘導体から選択される。 本発明の方法の好ましい変法によれば、 標的核酸配列はＤＮＡまたはＲＮＡ配列であり、酵素活性はＲＮＡ依存性お よび／またはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を含んでなり、 該酵素活性はさらに、一連の逆転写、転写および消化（digestion）反応に 従 い、標的核酸配列を増幅させるためのリボヌクレアーゼH活性およびＤＮＡ依存 性ＲＮＡポリメラーゼ活性を含んでなる。 リボヌクレアーゼHおよびＤＮＡポリメラーゼの酵素活性は、ある単一の酵 素または互いに異なる酵素により提供されてもよい。 例示すれば、本発明の方法は、PCR（ポリメラーゼ連鎖反応）、RT-PCR（逆 転写ポリメラーゼ連鎖反応）またはTMA（転写介在増幅(transcription-mediated amplification)）、またはNASBA（核酸配列に基づく増幅(nucleic acid sequen ce-based amplification)）法、もしくは他の酵素増幅法などの当業者に公知の 技術に従い、サンプル中の標的核酸を増幅させるために使用することができる。 本発朋はまた、予め官能化され、かつ、酵素処理を受けることが可能なヌク レオチド類似体または核酸に関する。 核酸類似体またはヌクレオチドの酵素処理は、その活性がヌクレオチドに結 びつけられている少なくとも１つの酵素が関与する間のin vivoまたはin vitro のすべてを含む。このように、それは、ヌクレオチドが、酵素工程中、形質転換 されていようといまいと、酵素に対する基質として働く少なくとも１種の酵素工 程のあらゆる反応を含んでなり；例示すれば、このような工程は転写、連結反応 、伸長および制限などの分子生物学技術で、さらに特には増幅技術(WINN-DEEN， Journal of Clinical Assay，第19巻，21-26頁(1996))で使用されるものから選 択される。 このように、その活性がヌクレオチドに結びつけられている酵素は、網羅的 ではないが特に以下のリストから選択される：大腸菌(E．coli)ＤＮＡポリメラ ーゼIのクレノウフラグメント、Taqポリメラーゼ、T7、T4またはT5ＤＮＡポリメ ラーゼ、a、bおよびgウイルスまたは真核細胞ポリメラーゼなどのＤＮＡ依存性 ＤＮＡポリメラーゼ；AMV（トリ骨髄芽球症ウイルス）およびMMLV（モロニーマ ウス白血病ウイルス）ポリメラーゼなどのＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ；T7 、T3、SP6、N4およびPBSIIＲＮＡポリメラーゼおよび大腸菌ＲＮＡポリメラーゼ などのＲＮＡポリメラーゼ；制限エンドヌクレアーゼおよびＲＮアーゼ（ＲＮAs e）Ｈなどのヌタレアーゼ活性を有する酵素；またはQ-ベータレプリカーゼ、 ターミナルトランスフェラーゼまたはリガーゼなどのその他のポリAポリメラー ゼ、レプリカーゼ。 好ましい具体例によれば、ここに参照して組み入れられる国際出願WO91/013 84に記載されている、標的ＲＮＡ核酸配列を増幅させる、または逆転写工程の後 に標的ＤＮＡ核酸配列を増幅させるTMA技術が本発明の方法を適用するために選 択される。 本発明によって予め官能化した核酸類似体は式(I) ｛式中、 Bは核塩基を表し、 Zはカップリングアームを表し、 nは0または1に等しい整数であり、 Xは核塩基B中の少なくとも１つの部位に結合している共有結合性反応性官能 基を表し、 R¹はHまたはOHを表し、 R²はH、OH、一リン酸エステル、ニリン酸エステルまたは三リン酸エステル 基、もしくはO-R基（ここでRは保護基を表す）を表し、 R³はＨ、保護基、または一リン酸エステル、二リン酸エステルまたは三リン 酸エステル基を表す｝に相当する。 好ましくは、R¹およびR²は各々互いに独立にHまたはOHを表し、かつ、R³は 一リン酸エステル、二リン酸エステルまたは三リン酸エステル基を表す。 本発明の予め官能化したヌクレオチドは以下のヌクレオチドから選択される ： −その核塩基がシトシンから誘導され、ピリミジン環の4位の少なくともア ミノ基において、保護されておらず、かつ、該ヌクレオチドの酵素処理に有意な 影響を有さない少なくとも１つの求核性の共有結合性反応性官能基を含み、該共 有結合性反応性官能基がNH₂、O-NH₂、SHヒドラジンおよびヒドラジド官能基から 選択され、かつ、該共有結合性官能基が、(-CH₂-)n₁および(-O-CH₂-)n₁（ここで 、n₁は１から１２までの間の整数である）；(-CH₂-O-CH₂-)n₂、（-CH₂-CH₂-O-CH₂ -CH₂-)n₂、(-CH₂-CH₂-O-CH₂-CH₂-O-CH₂-CH₂-)n₂および(-CH₂-O-CH₂-CH₂-)n₂（ ここで、n₂は１から６までの間の整数である）；および-NH-CH₂-O-CH₂-CH₂から 選択されるカップリングアームによりピリミジン環の4位にある該アミノ基に結 合している核酸。該共有結合性官能基は、-CH₂-、-CH₂-CH₂-、-CH₂-CH₂-CH₂-、- CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-、-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-、-CH₂-CH₂-O-CH₂-CH₂-、-CH₂-C H₂-O-CH₂-CH₂-O-CH₂-CH₂-およびNH-CH₂-O-CH₂-CH₂-から選択されるカップリング アームにより該アミノ基に結合していることが有利である。 −その塩基がウラシルから誘導され、少なくともピリミジン環の5位に、保 護されておらず、かつ、酵素処理に有意な影響を及ぼさない少なくとも１つの求 核性の共有結合性反応官能基を含み、該共有結合性反応官能基がNH₂、O-NH₂、SH 、ヒドラジンおよびヒドラジド基から選択されることを特徴とし；該共有結合性 反応官能基が、-C≡C-CH₂-および-C≡C-CH₂-NH-CO-CH₂-、-CH=CH-CH₂-NH-CO-CH₂ -および-CH₂=CH-CH₂から選択されるカップリングアームにより該アミノ基に結合 していることが有利である核酸。 −その塩基がアデニンから誘導され、ピリミジン環の6位の少なくともアミ ノ基において、保護されておらず、かつ、酵素処理に有意な影響を及ぼさない少 なくとも１つの求核性の共有結合性反応官能基を含み、該共有結合性反応官能基 がNH₂、O-NH₂、SH、ヒドラジンおよびヒドラジド基から選択されることを特徴と し；該共有結合性反応官能基が、(-CH₂-)n₁および(-O-CH₂-)n₁（ここで、n₁は1 から12までの間の整数を表す）；(-CH₂-O-CH₂-)n₂、(-CH₂-CH₂-O-CH₂-CH₂-)n₂、 (-CH₂-CH₂-O-CH₂-CH₂-O-CH₂-CH₂-)n₂および(-CH₂-CH₂-O-CH₂-CH₂-)n₂（ここで、 n₂は１から６までの間の整数を示す）；および(NH-CH₂-O-CH₂-CH₂-から選択され るカップリングアームによって該アミノ基に結合しているヌクレオチド。該共有 結合性反応官能基は、-CH₂-、-CH₂-CH₂-、-CH₂-CH₂-CH₂-、-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-、 -CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-、-CH₂ -CH₂-O-CH₂-CH₂-、-CH₂-CH₂-O-CH₂-CH₂-O-CH₂-CH₂-およびNH-CH₂-O-CH₂-CH₂-か ら選択されるカップリングアームにより該アミノ基に結合していることが有利で あり；好ましくは該カップリングアームは-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-である。 本発明はまた、酵素的増幅処理における、前記定義に同じ予め官能化したヌ クレオチドの使用に関する。 酵素処理に関しては、予め官能化したヌクレオチド類似体またはヌクレオチ ドの挙動は、これに対応するヌクレオチド類似体またはヌクレオチドのそれと多 かれ少なかれ同じである。これは、酵素に関して生物学的、また化学的に不活性 である結果、該類似体またはヌクレオチドの塩基中の部位に導入されている官能 基が、その基質に関する酵素の親和性または特異性のいずれかを有意に修飾しな いことによるものである。 最後に本発明は、すでに定義したようなヌクレオチドの特殊な使用に関する 。好ましくは、それらは以下の文献：EP-0721 988、WO-95/03426、US-5 409 818 およびUS-5 399 491に記載されたものなどの増幅法に使用される。 以下、実施例および添付図面を参照して本発明をさらに詳しく説明する。 図1は、4位にアミノ手を有するシチジンヌクレオチドを合成する概略スキー ムを示す。 図2は、4位にアルキルオキシアミノ手を有するシチジンヌクレオチドを合成 する概略スキームを示す。 図3は、アミノ交換によるヌクレオチドを合成する概略スキームを示す。 図4は、TMAの感受性におけるCTP-(N4)-C₆O₂-NH₂(27a)の組み込みの効果を示 す。 図5は、TMAの感受性におけるCTP-(N4)-C₄-NH₂(27b)の組み込みの効果を示す 。 前記図4および5において、反応あたりの標的コピー数はx軸で示され、反応 液（最終反応容量=100マイクロリットル）マイクロリットルあたりの得られた増 幅数はy軸で示されている。凡例、例えば、■、□、▲、○、●およびパーセン テージは図4および5の曲線に与えられている。このパーセンテージはTMA増 幅反応における天然ヌクレオチドと比較した場合の、予め官能化したヌクレオチ ドのパーセンテージに相当する。図4および5はそれぞれ、それら各々の天然ヌク レオチドと比較した場合の、種々の比率の27aおよび27bヌクレオチドの存在下で 、マイコバクテリウム・ツベルクロシス(Mycobacterium tuberculosis)16S ＲＮ Ａの標的領域から生じた増幅数の、ELOSA法（PCT特許出願WO92/19812に記載）に よる半定量化の結果を示す。 本発明のいくつかの利点を示す以下の実施例では標識のための官能基を含む 試薬について言及するが、もちろん本発明の範囲はこのような特性を持つ官能基 に限定されるものではないことが理解されよう。 標識および予め官能化されたヌクレオチドの合成 ヌクレオベースにおけるヌクレオチドを予め官能化するために一般的に使用 されている方法は、保護されている反応性官能基を有する保護されたヌクレオシ ドを合成することからなる。５’位のヒドロキシル官能基の脱保護によって、修 飾ヌクレオシドが遊離し、これは最終的にはLudwig−Eckstein法（J．Ludwig，F ．Eckstein，J．Org．Chem．，１９８９，５４，６３１−６３５）を用いて該部 位においてトリホスホリル化される。 ２’および３’ヒドロキシル官能基を保護し、しかもベースに導入された鎖 の反応性官能基を保護している基の加水分解によって、予め官能化したヌクレオ チドトリホスファートが得られる。 I−アデノシン系列 実施例１：アミノ鎖（４）を有するヌクレオシドの合成 合成法： アデノシンの官能化および保護： イソプロピリデン（１）：（Nucleic Acid Chemistry，part ２．Townsend ，Tipson，p．７６８，Wiley Interscience） エチル＝オルトホルマート（１２．４４ml，７４．８mmol）を、アルゴン雰 囲気下、APTS（３．９g，２０．６mmol）を含むアセトン（１０ml中のアデノシ ン（５g，１８．７mmol，アルドリッチ１４６５９−５）の懸濁液に滴下する。 一昼夜反応後、１．８６mlの２７％アンモニアを含む１１０mlの水を次いで加え る。３０分間撹拌後、反応媒体を白色結晶が見えるまで濃縮する。冷蔵庫 で１２時間後、白色沈殿が得られ、これを水中で再結晶する。４．１７５ｇ（１ ３．５mmo1，７２％）の生成物（１）が白色粉末の形態で得られる。該生成物は プロトンNMRで同定した。 トリアゾロ（２）：（San1ano，Miles，Robins，J．Am．Chem．Soc．，１９９ ４，１１６，９３３１−９３３２） アデノシン−イソプロピリデン（１）（１g，３．２mmol）およびアミジン （１．４g，６．５mmol）をピリジン（１５ml）中、１００℃で４８時間、アル ゴン雰囲気下、撹拌する。ピリジンを蒸発させ、トルエンで共蒸発させる。得ら れたオイルを次いで酢酸エチルに溶解し、該有機相をNaCl−飽和水で洗浄する。 Na₂SO₄で乾燥し、濃縮すると、生成物（２）力狛色粉末の形態で、６０％の収率 （７００mg，１．９mmol）で得られる。生成物（２）は、質量分析およびプロト ンNMRで同定された。 アミジンの合成：（Bartlett and Humphreg，J．Chem．Soc．，１９６７ ，１６６４−１６６６） チオニルクロリド（３９．９６g，２４．５ml，０．３３８mol）を、１０℃ で、DMF（２７０ml）中のN，N’−ジホルミルヒドラジン（１２g，０．１３ ６mol）に滴下する。該混合物は黄色になる。撹拌を２日間続ける。得られた沈 殿をろ過し、DMFで洗浄して、次いでエーテルで洗浄する。真空乾燥後、アミジ ンが９５％（２８g，０．１３０mol）の収率で得られる。 トリアゾロのモノ保護ジアミノブタンでの置換 １，４−ジアミノブタンのモノ保護：（３）の合成（Hassen，Nielsen，Ehr bar，Buchardt，Synthesis，１９８２，４０４−４０５） １，４−ジアミノブタン（０．１１３mol，９．９４g，１１．４ml）のクロ ロホルム（２５０ml）中の溶液を０℃に冷却する。ジ−tert−ブチル＝ジカーボ ナート（０．０２２mol，４．９５g，５．２２ml）のクロロホルム（２５０ml） 中の溶液を次いで、アルゴン雰囲気下、滴下する。該混合物を室温で一昼夜撹拌 する。形成された沈殿をろ過し、ろ液を濃縮する。残さのオイルを飽和塩化ナト リウム水溶液（４０ml）に溶解する。二保護生成物をろ過で除去する。水相を次 いでエーテル（５Ｘ５０ml）で抽出する。有機相を合わせて、硫酸ナトリウムで 乾燥し、濃縮する。生成物（３）がオイルの形態で得られ、９９％（３．８g,０ ．０２１８mol）の収率で得られる。生成物（３）は、質量分析およびプロトンN MRで同定した。 トリアゾロのジアミノブタン−モノbocでの置換：（４）の合成 生成物（２）（５００mg，１．４mol）を２０mlのアセトニトリルに溶解す る。化合物（３）（１．３１g，７mmol）を次いで加える。反応媒体を５０℃で ２日間、加熱し、HPLCで分析する。 アセトニトリルを蒸発後、残さを酢酸エチルに溶解し、該有機相を飽和食塩 水で洗浄する。乾燥して、酢酸エチルを蒸発後、残さをシリカゲルのクロマトグ ラフイー（溶出液：ジクロロメタン、次いでCH₂／MeOH、９８／２，９５／５(v ／v））にかける。濃縮し、ヘキサン中で結晶化すると、生成物（４）が白色粉 末の形態で、８０％の収率（５６３mg，１．１２mmol）で得られる。ヌクレオシ ド（４）は、質量分析およびプロトンNMRで同定した。 Eckstein法によるホスホリル化（Ludwig，Eckstein，J．Org．Chem．，１９８ ９，５４，６３１−６３５） PPP＝トリホスファート ヌクレオシド（４）（４８mg，１００mmol）を無水ピリジンに溶解し、該溶 液を２回濃縮する。１００mlのピリジン、３００mlのジオキサンおよびジオキサ ン中の調製したばかりの２−クロロ−４H−１，２，３−ジオキサホスホリン− ４−オン（１３０ml，１３０mmol）をアルゴン雰囲気下、添加する。該混合物を ２０分間撹拌し、０．５Ｍのトリブチルアンモニウムピロホスフアートの無水DM F溶液（３２０ml）と、１３０mlのトリブチルアミンを同時に添加する。 該混合物を３０分間撹拌後、ピリジン／水（９８／２，v／v）混合物中のヨ ウ素の１％溶液２mlを添加する。混合物を２０分間撹拌後、過剰のヨウ素を５％ のNaHSO₃の水溶液で処理し、撹拌を１０分間続ける。該混合物を乾燥するまで濃 縮し、水／ジクロロメタン抽出を行う。トリホスファートの形成は、HPLC（勾配 ：０から３５％のBで４０分；A＝２０mM Tris−HCl，pH７．６；B＝２０mM Tr is−HCl，pH７．６＋０．５Ｍ NaCl）で確認する。保持時間＝３５分。 該混合物を濃縮後、残さを水（１０ml）に溶解し、１０mlの５０％TFAの水 溶液を添加し、Bocおよびイソプロピリデン基の脱保護を行う。３０分後、TFAを 蒸発させ、水で共蒸発させる。１９分の保持時間を有する新規な生成物の形成が 観察される。 実施例２：オキシアミノ鎖を有するアデノシンヌクレオチドの合成 鎖の合成ルート 生成物（６）の合成 ヒドロキシフタルイミド（１０g，０．０６１mol）をDMF（３００ml）に溶 解する。Ｋ₂CO₃（１．０５当量，９g）を次いで添加する。沈殿形成が観察され る。該混合物を５０℃で１時間撹拌後、ブロム化誘導体（１当量，９．０３g） を添加し、撹拌を５０℃で２時間続ける。綿毛を通過させてろ過し、DMFを蒸発 させ、残さを酢酸エチルに溶解し、有機相を次いで1N HClで洗浄し、次いで １０％のNaHCO₃溶液、最後に飽和食塩水で洗浄する。有機相を乾燥させて蒸発さ せた後、生成物（６）が６９％（９．６６g）の収率で得られる。これは、プロ トンNMR、カーボン１３NMR、および質量分折で同定した。 ヒドラジン分解：鎖（７）の調製 生成物（６）（９．５１g，０．０４１mol）を１５０mlの９５％エタノール 中に入れる。ヒドラジン（２当量，４ml）を添加すると、当初の沈殿が直ぐに溶 解する。フタルヒドラジドの白色沈殿の形成が観察される。該混合物を５０℃で ３時間反応させた後、ろ過し、沈殿をエタノールで洗浄する。濃縮後、得られた ペーストをシリカゲルのクロマトグラフィー（ジクロロメタン／アセトニトリル ：９／１，v／v）で精製する。フリーのオキシアミン（７）を含有するフラクシ ョンを濃縮後、エーテル、次いで濃塩酸を添加する。生成物（７）が白色粉末の 形態で、４０％（２．３０g）の収率で得られる。これは、プロトンNMRおよびカ ーボン１３NMRから同定した。 オキシアミンBocの形成における保護 ２．３ｇ（０．０１６mol）の生成物（７）を１０mlのジオキサンに溶解す る。水酸化ナトリウムの1N水溶液を次いで添加する（２当量：０．０３２mol， ３２ml）。 ２０mlのジオキサンに溶解したジ−tert−ブチル＝ジカーボナート（１．２ 当量，０．０１９mol，４．１８g）を、次いでアルゴン雰囲気下、氷中で滴下す る。該混合物を０℃で３時間反応させた後、ジオキサンを蒸発させ、pHを１Ｎの HCl水溶液で３にする。該混合物を次いでエーテルで抽出（３Ｘ５０ml）する。 有機相を次いで１ＮのHCl水溶液、次いで飽和食塩水で洗浄する。硫酸ナトリウ ムで乾燥し、蒸発後、生成物（８a）が黄色のオイル形態（２．５６g，０．０１ ３mol，８０％）で得られる。これは、プロトンNMRおよびカーボン１３NMRで同 定した。 LiAlH₄を用いたニトリルの還元 化合物（８a）（２．５６g，０．０１３mol）を無水エチルエーテル（５０m l）中に溶解する。該混合物を氷浴中で冷却する。LiAlH₄（３g，０．０７９mol ）を次いで３回にわけて添加する。撹拌を一昼夜続け、水（１０ml）および１５ ％の水酸化ナトリウム水溶液を次いで添加する。白色沈殿が形成され、それをろ 過除去後、有機相を飽和食塩水で洗浄する。硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発後、 生成物（９）がオイル形態（７６９mg，０．００３７mol，２９％）で得られる 。これは、プロトンNMRおよびカーボン１３NMRで同定した。鎖（８b）は、プロ トンNMRおよびカーボン１３NMRで同定した。 オキシアミン鎖でのトリアゾロの置換 生成物（２）（２４６mg，０．６８mmol）を２０mlのアセトニトリルに溶解 する。鎖（８b）（７００mg，３．４３mmol）を次いで添加する。混合物を５０ ℃に保持する。反応をHPLCで追う。非常に反応は緩やかである。１週間後、 溶媒を蒸発させる。反応残さを酢酸エチルに溶解し、有機相を飽和食塩水で洗浄 する。硫酸ナトリウムで乾燥すると、黄色のオイルが得られ、これをシリカゲル のクロマトグラフィー（溶出液：ジクロロメタン／メタノール：９７／３，v／v ）にかける。溶媒を蒸発させた後、生成物（９）が白色粉末の形態（１２０mg， ０．２４mmol，３５％）で得られる。生成物（９）はプロトンNMRおよび質量分 析で同定した。 ヌクレオシド（９）のホスホリル化 実施例１に記載したプロトコール（ヌクレオチド５の調製）を用いて、ヌク レオシド（９）をホスホリル化すると、ヌクレオチド（１０）が得られる。 II−ウリジン系列 実施例３：アミン鎖（１５）を有するウリジンの合成 合成ルート： 鎖の合成： ５mlのプロパルギルアミン（７３mmol）を１ＮのNaOH／ジオキサン（１４６ ml／５０ml）混合物中に溶解する。５０mlのジオキサンに溶解した２０mlのBoc₂ Oを次いで、０℃でアルゴン雰囲気下、滴下する。沈殿形成が観察される。８時 間後、カーボナートの沈殿をろ過除去し、pHを1Nの塩酸水で３にする。該混合物 を次いでジクロロメタンで抽出する。有機相を次いで飽和食塩水で洗浄し、硫酸 ナトリウムで乾燥し、最後に蒸発させる。生成物（１１）がヘキサンを添加する ことによって沈殿する。８．９２g（０．０５７mmol，７９％）が回収される。 生成物（１１）はプロトンNMRおよび質量分析で同定した。 該鎖のベースへの導入：Heckカップリング（Hobbs，J．Org．Chem．，１９８ ９，５４，３４２０−３４２２） １０ｍlのDMFを脱気して、アルゴン雰囲気下に置く。ヨードウリジン（１g ，２．５６mmol，アルドリッチ，８５５２９−７）およびヨウ化銅（９７．５mg ，０．５１２mmol）を次いで添加する。反応混合物を暗所に置き、トリエチルア ミン（７１３ml，５１８mg，５．１２mmol）およびBoc鎖（１１）（１．２g，７ ．６８mmol）を次いでアルゴン雰囲気下、添加する。該混合物をアルゴン雰囲気 下に１０分間放置する。反応は、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジ ウム触媒（２９６mg，０．２５６mmol）を添加することによって開始する。反応 はHPLCで追う。反応を一昼夜続けた後、DMFを蒸発させ、アセトニトリルで共蒸 発させる。得られた残さをシリカゲルのクロマトグラフィーにかける（固 体材料負荷、溶出液：ジクロロメタン，ジクロロメタン／メタノール：９８／２ ，９５／５，９０／１０，８５／１５−v／v）。５２８mgの生成物（１２）（１ ．３mmol，５２％）が、蒸発後に得られる。生成物（１２）はプロトンNMRおよ び質量分析で同定した。 イソプロピリデン形態の保護（Townsend，Tipson，Nucleic acid chemistry ，part ２，p．７６５，Wiley-interscience） エチル＝オルトホルマート（１６６ml，１４８mg，１mmol）をアルゴン雰囲 気下、常温で、APTS（９．５mg，０．０５mmol）を含有するアセトン（２ml）中 の生成物（１２）（２００mg，０．５mmol）の懸濁液に添加する。反応はTLC（ ジクロロメタン／メタノール ９０／１０）で追う。２時間後、ジクロロメタン を添加し、有機相を１０％の炭酸水素ナトリウム水溶液、次いで飽和食塩水で洗 浄する。乾燥し、蒸発後、生成物（１３）が黄色の粉末形態（１６７mg，０．３ ８mmol，７６％）で得られる。 Eckstein法によるホスホリル化と脱保護（Ludwig，Eckstein，J．Org．Chem． ，１９８９，５４，６３１−６３５） ヌクレオシド（１３）（４４mg，１００mmol）を無水ピリジンに溶解し、該 溶液を２回濃縮する。１００mlのピリジン、３００mlのジオキサンおよびジオキ サン中の調製したばかりの２−クロロ−４Ｈ−１，２，３−ジオキサホスホリン −４−オン（１３０ml，１３０mmol）をアルゴン雰囲気下、添加する。該混合物 を２０分間撹拌し、０．５Ｍのトリブチルアンモニウムピロホスファートの無水 DMF溶液（３２０ml）と、１３０mlのトリブチルアミンを同時に添加する。 該混合物を３０分間撹拌後、ピリジン／水（９８／２，v／v）混合物中のヨ ウ素の１％溶液２mlを添加する。混合物を２０分間撹拌後、過剰のヨウ素を５％ のNaHSO₃の水溶液で処理し、撹拌を１０分間続ける。該混合物を乾燥するまで濃 縮し、水／ジクロロメタン抽出を行う。トリホスファートの形成は、HPLC（勾配 ：０から３５％のBで４０分；A＝２０mM Tris−HCI，pH７．６；B＝２０mM Tr is−HCl，pH７．６＋０．５Ｍ NaCl）で確認する。保持時間＝３６分。 該混合物を濃縮後、残さを水（１０ml）に溶解し、１０mlの５０％TFAの水 溶液を添加し、Bocおよびイソプロピリデン基の脱保護を行う。３０分後、TFAを 蒸発させ、水で共蒸発させる。２０分の保持時間を有する新規な生成物（１５） が形成される。 実施例４：アルコキシアミン鎖２１を有するウリジンの合成 合成ルート： カルボキシメトキシアミン−boc（１６）の合成（Kurth et al，J．Med． Chcm．，１９９３，１２５５−１２６１） カルボキシメチルアミン塩酸塩（６．６g，６０．４mmol）を１３２mlの水 に水酸化ナトリウム（２g，５０mmol）およびジオキサン（６６ml）の存在下、 溶解する。該溶液を氷浴で冷却する。ジ−tert−ブチル＝ジカーボナート（１３ ．９７g，６４．１mmol）のジオキサン（６６ml）中の溶液を滴下する。該混合 物を常温で一昼夜撹拌する。反応混合物を乾燥するまで濃縮する。２５０mlの水 を得られた沈殿に加え、全体を次いでエーテル（２Ｘ２５０ml）で抽出する。水 相を1NのHClでpH３まで酸性化する。該相を次いでエチルエーテル（３Ｘ５０ml ）、次いで酢酸エチル（３Ｘ２５０ml）で抽出する。有機相を合わせて、硫酸ナ トリウムで乾燥する。蒸発後、生成物（１６）が白色粉末の形態で得られる（１ ０g，５２mmol，８６％）。生成物（１６）は、プロトンNMRで同定した。 ペプチドカップリングによる鎖の合成（Costa，Dominguez，Cutts，Williams ，Bowen，Ｊ．Med．Chem．，１９９４，３７，３１４−３２１） 生成物（１６）（２g，１０．４mmol）を蒸留したばかりのTHFに溶解する。 DCC（２．１５g，１０．４mmol）を媒体を氷中で冷却後に添加する。該混合物を １５分間冷却したまま撹拌する。プロパルギルアミン（７１４ml，１０．４mmol ）を次いで添加する。撹拌を常温でアルゴン雰囲気下、２時間続ける。ろ過後、 溶媒を蒸発させる。得られた残さをジクロロメタンに溶解し、該溶液を１ＮのHC l水溶液、次いで５％の炭酸水素ナトリウム水溶液、最後に飽和食塩水で 洗浄する。硫酸ナトリウムで乾燥後、ジクロロメタンを蒸発させ、残さをシリカ ゲルのクロマトグラフィー（溶出液：酢酸エチル／ヘキサン，６０／４０，v／v ）にかける。生成物（１７）が白色粉末の形態で得られる（１．２３g，５．４m mol，５２％）。生成物（１７）は、プロトンNMRおよび質量分析で同定した。 Heckカップリング：Hobbs，Ｊ．Org．Chem．，１９８９，５４，３４２０−３ ４２２ １０mlのDMFを脱気して、アルゴン雰囲気下に置く。ヨードウリジン（１g， ２．５６mmol）およびヨウ化銅（９７．５mg，０．５１２mmol）を次いで添加す る。反応混合物を暗所に置き、トリエチルアミン（７１３ml，５１８mg，５．１ ２mmol）および鎖（１７）（１．７５g，７．６８mmol）を次いでアルゴン雰囲 気下、添加する。該混合物をアルゴン雰囲気下に１０分間放置する。反応は、テ トラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム触媒（２９６mg，０．２５６mm ol）を添加することによって開始する。反応はHPLCで追う。反応を一昼夜続けた 後、DMFを蒸発させ、アセトニトリルで共蒸発させる。得られた残さを酢酸エチ ルに溶解し、有機相を飽和食塩水で洗浄する。酢酸エチルを蒸発後、残さをシリ カゲルのクロマトグラフィーにかける（溶出液：ジクロロメタン／メタノール： ９０／１０，８５／１５，８０／２０，v／v）。７４７mgの生成物（１８）（１ ．６mmol，６２％）が、蒸発後に得られる。ヌクレオシド（１８）はプロトンNM Rおよび質量分析で同定した。 イソプロピリデン形態の保護（Townsend，Tipson，Nucleic acid chemistry ，part ２，p．７６５，Wiley-interscience） エチル＝オルトホルマート（３５５ml，３１６mg，２．１３mmol）をアルゴ ン雰囲気下、常温で、APTS（２０．２mg，０．１０mmol）を含有するアセトン（ ３ml）中の生成物（１８）（５００mg，１．０６mmol）の懸濁液に添加する。反 応はTLC（ジクロロメタン／メタノール ９０／１０）で追う。３時間後、ジク ロロメタンを添加し、有機相を１０％の炭酸水素ナトリウム水溶液、次いで飽和 食塩水で洗浄する。乾燥し、蒸発後、生成物（１９）が黄色の粉末形態（３９５ mg，０．７７mmol，７３％）で得られる。保護されたヌクレオシド（１９）は、 プロトンNMR、カーボン１３NMRおよび質量分析で同定した。 Eckstein法によるホスホリル化と脱保護（Ludwig，Eckstein，J．Org．Chem． ，１９８９，５４，６３１−６３５） ヌクレオシド（１９）（１０２mg，２００mmol）を無水ピリジンに溶解し、 該溶液を２回濃縮する。２００mlのピリジン、６００mlのジオキサンおよびジオ キサン中の調製したばかりの２−クロロ−４Ｈ−１，２，３−ジオキサホスホリ ン−４−オン（２６０ml，２６０mmol）をアルゴン雰囲気下、添加する。該混合 物を２０分間撹拌し、０．５Mのトリブチルアンモニウムピロホスファートの 無水DMF溶液（６４０ml）と、２６０mlのトリブチルアミンを同時に添加する。 該混合物を３０分間撹拌後、ピリジン／水（９８／２，v／v）混合物中のヨ ウ素の１％溶液（４ml，３１４mmol）を添加する。混合物を２０分間撹拌後、過 剰のヨウ素を５％のNaHSO₃の水溶液で処理し、撹拌を１０分間続ける。該混合物 を乾燥するまで濃縮し、残さを水／ジクロロメタン抽出する。トリホスファート の形成は、HPLC（勾配：０から３５％のBで４０分；A＝２０mM Tris−HCl，pH ７．６；B＝２０mM Tris-HCl，pH７．６＋０．５Ｍ NaCl；Waters Protein− Pak ８HR １０Ｘ１００mm DEAEカラム）で確認する。保持時間＝３５分。 該混合物を濃縮後、残さを水（５ml）に溶解し、５mlの５０％TFAの水溶液 を添加し、Bocおよびイソプロピリデン基の脱保護を行う。３０分後、TFAを蒸発 させ、水で共蒸発させる。HPLCで観察され、３０分の保持時間を有する新規な生 成物（２１）が形成される。該生成物を上記条件下でHPLCで精製し、脱塩する（ isocratic milliQ 水，Macherey Nagel Ｃ１８ヌクレオシルカラム）。 III−シチジン系列 I-アルキルアミノ鎖の存在によって４位が修飾されたヌクレオチドトリホスフ ァートの合成 ベースの４位にアミン化アルキル鎖を導入するために、ベースをCzernecki et al．の方法（S．Czernecki，T．Lediguarher，J．M．Valery，Nucleosides ＆ Nucleotides，１９８９，５４，６３１−６３５）で、［２’，３’−O−イ ソプロピリデン，５’−O−ブチルジメチルシリル］ウリジンから、トシル基を 導入することによって、活性化した。 トシル基のジアミン化アルキル鎖との求核置換、次いで導入された鎖のフリ ーのアミノ官能基のエチル＝トリフルオロアセタートを用いた保護が１工程で行 われる。 ５’位のヒドロキシル官能基の脱保護によって、修飾ヌクレオシドが遊離さ れ、これは、最終的には、前記の実施例に記載したLudwig−Eckstein法（J．Lud wig，F．Eckstein，J．Org.Chem．，１９８９，５４，６３１−６３５）を 用いて該位置においてトリホスホリル化される。 ４位に導入された鎖のアミノ官能基のおよび２’および３’ヒドロキシル基 を保護している基の加水分解によって、所望のヌクレオチドトリホスファートが 得られる（図１）。 トランスアミネーションによってヌクレオチドの４位に直接アミン化鎖を導 入することからなる他の方法も、ヌクレオチド（３３）および（３４）の調製に 使用された（図３）。 実施例５：［２’，３’−O−イソプロピリデン，５’−O−ブチルジメチルシ リル］ウリジン（２２）の合成 ２’，３’−O−イソプロピリデンウリジン（１mmol，シグマ，I−５１２７ ）のピリジン（５ml）溶液をアルゴン雰囲気下、常温で、t−ブチルジメチルシ リルクロリドで一昼夜処理する。反応を無水エタノール（２ml）を添加すること によって止め、混合物を濃縮し、トルエンで共蒸発させる。生成物（２２）をシ リカゲルクロマトグラフィー（溶出液：酢酸エチル／ヘキサン １：１，v：v， Rf＝０．３）で精製する。 実施例６：［２’，３’−O−イソプロピリデン，５’−O−ブチルジメチルシ リル−４−p−トルエンスルホニル］ウリジン（２３）の合成 アセトニトリル（１７ml）中の化合物（２２）（１mmol）を、炭酸カリウム （１．３mmol，１．３当量）およびp−トルエンスルホニルクロリド（１．２mmo l，１．２当量）の存在下、３時間、還流させる。出発化合物が完全に無くなっ た後、反応混合物を常温で、水（２ml）を添加することによって加水分解し、次 いで乾燥するまで蒸発させる。得られた残さを酢酸エチル及び水のパーティショ ン化によって処理し、以下の工程に使用する。 TLC：Rf＝０．７（溶出液：酢酸エチル／ヘキサン １：１，v：v）。 ヌクレオシド（２３）は以下のように特徴づけられる。 プロトン 実施例７：［４−Ｎ−アルキルトリフルオロアセチルアミノ−２’，３’−O −イソプロピリデン，５’−O−t−ブチルジメチルシリル］シチジン（２４）の 合成 ジアミン化アルキル剤（５mmol，５当量）を、常温でアルゴン雰囲気下、ジ クロロメタン（５ml）中の化合物（２３）(１mmol)の溶液に添加する。５分間撹 拌後、過剰量のエチル＝トリフルオロアセタート（１５mmol，１５当量）を反応 媒体に添加し、撹拌を１５分間続ける。所望のヌクレオシド（２４）を、シリカ ゲルのクロマトグラフィー（溶出液：アセトン／ヘキサン １：２，v：v，Rf＝ ０．２）で精製する。完全に保護された中間体のヌクレオシド（２４）の構造は 、プロトンNMRで確認される。 ヌクレオシド（２４a）の例： 実施例８：［４−Ｎ−アルキルトリフルオロアセチルアミノ−２’，３’−O −イソプロピリデン］シチジン（２５）の合成 THF（５ml）に溶解した化合物（２４）（１mmol）を、THF中のテトラブチル アンモニウムフルオリド（１．２mmol，１．２当量）のモル溶液で処理する。常 温でアルゴン雰囲気下、３又は４時間撹拌後、反応混合物を酢酸（１当量）で中 性化し、次いで乾燥するまで蒸発させる。化合物（２５）はシリカゲルのク ロマトグラフィー（溶出液：アセトン／ヘキサン １：１，v：v，Rf＝０．３） で精製する。 実施例９：［４−Ｎ−アルキルトリフルオロアセチルアミノ−２’，３’−O −イソプロピリデン−５’−O−トリホスファート］シチジン（２６）の合成 化合物（２５）（０．２mmol）をピリジン（２Ｘ１ml）で共蒸発させ、４０ ０mlのピリジン／ジオキサン（１：３，v：v）混合物に溶解する。ジオキサホス ホリノンクロリド（２６０μｌ）を反応混合物に添加する。５から１０分後に白 色沈殿が形成され、２０分撹拌後、DMF中のブチルアンモニウムピロホスファー ト（０．５M，６４０μｌ，１．６当量）を反応混合物に添加し、次いで、トリ ブチルアミン（２３０ml）を添加する。３０分撹拌後、反応混合物をピリジン／ 水（９８：２，v：v）混合物（４ｍl）中のヨウ素の１％溶液で酸化し、３０分 間撹拌をつづける。過剰のヨウ素を５％の重亜硫酸ナトリウムの水溶液で処理し 、反応媒体を乾燥するまで濃縮する。得られた残さを水（２０ml）に溶解し、該 溶液をジクロロメタンで洗浄することによって処理する。水相を回収し、HPLCで 分析する（ミリポア５Ｘ１００mm DEAE ８HRカラム，バッファA：２０mMトリ ス−HCl，pH７．６，バッファB：２０mMトリス−HCl，０．５M塩化ナトリウム， pH７．６，流速：０．５ml／分，勾配：０から３５％B４０分）。保持時.間：２ ４から２９分。TLC：Rf＝０．５，溶出液：プロパノール：水：水酸化アンモニ ウム（６：３：１，v：v：v）。 実施例１０：［４−Ｎ−アルキルアミノ−５’−O−トリホスファート］シチ ジン（２７）の合成 アンモニア水（１０ml）を、水（２０ml）中の化合物（２６）（０．２mmol ）の溶液に添加し、該混合物を１時間撹拌する。反応媒体を乾燥するまで濃縮し 、残さを水（２０ml）、次いで５０％トリフルオロ酢酸水溶液（１０ml）に溶解 し、撹拌を３０分間続ける。反応媒体を再度濃縮し、次いで水を用いて乾燥する まで蒸発させる。所望の化合物は、HPLCで精製、脱塩する。分析HPLC：保持時間 ：１７から２０分。精製：プレパラティブ１０Ｘ１００mmプロテイン パック８HR DEAEカラム、実施例９と同様のバッファおよび勾配が使用され、流 速は２ml／分である。脱塩：RP１８カラム、バッファA：水、バッファB：メタノ ール。TLC：Rf＝０．２、溶出液:プロパノール：水：水酸化アンモニウム（４： ５：１，v：v：v）。 II−アルキルオキシアミン化鎖の存在によって４位が修飾されたヌクレオチド トリホスファートの合成 末端がヒドロキシル化されたアルキル鎖をまず、シチジンの４位のトシル基 の求核置換によって導入する。次いで、導入された鎖のヒドロキシル官能基とN −フタルアミドヒドロキシルアミンとのミツノブ反応を行った。 相当するアルキルオキシアミン化ヌクシオチドトリホスファートが、アルキ ルアミン化ヌクレオチドトリホスファート合成と同様の工程（図２）にしたがっ て、得られる。 実施例１１：［４−Ｎ−ヘキサニル−６−オール−２’，３’−O−イソプロ ピリデン−５’−t-ブチルジメチルシリルシチジン（２８）の合成 ６−アミノヘキサノール（５mmol，５当量）を、常温でアルゴン雰囲気下、 ジクロロメタン（５ml）中の化合物（２３）（１mmol）の溶液に添加する。反応 を３０分間進めた後、溶媒を乾燥するまで濃縮し、化合物（２８）はシリカゲル クロマトグラフィーで精製する。 実施例１２：［４−Ｎ−ヘキサニル−６−N-フタルアミドオキシアミノ−２’ ，３’−O−イソプロピリデン−５’−t−ブチルジメチルシリル］シチジン（２ ９）の合成 ジエチル＝アゾジカルボキシラート（DEAD，３mmol，３当量）を常温でアル ゴン雰囲気下、THF（１０ml）中の、トリフェニルホスフィン（３mmol，３当量 ）およびN−フタルアミドヒドロキシルアミン（３mmol，３当量）の存在下、化 合物（２８）（１mmol）の溶液に添加する。１時間撹拌後、溶媒を乾燥するまで 濃縮し、化合物（２９）をシリカゲルクロマトグラフィーで精製する。 実施例１３：［４−Ｎ−ヘキサニル−６−Ｎ−フタルアミドオキシアミノ−２ ’，３’−O−イソプロピリデン］シチジン（３０）の合成 化合物（３０）は、実施例８に記載したプロトコールにしたがって合成され た。 実施例１４：［４−Ｎ−ヘキサニル−６−Ｎ−フタルアミドオキシアミノ−２ ’，３’−O−イソプロピリデン−５’−O−トリホスファート］シチジン（３１ ）の合成 化合物（３１）は、実施例９に記載したプロトコールにしたがって合成され た。分折HPLC（実施例１０と同様の条件）:保持時間：４４分。TLC:Rf＝0．5、 溶出液：プロパノール:水：水酸化アンモニウム（６：３：１，v：v：v）。 実施例１５：［４−Ｎ−ヘキサニル−６−オキシアミノ−５’−O−トリホス ファート］シチジン（３２）の合成 全保護ヌクレオチド（３２）を、実施例１０に記載したプロトコールにした がってトリフルオロ酢酸を用いて２’及び３’位を脱保護する。アルコキシアミ ノ官能基は、ヒドラジンの水溶液中、常温で一昼夜で脱保護される。ヌクレオチ 下（３２）は次いでHPLCで実施例１０と同様の条件下、精製される。 実施例１６：トランスアミン化による［４−Ｎ−（２，２−オキシ−ビス−エ チルアミン）−５’−O−トリホスファート］シチジン（３３）の合成 シチジントリホスファート（０．１mmol）を、１０Mの水酸化ナトリウム溶 液で予め７．０にpHを調節した、水（２．５ml）中の２，２’−オキシ−ビス− エチルアミン塩酸塩と重亜硫酸ナトリウム（１２mmol，１２０当量）からなる溶 液に添加する。該混合物を次いで３７℃で３日間撹拌する。化合物（３３）をHP LCで精製して脱塩する（実施例１０のＨＰＬＣ条件参照）。 実施例１７：トランスアミン化による［４−Ｎ−（アジピン酸ヒドラジド） −５’−O−トリホスファート］シチジン（３４）の合成 ヌクレオチド（３４）は、実施例１６に記載したプロトコールにしたがって 、ヒドラジド官能基を導入するためにアジピン酸ジヒドラジド（８３mg，０．４ ４mmol）を用いて、トランスアミン化によって調製された。ヌクレオチド（３４ ）はまた、実施例１０に記載されたように精製し、脱塩し、その構造はプロトン NMRで確認された。 IV−官能化フルオロホル(fluorophore)： 実施例１８：フルオレセインアルデヒド（３６）の合成 合成ルート： FITCの保護アルデヒドへのカップリング： フルオレセインイソチオシアナート（９１３mg，２．３５mmol，アルフォリ ッチ，Ｆ２５０−２）をアルゴン雰囲気下、無水DMF（１０ml）に溶解する。ア ミノブチルアルデヒドジエチルアセタール（aminobutyraldehyde diethylaceta l）（４２１mg，３９２ml，２３５mmol）を次いで添加する。１時間後、DMFを蒸 発させ、残さをシリカゲルのクロマトグラフィーにかける（溶出液：ジクロロメ タン／メタノール：９０／１０，v／v）。溶媒蒸発後、生成物（３５）がオレン ジ色の粉末（１．２１g，２．２mmol，９４％）で得られる。これは、プロトンN MRと質量分析で同定した。 アルデヒドの脱保護： 保護生成物（３５）（３４２mg，０．６２mmol）を２０mlの３０％酢酸水に 入れる。反応を１時間進めた後、溶媒を蒸発させ、アセトニトリルで共蒸発させ る。得られた残さをシリカゲルのクロマトグラフィーにかける（溶出液：ジクロ ロメタン：メタノール／９０／１０，v／v）。溶媒を蒸発させた後、オレンジ色 の粉末（１４５mg，０．３０mol，４８％）が得られる。これは、プロトンNMRと 質量分析で同定した。 実施例１９：予め官能化したポリヌクレオチドの化学合成 出発物質のヌクレオチド２’−デオキシ−８−（ペンテニル）チオアデノシ ン（３８）の合成 出発物質のヌクレオシドは、A．LAAY0UN，J．−L．DEC0UT and J．LH0MME， Tetrahedron Lett，１９９４，３５，４９８９−４９９０に記載された方法を 用いて得られた前駆体２’−デオキシ−８−メルカプトアデノシン（３７）を用 いて合成した。 ２’−デオキシ−８−メルカプトアデノシン（１６．６８mmol）を、過剰量 の炭酸カリウム（３３．００mmol）の存在下、無水DMF（ジメチルホルムアミド ）に溶解する。１−ブロモ−４−ペンテン（１８．３７mmol）をアルゴン雰囲気 下添加し、３時間、常温で撹拌しながらインキュベート後、鉱物塩をセライトを 用いてろ過し、DMFを蒸発させる。茶色の残さが得られ、ヘキサンで洗浄し、次 いでエチルエーテルで洗浄する。生成物をシリカのクロマトグラフィーにかけて 精製する（溶出液：ジクロロメタン／メタノール−９５／５（v／v）次いで９０ ／１０（v／v））。このようにして得られた出発物質のヌクレオチドは通常のス ペクトル法を用いて特徴づけられる。 予め官能化されたポリヌクレオチドの化学合成： 予め合成されたヌクレオシドをまず、オリゴヌクレオチドに組み入れる。こ の最後に、保護された出発物質のヌクレオシドに相当するホスホラミジトシント ン（３９）が、A．J．R0GERS”Oligonucleotide synthesis”（１９８４）， pp．２３−２４，M．J．GAIT Ed．，IRL Press．Oxfordに記載された方法を用 いて調製された。 Bz＝ベンゾイル DMT＝ジメトキシトリチル アデニンの環外アミノは、ベンゾイル基で保護され、一方、５’ヒドロキシ ルはジメトキシトリチルで保護され、３’ヒドロキシルはN，N−ジイソプロピル −２−シアノエチルホスホラミジト基で保護される。 Lが２’−デオキシ−８−（ペンテニル）チオアデノシンであるポリヌクレ オチド５’CGCACLCACGC３’が、製造者によって示唆されたプロトコールを用い てMilligen／Biosearch８７００装置で、自動的にホスホラミジト法によって合 成された。 合成されたポリヌクレオチドは逆相HPLC（セミプレパラテイブMacherey Nag el１０mmX２５cmカラム；Cl８；５μｍ孔度；溶出液：pH６の酢酸アンモニウム の０．１M水溶液と混合された０から３０％アセトニトリル２０分勾配）。ポリ ヌクレオチドを含むフラクションを集め、凍結乾燥する。 酢酸（水中８０％）で常温で１０分間オリゴヌクレオチドを処理した後、ポ リヌクレオチドの５’位を脱トリチル化し、ポリヌクレオチドを次いで単離して 、次いでエーテルで抽出する。 次いで、前の工程に組み入れられたヌクレオチドLを、ヌクレオチドジオー ル５’CGCACMCACGC３’を得るために活性化する。 ３４０nmmlのポリヌクレオチド５’CGCACLCACGC３’を１７０μｌの０．０ ２％のオスミウムテトラオキシド、２μｌのN−メチルモルホリン−N−オキシド および２μｌの３％過酸化水素からなる溶液で処理する。常温で一昼夜インキュ ベート後、ポリヌクレオチド５’CGCACMCACGC３’を前記条件を用いてHPLCで精 製する。 最後に、ポリヌクレオチドアルデヒド５’CGCACNCACGC３’ が、暗所中、２００μｌの５４μＭ過ヨウ素酸ナトリウムを２００μｌの１１ ０nMオリゴヌクレオチドジオール５’CGCACMCACGC３’の水溶液に添加すること によって得られる。１５分後、ポリヌクレオチドアルデヒド５’CGCACNCACGC３ ’をHPLC（セミプレパラテイブMacherey Nagel１０mmX２５cmカラム；Cl８；７ μｍ孔度：溶出液：pH６のジハイドロゲンホスファートナトリウムの２０mM水溶 液と混合された０から３０％メタノールの２０分勾配）で精製する。 実施例２０：実施例１９で得られた予め官能化したポリヌクレオチドの標識化 ： 標識化反応をダンシル核からなり、官能性蛍光基として、ジエチレングリコ ール鎖によつてオキシアミノ（求核性）基に結合した薬剤（４０）を用いて行う 。該薬剤はD．BOUTURYN et al．，Tetral1edron，１９９７，５３，５４８５ −５４９２に記載された方法を用いて調製した。 標識化反応は水中、オリゴヌクレオチドに対して幾分過剰量の薬剤（４０） （１．５当量）の存在下、行われる。HPLCによって反応の進行をモニターすると 、出発化合物が早急になくなり、官能化ポリヌクレオチド（４１）に相当する新 規生成物が形成される。プロトンNMRスペクトルの分析から、さらにダンシル標 識の結合が確認される。 実施例２１：転写による予め官能化されたポリヌクレオチドの酵素合成 予め官能化されたヌクレオチド：２’−デオキシ−８−（ブタナール）−チオ アデノシン−５’ートリホスファート（４３）の合成： 該合成は２’−デオキシ−８−（ペンテニル）チオアデノシン（３８）（実 施例１９参照）を用いて行われる。出発物質のヌクレオチド（４２）は、J．LUD WIG and F．ECKSTEIN，J．Org.Chem．，１９８９，５４，６３１−６３５に記 載された方法を用いて得られる。 予め官能化されたヌクレオチド（４３）を得るために必要な酸化工程は実施 例１９に記載したように行われる。 予め官能化したヌクレオチド(43)の酵素的組み込み： a)プロモーターを有するＤＮＡ鋳型の作製： 標準プライマーおよび標準プライマー配列の上流にファージT7RNAポリメラ ーゼに関するプロモーターのセンス配列を有するプライマーを用い、直鎖状pGEM プラスミドに含有される遺伝子HIVgagについてPCRを行つた。 プライマー配列： 標準プライマー(No．4014)： プロモータープライマー(No．4003)： この結果、158塩基対の生成物が得られ、フェノール／フロロホルムを用い てそれを抽出し、ミクロコン30を通すことにより精製する。 b)転写反応： エッペンドルフ管内で、40mMトリス塩酸緩衝液、pH8.1、20mM MgCl₂、5mMジ チオスレイトール、1mMスペルミジン、8％ポリエチレングリコール、0.01％トリ トンＸ100、50μｇ/mlのウシ血清アルブミン/ml中、最終容量25μｌで転 写反応を行った。予め官能化したヌクレオチド(43)および４種のリボヌクレオチ ド(CTP,GTP,ATPおよびUTP)をそれぞれ1.33Mmおよび各リボヌクレオチドについて は4mMの濃度で加える。PCR鋳型は10⁹コピー/μｌの濃度で加え、ファージT7ＲＮ Ａポリメラーゼ（特許出願FR 97 04166）は1u/μｌの濃度で加える。この反応物 を37℃にて60分間インキュベートする。ＤＮＡ鋳型を破壊するために、0.5uのＤ Ｎアーゼ1/μｌを培地に加える。サンプルのインキュベーションを37℃にて15分 間続ける。得られたＲＮＡはセフアデックス(Sephadex)G50を通すことにより精 製する。 平行して、T7ＲＮＡポリメラーゼを加えない反応により、第一の対照実験を 行う。行われた転写のための対照として、いずれの活性化したヌクレオチドも用 いずに第二の対照実験を行う。 精製した転写産物は実施例２に記載の実験方法を用いて標識し、アガロース ゲルにおける電気詠動移動に続き、紫外線下で視認化する。 実施例２２：TMA増幅反応中の予め官能化したポリヌクレオチドの合成 TMA増幅産物を強力に標識するために、予め官能化したヌクレオチド27a(CTP -(N4)-C₆O₂-NH₂)、27b(CTP-(N4)-C₄-NH₂)および32(CTP-(N4)-C₆-ONH₂)を増幅物 に組み込む。増幅反応を平行して、フルオレセイン、すなわちフルオレセイン-1 2-UTP(Boerh1nger，ref．1 427 857)を有する標識ヌクレオチドの存在下で続け る。 予め官能化したヌクレオチド27a、27bおよび32、ならびに比較のためのBoer hingerの標識ヌクレオチドref．1 427 857のTMA増幅反応産物への組み込みは、G enプローブ増幅^TMMTD2（マイコバクテリウム・ツベルクロシス指示試験）キット を用いて試験する。この反応はマイコバクテリアl6S ＲＮＡの136塩基断片を増 幅する。それは４種の酵素活性（ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ依存 性ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼおよびリボヌクレアー ゼH）および２種の酵素、T7ＲＮＡポリメラーゼおよびAMV逆転写酵素を用いる。 転写、逆転写およびＤＮＡ：ＲＮＡ二重らせんに含まれるＲＮＡの消化の工程（ これらの工程はＲＮＡウイルス複製サイクルに類似）を含む循環反応に より、この反応は２種のプライマー（単純プライマーおよびT7ＲＮＡポリメラー ゼプロモーターを含有するプライマー）によって認識される核酸配列を特異的に 増幅させることが可能になる。増幅因子は極めて豊富であり(10⁹)、感受性は極 めて良好である（１ないし10コピー）。得られた産物の90％は一本鎖ＲＮＡから なり、10％は二本鎖ＤＮＡからなる。 増幅反応は10⁶コピーのマイコバクテリウム・ツベルクロシス16SＲＮＡを用 いて行う。この標的ＲＮＡを予め得て、以下の方法により精製する：16SＲＮＡ 遺伝子をプロモーターの制御下でプラスミドにクローン化する。次いでin vitro 転写により16SＲＮＡを得る。このＲＮＡをフェノール／クロロホルムでの抽出 、およびミクロコン30^TM(Amicon)を通す濾過により精製する。それを260nmでの 吸収により検定する。 標準的なTMA反応は各天然rNTP(ATP，CTP，GTPおよびUTP)を4mM含む。予め官 能化したヌクレオチドを増幅産物へと組み込むためには、反応緩衝液中にこれら 修飾されたヌクレオチドの１つが含まれている限り、この反応を行う。修飾され たものであろうと天然物であろうと、同じシリーズの各ヌクレオチドの総濃度が 4mMであることを確かめると同時に、この反応は種々の濃度比率の修飾ヌクレオ チドおよび天然ヌクレオチドの存在下で検討される。検討された比率は0％、10 ％、30％、50％および70％（70％では試験できないフルオレセイン-UTPの場合は 除く）である。陰性対照実験も行い、この陰性対照実験は、酵素は別として（凍 結乾燥酵素を再溶解させるために使用する緩衝液により置換）、使用される最高 比率の修飾ヌクレオチドを含有する、すべての試薬を含んでなる反応液からなる 。 増幅反応は、変性ポリアクリルアミドゲル（6％アクリルアミド、7M尿素、1 xTBE、bioRad電気泳動装置、170ボルト、45分）上で反応混合液5μｌを電気泳動 させ、次いで臭化エチジウムで染色することにより分析し；続いて、ノーザンブ ロッドを行う。核酸をメンブラン（ナイロンN、bioRad半乾燥転移装置、0.5xTBE 、25V、15分）に転移させ、ペルオキシダーゼで標識したマイコバクテリウム・ ツベルクロシスに特異的な核酸プローブ： とハイブリダイズさせる（PEG中で37℃にて30分プレインキュベートし、次い で0.1ngのペルオキシダーセプローブ/μｌを含有するPEGの存在下で37℃にて１ 時間インキュベートする）。視認化は比色計による（基質、ジアミノベンジジン 、Sigma）。 蛍光ヌクレオチド（フルオレセイン-12-UTP）を含有する反応の場合には、 この増幅産物はまた、臭化エチジウムでの染色の前に紫外線テーブル上でのフル オレセインの励起により、ゲル上で視認化される。 臭化エチジウムでの染色に続き、予め官能化したヌクレオチドを使用するも のを含めあらゆる反応の場合で、期待される増幅産物が大量に視認化される。ノ ーザンブロッティングの後、これらの産物を特異的プローブとハイブリダイズさ せる。 実施例２３：TMA増幅産物における組み込み率の分析 標識ヌクレオチドフルオレセイン-12-UTP(Boerhinger，ref．1 427 857)の 存在する場合と比較することにより、予め官能化したヌクレオチド27a(CTP-(N4) -C₆O₂-NH₂)および27b(CTP-(N4)-C₄-NH₂)の存在下で得られた増幅物の予めの官能 化を評価するため、組み込まれた予め官能化したヌクレオチドと類似体天然ヌク レオチドの間の比率を決定する。 実施例22の実施において得られた増幅産物をミクロコン30^TM(Amicon製)を通 す濾過により、反応物中に過剰に存在するヌクレオチドから分離し、50μｌの水 に溶解させる。フルオレセイン-12-UTPの存在下での増幅の場合は、増幅はセフ ァデックス(Sephadex)G50上で行う（フルオレセインはミクロコンに吸着させる ）。 次いで増幅産物の吸収を260nmにて測定する（酵素を含まない対照は極めて 低濃度であるはずである）。 予め官能化したヌクレオチドを含む増幅反応（およびそれらの対照）の場合 では、次いで、核酸を下位のヌクレオシド段階へと消化する工程を行う： 増幅産物5 10¹⁴コピー（およそ35μｇ）を最終容量86μｌの水に希釈する（ 酵素を用いない対照の場合には、最大サンプル容量に等しい容量を用いる）。10 μｌの10xP1ヌクレアーゼ緩衝液(300mM CH₃COONa緩衝液、pH5.3、1mMZnSO₄)およ び4μｌのP1ヌクレアーゼ(Boerhinger，ref．236225，1μｇ/μｌ，0.3u/μｌ) を加える。反応混合物を37℃にて30分間インキュベートする。次いで、12μｌの 10xアルカリ性ホスファターゼ緩衝液(Boerhinger，ref．1246283)および1μｌの アルカリ性ホスファターゼ(Boerhinger，ref．713023，1U/μｌ)を加え、37℃に て15分間インキュベーションを続ける。反応は氷で停止させる。 次いで、高速液体クロマトグラフィー分析(HPLC，Beckman，Gold system)に より、ヌクレオシド標準品と比較することによって、このヌクレオシド組成物を 定める（各ヌクレオシド50ngのインジェクション）。20μＬの消化物C18(Ultras phere)カラムにインジェクトし、これを45℃で加熱する。分離は、メタノール勾 配（10分後、95％メタノールの0％から30％を15分内に通す）を含む50mMリン酸 ナトリウム緩衝液,pH7中で行う。ピークは254nmでの吸収により視認化し、ピー ク面積を積分により算出する。 官能化したヌクレオチドのピーク面積と天然類似体のそれとの間の比率によ り、組み込み率、すなわち組み込まれている予め官能化したヌクレオチドの量と 組み込まれている同シリーズのヌクレオチドの総量の間の比率を求めることがで きる。 酵素を用いない対照ではピークの立ち上がりは見られないはずである。この 対照が過剰に存在するヌクレオチドを除去する工程が首尾よく効力を示したこと を証明する。 フルオレセイン-UTPを含む増幅反応の場合では、組み込まれたフルオレセイ ンヌクレオチドの量を蛍光強度により測定する：標準範囲のフルオレセインの蛍 光強度はPerkin LS 50分光蛍光光度計で読みとる。種々の増幅反応の蛍光強度を 測定する。組み込まれたフルオレセイン量は標準曲線と比較することにより求め る。組み込み率は260nmでの吸収により測定される増幅物濃度に換算する。 HPLC分析により、８種の天然ヌクレオシド、ならびに試験された３種の予め 官能化したヌクレオチドに対する煩似体である３種のヌクレオシドを分離する ことができる。 下記表に示される結果は、検討されたすべての予め官能化したCTPヌクレオ チドが、慣例的に用いられる標識ヌクレオチドであるフルオレセイン-12-UTPよ りも優れた、TMA増幅産物における組み込み率を与えることを証明するものであ る。 これらの結果は、CTPヌクレオチドを予め官能化することがフルオレセイン を用いて標識することにより達成されるものより優れた組み込みを可能にするこ とを証明するものである。増幅物を極めて良好に予め官能化することより、官能 化後、フルオレセインヌクレオチドを用いて得られるものよりさらに強力な標識 を得ることができる。 同様に、組み込み率の改良は、シチジンのN4位に組み込まれるヌクレオチド 32のオキシアミノ基などの他の反応官能基を用いて達成することもできる。 実施例２４：TMA感受性における予め官能化したヌクレオチドの組み込みの 影響に関する分析 予め官能化したヌクレオチドの組み込みを含むTMAの感受性を研究するため 、種々の比率(100％，70％，50％，30％，10％および0％)の予め官能化したヌク レオチドとその天然類似体の存在下で、標的（実施例22に記載のマイコバクテリ ウム・ツベルクロシス16SＲＮＡ）量を減少させながら（10000,1000,100,10およ び0コピー）TMAを行った。同様の予め官能化したヌクレオチド、すなわち27a(CT P-(N4)-C₆O₂-NH₂)および27b(CTP-(N4)-C₄-NH₂)を試験した。 反応生成物を、特に実施例22に記載の方法により研究する。 また反応生成物をELOSA(PCT WO 92/19812)およびシグナル強度の標準範囲の それとの比較による半定量的手法にて分析する。 反応は、予め官能化したヌクレオチドの存在下で行い、電気泳動および染色 、ノーザンブロッティングおよびELOSAにより分析する。使用された種々の分析 方法の代表的なELOSAにより得られた結果を図4および5に示す。いずれの予め官 能化したヌクレオチドを使用しようとも(27aまたは27b)、最初の標的のコピー数 が極めて少ない場合でさえ、TMA反応の感受性に有意な影響を及ぼさない予め官 能化したヌクレオチド濃度を求めることが可能である。さらに特に、添付の図5 から明らかなように、ヌクレオチド27bは天然ヌクレオチドと置き換えることが 可能である。 実施例２５：予め官能化した増幅物の標識 予め官能化したヌクレオチド27b(CTP-(N4)-C₄-NH₂)の存在下で、実施例22を 行ったときに用いた方法により得られた予め官能化した増幅物を、増幅により維 持させ、組み込まれた予め官能化したヌクレオチドにより供給する求核基と、予 めフルオレセインと結合させた抗反応求電子基との間の化学結合反応により標識 する。得られた標識は、標識ヌクレオチドフルオレセイン-12-UTP(Boerhinger， ref．1 427 857)の存在下で得られたものと比較する。 10⁶コピーのマイコバクテリウム・ツベルクロシス16SＲＮＡ標的を用い、 予め官能化したヌクレオチド27bの50％存在下で、実施例22に記載の方法により 増幅物を得る。 得られた増幅物は、以下の方法：｛30μｌのTMA増幅産物を30μｌの0.2M炭 酸塩、0.15Ｍ NaCl緩衝液、pH8.8および40μｌ（およそ200当量）のフルオレセ インNHS(DMSO中3.5mg/ml)と混合｝を用いてフルオレセイン-NHS(Boerhinger 837 0042128)と結合させる。周囲温度で１時間振盪の後、この標識を分析する。 実施例22に記載のゲル電気泳動によりこの標識増幅物(15μｌ)を分析し、次 いで、臭化エチジウムでの染色の前後で、紫外線下で視認化する。このプロフィ ールを50%フルオレセイン-12-UTPの存在下で標識することにより得られたものと 比較する。 染色なしで得られたシグナルは、フルオレセインで直接標識することにより 得られたものよりさらに強力である。ヌクレオチド32が有するオキシアミノ基を 用いることにより、フルオロフォール36と結合させた後も、同等の良好な結果を 得ることができる。オキシアミノ／アルデヒド結合の反応性は、実施例20で示し たように、達成される結合時間を短縮することが可能である。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】平成１０年９月２５日（１９９８．９．２５） 【補正内容】 明細書 標的核酸配列の増幅方法 本発明は、標的核酸配列の増幅方法に関する。 文献：EP-A-0 285 057は、ヌクレオチドの構成要素、すなわち糖、プリンま たはピリミジン塩基およびリン酸エステル基の１つに種々の用途、特に標識の用 途を持つ官能基を導入することからなる核酸処理方法を開示している。このよう に処理されて得られたヌクレオチドは、該文献によれば、ポリヌクレオチドに、 特にこのヌクレオチドの存在により不安定になる二重らせんを有することなく二 本鎖型へと組み込むことができた。 しかしながらこの場合、先行技術によれば、ヌクレオチドに結合している官 能基は、立体障害、疎水性相互作用または複合現象などの種々の現象を示し、こ れらが、該処理ヌクレオチドを組み込んだポリヌクレオチドが、該処理ヌクレオ チドが組み込まれていない相当するポリヌクレオチドを認識するであろう大部分 の酵素によって認識されることを妨げるものである。 文献：WO−A−９２／００９８９は、標的核酸を増幅させることによって、 特に標識されたプローブを得るために、核酸配列を標識するための蛋白質を使用 する方法を提案している。該方法によれば、反応性官能基の存在によって天然の ヌクレオチドとは異なる修飾ヌクレオチドが使用され、増幅は予め官能化された プローブを得るために行われ、得られたプローブは蛋白質レベルと反応性官能基 によって反応するものである。最後に、修飾ヌクレオチドの反応性官能基は、適 当な箇所において保護されていてもよいチオール官能基およびアミノ官能基から 選択された求核性官能基である。 該方法の欠点は、幾千のオーダーである分子量を有することによって、その 大きさのために、該標識と該官能基との間の共有結合の収率および／または速度 が実質的に制限されてしまうことにあり、該問題点は、プローブに組み込まれた 修飾ヌクレオチドの数が増すにつれてより問題となるものである。さらに、該標 識は、得られたプローブが含有されている反応、特にハイブリダイゼーションを 減速してしまう可能性がある。 本発明は、前記の欠点を解消し、特にヌクレオチドの組み込みを妨害せず、 その結果として標的とする増幅反応における収率および／または感受性に有意な 影響を示さず、さらには標識の組み込みに従来付随していた標識の不安定現象を 回避することにより、増幅産物の優れた標識を得ることを可能にする増幅方法を 提供する。 かくして、本発明は、 −標的核酸配列と、標的核酸配列に特異的な少なくとも１つのオリゴヌクレ オチドプライマーと、１以上のヌクレオチド酵素活性とが少なくとも得られ、 −特に単一の酵素活性または複数の酵素活性に関して適切な条件下で、標的 配列を増幅させる、 標的核酸配列の増幅方法であって、 少なくとも１つの予め官能化したヌクレオチドを含む予め官能化した増幅産 物を得るために、少なくとも１つのヌクレオチドが、少なくとも、保護されてお らず、かつ、そのヌクレオチドの塩基の所定の部位の少なくとも１つに配置され 【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】平成１０年１１月１９日（１９９８．１１．１９） 【補正内容】 請求の範囲 １．−標的核酸配列と、標的核酸配列に特異的な少なくとも１つのオリゴヌク レオチドプライマーと、１以上の酵素活性と、ヌクレオチドとが少なくとも得ら れ、 −特に単一の酵素活性または複数の酵素活性に関して適切な条件下で、標的 配列を増幅させる、 サンプル中に存在する標的核酸配列の増幅方法であって、 −得られるヌクレオチド中、少なくとも１つのヌクレオチドが、前記ヌクレ オチドのベースの少なくとも１つの予め定められた部位に配され、親電子性また は求核性有機化学官能基から選択された、少なくとも１つの保護されていない共 有結合性反応性官能基の少なくとも存在によって、他のヌクレオチドとは異なる 予め官能化したヌクレオチドであり、さらに、 −得られた予め官能化した増幅産物が、官能化された増幅産物を得るために 、官能標識基と、予め官能化されたヌクレオチドの反応性官能基に特異的である 、共有結合性抗反応性官能基を含有する薬剤と、直接的にまたは間接的に反応す ることを特徴とする方法。 ２．該薬剤の官能標識基が、蛍光化学分子であることを特徴とする、請求項１ に記載の方法。 ３．該薬剤の官能標識基が、フルオレセインおよびダンシルから選択されるこ とを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。 ４．親電子性有機化学官能基が、アルデヒド、活性化エステル、カルボン酸、 イソチオシアナート、ハロアシル誘導体、およびスルホニルクロリド官能基から 選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。 ５．求核性有機化学官能基が、アミノ、チオール、オキシアミノ、アルコキシ アミノ、ヒドラジン、およびヒドラジド官能基から選択されることを特徴とする 請求項１に記載の方法。 ６．反応性官能基が、メトキシアミノ官能基であることを特徴とする請求項５ に記載の方法。 ７．予め官能化したヌクレオチドの反応性官能基が、結合手によってベースに 結合することを特徴とする請求項１に記載の方法。 ８．薬剤の抗反応性官能基が、（i）予め官能化されたヌクレオチドの反応性 官能基が親電子性官能基である場合には、求核性有機化学官能基から、および、 （ii）予め官能化されたヌクレオチドの反応性官能基が求核性官能基である場合 には、親電子性有機化学官能基から選択されることを特徴とする、請求項１に記 載の方法。 ９．薬剤の抗反応性官能基が、アルデヒド官能基であることを特徴とする請求 項３または８に記載の方法。 １０．薬剤の抗反応性官能基が結合手によって官能基に結合することを特徴と する請求項８に記載の方法。 １１．結合手が、アミノ、アミド、およびオキシ官能基によって中断されてい てもされてなくてもよい、飽和または不飽和炭化水素鎖から選択されることを特 徴とする請求項７および／または１０に記載の方法。 １２．アルデヒド官能基が、結合手、−NH−CS−NH-(CH₂)₃−によって官能基 に結合し、薬剤の官能基がフルオレセインであることを特徴とする請求項９また は１０に記載の方法。 １３．標的核酸配列が、DNAまたはRNA配列であり、酵素活性がRNA−依存およ び／またはDNA−依存DNAポリマラーゼ活性であることを特徴とする請求項１に記 載の方法。 １４．酵素活性がさらに、リボヌクレアーゼＨ活性およびDNA-依存RNAポリマ ラーゼ活性を含有することを特徴とする請求項１３に記載の方法。 １５．リボヌクレアーゼHおよびDNAポリマラーゼ酵素活性が、単一の酵素によ って供給されることを特徴とする請求項１４に記載の方法。 １６．リボヌクレアーゼHおよびDNAポリマラーゼ酵素活性が、異なる酵素によ って各々供給されることを特徴とする請求項１４に記載の方法。 １７．予め官能化されたヌクレオチドのベースがシトシンから誘導され、少な くともピリミジン環の４位のアミノ官能基に、少なくとも１つの、-NH₂、−ONH₂ 、アルコキシアミノ、−SH、ヒドラジンおよびヒドラジド官能基から選択される 求核反応性官能基を含有することを特徴とする請求項１に記載の方法。 １８．反応性官能基が−CH₂−O−NH₂官能基であることを特徴とする請求項１ ７に記載の方法。 １９．反応性官能基が−CH₂−O−NH₂官能基であることを特徴とする請求項１ ７に記載の方法。 ２０．反応性官能基が、−（CH₂−）n₁、（O−CH₂−）n₁、（ここで、n₁は１ から１２までの間の整数）；［−（CH₂）₂−O−（CH₂）₂−］n₂、［−（CH₂）₂ −O−（CH₂）₂−O−（CH₂）₂−］n₂、［−CH₂−O−（CH₂）₂−］n₂、（ここで、 n₂は１から６までの間の整数）；およびNH−CH₂−O− （CH₂）₂−から選択された結合手によって、ピリミジン環の４位のアミノ官能基 に結合することを特徴とする請求項１７ないし１９のいずれか１項に記載の方法 。 ２１．結合手が、−CH₂−、−（CH₂）₂−、−（CH₂）₃−、−（CH₂）₄−、− （CH₂）₆−、−（CH₂）₂−O−（CH₂）₂−、−（CH₂）₂−O−（CH₂）₂−O−（CH₂ ）₂−、および−NH−CH₂−O−（CH₂）₂−から選択されることを特徴とする請求 項２０に記載の方法。 ２２．結合手が、−（CH₂）₂−O−（CH₂）₂−O−（CH₂）₂−であることを特徴 とする請求項１９または２１に記載の方法。 ２３．酵素処理に付すことができ、そのベースがシトシンから誘導され、少な くともピリミジンベースの環の４位のアミノ官能基に、結合手によって結合して もしなくてもよいアルコキシアミノ官能基からなる少なくとも１つの反応性官能 基を含有することを特徴とする予め官能化されたヌクレオチド。 ２４．酵素処理に付すことができ、そのヌクレオベースがシトシンから誘導さ れ、少なくともピリミジンベースの環の４位のアミノ官能基に、−（CH₂）₂−O −（CH₂）₂−O−（CH₂）₂−からなる結合手によって結合したアミノ官能基から なる少なくとも１つの反応性官能基を含有することを特徴とする予め官能化され たヌクレオチド。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ラーユン，アリ フランス国 69007 リヨン リュ デュ ローヌ １ (72)発明者 ローム，ジャン フランス国 38240 メイラン リュ デ ブランドン 13 (72)発明者 トレヴィシオル，エマニュエル フランス国 38000 グレノーブル ブー ルヴァール デュ マレシャル ジョフル 15

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．−標的核酸配列と、標的核酸配列に特異的な少なくとも１つのオリゴヌク レオチドプライマーと、１以上のヌクレオチド酵素活性とが少なくとも得られ、 −特に単一の酵素活性または複数の酵素活性に関して適切な条件下で、標的 配列を増幅させる、 標的核酸配列の増幅方法であって、 少なくとも１つのヌクレオチドが、少なくとも、保護されておらず、かつ、 そのヌクレオチドの塩基の所定の部位の少なくとも１つに配置されている、少な くとも１つの共有反応官能の存在により、他のヌクレオチドとは異なる予め官能 化したヌクレオチドであること、及び、少なくとも１つの予め官能化したヌクレ オチドを含む予め官能化した増幅産物が得られることを特徴とする方法。 ２．さらに、 −官能基と、予め官能化されたヌクレオチドの反応性官能基に特異的である、 共有結合性抗反応性官能基を含有する薬剤が得られ、 −官能化された増幅産物を得るために、予め官能化された増幅産物が直接的に または間接的に、該薬剤と反応することを特徴とする、請求項１に記載の方法。 ３．予め官能化されたヌクレオチドの共有結合性反応性官能基が、親電子性ま たは求核性有機化学官能基であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。 ４．薬剤の抗反応性官能基が、（i）予め官能化されたヌクレオチドの共有結 合性反応性官能基が親電子性官能基である場合には、求核性有機化学官能基から 、および、（ii）予め官能化されたヌクレオチドの共有結合性反応官能基が求核 性官能基である場合には、親電子性有機化学官能基から選択されることを特徴と する、請求項２または３に記載の方法。 ５．親電子性有機化学官能基が、アルデヒド、活性化エステル、カルボン酸、 イソチオシアナート、ハロアシル誘導体、およびスルホニルクロリド官能基から 選択されることを特徴とする請求項３または４に記載の方法。 ６．求核性有機化学官能基が、アミノ、チオール、オキシアミノ、アルコキシ アミノ、ヒドラジン、およびヒドラジド官能基から選択されることを特徴とする 請求項３または４に記載の方法。 ７．共有結合性反応性官能基が、メトキシアミノ官能基であることを特徴とす る請求項６に記載の方法。 ８．修飾ヌクレオチドの共有結合性反応性官能基が、結合手によってベースに 結合することを特徴とする請求項１ないし７のいずれか１項に記載の方法。 ９．薬剤の共有結合性抗反応性官能基が、結合手によって官能基に結合するこ とを特徴とする請求項２ないし８のいずれか１項に記載の方法。 １０．結合手が、アミノ、アミド、およびオキシ官能基によって中断されてい てもされてなくてもよい、飽和または不飽和炭化水素鎖から選択されることを特 徴とする請求項８および／または９に記載の方法。 １１．薬剤の共有結合性抗反応性官能基が、アルデヒド官能基であり、後者が 官能標識基、たとえば蛍光または発光基に結合することを特徴とする請求項７ま たは９に記載の方法。 １２．アルデヒド官能基が、結合手、−NH−CS−NH−（CH₂）₃−によって官能 基に結合し、薬剤の官能基がフルオレセインであることを特徴とする請求項９ま たは１１に記載の方法。 １３．標識された官能化増幅産物が定量的におよび／または定性的に、均一ま たは不均一相中で検出されることを特徴とする請求項１ないし１２のいずれか１ 項に記載の方法。 １４．標的核酸配列が、DNAまたはRNA配列であり、酵素活性がRNA−依存およ び／またはDNA−依存DNAポリマラーゼ活性であることを特徴とする請求項１ない し１３のいずれか１項に記載の方法。 １５．酵素活性がさらに、リボヌクレアーゼH活性およびDNA−依存RNAポリマ ラーゼ活性を含有し、増幅が逆転写、転写、および消化反応の連続を用いること によって行われることを特徴とする請求項１４に記載の方法。 １６．リボヌクレアーゼHおよびDNAポリマラーゼ酵素活性が、単一の酵素によ つて供給されることを特徴とする請求項１５に記載の方法。 １７．リボヌクレアーゼHおよびDNAポリマラーゼ酵素活性が、異なる酵素によ つて各々供給されることを特徴とする請求項１５に記載の方法。 １８．酵素処理に付すことができ、一般式（I） 式中、 Bはヌクレオベースを示し、 Zは結合手を示し、 nは０または１の整数であり、 Xは、ヌクレオベースＢにおいて少なくとも１つの部位に結合する共有結合性 反応性官能基を示し、 R¹は、HまたはOHを示し、 R²は、H、OH、モノホスファート、ジホスファート、またはトリホスファート 、または保護基を示し、 R³は、H、保護基、またはモノホスファート、ジホスファート、またはトリホ スファートを示す、 で表わされる、ヌクレオチド類似体。 １９．R¹およびR²は各々、独立に、HまたはOHを示し、R³は、モノホスファー ト、ジホスファート、またはトリホスファートを示すことを特徴とする、請求項 １８に記載のヌクレオチド類似体。 ２０．酵素処理に付すことができ、そのヌクレオベースがシトシンから誘導さ れ、少なくともピリミジン環の４位のアミノ官能基に、少なくとも１つの保護さ れておらず、前記ヌクレオチドの酵素処理に重大な影響を与えない、求核性共有 結合性反応官能基を含有する、予め官能化されたヌクレオチドであって、共有結 合性反応性官能基がNH₂、ONH₂、SH、ヒドラジンおよびヒドラジド官能基から選 択されることを特徴とする予め官能化されたヌクレオチド。 ２１．共有結合性反応性官能基が、（−CH₂−）n₁、（−O-CH₂−）n₁、（ここ で、n₁は１から１２までの間の整数）；（−CH₂−O-CH₂−）n₂、（ −CH₂−CH₂−O−CH₂−CH₂−）n₂、（−CH₂−CH₂−O-CH₂−CH₂−O−CH₂−CH₂−)n₂ 、および（−CH₂−O−CH₂−CH₂−）n₂、にこで、n₂は１から６までの間の整数 ）；およびNH−CH₂−Ｏ−CH₂−CH₂から選択された結合手によって、ピリミジン 環の４位の前記アミノ官能基に結合することを特徴とする請求項２０に記載のヌ クレオチド。 ２２．結合手が、−CH₂−、−CH₂−CH₂−、−CH₂−CH₂−CH₂−、−CH₂−CH₂− CH₂−CH₂−、−CH₂−CH₂−CH₂−CH₂−CH₂−CH₂−、−CH₂−CH₂−O−CH₂−CH₂−₂ 、−CH₂−CH₂−O−CH₂−CH₂−O−CH₂−CH₂−、およびNH−CH₂−O−CH₂−CH₂から 選択されることを特徴とする請求項２１に記載のヌクレオチド。 ２３．酵素処理に付すことができ、そのベースがウラシルから誘導され、少な くともピリミジン環の５位に、少なくとも１つの保護されておらず、前記酵素処 理に重大な影響を与えない、求核性共有結合性反応官能基を含有する、予め官能 化されたヌクレオチドであって、共有結合性反応官能基が−NH₂、−O−NH₂、SH 、ヒドラジンおよびヒドラジド官能基から選択されることを特徴とする予め官能 化されたヌクレオチド。 ２４．共有結合性反応性官能基が、−C≡C−CH₂−、−C≡C−CH₂−NH−CO−CH₂ −、−CH＝CH−CH₂−、および−CH＝CH−CH₂−NH−CO−CH₂−から選択された結 合手によって、ピリミジン環の５位に結合することを特徴とする請求項２３に記 載のヌクレオチド。 ２５．酵素処理に付すことができ、そのベースがアデニンから誘導され、少な くともピリミジン環の６位の少なくともアミノ官能基に、少なくとも１つの保護 されておらず、前記酵素処理に重大な影響を与えない、求核性共有結合性反応官 能基を含有する、予め官能化されたヌクレオチドであって、共有結合性反応性官 能基がNH₂、CH₂−O−NH₂、SH、ヒドラジンおよびヒドラジド官能基から選択され ることを特徴とする予め官能化されたヌクレオチド。 ２６．共有結合性反応性官能基が、（−CH₂−）n₁、（−O−CH₂−）n₁、（こ こで、n₁は１から１２までの間の整数）；（−CH₂−O−CH₂−）n₂、（−CH₂−CH₂ −O−CH₂−CH₂−）n₂、（−CH₂−CH₂−O−CH₂−CH₂−O −CH₂−CH₂−）n₂、および（−CH₂−O−CH₂−CH₂−）n₂、（ここで、n₂は１から ６までの間の整数）；およびNH−CH₂−O−CH₂−CH₂−CH₂から選択された結合手 によって、ピリミジン環の６位の前記アミノ官能基に結合することを特徴とする 請求項２５に記載のヌクレオチド。 ２７．結合手が、−CH₂−、−CH₂−CH₂−、−CH₂−CH₂−CH₂−、−CH₂−CH₂− CH₂−CH₂−、−CH₂−CH₂−CH₂−CH₂−CH₂−CH₂−、−CH₂−CH₂−O−CH₂−CH₂−₂ 、-CH₂−CH₂−O−CH₂−CH₂−O−CH₂−CH₂−、およびNH−CH₂−O−CH₂−CH₂から 選択されることを特徴とする請求項２６に記載のヌクレオチド。 ２８．酵素増幅処理における請求項１２ないし２７のいずれか１項に記載のヌ クレオチドの使用。