CN114174509A - 引物和使用了该引物的双链dna的制造装置以及双链dna的制造方法 - Google Patents

引物和使用了该引物的双链dna的制造装置以及双链dna的制造方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种引物，该引物用于核酸的扩增，具有下述式(1)所示的结构。(这里，A1表示－S－、－S－S－或－Se－，B表示碱基，R1表示分解性保护基。＊是指与相邻的核苷酸的糖的键。)。本发明还提供一种双链DNA的制造装置，具备：具有式(1)所示的结构的正向引物和反向引物；PCR装置，以模板DNA为模板进行多个循环的PCR，生成3’末端凹陷的双链DNA；使3’末端成为平滑末端的克列诺片段；以及光照射设备，将R1脱保护以形成3’末端突出的粘附末端。
Figure DDA0003493476020000011

Description

引物和使用了该引物的双链DNA的制造装置以及双链DNA的制 造方法
技术领域
本发明涉及一种引物和使用了该引物的双链DNA的制造装置以及双链DNA的制造方法。
背景技术
在分子生物学等领域，为了进行基因重组或转化等，使用将目标DNA整合到宿主中而得的载体。通常，在目标DNA的量少的情况下，通过聚合酶链反应(PCR)扩增后使用。在PCR中，使用包含目标DNA序列的模板DNA，使用与其互补性地结合的引物反复进行多个循环的热变性和退火，从而扩增模板DNA。
通过PCR扩增的模板DNA的扩增产物直接是平滑末端，为了使其与质粒DNA等宿主DNA结合(连接)而需要进行处理。通常，作为这样的处理，使用切割特定序列的限制酶，但在该方法中由于可结合的DNA依赖于限制酶的切割位点的序列，因此存在缺乏通用性的问题。
作为不使用限制酶的方法，有以下的技术：以扩增产物的3’末端和5’末端作为粘附末端(也称为粘合末端、突出末端等)，在宿主侧也同样地形成粘附末端，连接两者以构建载体。例如，近年来，已知有Gibson装配(Gibson assembly)法、In－Fusion法、SLiCE法等。在这些方法中，均在双链DNA片段末端具有15bp左右的相同序列，利用核酸外切酶活性消化双链中的一侧的链使产生粘附末端，之后进行连接。此外，在Gibson装配法中，在体外使用Taq DNA连接酶进行连接，而在In－Fusion法中利用大肠杆菌内的修复系统进行连接。
在这些方法中，由于使用作为酶的核酸外切酶，所以除了花费成本以外，有时还因反应条件等导致位点特异性变差，难以形成定量的粘附末端，所以存在连接反应的效率低的问题。因此，寻求不使用酶的无缝克隆法。
因此，开发了利用化学方法调制具有粘附末端的DNA的方法，作为用于此方法的PCR用引物，已知有专利文献1中记载的引物。该文献的引物中相当于非互补性DNA部分的碱基序列中的3’末端的碱基用保护基修饰。该保护基具有使利用DNA聚合酶进行的DNA复制停止进行的功能，通过光照射处理或碱处理等可从被修饰碱基脱离。另外，在该文献中，使用用于向生物体分子内引入保护基(取代基)的取代基引入剂，将碱基保护基引入到引物的碱基中。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2009/113709号(权利要求1、权利要求2等)。
发明内容
发明要解决的技术问题
在专利文献1中，虽然是利用保护基部分停止DNA复制的进行，但并不是在特定位点切割单链DNA而生成粘附末端，所以位点特异性低。另外，例如在DNA中碱基有腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶这4种，但在专利文献1中，为了向碱基中引入保护基，需要通过与碱基种类相应的方法引入保护基，在引物的制造上费事且花费成本。
本发明的目的在于提供一种引物，该引物可在特定位点特异性地切割单链，并且可廉价地制造。另外，本发明的另一目的还在于：使用这样的引物的具有粘附末端的双链DNA的制造装置和双链DNA的制造方法。
解决技术问题的方法
为了解决上述问题，本发明人反复进行了深入研究。其结果，开发了一种经由特定的接头向核苷的糖部分引入分解性保护基的引物。而且，还发现了：通过分解其保护基而在其核苷部分切割单链，从而可制作具有粘附末端的双链DNA，完成了本发明。
即，本发明为一种引物，其特征在于：其是用于核酸的扩增的引物，具有下述式(1)所示的结构。
Figure BDA0003493475000000021
(这里，A1表示－S－、－S－S－或－Se－，B表示碱基，R1表示分解性保护基。＊是指与相邻的核苷酸的糖的键。)
这种情况下，优选上述R1为下述式(2A)所示的光分解性保护基。
Figure BDA0003493475000000031
(这里，A2表示碳原子数为1～3的亚烷基，A3表示碳原子数为1～3的亚烷基。＊是指与A1的键。)
进一步优选上述R1为下述式(3A)所示的2－硝基苄氧基甲基。
Figure BDA0003493475000000032
或者，优选上述R1为下述式(2B)所示的氟化物分解性保护基。
Figure BDA0003493475000000033
(这里，A4表示碳原子数为1～3的亚烷基，R2～R4表示直链或支链的碳原子数为1～4的烷基，R2～R4彼此可以相同也可以不同。＊是指与A1的键。)
这种情况下，优选上述R1为下述式(3B)所示的三异丙基甲硅烷氧基甲基。
Figure BDA0003493475000000034
另外，本发明为双链DNA的制造装置，其是用于使用上述任一项所述的引物制造具有粘附末端的双链DNA的双链DNA的制造装置，其特征在于，具备：正向引物，与作为模板的模板DNA的反义链的一部分序列互补，并且具有上述式(1)所示的结构；反向引物，与上述模板DNA的有义链的一部分序列互补，并且具有上述式(1)所示的结构；扩增设备，以上述模板DNA为模板进行多个循环的聚合酶链反应(PCR)，生成上述正向引物延伸的正向侧延伸链和上述反向引物延伸的反向侧延伸链，将上述正向侧延伸链和上述反向侧延伸链退火以生成3’末端凹陷的双链DNA；平滑化设备，利用克列诺片段将上述双链DNA的上述3’末端形成平滑末端；以及脱保护切割设备，将上述R1脱保护，在上述式(1)的结构部分切割DNA，形成3’末端突出的粘附末端。
而且，本发明还为双链DNA的制造方法，其是用于使用上述任一项所述的引物制造具有粘附末端的双链DNA的双链DNA的制造方法，其特征在于，具有以下工序：准备工序，准备正向引物和反向引物，该正向引物与作为模板的模板DNA的反义链的一部分序列互补、且具有上述式(1)所示的结构，该反向引物与上述模板DNA的有义链的一部分序列互补、且具有上述式(1)所示的结构；扩增工序，以上述模板DNA为模板进行多个循环的聚合酶链反应(PCR)，生成上述正向引物延伸的正向侧延伸链和上述反向引物延伸的反向侧延伸链，将上述正向侧延伸链和上述反向侧延伸链退火，生成3’末端凹陷的双链DNA；平滑化工序，利用克列诺片段将上述双链DNA的上述3’末端形成平滑末端；以及脱保护切割工序，将上述R1脱保护，在上述式(1)的结构部分切割DNA，形成3’末端突出的粘附末端。
这种情况下，上述R1为上述式(2A)所示的光分解性保护基，脱保护切割工序优选通过光照射将上述R1脱保护。
或者，上述R1为上述式(2B)所示的氟化物分解性保护基，脱保护切割工序优选利用氟化物将上述R1脱保护。
发明效果
根据本发明，可提供一种引物，该引物可在特定位点特异性地切割单链，并且可廉价地制造。另外，根据本发明，还可提供一种使用这样的引物的具有粘附末端的双链DNA的制造装置和双链DNA的制造方法。
附图说明
图1是显示具有粘附末端的双链DNA的制造方法和制造装置的示意图。
图2是显示包含光切割类似物的寡核苷酸的切割反应的实验的图。
图3是显示利用了通过光切割反应形成粘附末端的克隆反应的实验的图。
图4是示出包含光切割类似物的寡核苷酸切割反应的实验结果的图。
图5是示出包含氟切割类似物的寡核苷酸的切割反应的实验结果的图。
具体实施方式
1.引物
以下，对本发明的引物进行说明。本发明的引物是用于核酸的扩增的引物，具有下述式(1)所示的结构。
Figure BDA0003493475000000051
(这里，A1表示－S－、－S－S－或－Se－，B表示碱基，R1表示分解性保护基。＊是指与相邻的核苷酸的糖的键。)。此外，键＊中，式(1)的3’侧的键是在3’侧与相邻的核苷酸的糖的5’碳结合，5’侧的键是在5’侧与相邻的核苷酸的糖的3’碳结合。
B为碱基，具体而言，在DNA引物情况下，B选自腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶，在RNA引物的情况下，B选自腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶。
R1的分解性保护基是指通过任一种处理而分解的保护基(取代基)。这里所说的处理可列举：光照射处理、还原处理、碱处理、酸处理、氧化处理、脱甲硅烷基化处理、热处理、酯酶处理、磷酸酶处理等。
(1)光分解性保护基
在处理为光照射的情况下，优选R1为下述式(2A)所示的光分解性保护基。
Figure BDA0003493475000000052
(这里，A2表示碳原子数为1～3的亚烷基，A3表示碳原子数为1～3的亚烷基。＊是指与A1的键。)
作为碳原子数为1～3的亚烷基，可列举：亚甲基、亚乙基、亚丙基。
特别是，R1为下述式(3A)所示的2－硝基苄氧基甲基适合。
Figure BDA0003493475000000053
(2)氟化物分解性保护基(甲硅烷基类保护基)
在处理为还原处理的情况下，优选R1为下述式(2B)所示的氟化物分解性保护基(甲硅烷基类保护基)。
Figure BDA0003493475000000061
(这里，A4表示碳原子数为1～3的亚烷基，R2～R4表示直链或支链的碳原子数为1～4的烷基，R2～R4彼此可以相同也可以不同。＊是指与A1的键。)
作为直链或支链的碳原子数为1～4的烷基，可列举：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基。
特别是，R1优选下述式(3B)所示的三异丙基甲硅烷氧基甲基。
Figure BDA0003493475000000062
(3)其他的分解性保护基
作为可通过碱处理从被修饰碱基脱离的分解性保护基，可列举：异丁酰基、苯甲酰基、乙酰氧基甲基等。作为可通过酸处理从被修饰碱基脱离的分解性保护基，可列举：三苯甲基。作为可通过氧化处理从被修饰碱基脱离的分解性保护基，可列举：烯丙氧基甲基、二甲氧基苄氧基甲基、三甲氧基苄氧基甲基等。作为可通过脱甲硅烷基化处理从被修饰碱基脱离的分解性保护基，可列举：叔丁基二甲氧基甲硅烷氧基甲基、叔丁基二苯基甲硅烷氧基甲基等。作为可通过热处理从被修饰碱基脱离的分解性保护基，可列举：异氰酸酯基。作为可通过酯酶处理从被修饰碱基脱离的分解性保护基，可列举：乙酰氧基甲基。作为可通过磷酸酶处理从被修饰碱基脱离的分解性保护基，可列举：磷酸甲酯基。
本发明的引物是特别适合在PCR中使用的单链DNA或单链RNA，是分子内具有上述式(1)所示的结构的寡核苷酸或多核苷酸。引物的碱基对的数目可根据目标DNA等的序列等适当设定，通常在寡核苷酸中例如是20个碱基对以下、在多核苷酸中例如超过20个碱基对。对多核苷酸的碱基对的数目的上限没有特别限定，作为通常使用的引物，例如优选40个碱基对以下。另外，对寡核苷酸的碱基对的数目的下限也没有特别限定，只要是可用作引物的长度即可，作为通常使用的引物，例如优选5个碱基对以上。
2.引物的制造方法
本发明的引物可通过合成具有下述式(4)的结构的修饰核苷(以下，有时称为“核苷衍生物”)，并通过亚磷酰胺法等固相合成法在其上连接未修饰的核苷酸来制造。
Figure BDA0003493475000000071
(这里，A1、R1如上述式(1)中所定义，B是指碱基或修饰碱基。)
作为引物的合成方法的概要，首先，保护核苷的3’羟基和5’羟基，用接头元素A1取代2’羟基，使分解性保护基R1与该A1结合，之后将3’羟基和5’羟基脱保护。之后，使亚磷酰胺等反应，通过固相合成法连接未修饰的核苷酸以合成引物。以下，对实施例中登载的几个引物的具体的制造方法进行详细说明。
(a)具有光分解性保护基的核苷衍生物1(※A1为－S－基、R1为2－硝基苄氧基甲基的化合物)和引物的合成
Figure BDA0003493475000000072
按照上述的合成图解进行说明。在以下说明的合成图解中，数字表示化合物的编号。首先，准备核苷(在下述图解中为腺苷)作为起始物质(化合物1)。接下来，使1,3－二氯－1,1,3,3－四异丙基二硅氧烷与核苷在吡啶等溶剂中反应。由此，在核糖的3’羟基与5’羟基之间形成硅氧烷键的环状结构，保护3’位和5’位的羟基(化合物2)。
接下来，添加N－苯基三氟甲烷磺酰亚胺，使N,N－二甲基－4－氨基吡啶(DMAP)等亲核试剂在二氯甲烷(DCM)等溶剂中反应，使核糖的2’位成为三氟磺酸基(化合物3)。接下来，在N,N－二甲基甲酰胺(DMF)等的存在下使硫代乙酸钾等具有硫醇基的化合物反应，在核糖的2’位形成硫酯(化合物4)。再于氨/甲醇溶液中反应，从而将硫酯基转换成硫醇基(化合物5)。
然后，添加2－硝基苄基氯甲基酯、N,N－二异丙基乙胺(DIPEA)、四氢呋喃(THF)，使作为分解性保护基的2－硝基苄氧基甲基与硫醇结合(化合物6)。进一步添加苯甲酰氯(BzCl)、吡啶，使苯甲酰基与碱的氨基结合(化合物7)。在此状态下，添加氟化四正丁基铵(TBAF)和四氢呋喃(THF)，使核糖的3’位和5’位的保护基脱离以形成羟基(化合物8)。如此操作，可合成核苷衍生物(化合物8)。
接下来，为了通过亚磷酰胺法在核苷衍生物上连接其他的核苷酸以制造引物，对核苷衍生物进行修饰。首先，在核苷衍生物中加入4,4’－二甲氧基三苯甲基氯(DMTrCl)、吡啶，使4,4’－二甲氧基三苯甲基氯基与核糖的5’羟基结合(化合物9)。接下来，在THF、DIPEA中添加2－氰基乙基N,N－二异丙基氯亚磷酰胺，使亚磷酰胺与核糖的3’羟基结合(化合物10)。之后，利用常规方法，以成为所期望的序列的方式对核苷酸进行固相合成以合成引物。
(b)具有氟分解性保护基的核苷衍生物3(※A1为－S－基、R1为三异丙基甲硅烷氧基甲基的化合物)和引物的合成
Figure BDA0003493475000000091
截至化合物4为止的合成图解与上述的核苷衍生物1的合成的情形相同。接下来，添加3HF－Et3N(无水氟化氢(HF)、三乙胺(Et3N)的摩尔比为3：1)等氟化合物和THF，使核糖的3’位和5’位的保护基脱离以成为羟基(化合物11)。然后，加入DMTrCl、吡啶，使4,4’－二甲氧基三苯甲基氯基与核糖的5’羟基结合(化合物12)。接下来，在氨甲醇(NH3－MeOH)、DMF等的存在下，使氯甲氧基三异丙基硅烷(TOMCl)等硅烷化合物反应，使三异丙基甲硅烷氧基甲基与核糖的2’位结合(化合物13)。
接下来，为了通过亚磷酰胺法在核苷衍生物上连接其他的核苷酸以制造引物，对核苷衍生物进行修饰。首先，添加氯三甲基硅烷(TMSCl)、BzCl、吡啶，使苯甲酰基与碱的氨基结合、并使三甲基硅烷与核糖的3’羟基结合(化合物14)。接下来，使HF、吡啶反应，将核糖的3’位形成羟基(化合物15)。随后，与核苷衍生物1的合成的情形同样，使亚磷酰胺与核糖的3’羟基结合(化合物16)。
(c)具有光分解性保护基的核苷衍生物3(※A1为－Se－基、R1为2－硝基苄氧基甲基的化合物)和引物的合成
Figure BDA0003493475000000101
截至化合物3为止的合成图解与上述的核苷衍生物1的合成的情形相同。接下来，使二对甲苯酰硒醚、哌啶、DIPEA在DMF等溶剂中反应(化合物17)。再使哌啶、空气(Air)、NaBH4、2－硝基苄基氯甲基酯在DMF等溶剂中反应，使具有光分解性保护基的硒基化合物与核糖的2’位结合(化合物18)。
之后，与核苷衍生物1的合成图解同样地进行处理，依次合成化合物19～20。再利用亚磷酰胺法在核苷衍生物上连接其他的核苷酸以制造引物。这也是与核苷衍生物1的合成图解同样地进行处理，依次合成化合物21和化合物22。
3.具有粘附末端的双链DNA的制造方法和制造装置
接着，对具有粘附末端的双链DNA的制造方法和制造装置进行说明。本发明的双链DNA的制造装置是用于使用本发明的引物制造具有粘附末端的双链DNA的装置。另外，本发明的双链DNA的制造方法是使用包含目标DNA序列的模板DNA，使用本发明的引物制造具有粘附末端的双链DNA的方法。以下，参照图1进行说明。
首先，准备包含正向引物和反向引物的PCR扩增用引物对作为试剂(准备工序)。正向引物与模板DNA的反义链的一部分序列互补，并且具有式(1)所示的结构。另外，反向引物与模板DNA的有义链的一部分序列互补，并且具有式(1)所示的结构。
如图1的(a)所示，正向引物和反向引物以夹持要扩增的目标DNA序列的方式确定序列。另外，引物中的式(1)的具有分解性保护基的核苷酸的位置设计成在作为目标的粘附末端的序列(图的(d))中与5’凹陷侧的最5’末端侧的核苷酸的5’侧相邻的位置。即，与式(1)的结构的核苷酸相邻的3’侧的核苷酸成为粘附末端的5’末端的核苷酸。其他试剂为用于PCR的聚合酶(Taq聚合酶等)、缓冲剂、dNTP等。
接下来，使用PCR装置(扩增设备)扩增模板DNA的序列(扩增工序)。PCR装置以模板DNA为模板进行多个循环的聚合酶链反应(PCR)，生成正向引物延伸的正向侧延伸链和反向引物延伸的反向侧延伸链，将正向侧延伸链和反向侧延伸链退火，生成3’末端凹陷的双链DNA(图的(b))。
在PCR中，反复进行热变性、退火、延伸反应，以扩增模板DNA的序列。虽然还取决于PCR的条件，但热变性在约95℃下进行1～3分钟，退火是在引物的Tm±5℃下进行，延伸反应进行1～10分钟。对PCR的循环数没有特别限定，通常为24～40个循环左右。
如图所示，在PCR扩增产物中包含3’末端凹陷的双链DNA。这是由于：在以引物为模板合成互补链时，式(1)的分解性保护基阻碍聚合酶反应，使反应停止。
接下来，如图的(c)所示，利用克列诺片段(Klenow Fragment：平滑化设备)，通过补平反应使该凹陷的3’末端成为平滑末端(平滑化工序)。作为该反应的试剂，除KlenowFragment(酶)以外，还可列举：dNPT、缓冲剂等。补平反应的条件可适当设定，例如设为37℃、10～30分钟，之后是70℃、10分钟以使酶失活。
之后，如图的(d)所示，通过规定的处理将R1脱保护，在式(1)的结构部分切割单链DNA，形成3’末端突出的粘附末端(脱保护切割工序)。规定的处理是用于将R1脱保护的处理，可列举：上述的光照射处理、还原处理等。
以下，对切割机制进行说明。若如下式所示施行规定的处理，则式(1)的分解性保护基R1脱离，氢与接头A1结合。接头A1与核糖的2’碳和3’碳形成由三元环构成的杂环(例如，在A1为硫的情况下形成硫杂环丙烷环)，由此3’碳的磷酸键被切断。
Figure BDA0003493475000000121
作为光照射处理，例如可列举：使用光源装置(脱保护切割设备)照射300～400nm的波长的光1～30分钟的方法。另外，作为还原处理，例如可列举：使用氟化四正丁基铵(TBAF)等氟化物离子，例如进行70～80℃、1～30分钟的处理的方法。由此，引物的包含式(1)的核苷的5’末端侧的单链DNA被切断，可合成具有3’突出末端(5’凹陷末端)的双链DNA。关于其他的处理，也同样使用将分解性保护基脱保护的装置(脱保护切割装置)进行脱保护和单链DNA的切割。
在本发明中，无论限制酶等如何，均可自由自在地设计粘附末端，因此可自由地连接具有所期望的序列的DNA。例如，可设计目标DNA和载体两者的序列，通过脱保护切割处理在两者中形成通用的粘附末端以进行连接，调制重组DNA，将其用于克隆或制作文库、构建大量表达系统等。另外，通过连接具有粘附末端的多个基因组序列，可在试管内进行基因组叠合反应。或者，还可在平滑末端的状态下向细胞内引入双链DNA，在细胞内进行脱保护切割处理，从而在细胞内进行基因组叠合反应。
实施例
以下，根据实施例，具体地说明本发明，但这些实施例并不限定本发明的目的。另外，在以下的实施例中，只要没有特别规定，则“％”的表述为质量基准(质量百分比)。
1.光切割类似物(S)
1－1.光切割类似物(A＊)的合成
以下，示出光切割类似物的合成图解。以下，按照该合成图解，对光切割类似物的合成顺序进行说明。
Figure BDA0003493475000000131
(1)3’,5’－O－(1,1,3,3－四异丙基－1,3－二硅氧烷二基)腺苷(化合物2)
将3.9mL(12.3mmol)1,3－二氯－1,1,3,3－四异丙基二硅氧烷加入到3.00g(11.2mmol)腺苷(化合物1)的112mL吡啶溶液中，在0℃下搅拌反应混合物1小时。之后，将反应混合物加热至室温，搅拌5.5小时。使溶剂在真空中蒸发，用H2O和CH2Cl2提取残余物。有机相用1M的HCl溶液、饱和NaHCO3溶液、食盐水洗涤，干燥(Na2SO4)，在真空中浓缩。所得残余物通过硅胶层析(CH2Cl2/MeOH、100/0～95/5v/v)纯化，得到了5.43g(10.65mmol)化合物2(95％)。
1H－NMR(400MHz、DMSO－d6)：δ0.95－1.07(m,8H),3.92(dd,J＝12.8,2.8Hz,1H),3.97－4.01(m,1H),4.05(dd,J＝12.8,3.2Hz,1H),4.51(d,J＝5.6Hz,1H),4.79(dd,J＝8.8,5.2Hz,1H),5.60(brs,1H),5.86(d,J＝1.2Hz,1H),7.30(brs,2H),8.06(s,1H),8.20(s,1H)；LRMS(ESI+)calc.m/z 510.26(M+H+),532.24(M+Na+),found m/z 510(M+H+),532(M+Na+)。
(2)3’,5’－O－(1,1,3,3－四异丙基－1,3－二硅氧烷二基)－2’－O－三氟甲磺酰基－腺苷(化合物3)
在0℃下将4.57g(12.8mmol)N－苯基三氟甲烷磺酰亚胺加入到5.43g(10.7mmol)化合物2的溶液和3.90g(32.0mmol)DMAP的106mL CH2Cl2中。将反应混合物在0℃下搅拌1小时、在室温下搅拌2小时。用冷却的0.1M的AcOH溶液和CH2Cl2提取混合物。有机相用饱和NaHCO3溶液和食盐水洗涤，干燥(Na2SO4)，在真空中浓缩。所得残余物通过硅胶层析(己烷/EtOAc、1/1v/v)纯化，得到了4.76g(7.42mmol)化合物3(69％)。
1H－NMR(400MHz,DMSO－d6)：δ0.98－1.11(m,28H),3.94－4.08(m,3H),5.37(dd,J＝9.6,5.6Hz,1H),6.08(d,J＝4.8Hz,1H),6.45(s,1H),7.42(br s,2H),8.03(s,1H),8.26(s,1H)；LRMS(ESI+)calc.m/z642.21(M+H+),664.19(M+Na+),found m/z 642(M+H+),664(M+Na+)。
(3)9－[3,5－O－(1,1,3,3－四异丙基－1,3－二硅氧烷二基)－2－脱氧－2－乙酰硫－β－D－阿拉伯呋喃糖基]腺嘌呤(化合物4)
将1.06g(1.65mmol)化合物3和302mg(2.64mmol)CH3COOSK溶解于4.1mL DMF，在室温下搅拌20小时。用饱和NaHCO3溶液和己烷/EtOAc(1/3v/v)提取反应混合物。有机相用食盐水洗涤，干燥(Na2SO4)，在真空中浓缩。所得残余物通过硅胶层析(己烷/EtOAc、2/1～1/2v/v)纯化，得到了0.57g(1.00mmol)化合物4(61％)。
1H－NMR(400MHz,DMSO－d6)：δ1.01－1.18(m,28H),2.19(s,3H),3.89－3.98(m,2H),4.17(dd,J＝11.6,6.4Hz,1H),4.62(dd,J＝10,8.0Hz,1H),5.26(t,J＝8.0Hz,1H),6.39(d,J＝8.0Hz,1H),7.34(br s,2H),8.02(s,1H),8.10(s,1H)；HRMS(ESI+)calc.m/z568.24(M+H+),590.23(M+Na+),found m/z 568.2467(M+H+),590.2286(M+Na+)。
(4)9－[3,5－O－(1,1,3,3－四异丙基－1,3－二硅氧烷二基)－2－脱氧－2－硫代－β－D－阿拉伯呋喃糖基]腺嘌呤(化合物5)
在2.11g(3.72mmol)化合物4的25mL MeOH溶液中加入催化剂量的甲醇钠的28％MeOH溶液。在室温下搅拌混合物4小时，用H2O和EtOAc提取。有机相用H2O和食盐水洗涤，干燥(Na2SO4)，在真空中浓缩，得到了1.96g(3.72mmol)化合物5(当量)。
1H－NMR(400MHz,CDCl3)：δ1.04－1.14(m,21H),1.18(s,7H),3.81－3.92(m,2H),4.06(dd,J＝13.2,3.2Hz,1H),4.22(dd,J＝13.2,3.6Hz,1H),4.60－4.65(m,1H),5.64(s,1H),6.38(d,J＝7.2Hz,1H),8.10(s,1H),8.34(s,1H)。
(5)9－[3,5－O－(1,1,3,3－四异丙基－1,3－二硅氧烷二基)－2－脱氧－2－(2－硝基苄氧基甲基)硫代－β－D－阿拉伯呋喃糖基]腺嘌呤(化合物6)
在0℃下将1mL(1.30mmol)2－硝基苄氧基甲基氯的1.3M溶液加入到0.53g(1.00mmol)化合物5和524μL(1.30mmol)DIPEA的4.0mL CH2Cl2溶液中，搅拌1小时。用H2O和CH2Cl2提取混合物。有机相用饱和NaHCO3溶液和食盐水洗涤，干燥(Na2SO4)，在真空中浓缩。残余物通过硅胶层析(CH2Cl2/MeOH、50/1～20/1v/v)纯化，得到了0.57g(0.82mmol)化合物6(82％)。
1H－NMR(400MHz、CDCl3))：δ1.00－1.11(m 21H),1.17(s,7H),3.88－3.98(m,2H),4.04(dd,J＝12.8,2.8Hz,1H),4.19(dd,J＝13.2,4.4Hz,1H),4.67－4.84(m,5H),7.44－7.48(m,1H),7.62－7.72(m,2H),7.94(s,1H),8.07(dd,J＝8.0,1.2Hz,1H),8.23(s,1H)。
(6)N6－苯甲酰基－9－[3,5－O－(1,1,3,3－四异丙基－1,3－二硅氧烷二基)－2－脱氧－2－(2－硝基苄氧基甲基)硫代－β－D－阿拉伯呋喃糖基]腺嘌呤(化合物7)
在0.56g(0.81mmol)化合物6的5mL吡啶溶液中加入282μL(2.43mmol)苯甲酰氯，在室温下搅拌混合物3小时。将混合物冷却至0℃，加入2mL H2O，搅拌混合物0.5小时。加入2mL浓NH3(水溶液)，搅拌混合物0.5小时。用H2O和EtOAc提取反应混合物。有机相用饱和NaHCO3溶液和食盐水洗涤，干燥(Na2SO4)，在真空中浓缩。所得残余物通过硅胶层析(己烷/EtOAc、1/1v/v)纯化，得到了0.46g(0.58mmol)化合物7(72％)。
1H－NMR(400MHz,CDCl3)：δ1.01－1.10(m,21H),1.18(s,8H),3.93－4.09(m,2H),4.21(dd,J＝12.8,3.6Hz,1H),4.69－4.83(m,5H),7.46－7.56(m,3H),7.60－7.69(m,3H),7.96(dd,J＝8.0,1.2Hz,1H),8.05－8.11(m,2H),8.73(s,1H),8.79(dd,J＝5.2,1.6Hz,1H)。
(7)N6－苯甲酰基－9－[2－脱氧－2－(2－硝基苄氧基甲基)硫代－β－D－阿拉伯呋喃糖基]腺嘌呤(化合物8)
在0.47g(0.59mmol)化合物7的5mL THF溶液中加入1.2mL 1M的TBAF的THF溶液，在室温下搅拌1.5小时。将反应混合物在真空中浓缩，所得残余物通过硅胶层析(CH2Cl2/EtOAc、50/1～20/1v/v)纯化，得到了0.33g(0.59mmol)化合物8(定量)。
1H－NMR(400MHz,CDCl3)：δ3.16(d,J＝5.6Hz,1H),3.64－3.70(m,1H),3.73－3.78(m,1H),3.80－3.84(m,1H),3.97(dd,J＝7.2,2.8Hz,1H),4.38－4.45(m,1H),4.61－4.84(m,4H),5.12(t,J＝5.6Hz,1H),5.85(d,J＝6.0Hz,1H),6.62(d,J＝7.6Hz,1H),7.53－7.59(m,3H),7.62－7.67(m,2H),7.73－7.77(m,1H),8.02－8.06(m,3H),8.61(d,J＝4.8Hz,2H),11.11(s,1H)。
(8)N6－苯甲酰基－9－[5－O－(4,4’－二甲氧基三苯甲基)－2－脱氧－2－(2－硝基苄氧基甲基)硫代－β－D－阿拉伯呋喃糖基]腺嘌呤(化合物9)
在0.33g(0.59mmol)化合物8的4.0mL吡啶溶液中加入0.24g(0.71mmol)4,4－二甲氧基三苯甲基氯。在室温下搅拌反应混合物7.5小时。用H2O和EtOAc提取混合物。有机相用饱和NaHCO3溶液和食盐水洗涤，干燥(Na2SO4)，在真空中浓缩。所得残余物通过硅胶层析(CH2Cl2/MeOH、60/1～20/1v/v)纯化，得到了0.38g(0.44mmol)化合物9(72％)。
1H－NMR(400MHz,CDCl3)：δ1.04(d,J＝6.0Hz,5H),2.17(s,1H),3.18(d,J＝3.2Hz,1H),3.56(d,J＝4.4Hz,2H),3.78(d,J＝1.2Hz,6H),3.85(dd,J＝7.6,1.6Hz,1H),4.07－4.11(m,1H),4.62－4.71(m,3H),4.84(d,J＝12.Hz,1H),4.94(d,J＝14.4Hz,1H),6.65(d,J＝7.6Hz,1H),6.80－6.83(m,4H),7.20－7.33(m,4H),7.42－7.64(m,7H),8.03－8.06(m,3H),8.20(s,1H),8.72(s,1H),9.07(s,1H)。
(9)N6－苯甲酰基－9－{3－O－[2－氰基乙氧基(二异丙基氨基)膦烷基]－5－O－(4,4’－二甲氧基三苯甲基)－2－脱氧－2－(2－硝基苄氧基甲基)硫代－β－D－阿拉伯呋喃糖基}腺嘌呤(化合物10)
将241μL(1.08mmol)2－氰基乙基N,N－二异丙基氯亚磷酰胺添加在0.42g(0.49mmol)化合物9和417μL(2.45mmol)DIPEA的2.5mL THF溶液中，在室温下搅拌1小时。用饱和NaHCO3溶液和EtOAc提取反应混合物。有机相用食盐水洗涤，干燥(Na2SO4)，在真空中浓缩。所得残余物通过硅胶层析(己烷/EtOAc、1/2v/v)纯化，得到了0.46g(0.49mmol)化合物10(90％)。31P－NMR(159MHz,CDCl3)：δ150.4,150.7。
1－2.包含光切割类似物(A＊)的寡核苷酸的切割反应
图2是示出显示包含光切割类似物的寡核苷酸的切割反应依赖于光照射和加热的实验的图。该图的(a)是示出所用的20个碱基长的寡核苷酸序列和结构及预测的反应机制的化学式，(F)示出利用荧光素基进行的修饰。该图的(b)是切割反应的改性多核苷酸凝胶电泳分析的结果，(c)是显示由(b)所示的电泳结果算出的、切割反应产物的定量结果的曲线图。
将寡核苷酸(5’荧光素－d(ACGACTCA＊CTATAGGGCGAA)、1μM)混合在包含10mMTris－HCl(pH8.5)、50mM MgCl2、10mM二硫苏糖醇(DTT)的缓冲液中。
在96孔多孔板的孔中加入40μL该溶液，使用MAX－305光源装置(朝日分光)以4mW/cm2的光量照射365nm的光0分钟、1分钟、5分钟或10分钟。然后，将每10μL的该溶液分别注入管中，在72℃下加热0分钟、5分钟或10分钟。在冰上冷却后，添加10μL 2×甲酰胺加样溶液(80(v/v)％甲酰胺、50mM EDTA(pH8.0))，通过包含7.5M尿素的20％改性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)进行分析。凝胶中的寡核苷酸在5’末端标记。根据荧光素基的荧光，利用ChemiDocXRS+成像系统(Bio－Rad)进行检测。
以4mW/cm2的光量对1μM寡核苷酸、10mM Tris－HCl(pH8.5)、50mM MgCl2、40μL10mM的DTT照射365nm的光5分钟，在72℃下加热5分钟。用填充有ZipTipμ－C18树脂的移液管顶端进行脱盐、浓缩，以所得产物作为样品，使用ultraflexIII(Bruker Daltonics)进行MALDI－TOF分子量分析。作为基质，使用3－羟基吡啶甲酸。图的(a)所示的原料寡核苷酸(i)和其脱保护后体(ii、iii)及切割产物(iv、v)的通过MALDI－TOF MS法得到的检测结果见下表。
[表1]
Figure BDA0003493475000000171
如图的(b)、(c)所示，可知在光照射5分钟的条件下切割产物增加，在光照射10分钟的条件下切割产物进一步增加。另外，由图(b)可知：特别是在光照射10分钟、加热时间5分钟以上的条件下，原料的谱带变淡，切割产物的谱带变深，由此可知：该条件对切割反应是理想的。
1－3.利用了通过光切割反应形成粘附末端的克隆反应
以下，参照图3，对克隆和转化进行说明。图示出使用光切割类似物的GFP表达载体制作方法。作为概要，首先，以pET21d、pAcGFP1为模板进行PCR反应，得到各载体片段、插入片段。然后，通过光照射和加热生成粘附片段后，利用两者的混合物转化大肠杆菌，以质粒DNA的形式得到连接产物。以下，进行详细说明。
载体侧片段如下操作进行调制。使用Applied Biosystems 2720热循环仪，在(95℃、30秒→50℃、30秒→72℃、3分钟)/循环、30个循环的条件下调制反应液[0.5μM引物链(pET21d＿Fw和pET21d＿Rev、表2)、0.8ng/μL pET21d(Novagen)、KOD－Plus－Neo用1×PCR缓冲液、1.5mM MgSO4、0.2mM dNTPs、0.02U/μL KOD－Plus－Neo(东洋纺)]。在PCR反应后的200μL反应液中添加2μL 16U/μL的限制酶DpnI(东洋纺)，在37℃下加热1小时。在其中加入TE饱和苯酚(Nacalai Tesque)与氯仿的200μL等量混合液，剧烈混合后离心(14,000×g、3分钟)，分离水层。同样，用200μL氯仿提取反应液后，加入20μL 3M的NaOAc(pH5.2)和220μL异丙醇。在－30℃下冷却1小时后离心(20,000×g、20分钟)，从而回收DNA。通过琼脂糖凝胶电泳(包含GelRed(和光纯药工业)的0.8％Agarose S(和光纯药工业))纯化目标PCR产物。使用Wizard SV凝胶和PCR提纯系统(Promega)，由切取的凝胶片提取DNA(收量为1.27μgDNA)。
插入侧片段如下操作进行调制。使用Applied Biosystems 2720热循环仪，在(95℃、30秒→55℃、30秒→72℃、1分钟)/循环、30个循环的条件下调制反应液[0.5μM引物链(pAcGFP1＿Fw和pAcGFP1＿Rev、表2)、0.8ng/μL pAcGFP1(Takara Bio)、KOD－Plus－Neo用1×PCR缓冲液、1.5mM MgSO4、0.2mM dNTPs、0.02U/μL KOD－Plus－Neo)]。在PCR反应后的100μL反应液中添加1μL 16U/μL的限制酶DpnI(东洋纺)，在37℃下加热1小时。在其中加入TE饱和苯酚(Nacalai Tesque)与氯仿的100μL等量混合液，剧烈混合后离心(14,000×g、3分钟)，分离水层。同样，用200μL氯仿提取反应液后，加入10μL 3M的NaOAc(pH5.2)和110μL异丙醇。在－30℃下冷却1小时后离心(20,000×g、20分钟)，从而回收DNA。将目标PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳(包含GelRed(和光纯药工业)的1.5％Agarose S(和光纯药工业))纯化。使用Wizard SV凝胶和PCR提纯系统(Promega)，由切取的凝胶片提取DNA(收量为5.33μgDNA)。切割后PCR引物序列见下表。序列中的A＊表示光切割类似物(图2)。
[表2]
Figure BDA0003493475000000181
在96孔多孔板的孔中分别加入50μL载体片段溶液(6ng/μL DNA、10mM Tris－HCl(pH7.5)、5mM MgCl2、10mM DTT)和插入片段溶液(8.4ng/μL DNA、10mM Tris－HCl(pH7.5)、5mM MgCl2、10mM DTT)，使用手持UV灯(Funakoshi)以约4mW/cm2照射365nm光5分钟。然后，将2份该溶液回收到1只1.5mL的管中，在72℃下加热10分钟。加入10μL 3M的NaOAc(pH5.2)和110μL异丙醇，在－30℃下冷却1小时后离心(20,000×g、20分钟)，回收DNA。将DNA溶解于5μL的水中，将其中的4.7μL添加到50μL大肠杆菌感受态细胞溶液(NEB 5－α感受态大肠杆菌(高效率)、New England Biolabs)中。将其涂布于含有50μg/mL氨苄西林钠的LB琼脂培养基，在37℃下培养一夜。由进行了光照射和加热的样品得到9个克隆的连接产物。相对于此，由未进行光照射和加热的对照样品得到了2个克隆的连接产物。
2.氟切割类似物
2－1.氟切割类似物(A＊＊)的合成
以下，示出氟切割类似物的合成图解。以下，按照该合成图解来说明氟切割类似物的合成顺序。
Figure BDA0003493475000000191
(1)9－[2－脱氧－2－硫代－β－D－阿拉伯呋喃糖基]腺嘌呤(化合物11)
在572mg(1.00mmol)化合物4的10mL THF溶液中加入409μl(2.51mmol)3HF－Et3N，在室温下搅拌反应混合物2小时。在真空中浓缩混合物。所得残余物通过硅胶层析(CHCl3/MeOH、92/8v/v)纯化，得到了265mg(0.81mmol)化合物11(81％)。
1H－NMR(400MHz,DMSO－d6)：δ2.15(s,3H),3.64－3.87(m,3H),4.34(dd,J＝10.0,7.6Hz,1H),4.50(dd,J＝16.8,10Hz,1H),5.12(t,J＝5.2Hz,1H),5.80(d,J＝6.4Hz,1H),6.42(d,J＝7.6Hz,1H),7.30(br s,2H),8.10(s,1H),8.22(s,1H)；HRMS(ESI+)calc.m/z326.09(M+H+),348.07(M+Na+)found m/z 326.3798(M+H+),348.0800(M+Na+)。
(2)9－[5－O－(4,4’－二甲氧基三苯甲基)－2－脱氧－2－硫代－β－D－阿拉伯呋喃糖基]腺嘌呤(化合物12)
在265mg(0.815mmol)化合物11的8.0mL吡啶溶液中加入413mg(1.22mmol)4,4’－二甲氧基三苯甲基氯，在室温下搅拌反应混合物2.5小时。用H2O和CHCl3提取反应混合物。有机相用饱和NaHCO3溶液和食盐水洗涤，干燥(Na2SO4)，在真空中浓缩。所得残余物通过硅胶层析(CHCl3/MeOH、100/0～95/5v/v)纯化，得到了371mg(0.59mmol)化合物12(72％)。1H－NMR(400MHz,DMSO－d6)：δ2.17(s,3H),3.16(d,J＝8.4Hz,1H),3.45(dd,J＝10.4,7.6Hz,1H),3.69(s,3H),3.71(s,3H),4.02－4.07(m,1H),4.37(dd,J＝10.0,8.0Hz,1H),4.67(dd,J＝16.8,8.4Hz,1H),5.77(d,J＝5.6Hz,1H),6.47(d,J＝8.0Hz,1H),6.72(d,J＝8.8Hz,2H),6.78(d,J＝9.2Hz,2H),7.14－7.21(m,7H),7.29－7.33(m,4H),7.96(s,1H),8.14(s,1H)；13C－NMR(100MHz,DMSO)：δ30.0,51.2,54.9,63.7,72.2,82.5,83.3,85.4,112.9,113.0,119.1,126.5,127.6,129.6,129.7,135.4,135.5,140.1,144.8,148.7,152.3,156.0,157.9,158.0,193.9；HRMS(ESI+)calc.m/z 628.22(M+H+),650.20(M+Na+),found m/z 628.2216(M+H+),650.2054(M+Na+)。
(3)9－[5－O－(4,4’－二甲氧基三苯甲基)－2－脱氧－2－三异丙基甲硅烷氧基甲硫基－β－D－阿拉伯呋喃糖基]腺嘌呤(化合物13)
在749mg(1.19mmol)化合物12的6.0mL MeOH溶液中加入28％NaOMe的6.0mL MeOH溶液。在室温下搅拌反应混合物15分钟，在真空中浓缩。残余物用CH2Cl2稀释，用饱和NaHCO3溶液和食盐水洗涤。将有机相干燥(Na2SO4)，在真空中浓缩。无需进一步纯化，将所得残余物溶解于12mL THF。在溶液中加入1.4mL(8.33mmol)DIPEA、304μL(1.31mmol)(三异丙基甲硅烷氧基)甲基氯，在0℃下搅拌16.5小时。用H2O和CH2Cl2提取反应混合物。有机相用饱和NaHCO3溶液和食盐水洗涤，干燥(Na2SO4)，在真空中浓缩。所得残余物通过硅胶层析(己烷/EtOAc、1/1～1/2v/v)纯化，得到了499mg(0.65mmol)化合物13(54％)。1H－NMR(400MHz、DMSO－d6)：δ0.95－1.00(m,21H),3.19(d,J＝8.4Hz,1H),3.45(dd,J＝10.8,7.6Hz,1H),3.70(s,3H),3.71(s,3H),3.88(t,J＝7.6Hz,1H),3.97－4.01(m,1H),4.49(dd,J＝14.4,8.8Hz,1H),4.67(d,J＝10.4Hz,1H),4.76(d,J＝10.8Hz,1H),5.75(d,J＝6.0Hz,1H),6.49(d,J＝7.2Hz,1H),6.77(d,J＝8.8Hz,2H),6.81(d,J＝9.2Hz,2H),7.18－7.26(m,9H),7.35－7.36(m,2H),8.02(s,1H),8.11(s,1H)；13C－NMR(100MHz,DMSO)：δ11.2,17.6,17.7,52.5,54.9,63.5,63.8,74.2,82.9,84.0,85.4,113.0,118.7,126.6,127.7,129.6,135.4,135.5,139.4,144.8,149.0,152.3,155.9,157.9,158.0；HRMS(ESI+)calc.m/z 794.34(M+Na+),found m/z 794.3113(M+Na+)。
(4)N6－N6－二苯甲酰基－9－[5－O－(4,4’－二甲氧基三苯甲基)－2－脱氧－2－三异丙基甲硅烷氧基甲硫基－3－O－三甲基甲硅烷基－β－D－阿拉伯呋喃糖基]腺嘌呤(化合物14)
室温下在488mg(0.63mmol)化合物13的7.0mL吡啶溶液中加入96μL(0.76mmol)TMSCl。搅拌1小时后，加入218μL(1.90mmol)BzCl，在室温下搅拌混合物2小时。在反应混合物中添加11mL H2O，搅拌10分钟。然后，添加14mL 28％的NH3水溶液，搅拌混合物15分钟。用H2O和CH2Cl2提取反应混合物。用饱和NaHCO3溶液和食盐水洗涤有机相，干燥(Na2SO4)，在真空中浓缩。所得残余物通过硅胶层析(己烷/EtOAc、3/1～2/1v/v)纯化，得到了211mg(0.20mmol)化合物14(32％)。
1H－NMR(400MHz、DMSO－d6)：δ－0.05(s,9H),0.95－1.05(m,21H),3.20(d,J＝8.8Hz,1H),3.39(dd,J＝11.2,6.8Hz,1H),3.68(s,3H),3.69(s,3H),3.97－4.02(m,2H),4.54－4.63(m,3H),6.68(d,J＝7.6Hz,1H),6.78(d,J＝3.6Hz,2H),6.81(d,J＝3.6Hz,2H),7.15－7.21(m,7H),7.32－7.34(m,2H),7.40(t,J＝8.0Hz,4H),7.55(t,J＝8.0Hz,2H),7.75(d,J＝7.2Hz,4H),8.60(s,1H),8.65(s,1H)；13C－NMR(100MHz,DMSO－d6)：δ0.3,11.2,17.6,17.7,52.2,55.0,65.8,69.5,74.3,82.7,84.7,85.6,113.1,126.6,127.1,127.7,128.9,129.6,129.7,133.3,133.4,135.2,135.5,144.4,146.1,150.8,151.6,152.4,158.0,178.9；HRMS(ESI+)calc.m/z1052.45(M+H+),found m/z 1052.4480(M+H+)。
(5)N 6－N 6－二苯甲酰基－9－[5－O－(4,4’－二甲氧基三苯甲基)－2－脱氧－2－三异丙基甲硅烷氧基甲硫基－β－D－阿拉伯呋喃糖基]腺嘌呤(化合物15)
在160mg(0.15mmol)化合物14的1.5mL吡啶溶液中加入70％HF的11μL(0.42mmol)吡啶溶液，在室温下搅拌反应混合物2小时。用H2O和CH2Cl2提取反应混合物。有机相用饱和NaHCO3溶液和食盐水洗涤，干燥(Na2SO4)，在真空中浓缩。所得残余物通过硅胶层析(己烷/EtOAc、2/1v/v)纯化，得到了93mg(0.09mmol)化合物15(62％)。
1H－NMR(400MHz、DMSO－d6)：δ0.94－1.05(m,21H),3.20(d,J＝8.0Hz,1H),3.46(dd,J＝10.8,7.6Hz,1H),3.68(s,3H),3.69(s,3H),3.92－4.05(m,2H),4.41(dd,J＝15.2,8.8Hz,1H),4.65(d,J＝10.4Hz,1H),4.76(d,J＝10.8Hz,1H),6.64(d,J＝7.6Hz,1H),6.78(d,J＝8.0Hz,2H),6.80(d,J＝8.4Hz,2H),7.13－7.21(m,7H),7.31－7.33(m,2H),7.42(t,J＝7.6Hz,4H),7.57(t,J＝7.6Hz,2H),7.75(d,J＝7.6Hz,4H),8.54(s,1H),8.58(s,1H)；13C－NMR(100MHz,DMSO－d6)：δ11.2,17.6,17.7,52.5,54.9,63.6,66.0,74.1,83.0,84.8,85.4,113.0,126.6,127.1,127.7,128.9,129.5,129.8,133.3,133.5,135.2,135.8,144.6,146.0,150.8,151.6,152.4,152.9,158.0,171.9；HRMS(ESI+)calc.m/z 980.41(M+H+),found m/z 980.4331(M+H+)。
(6)N6－N6－二苯甲酰基－9－{3－O－[2－氰基乙氧基(二异丙基氨基)膦烷基]－5－O－(4,4’－二甲氧基三苯甲基)－2－脱氧－2－三异丙基甲硅烷氧基甲硫基－β－D－阿拉伯呋喃糖基}腺嘌呤(化合物16)
在93mg(0.01mmol)化合物15的950μL THF溶液中加入42μL(0.19mmol)2－氰基乙基N,N－二异丙基氯亚磷酰胺和80μL(0.47mmol)DIPEA，在室温下搅拌1小时。用H2O和EtOAc提取反应混合物。有机相用饱和NaHCO3溶液和食盐水洗涤，干燥(Na2SO4)，在真空中浓缩。所得残余物通过硅胶层析(己烷/EtOAc、2/1v/v)纯化，得到了83mg(0.07mmol)化合物16(70％)。
31P－NMR(159MHz、DMSO－d6)：δ149.1、149.9、HRMS(ESI+)calc.m/z 1180.52(M+H+)、found m/z 1180.5363(M+H+)。
2－2.寡核苷酸的合成
寡核苷酸是根据亚磷酰胺法使用DNA合成仪来合成。5’末端的荧光标记使用6－FAM亚酰胺(Chemgenes)。将所合成的各切割类似物的亚酰胺制成终浓度50mM的乙腈溶液，使用DNA合成仪引入到DNA引物内部。脱保护按照常规方法进行，各DNA用20％PAGE纯化，使用MALDI－TOF/MS(Bruker)确认结构。合成的DNA的序列见下表。
[表3]
Figure BDA0003493475000000221
3－3.包含氟切割类似物(A＊＊)的寡核苷酸的切割反应
将寡核苷酸(5’荧光素－d ACGACTCA＊＊CTATAGGGCGAA)、1μM)混合在含有10mMTris－HCl(pH8.5)、50mM MgCl2、10mM二硫苏糖醇(DTT)的缓冲液中，之后加入等量的1MTBAF的THF溶液，在72℃下加热10分钟。在冰上冷却后，利用离心蒸发仪去除溶剂，再次溶解于10μL 2×甲酰胺加样溶液(80(v/v)％甲酰胺、50mM EDTA(pH8.0))。所得样品通过含有7.5M尿素的20％改性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)进行分析。凝胶中的寡核苷酸在5’末端标记。根据荧光素基的荧光，使用ChemiDoc XRS+成像系统(Bio－Rad)进行检测。图4示出电泳凝胶的照片。如该图所示，可知通过切割反应寡核苷酸被切断。
3.光切割类似物(Se(硒))
3－1.光切割Se类似物(ASe)的合成
以下，示出光切割Se类似物的合成图解。以下，按照该合成图解，对光切割类似物的合成顺序进行说明。
Figure BDA0003493475000000231
(1)9－[3,5－O－(1,1,3,3－四异丙基－1,3－二硅氧烷二基)－2－脱氧－2－对甲苯酰硒基－β－D－阿拉伯呋喃糖基]腺嘌呤(化合物17)
在14.8g(46.7mmol)二对甲苯酰硒醚的160mL DMF溶液中加入4.3mL(43.7mmol)哌啶和8.2mL(46.7mmol)DIPEA，在室温下搅拌。搅拌5分钟后，在上述混合物中加入10g(15.6mmol)化合物3，在60℃下搅拌1小时。将AcOEt加入到反应混合物中，用1N的HCl水溶液、饱和NaHCO3水溶液洗涤。用食盐水洗涤，用Na2SO4干燥使其蒸发，得到了粗化合物。将该粗产物通过硅胶柱层析(Hex/AcOEt＝1/1～1/4、v/v)纯化，得到了5.7g化合物17(53％)。
1H－NMR(400MHz,CDCl3)：δ8.16(1H,s),7.92(1H,s),7.56(2H,d,J＝8.4Hz),7.15(2H,d,J＝8.4Hz),6.47(1H,d,J＝7.6Hz),6.09(2H,brs),5.25(1H,dd,J＝10.0,8.0Hz),4.72(1H,dd,J＝10.4,7.6Hz),4.27(1H,dd,J＝12.0,4.8Hz),4.03－4.01(2H,m),2.34(3H,s),1.18－0.99(28H,m)；13C－NMR(100MHz,CDCl3)：δ192.5,155.2,151.9,149.4,145.3,140.2,135.5,129.6,127.5,120.1,85.0,84.3,73.5,62.1,50.4,21.8,17.6,17.5,17.4,17.3,17.1,13.7,13.2,12.9,12.5；77Se－NMR(75MHz,CDCl3)：δ535.6；HRMS(ESI+)calc.m/z692.2197[M+H]+,found m/z 692.2200[M+H]+。
(2)9－[3,5－O－(1,1,3,3－四异丙基－1,3－二硅氧烷二基)－2－脱氧－2－(2－硝基苄氧基甲基)硒基－β－D－阿拉伯呋喃糖基]腺嘌呤(化合物18)
在空气条件下，在400mg(0.58mmol)化合物17的4mL DMF溶液中添加143μL(1.4mmol)哌啶，在室温下搅拌反应混合物16小时。然后，将气氛与氩交换，溶液用氩气通气10分钟，然后加入53mg(1.4mmol)NaBH4，在室温下搅拌。15分钟后，将反应混合物冷却至0℃，添加0.87mmol 2－硝基苄氧基甲基氯的2mL DMF溶液，在0℃下搅拌1小时。通过添加H2O使反应猝灭，用AcOEt提取，用食盐水洗涤，用Na2SO4干燥使其蒸发。粗产物通过硅胶柱层析(CHCl3/MeOH＝25/1、v/v)纯化，得到了226mg化合物18(53％)。
1H－NMR(400MHz,CDCl3)：δ8.14(1H,s),8.01－7.86(2H,m),7.68－7.32(3H,m),6.37(1H,d,J＝7.6Hz),6.15(2H,brs),5.02(1H,s,diastereotopic),4.97(1H,s,diastereotopic),4.86(1H,dd,J＝10.0,8.0Hz),4.77(1H,s,diastereotopic),4.75(1H,s,diastereotopic),4.13(1H,dd,J＝12.8,4.4Hz),4.01－3.94(2H,m),3.84－3.82(1H,m),1.11－0.95(28H,m)；13C－NMR(100MHz,CDCl3)：155.8,152.8,149.6,147.4,139.2,133.7,133.5,129.1,128.4,124.8,119.6,84.8,84.1,74.9,69.5,67.9,61.6,48.7,17.6,17.5,17.4,17.2,17.1,17.0,13.7,13.1,13.0,12.6；77Se－NMR(75MHz,CDCl3)：δ231.7；HRMS(ESI+)calc.m/z 739.2204[M+H]+,found m/z 739.2208[M+H]+。
(3)N6,N6－二苯甲酰基－9－[3,5－O－(1,1,3,3－四异丙基－1,3－二硅氧烷二基)－2－脱氧－2－(2－硝基苄氧基甲基)硒基－β－D－阿拉伯呋喃糖基]腺嘌呤(化合物19)
在200mg(0.27mmol)化合物18的3mL吡啶溶液中加入125μL(1.08mmol)苯甲酰氯，在室温下搅拌混合物4小时。在反应混合物中加入AcOEt，用H2O和食盐水洗涤，用Na2SO4干燥使其蒸发。粗产物通过硅胶柱层析(己烷/AcOEt＝2/1～1/2、v/v)纯化，得到了126mg化合物19(49％)。
1H－NMR(400MHz,CDCl3)：δ8.54(1H,s),8.13(1H,s),8.04－7.28(14H,m),6.47(1H,d,J＝7.6Hz),5.05－4.79(5H,m),4.19－3.85(4H,m),1.13－0.95(28H,m)；13C－NMR(100MHz,CDCl3)：δ172.3,152.9,152.0,151.9,147.6,143.8,134.2,133.7,133.2,133.0,129.6,129.3,128.7,128.6,128.0,124.9,85.4,84.3,75.2,69.7,68.2,61.7,49.1,17.6,17.5,17.4,17.2,17.1,14.2,13.7,13.1,13.0,12.6；77Se－NMR(75MHz,CDCl3)：δ234.4；HRMS(ESI+)calc.m/z947.2729[M+H]+,found m/z 947.2727[M+H]+。
(4)N6,N6－二苯甲酰基－9－[2－脱氧－2－(2－硝基苄氧基甲基)硒基－β－D－阿拉伯呋喃糖基]腺嘌呤(化合物20)
在125mg(0.13mmol)化合物19的1mL THF溶液中添加290μL 1M的TBAF的THF溶液，在室温下搅拌1小时。在真空中浓缩反应混合物，所得残余物通过硅胶柱层析(CHCl3/MeOH＝25/1、v/v)纯化，得到了65mg化合物20(71％)。
1H－NMR(400MHz,CDCl3)：δ8.56(1H,s),8.51(1H,s),8.02(1H,d,J＝8.0Hz),7.81(4H,d,J＝7.2Hz),7.60－7.30(9H,m),6.55(1H,d,J＝7.6Hz),5.02(2H,s),4.83－4.69(3H,m),3.98－3.75(4H,m)；13C－NMR(100MHz,CDCl3)：δ172.4,152.6,152.1,151.9,147.7,144.6,133.9,133.8,133.2,132.7,130.1,129.5,128.9,128.4,127.5,125.0,86.2,85.1,73.5,69.5,68.5,59.9,49.7；77Se－NMR(75MHz,CDCl3)：δ250.1。
(5)N 6,N 6－二苯甲酰基－9－[5－O－(4,4’－二甲氧基三苯甲基)－2－脱氧－2－(2－硝基苄氧基甲基)硒基－β－D－阿拉伯呋喃糖基]腺嘌呤(化合物21)
在60mg(0.085mmol)化合物20的0.8mL吡啶溶液中加入35mg(0.102mmol)4,4’－二甲氧基三苯甲基氯。在室温下搅拌反应混合物2小时。反应混合物用AcOEt稀释，用饱和H2O洗涤。用NaHCO3水溶液、食盐水洗涤，用Na2SO4干燥使其蒸发。粗产物通过硅胶柱层析(己烷/AcOEt＝1/1、v/v)纯化，得到了48mg化合物21(56％)。
1H－NMR(400MHz,CDCl3)：δ8.52(1H,s),8.21(1H,s),8.03(1H,d,J＝8.0Hz),7.83－7.81(4H,m),7.57－7.15(18H,m),6.79－6.77(4H,m),6.60(1H,d,J＝7.2Hz),5.04－4.72(4H,m),4.66(1H,dd,J＝8.8Hz),4.05－4.03(1H,m),3.93(1H,dd,J＝8.8,7.2Hz),3.72(6H,s),3.52－3.50(2H,m)；13C－NMR(100MHz,CDCl3)：δ172.3,158.7,152.7,152.2,151.9,147.8,144.4,143.8,135.7,135.6,134.2,133.8,133.0,132.5,130.1,129.5,129.0,128.7,128.3,128.0,127.0,125.1,113.3,86.9,85.4,83.3,76.5,69.5,68.6,62.9,55.3,49.6；77Se－NMR(75MHz,CDCl3)：δ252.0；HRMS(ESI+)calc.m/z 1007.2513[M+H]+,found m/z 1007.2536[M+H]+。
(6)N 6,N 6－二苯甲酰基－9－{3－O－[2－氰基乙氧基(二异丙基氨基)膦烷基]－5－O－(4,4’－二甲氧基三苯甲基)－2－脱氧－2－(2－硝基苄氧基甲基)硒基－β－D－阿拉伯呋喃糖基}腺嘌呤(化合物22)
在45mg(0.045mmol)化合物21和47μL(0.27mmol)DIPEA的0.5mL CH2Cl2溶液中添加25μL(0.11mmol)2－氰基乙基N,N－二异丙基氯亚磷酰胺，在0℃下搅拌1小时。反应混合物用AcOEt稀释，用饱和NaHCO3水溶液和食盐水洗涤，用Na2SO4干燥使其蒸发。粗产物通过硅胶柱层析(己烷/AcOEt＝1/1、v/v)纯化，得到了41mg化合物21(76％)。
31P－NMR(159MHz,CDCl3)：δ150.6,150.3；HRMS(ESI+)calc.m/z 1207.3592[M+H]+,found m/z 12707.3624[M+H]+。
3-2.寡核苷酸的合成
将所合成的切割类似物ASe的亚酰胺制成终浓度50mM的乙腈溶液，根据亚磷酰胺法，使用DNA合成仪合成DNA寡聚物。脱保护按照常规方法进行，通过反向HPLC[日立High-Tech Science公司制的LaChrom Elite；色谱柱、YMC公司制的Hydrosphere C18(250×10mm)]纯化，使用MALDI-TOF/MS(Bruker)确认结构。合成的DNA的序列见下表。
[表4]
序列
5’-ACGACTCA<sub>Se</sub>CTATAGGGCGAATTCGAGCTCGGT-3’
3-3.包含光切割类似物(ASe)的寡核苷酸的切割反应
在含有10mM Tris-HCl(pH8.5)、5mM MgCl2、10mM二硫苏糖醇(DTT)的缓冲液中混合3μM的寡核苷酸后，使用光照射装置MAX-305(朝日分光)，以约4mW/cm2照射波长365nm的光10分钟。所得样品用甲酰胺加样溶液(80(v/v)％甲酰胺、50mM EDTA(pH8.0))稀释2倍后，通过含有7.5M尿素的15％改性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)进行分析。凝胶中的寡核苷酸用SYBR Green II核酸凝胶染色剂染色，使用ChemiDoc XRS+成像系统(Bio-Rad)进行检测。结果见图5。由该结果可知：通过在缓冲液中、在室温下进行10分钟的光照射，看到了切割产物。

Claims (9)

1.一种引物，其特征在于：其是用于核酸的扩增的引物，具有下述式(1)所示的结构，
Figure FDA0003493474990000011
这里，A1表示－S－、－S－S－或－Se－，B表示碱基，R1表示分解性保护基，＊是指与相邻的核苷酸的糖的键。
2.根据权利要求1所述的引物，其特征在于：所述R1为下述式(2A)所示的光分解性保护基，
Figure FDA0003493474990000012
这里，A2表示碳原子数为1～3的亚烷基，A3表示碳原子数为1～3的亚烷基，＊是指与A1的键。
3.根据权利要求2所述的引物，其特征在于：所述R1为下述式(3A)所示的2－硝基苄氧基甲基，
Figure FDA0003493474990000013
4.根据权利要求1所述的引物，其特征在于：所述R1为下述式(2B)所示的氟化物分解性保护基，
Figure FDA0003493474990000014
这里，A4表示碳原子数为1～3的亚烷基，R2～R4表示直链或支链的碳原子数为1～4的烷基，R2～R4彼此可以相同也可以不同，＊是指与A1的键。
5.根据权利要求4所述的引物，其特征在于：所述R1为下述式(3B)所示的三异丙基甲硅烷氧基甲基，
Figure FDA0003493474990000021
6.一种双链DNA的制造装置，其是用于使用权利要求1～5中任一项所述的引物制造具有粘附末端的双链DNA的双链DNA制造装置，其特征在于，具备：
正向引物，与作为模板的模板DNA的反义链的一部分序列互补，并且具有所述式(1)所示的结构；
反向引物，与所述模板DNA的有义链的一部分序列互补，并且具有所述式(1)所示的结构；
扩增设备，以所述模板DNA为模板进行多个循环的聚合酶链反应(PCR)，生成所述正向引物延伸的正向侧延伸链和所述反向引物延伸的反向侧延伸链，将所述正向侧延伸链和所述反向侧延伸链退火以生成3’末端凹陷的双链DNA；
平滑化设备，利用克列诺片段将所述双链DNA的所述3’末端形成平滑末端；以及
脱保护切割设备，将所述R1脱保护，在所述式(1)的结构部分切割DNA，形成3’末端突出的粘附末端。
7.一种双链DNA的制造方法，其是用于使用权利要求1～5中任一项所述的引物制造具有粘附末端的双链DNA的双链DNA制造方法，其特征在于，具有以下工序：
准备工序，准备正向引物和反向引物，所述正向引物与作为模板的模板DNA的反义链的一部分序列互补、且具有所述式(1)所示的结构，所述反向引物与所述模板DNA的有义链的一部分序列互补、且具有所述式(1)所示的结构；
扩增工序，以所述模板DNA为模板进行多个循环的聚合酶链反应(PCR)，生成所述正向引物延伸的正向侧延伸链和所述反向引物延伸的反向侧延伸链，将所述正向侧延伸链和所述反向侧延伸链退火，生成3’末端凹陷的双链DNA；
平滑化工序，利用克列诺片段将所述双链DNA的所述3’末端形成平滑末端；以及
脱保护切割工序，将所述R1脱保护，在所述式(1)的结构部分切割DNA，形成3’末端突出的粘附末端。
8.根据权利要求7所述的双链DNA的制造方法，其特征在于：所述R1为所述式(2A)所示的光分解性保护基，脱保护切割工序通过光照射将所述R1脱保护。
9.根据权利要求7所述的双链DNA的制造方法，其特征在于：所述R1为所述式(2B)所示的氟化物分解性保护基，脱保护切割工序利用氟化物将所述R1脱保护。
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