JPH08507926A - エキソヌクレアーゼ分解を介した質量分析法によるｄｎａ配列決定 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 核酸を最初の末端からエキソヌクレアーゼ活性により一方向に切断して、配列順に個々のヌクレオチドを放出させ、配列順に放出される各ヌクレオチドを質量分析機で同定し、そして同定されたヌクレオチドから核酸配列を決定することによる核酸配列の決定方法が開示される。この方法は、１以上の核酸配列を同時に決定するための多重化が可能である。

Description

【発明の詳細な説明】 エキソヌクレアーゼ分解を介した質量分析法によるＤＮＡ配列決定発明の背景 生命科学のためにＤＮＡ配列決定が有している基礎的役割は明らかである。ヒ トのゲノムプロジェクト（ｇｅｎｏｍｅ ｐｒｏｊｅｃｔ）におけるその重要性 は広く議論され、公開されてきた［例えばＪ．Ｅ．Ｂｉｓｈｏｐ ａｎｄ Ｍ． Ｗａｌｄｈｏｌｚ，１９９１，Ｇｅｎｏｍｅ．Ｔｈｅ Ｓｔｏｒｙ ｏｆ ｔｈ ｅ Ｍｏｓｔ Ａｓｔｏｎｉｓｈｉｎｇ Ｓｃｉｅｎｃｉｆｉｃ Ａｄｖｅｎｔ ｕｒｅ ｏｆ Ｏｕｒ Ｔｉｍｅ−Ｔｈｅ Ａｔｔｅｍｐｔ ｔｏ Ｍａｐ Ａ ｌｌ Ｇｅｎｅｓｉｎ ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｂｏｄｙ，Ｓｉｍｏｎ ＆ Ｓｃ ｈｕｓｔｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ］。 ＤＮＡ配列決定における技術の現状は最近の総説にまとめられている［例えば Ｂ．Ｂａｒｒｅｌｌ，Ｔｈｅ ＦＡＳＥＢ Ｊｏｕｒｎａｌ，５，４０（１９９ １）；Ｇ．Ｌ．Ｔｒａｉｎｏｒ，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６２，４１８（１９９０ ）及びそこに引用されている参照文献］。最も広く用いられるＤＮＡ配列決定の 化学は酵素的鎖終結法（ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｃｈａｉｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｉ ｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）であり［Ｆ．Ｓａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎ ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ，７４，５４６３（１９７７）］、それは数 種の配列決定戦略に適合させられてきた。配列決定反応は好熱性Ｔａｇ ＤＮＡ ポリメラーゼなどの種々のＤＮＡポリメラーゼ［Ｍ．Ａ．Ｉｎｎｅｓ，Ｐｒｏｃ ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ，８５，９４３６（１９ ８８）］、又は特別に修飾されたＴ７ ＤＮＡポリメラーゼ（“ＳＥＱＵＥＮＡ ＳＥ”）［Ｓ．Ｔａｂｏｒ ａｎｄ Ｃ．Ｃ．Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ ，８４，４７６７（１９８７）］を用い て、あるいはポリマー支持体の使用と組み合わせて溶液中で行われる。例えば引 用することによりその記載事項が本明細書の内容となるＳ．Ｓｔａｈｌ ｅｔ ａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１６，３０２５（１９８８）； Ｍ．Ｕｈｌｅｎ，ＰＣＴ出願 ＷＯ ８９／０９２８２；Ｃｏｃｕｚｚａ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＴ出願 ＷＯ ９１／１１５３３；及びＪｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ ．，ＰＣＴ出願 ＷＯ ９２／０２５７５を参照されたい。 今日用いられているほとんどすべての配列決定戦略の中心的、しかし同時に制 限的部分は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）による塩基−特異的 に終結されたからまった（ｎｅｓｔｅｄ）フラグメント群の分離である。この方 法は時間がかかり、誤まりがちであり、不明確な配列決定を生じ得る。ＰＡＧＥ の利用の結果、ＰＡＧＥによって得た配列のラダーを説明して信頼できる結果を 得るために経験の豊富な人間が必要な場合が多い。自動配列読み取り機は、“ス マイリング（ｓｍｉｌｉｎｇ）”、圧縮（ｃｏｍｐｒｅｓｓｉｏｎｓ）、フェイ ントゴーストバンド（ｆａｉｎｔ ｇｈｏｓｔ ｂａｎｄ）などの人工産物を取 り扱うことができないことが非常に多い。これは³²Ｐ、³³Ｐ又は³⁵Ｓなどの放射 性標識を用いた標準的検出法、ならびに配列決定バンドの検出に蛍光色素を用い たいわゆる自動ＤＮＡシークエンサー（例えばＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔ ｅｍｓ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｄｕｐｏｎｔ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の場合も真 実である。 しかし時間因子を別として、ＰＡＧＥを統合（ｉｎｔｅｇｒａｌ）部分として 含むすべての方法の最大の制限は信頼できる配列情報の生成、ならびに現存する ソフトウェア及びＤＮＡ配列及びタンパク質データバンクを用いた配列データの 複雑な分析を容易にするためにこの情報をコンピューターフォーマットに変換挿 入することである。 標準的Ｓａｎｇｅｒ配列決定を用いると、２００〜５００塩基の未確定配列情 報を約２４時間で得ることができ、自動ＤＮＡシークエンサーを用いてこの数は 、数試料を同時に処理するために約１０倍〜２０倍となることができた。ユニー ク標識配列を用いることにより、ブロッティング、膜へのＵＶ−架橋及び特異的 相補的標識プローブとのハイブリッド形成の後に同一のＰＡＧＥから数個の配列 決定ラダーを次々と検出することができる多重ＤＮＡ配列決定［Ｇ．Ｃｈｕｒｃ ｈ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０，１８５−１８８（１９８８）；Ｋ ｏｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．Ｓｙｍｐｏ ｓｉｕｍ Ｓｅｒ．Ｎｏ．２４ ，３１８−２１（１９９１）］を用いることによ り処理量をさらに増加させることができた。しかしこの方法はまだ非常に労力を 要し、多くの場合に非常な熟練者を必要とし、全過程の重要要素としてＰＡＧＥ を用いることにより妨げられ得る。 大規模配列決定プロジェクトは多くの場合、ｃＤＮＡ、あるいはコスミド、プ ラスミド（例えばｐＵＣ）、ファージミド（例えばｐＥＭＢＬ、ｐＧＥＭ）又は １本鎖ファージ（例えばＭ１３）ベクターなどの適したクローニングベクター中 に挿入された大ＤＮＡフラグメントのゲノムライブラリを用いて開始される［Ｔ ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ （１９８２）Ｍｏｌｅｃｕｌ ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏ ｌ．１０１（１９８３），Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ，Ｐａｒｔ Ｃ；Ｖ ｏｌ．１５３（１９８７），Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ，Ｐａｒｔ Ｄ； Ｖｏｌ．１５４（１９８７），Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ，Ｐａｒｔ Ｅ ；Ｖｏｌ．１５５（１９８７），Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ，Ｐａｒｔ Ｆ ａｎｄＶｏｌ．１５２（１９８７）．Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａ ｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ］。Ｓａｎｇｅｒ配列決定化学は一度に約２００〜５００塩基 の読み取りを可能にするのみなので大ＤＮＡフラグメントは現在１回の実験で直 接配列決定できず、長いＤＮＡフラグメントを短い片に切断し、それを別々に配 列決定しなければならない。１つの方法の場合、これは例えば非特異的ＤＮアー ゼＩ消化、頻繁に切断する制限酵素、又は音波処理、ならびにアガロースゲル上 の電気泳動による分類により完全に無作為な方法でなされる［Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ，同上］。しかしこの方法は、連続したＤＮＡ配列 が得られるまでいくつかの配列が多数回配列決定されるので時間がかかり、多く の場合不経済である。全配列の隙間を閉じるための作業の経費が膨大であること が非常に多い。結局、長いＤＮＡ配列を非無作為な、すなわち直接的な方法で１ 端から他端に配列決定できる方法を有することが望ましい。この達成のためにい くつかの戦略が提案された［Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，同 上 ；Ｓ．Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｇ ｅｎｅ ，２８，３５１−５９（１９８４）：Ｓ．Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ｅｔ ａｌ ．米国特許第４，８４３，００３号；ならびにＰＣＴ出願ＷＯ ９１／１２３４ ］。しかし現在利用できる配列決定法のいずれも時間的又は経済的に受け入れら れる、メガ塩基のＤＮＡ配列を決定する方法を与えない。この主な理由は、全過 程の中心及び重要要素としてＰＡＧＥを利用することに由来する。 ＰＡＧＥにおいて、変性条件下で終結ＤＮＡフラグメントのからまった群が、 異なる長さのＤＮＡ鎖の異なる移動度により分離される。しかしもっと厳密に観 察すると、ＰＡＧＥによるＤＮＡ鎖の移動度を支配しているのは鎖長のみでなく 、塩基の組成の移動度への有意な影響があることが明らかになる［Ｒ．Ｆｒａｎ ｋ ａｎｄ Ｈ．Ｋｏｓｔｅｒ，Ｎｅｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｖ．，６， ２０６９（１９７９）］。従って、同一の長さであるが異なる配列／塩基組成の ＤＮＡフラグメントは異なる移動度を有するので、ＰＡＧＥは非常に遅いのみで なく、分子量の決定に関して信頼できない方法でもある。同様に、同一の移動度 を有するＤＮＡ配列は異なる配列／塩基組成を有することができる。 従って、与えられたＤＮＡフラグメントの配列／塩基組成の決定のための最も 信頼できる方法は、配列をその分子量と関連づけることである。質量分析法はこ れを行うことができる。上記の方法と比較した質量分析法の大きな利点は、分析 当たり数秒の範囲である速度、及び質量決定の精度、ならびに正しい質量データ をコンピューターに直接読み取ることができることである。ＤＮＡ配列決定のた めの質量分析法の適用は、いくつかのグループにより研究されてきた［例えばＭ ｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ，Ｖｏｌ．１９３；Ｍａｓｓ Ｓｐ ｅｃｔｒｏ ｍｅｔｒｙ，（Ｊ．Ａ．ＭｃＣｌｏｓｋｅｙ，ｅｄｉｔｏｒ），１９９０，Ａｃ ａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｋ．Ｈ．Ｓｃｈｒａｍｍ Ｂｉ ｏｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆＭａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ ｅｔｒｙ ，３４，２０３−２８７（１９９０）；Ｐ．Ｆ．Ｃｒａｉｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ，９，５０５（１９９０）］。 ＤＮＡの配列決定に質量分析法を用いるほとんどの試みは、塩基特異的標識に 、例えば４つの硫黄同位体³²Ｓ、³³Ｓ、³⁴Ｓ及び³⁶Ｓなどの安定な同位体を用い てきた。例えばＢｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＴ出願 ＷＯ ８９／１２ ６９４，Ｒ．Ｌ．Ｍｉｌｌｓ 米国特許第６，０６４，７５４号、米国特許第５ ，００２，８６８号、Ｊａｃｏｂｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅａｎ ヨーロッパ 特許出願第Ａｌ ０３６０６７６号を参照されたい。これらの方法のほとんどは Ｓａｎｇｅｒ配列決定化学、及び質量分析の前にからまった終結ＤＮＡフラグメ ントを分離するための毛管領域電気泳動（ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｚｏｎｅ ｅｌ ｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）（ＣＺＥ）などのいくつかの変更をしたポリアク リルアミドゲル電気泳動を用いており、後者は質量分析法の利点をある程度危う くしている。 ＰＡＧＥの１つの利点は平行法であるという性質、すなわちいくつかの試料を 同時に分析できることであるが（これは順次法であるＣＺＥに関しては真実でな い）、質量分析法では一般に試料を順次に扱うことができるのみである。米国特 許出願０８／００１，３２３において、ＰＡＧＥを用いず、比較的大きな生体高 分子に適用できる電子スプレー（ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ）（ＥＳ）などの脱 着／イオン化法［Ｊ．Ｂ． Ｆｅｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．，８８，４４５１−５９（ １９８４）；Ｆｅｎｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＴ出願 ＷＯ ９０／１４１４８； 及びＢ．Ａｒｄｒｅｙ，ＳｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙＥｕｒｏｐｅ，４，１０−１ ８（１９９２）］及びマトリックスアシストレーザー脱着／イオン化（ＭＡＬＤ Ｉ）質量分析法［Ｆ．Ｈｉｌｌｅｎｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．， Ｌａｓｅｒ Ｄ ｅｓｏｒｐｔｉｏｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，Ｐａｒｔ Ｉ：Ｍ ｅｃｈａｎｉｓｍs ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｗｓ ａｎｄ Ｐａｒｔ ＩＩ ：Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＭＡＬＤ Ｉ ｏｆ Ｌａｒｇｅ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，ｉｎ ＭａｓｓＳｐｅｃｔ ｒｏｍｅｔｒｙ ｉｎ ｔｈｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ：Ａ Ｔｕｔｏｒｉａｌ （Ｍ．Ｌ．Ｇｒｏｓｓ，ｅｄｉｔｏｒ），１６５−１９７（１９９２ ），Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ］を用いた質量分析法によるＤＮＡ配列決定が提案さ れ、これは塩基−特異的に終結されたからまったＤＮＡフラグメントの混合物中 で分子質量を直接測定することにより、ＤＮＡ配列の決定を容易にすることがで きる。質量−修飾ヌクレオチド三リン酸誘導体の利用を介した多重化の概念を統 合する（ｉｎｔｅｇｒａｔｅ）ことにより、現在の質量分析法の場合 ｓｔｅｒ．米国特許出願０８／００１，３２３、同上］。 ＭＡＬＤＩ及びＥＳ質量分析法はいくつかの側面において相補的な方法である 。大気圧イオン化界面（ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｉｎｔｅｒｆａｃｅ）（ＡＰＩ ）を用いるＥＳは高性能液体クロマトグラフ（ＨＰＬ Ｃ）［Ｋ．Ｂ．Ｔｏｍｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍａｓｓ Ｓ ｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ，２０，７８３−８８（１９９１）］及び毛管領域電気 泳動（ＣＺＥ）［Ｒ．Ｄ．Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，６０ ，４３６−４１（１９８８）］からの連続流に適応させることができるが、 これは現在ＭＡＬＤＩ質量分析法の場合は利用できない。他方ＭＡＬＤＩ質量分 析法は、ＹＯＦ質量分析器を用いた比較的大分子の分析における緩衝塩及び他の 低分子量成分に対して感度が低く［Ｈｉｌｌｅｎｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．（１９ ９２ ），同上］；対照的にＥＳ質量分析法は低揮発性の副生成物に対して非常に 感受性である。ＥＳ質量分析法において高質量領域は多重帯電分子イオンの形成 を介して近付くことができるが、ＭＡＬＤＩ質量分析法の場合、これは飛行時間 （ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ）（ＴＯＦ）質量分析器及び生体分子の揮発の ための適したマトリックスの補助を適用することによりなされる。ＥＳと類似し て熱スプレー（ｔｈｅｒｍｏｓｐｒａｙ）界面を用いてＨＰＬＣが質量分析器と オンラインで組み合わされてきた。酵素的加水分解物に由来するヌクレオシドは そのような配置を用いて分析されてきた［Ｃ．Ｇ．Ｅｄｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ．，１３，８１９７−８２０６（１９８５ ）］。しかしＥｄｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．は核酸の配列決定のための方法は開示 していない。 長いＤＮＡフラグメントのＤＮＡ配列を決定するための相補的で完全に異なる 方法は、エキソヌクレアーゼを用いて１端からヌクレオチド毎にＤＮＡ鎖を前進 的に分解する。この方法はＪｅｔｔ ｅｔ ａｌ．により提案された。Ｊ．Ｈ． ．Ｊｅｔｔ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ ｅｃｕｌａｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ＆ Ｄｙｎａｍｉｃｓ ，７，３０１−３０ ９（１９８９）；及びＪ．Ｈ．Ｊｅｔｔ ｅｔ ａｌ．ＰＣＴ出願 ＷＯ ８９ ／０３４３２を参照されたい。ＤＮＡ又はＲＮＡフラグメントの１分子を流動流 に懸濁し、エキソヌクレアーゼと接触させ、それが１つづつ順にヌクレオチドを 切断する。放出されたヌクレオチドの検出は４つのヌクレオチドを４種類の蛍光 色素で特異的に標識し、レーザー誘導流細胞測定法（ｌａｓｅｒ ｉｎｄｕｃｅ ｄ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ ｔｅｃｈｎｑｕｅ）を含んで行われる。 しかし段階的酵素分解過程を用いる戦略は、この過程を同調化するのが困難で ある、すなわち酵素反応がすぐに位相から逸脱するという問題に悩まされ得る。 Ｊｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，同上は、１つのみのＤＮＡ又はＲＮＡ分子をエキソヌ クレアーゼにより分解することによりこの問題を解決することを試みた。しかし 、１つの分子を扱うこと、それを移動流中に保つこと、及び１つのヌクレオチド を明確に同定する検出感度を達成することは、解決しなければならない非常に困 難な技術的問題のいくつかにすぎないので、この方法は非常に困難である。さら に蛍光標識を用いる場合、蛍光シグナルのための物理的検出法は制御の困難な時 間因子を含み、レーザーによる励起を用いる必要性は蛍光シグナルの光退色を起 こし得る。 本明細書に記載の本発明は、現存のＤＮＡ配列決定法に固有の上記の問題のほ とんどを解決し、ヒトゲノム（及び他のゲノム）配列決定プロジェクトに取り組 むのに先要の高速ＤＮＡ配列決定に適した化学及び系を提供する。発明の概略 ほとんどの配列決定戦略と対照的に、本発明の方法はＳａｎｇｅｒ配列決定化 学、ポリアクリルアミド電気泳動又は放射性、蛍光もしくは化学発光検出を用い ない。代わりに本発明の方法は、従来のクローニングベクター中にクローニング された大ＤＮＡフラグメントを用いて開始して直接配列決定法を適応させ、質量 分析検出に基づく。これを行うためにＤＮＡは保護、酵素活性の特異性又は固定 化を用い、エキソヌクレアーゼ消化を介して段階的に１方向的に分解され、ヌク レオチド又は誘導体は質量分析法により検出される。 この酵素分解の前に、クローニングされたＤＮＡフラグメントの配列全体にわ たる何組かの順次（ｏｒｄｅｒｅｄ）欠失を創造することができる。この方法で 質量−修飾ヌクレオチドをエキソヌクレアーゼ及びＤＮＡ／ＲＮＡポリメラーゼ の組み合わせを用いて挿入することができる。これは多重質量分析検出、又は分 解過程を同調化するためのエキソヌクレアーゼの活性の調節を可能にする。本発 明の他の実施態様の場合、少量の酵素反応混合物を質量分析検出に合わせられる 速度で移動するベルト上に連続的に適用することにより位相化問題を解決するこ とができる。本発明のさらに別の実施態様の場合、種々の反応器からの反応混合 物を移動するベルト上に同時に適用することにより、処理量をさらに増加させる ことができた。この場合、種々の組の配列決定反応を、４つのヌクレオチドに結 合させた特異的質量−修飾標識により同定することができる。二次元的多重化は 、本発明に記載する通りエキソヌクレアーゼ媒介質量分析配列決定の処理量をさ らに増加させることができる。図面の簡単な説明 添付の図面は明細書の一部を形成し、本発明のある実施態様を例示す る実施例を提供する目的に供せられる。説明と共にそれらは本発明の範囲を制限 することなく本発明の原理を説明するのを補助する。 図１は１本鎖核酸を用いて開始されるエキソヌクレアーゼ配列決定の方法を示 す。 図２は図１と類似であるが、２本鎖ベクター中に挿入された標的核酸を用いて 開始される方法を示す。 図３は標的核酸配列多重化質量分析法への質量−修飾ヌクレオチドの導入の方 法を示す。 図４Ａ及び４Ｂは標的核酸配列多重化質量分析法への質量−修飾ヌクレオチド の導入の方法を示す。 図５は区別できる質量増加の導入又はエキソヌクレアーゼ活性の調節のために 修飾できる核酸分子内の位置を示す。 図６は配列決定されるべきＤＮＡ又はＲＮＡ中への質量−修飾ヌクレオチドの 酵素的挿入に有用な修飾ヌクレオシド三リン酸の種々の構造を示す。 図７は質量分析法による区別のために異なる増加でヌクレオチドを質量−修飾 するため、及び／又はエキソヌクレアーゼの酵素活性を調節するために有用ない くつかの可能な官能基（Ｒ）を示す。 図８は質量修飾官能基Ｒのヌクレオシドへの結合のためのいくつかの結合基Ｘ を示す。 図９は配列決定反応器系の略図である。 図１０はエキソヌクレアーゼ分解により放出されたヌクレオチドの段階的質量 分析検出の時間経過に従う、理想的出力シグナルのグラフ図である。 図１１は多重エキソヌクレアーゼ質量分析配列決定を容易にするために質量修 飾により導入される特異的標識を示す。 図１２は図９の配列決定反応器と連結された、レーザー誘導質量分析配列決定 のためのエキソヌクレアーゼ試料の単一又は複数軌道を運ぶ移動ベルト装置の略 図てある。 図１３は多重エキソヌクレアーゼ媒介質量分析配列決定において用いられる個 別に標識されたシグナル軌道の略図である。 図１４Ａ及び１４Ｂは質量分析配列決定のための２本鎖エキソヌクレアーゼ配 列決定の方法を示す。発明の詳細な説明 本発明の方法のための出発点は、例えばゲノム又はｃＤＮＡライブラリからク ローニングされたＤＮＡ、あるいは単離され、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ） により増幅された未知の配列のＤＮＡフラグメントを含むＤＮＡの片であること ができる。ライブラリは、例えば標準的方法に従い、ベクターをクローニングす ることにより得ることができる［Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ（１９８２），同上；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ ｏｇｙ ，Ｖｏｌ，１０１（１９８３）及びＶｏｌ．１５２−１５５（１９８７） ，同上］。適したクローニングベクターは商業的に入手することもできる。明ら かである通り、本発明はいずれかの特定のベクター構築物及びクローニング法に 制限されず、例えばいずれかのベクターにおけるクローニングにより、又はポリ メラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により得たいずれの与えられたＤＮＡフラグメント にも適用することができる。未知のＤＮＡ配列は標準的ＰＣＲを用いて２本鎖の 形態で、又は非対称ＰＣＲを用いて１ 本鎖の形態で得ることができる［ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉ ｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏr ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆ ｉｃａｔｉｏｎ（Ｅｒｌｉｃｈ，ｅｄｉｔｏｒ），Ｍ．Ｓｔｏｋｔｏｎ Ｐｒｅ ｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）］。ＤＮＡ及びＲＮＡは両方共、エキソヌ クレアーゼの選択に依存して５’又は３’末端からエキソヌクレアーゼ分解的に 分解できることは、当該技術分野におけ熟練者には明らかである。同様に、未知 のＤＮＡ分子の配列は、エキソヌクレアーゼ消化により直接決定することができ 、あるいは別の場合、未知の配列のＤＮＡフラグメントを最初に相補的ＲＮＡコ ピー中に転写し、続いてそれをエキソヌクレアーゼ的に分解してＲＮＡ配列を与 えることができる。ｐＧＥＭ（Ｐｒｏｍｅｇａ）ベクターなどの適したベクター は、複数のクローニング部位にフランキングするＳＰ６又はＴ７ ＤＮＡ依存性 ＲＮＡポリメラーゼに関する特異的プロモーターを有するので、現在有用である 。この特徴は、続くエキソヌクレアーゼ配列決定のために、未知のＤＮＡ鎖の両 方の相補的ＲＮＡへの転写を可能にする。さらにこれらのベクターはファージミ ドベクターの種類に属し、未知の２本鎖ＤＮＡの１本鎖ＤＮＡの生成の手段を与 える。かくして複製起点の配向のみが異なる２つのベクターを用いることにより 、未知のＤＮＡ配列の両方の鎖を１本鎖の形態で得ることができ、続くエキソヌ クレアーゼ配列決定に用いることができる。本発明の範囲は制限部位の選択によ っても制限されない。しかし、エキソヌクレァーゼ配列決定のための調製におけ る操作の間、未知のＤＮＡフラグメントを変化させずに保つために、希少切断（ ｒａｒｅ ｃｕｔｔｉｎｇ）制限部位が好ましい。以下の説明及び図は、例えば 本発明の原理を示す目的に供 せられる。本発明の範囲内である変動は当該技術分野における熟練者に明らかで ある。種々の質量分析配置は本発明の範囲内である：脱着／イオン化として、例 えば高速イオン衝撃（ｆａｓｔ ａｔｏｍｉｃ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）（Ｆ ＡＢ）、プラズマ脱着（ＰＤ）、熱スプレー（ＴＳ）ならびに好ましくは電子ス プレー（ＥＳ）及び適したマトリックスを用いた、又は用いないレーザー脱着（ ＬＤ又はＭＡＬＤＩ）；質量分析器として、例えば飛行時間（ＴＯＦ）配置又は 四極子を適用することができる。 （ｉ）エキソヌクレアーゼ配列決定のための未知の核酸配列の調製 図１は１本鎖環状クローニングベクターの１本鎖ＤＮＡ挿入片（“標的ＤＮＡ ”）の場合の方法を示す。標的ＤＮＡの境界はＡ及びＢと称する。図１に示す通 り標的ＤＮＡはベクターのＮｏｔＩ部位にクローニングされた。ＮｏｔＩ部位を ２本鎖に復帰させ、挿入ＤＮＡのＡ境界にフランキングするベクター配列と相補 的な合成オリゴデオキシヌクレオチド［Ｎ．Ｄ．Ｓｉｎｈａ，Ｊ．Ｂｉｅｒｎａ ｔ，Ｊ．ＭｃＭａｎｕｓ １２，４５３９（１９８４）］をその部位にハイブリッド形成させ、ＮｏｔＩ制 限エンドヌクレアーゼで切断する。次いで２片の合成オリゴデオキシヌクレオチ ドをモレキュラーシーブ濾過、膜濾過、沈澱又は他の標準的方法により除去する ことができる。 図１はｄＮＴＰの不在下で例えばＴ４ ＤＮＡポリメラーゼなどのエキソヌク レアーゼの時間制限作用（ｔｉｍｅ−ｌｉｍｉｔｅｄ ａｃｔｉｏｎ）により得 ることができる１組の順次の欠失（ｔ⁰、ｔ¹、ｔ²、ｔ³）も示す。欠失の組を固 体支持体Ｔｒに固定することができ（Ｔｒ⁰、 Ｔｒ¹、Ｔｒ²、Ｔｒ³）、又は別の場合完全な標的ＤＮＡ配列を含む固体支持体 Ｔｒ⁰をエキソヌクレアーゼを用いて時間制限的方法で処理することによる不均 一反応において順次欠失の組を得ることができる。各時点の３’末端が不均一す ぎて（すなわち“ファジー”）エキソヌクレアーゼ媒介質量分析配列決定により 分析できない場合、この配列決定過程の前に、選択された１つの形質転換コロニ ーを用いて鋳型の環状化及びクローニング段階を行うことができる。 ３末端にそのＡ境界を有する未知の配列を有する１本鎖直鎖状ＤＮＡは、下記 に記載し、図９に略図的に描かれる装置において３’エキソヌクレアーゼにより 、エキソヌクレアーゼが反応器内で例えばビーズ上、フリット上、フリットの上 に位置する膜上、又は毛管のガラス壁上に固定化されるか、あるいはゲルマトリ ックスに捕獲されれば、あるいは単に直鎖状ＤＮＡフラグメントがループ内を循 環する間、反応器内にエキソヌクレアーゼを保つ半透膜により、直接配列決定す ることができる。 時間間隔的に、又は別の場合連続流として、緩衝液及び放出されるヌクレオチ ドを含む反応混合物を質量決定及びヌクレオチド同定のために質量分析器に供給 する。他の実施態様の場合、エキソヌクレアーゼの作用により放出されるヌクレ オチドを含む流れを第２の反応器又は反応器系列に通過させ、それが放出される ヌクレオチドを修飾させる。例えば第２の反応器は固定化アルカリホスファター ゼを含み、通過するヌクレオチドは質量分析器に供給される前にヌクレオシドに 変換される。他の質量−修飾を下記に記載する。 一般に質量修飾されるのが放出されるヌクレオチド（又はリボヌクレオチド） である場合、修飾は可能な限り少ない、及び比較的有効な段階 で行うべきである。例えばオリゴヌクレオチド合成のための塩基保護基の付加に おいて用いられる反応を用い、放出されるヌクレオチドを質量分析の直前に修飾 することができる。例えばアデニン、グアニン又はシトシンのアミノ官能基をア シル化により修飾することができる。アミノアシル官能基は例えばアセチル、ベ ンゾイル、イソブチリル又はアニソイル基であることができる。ピリジンの存在 下においてベンゾイルクロリドはアデニンアミノ基、ならびにデオキシリボース （又はリボース）ヒドロキル基をアシル化することができる。グリコシド結合は 加水分解を受け易いので、アシル反応がこれらの部位において有効でないと糖部 分は選択的に脱アシル化される（すなわち糖の不完全なアシル化から生ずる分子 量の不均一性）。糖部分自身は質量−修飾化学の標的となることができる。例え ば糖部分はアシル化、トリチル化、モノメトキシトリチル化されることができる 。放出されるヌクレオチド（又はリボヌクレオチド）を質量−修飾するための他 の化学は当該技術分野における熟練者に明らかであろう。 他の実施態様において、直鎖状１本鎖ＤＮＡフラグメントを固体支持体に固定 化することができる。これは例えば固体支持体上の官能基への共有結合により、 例えばリガーゼが反応するのに十分な長さのスペーサーを含み、支持体の５’末 端に共有結合する特異的オリゴヌクレオチド配列を介して行うことができる（図 １）。固体結合オリゴヌクレオチド及び直鎖状１本鎖ベクターＤＮＡの５’末端 と部分的に相補的な配列を有する添え木（ｓｐｌｉｎｔ）オリゴヌクレオチドは 、配列決定されるべきＤＮＡを固体支持体に共有結合させる。アニーリングの後 、連結（即ちＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いた）により固体結合オリゴヌクレオ チド及び配列決定されるべきＤＮＡが共有結合により結合する。続いて添え木オ リゴヌクレオチドは温度ジャンプ（ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｊｕｍｐ）及び／ 又はＮａＯＨ処理により除去することができるか、あるいは他の標準的方法を用 いて支持体から洗い流される。直鎖状ＤＮＡ試料を有する固体支持体は、反応器 に移され（図９）、溶液中でエキソヌクレアーゼと接触させられる。示されてい る通り、未知のＤＮＡフラグメントの３’末端が露出されている場合（すなわち 非保護）、３’エキソヌクレアーゼが用いられる。放出ヌクレオチド、又は中間 でアルカリホスファターゼなどの修飾剤と接触する場合は修飾ヌクレオチドは、 上記の通り質量分析法により同定される。他の結合基が本明細書に記載されてお り、さらに他の結合基はここに記載する本発明から当該技術分野における熟練者 には明らかであろう。 固体支持体は多様な材料及び形のもの、例えばシリカゲル、孔制御ガラス（ｃ ｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ）、セルロース、ポリアクリルアミ ド、セファロース、セファデックス、アガロース、ポリスチレン及び他のポリマ ーのビーズ、あるいはポリエチレン、ポリビニリデンフルオリド（ＰＶＤＦ）な どの膜であることができる。固体支持体はガラス又はポリマーで作られた毛管、 ならびにフリットであることもできる。へび毒からのホスホジエステラーゼ、Ｅ ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）からのエキソヌクレアーゼＶＩＩ、Ｂａｌ ３１エキソ ヌクレアーゼ及び例えばＴ４ ＤＮＡポリメラーゼなどのｄＮＴＰの不在下で働 くいくつかのＤＮＡポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性などの種 々の３’エキソヌクレアーゼを用いることができる。 逆転複製起点を有するファージミドベクターを用いる場合、固定化さ れる直鎖状１本鎖ＤＮＡの３’末端にＢ境界が位置し、同一の制限エンドスクレ アーゼ、ハイブリッド形成オリゴデオキシヌクレォチド及び添え木オリゴヌクレ オチドを用いたエキソヌクレアーゼ配列決定に暴露される。本発明の他の実施態 様と同様に、ハイブリッド形成オリゴヌクレオチドはＡ境界の上流のプロモータ ー部位に結合するように設計することもでき、そうすることにより２本鎖プロモ ーターＤＮＡを復帰させることができる。直接、又は５’末端に結合官能基を有 する短い開始オリゴヌクレオチドを用いて、適した特異的ＤＮＡ依存性ＲＮＡポ リメラーゼを用いて転写を開始することができる［Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎ ｚｙｍｏｌｏｇｙ ，ｖｏｌ．１８５，Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃ ｈｎｏｌｏｇｙ（１９９０）；Ｊ．Ｆ．Ｍｉｌｌｉｇａｎ，Ｄ．Ｒ．Ｇｒｏｅｂ ｅ，Ｇ．Ｗ．Ｗｉｔｈｅｒｅｌｌ ａｎｄ Ｏ．Ｃ．Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ，Ｎｕ ｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ．，１５，８７８３ほ９８（１９８７）；Ｃ． Ｐｉｔｕｌｌｅ，Ｒ．Ｇ．Ｋｌｅｉｎｅｉｄａｍ，Ｂ．Ｓｐｒｏａｔ ａｎｄ Ｇ．Ｋｒｕｐｐ， Ｇｅｎｅ， 出願０８／００１，３２３，同上］。ＲＮＡ転写産物は反応器（図９）に移され 、固定化された、又は他の方法で含まれるエキソヌクレアーゼと接触させられる か、あるいはＲＮＡ転写産物に挿入される開始オリゴヌクレオチドの５’官能基 を介して固体支持体に固定化され、次いで溶液中のエキソヌクレアーゼと接触さ せられる。 ＤＮＡ挿入片の長さ（すなわち図１における境界ＡとＢの間のヌクレオチドの 数）に依存して、質量分析エキソヌクレアーゼ配列決定法は１回の実験でＡから Ｂの完全な配列の決定を可能にすることができる。別 の場合、エキソヌクレアーゼ配列決定の前に、標準的方法に従って１組の順次欠 失を調製することができ［例えばＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇy ，Ｖｏｌ．１０１（１９８３）及びＶｏｌ．１５２−１５５（１９８７）：Ｒ． Ｍ．Ｋ．Ｄａｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｓｍｉｄ，１３，３１−４０（１９８ ５）］、図１において段階Ｔｒ⁰〜Ｔｒ³が固定ＤＮＡフラグメントからの質量分 析エキソヌクレアーゼ配列決定反応の異なる時間値、あるいはエキソヌクレアー ゼＤＮＡ／ＲＮＡ質量分析配列決定法のための異なる出発点を示すことができる ようにする。いずれの場合も記載の本発明の原理は、挿入片の全配列を決定でき る方法を提供する。 本発明の他の実施態様において、未知のＤＮＡ配列（標的ＤＮＡ）は２本鎖ク ローニングベクター（図２）に挿入されているか、あるいは例えばＰＣＲ（ポリ メラーゼ連鎖反応）法による場合のように２本鎖の形態で得られる［ＰＣＲ Ｔ ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ，（１９８９），同上］。配列決定されるべきＤＮＡは図２ に示されるようにＮｏｔｅＩ部位に連結されたようなクローニングベクター中に 挿入される。Ａ境界に隣接して他の切断制限エンドヌクレアーゼ部位、例えばＡ ｓｃＩエンドヌクレアーゼ切断部位が位置していることができる。２本鎖環状分 子はＡｓｃＩエンドヌクレアーゼを用いた処理により直鎖状とされ、上記の通り 添え木オリゴヌクレオチド（及びリガーゼ）を用いて固体支持体に連結されるこ とができ、それによりＡｓｃＩ制限部位が復帰される（Ｔｒ⁰ｄｓ及びＴｒ⁰’ｄ ｓ）。固定されていない鎖は、２本鎖ＤＮＡを標準的変性条件に供し、洗浄する ことにより除去することができ、それにより固体支持体に固定化された１本鎖Ｄ ＮＡが生成される（Ｔｒ⁰ｓｓ及び Ｔｒ⁰’ｓｓ）。未知の２本鎖ＤＮＡ配列は支持体にいずれの配向でも連結する ことができるので、２つの同一でなはい固定化された３’末端（十及び−鎖）が 存在し、それは不明確な配列決定データを生ずる。３’末端にベクターＤＮＡ配 列を有する固定化フラグメント（Ｔｒ⁰’ｓｓ）を、例えば保護されるべき鎖の ３’末端と相補的なオリゴデオキシヌクレオチドを用いてアニーリングすること により、配列決定過程の間、３’エキソヌクレアーゼ分解から保護することがで きる。３’末端のみで、すなわち（−）の鎖情報を有する間違った１本鎖ＤＮＡ （Ｔｒ⁰’ｓｓ）にハイブリッド形成が起こるので、ＤＮＡポメラーゼを用いた 処理を介して固定（−）鎖中にいくつかのアルファーチオｄＮＴＰを挿入し、そ の鎖をエキソヌクレアーゼ分解から完全に保護することができる［Ｐ．Ｍ．Ｊ． Ｂｕｒｇｅｒｓ ａｎｄ Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１８ ，５９２（１９７９）；Ｓ．Ｌａｂｉｅｔ，Ｊ．Ｌｅｈｒａｃｈ ａｎｄ Ｒ．Ｓ．Ｇｏｏｄｙ，ＤＮＡ，５，１７３（１９８６）；Ｓ．Ｌａｂｅｉｔ，Ｊ ．Ｌｅｈｒａｃｈ ａｎｄ Ｒ．Ｓ．Ｇｏｏｄｙ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ，Ｖｏｌ．１５５，ｐａｇｅ １６６（１９８７）同上 ］。必要ならエキソヌクレアーゼ抵抗性ヌクレオチドの挿入の後に標準的変性条 件下における洗浄段階によりオリゴヌクレオチドプライマーを除去することがで きる。固定化された１本鎖ＤＮＡは配列決定反応器（図９）移され、３’末端に 未知の配列を有する試料を段階的にエキソヌクレアーゼで分解する。放出された ヌクレオチド、又は場合により修飾されたヌクレオチドは連続的に質量分析器に 供給され、配列が明らかにされる。 上記の通り、挿入ＤＮＡが長すぎて１回のエキソヌクレアーゼ質量分 析配列決定において境界Ａ及びＢ（図２）の間の完全な配列情報が決定できない 場合、例えばエキソヌクレアーゼＩＩＩ消化に対して不活性な制限部位ＲＩＩＩ 生産性３’付着末端を用いるなどの標準的方法に従って１系列の重複した順次欠 失を構築することができる［Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖ ｏｌ １５２−１５５（１９８７）及びＳ．Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｇｅｎｅ，（１ ９８４ ），同上］。必要なら、欠失突然変異体を再環状化し、標準的方法に従っ て宿主細胞を形質転換するのに用いることができる。形質転換された宿主細胞の １つのコロニーを選択し、さらに増殖させ、欠失突然変異体を単離し、上記の方 法と同様にして１本鎖ＤＮＡとして固定し、続いてエキソヌクレアーゼ質量分析 配列決定により分析する。別の場合、固定化された全長１本鎖ＤＮＡ（Ｔｒ⁰ｓ ｓ）を時間制限反応においてＮＴＰの不在下でＴ４ＤＮＡポリメラーゼなどのエ キソヌクレアーゼで処理し、続くエキソヌクレアーゼ質量分析配列決定のための １組の固定化順次欠失を創造することができる。しかし３’末端が直接質量分析 エキソヌクレアーゼ配列決定のために不均一すぎる場合、中間クローニング段階 を含むことができる。さらに別の実施態様において、１本鎖（ｓｓ）核酸フラグ メントを溶液中に与えることによりエキソヌクレアーゼ媒介配列決定を行うこと ができる。これは例えばＴｒ₀ｓｓなどの固体支持体をユニークＡｓｃＩ部位に 相補的なオリゴヌクレオチドで処理することにより行うことができる。ハイブリ ッド形成の後、この部位はこの時２本鎖であり、ＡｓｃＩエンドヌクレアーゼ切 断及び１本鎖フラグメントの放出に感受性である。 ｐＧＥＭ群（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．）の１つなどのクローニン グベクターが用いられる場合、挿入部位にフランキングするどちらの特異的プロ モーターが用いられるか（挿入片のＡ又はＢ境界の隣に位置する）、及び対応す る特異的ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（すなわちＳＰ６又はＴ７ ＲＮＡポ リメラーゼ）に依存して２本鎖標的ＤＮＡの両鎖を別々に転写することができる 。ＲＮＡ転写産物は、固定化又は捕獲エキソヌクレアーゼを用いた質量分析エキ ソヌクレアーゼ配列決定のために直接配列決定反応器（図９）に移される。別の 実施態様において、ＲＮＡ転写産物を続いて固体支持体に固定化することを可能 にする５’官能基を有する開始オリゴヌクレオチドを介して転写過程が開始され る の場合、質量分析配列決定は溶液中のエキソヌクレアーゼを用いて配列決定反応 器内で行うことができる。段階的に放出されるリボヌクレオチド又は修飾リボヌ クレオチド（すなわち固定化アルカリホスファターゼを含む反応器の通過により 生成されるリボヌクレオシド）が配列決定のために質量分析器に供給される。 （ii）多重ヌクレアーゼ配列決定法へのマス−修飾ヌクレオチドの導入 標準的なマススペクトロメトリーは連続的な手法なので、処理量に限界がある 。しかし本発明では配列決定されるＤＮＡまたはＲＮＡ中にマス−修飾ヌクレオ チドを導入することにより処理量をかなり増大させることができ、数種の核酸配 列決定をマススペクトロメトリーにより同時に平行して分析することができる。 Ｈ．Ｋｏｓｔｅｒ、米国特許出願第０８／００１，３２３明細書（同上）を参照 にされたい。低分子量核酸成分（未修飾またはマス−修飾ヌクレオチド／ヌクレ オシドのような）を多マススペクトロメトリーで同時に分析できる。 マス−修飾ヌクレオチドは様々な方法を使用してマス−修飾ヌクレオシド三リ ン酸前駆体により導入することができる。例えば、挿入ＤＮＡのＡおよびＢ境界 にそれぞれ位置する相補的ベクター配列に結合している“プライマー”および“ ストッパー”オリゴヌクレオチド（第３図）、ならびにＤＮＡポリメラーゼに対 する鋳型（好ましくはシークエナーゼ、２．０バージョン（ＵＢバイオケミカル ス：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｔ７ ＤＮＡ ポリメラーゼ由来）、Ｔａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼまたはＡＭＶ逆転写酵素のような３’−５’および５’− ３’エキソヌクレアーゼ活性を欠いたもの）を有することにより、標的ＤＮＡ配 列を一本鎖クローニングベクター中に挿入することから始めることができる。説 明的な態様では、未知のＤＮＡ配列をＮｏｔＩのような制限酵素部位に挿入した 。Ａ境界に隣接して、もう１つの制限エンドヌクレアーゼ部位（ＡｓｃＩ部位の ような）をプライマー結合部位中に、部分的二重鎖環状ＤＮを唯一のＡｓｃＩ部 位で開裂し、そしてマス−修飾（−）鎖（第三図のｔ³）を標準的手法（すなわ ち膜濾過、分子ふるい、ＰＡＧＥまたはアガロース電気泳動）で単離することが でき、そして所望により、Ｔ４ ＤＮＡロガーゼによる連結のためにＡｓｃＩ部 位を二重鎖の状態で保持するスプリントオリゴヌクレオチドを介して固体支持体 に結合させることができるように配置させることができる。スプリントオリゴヌ クレオチドを除去した後、３’末端に（すなわちＴｒ³）そのＢ’境界を持つ固 定化された一本鎖ＤＮＡ断片はエキソヌクレアーゼ媒介マススペクトロメトリー 配列決定の準備できている。別の説明的な態様では、たとえベクターが相補的Ａ ｓｃＩ部位を持たなくても同じプライマーを使用できる。プライマーは第３図に 示すようにその５’末端配列でベク ターにハイブリダイズしないであろうが、それにもかかわらず上記の同じスプリ ントオリゴヌクレオチドを使用して一本鎖マス−修飾ＤＮＡを固体支持体に共有 結合させることができる。さらに別の態様ではプライマーの５’末端に制限酵素 配列情報が無くてもよく、これは反対のベクター配列に相補的であってもなくて もよいが、固体支持体に共有結合できる特定のスプリントオリゴヌクレオチドに 相補的である。後者の２つの方法は制限エキソヌクレアーゼによる開裂および鎖 の分離の必要が無い。 マス−修飾（−）鎖の酵素的合成後に得られた反応混合物を、直接固体支持体 に結合し、環状ベクターＤＮＡおよびストッパーオリゴヌクレオチドを変性条件 下で取り出す。さらに別の態様では標的ＤＮＡ配列情報の１組の順序立った欠失 の作成、なびにマス−修飾ヌクレオチドの組み込みを、ＤＮＡポリメラーゼ反応 を様々な時間間隔（すなわちｔ⁰、ｔ¹、ｔ²、ｔ³、第３図）で終結させることに より組み合わせて、ラダー（ｌａｄｄｅｒ）のマス−修飾（−）鎖を作成できる 。マススペクトロメトリーのエキソヌクレアーゼ配列決定にとって各時間点の３ ’末端が大変異質な場合は、上記の機環状化およびクローニングを含む事ができ る。 第１４Ａおよび１４Ｂ図に示すように、（＋）および（−）鎖の両方を同時に エキソヌクレアーゼ配列決定できる。マス−修飾ヌクレオチドを（＋）または（ −）鎖のいずれかに組み込むことは、上記ののように行うことができる。説明な 態様では、（＋）および（−）鎖の両方を固体支持体に結合し、そして同時にエ キソヌクレアーゼ処理する。（−）鎖にマス−修飾ヌクレオチドが存在すると、 両方の鎖から放出されたヌ クレオチドから生じるマススペクトロメトリー信号を識別できる。エキソヌクレ アーゼ配列決定法が本質的に１つのパス（ｐａｓｓ）中のＡおよびＢ境界の間で 進行する場合、（−）鎖の配列を逆にでき、そして相補配列に配列させることが できる。この方法の利点はあいまいな配列データの同定である（すなわち１つの 鎖の配列誤差から生じる塩基対ミスマッチ）。あるいは、配列決定が各鎖の重複 点に進行すならば、完全な配列は部分的エキソヌクレアーゼ配列決定法により得 ることができる。各配列断片の相補的重複領域を調べ、そし２つの配列断片を整 列することにより１つまたは両方の鎖の残りの配列を、他の既知の配列に基ずき “再構成”できる。この後の実施例では“１パス”中の大変大きなＤＮＡ断片を 配列決定する手段を提供し、１つの鎖だけをエキソヌクレアーゼ配列決定するこ とにより可能になる。 ファジェミド型（例えば、ｐＧＥＭ族、プロメガ社：Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒ ｐ．）のベクターを使用して、未知のＤＮＡ断片の両鎖は、複製のｆ１起源を反 対方向に持つベクターを使用するだけでマス−修飾され得る。 本発明のさらなる態様および上記記載の反応に類似して、両鎖からのＲＮＡ転 写物を、例えば挿入部位の周辺領域を含む転写プロモーター領域を使用して、二 本鎖プロモーター部位を相補的オリゴヌクレオチドにより保存し［Ｍｅｔｈｏｄ ｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ． ｖｏｌ１８５．（１９９０）；Ｕｈｌｅｎｂ ｅｃｋら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，（１９８７），同上］、そし て適当なＲＮＡポリメラーゼによりマス−修飾リボヌクレオシド三リン酸の存在 下で転写することにより得ることができる。上記のように固定化またはトラップ されたエ キソヌクレアーゼを使用することにより、マス−修飾ＲＮＡをマススペクトロメ トリー配列決定のために配列決定反応槽に直接移すことができる。別の態様では 、転写はマス−修飾ＲＮＡを固体支持体に連いて固定化するための５’官能基を 持つ開始オリゴヌクレオチドで始めることができる［Ｋｒｕｐｐら、Ｇｅｎｅ（ １９９２），同上］。後の例では、固定化マス−修飾ＲＮＡを配列決定槽（第９ 図）中で、マススペクトロメトリー配列決定の溶液中のエキソヌクレアーゼと接 触させることができる。 二本鎖ベクター中の未知のＤＮＡ挿入物から始まる固定化された鎖のマス−修 飾は（第４Ａ図）、第２図のＴｒ⁰ｄｓと同様な状況から開始するこにより導入 できる。しかし、５’リン酸化エキソヌクレアーゼIII耐性スプリントオリゴヌ クレオチド（すなわち２’，３’ジデオキシ）は、（−）鎖に連結され、エキソ ヌクレアーゼIIIにより（＋）の一側性消化が行われる（第４Ａ図）。マス−修 飾は次にシークエナーゼ、バージョン２．０（ＵＳバイオケミカルズ）、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼまたはＡＷＶ逆転写酵素のような鋳型依存性ＤＮＡポリメ ラーゼおよび適当なマス−修飾ｄＮＴＰｓを使用するフィリング−イン反応（ｆ ｉｌｌｉｎｇ−ｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）により導入される。別の態様では、第 ２図のＴｒ⁰ｓｓと同様な状況から開始して、（＋）鎖の３’末端でＡ境界の外 側に結合するように設計された（−）プライマーを使用して、上記のようにマス −修飾ｄＮＴＰｓおよびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを使用してマス−修飾 （−）鎖を合成できる。１つの態様では、このプライマーが効果的にハイブリダ イズできるようにＮｏｔＩとＡｓｃＩ部位の間の短い領域（ｓｔｒｅｔｃｈ）が あってもよい。この方法も、 Ｔｒ⁰’ｓｓ（第４Ｂ図）から開始するマス−修飾（＋）鎖を作成することによ り行うことができる。新たに合成された（＋）鎖は（−）鎖固体支持体から、変 性により単離することができ、そしてプライマー、これに相補的な部分であるス プラントオリゴヌクレオチドおよび別の固体支持体にすでに結合しているオリヌ クレオチドの５’配列情報を介して固定化される（第４Ｂ図）。連結後（すなわ ちＴ４リガーゼで）、遊離したマス−修飾ヌクレオチドを介してマススペクトロ メトリー配列決定法のために、スプラントオリゴヌクレオチドを取り出し、そし て固定化マス−修飾一本鎖（＋）ＤＮＡを配列決定槽（第９図）に移し、溶液中 のＴ４ ＤＮＡポリメラーゼのようなエキソヌクレアーゼと接触させる。 本発明によれば、マス−修飾官能基はヌクレオチド部分の様々な位置にあって よい（第５および６図）。さらなる例および合成化学についてはＨ．Ｋｏｓｔｅ ｒ，米国特許出願第０８／００１，３２３号明細書も参照にされたい。例えば、 マス−修飾官能基は複素環塩基のプリンヌクレオチドのＣ−８位（Ｍ１）または ｃ７−デアザプリンヌクレオチドのＣ−８もしくはＣ７（Ｍ２）、ならびにウラ シルおよびシトシンのＣ−５、ならびにチミン残基のＣ−５メチル基（Ｍ−１） に位置することができる。これらの位置での修飾はマス−修飾核酸（ＤＮＡ／Ｒ ＮＡ）中への酵素的取り込みに必要な高い正確さのワトソン−クリック特異的塩 基対合を妨害しない。例えばアルファ−チオヌクレオシド三リン酸のようなホス ホジエステル結合（Ｍ４）で導入された修飾は、これらの修飾が正確なワトソン −クリック塩基−対合を妨害せず、さらに完全な核酸分子の合成後部位特異的１ 段階修飾（例えば、アルキル化反応［Ｋ．Ｌ．Ｎａｋａｍａｙｅ，Ｇ．Ｇｉｓｈ ，Ｆ．ＥｃｋｓｔｅｉｎおよびＨ．− Ｐ Ｖｏｓｓｂｅｒｇ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，１６，９９４７ −５９（１９８８）を介して］を可能にするので有利ある。しかし、この修飾は エキソヌクレアーゼにより放出されたヌクレオチドが固定化アルカリホスファタ ーゼ中間体放出により処理され、マススペクトロメトリーで検出される場合は適 用できない。マス−修飾はまた、糖部分（Ｃ−２’位置のような：Ｍ３）で起こ ってもよい。この位置の修飾は、時折分解工程とシクロナイズするために、エキ ソヌクレァーゼ活性の速度を変調させる目的で導入できる。Ｍ４修飾もこれに役 立つ。例えば、モノチオ官能基を持つホスホジエステル結合は、エキソヌクレア ーゼIIIによるエキソヌクレアーゼ分解に対してて約１００倍感度が低いことが 知られている［ＢｕｒｇｅｒｓおよびＥｃｋｓｔｅｉｎ，（１９７９）、同上］ 。 第７図および８図の表は、ヌクレオチド用のマス−修飾官能基の例を描いてい る。このリストは限定する訳ではないが、ヌクレオチド分子中の他の多くのマス −修飾官能基および位置の組み合わせが可能であるので、それらは本発明中にふ くまれるものと考える。マス−修飾官能基は例えば、ハロゲン、アジドまたはＸ Ｒ型であることができる。式中、Ｘは連結基であり、Ｒはマス−修飾官能基であ る。このようにマス−修飾官能基はヌクレオチド分子中に明らかなマス増分を導 入するために使用できる。 本発明の範囲を限定するわけではないが、マス−修飾ＭはＸＲ中のＸに導入さ れることができ、ならびにＲについてはオリゴー／ポリエチレングリコール誘導 体を使用する。この場合のマス−修飾増分は４４であり、すなわち５種類のマス −修飾種がｍを０から４に変更するだけで作 成することができ、したがって４５（ｍ＝０）、８９（ｍ＝１）、１３３（ｍ＝ ２）、１７７（ｍ＝３）および２２１（ｍ＝４）のマス単位が加わる。オリゴー ／ポリエチレングリコールもメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｔ−ブ チル等のような低アルキルによりモノ置換されることができる。連結官能基Ｘも 第８図に説明するように選択できる。マス−修飾化合物に使用する他の化学は、 例えば最近、オリゴヌクレオチドおよび類似体（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄ ｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ）、実践的方法（Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ）Ｆ，Ｅｃｋｓｔｅｉｎ編集、ＩＲＬ出版、オックスフォード 、１９９１に記載されている。 さらに別の態様では、オリゴー／ポリエチレングリコール以外の様々なマス− 修飾官能基Ｒが選択され、そして適当の連結化学Ｘを介して結合できる。単純な マス−修飾はＨをＦ，Ｃｌ，Ｂｒおよび／またはＩのようなハロゲンに；あるい はＳＣＮ，ＮＣＳのような擬ハロゲンに代えることにより；あるいは様々なアル キル、アリールまたはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｔ−ブチル、 ヘキシル、フェニル、置換フェニル、ベンジルのようなアラルキル部分を使用す ることにより；あるいはＣＨ₂Ｆ、ＣＨＦ₂、ＣＦ₃、Ｓｉ（ＣＨ₃）₃，Ｓｉ（Ｃ Ｈ₃）₂（Ｃ₂Ｈ₅）、Ｓｉ（ＣＨ₃）（Ｃ₂Ｈ₅）₂、Ｓｉ（Ｃ₂Ｈ₅）₃のような官能 基で達成できる。さらに別のマス−修飾はＸを介してヌクレオチドにホモ−また はヘテロペプチドを付加させることにより得られる。５７のマス増分を持つマス −修飾種を作成するのに有用な例は、オリゴグリシンの付加であり、例えば７４ （ｒ＝１，ｍ＝０）、１３１（ｒ＝１，ｍ＝２）、１８８（ｒ＝１，ｍ＝３）、 ２４５（ｒ＝１，ｍ＝４）のマス−修飾 が達成される。単純なオリゴアミドも使用でき、例えば７４（ｒ＝１，ｍ＝０） 、８８（ｒ＝２，ｍ＝０）、１０２（ｒ＝３，ｍ＝０）、１１６（ｒ＝４，ｍ＝ ０）などのマス−修飾が得られる。当業者には多くの様々なマス−修飾官能基を ヌクレオチドに導入するために、数多くの可能性があることが明らかであろう。 さらに別の態様では、マス−修飾官能基は２つ以上の工程により導入すること ができる。この場合ヌクレオチドは、第一工程で、アジド、−Ｎ₃のような前駆 体官能基により修飾されるか、あるいはＸＲ中のＲが例えば限定するわけではな いが、ＯＨ、−ＮＨ２，−ＮＨＲ，−ＳＨ，−ＮＣＳ，−ＯＣＯ（ＣＨ₂）_rＣＯ ＯＨ（_r＝１−２０），−ＮＨＣＯ（ＣＨ₂）_rＣＯＯＨ（ｒ＝１−２０）、−Ｏ ＳＯ₂ＯＨ、−ＯＣＯ（ＣＨ₂）ｒＩ（ｒ＝１−２０）、−ＯＰ（Ｏ−アルキル） Ｎ（アルキル）₂の一時的機能を提供するＨである官能基により修飾される。こ れらの嵩が低い官能基は酵素的ＤＮＡまたはＲＮＡ合成反応により良い基質特性 を生じる。適当なマス−修飾官能基をマススペクトロメトリー前、標的核酸配列 の生成後、ならびにエキソヌクレアーゼ分解前またはエキソヌクレアーゼ活性放 出後に導入することができる。 （iii）エキソヌクレアーゼ配列決定機 エキソヌクレアーゼ配列決定機の概略を第９図に示す。中心部は冷却／加熱マ ントル（２）およびフリットまたは半透膜（４）を有する反応槽Ｓである。数個 のフラスコ（Ｒ１−Ｒ５）を緩衝液、酵素、などが冷却／加熱コイルＴを通って 供給されるように装備することができる。反応槽Ｓの下に、キャピラリーチュー ブＥがあり、この中にエキソヌクレアーゼまたは核酸が固定されている。本発明 の範囲ではこのシステムを 操作できる少なくとも２つの異なる様式がある。１つの様式では、核酸は反応槽 Ｓ中のビーズまたは平坦な膜ディスクに固定化されるか、またはキャピラリーＥ 内の壁の内側表面に固定化される。エキソヌクレアーゼが制御された様式で反応 槽に加えられ、反応混合物は注意深く温度調節され維持されているループを通っ て循環する。第二の様式では、エキソヌクレアーゼが例えば反応槽Ｓの下のキャ ピラリーＥに固定化されるか、またはビーズもしくは膜に固定化されるか、また はゲルにトラップされるか、あるいは半透膜により反応槽Ｓに維持されることが できる。キャピラリーの長さおよび直径ならびにポンプ装置Ｐの流速を変えるこ とにより、核酸とエキソヌクレアーゼが接触する時間を変化させることができる 。 両方の様式で、アリコートは連続的にまたはパルスで、直接的もしくは反応槽 ＡＰ（これは例えば固定化アルカリホスファターゼまたは他のマス−修飾試薬を 含む）を通ってマススペクトロメーターに供給されることができる。マススペク トロメーターに移す液体容量が非常に多い場合は、その一部が供給され、そして 残りは分流機ＳＰにより流れから分離される。未使用または過剰な溶液は廃棄容 器Ｗにより捨てることができる。エキソヌクレアーゼ消化の反応混合物が移動性 ベルトを通過して進行しをている場合は、液流はマススペクトロメーターに入る 前にこのモジュールを直接通過するようにできる。 （iv）エキソヌクレアーゼ配列決定法 様々なエキソヌクレアーゼを使用でき、それには例えばヘビ毒ホスホジエステ ラーゼ、Ｂａｌ−３１ヌクレアーゼ、大腸菌エキソヌクレアーゼVII、マングビ ーンヌクレアーゼ、Ｓ１ヌクレアーゼ、エキソヌクレア ーゼおよびエキソヌクレアーゼIII、ならびに大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｄ ＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片、Ｔ４またはＴ７ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａ ｑ ＤＮＡ ポリメラーゼ、ディープ ベント（Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ）ＤＮＡポ リメラーゼ、およびＶｅｎｔ_rＤＮＡポリメラーゼのようないくつかのＤＮＡポ リメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性がある。これらのエキソヌクレアーゼ活性 をモジュレート（ｍｏｄｕｌａｔｅｄ）することができ、それは例えば最適ｐＨ および／または温度範囲をシフトすることにより、あるいは反応混合物に毒薬を 加えることによる。エキソヌクレアーゼ活性は、ヌクレオチド構造ブロックの糖 部分のＣ−２’の、またはホスホジエステル結合の官能基によってもモジュレー トすることができる（すなわち第５または６図のＭ３／Ｍ４）。 未修飾ヌクレオチドを検出する場合には、リン酸ジアニオンのマスはｐｄＧに ついては３２９，２０９、ｐｄＡについては３１３，２１０、ｐｄＴについては ３０４，１９６、そしてｐｄＣについては２８９，１８５である。理想的なシス テムでは酵素消化はすべての核酸鎖で同時に始まり、そしてヌクレオチドが同一 の時間間隔ｄで放出され、そしてマススペクトロメーターにより次々とそれらの 個別の分子量が検出される。第１０図は配列５’．．．Ａ−Ｔ＊−Ｃ−Ｃ−Ｇ− Ｇ−Ａ３’について、時間に対する信号を説明している。 適当に修飾されたチミジンＴ＊について、官能基Ｍ３／Ｍ４をモジュレートす る活性の影響も描かれている。ｄＣとｄＴ＊の間のホスホジエステル結合の開裂 速度が劇的に減少しているので、Ｔ＊信号が表す分子マスは長時間間隔ｆの後に 現れる。１種類のヌクレオチドの開裂速度が有意に遅くなると、結果として酵素 工程の全体の同調がより良いものに なる。この遅延効果は修飾官能基の嵩ならびにエキソヌクレアーゼの活性部位と 相互反応する可能性により、かなり大きな程度にまで変化することができる。さ らに部分的に重複する信号は計算法により解像できる。 （v）多重エキソヌクレアーゼ配列決定： 多重エキソヌクレアーゼ配列決定の原理を用いることによって、処理量のかな りの増加を更に得ることができる。この概念の原理を図１１中に示す。多重質量 分析のエキソヌクレアーゼＤＮＡ配列決定のためには、平行して処理すべきＤＮ Ａフラグメントは、マス−修飾官能価Ｍによって導入されるフラグメントの特定 のラベルによって同定することができる。標的核酸配列は、例えば、未修飾ｄＮ ＴＰ⁰又はＮＴＰ⁰（Ｔｒ０）、同じ官能基、例えば複素環式塩基における付加的 なメチル基によってマス−修飾されたヌクレオシドトリホスフェートを使用する ことによって、ｄＮＴＰ¹又はＮＴＰ¹（Ｔｒ０）のどちらか、Ｔｒ０又はＴｒ１ のヌクレオチドから区別するのに十分に大きな質量差、例えば複素環式塩基にお けるエチル基を使用することによって、ｄＮＴＰ²又はＮＴＰ²のどちらかを用い ることによってなどでマス−修飾することができる。かくしてｉ修飾されたＤＮ Ａフラグメントは、同時にエキソヌクレアーゼ配列することができる。例えば、 ｉが異なるＤＮＡフラグメントは、異なる膜の上に固定することができ、そして このような複数の膜を反応器Ｓ（図９）中に設置し同時エキソヌクレアーゼ質量 分析配列法定することができる。種々のマス−修飾された４種のヌクレオチドの 個々の分子量は予め知られているので、質量分析で検出されたヌクレオチド質量 は、親の核酸フラグメントに容易に割り当てることができ、かくして数個の配列 を質量分析計によって同時に検出することができる。同じヌクレオチド［例えば ｄＴがすべての配列において同じ位置にある］が平行して処理される時のような 最悪の場合においてさえも、信号は、ｄＴ⁰、ｄＴ¹、ｄＴ²、ｄＴ³、．．．、ｄ Ｔ¹の間の質量の差によって解読するこ とができる。 エキソヌクレアーゼ作用の同期化は、修飾ヌクレオチド（Ｃ−２’で又はホス ホジエステル結合で修飾された）をさもなければ未修飾の又はマス−修飾された 核酸フラグメント中に上で述べたようにして組み入れることによって改善するこ とができる。特に、このようなマス−修飾されたヌクレオチドはまた、一本鎖核 酸フラグメントの３’の端（即ち、Ｃ−２’又はホスホジエステル結合修飾）に おいて導入して、エキソヌクレアーゼ反応の一層均一な開始を達成することがで きる。 本発明のなおもう一つの態様においては、隣接信号の重なりの減少を、図１２ 中に図式的に示したような移動ベルト装置を使用することによって達成すること ができる。最近の刊行物において、全く無関係の用途においてではあるけれども 移動ベルトが公表されている［Ｍ．Ｍｏｉｎｉ及びＦ．Ｐ．Ａｂｒａｍｓｏｎ，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，２０，３０８〜 １２（１９９１）］。移動ベルトの効果は、図１３中に示されたような順次放出 されたヌクレオチド／ヌクレオシド信号の出現をむらなく分散させるのを助ける ことである。引き続く、即ち隣接する信号の間の幅は、移動ベルトの速度と共に 増加され得る。 本発明の範囲を限定するものではないが、、図１２は、エキソヌクレアーゼ媒 介された質量分析の配列決定のための移動ベルトモジュールの可能な形態を示す 。エンドレス金属リボン（１０）は、制御可能なステッピングモーター及び適切 に位置付けられたプーリーを使用して可変速度で駆動される。バネで荷重された プーリーは、移動ベルトに十分に高い張力を維持するために使用することができ る。サンプルは、冷却／加熱 プレートＢと直接接触する位置で反応器モジュールＡ（図９）からベルトに付与 される。マトリックスで補助されたレーザー脱着／イオン化質量分析法を用いる 場合には、サンプルは、ベルトの上に積載するのに先立ってマトリックス溶液Ｍ と混合することができる。結晶形成は、視検装買Ｄ（ＣＣＤカメラ及び光学装置 ）によって観察することができる。その代わりに、混合バルブ又は渦巻き（１２ ）においてサンプルを希釈剤又はその他の薬剤、酵索、内部標準などと混合する ために、容器Ｍを使用することができる。比較的小さな分子、例えば解放された ヌクレオチドの場合には、レーザー脱着／イオン化方法を行うためにはマトリッ クスは必須ではない。ベルト１０は、脱着及びイオン化のためにサンプルをレー ザーソースＥ（適切な光学装置を有する）の下に移動させる。 加熱要索Ｃ、例えばマイクロ波ソースを、断熱遮蔽物Ｉによって前進移動ベル トから分離された戻りベルトの表面の近くに置いて、新しいサンプルを堆積する のに先立って金属リボンベルト１０の表面からあり得る有機物質を清掃すること ができる。その代わりに、洗浄ステーションＷを加熱要素Ｃの前に一体化するこ とができる。この場合には、加熱要素Ｃの機能は、サンプルの再堆積に先立って 金属リボンを完全に乾かすことで良い。レーザーがサンプルを標的にする前及び 後に、二つの差動真空ポンプ段階Ｆ及びＧを位置付ける。第二真空段階の後で、 イオンを質量分折計中に加速するために電場を印加する。質量分析計として四重 極を使用することができるが、当該技術においては他の質量分析装置も知られて いてそして本発明の範囲内にある。大気圧であるサンプル付与区画と質量分析計 との間の移動ベルトの真空界面のデザインは重要である可能性がある。一つの手 法においては、この真空シールは、前に述べ た［上で引用したＭｏｉｎｉら（１９９１）］ように二段階真空ロックにおける トンネルシールの使用によって与えることができる。 上で述べたように、多重化によって処理量の増加を得ることができる。本発明 のなおもう一つの態様においては、ｓサンプルをｓ配列決定反応器Ａ（図９）か ら移動ベルトの上に同時に異なる場所に付与することによって、移動ベルト装置 を多重化における第二次元のために使用することができる。これらの多重サンプ ルの脱着及びイオン化は、レーザービームを調節可能な速度及び周波数で移動ベ ルトの方向に垂直に前後に移動させることによって達成される。検出されたヌク レオチド／ヌクレオシドの種々の核酸フラグメントへの同定及び割り当ては、第 二次元多重化によって、即ち、核酸フラグメントを例えば−ＣＨ₂−、−ＣＨ₂Ｃ Ｈ₂−、−ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂−及び−ＣＨ₂（ＣＨ₂）_rＣＨ₂−によって質量ラベル し、そして異なる反応器を例えば、個々のハロゲン原子によってラベルすること によって、即ち、反応器１にはＦ（かくして−ＣＨ₂Ｆ、−ＣＨ₂ＣＨ₂Ｆ、−Ｃ Ｈ₂ＣＨ₂ＣＨ₂Ｆ、−ＣＨ₂（ＣＨ₂）_rＣＨ₂Ｆによってラベルされた異なるＤＮ Ａフラグメントを有する）、反応器２にはＣｌ（かくして−ＣＨ₂Ｃｌ、−ＣＨ₂ ＣＨ₂Ｃｌ、−ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂Ｃｌ及び−ＣＨ₂（ＣＨ₂）_rＣＨ₂Ｃｌによってラ ベルされた異なるＤＮＡフラグメントを有する）、反応器３にはＢｒなどによっ て達成することができる。これは、処理量を劇的に増加させることができる。二 次元多重化は異なるやり方で付与することもできる。例えば、それは、同じ長さ のＤＮＡ挿入物の一組の重なる欠失（ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ）を生成させるフラグ メントを同時に配列するために使用することができる。もう一つの実施態様にお いては、異なるＤＮＡ挿入物の順序付けられた欠 失の幾つかの部分組を平行して分析することができる。 エキソヌクレアーゼで媒介された質量分折のＤＮＡ配列決定の非常に大きな利 点は、質量分析法によって小さな分子が分析されそして同定されることである。 この質量領域においては、質量分析計の精度は日常的に非常に高く、即ち、０． １質量単位が容易に検出される。質量における小さな差を検出しそして分解する ことができるので、これは多重化のための潜在力を増加させる。質量分析の配列 決定の付加的な利点は、同定された質量をコンピューターによってそして配列に 自動的に割り当てられた時間座標を加えることによって自動的に記録することが できることである。このようにして決定された配列は記憶される（即ち、コンピ ューターメモリー中のディスク又はレジデントに保管される）ので、多重タスク の環境において作動する適切な現存のコンピュータープログラムは、重なりを探 して“背景”（即ち、エキソヌクレアーゼ質量分析の配列決定器による新しい配 列データの連続的な発生の間に）の中をサーチすることができ、そして配列デー タバンクへの結合によって相同サーチなどにおいて使用することができる連続し た配列情報を発生させる。本発明のもう一つの面は、上で述べた配列決定反応物 の組み合わせを含む、エキソヌクレアーゼ質量分析法によって核酸を配列決定す るためのキットに関する。例えば、一つの態様においては、このキットは数個の 異なる種の核酸の多重質量分析の配列決定のための試薬を含む。このキットは、 核酸を最初の末端から一方向的に（ｕｎｉｌａｔｅｒａｌｌｙ）開裂させて順次 に個々のヌクレオチドを放出するためのエキソヌクレアーゼ、核酸の異なる種を 合成するための一組のヌクレオチド［ここで、ヌクレオチドの少なくとも一部は 、核酸の異なる種の各々の順次に放出 されたヌクレオチドが識別可能であるようにマス−修飾されている］、相補的な 鋳型及び一組のヌクレオチドから核酸を合成するためのポリメラーゼ、並びに核 酸の一つ又はエキソヌクレアーゼを固定するための固体支持体を含むことができ る。このキットはまた、適切な緩衝液、並びに多重質量分析法を実施して核酸の 多種多様な種を同時に配列決定するための指示書を含むことができる。もう一つ の態様においては、配列決定キットは、標的核酸を最初の末端から一方向的に開 裂させて個々のヌクレオチドを順次に放出するためのエキソヌクレアーゼ、核酸 の異なる種を合成するための一組のヌクレオチド［ここで、ヌクレオチドの少な くとも一部は、エキソヌクレアーゼの活性を調節するためにマス−修飾されてい る］、相補的な鋳型及び一組のヌクレオチドから核酸を合成するためのポリメラ ーゼ、並びに核酸の一つ又はエキソヌクレアーゼを固定するための固体支持体を 含むことができる。 本発明のもう一つの面は、質量分析法によって検出可能なネステッド消化（ｎ ｅｓｔｅｄ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）フラグメントのラダーを製造するために核酸 のエキソヌクレアーゼ消化を使用する“逆サンガー”タイプの配列決定方法に関 する。例えば、上のように、標的核酸は、固体支持体に固定してエキソヌクレア ーゼの作用による鎖の一方向的な分解を与えることができる。エキソヌクレアー ゼの活性を抑制する（即ち、個々の核酸鎖を更なる分解から保護する）マス−修 飾されたヌクレオチドの限られた数を標的核酸中に組み入れることは、ネステッ ドエキソヌクレアーゼフラグメントのラダーをもたらすことができる。Ｌａｂｅ ｉｔら（１９８６）ＤＮＡ ５：１７３、Ｅｅｋｓｔｅｉｎら（１９８８）Ｎｕ ｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１６ ：９９４７、及びＰＣＴ出願 第ＧＢ８６／００３４９号を参照せよ。次に、ネステッドエキソヌクレアーゼフ ラグメントを固体支持体から放出（即ち、開裂可能な結合によって）することが でき、そしてネステッドフラグメントの各々の種に関する分子量の値を、米国特 許出願第０８／００１，３２３号中で述べられたようにして、質量分析法によっ て測定することができる。測定された分子量の値から、核酸の配列を画くことが できる。この反応の多くの変形例が可能であること、及びそれは多重化しやすい ことが明らかである。例えば、標的核酸を固体支持体に結合させる必要はなく、 むしろ一方向的なエキソヌクレアーゼ分解を保証するために任意の保護基を使用 することができる。質量分析法によって差別化されるのに十分に大きな分子量の 差を有する（即ち、特定のマス−修飾されたヌクレオチドに関する鎖の停止がす べての他の停止と識別可能である）マス−修飾されたヌクレオチドを使用する場 合には、エキソヌクレアーゼ配列決定は、ただ一組のネステッドフラグメントを 作り出すために実施することができる。別法として、個々のタイプのエキソヌク レアーゼ抑制ヌクレオチドを、何組かのネステッドフラグメントを作り出すため に別の反応に組み入れることができる。例えば、一組はマス−修飾されたＡで停 止し、一組はマス−修飾されたＧで停止するなどの４組のネステッドフラグメン トを別々に発生させることができ、そして全配列、を、ネステッドエキソヌクレ アーゼフラグメントの集合を整列させることによって決定する。 実施例１ジスルフィド結合を介しての固体支持体への核酸の固定化 固体支持体として、フェニルイソチオシアネート基を有するＳＥＱＵＥＬＯＮ 膜（Millipore Corp.，Bedford，MA）を出発物質として使用する。直径８ｍｍを 有する膜ディスクをＮ−メチルモルホリン／水／２−プロパノールの溶液（ＮＭ Ｍ溶液）（２／４９／４９；ｖ／ｖ／ｖ）で湿らし、過剰の液体を濾紙で除去し 、そして５５℃に設定した加熱ブロック上に位置するプラスチックフィルムの試 験片又はアルミニウム箔上に載せる。ディスク１枚当たり、ＮＭＭ中の１ｍＭの ２−メルカプトエチルアミン（システアミン）又は２，２’−ジチオ−ビス（エ チルアミン）（シスタミン）又はＳ−（２−チオピリジル）−２−チオ−エチル アミン（１０μｌ，１０ミリモル）の溶液を添加し、そして５５℃に加熱した。 １５分間後に、ディスク１枚当たり、１０μｌのＮＭＭ溶液を添加し、そしてさ らに５分間加熱した。過剰のイソチオシアネート基は、ＮＭＭ溶液中の１０ｍＭ のグリシンの１０μｌの溶液を用いる処理により除去できる。シスタミンの場合 には、１５分間室温で１Ｍの水性ジチオトレイトール（ＤＴＴ）／２−プロパノ ール（１：１，ｖ／ｖ）の１０μｌの溶液を用いてディスクを処理する。次いで 、各回１ｍｌのＮＭＭ溶液の５つのアリコートを次に１ｍｌのアセトニトリル／ 水（１：１，ｖ／ｖ）の５つのアリコートを用いて、ディスクを徹底的に洗浄し た後、乾燥した。直ちに使用しない場合には、ディスクを、１Ｍの水性ジチオト レイトール／２−プロパノール（１：１，ｖ／ｖ）中の遊離チオ基を用いて貯蔵 し、使用前に各回１ｍｌのＮＭＭ溶液で３回洗浄してＤＴＴを除去する。５’− ＳＨ官能基を有する１本鎖の核酸断片は種々の方 法で調製できる［例えばB．C．F Chu et al.，Nucl eic Acids Res.，14，5591- 5603（1986），Sproat et al.，Nucleic Acids Res.，15，4837-48（1987）and Oligonucleotides and Analogues．Approach（F．Eckstein editor），IRL Pres s Oxford，1991］。 次に、５’−チオール基を有する１本鎖の核酸断片を、穏やかな酸化条件下で 、チオール化膜支持体に結合させる。一般に、チオール化膜支持体に、１０μｌ の１０ｍＭの脱気した酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液（ＴＥＡＡ）、ｐＨ７ ．２、に溶解した５’−チオール化核酸断片を添加するだけで十分であり、冷送 風機を用いて膜ディスク上で試料を乾燥することにより結合が達成される。この 工程は、前記のとおりに、１０μｌの１０ｍＭのＴＥＡＡ緩衝液、ｐＨ７．２、 で膜を湿らしそして乾燥することにより、繰返すことができる。２−チオピリジ ル誘導化合物を用いる場合には、定着（anchoring）は、３４３ｎｍでのピリジ ン−２−チオンの解放を分光測定することによりモニターできる。 このアプローチの別の変法では、標準手法により、１本鎖の核酸の５’−末端 はアミノ基で官能基修飾される。１級アミノ基は３−（２−ピリジルジチオ）プ ロピオン酸 Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステル（ＳＰＤＰ）と反応し、次 いでチオール化支持体に結合し、そして前述のようにピリジル−２−チオンの解 放によりモニターされる。残存するタンパク質の変性そして官能基修飾核酸のエ タノール沈殿の後、ペレットを１０μｌの１０ｍＭのＴＥＡＡ緩衝液、ｐＨ７． ２に溶解し、そして１０ｍＭのＴＥＡＡ中の２ｍＭのＳＰＤＰの１０μｌの溶液 を添加する。反応混合物を渦巻状に攪拌しそして３０分間２５℃でインキュベー トする。次に、過剰のＳＰＤＰを各回５０μｌのエタノールで３回抽 出（渦巻状の攪拌、遠心）して除去し、そして得られたペレットを１０μｌの１ ０ｍＭのＴＥＡＡ緩衝液、ｐＨ７．２に溶解し、そしてチオール化支持体に結合 する（上記参照）。 固定化核酸は、１０ｍＭのＴＥＡＡ緩衝液、ｐＨ７．２中の各回１０μｌの１ ０ｍＭの２−メルカプトエタノールを用いて３回連続的に処理することにより、 解放できる。 実施例２レブリニル基を介しての固体支持体への核酸の固定化 ９−フルオレニルメチル Ｎ−サクシンイミジル カーボネートを使用しＦｍ ｏｃ基を用いて、５−アミノレブリン酸の１級アミノ基を保護し、次いで標準条 件下でＮ−ヒドロキシサクシンイミドとジシクロヘキシルカルボジイミドを用い てＮ−ヒドロキシサクシンイミドエステル（ＮＨＳエステル）に変換する。５’ −末端が１級アミノ基で官能基修飾された核酸を、ＥｔＯＨで沈殿させ、そして １０μｌの１０ｍＭのＴＥＡＡ緩衝液、ｐＨ７．２に再懸濁させ、１０ｍＭのＴ ＥＡＡ緩衝液中の１０μｌの２ｍＭのＦｍｏｃ−５−アミノレブリニル−ＮＨＳ エステルの溶液を添加し、渦巻状に攪拌しそして３０分間２５℃でインキュベー トする。過剰の試薬類はエタノール沈殿及び遠心で除去できる。Ｎ，Ｎ−ジメチ ルホルムアミド／水（１：１，ｖ／ｖ）中の１０μｌの２０％ピペリジンの溶液 中でペレットを再懸濁させて、Ｆｍｏｃ基を開裂する。２５℃で１５分間、各回 １００μｌのエタノールを用いて３回の沈殿／遠心によりピペリジンを徹底的に 除去する。ペレットを１０μｌのＮ−メチルモルホリン、プロパノール−２及び 水の（２／１０／８８；ｖ／ｖ／ｖ）の１０μｌの溶液に再懸濁し、そしてイソ チオシアネート基を 担持する固体支持体に結合する。ＤＩＴＣ−Ｓｅｑｕｅｌｏｎ膜（Millipore Co rp.，Bedford，MA）の場合には、膜は実施例１の記載の通りに調製され、そして 結合は、上述のように５５℃で加熱ブロック上で達成される。この手法は同様の 様式でイソチオシアネート基を有する他の固体担体にも適用できる。 固定化核酸は、１０μｌの１００ｍＭの酢酸ヒドラジニウム緩衝液、ｐＨ６． ５を用いて３回連続的に処理することにより固体支持体から解放できる。 実施例３トリプシン感受性結合を介しての固体支持体への核酸の固定化 直径８ｍｍのＳｅｑｕｅｌｏｎ ＤＩＴＣ膜ディスク（Millipore Corp.，Bed ford，MA）を、１０μｌのＮＭＭ溶液（Ｎ−メチルモルホリン／プロパノール− ２／水；２／４９／４９；ｖ／ｖ／ｖ）で湿らし、そしてＮＭＭ中の１０μｌの １０ｍＭの１，６−ジアミノヘキサンの溶液との反応により、結合アーム（link er arm）を導入する。１００μｌのＮＭＭ溶液で３回の洗浄工程により過剰のジ アミンを除去する。標準ペプチド合成プロトコールを使用して、Ｎ−Ｆｍｏｃ− Ｎ−ｔＢｏｃ−Ｌ−リシン ペンタフルオロフェニルエステルを用いる２つの連 続的な縮合により、２つのＬ−リシン残基を結合させる。末端のＦｍｏｃ基を、 ＮＭＭ中のピペリジンを用いて除去し、そして遊離ε−アミノ基を１，４−フェ ニレン ジイソチオシアネート（ＤＩＴＣ）に結合させる。過剰のＤＩＴＣを、 各回１００μｌのプロパノール−２を用いて３回の洗浄工程で除去し、そして標 準ペプチド合成プロトコールに従い、Ｎ−ｔＢｏｃ基をトリフルオロ酢酸で除去 する。５’−末端での１級アミノ基か ら上述のようにして核酸を調製する。エタノールで沈殿させたペレットを、１０ μｌのＮ−メチルモルホリン／プロパノール−２／水（２／１０／８８；ｖ／ｖ ／ｖ）の溶液に再懸濁し、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−ＤＩＴＣ膜ディスクに移し、そして ５５℃に設定した加熱ブロック上で結合させた。乾燥後、１０μｌのＮＭＭ溶液 を添加し、そして乾燥工程を繰返した。 固定化核酸は、トリプシンを用いる処理により、固体支持体から解放できる。 実施例４ピロリン酸結合を介しての固体支持体への核酸の固定化 ＤＩＴＣ Ｓｅｑｕｅｌｏｎ膜ディスク（直径８ｍｍのディスク）を、実施例 ３の記載どおりに調製し、ＮＭＭ溶液中の１０μｌの１０ｍＭの３−アミノピリ ジン アデニン ジヌクレオチド（ＡＰＡＤ）（Ｓｉｇｍａ）の溶液を添加した 。過剰のＡＰＡＤを１０μｌのＮＭＭ溶液で洗浄して除去し、そしてディスクを 、１０μｌの１０ｍＭの過ヨウ素酸ナトリウムで処理する（１５分間、２５℃） 。過剰の過ヨウ素酸塩を除去し、５’−末端に１級アミノ基を有するものを１０ μｌのＮ−メチルモルホリン／プロパノール−２／水（２／１０／８８；ｖ／ｖ ／ｖ）の溶液に溶解し、そして固定化ＮＡＤアナログの２’，３’−ジアルデヒ ド官能基に結合した。 固定化核酸は、３７℃で１５分間、１０ｍＭのＴＥＡＡ緩衝液、ｐＨ７．２中 のＮＡＤアーゼ又はピロホスファターゼを用いる処理により固体支持体から解放 できる。 実施例５グリシン残基を用いて複素環塩基のＣ−５をマス修飾したピリミジンヌクレオチ ドの合成 出発物質は、文献ノ手法［Haralambidis et al.，Nucleic Acids Res.，15，4 857-76（1987）］に従い、調製されそして３’，５’−Ｏ−脱アシル化した５− （３−アミノプロピニル−１）−３’，５’−ジ−ｐ−トリルデオキシウリジン である。０．２８１ｇ（１．０ミリモル）の５−（３−アミノプロピニル−１） −２’−デオキシウリジンを、６０分間、室温で、０．１２９ｇ（１ミリモル； １７４μｌ）のＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンの存在下で、５ｍｌの無水 Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中の０．９２７ｇ（２．０ミリモル）のＮ−Ｆｍ ｏｃ−グリシン ペンタフルオロフェニルエステルと反応させる。溶媒をロータ リーエバポレーションで除去し、そして生成物をシリカゲルクロマトグラフィー （Kieselgel 60，Merck;カラム：２．５ ｘ ５０ｃｍ，クロロホルム／メタノ ール混合液で溶離）で精製する。収率０．４４ｇ（０．７８ミリモル，７８％） 。別のグリシン残基を加えるために、ＤＭＦ中のピペリジンの２０％溶液で２０ 分間処理してＦｍｏｃ基を除去し、減圧下蒸発させ、そして残存する固体物質を ２０ｍｌの酢酸エチルで３回抽出する。残存する酢酸エチルを除去した後、Ｎ− Ｆｍｏｃ−グリシン ペンタフルオロフェニルエステルを上述のように結合する 。化学的ＤＮＡ合成のための、このグリシン修飾チミジンアナログ構築ブロック は標的核酸中のチミジン又はウリジンヌクレオチドの代替として使用できる。 実施例６β−アラニン残基を用いて複素環塩基のＣ−５をマス修飾したピリミジ ンヌクレオチドの合成 出発物質は実施例５と同一である。０．２８１ｇ（１．０ミリモル）の５−（ ３−アミノプロピニル−１）−２’−デオキシウリジンを、６０分間、室温で、 ０．１２９ｇ（１７４μｌ；１ミリモル）のＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミ ンの存在下で、５ｍｌのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中のＮ−Ｆｍ ｏｃ−β−アラニン ペンタフルオロフェニルエステル（０．９５５ｇ，２．０ ミリモル）と反応させる。溶媒を除去し、そして生成物を実施例５に記載のよう にシリカゲルクロマトグラフィーで精製する。収率０．４２５ｇ（０．７４ミリ モル，７４％）。Ｆｍｏｃ基の除去後に、まったく同様にして別のβ−アラニン 部分を加えることができる。この構築ブロックは標的核酸中のチミジン又はウリ ジン残基の代替となることができる。 実施例７エチレングリコールモノメチルエーテルを用いて複素環塩基のＣ−５をマス修飾 したピリミジンヌクレオチドの合成 ヌクレオシド成分として５−（３−アミノプロピニル−１）−２’−デオキシ ウリジンを本実施例に用いる（実施例５及び６参照）。マス修飾官能基は次のよ うにして得られる：５０ｍｌの無水ピリジン中に溶解した新たに蒸留した７．６ １ｇ（１００．０ミリモル）のエチレングリコールモノメチルエーテルを、一夜 、室温で、１．２２ｇ（１０．０ミリモル）の４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリ ジンの存在下で、１０．０１ｇ（１００．０ミリモル）の再結晶した無水コハク 酸と反応させる。水（５．０ｍｌ）を添加して反応を停止し、反応混合物を減圧 下で蒸発させ、乾燥トルエン（各回２０ｍｌ）で２回同時蒸発させ、そして残渣 を１００ｍｌのジクロロメタンに再溶解する。１０％のクエン酸水溶液（２ ｘ ２ｍｌ）で２回そして水（２０ｍｌ）で１回連続的に抽出し、そして有機相を 無水硫酸ナトリウムで乾燥する。有機相を減圧下で蒸発させ、残渣を５０ｍｌの ジクロロメタンに再溶解しそして５００ｍｌのペンタン中に沈殿させ、そして沈 殿物を減圧下で乾燥する。収率：１３．１２ｇ（７４．０ミリモル；７４％）。 ８．８６ｇ（５０．０ミリモル）のサクシニル化したエチレングリコールモノメ チルエーテルを５％の乾燥ピリジン（５ｍｌ）を含む１００ｍｌのジオキサンに 溶解し、そして６．９６ｇ（５０．０ミリモル）の４−ニトロフェノール及び１ ０．３２ｇ（５０．０ミリモル）のジシクロヘキシルカルボジイミドを添加し、 そして反応を室温で４時間行う。ジシクロヘキシル尿素を濾過にて除去し、濾液 を減圧下で蒸発させ、残渣を５０ｍｌの無水ＤＭＦに再溶解する。１２．５ｍｌ （約１２．５ミリモルの４−ニトロフェニルエステル）のこの溶液を使用して、 ２．８１ｇ（１０．０ミリモル）の５−（３−アミノプロピニル−１）−２’− デオキシウリジンを溶解する。室温で一夜、１．０１ｇ（１０．０ミリモル；１ ．４ｍｌ）のトリエチルアミンの存在下で反応を実施する。反応混合物を減圧下 で蒸発させ、トルエンで同時蒸発させ、ジクロロメタンに再溶解し、そしてジク ロロメタン／メタノール混合液を用いてシリカゲル（Si60，Merck；カラム４ ｘ ５０ｃｍ）上でクロマトグラフする。所望の化合物を含む画分を回収し、蒸 発させ、２５ｍｌのジクロロメタンに再溶解し、そして２５０ｍｌのペンタン中 に沈殿させる。 実施例８ジエチレングリコールモノメチルエーテルを用いて複素環塩基のＣ−５ をマス修飾したピリミジンヌクレオチドの合成 ヌクレオチド出発物質は既述の実施例のように５−（３−アミノプロピニル− １）−２’−デオキシウリジンである。マス修飾した官能基を実施例７と同様に して得る。５０ｍｌの無水ピリジンに溶解した新たに蒸留した１２．０２ｇ（１ ００．０ミリモル）のジエチレングリコールモノメチルエーテルを、一夜、室温 で、１．２２ｇ（１０．０ミリモル）の４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（ ＤＭＡＰ）の存在下で、１０．０１ｇ（１００．０ミリモル）の再結晶した無水 コハク酸と反応させる。後処理は実施例７と同様である。収率：１８．３５ｇ（ ８２．３ミリモル；８２．３％）。実施例７に記載のように、１１．０６ｇ（５ ０．０ミリモル）のサクシニル化したジエチレングリコールモノメチルエーテル を４−ニトロフェニルエステルに変換し、そして引き続き１２．５ミリモルを２ ．８１ｇ（１０．０ミリモル）の５−（３−アミノプロピニル−１）−２’−デ オキシウリジンと反応させる。シリカゲルカラムクロマトグラフィー及びペンタ ン中での沈殿後の収率：３．３４ｇ（６．９ミリモル；６９％）。 実施例９グリシンを用いて複素環塩基のＣ−８をマス修飾したデオキシアデノシンの合成 出発物質は、文献［Singh et al.，Nucleic Acids Res.，18，3339-45（1990 ）］に従って調製したＮ−６−ベンゾイル−８−ブロモ−５’−Ｏ−（４，４’ −ジメトキシトリチル）−２’−デオキシアデノシンである。６３２．５ｍｇ（ １．０ミリモル）のこの８−ブロモ−デオキシアデノシン誘導体を５ｍｌの無水 エタノールに懸濁し、そして２４１． ４ｍｇ（２．１ミリモル；３６６μｌ）のＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン の存在下で、２５１．２ｍｇ（２．０ミリモル）のグリシンメチルエステル（塩 酸塩）と反応させ、そして薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）でチェックしなが らヌクレオシド出発物質が消失するまで（４〜６時間）還流する。溶媒を蒸発さ せ、そして残渣を、０．１％ピリジンを含むクロロホルム／メタノールの溶媒混 合物を用いてシリカゲルクロマトグラフィー（カラム：２．５ ｘ ５０ｃｍ） で精製する。生成物の画分を併合し、溶媒を蒸発させ、５ｍｌのジクロロメタン に溶解し、そして１００ｍｌのペンタン中で沈殿させる。収率：４８７ｍｇ（０ ．７６ミリモル；７６％）。 実施例１０グリシルグリシンを用いて複素環塩基のＣ−８をマス修飾したデオキシアデノシ ンの合成 この誘導体は実施例９のグリシン誘導体と同様にして調製する。６３２．５ｍ ｇ（１．０ミリモル）のＮ−６−ベンゾイル−８−ブロモ−５’−Ｏ−（４，４ ’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシアデノシンを５ｍｌの無水エタノー ルに懸濁し、そして２４１．４ｍｇ（２．１ミリモル；３６６μｌ）のＮ，Ｎ− ジイソプロピルエチルアミンの存在下で、３２４．３ｍｇ（２．０ミリモル）の グリシル−グリシンメチルエステルと反応させる。混合物を還流し、そして反応 の完了をＴＬＣでチェックする。後処理及び精製は実施例９に記載されるのと同 様である。シリカゲルカラムクロマトグラフィー及びペンタン中での沈殿後の収 率：４６４ｍｇ（０．６５ミリモル；６５％）。 実施例１１エチレングリコールモノメチルエーテル残基を用いて糖部分のＣ−２ ’をマス修 飾したデオキシチミジンの合成 出発物質は、文献［例えば、Verheyden et al.，J．Org．Chem.，36，250-254 （1971）；Sasakietal.，Org．Chem.，41，3138-3143（1976）；Imazawa et al. ，J．Org．Chem.，44，2039-2041（1979）；Hobbs et al.，J．Org．Chem.，42 ，714-719（1976）；Ikehara et al.，Chem.，Pharm．Bull．Japan．26，240-24 4（1978）；国際公開88/00201号も参照］に従って合成した５’−Ｏ−（４，４ −ジメトキシトリチル）−２’−アミノ−２’−デオキシチミジンである。５’ −Ｏ−（４，４−ジメトキシトリチル）−２’−アミノ−２’−デオキシチミジ ン（５５９．６２ｍｇ；１．０ミリモル）を、室温で１８時間、１．０ミリモル （１４０μｌ）のトリエチルアミンの存在下で、１０ｍｌの乾燥ＤＭＦ中の２． ０ミリモルのサクシニル化エチレングリコールモノメチルエーテル（実施例７参 照）の４−フェニルエステルと反応させる。反応混合物を減圧下で蒸発させ、ト ルエンで同時蒸発させ、ジクロロメタンに再溶解し、そしてシリカゲルクロマト グラフィー（Si 60，Merck;カラム：２．５ ｘ ５０ｃｍ，０．１％のトリエ チルアミンを含むクロロホルム／メタノール混合液で溶離）で精製する。生成物 の画分を併合し、溶媒を蒸発させ、そしてペンタン中で沈殿させる。収率：５２ ４ｍｇ（０．７３ミリモル；７３％）。 類似の方法で、サクシニル化ジエチレングリコールモノメチルエーテル（実施 例８参照）及びトリエチレングリコールモノメチルエーテルを用いて、対応する マス修飾したデオキシチミジンを調製する。エチレン、ジエチレン及びトリエチ レングリコール誘導体のマス（質量）差はそれ ぞれ４４．０５、８８．１及び１３２．１５ダルトンである。 実施例１２グリシン、グリシルーグリシン、およびβ−アラニン残基で複素環式塩基のＣ− ５をマス−修飾してあるデオキシウリジン−５’−三リン酸の合成 ０．２８１ｇ（１０ミリモル）の５−（３−アミノプロピニル−１）−２’− デオキシウリジン（実施例５を参照せよ）を、０．１２９ｇのＮ，Ｎ−ジイソプ ロピルエチレンアミン（１７４μｌ、１．０ミリモル）の存在下、５ｍｌの脱水 ＤＭＦ中で、０．９２７ｇ（２．０ミリモル）のＮ−Ｆｍｏｃ−グリシンペンタ フルオロフェニルエステルもしくは０．９５５ｇ（２．０ミリモル）のＮ−Ｆｍ ｏｃ−β−アラニンペンタフルオロフェニルエステルのいずれかと室温で一晩反 応させる。溶媒を減圧蒸留により除去し、そしてこの縮合生成物をシリカゲル上 でのフラッシュクロマトグラフィーにより精製する［Ｓｔｉｌｌ ｅｔ ａｌ． ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，４３，２９２３−２９２５（１９７８）］。収率： グリシンについては４７６ｍｇ（０．８５ミリモル：８５％）、そしてβ−アラ ニン誘導体については４３６ｍｇ（０．７６ミリモル；７６％）である。グリシ ル−グリシン誘導体の合成のためには、１．０ミリモルのＦｍｏｃ−グリシン− デオキシウリジン誘導体のＦｍｏｃ基をＤＭＦ中の２０％のピペリジンでの室温 における１時間の処理により除去する。溶媒を減圧蒸留により除去し、残基をト ルエンと共に２回共蒸留し、そして０．９２７ｇ（２．０ミリモル）のＮ−Ｆｍ ｏｃ−グリシンペンタフルオロフェニルエステルと縮合させ、そして標準方法に 従って精製する。収率：４４５ｍｇ（０．７２ミリモル；７２％）である。Ｆ ｍｏｃ基でＮ−保護化してあるグリシル−、グリシル−グリシル−、およびβ− アラニル−２’−デオキシウリジン誘導体を今度は、ワンポット反応でのピリジ ン中の塩化４，４−ジメトキシトリチルでのトリチル化およびピリジン中の無水 酢酸でのアセチル化、ならびにその後の標準方法に従う８０％の酢酸水溶液での 一時間の処理による脱トリチル化により３’−Ｏ−アセチル誘導体へと転化させ る。溶媒を除去し、残渣を１００ｍｌのクロロホルム中に溶解し、そして５０ｍ ｌの１０％重炭酸ナトリウムで二回、次いで５０ｍｌの水で一回抽出し、硫酸ナ トリウムで脱水し、溶媒を蒸留し、そして残渣をシリカゲル上でのフラッシュク ロマトグラフィーにより精製する。収率：各々、グリシル−３−Ｏ’−アセチル −２’−デオキシウリジン誘導体については３６１ｍｇ（０．６０ミリモル；７ １％）、β−アラニル−３−Ｏ’−アセチル−２’−デオキシウリジン誘導体に ついては３５１ｍｇ（０．５７ミリモル；７５％）、グリシル−グリシル−３− Ｏ’−アセチル−２’−デオキシウリジン誘導体については３２３ｍｇ（０．４ ９ミリモル；６８％）である。ＰＯＣｌ₃での５’−ＯＨのリン酸化、ＤＭＦ中 のテトラ（トリ−ｎ−ブチルアンンモニウム）ピロリン酸でのインサイチュー反 応による５’−三リン酸への転化、３’−脱−Ｏ−アセチル化、およびＦｍｏｃ の開裂、およびＤＥＡＥ−セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）上での陰イオン −交換クロマトグラフィーによる最終精製を実施する。ウラシル部分のＵＶ−吸 収による収率：５−（３−（Ｎ−グリシル）−アミドプロピニル−１）−２’− デオキシウリジン−５’−三リン酸は０．４１ミリモル（８４％）、５−（３− （Ｎ−β−アラニル）−アミドプロピニル−１）−２’−デオキシウリジン−５ ’−三リン酸は０．４３ミ リモル（７５％）、および５−（３−Ｎ−グリシル−グリシル）−アミドプロピ ル−１）−２’−デオキシウリジン−５’−三リン酸は０．３８ミリモル（７８ ％）である。 実施例１３８−グリシル−および８−グリシル−グリシル−２’−デオキシアデノシン−５ ’−三リン酸の合成 実施例９および１０、ならびに刊行物［Ｋｏｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔ ｒａｈｅｄｒｏｎ ，３７：３６２（１９８１）］に従って製造される７２７ｍｇ （１．０ミリモル）のＮ６−（４−第三級−ブチルフェノキシアセチル）−８− グリシル−５’−（４，４−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシアデノシン もしくは８００ｍｇ（１．０ミリモル）のＮ６−（４−第三級−ブチルフェノキ シアセチル）−８−グリシル−グリシル−５’−（４，４−ジメトキシトリチル ）−２’−デオキシアデノシンを、ワンポット反応で３’−ＯＨをピリジン中の 無水酢酸でアセチル化および５’−位を８０％の酢酸で脱トリチル化させ、そし てＰＯＣｌ₃でのリン酸化およびテトラ（トリ−ｎ−ブチルアンモニウム）ピロ リン酸でのインサイチューの反応を介して５’−三リン酸へと転化させる。グリ シン残基のＮ６−第三級−ブチルフェノキシアセチル、３’−Ｏ−アセチル、お よびＯ−メチル基の脱保護化を濃厚なアンモニア水溶液を用いて室温で３時間実 施する。アンモニアを凍結乾燥により除去し、そして残渣をジクロロメタンで洗 浄し、溶媒を減圧蒸留により除去し、そして残存する固形物質を０．１Ｎ〜１． ０Ｍの重炭酸トリエチルアンモニウムの直線濃度勾配液を用いるＤＥＡＥ−セフ ァデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）上での陰イオン−交換クロマトグラフィーによ り精製 する。ヌクレオシド三リン酸含有性分画（ポリエチレンイミンセルロースプレー ト上でのＴＬＣにより確認される）を合わせ、そして凍結乾燥する。８−グリシ ル−２’−デオキシアデノシン−５’−三リン酸（アデニン部分のＵＶ−吸収に より決定される）の収率は５７％（０．５７ミリモル）であり、８−グリシルー グリシル−２’−デオキシアデノシン−５’−三リン酸の収率は５１％（０．５ １ミリモル）である。 これまでに引用される全ての引用文献および公開物は引用により本明細書に取 り込まれる。 等価物 当業者は、通常の実験程度の技術を使用して本明細書に記載される独特の方法 に対する数々の等価物を認識するか、あるいは確認することができるであろう。 このような等価物は本発明の範囲内に含まれ、そして以下に示す請求の範囲によ り保護されるものとみなす。 配列表 （２） 配列番号：１に関する情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１０ 塩基対 （Ｂ）型： 核酸 （Ｃ）鎖の数： 一本鎖 （Ｄ）トポロジー： 直鎖状 （ii）配列の種類：他の核酸 （iii）ハイポセティカル：ＹＥＳ （xi）配列の特徴： 配列番号：１ （２） 配列番号：２に関する情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１４ 塩基対 （Ｂ）型： 核酸 （Ｃ）鎖の数： 一本鎖 （Ｄ）トポロジー： 直鎖状 （ii）配列の種類：他の核酸 （iii）ハイポセティカル：ＹＥＳ （xi）配列の特徴： 配列番号：２ （２） 配列番号：３に関する情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１４ 塩基対 （Ｂ）型： 核酸 （Ｃ）鎖の数： 一本鎖 （Ｄ）トポロジー： 直鎖状 （ii）配列の種類：他の核酸 （iii）ハイポセティカル：ＹＥＳ （xi）配列の特徴： 配列番号：３ （２） 配列番号：４に関する情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１２ 塩基対 （Ｂ）型： 核酸 （Ｃ）鎖の数： 一本鎖 （Ｄ）トポロジー： 直鎖状 （ii）配列の種類：他の核酸 （iii）ハイポセティカル：ＹＥＳ （xi）配列の特徴： 配列番号：４ （２） 配列番号：５に関する情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１２ 塩基対 （Ｂ）型： 核酸 （Ｃ）鎖の数： 一本鎖 （Ｄ）トポロジー： 直鎖状 （ii）配列の種類：ｃＤＮＡ （iii）ハイポセティカル：ＹＥＳ （xi）配列の特徴： 配列番号：５ （２） 配列番号：６に関する情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１０ 塩基対 （Ｂ）型： 核酸 （Ｃ）鎖の数： 一本鎖 （Ｄ）トポロジー： 直鎖状 （ii）配列の種類：他の核酸 （iii）ハイポセティカル：ＹＥＳ （xi）配列の特徴： 配列番号．６

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． （ｉ）配列決定すべき核酸を単離すること；（ｉｉ）エキソヌクレア ーゼ活性を用いて、最初の末端から片側より核酸を切断して、個々のヌクレオチ ドを配列順に切り離すこと；（ｉｉｉ）質量分析法によって、配列順に切り離さ れた各ヌクレオチドを同定すること；そして（ｉｖ）同定されたヌクレオチドか ら核酸の配列を決定することを含む、核酸の配列決定方法。 ２． 核酸が、２’‐デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である、請求の範囲１記 載の方法。 ３． 核酸が、リボ核酸（ＲＮＡ）である、請求の範囲１記載の方法。 ４． エキソヌクレアーゼが、ヘビ毒ホスホジエステラーゼ、脾臓ホスホジ エステラーゼ、Ｂａｌ−３１ヌクレアーゼ、大腸菌エキソヌクレアーゼＩ、大腸 菌エキソヌクレアーゼＶＩＩ、マング・ビーン（Ｍｕｎｇ Ｂｅａｎ）ヌクレア ーゼ、Ｓ１ヌクレアーゼ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのエキソヌクレアーゼ活 性、ＤＮＡポリメラーゼＪのクレノウ・フラグメントのエキソヌクレアーゼ活性 、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ のエキソヌクレアーゼ活性、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活 性、ディープ・ベント（Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ）ＤＮＡポリメラーゼのエキソヌク レアーゼ活性およびＶｅｎｔ_rＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性か らなる群から選ばれる、請求の範囲１記載の方法。 ５． エキソヌクレアーゼが、固体支持体への共有結合またはゲルマトリッ クス中への包埋によって固定化されるか、あるいは半浸透膜を設えたリアクター 中に含有される、請求の範囲１記載の方法。 ６． 固体支持体が、毛細管であり、そしてエキソヌクレアーゼ活性が、毛 細管の内壁に共有結合されている、請求の範囲５記載の方法。 ７． 固体支持体が、ガラス・ビーズ、セルロース・ビーズ、ポリスチレン ・ビーズ、セファデックス・ビーズ、セファロース・ビーズ、ポリアクリルアミ ド・ビーズおよびアガロース・ビーズからなる群から選ばれる、請求の範囲５記 載の方法。 ８． 固体支持体が、平らな膜である、請求の範囲５記載の方法。 ９． 核酸が、固体支持体に共有結合によって固定化され、そしてエキソヌ クレアーゼが、固定化されたポリヌクレオチドと接触される溶液中に存在する、 請求の範囲１記載の方法。 １０． 固体支持体が、毛細管であり、そして核酸が、毛細管の内璧に共有結 合されている、請求の範囲９記載の方法。 １１． 固体支持体が、ガラス・ビーズ、セルロース・ビーズ、ポリスチレン ・ビーズ、セファデックス．ビーズ、セファロース・ビーズ、ポリアクリルアミ ド・ビーズおよびアガロース・ビーズからなる群から選ばれる、請求の範囲９記 載の方法。 １２． 固体支持体が、平らな膜である、請求の範囲９記載の方法。 １３． 核酸が、マス−修飾されたメクレオチドを含む、請求の範囲１記載の 方法。 １４． マス−修飾されたヌクレオチドが、エキソヌクレアーゼ活性の速度を 調節する、請求の範囲１３記載の方法。 １５． 配列順に切り離されたヌクレオチドが、エキソヌクレアーゼの切り離 しに続いて、質量分析法による同定の前にマス−修飾される、請求の範囲１記載 の方法。 １６． 配列順に切り離されたヌクレオチドが、アルカリホスファターゼとの 接触によってマス−修飾される、請求の範囲１５記載の方法。 １７． ｉ 異種の核酸が、多重質量分析法による配列決定によって、同時に 配列決定され、そのｉ核酸の各種類が、配列順に切り離されたヌクレオチドの少 なくとも１部分のマス−修飾による全体での差異に基づく残ｉ−１核酸から、配 列順に切り離されたヌクレオチドを、質量分析法によって区別し得る、請求の範 囲１記載の方法。 １８． マス−修飾されたヌクレオチドが、エキソヌクレオチドの活性を調節 するために、さらに働く、請求の範囲１７記載の方法。 １９． マス−修飾されたヌクレオチドが、配列順に切り離されたヌクレオチ ドに付着されたマス−修飾官能基（Ｍ）を含む、請求の範囲１７記載の方法。 ２０． マス−修飾されたヌクレオチドの少なくとも１つが、５’リン酸に付 着されたマス−修飾官能基（Ｍ）により修飾される、請求の範囲２０記載の方法 。 ２１． マス−修飾されたヌクレオチドの少なくとも１つが、糖部分のＣ−２ ’位に付着されたマス−修飾官能基（Ｍ）により修飾される、請求の範囲２０記 載の方法。 ２２． マス−修飾されたヌクレオチドの少なくとも１つが、複素環塩基に付 着されたマス−修飾官能基（Ｍ）により修飾される、請求の範囲２０記載の方法 。 ２３． マス−修飾されたヌクレオチドが、Ｃ−５位で修飾されたシトシン部 分、Ｃ−５位で修飾されたウラシル部分、Ｃ−５メチル基で修飾されたチミン部 分、Ｃ−８位で修飾されたアデニン部分、Ｃ−８位で修飾されたｃ７−デアザア デニン部分、Ｃ−７位で修飾されたｃ７−デアザアデニン部分、Ｃ−８位で修飾 されたグアニン部分、Ｃ−８位で修飾されたｃ７−デアザグアニン部分、Ｃ−７ 位で修飾されたｃ７−デアザグアニン部分、Ｃ−８位で修飾されたヒポキサンチ ン部分、Ｃ−８位で修飾されたｃ７−デアザヒポキサンチン部分、およびＣ−７ 位で修飾されたｃ７−デアザヒポキサンチン部分からなる群から選ばれた修飾さ れた複素環塩基を含む、請求の範囲２２記載の方法。 ２４． マス 修飾官能基（Ｍ）が、ＸＲ，Ｆ，Ｃｌ，Ｂｒ，Ｉ，Ｓｉ（ＣＨ₃ ）₃、Ｓｉ（ＣＨ₃）₂（Ｃ₂Ｈ₅）、Ｓｉ（ＣＨ₃）（Ｃ₂Ｈ₅）₂、Ｓｉ（Ｃ₂Ｈ₅）₃ 、ＣＨ₂Ｆ，ＣＨＦ₂およびＣＦ₃［式中、Ｘは、−ＯＨ，ＮＨ₂，−ＮＨＲ，− ＳＨ，−ＮＣＳ，−ＯＣＯ（ＣＨ₂）_rＣＯＯＨ（ｒ＝１〜２０）、−ＮＨＣＯ（ ＣＨ₂）_rＣＯＯＨ（ｒ＝１〜２０）、ＯＳＯ₂ＯＨ，−ＯＣＯ（ＣＨ₂）_rＩ（ｒ ＝１〜２０）およびＯＰ（Ｏ−アルキル）Ｎ（アルキル）₂からなる群から選ば れ、そしてＲは、Ｈ，メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｔ−ブチル、 ヘキシル、ベンジル、ベンズヒドリル、トリチル、置換トリチル、アリール、置 換アリール、ポリオキシメチレン、モノアルキル化ポリオキシメチレン、ポリエ チレンイミン、一般式［−ＮＨ（ＣＨ₂）_r−ＮＨＣＯ（ＣＨ₂）_rＣＯ−］_mをも つポリアミド、一般式［−ＮＨ（ＣＨ₂）_rＣＯ−］_mをもつポリアミド、一般式 ［−Ｏ（ＣＨ₂）_rＣＯ−］_mをもつポリエステル、一般式−Ｓｉ（Ｙ）₃のアルキ ル化シリル化合物、一般式（−ＮＨＣＨａａＣＯ−）_mのヘテロ・オリゴ／ポリ アミノ酸、一般式−（ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ）_m−ＣＨ₂ＣＨ₂ＯＨのポリエチレングリ コール、および一般式−（ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ）_mＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ−Ｙのモノアルキル化 ポリエチレングリコール（この場合、ｍは、範囲０〜２００であり、Ｙは、メチ ル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｔ ブチル、ヘキシルからなる群から選 ばれた低級アルキル基であり、rは、範囲１〜２０であり、そしてａａは、天然 に存在するアミノ酸のいずれかのアミノ酸側鎖をも表す）からなる群から選ばれ る］からなる群から選ばれる、請求の範囲２０記載の方法。 ２５． マス−修飾された核酸が、マス−修飾された核酸を用いて核酸を合成 することによって、核酸塩基配列に相補的な一本鎖の鋳型ポリヌクレオチドから 調製される、請求の範囲１３記載の方法。 ２６． マス−修飾された核酸が、核酸を固体支持体に繋げさせる配列をもつ プライマーを用いて合成される、請求の範囲２５記載の方法。 ２７． マス−修飾された核酸が、ＤＮＡポリメラーゼおよびマス−修飾され たデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）を用いて合成される、請求の 範囲２５記載の方法。 ２８． マス−修飾された核酸が、ＲＮＡポリメラーゼおよびマス−修飾され たリボヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）を用いて合成される、請求の範囲２５記 載の方法。 ２９． 核酸の合成が、核酸を固体支持体に固定化できる５’官能基をもつイ ニシエーターオリゴヌクレオチドの存在下で開始される、請求の範囲２５記載の 方法。 ３０． 核酸が、さらに、核酸を固体支持体に共有結合させるための結合基（ Ｌ）を含む、請求の範囲９記載の方法。 ３１． 固体支持体が、さらに、スプリント（ｓｐｌｉｎｔ）オリゴヌクレオ チドを含み、そして結合基（Ｌ）が、そのスプリントオリゴヌクレオチドにアニ ーリングし、そしてリガーゼ活性の作用によって固体支持体に共有結合できるヌ クレオチド配列を含む、請求の範囲３０記載の方法。 ３２． （ｉ）標的核酸のエキソヌクレアーゼ切断反応を含み、その切断反応 が、配列順に切り離された個々のヌクレオチドのトレイン（ｔｒａｉｎ）を生成 するためのリアクター手段；（ｉｉ）標的核酸のエキソヌクレオチド切断によっ て切り離された個々の核酸のトレインを検出するための質量分析手段；そして（ ｉｉｉ）個々のヌクレオチドのトレインを、リアクター手段から質量分析手段へ 移行するための移行手段を含む、エキソヌクレアーゼ介在の質量分析法による配 列決定のシステム。 ３３． 移行手段が、さらに、移動ベルトを含む、請求の範囲３２のシステム 。 ３４． リアクター手段が、さらに、エキソヌクレアーゼ切断反応の温度を調 節ための冷却／加熱マントルを設えたリアクター、リアクターに少なくとも１種 の試薬を供給するための少なくとも１個の試薬フラスコ、リアクターへ、および リアクターから試薬と反応物をポンプ移送するための少なくとも１個のポンプ装 置、およびリアクターに標的核酸の１つまたはエキソヌクレアーゼを固定化する ための手段を含む、請求の範囲３２記載のシステム。 ３５． リアクター手段が、さらに、標的核酸のエキソヌクレアーゼ切断によ って切り離された個々のヌクレオチドをマス−修飾するための少なくとも１つの 第２のリアクターを含む、請求の範囲３４記載のシステム。 ３６． 第２のリアクターが、固定化されたアルカリホスファターゼを含む、 請求の範囲３５記載のシステム。 ３７． 移動ベルトが、ステッピングモーターによって動かされ、スプリング 装填プーリーにより引っ張って保持される移動ベルト、移動ベルトの部分に、標 的核酸のエキソヌクレアーゼ切断によって切り離された個々のヌクレオチドのサ ンプルを適用するためのサンプル適用領域、サンプル適用領域の温度を調節する ために、サンプル適用領域の下に置かれた冷却／加熱プレート、サンプル遮用領 域を見るための光学装置をもつＣＣＤカメラ、移動ベルトの動きと直角方向に、 ベルトの表面を横切って動くことができるイオン化／脱離源、移動ベルトの一部 分の上を真空にするための拡散真空ポンプ装置、および移動ベルトからサンプル 残渣の除去をする加熱装置を含む、請求の範囲３３記載のシステム。 ３８． さらに、サンプルの適用前に洗浄液によって移動ベルトを洗浄する洗 浄装置を含み、この装置では、加熱装置が洗浄液による洗浄後のベルトを乾燥さ せる、請求の範囲３７記載のシステム。 ３９． 加熱装置が、極超短波である、請求の範囲３７のシステム。 ４０． イオン化／脱離源が、レーザーである、請求の範囲３７記載のシステ ム。 ４１． さらに、複数の核酸の平行配列決定のための複数のリアクター手段を 含む、請求の範囲３２記載のシステム。 ４２． 切り離された核酸の検出されたトレイン（ｔｒａｊｎ）を処埋し、標 的核酸の配列を決定ずるためのマイクロプロセッサーを含む、請求の範囲３２の システム。 ４３． （ｉ）最初の末端から片側より核酸を切断して、個々のヌクレオチド を配列順に切り離すエキソヌクレアーゼ；（ｉｉ）異種の核酸を合成し、各々異 種の核酸の配列順に切り離されたヌクレオチドが特定されるように、その核酸の 少なくとも１部分がマス−修飾されるための、ヌクレオチドのセット、（ｉｉｉ ）相補的鋳型およびヌクレオチドのセットから核酸を合成するためのポリメラー ゼ、および（ｉｖ）１種の核酸またはエキソヌクレアーゼを固定化するための固 体支持体を含む、質量分析法によって少なくとも２種の異種の核酸をエキソヌク レアーゼで配列決定するキット。 ４４． 核酸が、２’−デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である、請求の範囲４３ 記載のキット。 ４５． 核酸が、リボ核酸（ＲＮＡ）である、請求の範囲４３記載のキット。 ４６． エキソヌクレアーゼが、ヘビ毒ホスホジエステラーゼ、脾臓ホスホジ エステラーゼ、Ｂａｌ‐３１ヌクレアーゼ、大腸菌エキソヌクレアーゼＩ、大腸 菌エキソヌクレアーゼＶＩＩ、マング・ビーン（Ｍｕｎｇ Ｂｅａｎ）ヌクレア ーゼ、Ｓｌヌクレアーゼ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのエキソメクレアーゼ活 性、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ・フラグメントのエキソヌクレアーゼ活性 、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ のエキソヌクレアーゼ活性、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活 性、ディープ・ベント（Ｖｃｅｐ Ｖｅｎｔ）ＤＮＡポリメラーゼのエキソヌク レアーゼ活性およびＶｅｎｔ_rＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性か らなる群から選ばれる、請求の範囲４３記載のキット。 ４７． 固体支持体が、毛細管、平らな膜、ガラス・ビーズ、セルロース・ビ ーズ、ポリスチレン・ビーズ、セファデックス・ビーズ、セファロース・ビーズ 、ポリアクリルアミド・ビーズおよびアガロース・ビーズからなる群から選ばれ る、請求の範囲４３記載のキット。 ４８． 固体支持体が、核酸の共有結合を促進するように官能基化される、請 求の範囲４３記載のキット。 ４９． エキソヌクレアーゼが、固体支持体に共有結合することによって固定 化される、請求の範囲４３記載のキット。 ５０． マス−修飾されたヌクレオチドが、ヌクレオチド部分に付着されたマ ス−修飾官能基（Ｍ）を含む、請求の範囲４３記載のキット。 ５１． マス−修飾官能基（Ｍ）が、５’リン酸、糖部分のＣ−２’位、およ び複素環塩基からなる群から選ばれた位置において、ヌクレオチド部分に付着さ れる、請求の範囲５０記載の方法。 ５２． マス 修飾官能基（Ｍ）が、ＸＲ，Ｆ，Ｃｌ，Ｂｒ，Ｉ，Ｓｉ（ＣＨ₃ ）₃、Ｓｉ（ＣＨ₃）₂（Ｃ₂Ｈ₅）、Ｓi（ＣＨ₃）（Ｃ₂Ｈ₅）２、Ｓｉ（Ｃ₂Ｈ₅）₃ 、ＣＨ₂Ｆ，ＣＨＦ₂およびＣＦ₃［式中、Ｘは、−ＯＨ，ＮＨ₂，−ＮＨＲ，Ｓ Ｈ． ＮＣＳ，−ＯＣＯ（ＣＨ₂）_rＣＯＯＨ（ｒ＝１〜２０）、−ＮＨＣＯ（Ｃ Ｈ₂）_rＣＯＯＨ（ｒ＝１〜２０）、ＯＳＯ₂ＯＨ，−ＯＣＯ（ＣＨ₂）_rＩ（ｒ＝ １〜２０）およびＯＰ（Ｏ−アルキル）Ｎ（アルキル）₂からなる群から選ばれ 、そしてＲは、Ｈ，メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｔ−ブチル、ヘ キシル、ベンジル、ベンズヒドリル、トリチル、置換トリチル、アリール、置換 アリール、ポリオキシメチレン、モノアルキル化ポリオキシメチレン、ポリエチ レンイミン、一般式［−ＮＨ（ＣＨ₂）_r−ＮＨＣＯ（ＣＨ₂）_rＣＯ−］_mをもつ ポリアミド、一般式［−ＮＨ（ＣＨ₂）_rＣＯ−］_mをもつポリアミド、一般式［ −Ｏ（ＣＨ₂）_rＣＯ−］_mをもつポリエステル、一般式−Ｓｉ（Ｙ）₃のアルキル 化シリル化合物、一般式（−ＮＨＣＨａａＣＯ−）_mのヘテロ‐オリゴ／ポリア ミノ酸、一般式−（ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ）_m−ＣＨ₂ＣＨ₂ＯＨのポリエチレングリコー ル、および一般式−（ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ）_m−ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ−Ｙのモノアルキル化ポ リエチレングリコール（この場合、ｍは、範囲０〜２００であり、Ｙは、メチル 、エチル、プロピル、イソプロピル、ｔ‐ブチル、ヘキシルからなる群から 選ばれる低級アルキル基であり、ｒは、範囲１〜２０であり、そしてａａは、天 然に存在するアミノ酸のいずれかのアミノ酸側鎖をも表す）からなる群から選ば れる］からなる群から選ばれる、請求の範囲５０記載の方法。 ５３． さらに、エンドヌクレアーゼ配列決定プロトコールを提供する教示マ ニュアルを含む、請求の範囲４３記載のキット。 ５４． （ｉ）最初の末端から片側より核酸を切断して、個々のヌクレオチド を配列順に切り離すエキソヌクレアーゼ；（ｉｉ）核酸を合成し、ヌクレオチド の少なくとも１部分が、エキソヌクレアーゼの切断活性を調節するためにマス− 修飾されるための、ヌクレオチドのセット、（ｉｉｉ）相補的鋳型およびヌクレ オチドのセットから核酸を合成するためのポリメラーゼ、および（ｉｖ）１種の 核酸またはエキソヌクレアーゼを固定化するための固体支持体を含む、エキソヌ クレアーゼ介在の質量分析法によって核酸を配列決定するためのキット。 ５５． （ｉ）配列決定すべき核酸を単離すること；（ｉｉ）エキソヌクレア ーゼ活性を用いて、最初の末端から片側より核酸を切断して、まとまった（ｎｅ ｓｔｅｄ）核酸断片のセットを生成すること；（ｉｉｉ）質量分析法によって、 核酸断片のセットの各１つの分子量値を決定すること；そして（ｉｖ）核酸断片 のセットの分子量値から核酸の配列を決定することを含む、核酸の配列決定方法 。