CN106211755B

CN106211755B - 使用erk和raf抑制剂的组合的癌症治疗

Info

Publication number: CN106211755B
Application number: CN201480074321.4A
Authority: CN
Inventors: S·萨哈; D·威尔施; G·德克雷斯森佐; J·J·罗伊克斯
Original assignee: Biomedical Valley Discovery Co ltd
Current assignee: Biomedical Valley Discovery Co ltd
Priority date: 2013-12-20
Filing date: 2014-12-19
Publication date: 2021-06-22
Anticipated expiration: 2034-12-19
Also published as: EP3082800A4; EP4043017A1; CA2934669A1; MX2021008610A; US10668055B2; AU2014368906B2; WO2015095819A2; CA2934669C; EP3082800A2; EP3082800B1; MX2016008201A; RU2016129287A; BR112016014481B1; JP6678585B2; WO2015095819A3; CA3168002A1; CN106211755A; BR112016014481A2; ES2909910T3; AU2014368906A1

Abstract

本发明提供在受试者中治疗或改善癌症的效应的方法及其他。所述方法包括向所述受试者施用有效量的(i)第一抗癌剂，其是BVD‑523或其药学可接受的盐和(ii)第二抗癌剂，其是1型RAF抑制剂(如达拉非尼)或另一种RAF抑制剂(如瑞戈非尼)或其药学可接受的盐，以治疗或改善癌症的效应。还提供了用于在受试者中治疗或改善癌症的效应的药用组合物和试剂盒。

Description

使用ERK和RAF抑制剂的组合的癌症治疗

相关申请的交叉引用

本申请是2014年12月19提提交的国际申请号 PCT/US2014/071715的国家阶段，要求美国临时专利申请序列号 61/919347(提交于2013年12月20日)的权益。上述申请通过引用以其全文并入本文。

技术领域

本发明提供在受试者中治疗或改善癌症的效应的方法、试剂盒、药用组合物及其他，使用(i)第一抗癌剂，其是BVD-523或其药学可接受的盐和(ii)第二抗癌剂，其为1型RAF抑制剂，例如达拉非尼(dabrafenib)或其药学可接受的盐，以治疗或改善所述癌症的效应。

通过引用并入的序列表

本申请包含对氨基酸和/或核酸序列的引用，其与本申请同时提交，序列表的文本文件为“0375604.txt”，文件大小255KB，创建于2014 年12月19日。根据37C.F.R§1.52(e)，上述序列表通过引用以其全文并入本文(5)。

发明背景

靶向丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号传导途径的药物抑制剂显示对多种癌症，尤其是那些带有BRAF蛋白激酶突变的癌症有临床疗效。RAF和MEK激酶抑制剂被批准以单剂使用于晚期转移性 BRAF突变体黑色素瘤，而达拉非尼和曲美替尼(trametinib)的组合目前则正处于食品和药物管理局(FDA)的审查中用于此目的。单独或组合地，BRAF和MEK抑制剂显示在其他癌症中有不同的活性，在BRAF突变甲状腺癌和肺癌中的疗效很有前途，且在BRAF突变肠癌中可能有边缘活性。

用BRAF和MEK抑制剂可见不同的临床疗效形式。当单独施用或者当以顺序或同时的组合策略施用时，初始肿瘤消退的程度和外显率以及疾病进展之前响应的持续时间都根据每种药物类别有独特的变化。迄今为止，同时施用的达拉非尼和曲美替尼组合疗法似乎是BRAF 突变黑色素瘤的优选干预措施。

与其他靶向疗法相同，疾病对RAF和MEK抑制剂的响应形式似乎受到存在于使用所述药物的癌症中的固有遗传异质性的影响。例如，已经表明某些遗传改变，包括PTEN和激活PI3K的细胞生长信号等的其他变化可预测出在用RAF抑制剂vemurafenib处理的BRAF突变黑素瘤中的不良初始响应，和/或相对快速的进展。类似地，MEK 基因基因座中的直接突变似乎在那些由BRAF、MEK或组合药物中任一方式治疗后还会进展的肿瘤中显现。几个附加的实例，从RAS和 RAF基因扩增以及剪接突变，表明当致癌多效性遇到靶向药物治疗的选择压力会有获得性药物抗性的产生。

因此，新型靶向剂在理想情况下会抑制致癌途径的多样化的节点，并且还可以以组合形式通过诱导超过多种癌症基因组的适应能力的选择压力负担而达到效果。本申请针对的是满足对新靶向剂的需求及其他。

发明概述

本发明的一个实施方式是在有此需要的受试者中治疗或改善癌症的效应的方法。该方法包括给受试者施用有效量的(i)第一抗癌剂，其是BVD-523或其药学可接受的盐和(ii)第二抗癌剂，其是1型RAF 抑制剂或其药学可接受的盐，以治疗或改善癌症的效应。

本发明的另一个实施方式是在有此需要的受试者中治疗或改善癌症的效应的方法。该方法包括给受试者施用有效量的(i)BVD-523 或其药学可接受的盐和(ii)第二抗癌症剂，其是达拉非尼或其药学可接受的盐，以治疗或改善癌症的效应。

本发明的另一个实施方式是产生癌细胞死亡的方法。此方法包括将癌细胞接触有效量的(i)第一抗癌剂，其是BVD-523或其药学可接受的盐和(ii)第二抗癌症剂，其是1型RAF抑制剂或其药学可接受的盐。

本发明的另一个实施方式是用于治疗或改善在有此需要的受试者的癌症的效应的试剂盒。此试剂盒包括有效量的(i)第一抗癌剂，其是BVD-523或其药学可接受的盐和(ii)第二抗癌剂，其是1型RAF 抑制剂或其药学可接受的的盐，与其使用说明书一同包装。

本发明的另一个实施方式是用于在有此需要的受试者中治疗或改善癌症的效应的药用组合物。该药用组合物包含药学可接受的稀释剂或载体和有效量的(i)第一抗癌剂，其是BVD-523或其药学可接受的盐和(ii)第二抗癌剂，其是1型RAF抑制剂或其药学可接受的盐，其中第一和第二抗癌剂的施用相比任一抗癌剂的单独施用提供了协同效应。

本发明的另一个实施方式是在有此需要的受试者中治疗或改善癌症的效应的方法。该方法包括给受试者施用有效量的(i)第一抗癌剂，其是BVD-523或其药学可接受的盐和(ii)第二抗癌剂，其是RAF 抑制剂，选自AAL881(Novartis)；AB-024(AmbitBiosciences)、 ARQ-736(ArQule)、ARQ-761(ArQule)、AZ628(Axon Medchem BV)、BeiGene-283(BeiGene)、BIIB-024(MLN 2480)(Sunesis&Takeda)、 b-raf抑制剂(Sareum)、BRAF激酶抑制剂(Selexagen Therapeutics)、 BRAF siRNA 313(tacaccagcaagctagatgca)和253 (cctatcgttagagtcttcctg)(Liu等人2007)、CTT239065(Institute of CancerResearch)、DP-4978(Deciphera Pharmaceuticals)、HM-95573 (Hanmi)、GW-5074(SigmaAldrich)、ISIS 5132(Novartis)、LErafAON (NeoPharm，Inc.)、LBT613(Novartis)、LGX-818(Novartis)、帕唑帕尼(pazopanib，GlaxoSmithKline)、PLX5568(Plexxikon)、RAF-265(Novartis)、RAF-365(Novartis)、瑞戈非尼(regorafenic，Bayer HealthcarePharmaceuticals，Inc.)、RO 5126766(Hoffmann-La Roche)、TAK 632(Takeda)、TL-241(Teligene)、XL-281(Exelixis)，其药学可接受的盐，及其组合，以治疗或改善的癌症的效应。

本发明的另一个实施方式是产生癌细胞死亡的方法。此方法包括将癌细胞接触有效量的(i)第一抗癌剂，其是BVD-523或其药学可接受的盐和(ii)第二抗癌剂，其是RAF抑制剂，选自AAL881 (Novartis)；AB-024(Ambit Biosciences)、ARQ-736(ArQule)、ARQ-761 (ArQule)、AZ628(Axon Medchem BV)、BeiGene-283(BeiGene)、 BIIB-024(MLN 2480)(Sunesis&Takeda)、b-raf抑制剂(Sareum)、 BRAF激酶抑制剂(Selexagen Therapeutics)、BRAF siRNA 313 (tacaccagcaagctagatgca)和253(cctatcgttagagtcttcctg)、CTT239065(Institute of Cancer Research)、DP-4978(Deciphera Pharmaceuticals)、 HM-95573(Hanmi)、GW-5074(Sigma Aldrich)、ISIS 5132(Novartis)、 LErafAON(NeoPharm，Inc.)、LBT613(Novartis)、LGX-818 (Novartis)、帕唑帕尼(GlaxoSmithKline)、PLX5568(Plexxikon)、 RAF-265(Novartis)、RAF-365(Novartis)、瑞戈非尼(Bayer HealthcarePharmaceuticals，Inc.)、RO 5126766(Hoffmann-La Roche)、TAK 632 (Takeda)、TL-241(Teligene)、XL-281(Exelixis)，其药学可接受的盐，及其组合。

本发明的另一个实施方式是用于在有此需要的受试者中治疗或改善癌症的效应的试剂盒。此试剂盒包含有效量的(i)第一抗癌剂，其是BVD-523或其药学可接受的盐和(ii)第二抗癌剂，其是RAF抑制剂，选自AAL881(Novartis)；AB-024(Ambit Biosciences)、ARQ-736 (ArQule)、ARQ-761(ArQule)、AZ628(Axon Medchem BV)、 BeiGene-283(BeiGene)、BIIB-024(MLN 2480)(Sunesis&Takeda)、 b-raf抑制剂(Sareum)、BRAF激酶抑制剂(Selexagen Therapeutics)、 BRAF siRNA 313(tacaccagcaagctagatgca)和253(cctatcgttagagtcttcctg)、CTT239065(Institute of Cancer Research)、 DP-4978(Deciphera Pharmaceuticals)、HM-95573(Hanmi)、GW-5074 (Sigma Aldrich)、ISIS 5132(Novartis)、LErafAON(NeoPharm，Inc.)、 LBT613(Novartis)、LGX-818(Novartis)、帕唑帕尼 (GlaxoSmithKline)、PLX5568(Plexxikon)、RAF-265(Novartis)、 RAF-365(Novartis)、瑞戈非尼(Bayer Healthcare Pharmaceuticals， Inc.)、RO 5126766(Hoffmann-LaRoche)、TAK 632(Takeda)、TL-241 (Teligene)、XL-281(Exelixis)，其药学可接受的盐，及其组合，与其使用说明书一起包装。

本发明的另一个实施方式是用于在有此需要的受试者中治疗或改善癌症的效应的药用组合物。该药用组合物包含药学可接受的稀释剂或载体和有效量的(i)第一抗癌剂，其是BVD-523或其药学可接受的盐和(ii)第二抗癌剂，其是RAF抑制剂，选自AAL881(Novartis)； AB-024(Ambit Biosciences)、ARQ-736(ArQule)、ARQ-761(ArQule)、 AZ628(Axon Medchem BV)、BeiGene-283(BeiGene)、BIIB-024(MLN 2480)(Sunesis&Takeda)、b-raf抑制剂(Sareum)、BRAF激酶抑制剂(Selexagen Therapeutics)、BRAF siRNA 313(tacaccagcaagctagatgca) 和253(cctatcgttagagtcttcctg)、CTT239065(Institute ofCancer Research)、DP-4978(Deciphera Pharmaceuticals)、HM-95573 (Hanmi)、GW-5074(Sigma Aldrich)、ISIS 5132(Novartis)、LErafAON (NeoPharm，Inc.)、LBT613(Novartis)、LGX-818(Novartis)、帕唑帕尼(GlaxoSmithKline)、PLX5568(Plexxikon)、RAF-265(Novartis)、 RAF-365(Novartis)、瑞戈非尼(Bayer HealthcarePharmaceuticals， Inc.)、RO 5126766(Hoffmann-La Roche)、TAK 632(Takeda)、TL-241(Teligene)、XL-281(Exelixis)，其药学可接受的盐，及其组合，其中第一和第二抗癌剂的施用相比于单独的任一抗癌剂施用提供了协同效应。

附图简述

本专利或申请文件包含至少一个彩绘附图。具有彩色绘图的本专利或专利申请出版物的副本将由专利局应要求并支付必要的费用时提供。

图1A-C显示第1个月在人恶性黑色素瘤细胞系(A375细胞)中的剂量递增研究的进展情况。多种处理(曲美替尼(2型MEK抑制剂)、达拉非尼(BRAF抑制剂)和BVD-523(ERK1/2抑制剂)如标记所示。

图2A-H显示追踪第1个月对剂量递增试剂的敏感度的变化的扩增测定法结果。多种处理(曲美替尼、达拉非尼、BVD-523和紫杉醇) 如图表顶端标记。图表右方说明文字显示剂量递增研究中的多种细胞类型。例如，“达拉非尼”指的是已经从剂量递增研究的第1个月用最高剂量的达拉非尼处理的细胞。亲本指代尚未使用药物处理的对照细胞。图2A-2C和2G相对对照进行标准化，而图2D-2F和2H显示原始数据。

图3A-3D显示第2个月在A375细胞中的剂量递增研究的进展情况。多种处理(曲美替尼、达拉非尼和BVD-523)如标记所示。

图4A-H显示追踪第2个月对剂量递增试剂的敏感度的变化的扩增测定法结果。多种处理(曲美替尼、达拉非尼、BVD-523和紫杉醇) 如图表顶端标记。图表右方说明文字显示剂量递增研究中的多种细胞类型。例如，“达拉非尼”指的是已经从剂量递增研究的第2个月用最高剂量的达拉非尼处理的细胞。亲本指代尚未使用药物处理的对照细胞。图4A-4C和4G相对对照进行标准化，而图4D-4F和4H显示原始数据。

图5A-H只显示来自图4的亲本和BVD-523细胞系的数据。多种处理(曲美替尼、达拉非尼、BVD-523和紫杉醇)如标记所示。图5A-5C 和5G相对对照进行标准化，而图5D-5F和5H显示原始数据。

图6A-D显示第3个月在人恶性黑色素瘤细胞系(A375细胞)中的剂量递增研究的进展情况。多种处理(曲美替尼、达拉非尼和 BVD-523如标记所示。

图7是表示所述剂量递增测定法中适用于DMSO的对照孔中生长的细胞的增殖测定法结果的直方图。

图8A-D是一组线图，显示本研究的第3个月的增殖测定法。多种处理(曲美替尼、达拉非尼、BVD-523和紫杉醇)如图表顶端标记。图表右方说明文字显示剂量递增研究中的多种细胞类型。例如，“达拉非尼”指的是已经从剂量递增研究的第3个月用最高剂量的达拉非尼处理的细胞。亲本指代尚未使用药物治疗的对照细胞。

图9A-D仅显示来自图8的亲本、达拉非尼和BVD-523细胞系的数据。

图10A是显示使用Alamar蓝细胞活力测定法，曲美替尼/达拉非尼组合在A375细胞中抑制％的剂量矩阵。图10B是显示用于曲美替尼/达拉非尼组合的Bliss余量的剂量矩阵。图10C和10D显示使用 Alamar蓝细胞活力测定法，达拉非尼和曲美替尼单剂处理A375细胞中相对于仅DMSO处理对照的活力％。图10E显示使用Alamar蓝细胞活力测定法，达拉非尼和曲美替尼组合处理在A375细胞中相对于仅DMSO处理对照的活力％。

图11A为显示使用CellTiter-GLo细胞活力测定法，曲美替尼/达拉非尼组合在A375细胞中抑制％的剂量矩阵。图11B是显示曲美替尼/达拉非尼组合的Bliss余量的剂量矩阵。图11C和11D显示使用 CellTiter-GLo细胞活力测定法，达拉非尼和曲美替尼单剂处理在 A375细胞中相对于仅DMSO处理对照的活力％。图11E显示使用 CellTiter-GLo细胞活力测定法，达拉非尼和曲美替尼组合处理在 A375细胞中相对于仅DMSO处理对照的％存活率。

图12A是显示使用Alamar蓝细胞活力测定法，BVD-523/达拉非尼组合在A375细胞中抑制％的剂量矩阵。图12B是显示用于 BVD-523/达拉非尼组合的Bliss余量的剂量矩阵。图12C和12D显示使用Alamar蓝细胞活力测定法，达拉非尼和BVD-523单剂处理在 A375细胞中相对于仅DMSO处理对照的活力％。图12E显示使用 Alamar蓝细胞活力测定法，达拉非尼和BVD-523组合处理在A375 细胞中相对于仅DMSO处理对照的活力％。

图13A为显示使用CellTiter-GLo细胞活力测定法，BVD-523/达拉非尼组合在A375细胞中抑制％的剂量矩阵。图13B是显示BVD-523/达拉非尼组合的Bliss余量的剂量矩阵。图13C和13D显示使用CellTiter-GLo细胞活力测定法，BVD-523和曲美替尼单剂处理在A375细胞中相对于仅DMSO治疗对照的活力％。图13E显示使用 CellTiter-GLo细胞活力测定法，BVD-523和曲美替尼组合处理在 A375细胞中相对于仅DMSO治疗对照的活力％。

图14A是显示使用Alamar蓝细胞活力测定法，曲美替尼 /BVD-523组合在A375细胞中抑制％的剂量矩阵。图14B是显示用于曲美替尼/BVD-523组合的Bliss余量的剂量矩阵。图14C和14D显示使用Alamar蓝细胞活力测定法，BVD-523和曲美替尼单剂处理在 A375细胞中相对于仅DMSO处理对照的活力％。图14E显示使用 Alamar蓝细胞活力测定法，BVD-523和曲美替尼组合处理在A375细胞中相对于仅DMSO处理对照的活力％。

图15A是显示使用CellTiter-GLo细胞活力测定法，曲美替尼 /BVD-523组合在A375细胞中抑制％的剂量矩阵。图15B是显示曲美替尼/BVD-523组合的Bliss余量的剂量矩阵。图15C和15D显示使用 CellTiter-GLo细胞活力测定法，BVD-523和曲美替尼单剂处理在 A375细胞中相对于仅DMSO治疗对照的活力％。图15E显示使用 CellTiter-GLo细胞活力测定法，BVD-523和曲美替尼组合处理在 A375细胞中相对于仅DMSO治疗对照的活力％。

图16A-D是一组图像，显示不同浓度(nM)BVD-523、达拉非尼(Dab)和曲美替尼(Tram)处理4小时后，在A375细胞中MAPK 信号传导情况的Western印迹分析。除非另有说明，每个泳道上样40 μg总蛋白。在该实验中，收集一式两份样品。图16A和16B显示一式两份样品的结果。类似地，图16C和16D也显示一式两份样品的结果。在图16A和16B中，在A375细胞中pRSK1相对于其他标记信号较弱。测试了来自Cell Signaling(Cat#11989)的一个不同的 pRSK1-S380抗体，但并没有得出检测信号(数据未显示)。在图16C 和16D中，pCRAF-338得出的信号最弱。

图17A-D是一组图像，显示不同浓度(nM)BVD-523、达拉非尼(Dab)和曲美替尼(Tram)处理4小时后，人结直肠癌细胞系 (HCT116细胞)MAPK信号传导情况的Western印迹分析。除非另有说明，每个泳道上样40μg总蛋白。在该实验中，收集一式两份样品。图17A和17B显示一式两份样品的结果。类似地，图17C和17D 也显示一式两份样品的结果。在图17A-17B中，HCT116细胞中的 pRSK1水平似乎极低，在图17C-17D中，pCRAF-338信号也很弱。

图18A-D是一组图像，显示如图中标记的不同浓度(nM)的 BVD-523(“BVD523”)、曲美替尼(Tram)和/或达拉非尼(Dab) 处理24小时后，在A375黑色素瘤细胞中细胞周期和细胞凋亡蛋白的 Western印迹分析。除非另有说明，每个泳道上样50μg总蛋白。在该实验中，收集一式两份样品。图18A和18B显示一式两份样品的结果。类似地，图18C和18D也显示一式两份样品的结果。在图18A 和18B中，未有明显的条带大小对应于裂解的PARP(89kDa)。

图19是显示与不同量的BVD-523或BVD-523组合30nM的 AZ628(一种RAF抑制剂)或3nM的达拉非尼孵育96小时后，A375 细胞活力的直方图。Bliss分数示于黄色框中。

图20是显示与不同量的BVD-523或BVD-523组合30nM的 AZ628或3nM的达拉非尼孵育24小时后，在A375细胞中半胱天冬酶(Caspase)活性的直方图。

图21是显示与不同量的BVD-523或BVD-523组合30nM的 AZ628或3nM的达拉非尼孵育48小时后，在A375细胞中半胱天冬酶活性的直方图。

图22是显示与不同量的BVD-523或BVD-523组合3μM的 ABT-263孵育96小时后，HCT116细胞活力的直方图。Bliss分数示于黄色框中。

图23是显示与不同量的BVD-523或BVD-523组合3μM的 ABT-263孵育24小时后，在HCT116细胞中半胱天冬酶活性的直方图。

图24是显示与不同量的BVD-523或BVD-523组合3μM的 ABT-263孵育48小时后，在HCT116细胞中半胱天冬酶活性的直方图。

图25是显示本文所用的剂量递增实验流程的流程图。

图26显示了研究中小鼠的各自到终点的时间。

图27显示研究中平均肿瘤生长(图27A)和Kaplan-Meier曲线 (图27B)。

图28A-28D显示多组施用达拉非尼/BVD-523组合的小鼠的平均肿瘤生长与单一疗法组的对比。

图29显示体内研究第1天起的平均体重变化百分比。

图30显示丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)途径的示意图。

图31A是显示使用Alamar蓝细胞活力测定法，AZ628/曲美替尼组合在HCT116细胞中抑制％的剂量矩阵。图31B是显示AZ628/曲美替尼组合的Bliss余量的剂量矩阵。图31C和31D显示使用Alamar 蓝细胞活力测定法，AZ628和曲美替尼单剂处理在HCT116细胞中相对于仅DMSO处理对照的活力％。图31E显示使用Alamar蓝细胞活力测定法，AZ628/曲美替尼组合处理在HCT116细胞中相对于仅 DMSO处理对照的活力％。

图32A是显示使用Alamar蓝细胞活力测定法，AZ628/BVD-523 组合在HCT116细胞中抑制％的剂量矩阵。图32B是显示 AZ628/BVD-523组合的Bliss余量模型的剂量矩阵。图32C和32D显示使用Alamar蓝细胞活力测定法，AZ628和BVD-523单剂处理在 HCT116细胞中相对于仅DMSO处理对照的活力％。图32E显示使用 Alamar蓝细胞活力测定法，AZ628/BVD-523组合处理在HCT116细胞中相对于仅DMSO处理对照的活力％。

图33A是显示使用Alamar蓝细胞活力测定法，索拉非尼 (sorafenib)/曲美替尼组合在HCT116细胞中抑制％的剂量矩阵。图 33B是显示索拉非尼/曲美替尼组合的Bliss余量的剂量矩阵。图33C 和33D显示使用Alamar蓝细胞活力测定法，索拉非尼和曲美替尼单剂处理在HCT116细胞中相对于仅DMSO处理对照的活力％。图33E 显示使用Alamar蓝细胞活力测定法，索拉非尼/曲美替尼组合处理在 HCT116细胞中相对于仅DMSO处理对照的活力％。

图34A是显示使用Alamar蓝细胞活力测定法，索拉非尼 /BVD-523组合在HCT116细胞中抑制％的剂量矩阵。图34B是显示索拉非尼/BVD-523组合的Bliss余量的剂量矩阵。图34C和34D显示使用Alamar蓝细胞活力测定法，索拉非尼和BVD-523单剂处理在 HCT116细胞中相对于仅DMSO处理对照的活力％。图34E显示使用 Alamar蓝细胞活力测定法，索拉非尼/BVD-523组合处理在HCT116 细胞中相对于仅DMSO处理对照的活力％

图35A是显示使用Alamar蓝细胞活力测定法，达拉非尼/曲美替尼组合在HCT116细胞中抑制％的剂量矩阵。图35B是显示达拉非尼 /曲美替尼组合的Bliss余量的剂量矩阵。图35C和35D显示使用 Alamar蓝细胞活力测定法，达拉非尼和曲美替尼单剂处理在HCT116 细胞中相对于仅DMSO处理对照的活力％。图35E显示使用Alamar 蓝细胞活力测定法，达拉非尼/曲美替尼组合处理在HCT116细胞中相对于仅DMSO处理对照的活力％。

图36A是显示使用Alamar蓝细胞活力测定法，达拉非尼 /BVD-523组合在HCT116细胞中抑制％的剂量矩阵。图36B是显示达拉非尼/BVD-523组合的Bliss余量的剂量矩阵。图36C和36D显示使用Alamar蓝细胞活力测定法，达拉非尼和BVD-523单剂处理在 HCT116细胞中相对于仅DMSO处理对照的活力％。图36E显示使用 Alamar蓝细胞活力测定法，达拉非尼/BVD-523组合处理在HCT116 细胞中相对于仅DMSO处理对照的活力％。

图37A是显示使用Alamar蓝细胞活力测定法，AZ628/BVD-523 组合在A375细胞中抑制％的剂量矩阵。图37B是显示AZ628/BVD-523 组合的Bliss余量的剂量矩阵。图37C和37D显示使用Alamar蓝细胞活力测定法，AZ628和BVD-523单剂处理在A375细胞中相对于仅DMSO处理对照的活力％。图37E显示使用Alamar蓝细胞活力测定法，AZ628/BVD-523组合处理在A375细胞中相对于仅DMSO处理对照的活力％。

图38A是显示使用Alamar蓝细胞活力测定法，索拉非尼/曲美替尼组合处理在A375细胞中抑制％的剂量矩阵。图38B是显示索拉非尼/曲美替尼组合的Bliss余量的剂量矩阵。图38C和38D显示使用 Alamar蓝细胞活力测定法，索拉非尼和曲美替尼单剂处理在A375细胞中相对于仅DMSO处理对照的活力％。图38E显示使用Alamar蓝细胞活力测定法，索拉非尼/曲美替尼组合处理在A375细胞中相对于仅DMSO处理对照的活力％。

图39A是显示使用Alamar蓝细胞活力测定法，索拉非尼 /BVD-523组合在A375细胞中抑制％的剂量矩阵。图39B是显示索拉非尼/BVD-523组合的Bliss余量的剂量矩阵。图39C和39D显示使用 Alamar蓝细胞活力测定法，索拉非尼/和BVD-523单剂处理在A375 细胞中相对于仅DMSO处理对照的活力％。图39E显示使用Alamar 蓝细胞活力测定法，索拉非尼//BVD-523组合处理在A375细胞中相对于仅DMSO处理对照的活力％。

图40A是显示使用Alamar蓝细胞活力测定法，达拉非尼/曲美替尼组合处理在A375细胞中抑制％的剂量矩阵。图40B是显示达拉非尼/曲美替尼组合的Bliss余量的剂量矩阵。图40C和40D显示使用 Alamar蓝细胞活力测定法，达拉非尼和曲美替尼单剂处理在A375细胞中相对于仅DMSO处理对照的活力％。图40E显示使用Alamar蓝细胞活力测定法，达拉非尼/曲美替尼组合处理在A375细胞中相对于仅DMSO处理对照的活力％。

图41A是显示使用Alamar蓝细胞活力测定法，达拉非尼 /BVD-523组合处理在A375细胞中抑制％的剂量矩阵。图41B是显示达拉非尼/BVD-523组合的Bliss余量的剂量矩阵。图41C和41D显示使用Alamar蓝细胞活力测定法，达拉非尼和BVD-523单剂处理在 A375细胞中相对于仅DMSO处理对照的活力％。图41E显示使用 Alamar蓝细胞活力测定法，达拉非尼/BVD-523组合处理在A375细胞中相对于仅DMSO处理对照的活力％。

图42显示A375(图42A-图42F)和G-361(图42G-图42L)细胞中单剂增殖测定法的结果。显示了用达拉非尼(图42A和图42G)、维罗非尼(Vemurafenib)(图42B和图42H)、TAK-632(图42C 和图42I)、BVD-523(图42D和治疗图42J)、SCH772984(图42E 和图42K)和紫杉醇(图42F和图42L)进行治疗的扩增结果。

图43A是显示达拉非尼/BVD-523组合在A375细胞中抑制％的剂量矩阵。图43B是显示达拉非尼/BVD-523组合的Loewe余量的剂量矩阵。图43C是显示达拉非尼/BVD-523组合的Bliss余量的剂量矩阵。图43D和43E分别显示达拉非尼和BVD-523单剂处理在A375细胞中相对于仅DMSO处理对照的活力％。

图44A是显示达拉非尼/SCH772984组合在A375细胞中抑制％的剂量矩阵。图43B是显示达拉非尼/SCH772984组合的Loewe余量的剂量矩阵。图43C是显示达拉非尼/SCH772984组合的Bliss余量的剂量矩阵。图43D和43E分别显示达拉非尼和SCH772984单剂处理在 A375细胞中相对于仅DMSO处理对照的活力％。

图45A是显示维罗非尼/BVD-523组合在A375细胞中抑制％的剂量矩阵。图45B是显示维罗非尼/BVD-523组合的Loewe余量的剂量矩阵。图45C是显示维罗非尼/BVD-523组合的Bliss余量的剂量矩阵。图45D和45E分别显示维罗非尼和BVD-523单剂处理在A375细胞中相对于仅DMSO处理对照的活力％。

图46A是显示维罗非尼/SCH772984组合在A375细胞中抑制％的剂量矩阵。图46B是显示维罗非尼/SCH772984组合的Loewe余量的剂量矩阵。图46C是显示维罗非尼/SCH772984组合的Bliss余量的剂量矩阵。图46D和46E分别显示维罗非尼和SCH772984单剂处理在 A375细胞中相对于仅DMSO处理对照的活力％。

图47A是显示TAK-632/BVD-523组合在A375细胞中抑制％的剂量矩阵。图47B是显示TAK-632/BVD-523组合的Loewe余量的剂量矩阵。图47C是显示TAK-632/BVD-523组合的Bliss余量的剂量矩阵。图47D和47E分别显示TAK-632和BVD-523单剂处理在A375 细胞中相对于仅DMSO处理对照的活力％。

图48A是显示TAK-632/SCH772984组合在A375细胞中抑制％的剂量矩阵。图48B是显示TAK-632/SCH772984组合的Loewe余量的剂量矩阵。图48C是显示TAK-632/SCH772984组合的Bliss余量的剂量矩阵。图48D和48E分别显示TAK-632和SCH772984单剂处理在A375细胞中相对于仅DMSO处理对照的活力％。

图49A是显示达拉非尼/BVD-523组合在G-361细胞中抑制％的剂量矩阵。图49B是显示达拉非尼/BVD-523组合的Loewe余量的剂量矩阵。图49C是显示达拉非尼/BVD-523组合的Bliss余量的剂量矩阵。图49D和49E分别显示达拉非尼和BVD-523单剂处理在G-361细胞中相对于仅DMSO处理对照的活力％。

图50A是显示达拉非尼/SCH772984组合在G-361细胞中抑制％的剂量矩阵。图50B是显示达拉非尼/SCH772984组合的Loewe余量的剂量矩阵。图50C是显示达拉非尼/SCH772984组合的Bliss余量的剂量矩阵。图50D和50E分别显示达拉非尼和SCH772984单剂处理在G-361细胞中相对于仅DMSO处理对照的活力％。

图51A是显示维罗非尼/BVD-523组合在G-361细胞中抑制％的剂量矩阵。图51B是显示维罗非尼/BVD-523组合的Loewe余量的剂量矩阵。图51C是显示维罗非尼/BVD-523组合的Bliss余量的剂量矩阵。图51D和51E分别显示维罗非尼和BVD-523单剂处理在G-361细胞中相对于仅DMSO处理对照的活力％。

图52A是显示维罗非尼/SCH772984组合在G-361细胞中抑制％的剂量矩阵。图52B是显示维罗非尼/SCH772984组合的Loewe余量的剂量矩阵。图52C是显示维罗非尼/SCH772984组合的Bliss余量的剂量矩阵。图52D和52E分别显示维罗非尼和SCH772984单剂处理在G-361细胞中相对于仅DMSO处理对照的活力％。

图53A是显示TAK-632/BVD-523组合在G-361细胞中抑制％的剂量矩阵。图53B是显示TAK-632/BVD-523组合的Loewe余量的剂量矩阵。图53C是显示TAK-632/BVD-523组合的Bliss余量的剂量矩阵。图53D和53E分别显示TAK-632和BVD-523单剂处理在G-361 细胞中相对于仅DMSO处理对照的活力％。

图54A是显示TAK-632/SCH772984组合在G-361细胞中抑制％的剂量矩阵。图54B是显示TAK-632/SCH772984组合的Loewe余量的剂量矩阵。图54C是显示TAK-632/SCH772984组合的Bliss余量的剂量矩阵。图54D和54E分别显示TAK-632和SCH772984单剂处理在G-361细胞中相对于仅DMSO处理对照的活力％。

图55A显示所测试的组合在A375和G-361两种细胞中的协同效应分数。图55B显示图55A中数值的图表。

图56A显示所测试的组合在A375和G-361两种细胞中的Loewe 体积。图56B显示图56A中数值的图表。

图57A显示所测试的组合在A375和G-361两种细胞中的Bliss 体积。图57B显示图57A中数值的图表。

图58显示BVD-523和SCH772984的组合的结果。图58A显示表示该组合在A375细胞中的抑制(％)的剂量矩阵。图58B-图58C 显示在58A中的组合在单剂增殖测定法中的结果。图58D显示在58A 中的组合的Loewe余量。58E显示在图58A中的组合的Bliss余量。

发明详述

本发明的一个实施方式是在有此需要的受试者中治疗或改善癌症的效应的方法。该方法包含给受试者施用有效量的(i)第一抗癌剂，其是BVD-523或其药学可接受的盐和(ii)第二抗癌剂，其是1型RAF 抑制剂或其药学可接受的盐，以治疗或改善的癌症的效应。

如本文所使用的，术语“治疗”、“处置”、“处理”及其语法变化表示使个体受试者经受某种治疗流程、治疗方案、处理或拯治，在其中期望在所述受试者如患者上获得生理反应或结果。具体而言，本发明的方法和组合物可用于减缓疾病症状的发展或者延缓疾病或病症的发作，或者中止疾病的发展的进程。然而，因为每一个治疗的受试者可能不对特定治疗流程、治疗方案、处理或拯治有响应，所以治疗并不要求在各个及每个受试者或受试群体，例如患者群体中实现所需的生理学应答或结果。因此，给定的受试者或受试群体，例如患者群里可能无法响应或不充分地响应治疗。

如本文所使用的，术语“改善”、“缓解”及其语法变体表示在受试者中降低某种疾病症状的严重程度。

如本文所使用的，“受试者”是哺乳动物，优选为人。除了人，本发明的范围之内的哺乳动物的种类包括，例如，农场动物、家养动物、实验室动物等。农场动物的一些实例包括牛、猪、马、山羊等。家养动物的的一些实例包括狗、猫等。实验动物的一些实例包括灵长类、大鼠、小鼠、兔、豚鼠等。

在本发明中，BVD-523是根据式(I)的化合物：

和其药学可接受的盐。BVD-523可以根据公开于例如美国专利号 7,3549,39的方法来合成。BVD-523的对映体和其两个对映体的外消旋混合物也包括在本发明的范围之内。BVD-523是一种ERK1/2抑制剂，被认为具有例如独特且与某些其他的ERK1/2抑制剂如SCH772984 不同的作用机制。例如，其他的ERK1/2抑制剂如SCH772984，抑制 ERK的自磷酸化(Morris等人，2013)，而BVD-523允许ERK的自磷酸化，同时仍抑制ERK(图18)。

如本文所使用的，“RAF抑制剂”是指(i)直接与RAF相互作用，如通过结合RAF和(ii)降低RAF的表达或活性的那些物质。RAF 抑制剂可通过其各自的结合模式被分类成两种类型。如本文所使用的， “1型”RAF抑制剂是靶向激酶活性构象中的ATP结合位点的那些抑制剂。“2型”RAF抑制剂是优先结合所述激酶的无活性构象的那些抑制剂。非限制性的1型RAF抑制剂的实例包括：

化合物7

(Li等人，2010)、

化合物9

(同上)、

化合物10

(同上)、

化合物13

(同上)、

化合物14

(同上)、达拉非尼 (GlaxoSmithKline)、GDC-0879(Genentech)、L-779450B-raf(Merck)、 PLX3202(Plexxikon)、PLX4720(Plexxikon)、SB-590885 (GlaxoSmithKline)、SB-699393(GlaxoSmithKline)、维罗非尼(Plexxikon)，其药学可接受的盐及其组合。优选地，1型RAF抑制剂是达拉非尼或其药学可接受的盐。

在该实施方式的一个方面，患有癌症的受试者具有体细胞BRAF 突变或对MAPK通路抑制剂治疗顽固。优选地，受试者对非ERK的 MAPK通路抑制剂治疗顽固。

如本文所使用的，“体细胞突变”是指在注定不会成为生殖细胞的任何细胞中发生的变化。所述突变可以是，例如，置换、删除、插入或融合。下表1显示BRAF突变的分布概况，如Sanger数据库中所示。

表1-BRAF突变分布概况

突变类型	突变体样本	百分比
			无义置换	23	0.07
错义置换	32955	99.07
			同义置换	80	0.24
阅读框内插入	25	0.08
			移码插入	1	0.00
阅读框内删除	13	0.04
			移码删除	5	0.02
复杂突变	39	0.12
			其他	172	0.52
总计	33263	100

BRAF突变在约66％的黑色素瘤中发现(Davies等人，2002；Brose 等人，2002；Hocket等人，2007)，在其他癌症中发现的百分比相对更低，为甲状腺肿瘤36％、结肠癌10％(Xu等人，2003；Fransen 等人，2004)。最普遍的BRAF突变发生在野生型蛋白激酶的第600 氨基酸处(SEQ ID NO：2)，其中缬氨酸置换为谷氨酸，形成突变体B-RafV600E，这占BRAF突变的约80％(Davies等人，

等人，2007)。相比野生型B-R的基础活性， B-RafV600E激酶结构域具有高500倍的激酶活性(Wan等人，2004)。在黑色素瘤中确定的其他BRAF突变中，V600K和V600D/R也很常见，并分别占据了所有BRAF突变的16％和3％(Long等，2011)。除了黑色素瘤，BRAF突变也常见于许多其他癌症，包括甲状腺乳头状癌、卵巢癌和结肠癌。(Wellbrock等人，2004)。在一项研究中，发现BRAF剪接变体(剪接掉外显子14和15)存在于5/24(21％) 个结肠直肠癌细胞系中(Seth等人，2009)。

下表2来自Sanger数据库，显示BRAF突变在人肿瘤中的分布和频率。

表2

下表3显示了选择BRAF基因的核酸和氨基酸序列。这些序列可以用于鉴定具有突变BRAF基因型的受试者的方法中(如在下面阐述的方法)。

表3

用于鉴定核酸中的突变(如上述鉴定的BRAF基因)的方法在本领域中公知。核酸可以从生物样品中获得。在本发明中，生物样品包括但不限于，血液、血浆、尿、皮肤、唾液和活检标本。生物样品是从由本领域中已知的常规程序和方法获自受试者。

用于鉴定突变的方法的非限制性实例包括PCR、测序、杂交捕获、溶液中捕获、分子倒置探针、荧光原位杂交(FISH)测定法，及其组合。

多种测序方法是本领域已知的。这些包括但不限于Sanger测序 (也称为双脱氧测序)和多种合成测序(SBS)方法，例如公开于 Metzker 2005、杂交测序、连接测序(例如，WO2005021786)、降解测序(例如，美国专利号5,622,824和6,140,053)和纳米孔测序(其可商购自Oxford Nanopore Technologies,UK)。在深度测序技术中，序列中的给定核苷酸在测序过程中被读到一次以上。深度测序技术在例如美国专利公开号20120264632和国际专利公开号WO2012125848 中公开。

检测突变的基于PCR的方法在本领域是已知的，其采用PCR扩增，其中所述样品中的每个靶序列具有一对相应的独特的序列特异性引物。例如，聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP) 方法允许基因组序列通过PCR扩增后快速检测突变。突变通过用特定的限制性内切酶消化鉴别和电泳鉴定。见例如Ota等人，2007。突变也可以利用实时PCR进行检测。见，例如，国际申请公开号 WO2012046981。

杂交捕获方法是本领域中已知的，并且公开于，例如，美国专利公开号20130203632和美国专利号8,389,219和8,288,520中。这些方法是基于靶基因组区域与用户设计的寡核苷酸的选择性杂交。可以与固定在高密度或低密度微阵列上的寡核苷酸进行杂交(阵列上捕获)，或与用配体(例如，生物素)修饰并在随后固定于固体(如珠子)表面的寡核苷酸进行溶液相杂交(溶液中捕获)。

分子倒置探针(MIP)法在本领域是已知的，并且在例如Absalan 等人，2008中公开。这些方法使用MIP分子，其是特殊的“挂锁”探针(Nilsson等人，1994)，用于基因分型。MIP分子是包含特异性区域、通用序列、限制性酶切位点和标签(索引)序列(16-22bp)的线性寡核苷酸。在这些方法中，MIP直接围绕目的遗传标志物/SNP 进行杂交。MIP方法还可以使用并行杂交于基因组DNA的大量“挂锁” 探针集合(Hardenbol等人，2003)。在完美匹配的情况下，基因组的同源性区域经过构象反转后被连接(如该技术的名称所表明)，并创造出环状分子。第一次限制性酶切后，用通用引物扩增所有分子。对扩增子再次进行限制性酶切，以确保产生用于微阵列杂交的短片段。标记产生的短片段，并通过标签序列，将其杂交于在阵列上的cTag (索引的互补链)。形成Tag-cTag双链体后，将检测到信号。

如本文所使用的，对MAPK通路抑制剂治疗“顽固”是指一个或多个MAPK通路抑制剂在治疗癌症中具有降低的功效。

如本文中所使用的，“促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路抑制剂”是减少在MAPK途径中蛋白的活性、表达或磷酸化而导致细胞生长减少或细胞死亡增加的任何物质。

哺乳动物MAPK级联的概述示于图30。MAPK途径的细节在例如Akinleye等人，2013中综述。简言之，对于图30中的ERK1/2的模块(浅紫色方框)，MAPK 1/2信号传导级联反应是由配体结合至受体酪氨酸激酶(RTK)而激活。活化的受体募集并磷酸化接头蛋白 Grb2和SOS，后者然后与膜结合的GTPase Ras相互作用并造成其活化。Ras以其活化的GTP-结合形式募集并激活Raf激酶(A-Raf、B-Raf 和C-Raf/Raf-1)。活化的Raf激酶激活MAPK 1/2(MKK1/2)，后者进而催化ERK1/2的激活序列Thr-Glu-Tyr中苏氨酸和酪氨酸残基的磷酸化。对于JNK/p38模块(图30中黄色方框)，上游激酶MAP3K，如MEKK1/4、ASK1/2和MLK1/2/3，激活MAP2K3/6(MKK3/6)、 MAP2K4(MKK4)和MAP2K7(MKK7)。这些MAP2K随后激活 JNK蛋白激酶，包括JNK1、JNK2、JNK3和p38α/β/γ/δ。为了执行其功能，JNK激活数个转录因子，包括c-Jun、ATF-2、NF-ATc1、 HSF-1和STAT3。对于ERK5模块(图30蓝色方框)，MAP2K5 (MKK5)的上游激酶是MEKK2和MEKK3。MEK5的最有特征性的下游靶标是ERK5，也被称为大MAP激酶1(BMK1)，因为它是其他MAPK的大小的两倍。

MAPK通路抑制剂的非限制性实例包括RAS抑制剂、RAF抑制剂、MEK抑制剂、ERK1/2抑制剂，其药学可接受的盐，及其组合。

如本文中所使用的，“RAS抑制剂”是指(ⅰ)例如通过结合RAS 直接与RAS相互作用，及(ii)降低RAS的表达或活性的那些物质。非限制示例性RAS抑制剂包括但不限于，法尼基转移酶抑制剂(如，例如，tipifarnib和洛那法尼(洛那法尼))、含法尼基小分子(如，例如，salirasib和TLN-4601)、DCAI(如Maurer公开，Maurer等人，2012)、Kobe0065和Kobe2602(如Shima公开，Shima等人， 2013)、HBS 3(Patgiri等人，2011)和AIK-4(Allinky)。

如本文中所使用的，“RAF抑制剂”表示(ⅰ)例如通过结合RAF 直接与RAF相互作用，且(ii)降低RAF的表达或活性的那些物质，如，例如，A-RAF、B-RAF和C-RAF(RAF-1)。非限制示例性RAF 抑制剂包括：

化合物7

(Li等人2010)、

化合物9

(同上)、

化合物10

(同上)、

化合物13

(同上)、

化合物14

(同上)、

化合物15

(同上)、

化合物16

(同上)、

化合物18

(同上)、

化合物19

(同上)、

化合物20

(同上)、

化合物21

(同上)、

化合物22

(同上)、

化合物23

(同上)、

化合物24

(同上)、

化合物25

(同上)、

化合物26

(同上)、

化合物27

(同上)、

化合物28

(同上)、

化合物30

(同上)、

化合物31

(同上)、

化合物32

(同上)、

化合物33

(同上)、

化合物34

(同上)、

化合物35

(同上)、

化合物36

(同上)、

化合物37

(同上)、

化合物38

(同上)、

化合物39

(同上)、

化合物40

(同上)、AAL881(Novartis)；AB-024(Ambit Biosciences)、ARQ-736 (ArQule)、ARQ-761(ArQule)、AZ628(Axon Medchem BV)、 BeiGene-283(BeiGene)、BIIB-024(MLN 2480)(Sunesis&Takeda)、 b-raf抑制剂(Sareum)、BRAF激酶抑制剂(Selexagen Therapeutics)、BRAF siRNA 313(tacaccagcaagctagatgca)和523 (cctatcgttagagtcttcctg)(Liu等人，2007)、CTT239065(Institute of Cancer Research)、达拉非尼(GSK2118436)、DP-4978(Deciphera Pharmaceuticals)、HM-95573(Hanmi)、GDC-0879(Genentech)、 GW-5074(Sigma Aldrich)、ISIS 5132(Novartis)、L779450(Merck)、 LBT613(Novartis)、LErafAON(NeoPharm、Inc.)、LGX-818 (Novartis)、帕唑帕尼(GlaxoSmithKline)、PLX3202(Plexxikon)、 PLX4720(Plexxikon)、PLX5568(Plexxikon)、RAF-265(Novartis)、 RAF-365(Novartis)、瑞戈非尼(Bayer Healthcare Pharmaceuticals、 Inc.)、RO 5126766(Hoffmann-La Roche)、SB-590885 (GlaxoSmithKline)、SB699393(GlaxoSmithKline)、索拉非尼(Onyx Pharmaceuticals)、TAK 632(Takeda)、TL-241(Teligene)、维罗非尼(RG7204或PLX4032)(Daiichi Sankyo)、XL-281(Exelixis)、 ZM-336372(AstraZeneca)，其药学可接受的盐，及其组合。

如本文中所使用的，“MEK抑制剂”表示(i)例如通过结合MEK 直接与MEK相互作用且(ii)降低MEK的活性或表达的那些物质。因此，在MEK上游起作用的抑制剂，如RAS抑制剂和RAF抑制剂，不是根据本发明的MEF抑制剂。非限制性的MEK抑制剂的实例包括炭疽毒素、安卓奎诺尔(antroquinonol，Golden Biotechnology)、 ARRY-142886(6-(4-溴-2-氯-苯基氨基)-7-氟-3-甲基-3H-苯并咪唑-5- 羧酸酸(2-羟基乙氧基)-酰胺)(ArrayBioPharma)、 ARRY-438162(Array BioPharma)、AS-1940477(Astellas)、 AS-703988(Merck KGaA)、bentamapimod(Merck KGaA)、 BI-847325(Boehringer Ingelheim)、E-6201(Eisai)、 GDC-0623(Hoffmann-La Roche)、GDC-0973(cobimetinib) (Hoffmann-LaRoche)、L783277(Merck)、炭疽毒素致死因子部分、 MEK162(Array BioPharma)、PD 098059(2-(2'-氨基-3-甲氧基苯基) -oxanaphthalen-4-酮)(Pfizer)、PD 184352(CI-1040)(Pfizer)、 PD-0325901(Pfizer)、pimasertib(Santhera Pharmaceuticals)、 RDEA119(Ardea Biosciences/Bayer)、refametinib(AstraZeneca)、 RG422(ChugaiPharmaceutical Co.)、RO092210(Roche)、RO4987655 (Hoffmann-La Roche)、RO5126766(Hoffmann-La Roche)、selumetinib (AZD6244)(AstraZeneca)、SL327(Sigma)、TAK-733(Takeda)、曲美替尼(Japan Tobacco)、U0126(1,4-二氨基-2,3-二氰基-1,4-双(2-氨基苯硫基)丁二烯)(Sigma)、WX-554(Wilex)、YopJ多肽(Mittal 等人，2010)，其药学可接受的盐，及其组合。

如本文中所使用的，“ERK1/2抑制剂”表示(i)例如通过结合 ERK1/2直接与ERK1和/或ERK2相互作用且(ii)降低ERK1和/ 或ERK2蛋白激酶的活性或表达的那些物质。因此，在ERK1/2上游起作用的抑制剂，如MEK抑制剂和RAF抑制剂，不是根据本发明的 ERK1/2抑制剂。ERK1/2抑制剂的非限制性实例包括AEZS-131 (Aeterna Zentaris)、AEZS-136(Aeterna Zentaris)、BVD-523， SCH-722984(Merck&Co.)、SCH-772984(Merck&Co.)、 SCH-900353(MK-8353)(Merck&Co.)，其药学可接受的盐，及其组合。

在该实施方式的另一个方面，该方法还包括向受试者施用有效用于治疗或改善癌症的效应的至少一种额外的治疗剂。所述额外的治疗剂可以选自抗体或其片段、细胞毒性剂、毒素、放射性核素、免疫调节剂、光敏治疗剂、放射增敏剂、激素、抗血管生成剂，及其组合。

如本文中所使用的，“抗体”包括天然存在的免疫球蛋白，以及非天然存在的免疫球蛋白，包括，例如，单链抗体、嵌合抗体(如，人源化小鼠抗体)和异源偶联抗体(例如，双特异性抗体)。抗体片段包括结合抗原的那些，(例如，的Fab'、F(ab')2、Fab、Fv和rIgG)。另见，例如，Pierce Catalog and Handbook，1994-1995(Pierce Chemical Co.,，Rockford，Ill。)；Kuby，J.，Immunology，第3版， WH Freeman&Co.,New York(1998)。术语抗体还包括二价或双特异性分子、双抗体、三抗体和四抗体。术语“抗体”还包括多克隆和单克隆抗体。

可以在本发明中使用的治疗性抗体的实例包括利妥昔单抗 (Rituxan)、西妥昔单抗(爱必妥)、贝伐单抗(Avastin)和 Ibritumomab(Zevalin)。

根据本发明的细胞毒性剂包括DNA损伤剂、抗代谢物、抗微管剂、抗生素等。DNA损伤剂包括烷化剂、铂基试剂、嵌入剂、DNA 复制抑制剂。DNA烷化剂的非限制性实例包括环磷酰胺、氮芥、尿嘧啶氮芥、美法仑、苯丁酸氮芥、异环磷酰胺、卡莫司汀、洛莫司汀、链佐星、白消安、替莫唑胺，其药学可接受的盐、原药及其组合。铂基试剂的非限制性实例包括顺铂、卡铂、奥沙利铂、奈达铂、沙铂、四硝酸三钼，其药学可接受的盐、原药及其组合。非限制性的嵌入剂的实例包括阿霉素、柔红霉素、伊达比星、米托蒽醌，其药学可接受的盐、原药及其组合。DNA复制抑制剂的非限制性实例包括依立替康、托泊替康、安吖啶、依托泊苷、磷酸依托泊苷、替尼泊苷，其药学可接受的盐、原药及其组合。抗代谢物包括叶酸拮抗剂如甲氨蝶呤和培美曲塞，嘌呤拮抗剂如6-巯基嘌呤、达卡巴嗪和氟达拉滨，及嘧啶拮抗剂如5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、卡培他滨、吉西他滨、地西他滨，其药学可接受的盐、原药及其组合。抗微管剂包括但不限于长春花生物碱、紫杉醇

多西紫杉醇

和伊沙匹隆

抗生素包括但不限于放线菌素、蒽环类、戊柔比星、表柔比星、博莱霉素，普卡霉素、丝裂霉素，其药学可接受的盐、原药及其组合。

根据本发明的细胞毒性剂也包括PI3K/Akt通路的抑制剂。非限制性的PI3K/Akt信号通路抑制剂的实例包括A-674563(CAS# 552325-73-2)、AGL 2263、AMG-319(Amgen，Thousand Oaks， CA)、AS-041164(5-苯并[1,3]二氧杂环戊烯-5-基亚甲基-噻唑烷-2,4-二酮)、AS-604850(5-(2,2-二氟-苯并[1,3]二氧杂环戊烯-5-基亚甲基) -噻唑烷2,4-二酮)、AS-605240(5-喹喔啉-6-亚甲基-1,3-噻唑烷-2,4- 二酮)、AT7867(CAS#857531-00-1)、苯并咪唑系列、Genentech (Roche Holdings Inc.,South San Francisco,CA)、BML-257(CAS #32387-96-5)、CAL-120(Gilead Sciences，Froster City，CA)、 CAL-129(GileadSciences)、CAL-130(Gilead Sciences)、CAL-253 (Gilead Sciences)、CAL-263(GileadSciences)、CAS#612847-09-3、 CAS#681281-88-9、CAS#75747-14-7、CAS#925681-41-0、CAS# 98510-80-6、CCT128930(CAS#885499-61-6)、CH5132799(CAS #1007207-67-1)、CHR-4432(Chroma Therapeutics,Ltd.,Abingdon, UK)、FPA 124(CAS#902779-59-3)、GS-1101(CAL-101)(Gilead Sciences)、GSK 690693(CAS#937174-76-0)、H-89(CAS# 127243-85-0)、和厚朴酚、IC87114(Gilead Science)、IPI-145(Intellikine Inc.)、KAR-4139(KarusTherapeutics,Chilworth,UK)、KAR-4141 (Karus Therapeutics)、KIN-1(KarusTherapeutics)、KT 5720 (CAS#108068-98-0)、米替福新、MK-2206二盐酸盐 (CAS#1032350-13-2)、ML-9(CAS#105637-50-1)、纳曲吲哚盐酸盐、OXY-111A(NormOxys Inc.，Brighton，MA)、哌立福新、 PHT-427(CAS#1191951-57-1)、PI3激酶δ抑制剂,Merck KGaA(Merck&Co.,Whitehouse Station,NJ)、PI3激酶δ抑制剂，Genentech (Roche HoldingsInc.)、PI3激酶δ抑制剂,Incozen(Incozen Therapeutics,Pvt.Ltd.,Hydrabad,India)、PI3激酶δ抑制剂-2, Incozen(IncozenTherapeutics)、PI3激酶抑制剂，Roche-4(RocheHoldings Inc.)、PI3激酶抑制剂Roche(Roche Holdings Inc.)、PI3 激酶抑制剂，Roche-5(Roche Holdings Inc.)、PI3-α/δ抑制剂，Pathway Therapeutics(Pathway TherapeuticsLtd.,South San Francisco,CA)、 PI3-δ抑制剂，Cellzome(Cellzome AG，Heidelberg,Germany)， PI3-δ抑制剂，Intellikine(Intellikine Inc.，La Jolla，CA)、PI3-δ 抑制剂，Pathway Therapeutics-1(Pathway Therapeutics Ltd.)、PI3-δ 抑制剂，PathwayTherapeutics-2(Pathway Therapeutics Ltd.)、 PI3-δ/γ抑制剂，Cellzome(CellzomeAG)、PI3-δ/γ抑制剂，Cellzome (Cellzome AG)，PI3-Δ/γ抑制剂，Intellikine(Intellikine Inc.)、 PI3-Δ/γ抑制剂，Intellikine(Intellikine Inc.)、PI3-Δ/γ抑制剂，Pathway Therapeutics(Pathway Therapeutics Ltd.)、PI3-δ/γ抑制剂，PathwayTherapeutics(Pathway Therapeutics Ltd.)、PI3-γ抑制剂Evotec (Evotec)、PI3-γ抑制剂，Cellzome(Cellzome AG)、PI3-γ抑制剂，Pathway Therapeutics(PathwayTherapeutics Ltd.)、PI3Kδ/γ抑制剂，Intellikine-1(Intellikine Inc.)、PI3Kδ/γ抑制剂，Intellikine-1 (Intellikine Inc.)、pictilisib(Roche Holdings Inc.)、PIK-90(CAS #677338-12-4)、SC-103980(Pfizer,New York,NY)、SF-1126 (SemaforePharmaceuticals,Indianapolis,IN)、SH-5、SH-6、四氢姜黄素、TG100-115(TargegenInc.,San Diego,CA)、曲西立滨、 X-339(Xcovery，West Palm Beach,FL)、XL-499(Evotech，Hamburg, Germany)，或其药学可接受的盐，及其组合。

在本发明中，术语“毒素”指植物或动物来源的抗原毒药或毒液。一个实例是白喉毒素或其部分。

在本发明中，“放射性核素”指一种放射性物质，例如通过静脉注射或口服施用于患者后，其通过患者的正常代谢渗入靶器官或组织，在那里其提供了短时的局部放射作用。放射性核素的实例包括但不限于，I-125、At-211、Lu-177、Cu-67、I-131、Sm-153、Re-186、P-32、 Re-188、In-114m和Y-90。

在本发明中，术语“免疫调节剂”是指一种物质，其通过增加或降低免疫系统产生抗体或者识别并与启动其生产的抗原进行反应的致敏细胞的能力而改变免疫应答。免疫调节剂可以是重组的、合成的，或天然的制备物，包括细胞因子、皮质类固醇、细胞毒性剂、胸腺素，和免疫球蛋白。一些免疫调节是在体内天然存在，并且这些物种中的某些可以以药学制备物形式得到。免疫调节剂的实例包括，但不限于，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、干扰素、咪喹莫特和来自细菌的细胞膜级分、IL-2、IL-7、IL-12、CCL3、CCL26、CXCL7及合成的胞嘧啶磷酸鸟苷(CpG)。

在本发明中，术语“光敏治疗剂”是指在暴露于光时即活化的化合物和组合物。光敏治疗剂的某些实例在例如美国专利申请号 2011/0152230A1，“Photoactive MetalNitrosyls For Blood Pressure Regulation And Cancer Therapy。”中公开。

在本发明中，术语“放射致敏剂”是指使肿瘤细胞对放射治疗更敏感的化合物。放射增敏剂的实例包括米索硝唑、甲硝唑、替拉扎明，和反式藏红花钠。

在本发明中，术语“激素”是指由身体一部分的细胞释放的、影响身体另一部分的细胞的物质。激素的实例包括但不限于，前列腺素、白三烯、前列腺环素、血栓素、胰淀素、抗穆勒氏管激素、脂联素、促肾上腺皮质激素、血管紧张素原、血管紧张素、加压素、心房肽、脑利钠肽、降钙素、缩胆囊素、促肾上腺皮质激素释放激素、脑啡肽、内皮素、促红细胞生成素、卵泡刺激素、甘丙肽、胃泌素、生长素释放肽、胰高血糖素、促性腺激素释放激素、生长激素释放激素、人绒毛膜促性腺激素、人胎盘催乳素、生长激素、抑制素、胰岛素、促生长因子、瘦素、促脂解激素、促黄体激素、黑素细胞刺激素、促胃动素、食欲素、催产素、胰多肽、甲状旁腺激素、催乳素、促乳素释放激素、松弛素、肾素、分泌素、生长抑素、血小板生成素、促甲状腺激素、睾酮、脱氢表雄酮、雄烯二酮、双氢睾酮、醛固酮，雌二醇、雌酮、雌三醇、皮质醇、孕酮、骨化三醇和骨化二醇。

一些化合物干扰某些激素的活性或阻止某些激素的产生。这些激素干扰化合物包括但不限于，他莫昔芬

阿那曲唑

来曲唑

和氟维司群

这类化合物也在本发明激素的含义内。

如本文中所使用的，“抗血管生成”剂是指降低或抑制新血管生长的物质，例如，血管内皮生长因子(VEGF)的抑制剂和血管内皮细胞迁移的抑制剂。抗血管生成剂包括但不限于2-甲氧基雌二醇、血管抑素、贝伐单抗、软骨来源的血管生成抑制因子、血管内皮抑制素、 IFN-α、IL-12、伊曲康唑、利诺胺、血小板因子-4、催乳素、SU5416、苏拉明、tasquinimod、tecogalan、四硫代钼酸盐、沙利度胺、血小板反应蛋白、血小板反应蛋白、TNP-470、阿柏西普，其药学可接受的盐、原药及其组合。

在该实施方式的另一个方面，第一和第二抗癌剂的施用相比任一抗癌剂的单独施用提供了协同效应。如本文中所使用的，“协同”是指比加合的作用更多。协同效应可以通过本领域已知的各种测定法测定，包括但不限于本文公开的那些方法，如Bliss余量测定法。

本发明的另一个实施方式是在有此需要的受试者中治疗或改善癌症的效应的方法。这种方法包括给受试者施用有效量的(i)BVD-523 或其药学可接受的盐和(ii)第二抗癌症剂，其是达拉非尼或其药学可接受的盐，以治疗或改善癌症的效应。

合适的和优选的受试者如本文所公开。在本实施方式中，所述方法可用于治疗上文公开的癌症，包括具有上文确定的突变背景的那些癌症。鉴定这些突变的方法也如上文所阐述。

在该实施方式的一个方面，BVD-523或其药学可接受的盐是以进一步包括药学可接受的载体或稀释剂的药用组合物的形式施用。

在该实施方式的另一个方面，达拉非尼或其药学可接受的盐是以进一步包括药学可接受的载体或稀释剂的药用组合物的形式施用。

在该实施方式的另一个方面，所述方法还包括施用至少一种附加的治疗剂，优选的为如本文所公开的PI3K/Akt通路的抑制剂。

在该实施方式的另一个方面，第一和第二抗癌剂的施用相比任一抗癌剂的单独施用提供了协同效应。

合适的和优选的1型RAF抑制剂如本文所公开。在该实施例中，对癌细胞死亡的产生可在具有各种突变的背景和/或有如以上所公开的特征的癌细胞中实现。鉴定此类突变的方法也在上文阐述。

在该实施方式的一个方面，所述方法可以在体外或体内进行，并且可以在本文公开的癌症类型的细胞中通过例如杀死癌细胞而产生癌细胞死亡。

在该实施方式的另一个方面，所述癌细胞是哺乳动物癌细胞。优选地，哺乳动物癌细胞从选自如下的哺乳类获得：人、灵长类动物、农场动物，和家养动物。更优选地，哺乳动物癌细胞是人癌细胞。

在该实施方式的另一个方面，将癌细胞与第一和第二抗癌剂接触相比于癌细胞与任一抗癌剂单独接触提供了协同效应。

在该实施方式的另一个方面，所述方法还包括将癌细胞与至少一种附加的治疗剂，优选PI3K/Akt通路的抑制剂接触，如本文所公开。

在该实施方式的另一个方面，相比于癌细胞与任一单独抗癌剂接触，将癌细胞与第一和第二抗癌剂接触提供了协同效应。在本实施例中，“接触”是指将BVD-523和1型RAF抑制剂，和可选的一种或多种其他治疗剂紧靠癌细胞。这可通过使用药物递送的常规技术递送至哺乳动物或在体外的情况通过例如，将BVD-523和1型RAF抑制剂，和可选的其他治疗剂置于癌细胞所在的培养基来实现。

本发明的另一个实施方式是用于在有此需要的受试者中治疗或改善癌症的效应的试剂盒。此试剂盒包括有效量的(i)第一抗癌剂，其是BVD-523或其药学可接受的盐和(ii)第二抗癌剂，其是1型RAF 抑制剂或其药学可接受的的盐，与使用说明书一同包装。

所述试剂盒也可以包括合适的储存容器储存本发明的各种抗癌剂 (其可以是例如药用组合物的形式)和其他试剂，例如，缓冲剂，平衡盐溶液等，例如，安瓿、小瓶、管等，用于施用抗癌剂于受试者。本发明的抗癌剂和其他试剂可以以任何便利的形式存在于试剂盒中，如，例如以溶液或粉末形式。所述试剂盒可进一步包括包装容器，可选地具有用于容纳药用组合物和其他可选试剂的一个或多个分区。

合适和优选的受试者和1型RAF抑制剂如本文所公开。在该实施方式中，所述试剂盒可用于治疗上文公开的癌症，包括具有本文鉴定的突变背景的那些癌症。鉴定这种突变的方法阐述于上文。

在该实施方式的另一个方面，所述试剂盒进一步包含至少一种附加的治疗剂，优选地为PI3K/Akt通路的抑制剂，如本文所公开。

本发明的另一个实施方式是用于在有此需要的受试者中治疗或改善癌症的效应的药用组合物。该药用组合物包含药学可接受的稀释剂或载体和有效量的(i)第一抗癌剂，其是BVD-523或其药学可接受的盐和(ii)第二抗癌剂，其是1型RAF抑制剂或其药学可接受的盐，其中，第一和第二抗癌剂的施用相比任一抗癌剂的单独施用提供了协同效应。此药用组合物可以进一步包含药学可接受的稀释剂或载体。

合适的和优选的受试者和1型RAF抑制剂如本文所公开。本发明的药用组合物可以用于治疗上文公开的癌症，包括具有本文鉴定的突变背景的那些癌症。鉴定此类突变的方法也在上文阐述。

在该实施方式的另一个方面，该药用组合物进一步包含至少一种附加的治疗剂，优选地为PI3K/Akt通路的抑制剂，如本文所公开。

本发明的另一个实施方式是有此需要的受试者中治疗或改善癌症的效应的方法。这种方法包括给受试者施用有效量的(i)第一抗癌剂，其是BVD-523或其药学可接受的盐和(ii)第二抗癌剂，其是RAF 抑制剂，选自AAL881(Novartis)；AB-024(AmbitBiosciences)、 ARQ-736(ArQule)、ARQ-761(ArQule)、AZ628(Axon Medchem BV)、BeiGene-283(BeiGene)、BIIB-024(MLN 2480)(Sunesis&Takeda)、 b-raf抑制剂(Sareum)、BRAF激酶抑制剂(Selexagen Therapeutics)、 BRAF siRNA 313(tacaccagcaagctagatgca)和253 (cctatcgttagagtcttcctg)、CTT239065(Institute of Cancer Research)、 DP-4978(Deciphera Pharmaceuticals)、HM-95573(Hanmi)、GW-5074 (Sigma Aldrich)、ISIS5132(Novartis)、LErafAON(NeoPharm，Inc.)、 LBT613(Novartis)、LGX-818(Novartis)、帕唑帕尼 (GlaxoSmithKline)、PLX5568(Plexxikon)、RAF-265(Novartis)、 RAF-365(Novartis)、瑞戈非尼(Bayer Healthcare Pharmaceuticals， Inc.)、RO 5126766(Hoffmann-La Roche)、TAK 632(Takeda)、TL-241 (Teligene)、XL-281(Exelixis)，其药学可接受的盐，及其组合，以治疗或改善的癌症的效应。优选地，第二抗癌剂是瑞戈非尼(regorafenib) 或其药学可接受的盐。

在本实施方式中，合适的和优选的受试者如本文所公开。在本实施方式中，这些方法可以用于治疗上文公开的癌症，包括具有本文鉴定的突变背景的那些癌症。鉴定此类突变的方法也在上文阐述。

在该实施方式的另一个方面，如本文所公开的方法进一步包括施用至少一种附加的治疗剂，优选地为PI3K/Akt通路的抑制剂，如本文所公开。

本发明的另一个实施方式是产生癌细胞死亡的方法。此方法包括将癌细胞接触有效量的(i)第一抗癌剂，其是BVD-523或其药学可接受的盐和(ii)第二抗癌剂，其是RAF抑制剂，选自AAL881 (Novartis)；AB-024(Ambit Biosciences)、ARQ-736(ArQule)、ARQ-761 (ArQule)、AZ628(Axon Medchem BV)、BeiGene-283(BeiGene)、 BIIB-024(MLN 2480)(Sunesis&Takeda)、b-raf抑制剂(Sareum)、 BRAF激酶抑制剂(Selexagen Therapeutics)、BRAF siRNA 313 (tacaccagcaagctagatgca)和253(cctatcgttagagtcttcctg)、CTT239065(Institute of Cancer Research)、DP-4978(Deciphera Pharmaceuticals)、 HM-95573(Hanmi)、GW-5074(Sigma Aldrich)、ISIS 5132(Novartis)、 LErafAON(NeoPharm，Inc.)、LBT613(Novartis)、LGX-818 (Novartis)、帕唑帕尼(GlaxoSmithKline)、PLX5568(Plexxikon)、 RAF-265(Novartis)、RAF-365(Novartis)、瑞戈非尼(Bayer HealthcarePharmaceuticals，Inc.)、RO 5126766(Hoffmann-La Roche)、TAK 632 (Takeda)、TL-241(Teligene)、XL-281(Exelixis)，其药学可接受的盐，及其组合，以治疗或改善的癌症的效应。优选地，第二抗癌剂是瑞戈非尼或其药学可接受的盐。

合适的和优选的癌细胞如本文所公开。在本实施方式中，产生癌细胞死亡可在具有各种突变的背景和/或具有如上文公开的特征的癌细胞中实现。鉴定此类突变的方法也在上文中阐述。

本实施方式中的方法可在体外或体内进行，可用以在本文公开的癌症类型的细胞中通过例如杀死癌细胞而产生癌细胞死亡。

在该实施方式的一个方面，所述癌细胞是哺乳动物癌细胞。哺乳动物癌细胞从选自如下的哺乳类获得：人、灵长类动物、农场动物，和家养动物。更优选地，哺乳动物癌细胞是人癌细胞。

在该实施方式的另一个方面，该方法进一步包括施用至少一种附加的治疗剂，优选地为PI3K/Akt通路的抑制剂，如本文所公开。

在该实施方式的另一个方面，相比于癌细胞与任一单独抗癌剂接触，癌细胞与第一和第二抗癌剂的接触提供了协同效应。

在本实施例中，“接触”是指将BVD-523和RAF抑制剂，及可选的一种或多种其他治疗剂紧靠癌细胞。这可通过使用药物递送的常规技术递送至哺乳动物，或在体外的情况通过例如，将BVD-523和RAF 抑制剂，和可选的其他治疗剂置于癌细胞所在的培养基来实现。

本发明的另一个实施方式是用于在有此需要的受试者中治疗或改善癌症的效应的试剂盒。此试剂盒包括有效量的(i)第一抗癌剂，其是BVD-523或其药学可接受的盐和(ii)第二抗癌剂，其是RAF抑制剂，选自AAL881(Novartis)；AB-024(Ambit Biosciences)、ARQ-736 (ArQule)、ARQ-761(ArQule)、AZ628(Axon Medchem BV)、 BeiGene-283(BeiGene)、BIIB-024(MLN 2480)(Sunesis&Takeda)、 b-raf抑制剂(Sareum)、BRAF激酶抑制剂(Selexagen Therapeutics)、 BRAF siRNA 313(tacaccagcaagctagatgca)和253(cctatcgttagagtcttcctg)、CTT239065(Institute of Cancer Research)、 DP-4978(Deciphera Pharmaceuticals)、HM-95573(Hanmi)、GW-5074 (Sigma Aldrich)、ISIS 5132(Novartis)、LErafAON(NeoPharm，Inc.)、 LBT613(Novartis)、LGX-818(Novartis)、帕唑帕尼 (GlaxoSmithKline)、PLX5568(Plexxikon)、RAF-265(Novartis)、 RAF-365(Novartis)、瑞戈非尼(Bayer Healthcare Pharmaceuticals， Inc.)、RO 5126766(Hoffmann-LaRoche)、TAK 632(Takeda)、TL-241 (Teligene)、XL-281(Exelixis)，其药学可接受的盐，及其组合，与使用说明书一同包装。优选地，第二抗癌剂是瑞戈非尼或其药学可接受的盐。

在本实施方式中，合适的和优选的受试者如本文所公开。在此实施方式中，所述试剂盒可用于治疗上文公开的癌症，包括具有本文鉴定的突变背景的那些癌症。鉴定这些突变的方法阐述于上文。

在该实施方式的另一个方面，该试剂盒进一步包含至少一种附加的治疗剂，优选地为PI3K/Akt通路的抑制剂，如本文所公开。

本发明的另一个实施方式是用于在有此需要的受试者中治疗或改善癌症的效应的药用组合物。该药用组合物包含药学可接受的稀释剂或载体和有效量的(i)第一抗癌剂，其是BVD-523或其药学可接受的盐和(ii)第二抗癌剂，其是RAF抑制剂，选自AAL881(Novartis)； AB-024(Ambit Biosciences)、ARQ-736(ArQule)、ARQ-761(ArQule)、 AZ628(Axon Medchem BV)、BeiGene-283(BeiGene)、BIIB-024(MLN 2480)(Sunesis&Takeda)、b-raf抑制剂(Sareum)、BRAF激酶抑制剂(Selexagen Therapeutics)、BRAF siRNA 313(tacaccagcaagctagatgca) 和253(cctatcgttagagtcttcctg)、CTT239065(Institute ofCancer Research)、DP-4978(Deciphera Pharmaceuticals)、HM-95573 (Hanmi)、GW-5074(Sigma Aldrich)、ISIS 5132(Novartis)、LErafAON (NeoPharm，Inc.)、LBT613(Novartis)、LGX-818(Novartis)、帕唑帕尼(GlaxoSmithKline)、PLX5568(Plexxikon)、RAF-265(Novartis)、 RAF-365(Novartis)、瑞戈非尼(Bayer HealthcarePharmaceuticals， Inc.)、RO 5126766(Hoffmann-La Roche)、TAK 632(Takeda)、TL-241(Teligene)、XL-281(Exelixis)，其药学可接受的盐，及其组合，其中第一和第二抗癌剂的施用相比于单独的任抗癌剂的施用提供了协同效应。

在本实施方式中，合适的和优选的受试者如本文所公开。本发明的药用组合物可以用于治疗上文公开的癌症，包括具有本文鉴定的突变背景的那些癌症。鉴定这些突变的方法亦阐述于上文。

根据本发明的所述药用组合物可以是包含两种抗癌剂的单位剂型。在该实施方式的另一个方面，第一抗癌剂以第一种单位剂型，而第二抗癌剂以与第一种分开的第二种单位剂型。

第一和第二抗癌剂可以共施用于受试者，可以是同时或在不同的时刻，如医师认为的最适时刻。如果第一和第二抗癌剂是在不同的时间施用，例如系列施用，所述第一抗癌剂可以在第二抗癌剂之前施用于受试者。或者，第二抗癌剂可以在第一抗癌剂之前施用于受试者。

在本发明中，“有效量”或“治疗有效量”的本发明的抗癌剂，包括本文所公开的含有相同内容的药用组合物，是指当施用于受试者时，这种试剂或组合物的量足以起到如本文描述的有益的或期望的结果。有效的剂型，施用模式和剂量用量可根据经验确定，而且本领域技术人员有能力作出这类决定。本领域技术人员理解的是，剂量用量会随着施用途径、排泄速率、治疗的持续时间、任何其他正施用的药物的性质、哺乳动物的物种例如人患者的年龄、身材大小和在医学和兽医学的领域中众所周知的类似因素而变化。在一般情况下，根据本发明的试剂或组合物的合适剂量将是这样的试剂或组合物的量，其是有效产生期望效果的最低剂量。本发明的试剂或组合物的有效剂量可以以二、三、四、五、六个或更多分剂量施用，在一天中合适的时间间隔分开施用。

BVD-523、RAF抑制剂或本文公开的另外的抗癌剂的剂量的合适的非限制性实例为从约1mg/kg至2400mg/kg每天、例如从约1mg/kg 到约1200mg/kg每天、75mg/kg每天到约300mg/kg每天、包括从约 1mg/kg到约100mg/kg每天。这种试剂的其他代表性剂量包括约1mg /kg、5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、 35mg/kg、40mg/kg、45mg/kg、50mg/kg、60mg/kg、70mg/kg、75mg/kg、 80mg/kg、90mg/kg、100mg/kg、125mg/kg、150mg/kg、175mg/kg、 200mg/kg、250mg/kg、300mg/kg、400mg/kg、500mg/kg、600mg/kg、 700mg/kg、800mg/kg、900mg/kg、1000mg/kg、1 100mg/kg、1200mg/kg、 1300mg/kg、1400mg/kg、1500mg/kg、1600mg/kg、1700mg/kg、 1800mg/kg、1900mg/kg、2000mg/kg、2100mg/kg、2200mg/kg及2300mg/kg每天。BVD-523、RAF抑制剂或本文公开的其他抗癌剂的有效剂量可以以二、三、四、五、六个或更多个分剂量，在一天中合适的时间间隔分别施用。

所述BVD-523、RAF抑制剂或其他抗癌剂或本发明的包含相同内容的药用组合物可以以任何期望的和有效的方式施用：用于口服摄取、或作为软膏或滴液对局部施用于眼睛，或者以任何适当的方式进行肠胃外或其他施用，例如腹膜内、皮下、局部、皮内、吸入、肺内、直肠、阴道、舌下、肌内、静脉内、动脉内、鞘内或淋巴内施用。进一步地，BVD-523、RAF抑制剂或其他抗癌剂或本发明的含有相同内容的药用组合物可与其他处理一起施用。如有需要，BVD-523、RAF抑制剂或其他抗癌剂或本发明的含有相同内容的药用组合物可以包在胶囊内或以其他方式保护不受胃或其他分泌物的破坏。

本发明的药用组合物包含一种或多种活性成分，例如混合有一种或多种药学可接受的稀释剂或载体的抗癌剂，和可选的一种或多种其他化合物、药物、成分和/或材料。无论所选为何种施用途径，本发明的试剂/化合物都通过本领域技术人员已知的常规方法配制成药学可接受的剂型。例如，见Remington,The Science and Practice of Pharmacy(21^st Edition,Lippincott Williams and Wilkins, Philadelphia,PA.)。

药学可接受的稀释剂或载体在本领域公知(参见，例如， Remington,The Scienceand Practice of Pharmacy(第21版, Lippincott Williams and Wilkins,Philadelphia,PA.)及美国国家处方集(American Pharmaceutical Association,Washington,D.C.))，且包括糖(例如，乳糖、蔗糖、甘露糖醇、山梨糖醇)、淀粉、纤维素制备物、磷酸钙(例如磷酸二钙、磷酸三钙和磷酸氢钙)、柠檬酸钠、水、水溶液(例如，盐水、氯化钠注射液、林格氏注射液、右旋糖注射液、右旋糖和氯化钠注射液、乳酸林格氏注射液)、醇(例如，乙醇、丙醇、苄醇)、多元醇(例如，甘油、丙二醇，和聚乙二醇)、有机酯(如油酸乙酯和甘油三酯)、可生物降解的聚合物(如聚丙交酯-聚乙交酯、聚(原酸酯)、和聚(酸酐))、弹性体基质、脂质体、微球、油(例如，玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油、芝麻油、棉籽油，和花生油)、可可脂、蜡(例如，栓剂蜡)、石蜡、硅酮、滑石、水杨酸盐等。在本发明的药用组合物中使用的每种药学可接受的稀释剂或载体必须在与制剂的其他成分相容和不损伤受试者的意义上是 “可接受的”。适于选定剂型和预期施用途径的稀释剂或载体在本领域中是公知的，而且可以使用本领域的普通技术来确定用于选定的剂型和施用方法的可接受稀释剂或载体。

本发明的药用组合物可以可选地包含在药用组合物中常用的附加的成分和/或材料。这些成分和材料在本领域中是公知的，包括：(1) 填充剂或增量剂，如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(2) 粘合剂，如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素、蔗糖和阿拉伯胶；(3)保湿剂，例如甘油；(4)崩解剂，如琼脂-琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、藻酸、某些硅酸盐、淀粉羟乙酸钠、交联羧甲基纤维素钠和碳酸钠；(5)溶液阻滞剂，如石蜡； (6)吸收促进剂，如季铵化合物；(7)润湿剂，如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(8)吸收剂，如高岭土和膨润土粘土；(9)润滑剂，如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇，和月桂基硫酸钠；(10)悬浮剂，如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂-琼脂和黄蓍胶；(11)缓冲剂；(12) 赋形剂，例如乳糖、牛奶乳糖、聚乙二醇、动物和植物脂肪、油、蜡、石蜡、可可脂、淀粉、黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨润土、硅酸、滑石、水杨酸盐、氧化锌、氢氧化铝、硅酸钙，和聚酰胺粉末；(13)惰性稀释剂，例如水或其他溶剂；(14)防腐剂；(15) 表面活性剂；(16)分散剂；(17)控制释放或吸收延迟剂，如羟丙基甲基纤维素、其它聚合物基质、可生物降解的聚合物、脂质体、微球体、单硬脂酸铝、明胶和蜡；(18)遮光剂；(19)佐剂；(20)润湿剂； (21)乳化剂和悬浮剂；(22)增溶剂和乳化剂，如乙基醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、油 (具体而言是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢呋喃醇、聚乙二醇和山梨醇脂肪酸酯；(23)推进剂，例如氯氟烃和挥发性未取代烃，如丁烷和丙烷；(24)抗氧化剂； (25)使制剂与预期接受者的血液等渗的试剂，例如糖和氯化钠；(26) 增稠剂；(27)涂层材料，例如卵磷脂；和(28)甜味剂、调味剂、着色剂、芳香剂和防腐剂。每种这样的成分或材料必须在与制剂的其他分相容和不损伤受试者的意义上是“可接受的”。适于选定剂型和预期施用途径的成分或材料在本领域中是公知的，而且可以使用本领域的普通技术来确定用于选定的剂型和施用方法的可接受的成分和材料。

本发明的适于口服施用的药物组合物可以是胶囊、扁囊剂、丸剂、片剂、粉剂、颗粒剂、在水性或非水性液体中的溶液或悬浮液、水包油或油包水液体乳剂、酏剂或糖浆、锭剂、丸剂、药糖剂或糊剂的形式。这些制剂可以通过本领域中已知的方法，例如通过常规的锅包衣法、混合、造粒或冷冻干燥过程制备。

用于口服施用(胶囊剂、片剂、丸剂、糖衣丸、粉末、颗粒等) 的固体剂型可例如通过将活性成分与一种或多种药学可接受的稀释剂或载体，以及可选一种或多种填料、增量剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、溶液阻滞剂、吸收促进剂、润湿剂、吸收剂、润滑剂和/或着色剂混合而制备。可采用相似类型的固体组合物作为使用合适的赋形剂的软的和硬的填充明胶胶囊中的填充剂。片剂可通过压制或模制制造，可选地含有一种或多种辅助成分。压缩片剂可使用合适的粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂、表面活性剂或分散剂来制备。模制片剂可以通过在合适的机器中模制来制备。片剂和其他固体剂型，如糖衣丸、胶囊、丸剂和颗粒剂，可选地被制备成具有包衣和壳，如肠溶包衣和药物配制领域公知的其他包衣。其也可以这样配制，使其中活性成分得到缓慢或控制释放。可以通过例如用截留细菌的滤器过滤对其进行灭菌。可选地，这些组合物还含有遮光剂，也可以是组合物，这样其只在或优先在胃肠道的某一部分释放活性成分，可选以延迟的方式释放。所述活性成分也可以是微囊化的形式。

用于口服施用的液体剂型包括药学可接受的乳剂、微乳剂、溶液、悬浮液、糖浆和酏剂。液体剂型可以含有本领域中通常使用的合适的惰性稀释剂。除了惰性稀释剂，口服组合物还可以包括佐剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、调味剂、着色剂、芳香剂和防腐剂。悬浮液可以含有悬浮剂。

用于直肠或阴道施用的本发明的药用组合物可以呈现为栓剂，其可通过将一种或多种活性成分与一种或多种合适的无刺激性的稀释剂或载体(其在室温下为固体，而在体温下为液体)混合来制备，因此，其将在直肠或阴道腔中融化并释放活性化合物。适合于阴道施用的本发明的药用组合物还包括阴道栓剂、棉条、霜剂、凝胶剂、糊剂、泡沫剂或喷雾制剂，其含有如本领域已知的合适的药学可接受的稀释剂或载体。

用于局部或透皮施用的剂型包括粉剂、喷雾剂、软膏、糊剂、霜剂、洗剂、凝胶、溶液、贴剂、滴液和吸入剂。活性剂/化合物可以在无菌条件下与合适的药学可接受的稀释剂或载体混合。软膏剂、糊剂、霜剂和凝胶剂可含有赋形剂。粉剂和喷雾剂可以含有赋形剂和推进剂。

适于肠道外施用的本发明的药用组合物可以包含一种或多种试剂 /化合物，组合有一种或多种药学可接受的无菌等渗水性或非水性溶液、分散剂，混悬剂或乳剂，或无菌粉末，其在使用前可重新配制成无菌可注射溶液或分散剂，其可以含有合适的抗氧化剂、缓冲剂、使制剂与预期接受者的血液等渗的溶质，或悬浮剂或增稠剂。可通过例如使用包衣材料，通过在分散剂情况下维持所需的颗粒大小，以及通过使用表面活性剂以保持适当的流动性。这些药用组合物还可以含有合适的佐剂，如润湿剂、乳化剂和分散剂。也可能期望包含等渗剂。此外，可注射药物形式的延长吸收可以通过包含延迟吸收的试剂来实现。

在一些情况下，为了延长药物(例如，药剂)的效应，希望减慢皮下或肌内注射的吸收。这可以通过使用水溶性差的晶体或无定形物质的液体混悬液来实现。

活性剂/药物的吸收速率则取决于其溶解速率，溶解速率进而取决于晶体大小和晶型。备选地，胃肠外施用的制剂/药物的延迟吸收可通过将活性剂/药物溶解或悬浮于油性媒介物中实现。可注射的补给 (depot)形式可以通过形成可生物降解的聚合物中的活性成分的微胶囊基质而制备。根据活性成分与聚合物的比率和所用特定聚合物的性质，活性成分的释放速率可以得到控制。还通过将药物包埋在与身体组织相容的脂质体或微乳中制备补给注射制剂。可注射的材料可通过例如用细菌截留过滤器过滤进行灭菌。

所述制剂可存在于单位剂量或多剂量的密封容器，例如，安瓿和小瓶中，并且可以在冻干条件下存储，仅需要在用前即刻加入无菌液体稀释剂或载体，例如注射用水。临时性注射溶液和悬浮液可以由无菌粉末，颗粒和上述类型的片剂制备。

本发明提供了显示增强ERK抑制剂的效应的组合。本文中，申请人还表明，不同的ERK抑制剂的组合是类似协同的。因此，可以预期的是本文描述的组合的效应可以通过使用一个或多个附加的 ERK抑制剂得到进一步提高。因此，本发明的一些实施方式包括一种或多种附加的ERK抑制剂。

提供以下实施例以进一步说明本发明的方法。这些实施例仅是说明性的，并不旨在于任何方面限制本发明的范围。

实施例

实施例1

材料和方法

将癌症细胞系维持在标准培养基和血清条件下的细胞培养物中。用于剂量递增研究时，分瓶培养A375细胞，使其生长至约40-60％的汇合度，然后用初始剂量的指定药物进行处理。表4显示剂量递增的药物处理情况的总结。

表4-剂量递增的处理情况总结

处理	抑制剂
		1	曲美替尼(MEKi)
2	达拉非尼(BRAFi)
		3	BVD-523(ERKi)
4	达拉非尼(BRAFi)+曲美替尼(MEKi)
		5	达拉非尼(BRAFi)+BVD-523(ERKi)
6	曲美替尼(MEKi)+BVD-523(ERKi)

根据Little等人，2011的方法进行单剂剂量递增，这在图25中进行概述。然后使细胞生长至70-90％汇合度，分瓶。分瓶比率尽可能保持“正常”，不同处理之间保持合理一致(例如，亲本细胞的正常分瓶比率为至少50％)。每3-4天换新鲜培养基。当细胞再次达到约 40-60％汇合度时，进行剂量递增。如错过40-60％的区间，则将细胞再次分瓶，一旦它们达到40-60％汇合度时则进行施用。依然每3-4天换新培养基。根据需要重复该过程(图25)。

对于单剂处理，起始浓度和剂量的增加是这样进行的，由近似IC₅₀开始，在起始4-5次施用中，小幅度递增，或缓慢增加，剂量加倍，随后4次施用中以相同幅度增加，然后在随后的施用中转为浓度增加 1.5倍。

对于组合处理，起始浓度和剂量的增加是这样进行的，由各化合物的近似IC₅₀的一半开始(组合测定表明，这将导致约40-70％的抑制范围)，按照单剂的递增方法进行递增(即做一个初始倍增，然后在接下来4次施用中每次增加相同幅度，之后转为浓度增加1.5倍)。表5显示使用这些方案的投放剂量的增加情况。

表5–第1个月的投放剂量增加情况

通过有限稀释从抗性细胞池中获得抗性细胞克隆群体。

使用增殖测定法追踪在适当的时间间隔对剂量增加的试剂的灵敏度变化(例如，在每月，尽管定时取决于可用的适当细胞数)。用于增殖测定，将细胞以3000个细胞/孔接种于96孔板中，在含有10％ FBS的不含药物的DMEM培养基中，使其在添加化合物或媒介物之前贴壁过夜。由DMSO储备液制备化合物，得到的最终浓度范围如图 2A-H显示。最终的DMSO浓度恒定为0.1％。将测试化合物与细胞在 37℃、5％CO ₂的湿润环境下中孵育96小时。然后加入10％(v/v)的 Alamar蓝，孵育4小时，并用BMG FLUOstar读板仪检测荧光产物。扣除平均单独媒介物的背景值，并使用GraphPad Prism中的4-参数逻辑方程进行数据分析。紫杉醇用作阳性对照。

使用生长于表6所示不同浓度的各试剂中的细胞在第28天开始第 1个月的增殖测定法。

表6-用于增殖测定法的药物初始浓度–第1个月

细胞系	Dab	Tram	BVD-523
				亲本细胞	-	-	-
Tram	-	2nM	-
				Dab	15nM	-	-
BVD-523	-	-	0.48μM
				Tram+Dab	5nM	1nM	-
Dab+BVD-523	7.5nM	-	0.24μM
				Tram+BVD-523	-	1nM	0.16μM

使用生长于表7所示不同浓度的各试剂中的细胞在第56天开始第 2个月的增殖测定法。

表7-用于增殖测定法的药物初始浓度–第2个月

细胞系	Dab	Tram	BVD-523
				亲本细胞	-	-	-
Tram	-	8nM	-
				Dab	127nM	-	-
BVD-523	-	-	0.8μM
				Tram+Dab	10nM	2nM	-
Dab+BVD-523	12.5nM	-	0.4μM
				Tram+BVD-523	-	2nM	0.32μM

在第3个月递增时期结束时，将培养物在最高浓度中维持2周，之后进行最后一轮增殖测定法和可能的单细胞克隆。因为增殖测定法/ 单细胞克隆需要增殖活跃的细胞，所以对于其中细胞在最高浓度增殖很慢或仅仅是近期才进行递增的处理中，还在较低浓度下维持备份培养物的生长(表8)。对于其中细胞在最高浓度(1.8μΜ)下似乎完全停止生长并看起来特别脆弱的BVD-523处理，将培养物在较低浓度下维持2周的时间。

表8-在固定的浓度下培养2周的处理详情

使用生长于表9所示不同浓度的各试剂中的细胞，第3个月的增殖测定法。

表9-用于增殖测定法的药物初始浓度–第3个月

对于组合研究，将A375细胞(ATCC)以3000个细胞/孔一式三份接种于96孔板中，在含有10％FBS的不含药物的DMEM培养基中，使其在添加测试化合物或媒介物对照前贴壁过夜。使用最终DMSO浓度0.2％的10×8的剂量矩阵测试不同组合。接着是96小时的测定法孵育期，随后在荧光读板仪读取之前加入10％(v/v)的Alamar蓝并孵育4小时。读取Alamar蓝后，拍掉培养基/Alamar蓝混合物并添加 100μl的CellTiter-GLo/PBS(1：1)，按照制造商的说明书(Promega) 处理平板。减去仅由媒介物产生的背景值后分析数据。然后应用Bliss加和模型。

简言之，使用公式C_bliss＝A+B-(A x B)计算组合抑制的预测分数抑制值，其中A和B是由特定浓度的单独药物A或单独药物B 获得的分数抑制。C_bliss是如果这两种药物组合是精确相加时预期的分数抑制。从实验观察到的分数抑制值中减去C_bliss值得出“Bliss余量”值。Bliss余量值大于0表示协同效应，而值小于0表示拮抗作用。将 Bliss余量值以热图±SD作图。

单一和组合数据也呈现为GraphPad Prism中生成的剂量-响应曲线(使用相对仅DMSO处理对照的活力％作图)。

对于集中的组合研究，Alamar蓝活力测定法如上述用于组合研究的方法进行。此外，进行了Caspase-Glo 3/7测定法。简言之，将HCT116 细胞以5000个细胞/孔的细胞密度一式三份接种于白色96孔板中，其中含有McCoy’s 5A+10％FBS。将A375细胞以5000个细胞/孔的密度种于DMEM+10％FBS中。使细胞贴壁过夜，然后添加指定量的测试化合物或媒介物对照。DMSO的最终浓度为0.2％，包括800nM的星形孢菌素作为阳性对照。使用了24和48小时的测定法孵育时间。然后，添加Caspase-Glo

3/7 50％(v/v)溶液，在水平摇床上将平板混合 5分钟并在室温下孵育1小时，之后在发光平板仪上读取。减去仅培养基背景值并分析数据。

实施例2

剂量递增和增殖测定法-第1个月

剂量递增进程–第1个月

用BVD-523、达拉非尼和曲美替尼作为单一试剂或组合进行剂量递增处理A375细胞。在第一个月中小幅增加剂量。除了增长率显着降低，细胞一般对剂量递增有良好的耐受性，而不是生长速率有显著降低，而计划是在第2个月用较大的幅度进行更激烈的剂量递增。图 1A-C显示剂量递增研究的第1个月进程。

增殖测定法结果-第1个月

进行增殖测定法以评估剂量递增细胞系对比亲代细胞系对 BVD-523、达拉非尼和曲美替尼处理的响应。

图2A-H显示来自第1个月研究的正态化和原始增殖测定法结果。注意，在不同的处理之间(图2D-F，2H)DMSO对照最大信号差异表明不同处理之间的差异化增长率。这些差异可能影响细胞系在增殖测定法中对抑制剂的响应。

表10显示研究第1个月的IC₅₀数据。

表10-IC₅₀数据-第1个月

*Par＝亲本细胞系

早期提示生长于存在递增剂量的达拉非尼或曲美替尼(作为单剂或组合)中的细胞，在增殖测定法中表现出对这两种试剂响应降低。

在第2个月的早期阶段，仅达拉非尼处理中细胞生长率相对于第 1个月的早期阶段有显著增加。这使得进展速率增加并表明抗性变得明显。

实施例3

剂量递增和增殖测定法-第2个月

剂量递增进程–第2个月

研究的第二个月见证大多数处理转为剂量相比于初始平缓递增阶段增加幅度更大(1.5倍)。达拉非尼和曲美替尼的单剂递增是最快的，其中细胞生长于相当于亲代细胞的IC₅₀的100倍的浓度下(图3A，B)。 BVD-523的单剂递增进展相比达拉非尼和曲美替尼(图3C)更慢。参见图3D的单剂递增情况的比较。BVD-523剂量递增细胞相比达拉非尼和曲美替尼剂量递增群体具有更“脆弱”的外观和更多数量的漂浮细胞。

组合试剂的剂量递增比单剂处理进展更慢。BVD-523/曲美替尼组合在预防癌细胞的进展中尤其有效。

增殖测定法结果-第2个月

在单剂剂量增加的达拉非尼和曲美替尼的细胞群体进行的增殖测定法显示剂量响应曲线有适度变化，这表明进行额外时间的剂量增加将对进一步富集抗性细胞是有益的。有趣的是，在增殖测定法中，有证据表明，暴露于BVD-523的细胞在抑制剂撤出时生长不如从前，或许表明药物依赖的程度。

图4A-H显示来自研究第2个月的正态化和原始增殖测定法结果。注意，在不同的处理之间(图4D-F，4H)DMSO对照最大信号差异表明不同处理之间的不同增长率。这些不同可能影响细胞系在增殖测定法中对抑制剂的响应。

图5A-H显示来自研究第2个月的正态化和原始增殖测定法结果，仅聚焦于亲本和BVD-523细胞系的数据。

表11显示研究第2个月的IC₅₀数据。从Prism中拟合的4-参数曲线确定相对IC₅₀。

表11-IC₅₀数据-第2个月

^*Par＝亲本细胞系

实施例4

剂量递增和增殖测定法-第3个月

剂量递增进程–第3个月

图6A-C显示研究的第3个月的单一和组合试剂的剂量递增情况。图6D显示单剂剂量递增的比较。

增殖测定法结果–第3个月

图7显示DMSO对照孔在增殖测定法期间的生长情况的评估。图 8A-D显示研究第3个月的结果。图9A-D显示研究第3个月的结果，聚焦于单剂处理的细胞系。

表12显示研究第3个月的IC₅₀数据。从Prism中拟合的4-参数曲线确定相对IC₅₀。由于测定法期间用曲美替尼进行剂量递增处理的细胞系不生长，所以没有确定该细胞系的IC₅₀值(ND：未做)。

表12-IC₅₀数据-第3个月

^*Par＝亲本细胞系

实施例5

组合研究的结果

正如预期的那样，携带BRAF(V600E)突变的A375细胞对达拉非尼敏感。使用的Alamar蓝(图10、12、14)计算出的达拉非尼和 BVD-523单剂的IC₅₀值通常比用CellTiter-GLO(图11、13、15)得出的结果略低。已发表的CellTiter-Glo测定法中达拉非尼和曲美替尼在72小时的IC₅₀值分别为28±16nM和5±3nM(Greger等人,2012； King等人,2013)——本文报道的单剂结果与这些值是一致的。有一些证据表明在所有处理中有一定范围的协同效应。一式三份之间的变化小，然而，一些证据表明有边缘效应，这可能解释了在某些处理中观察到的相对于无药物对照生长明显增强的现象(如在曲美替尼 /BVD-523组合中尤其明显)。这使得对Bliss分析的解释更具挑战，引物在一些处理中其可能导致协同效应水平的虚增强。

对A375细胞重复了组合测定法。此外，HCT116细胞在随访的组合测定法中使用。这些实验的结果示于图31-41。单剂BVD-523、曲美替尼和达拉非尼的效力与以往的研究报道的那些一致。

HCT116细胞是具有KRAS突变的人结肠癌细胞。达拉非尼和曲美替尼在相关目标浓度下是拮抗剂。与此相反，曲美替尼与AZ628在广泛范围的组合下，以及与更高浓度的索拉非尼组合都表现出协同效应。BVD-523表现出与AZ628和索拉非尼都有一定范围内的协同效应。

在A375细胞中，曲美替尼在达拉非尼和AZ628浓度较低时表现出一定协同效应。BVD-523与较低浓度的索拉非尼表现出一定范围的协同效应。

实施例6

BVD-523改变MAPK激酶活性和效应子功能的的标志物

为进行Western印迹研究，将HCT116细胞(5×10⁶)接种到含 McCoy 5A+10％FBS的10cm培养皿中。将A375细胞(2.5×10⁶)接种于含DMEM+10％FBS的10cm培养皿中。在添加指定量的测试化合物(BVD-523)或媒介物对照前使细胞贴壁过夜。如下文标出对细胞进行4或24小时的处理，之后分离全细胞蛋白裂解物。通过胰蛋白酶消化收获细胞、沉淀，并快速冷冻。用RIPA(放射性免疫共沉淀测定法)缓冲液制备裂解物，通过离心进行澄清，并通过双金鸡宁酸测定法(BCA)进行定量。通过SDS-PAGE电泳分离20-50μg蛋白质，将其印迹到PVDF膜上，并使用下文表13中(对于4-小时处理) 和表14(对于24小时处理)详述的抗体进行杂交。

表13-抗体详述

表14-抗体详述

图16-18显示了对用各种浓度BVD-523处理的细胞进行蛋白质印迹分析：1)4小时后A375细胞中的MAPK信号传导组分；2)用不同量的BVD-523处理24小时后，A375细胞中细胞周期和凋亡的信号传导；和3)处理4小时后，在HCT-116细胞中的MAPK信号传导。结果表明，对RAF和RAS突变的癌细胞进行急性和长期的BVD-523 处理会影响ERK激酶的底物磷酸化及效应子靶标二者。诱导这些变化所需的BVD-523浓度通常在低微摩尔范围。

数个特异性活性标志物的变化是值得注意的。首先，在BVD-523 处理后大量迁移缓慢的ERK激酶亚型有所增加；能很快观察到适度的变化，并在长期的处理后增加。虽然这可能表示在有酶促活性的磷酸化形式的ERK的增加，但仍然值得注意的是，多种受ERK直接和间接调控的蛋白质在BVD-523处理后保持“关”的状态。首先，RSK1/2 蛋白质显示在残基处(T359/S363)磷酸化减少，这是严格依赖于ERK 进行的蛋白质修饰。第二，BVD-523处理诱导MAPK反馈磷酸酶 DUSP6发生复杂的变化：在急性处理后迁移缓慢的蛋白质异构体减少，而在长期BVD-523处理后总蛋白水平也大大减少。这两个结果均与ERK激酶活性降低是一致的，其通过翻译后的和转录的机制两方面控制DUSP6功能。总的来说，尽管通常认为是活性形式的细胞ERK 有所增加，但看上去可能是BVD-523的急性或长期处理后细胞ERK 酶活性完全被抑制。

与这些观察一致的是，需要MAPK通路信号传导的效应子基因在 BVD-523处理后发生改变。G1/S细胞周期装置在翻译后和转录水平都由MAPK信号传导调节，且细胞周期蛋白D1水平在长期BVD-523 处理后大大降低。类似地，基因表达和细胞凋亡效应子蛋白质的丰度往往需要完整的MAPK信号传导，而在长期BVD-523处理后Bim-EL 总水平得到增加。然而，如上文指出的，在A375细胞背景下没有注意到PARP蛋白质的裂解及增加的细胞凋亡；这表明其他因素可能影响BVD-523/ERK-依赖的效应子信号传导的变化是否被翻译成明确的事件，例如细胞死亡和细胞周期阻滞。

与BVD-523的细胞活性相一致，标志物分析表明ERK抑制改变了癌细胞中的多种分子信号传导事件，这使得它们容易受到细胞增殖和存活降低二者的影响。

总之，图16-18表明BVD-523抑制了MAPK信号通路并相比于 RAF或MEK抑制在这种情况下可能更为有利。

最后，BVD-523的特性使其成为相比具有相似活性的其他试剂成为用作ERK抑制剂的优选剂。已知的是激酶抑制剂药物显示与它们的酶靶标有独特和特异性的相互作用，而药物疗效受到直接抑制模式及对处理后发生的适应性变化的易感性的强烈影响。例如，ABL、KIT、 EGFR和ALK激酶抑制剂仅在其同源靶标是有活性或非活性的状态下有效的。类似地，这些抑制剂中的某些只对蛋白质靶标的二级遗传突变或翻译后适应性变化敏感。最后，RAF抑制剂显示与存在于某些蛋白质复合物和/或亚细胞定位的RAF激酶有差异性效力。总之，由于类似地已知ERK激酶在多样的、可变的、复杂的生化状态中存在，看上去BVD-523可能与这些靶标以与其他试剂不同且高度优选的方式相互作用或抑制这些靶标。

实施例7

体内测定法

小鼠

雌性无胸腺裸鼠(Crl:NU(Ncr)-Foxn/^nu,Charles River)在研究的第1天为9周龄，体重(BW)范围为17.5至26.2克。用水(反渗透水，1ppm Cl)和NIH 31改性和辐照实验室饮食Lab

(由18.0％的粗蛋白、5.0％粗脂肪、5.0％粗纤维构成)随意喂食动物。小鼠被安置在静态microisolator中的经过辐射的Enrich-o'cobsTM Laboratory AnimalBedding上，光照周期为每天12小时，温度20-22℃(68-72°F)，湿度40-60％。遵循了Guidefor Care and Use of Laboratory Animals 中对于限制、畜养管理、外科手术、饲料和液体调节及兽医护理的建议。

体内植入及肿瘤生长

通过在无胸腺裸鼠中用A375人黑色素瘤进行系列皮下移植引发肿瘤倚重移植物。肿瘤植入的当天，每只测试小鼠接受在右胁腹皮下植入1mm³的A375片段，并监测接近80至120mm³目标范围的平均尺寸作为肿瘤生长。用卡尺测量二维的肿瘤，并使用下式计算体积：

肿瘤体积

其中w＝肿瘤宽度，l＝肿瘤长度，单位为毫米。假设1mg相当于 1mm³肿瘤体积，可由此估算肿瘤重量。

肿瘤植入10天后，指定作为研究的第1天，将动物分成九组(第 1-9组)，每组由15只小鼠组成，和一组(第10组)包括10只小鼠。个体肿瘤体积介于75至144mm³之间，组平均肿瘤体积为110或 111mm³。

治疗剂

以干粉形式供给BVD-523和达拉非尼并避光储存于室温。

通过在溶于去离子水的1％羧甲基纤维素(“1％CMC”)中悬浮所需量的BVD-523粉末制备BVD-523药剂。制备10mg/mL BVD-523 储备液，并用于100mg/kg BVD-523的组的给药。用媒介物稀释储备液的等分试样至5.0mg/mL的浓度，以提供50mg/kg的BVD-523剂型，给药体积为10mL/kg。将BVD-523药剂避光储存于4℃，最多一周。

达拉非尼干粉由84.5％的活性化合物构成，其在制备药剂时确定。以11.834和5.917mg/mL的浓度在1％CMC中配制达拉非尼，分别得到100和50mg/kg的活性化合物剂量，以10mL/kg的给药体积。将所述达拉非尼药剂避光储存于4℃，最多一周。

将1％的CMC媒介物(“媒介物”)被用于对照组施用。

通过将所需数量的100mg

胶囊的内容物悬浮于去离子水中达到15mg/mL的浓度，制备替莫唑胺(

Schering Corporation,Lot No.2RSA013)的药剂，其供给150mg/kg的剂量，给药为10mL/kg。在5天的给药期将替莫唑胺避光储存在4℃下。

处理

在研究的第1天，将小鼠按中概述的处理计划分成九组(第1-9 组，每组有15只小鼠)，和一组(第10组，包括10只小鼠)，根据下文表15中概述的处理计划开始给药。每药剂都经过口服灌胃(p.o.) 以给药体积10mL/kg(每20克体重0.2mL)来给予，根据每个个体动物的体重换算。媒介物和达拉非尼药剂每日给予一次直至研究结束 (qd至结束)，而BVD-523药剂为每日给予两次直至研究结束(bid 至结束)。对bid给药，在第1天下午开始给药，这样第一天只给予一次药剂(“第一天1剂”)。

表15-A375体内研究的实验流程设计

媒介物＝溶于DI水中1％羧甲基纤维素(CMC)

对于bid药剂，第一天下午给予一次药剂，最后一天早晨给予一次药剂。

在研究过程中对组合处理组的给药进行如下文描述的修改。

对照

第1组接收1％CMC媒介物，并作为％TGD计算的对照组。第 10组以150mg/kg接收替莫唑胺，一天一次，共五天(qd×5)，并作为对照组。

单一疗法处理

第6和7组分别接收50和100mg/kg的达拉非尼。第8和9组分别接收50和100mg/kg的BVD-523。

组合处理

第2和3组分别接收50mg/kg的达拉非尼与50或100mg/kg的 BVD-523的组合。第4和5组分别接收100mg/kg的达拉非尼与50或 100mg/kg的BVD-523的组合。由于对组合处理有显著响应，在第20 天时停止第2-5组施用，以监测肿瘤再生长。当平均肿瘤负荷达到1000mm³时在组中重新启动给药。截止第42天，在任何组合组中肿瘤负荷均未达到1000mm³。重新开始给药以使得最终给药后的血清和肿瘤能被取样用于药代动力学分析。在第42天开始，第2-5组接收每天一次共四天给予的达拉非尼和每天两次共三天给予的BVD-523，接着在第45天早晨进行一次BVD-523药剂。最终施用时间表在下文表 16显示。

实验终点和肿瘤生长延迟(TGD)分析

每周两次用卡尺测量肿瘤，而当其肿瘤达到预先确定的肿瘤体积的终点2000mm³或在最后一天(取两种情况中较先满足的时间)，对每只动物实施安乐死。将由于达到肿瘤体积终点而退出研究的动物记录为由于肿瘤进展(TP)而被实施安乐死，并记录安乐死的日期。计算对每只小鼠由下面的等式计算用于分析的终点前时间(TTE)：

其中，TTE以天表示，终点体积以mm³表示，b是截距，m是由对数转化的肿瘤生长数据组的线性回归获得的直线斜率。该数据集包括第一次观察到的超出分析中使用的终点体积的情况，和紧接着连续三次观察到的达到所述终点体积的情况。计算出的TTE通常不到TP 日期，即动物由于肿瘤大小而被安乐死的这天。为未达到终点体积的荷瘤动物分配一个TTE值，等于研究最后一天。任何归类为由于意外原因(NTRa)或由于未知病因(NTRu)的NTR(非处理相关)死亡的动物被排除在TTE计算(以及所有进一步的分析)之外。对归类为 TR(处理相关)死亡或NTRm(由于转移的非处理相关的死亡)的动物分配一个TTE值，等于死亡这天。

由肿瘤生长延迟(TGD)评估处理结果，将TGD定义为处理组相比于对照组到达终点时间(TTE)中位数的增加：

TGD＝T-C，

用天数表示，或以对照组的TTE中位数的百分比表示：

其中：

T＝处理组TTE的中位数，及

C＝指定对照组TTE的中位数。

回归响应的标准

可由研究过程中观察到的消退相应的几率和幅度来确定处理功效。处理可能会导致动物中肿瘤部分消退(PR)，或完全消退(CR)。在PR响应中，肿瘤体积在研究过程中连续三次测量的肿瘤体积都为其第1天的50％或更少，并且在这三次测量中的一次或多次都大于等于135mm³。在CR响应中，研究过程中连续三次测量的肿瘤体积都小于135mm³的。CR响应的动物在研究终止时被另外归类为无肿瘤生存者(TFS)。对动物的回归相应进行了监测。

毒性

第1-5天对动物进行每日称重，然后每周两次，直到研究完成。就任何不良的处理相关(TR)的副作用的明显迹象对小鼠经常进行观察，并且在观察到时记录临床症状。按实验流程监测个体体重减少情况，并对超出可接受的体重减少限度的任何动物实施安乐死。还按实验流程监测组平均体重减少。在超出可接受平均体重减少限度的任何组中暂停给药。如果平均体重恢复，则在该组中可以恢复施用，但会使用较低剂量或较低频率的给药安排。

最大耐受剂量(MTD)的可接受毒性被定义为研究中组平均体重减少小于20％，且处理相关(TR)死亡不超过10％。如果死亡归因于处理的副作用(如通过临床症状和/或剖检证明)，则被分类为TR，或者如果由于在给药期间或最后施用后14天之内不明原因则也被归类为TR。如果没有证据表明死亡与处理副作用相关，则所述死亡被分类为非处理相关(NTR)。基于死因对NTR死亡进行进一步鉴定。如果死亡由意外或人为错误导致，则被分类为NTRa。如果剖检表明死亡可能由侵袭和/或转移的肿瘤扩散，则被分类为NTRm。如果死亡原因不明，尽管不能排除死亡由处理副作用造成，却并没有可用的证据证明死亡与处理副作用、转移、意外或人为错误相关，则所述死亡被分类为NTRu。

采样

当可用时，通过二氧化碳麻醉下终端心脏穿刺在最终给药3、6 和12小时后，对每组五只小鼠实施安乐死，并收集各动物的全部血容量。分离血清并于-80℃冷冻储存直至运送。此外，收获这些小鼠的肿瘤，并分成两部分。一部分速冻并储存在-80℃。另一部分在10％中性缓冲福尔马林中固定16-24小时，然后转移到70％乙醇中。对有检测不到肿瘤的小鼠的组，从每组三只小鼠收集植入位点的组织，包括完整皮肤和一定厚度的肌肉。

统计和作图分析

使用Windows 3.03可用的的Prism(GraphPad)用于图形表示和统计分析。

评估总体生存情况的对数秩检验被用于分析两组TTE值之间差异的显著性。对数秩分析包括组中除了那些评估为NTR死亡的所有动物的数据。双尾统计分析均在显著性水平P＝0.05下进行。没有为多重比较调整统计测试。Prism总结的测试结果如下：不显著(ns) 为P>0.05，显著(由符号“*”表示)为0.01<P<0.05，非常显著(“*＊”) 为0.001<P<0.01，和极显著(“^*＊＊”)为P<0.001。统计学显著性的测试不提供对组间差异的幅度的评估，因此本报道文中的所有显著性水平都被描述为显著或不显著。

构建散点图以按组显示单个小鼠的TTE值。将组平均肿瘤体积绘制为时间的函数。当动物由于肿瘤的大小退出研究，所记录的动物的最终肿瘤体积包括在用来在随后的时间点计算平均体积的数据内。(当存在时)误差线表示平均标准误差(SEM)。Kaplan-Meier作图显示研究过程各组剩余动物百分比相对时间的情况。Kaplan-Meier作图和和对数秩检验共享相同的TTE数据组。第1天起对每天测量的体重计算各组平均体重百分比的变化，并绘制为时间的函数。肿瘤生长和体重作图排除了NTR死亡的数据，并在可估算动物的50％都退出研究后终止。

结果

根据表15中公开的改良实验流程处理A375体内研究的组。在第 45天终止实验。表16是各组对处理响应的总结。图26是显示各组的个体TTE的散点图。图27呈现研究中各组的平均肿瘤生长(图27A) 和Kaplan-Meier存活(图27B)图。图28A-D为四种组合相比其各自的单一疗法的平均肿瘤生长曲线。图29为从第1天起各组平均体重变化百分比。

疗效-对照小鼠(第1组)中A375人黑色素瘤的生长情况

在第1组中，第4天发现一只对照小鼠死亡，剖检后被评估为 NTRu。其他14份对照肿瘤迅速一致地发展到2000mm³的终点，TTE 中位数为9.2天，这为所述45天的研究(表15)建立了最大可能的 TGD——35.8天(389％)。散点图显示对照TTE簇(图26)。第1 组的平均肿瘤生长曲线图中显示了对照肿瘤的快速生长(图27A和图 28A-D)。

疗效-对达拉非尼作为单一疗法的响应(第6和7组)

第6和7组接收作为单一疗法的达拉非尼，剂量分别为50和 100mg/kg，p.o.qd至结束。第6和7组的TTE中位数分别为16.1和 28.5天，分别对应于剂量相关TGD为6.9天(75％)和19.3天(210％)，且各自相比对照存活率差异显著(第1组对比第6或7组，P<0.001)。在100mg/kg的达拉非尼组中记录有一个PR(表16)。所有第6组的肿瘤达到2000mm³终点肿瘤体积，而第7组有13/15个肿瘤达到终点，另外两个在第45天仍停留在MTV为282mm³(表16)。第6和7 组的平均肿瘤生长图表明剂量相关的延迟，尽管在这两组中处理过程中肿瘤都有所进展(图27A)。

疗效-对BVD-523作为单一处理的响应(第8和9组)

第8和9组接收作为单一疗法的BVD-523，剂量分别为50和 100mg/kg，p.o.bid至结束。第8和9组的TTE中位数分别为8.6和 18.5天，其中50mg/kg BVD-523组对应无TGD，而100mg/kg BVD-523组对应TGD9.3天(101％)(表16)。对数秩分析仅检测到100mg/kg的BVD-523与对照组相比有显著存活率差异(第1组对第8组，P>0.05；第1组对第9组，P<0.001)。第8组有一个CR 在第45天仍为TFS，而第9组有两个CR/TFS，这两组中所有其他肿瘤都达到2000mm³终点肿瘤体积(表16)。50mg/kg的BVD-523组的平均肿瘤生长曲线图与对照类似，而100mg/kg的BVD-523组在处理期间肿瘤有进展，与对照相比显示边缘延迟(图27A)。

疗效-对达拉非尼和BVD-523组合处理的响应(第2-5组)

第2和3组分别接收50mg/kg的达拉非尼和50或100mg/kg的 BVD-523，而第4和5组分别接收100mg/kg的达拉非尼及50或 100mg/kg的BVD-523。如表16所示，对组合处理方案进行了修改，给药在20天之后结束，然后在第42天重新启动(表16)。

第2-5组TTE中位数各为45.0天，对应于在研究中的最大可能 TGD(35.8天，389％)，并与对照相比有显著的总体存活优势(第1 组vs.第2-5组，P<0.001)。

第2组的5份肿瘤达到2000mm³的终点体积，而第3-5组没有肿瘤的生长到终点体积。第2组有三个PR和八个CR，其中七只小鼠在第45天仍然为TFSS(表16)。第3组在第31天有一例NTRu死亡，另外14只小鼠具有CR，并在研究结束时仍保持TFS。第4组有一个 PR，十四个CR保持TFS，而第5组为100％TFS。

截止第20天给药停止时，第2-5组中均未检测到平均肿瘤负荷(图 27A)。平均肿瘤生长只在最低剂量组合组(第2组)中恢复，在其他三个组合组(图27AI)中截止研究结束仍不可检测到。每个组合组的肿瘤生长图显示其相比相应的单一疗法有显著的活性(图28A-D)。

疗效-对替莫唑胺处理的响应(第10组)

替莫唑胺参比处理得到TTE中位数为10.5天，这相当于可以忽略的TGD(1.3天，14％)，肿瘤没有消退(表16)。对数秩分析发现替莫唑胺组与对照组相比无显著的生存率差异(第1组对第10组， P＝0.052)。相比第1组对照的图(图27A)，该组的平均肿瘤生长图显示的延迟可以忽略不计。

副作用

表16提供最大平均BW减少、TR和NTR死亡的概况。图29为每组从第1天起平均BW变化百分比。

在研究中没有TR死亡的记录，但对两个NTRu死亡进行了评估 (表16)。第4天在第1组记录到一个NTRu死亡，第31天在第3 组记录到第二个NTRu死亡。第1组的动物被发现死亡后剖检，事先没有观察到临床现象，而第3组小鼠在死亡之前瘦、弯腰驼背、嗜睡，剖检露出肝脏上的白色结节团，提示转移性疾病是死亡的可能原因。在研究中组间可忽略不计或无平均BW减少(表16和图29)，且治在BVD-523和达拉非尼单一和组合疗法组间无显著的处理相关副作用的迹象。

总结

体内研究评价了BVD-523和达拉非尼的组合在A375人黑色素瘤异种移植瘤裸鼠模型中的疗效。按每日两次的时间安排以50或 100mg/kg口服施用BVD-523，按每日一次的时间安排以50或 100mg/kg口服施用达拉非尼，有单独施用和组合施用。由于对组合处理的响应显著，因此在第20天停止组合处理组的给药以监测肿瘤再生长，并在第42天重新开始给药以在第45天研究结束时进行样品采集。

A375对照肿瘤迅速而一致地进展达到肿瘤体积终点。对照组的 TTE中位数为9.2天，确定了这一为期45天的研究的最大可能TGD 为35.8天(389％)。对照TTE的波动范围很小，这反映了对照肿瘤生长的一致性，且允许对数秩检验检测到对照和处理小鼠之间的微小差异。替莫唑胺参比处理导致可忽略不计的TGD(1.3天，14％)，并且没有肿瘤消退，这与先前替莫唑胺在这一肿瘤模型中的结果一致。

50和100mg/kg的达拉非尼单一疗法产生剂量相关的疗效，TGD 分别为6.9天(75％)和19.3天(210％)，而且在100mg/kg的达拉非尼组中有一个PR。50mg/kg BVD-523单一疗法是无效的，不产生 TGD，且与对照相比没有显著的生存率差异(P>0.05)。该组中仅有的一个TFS可能是由于处理或自然消退。100mg/kg的BVD-523单一疗法有边缘活性，导致9.3天的TGD(101％)，且相对于对照组有显著存活率差异(P<0.001)，有两个TFS，可能是由于处理或自然消退。

在本研究中测试达拉非尼与BVD-523的四种组合中每个都是高活性的，产生最大可能的TGD、显著的肿瘤消退响应，相比其对应的单一疗法整体存活率在统计学上更优(P<0.001)。最低剂量组合处理组(第2组)产生了显著的7/15TFS。三种较高的剂量组合在(第3-5组)截止研究结束时实现了43/44个无瘤幸存者，包括最高剂量的组合处理组中的15/15TFS(第5组)。值得注意的是，在对照肿瘤的倍增时间平均不超过3天的情况下，在第3-5组中的43/44只小鼠从第21至42天的施用间歇期中无肿瘤再生长，这对应了近似7次肿瘤倍增的一段持续时间。这些结果与疗愈性或近疗愈活性是一致的。

总之，达拉非尼和BVD-523各自产生了如单一疗法的边缘剂量相关疗效，但在组合时有显著的活性。在这项研究中测试达拉非尼与 BVD-523的组合产生显著的无瘤生存率及比单独给予任一药剂更优的疗效。

我们发现，使用BVD-523例证进行ERK激酶抑制与RAF抑制剂达拉非尼组合，在具有BRAF突变的黑色素瘤模型中起效。在细胞中，BVD-523和达拉非尼的组合处理诱导细胞增殖的一定范围的协同抑制。当在移植瘤模型中一同给药时，组合处理比单剂处理会导致显著的和持久的肿瘤消退。

此外，当A375细胞在长期暴露于MAPK级联的抑制剂后被诱导表现出获得性药物抗性时，使用BVD-523进行ERK抑制显示吸引人的特性。在用达拉非尼或曲美替尼处理数周后，可以分离出在浓度超过10倍于各自化合物生长IC50抑制浓度的环境下迅速生长的A375 细胞。2个月后，暴露于单独BVD-523的细胞生长不良，并且只能承受小于超过IC 50的10倍浓度增加的药物暴露。用BVD-523和达拉非尼的组合处理的细胞同样表现出生长不良，且只能在组合中达拉非尼水平适度增加时进行培养。

最后，在从对维罗非尼起始响应后表现出疾病消退的患者获得活检衍生的黑色素异种移植模型中，测试了BVD-523。有趣的是，该体内模型表现出获得性交叉抗性，似乎对达拉非尼和曲美替尼都不敏感。 BVD-523在该模型中似乎很有效，并在单独使用或与达拉非尼组合时诱导了有效的抗肿瘤应答。

总体而言，这些结果表明组合的ERK和RAF抑制剂处理在BRAF 突变体黑色素瘤的背景下有效。BVD-523具有新的药物作用模式，并可能在同时显示对BRAF或MEK的固有敏感或获得性抗性的这些模型中显示长期的持续效应。RAF和ERK抑制剂的组合用于BRAF突变的癌症抑制了两个致癌途径控制点，这进而似乎创造了针对亚型和获得性抗性的一道困难屏障。

这些结果表明使用ERK和RAF抑制剂的组合的疗法可以在各种癌症中起作用，尤其是那些具有BRAF的致癌变化的那些，包括黑色素瘤、甲状腺癌、肺癌和结肠癌。

实施例8

附加的组合研究

单一处理剂的增殖测定

将细胞以表17所示的密度和培养基条件接种于96孔板，并使其在添加化合物或媒介物对照前贴壁过夜。从DMSO储备液中制备化合物，得到所需的最终浓度。最终的DMSO浓度恒定在0.1％。将测试化合物与细胞在37℃，5％CO₂的湿润环境下一同孵育72小时。根据制造商说明书加入CellTiter-Glo^R反应剂(Promega，Madison，WI)，并使用BMGFLUOstar读板器(BMG Labtech，Ortenberg，Germany) 检测发光。扣除平均仅媒介物的背景值，并使用GraphPad Prism的4 参数逻辑方程分析数据(GraphPad软件，La Jolla，CA)。

组合的增殖测定

将细胞以表17所示的密度和培养基条件一式三份接种于96孔板，并使其在添加化合物或媒介物对照前贴壁过夜。从DMSO储备液中制备化合物，得到所需的最终浓度。最终的DMSO浓度恒定在0.2％。用10×8剂量矩阵测试不同组合。将测试化合物与细胞在37℃，5％CO₂的湿润环境下一同孵育72小时。根据制造商说明书加入 CellTiter-Glo^R反应剂(Promega，Madison，WI)，并使用BMG FLUOstar读板器(BMG Labtech，Ortenberg，Germany)检测发光。扣除平均仅媒介物的背景值并分析数据。

对于所述10×8个组合测定，通过Loewe加和和Bliss独立模型确定剂量矩阵中的组合相互作用，使用Chalice^TM组合分析软件(Horizon Discovery Group,Cambridge,MA)，如用户手册中概述的(可在 chalice.horizondiscovery.com/chalice-portal/documentation/analyzer/ home.jsp找到)。通过实验观察到的各个组合点的抑制水平与预期加和值进行比较确定协同性，所述预期加和值源于沿矩阵边缘上的单剂响应值。潜在的协同效应是通过将计算出的超过剂量矩阵中加和预期值的抑制余量作为热图，并通过基于Loewe模型报道定量的“协同得分”而确定的。在GraphPad Prism(GraphPad软件,LaJolla,CA)中生成剂量响应曲线代表源于组合测定平板中的单剂数据(使用相对仅 DMSO处理对照的活力百分比作图)。

表17-细胞系接种密度和生长培养基

细胞系	接种密度(细胞/孔)	培养基
			A375	2500	DMEM+10％FBS
G-361	5000	McCoy’s 5A+10％FBS

结果

本研究的目的是评估ERK抑制剂和I型RAF抑制剂相组合的效果。测试了一种新颖ERK抑制剂BVD-523与两种I型RAF抑制剂—— 达拉非尼(GSK2118436)和维罗非尼(PLX4032)，和II型抑制剂 TAK-632在两种BRAF V600E突变黑色素瘤细胞系A375和G-361中的效果。还测试了第二种机制不同的ERK抑制剂(SCH772984)与达拉非尼(GSK2118436)和维罗非尼(PLX4032)的组合。

首先进行了单剂增殖测定以选择组合研究的适当浓度范围。尽管这两种细胞系对紫杉醇具有类似的灵敏水平，但G-361细胞相比A375 细胞表现出对ERK和RAF抑制敏感度低4至6倍(图42)。IC₅₀结果总结于表18。

表18–测试化合物的单剂IC₅₀值

*对于达拉非尼的值应被视为近似为曲线的顶部值，没有在测试的剂量范围内得到明确定义。

使用Loewe加和和Bliss独立模型及Chalice^TM Bioinformatics Software(Horizon Discovery Group,Cambridge,MA)测试8x10矩阵的浓度中两种化合物之间的组合相互作用。Chalice^TM能够通过将计算出的超过剂量矩阵中加和预期值的抑制余量显示为热图，并通过基于 Loewe模型报道定量的“协同得分”而鉴定出可能的系统相互作用。

在A375细胞(图43-图48)中，使用Loewe模型的分析表明，与BVD-523的组合主要表现出加和。使用Bliss法的结果相似，尽管这种方法表明在较高浓度下对各组合存在一个温和拮抗作用的区域。与此相反，在G-361细胞中(图49-图54)，尽管在整个剂量矩阵中大多数相互作用也是加和性的，但两种分析模型也揭示在中等浓度时有小范围的适度协同性。用第二种机制不同的ERK抑制剂 (SCH772984)得到类似的结果。这支持了这样的概念，即在G-361 中观察到的协同性可能是与ERK的抑制特异地相关，而不是由于脱靶效应。

总之，这些结果表明，在携带BRAF V600E突变的黑色素瘤细胞系中，BVD-523和I型、II型RAF抑制剂之间的相互作用至少是加和性的，而且在某些情况下为协同的。

协同相互作用是在两方面打分(图55-图57)。根据超过其而预测组合是加和的活性余量可以用简单的体积得分进行计算，这计算了所测量的和预测的响应面之间的体积。该体积得分表示对组合的整体响应是协同的(正值)、拮抗的(负值)或加和的

。此外， “协同得分”是超过Leowe加和的正-门控的抑制加权体积。这提供了附加的优先，利于其协同效应发生在高效应水平的组合，忽略了响应面的拮抗部分。

实施例9

ERK抑制剂之间的组合相互作用

在具有10％FBS的DMEM中培养RAF突变体黑素瘤细胞系 A375细胞，以每孔2000个细胞的初始密度一式三份接种于96孔平板。如上文实施例8所描述的，72小时后分析ERK抑制剂BVD-523和 SCH772984之间的组合相互作用。根据制造商说明书使用 CellTiter-Glo^R反应剂(Promega，Madison，WI)，并使用BMG FLUOstar读板器(BMG Labtech，Ortenberg，Germany)检测发光确定活力。

Loewe和Bliss“余量抑制”热图的可视化表明BVD-523和 SCH772984的组合主要是加和作用，在中档剂量下有一定范围的潜在协同性(图58)。

总之，这些结果表明，BVD-523和SCH772984之间的相互作用至少是加和的，而且在某些情况下是协同的。

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本申请引用的所有文档都以全文引用的方式并入本文作为参考。

尽管本文描述本发明的阐述性实施方式，要理解的时本发明不限于描述的那些，多种其他变化或修饰可由本领域技术人员作出，而不偏离本发明的范围或精神。

Claims

1.有效量的(i)第一抗癌剂，其是BVD-523或其药学可接受的盐和(ii)第二抗癌剂，其是1型RAF抑制剂或其药学可接受的盐在制备用于在有此需要的受试者中治疗或改善癌症的效应的药物中的用途，

其中所述1型RAF抑制剂选自达拉非尼、维罗非尼、其药学可接受的盐及其组合，

其中所述癌症是黑色素瘤或结肠癌，并且

其中所述有效量的第一和第二抗癌剂相比单独的任一抗癌剂提供了协同效应。

2.根据权利要求1的用途，其中所述受试者是哺乳动物。

3.根据权利要求2的用途，其中所述哺乳动物选自人、灵长类、农场动物，和家养动物。

4.根据权利要求2的用途，其中所述哺乳动物是人。

5.根据权利要求1的用途，其中所述1型RAF抑制剂是达拉非尼或其药学可接受的盐。

6.根据权利要求1的用途，其中所述患有癌症的受试者具有体细胞BRAF突变或对MAPK通路抑制剂治疗顽固。

7.根据权利要求1的用途，其中所述药物还包含至少一种附加的治疗剂，选自抗体或其片段、细胞毒性剂、毒素、放射性核素、免疫调节剂、光敏治疗剂、放射增敏剂、激素、抗血管生成剂，及其组合。

8.根据权利要求7的用途，其中所述附加的治疗剂是PI3K/Akt通路的抑制剂。

9.根据权利要求8的用途，其中所述PI3K/Akt通路的抑制剂选自：A-674563(CAS#552325-73-2)、AGL 2263、AMG-319、AS-041164(5-苯并[1,3]二氧杂环戊烯-5-基亚甲基-噻唑烷-2,4-二酮)、AS-604850(5-(2,2-二氟-苯并[1,3]二氧杂环戊烯-5-基亚甲基)-噻唑烷-2,4-二酮)、AS-605240(5-喹喔啉-6-亚甲基-1,3-噻唑烷-2,4-二酮)、AT7867(CAS#857531-00-1)、苯并咪唑系列、BML-257(CAS#32387-96-5)、CAL-120、CAL-129、CAL-130、CAL-253、CAL-263、CAS#612847-09-3、CAS#681281-88-9、CAS#75747-14-7、CAS#925681-41-0、CAS#98510-80-6、CCT128930(CAS#885499-61-6)、CH5132799(CAS#1007207-67-1)、CHR-4432、FPA 124(CAS#902779-59-3)、GS-1101(CAL-101)、GSK 690693(CAS#937174-76-0)、H-89(CAS#127243-85-0)、和厚朴酚、IC87114、IPI-145、KAR-4139、KAR-4141、KIN-1、KT 5720(CAS#108068-98-0)、米替福新、MK-2206二盐酸盐(CAS#1032350-13-2)、ML-9(CAS#105637-50-1)、纳曲吲哚盐酸盐、OXY-111A、哌立福新、PHT-427(CAS#1191951-57-1)、pictilisib、PIK-90(CAS#677338-12-4)、SC-103980、SF-1126、SH-5、SH-6、四氢姜黄素、TG100-115、曲西立滨、X-339、XL-499，或其药学可接受的盐，及其组合。

10.根据权利要求8的用途，其中所述PI3K/Akt通路的抑制剂选自：PI3激酶抑制剂。

11.根据权利要求8的用途，其中所述PI3K/Akt通路的抑制剂选自：PI3激酶δ抑制剂、PI3Kδ/γ抑制剂及其组合。

12.根据权利要求8的用途，其中所述PI3K/Akt通路的抑制剂选自：PI3-α/δ抑制剂、PI3-δ抑制剂、PI3-δ/γ抑制剂、PI3-γ抑制剂及其组合。

13.有效量的(i)第一抗癌剂，其是BVD-523或其药学可接受的盐和(ii)第二抗癌剂，其是达拉非尼或其药学可接受的盐在制备用于在有此需要的受试者中治疗或改善癌症的效应的药物中的用途，其中所述癌症是黑色素瘤或结肠癌，并且其中所述有效量的第一和第二抗癌剂相比单独的任一抗癌剂提供了协同效应。

14.根据权利要求13的用途，其中所述受试者是哺乳动物。

15.根据权利要求14的用途，其中所述哺乳动物选自人、灵长类动、农场动物，和家养动物。

16.根据权利要求14的用途，其中所述哺乳动物是人。

17.根据权利要求13的用途，其中所述BVD-523或其药学可接受的盐以药用组合物的形式施用，所述药用组合物进一步包含药学可接受的载体。

18.根据权利要求13的用途，其中所述达拉非尼或其药学可接受的盐是以药用组合物的形式施用，所述药用组合物进一步包含药学可接受的载体。

19.根据权利要求13的用途，其中所述患有癌症的受试者具有BRAF突变或对MAPK通路抑制剂顽固。

20.根据权利要求13的用途，其中所述药物还包含至少一种附加的治疗剂，选自抗体或其片段、细胞毒性剂、毒素、放射性核素、免疫调节剂、光敏治疗剂、放射增敏剂、激素、抗血管生成剂，及其组合。

21.根据权利要求20的用途，其中所述附加的治疗剂是PI3K/Akt通路的抑制剂。

22.根据权利要求21所述的用途，其中所述PI3K/Akt通路的抑制剂选自：A-674563(CAS#552325-73-2)、AGL 2263、AMG-319、AS-041164(5-苯并[1,3]二氧杂环戊烯-5-基亚甲基-噻唑烷-2,4-二酮)、AS-604850(5-(2,2-二氟-苯并[1,3]二氧杂环戊烯-5-基亚甲基)-噻唑烷-2,4-二酮)、AS-605240(5-喹喔啉-6-亚甲基-1,3-噻唑烷-2,4-二酮)、AT7867(CAS#857531-00-1)、苯并咪唑系列、BML-257(CAS#32387-96-5)、CAL-120、CAL-129、CAL-130、CAL-253、CAL-263、CAS#612847-09-3、CAS#681281-88-9、CAS#75747-14-7、CAS#925681-41-0、CAS#98510-80-6、CCT128930(CAS#885499-61-6)、CH5132799(CAS#1007207-67-1)、CHR-4432、FPA 124(CAS#902779-59-3)、GS-1101(CAL-101)、GSK 690693(CAS#937174-76-0)、H-89(CAS#127243-85-0)、和厚朴酚、IC87114、IPI-145、KAR-4139、KAR-4141、KIN-1、KT 5720(CAS#108068-98-0)、米替福新、MK-2206二盐酸盐(CAS#1032350-13-2)、ML-9(CAS#105637-50-1)、纳曲吲哚盐酸盐、OXY-111A、哌立福新、PHT-427(CAS#1191951-57-1)、pictilisib、PIK-90(CAS#677338-12-4)、SC-103980、SF-1126、SH-5、SH-6、四氢姜黄素、TG100-115、曲西立滨、X-339、XL-499，或其药学可接受的盐，及其组合。

23.根据权利要求21的用途，其中所述PI3K/Akt通路的抑制剂选自：PI3激酶抑制剂。

24.根据权利要求21的用途，其中所述PI3K/Akt通路的抑制剂选自：PI3激酶δ抑制剂、PI3Kδ/γ抑制剂及其组合。

25.根据权利要求21的用途，其中所述PI3K/Akt通路的抑制剂选自：PI3-α/δ抑制剂、PI3-δ抑制剂、PI3-δ/γ抑制剂、PI3-γ抑制剂及其组合。

26.一种在体外或离体产生癌细胞死亡的方法，包括将肿瘤细胞接触有效量的(i)第一抗癌剂，其是BVD-523或其药学可接受的盐和(ii)第二抗癌剂，其是1型RAF抑制剂或其药学可接受的盐，

其中所述癌细胞来自黑色素瘤或结肠癌，并且

其中与将癌细胞和任一单独抗癌剂接触相比，所述癌细胞与所述有效量的第一和第二抗癌剂接触提供了协同效应。

27.根据权利要求26的方法，其中所述癌细胞是哺乳动物癌细胞。

28.根据权利要求27的方法，其中所述哺乳动物癌细胞从选自如下的哺乳类获得：人、灵长类动物、农场动物，和家养动物。

29.根据权利要求27的方法，其中所述哺乳动物癌细胞是人癌细胞。

30.根据权利要求26的方法，其中所述1型RAF抑制剂是达拉非尼或其药学可接受的盐。

31.根据权利要求26的方法，其中所述患有癌症的受试者具有体细胞BRAF突变或对MAPK通路抑制剂治疗顽固。

32.根据权利要求26的方法，其进一步包括施用至少一种附加的治疗剂，选自抗体或其片段、细胞毒性剂、毒素、放射性核素、免疫调节剂、光敏治疗剂、放射增敏剂、激素、抗血管生成剂，及其组合。

33.根据权利要求32的方法，其中所述附加的治疗剂是PI3K/Akt通路的抑制剂。

34.根据权利要求33的方法，其中所述PI3K/Akt通路的抑制剂选自：A-674563(CAS#552325-73-2)、AGL 2263、AMG-319、AS-041164(5-苯并[1,3]二氧杂环戊烯-5-基亚甲基-噻唑烷-2,4-二酮)、AS-604850(5-(2,2-二氟-苯并[1,3]二氧杂环戊烯-5-基亚甲基)-噻唑烷-2,4-二酮)、AS-605240(5-喹喔啉-6-亚甲基-1,3-噻唑烷-2,4-二酮)、AT7867(CAS#857531-00-1)、苯并咪唑系列、BML-257(CAS#32387-96-5)、CAL-120、CAL-129、CAL-130、CAL-253、CAL-263、CAS#612847-09-3、CAS#681281-88-9、CAS#75747-14-7、CAS#925681-41-0、CAS#98510-80-6、CCT128930(CAS#885499-61-6)、CH5132799(CAS#1007207-67-1)、CHR-4432、FPA 124(CAS#902779-59-3)、GS-1101(CAL-101)、GSK 690693(CAS#937174-76-0)、H-89(CAS#127243-85-0)、和厚朴酚、IC87114、IPI-145、KAR-4139、KAR-4141、KIN-1、KT 5720(CAS#108068-98-0)、米替福新、MK-2206二盐酸盐(CAS#1032350-13-2)、ML-9(CAS#105637-50-1)、纳曲吲哚盐酸盐、OXY-111A、哌立福新、PHT-427(CAS#1191951-57-1)、PI3激酶δ抑制剂、PI3激酶抑制剂、PI3-α/δ抑制剂、PI3-δ抑制剂、PI3-δ/γ抑制剂、PI3-γ抑制剂、PI3Kδ/γ抑制剂、pictilisib、PIK-90(CAS#677338-12-4)、SC-103980、SF-1126、SH-5、SH-6、四氢姜黄素、TG100-115、曲西立滨、X-339、XL-499，或其药学可接受的盐，及其组合。

35.根据权利要求33的方法，其中所述PI3K/Akt通路的抑制剂选自：PI3激酶抑制剂。

36.根据权利要求33的方法，其中所述PI3K/Akt通路的抑制剂选自：PI3激酶δ抑制剂、PI3Kδ/γ抑制剂及其组合。

37.根据权利要求33的方法，其中所述PI3K/Akt通路的抑制剂选自：PI3-α/δ抑制剂、PI3-δ抑制剂、PI3-δ/γ抑制剂、PI3-γ抑制剂及其组合。

38.用于在有此需要的受试者中治疗或改善癌症的效应的试剂盒，其包括有效量的(i)第一抗癌剂，其是BVD-523或其药学可接受的盐和(ii)第二抗癌剂，其是1型RAF抑制剂或其药学可接受的盐，与其使用说明书一起包装，

其中所述癌症是黑色素瘤或结肠癌，并且

39.根据权利要求38的试剂盒，其中所述受试者是哺乳动物。

40.根据权利要求39的试剂盒，其中所述哺乳动物选自人、灵长类、农场动物，和家养动物。

41.根据权利要求39的试剂盒，其中所述哺乳动物是人。

42.根据权利要求38的试剂盒，其中所述1型RAF抑制剂是达拉非尼或其药学可接受的盐。

43.根据权利要求38的试剂盒，其中所述患有癌症的受试者具有体细胞BRAF突变或对MAPK通路抑制剂治疗顽固。

44.根据权利要求38的试剂盒，其进一步包括施用至少一种附加的治疗剂，选自抗体或其片段、细胞毒性剂、毒素、放射性核素、免疫调节剂、光敏治疗剂、放射增敏剂、激素、抗血管生成剂，及其组合。

45.根据权利要求44的试剂盒，其中所述附加的治疗剂是PI3K/Akt通路的抑制剂。

46.根据权利要求45的试剂盒，其中所述PI3K/Akt通路的抑制剂选自：A-674563(CAS#552325-73-2)、AGL 2263、AMG-319、AS-041164(5-苯并[1,3]二氧杂环戊烯-5-基亚甲基-噻唑烷-2,4-二酮)、AS-604850(5-(2,2-二氟-苯并[1,3]二氧杂环戊烯-5-基亚甲基)-噻唑烷-2,4-二酮)、AS-605240(5-喹喔啉-6-亚甲基-1,3-噻唑烷-2,4-二酮)、AT7867(CAS#857531-00-1)、苯并咪唑系列、BML-257(CAS#32387-96-5)、CAL-120、CAL-129、CAL-130、CAL-253、CAL-263、CAS#612847-09-3、CAS#681281-88-9、CAS#75747-14-7、CAS#925681-41-0、CAS#98510-80-6、CCT128930(CAS#885499-61-6)、CH5132799(CAS#1007207-67-1)、CHR-4432、FPA 124(CAS#902779-59-3)、GS-1101(CAL-101)、GSK 690693(CAS#937174-76-0)、H-89(CAS#127243-85-0)、和厚朴酚、IC87114、IPI-145、KAR-4139、KAR-4141、KIN-1、KT 5720(CAS#108068-98-0)、米替福新、MK-2206二盐酸盐(CAS#1032350-13-2)、ML-9(CAS#105637-50-1)、纳曲吲哚盐酸盐、OXY-111A、哌立福新、PHT-427(CAS#1191951-57-1)、pictilisib、PIK-90(CAS#677338-12-4)、SC-103980、SF-1126、SH-5、SH-6、四氢姜黄素、TG100-115、曲西立滨、X-339、XL-499，或其药学可接受的盐，及其组合。

47.根据权利要求45的试剂盒，其中所述PI3K/Akt通路的抑制剂选自：PI3激酶抑制剂。

48.根据权利要求45的试剂盒，其中所述PI3K/Akt通路的抑制剂选自：PI3激酶δ抑制剂、PI3Kδ/γ抑制剂及其组合。

49.根据权利要求45的试剂盒，其中所述PI3K/Akt通路的抑制剂选自：PI3-α/δ抑制剂、PI3-δ抑制剂、PI3-δ/γ抑制剂、PI3-γ抑制剂及其组合。

50.在有此需要的受试者中治疗或改善癌症的效应的药用组合物，该药用组合物包含药学可接受的载体和有效量的(i)第一抗癌剂，其是BVD-523或其药学可接受的盐和(ii)第二抗癌剂，其是1型RAF抑制剂或其药学可接受的盐，其中所述1型RAF抑制剂选自达拉非尼、维罗非尼、其药学可接受的盐及其组合，其中所述癌症是黑色素瘤或结肠癌，并且其中所述有效量的第一和第二抗癌剂相比单独的任一抗癌剂提供了协同效应。

51.根据权利要求50的药用组合物，其中所述受试者是哺乳动物。

52.根据权利要求51的药用组合物，其中所述哺乳动物选自人、灵长类、农场动物，和家养动物。

53.根据权利要求51的药用组合物，其中所述哺乳动物是人。

54.根据权利要求50的药用组合物，其中所述1型RAF抑制剂是达拉非尼或其药学可接受的盐。

55.根据权利要求50的药用组合物，其中所述患有癌症的受试者具有体细胞BRAF突变或对MAPK通路抑制剂治疗顽固。

56.根据权利要求50的药用组合物，其进一步包括施用至少一种附加的治疗剂，选自抗体或其片段、细胞毒性剂、毒素、放射性核素、免疫调节剂、光敏治疗剂、放射增敏剂、激素、抗血管生成剂，及其组合。

57.根据权利要求56的药用组合物，其中所述附加的治疗剂是PI3K/Akt通路的抑制剂。

58.根据权利要求57的药用组合物，其中所述PI3K/Akt通路的抑制剂选自：A-674563(CAS#552325-73-2)、AGL 2263、AMG-319、AS-041164(5-苯并[1,3]二氧杂环戊烯-5-基亚甲基-噻唑烷-2,4-二酮)、AS-604850(5-(2,2-二氟-苯并[1,3]二氧杂环戊烯-5-基亚甲基)-噻唑烷-2,4-二酮)、AS-605240(5-喹喔啉-6-亚甲基-1,3-噻唑烷-2,4-二酮)、AT7867(CAS#857531-00-1)、苯并咪唑系列、BML-257(CAS#32387-96-5)、CAL-120、CAL-129、CAL-130、CAL-253、CAL-263、CAS#612847-09-3、CAS#681281-88-9、CAS#75747-14-7、CAS#925681-41-0、CAS#98510-80-6、CCT128930(CAS#885499-61-6)、CH5132799(CAS#1007207-67-1)、CHR-4432、FPA 124(CAS#902779-59-3)、GS-1101(CAL-101)、GSK 690693(CAS#937174-76-0)、H-89(CAS#127243-85-0)、和厚朴酚、IC87114、IPI-145、KAR-4139、KAR-4141、KIN-1、KT 5720(CAS#108068-98-0)、米替福新、MK-2206二盐酸盐(CAS#1032350-13-2)、ML-9(CAS#105637-50-1)、纳曲吲哚盐酸盐、OXY-111A、哌立福新、PHT-427(CAS#1191951-57-1)、pictilisib、PIK-90(CAS#677338-12-4)、SC-103980、SF-1126、SH-5、SH-6、四氢姜黄素、TG100-115、曲西立滨、X-339、XL-499，或其药学可接受的盐，及其组合。

59.根据权利要求57的药用组合物，其中所述PI3K/Akt通路的抑制剂选自：PI3激酶抑制剂。

60.根据权利要求57的药用组合物，其中所述PI3K/Akt通路的抑制剂选自：PI3激酶δ抑制剂、PI3Kδ/γ抑制剂及其组合。

61.根据权利要求57的药用组合物，其中所述PI3K/Akt通路的抑制剂选自：PI3-α/δ抑制剂、PI3-δ抑制剂、PI3-δ/γ抑制剂、PI3-γ抑制剂及其组合。

62.根据权利要求50的药用组合物，其是包含两种抗癌剂的单位剂型。

63.根据权利要求50的药用组合物，其中所述第一抗癌剂处于第一种单位剂型，而所述第二抗癌剂处于与第一种单位剂型分开的第二种单位剂型。

64.根据权利要求50的药用组合物，其中所述第一和第二抗癌剂共施用于受试者。

65.根据权利要求50的药用组合物，其中所述第一和第二抗癌剂系列施用于受试者。

66.根据权利要求65的药用组合物，其中所述第一抗癌药在所述第二抗癌剂之前施用于受试者。

67.根据权利要求65的药用组合物，其中所述第二抗癌药在所述第一抗癌剂之前施用于受试者。

68.在有此需要的受试者中治疗或改善癌症的效应的药用组合物，所述药用组合物包含药学可接受的载体和有效量的(i)第一抗癌剂，其是BVD-523或其药学可接受的盐和(ii)第二抗癌剂，其是维罗非尼或其药学可接受的盐，其中所述癌症是黑色素瘤或结肠癌，并且其中所述有效量的第一和第二抗癌剂相比单独的任一抗癌剂提供了协同效应。

69.权利要求68的药用组合物在制备用于在有此需要的受试者中治疗或改善癌症的效应的药物中的用途。

70.用于在有此需要的受试者中治疗或改善癌症的效应的试剂盒，所述试剂盒包括有效量的根据权利要求68的药用组合物。

71.有效量的(i)第一抗癌剂，其是BVD-523或其药学可接受的盐和(ii)第二抗癌剂，其是1型RAF抑制剂或其药学可接受的盐在制备用于产生癌细胞死亡的药物中的用途，

其中所述癌细胞来自黑色素瘤或结肠癌，并且

72.根据权利要求71的用途，其中所述癌细胞是哺乳动物癌细胞。

73.根据权利要求72的用途，其中所述哺乳动物癌细胞从选自如下的哺乳类获得：人、灵长类动物、农场动物，和家养动物。

74.根据权利要求72的用途，其中所述哺乳动物癌细胞是人癌细胞。

75.根据权利要求71的用途，其中所述1型RAF抑制剂是达拉非尼或其药学可接受的盐。

76.根据权利要求71的用途，其中所述患有癌症的受试者具有体细胞BRAF突变或对MAPK通路抑制剂治疗顽固。

77.根据权利要求71的用途，其中所述药物还包含至少一种附加的治疗剂，选自抗体或其片段、细胞毒性剂、毒素、放射性核素、免疫调节剂、光敏治疗剂、放射增敏剂、激素、抗血管生成剂，及其组合。

78.根据权利要求77的用途，其中所述附加的治疗剂是PI3K/Akt通路的抑制剂。

79.根据权利要求78的用途，其中所述PI3K/Akt通路的抑制剂选自：A-674563(CAS#552325-73-2)、AGL 2263、AMG-319、AS-041164(5-苯并[1,3]二氧杂环戊烯-5-基亚甲基-噻唑烷-2,4-二酮)、AS-604850(5-(2,2-二氟-苯并[1,3]二氧杂环戊烯-5-基亚甲基)-噻唑烷-2,4-二酮)、AS-605240(5-喹喔啉-6-亚甲基-1,3-噻唑烷-2,4-二酮)、AT7867(CAS#857531-00-1)、苯并咪唑系列、BML-257(CAS#32387-96-5)、CAL-120、CAL-129、CAL-130、CAL-253、CAL-263、CAS#612847-09-3、CAS#681281-88-9、CAS#75747-14-7、CAS#925681-41-0、CAS#98510-80-6、CCT128930(CAS#885499-61-6)、CH5132799(CAS#1007207-67-1)、CHR-4432、FPA 124(CAS#902779-59-3)、GS-1101(CAL-101)、GSK 690693(CAS#937174-76-0)、H-89(CAS#127243-85-0)、和厚朴酚、IC87114、IPI-145、KAR-4139、KAR-4141、KIN-1、KT 5720(CAS#108068-98-0)、米替福新、MK-2206二盐酸盐(CAS#1032350-13-2)、ML-9(CAS#105637-50-1)、纳曲吲哚盐酸盐、OXY-111A、哌立福新、PHT-427(CAS#1191951-57-1)、pictilisib、PIK-90(CAS#677338-12-4)、SC-103980、SF-1126、SH-5、SH-6、四氢姜黄素、TG100-115、曲西立滨、X-339、XL-499，或其药学可接受的盐，及其组合。

80.根据权利要求78的用途，其中所述PI3K/Akt通路的抑制剂选自：PI3激酶抑制剂。

81.根据权利要求78的用途，其中所述PI3K/Akt通路的抑制剂选自：PI3激酶δ抑制剂、PI3Kδ/γ抑制剂及其组合。

82.根据权利要求78的用途，其中所述PI3K/Akt通路的抑制剂选自：PI3-α/δ抑制剂、PI3-δ抑制剂、PI3-δ/γ抑制剂、PI3-γ抑制剂及其组合。