CN110998319A - 用表观遗传疗法诱导合成致死性 - Google Patents

用表观遗传疗法诱导合成致死性 Download PDF

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Abstract

本公开内容总体上涉及用于治疗癌症的组合物和方法。在一些方面中，本文公开了使用至少一种表观遗传化合物和至少一种化学治疗剂的组合用表观遗传疗法诱导合成致死性(ISLET)的方法。本文还公开了用于鉴定当与至少一种表观遗传化合物组合时诱导癌细胞杀伤的化合物的筛选方法。本文还公开了增强化学治疗剂针对癌症的治疗效果的方法，所述方法包括向具有癌症的受试者施用有效增强化学治疗剂针对癌症的治疗效果的量的表观遗传化合物。

Description

用表观遗传疗法诱导合成致死性
关于联邦资助研究或开发的声明
本发明是在由美国国立卫生研究院/国家癌症研究所(National Institutes ofHealth/National Cancer Institute)授予的授权号R01CA113374、R03MH098712和P50CA058236的政府支持下完成的。政府在本发明中具有一定权利。
发明领域
本公开内容总体上涉及用于治疗癌症的组合疗法，以及用于鉴定可以以组合使用以治疗癌症的化合物的筛选方法。
背景
癌症仍然是一个重大的健康问题并且在全世界是主要的死亡原因。在理解癌症的遗传基础中已经取得了显著的进展，并且相当多的研究已经集中于可能参与特定癌症的发展的特定基因。癌基因是过表达时导致癌症的基因，而肿瘤抑制基因是低表达时可能导致癌症的基因。因此，用药物控制癌基因和肿瘤抑制基因二者的能力是有巨大价值的。
最近，研究人员对获得对参与癌症以及癌基因和肿瘤抑制基因二者的控制的表观遗传因素的更好理解感兴趣。表观遗传学涉及由除细胞或生物体的DNA序列之外的因素引起的表型。DNA和组蛋白上的表观遗传标志物的改变可以介导肿瘤抑制基因的抑制和癌基因的活化。因此，通过抑制负责“写入(writing)”、“消除(erasing)”和“读取(reading)”表观遗传标志物的表观遗传酶和/或机制来逆转这样的改变是一种有吸引力的癌症治疗策略。
例如，DNA甲基化是对DNA的一种化学修饰，其可以通过被称为甲基转移酶的酶来进行，其中甲基基团被添加到DNA的某些胞嘧啶。这种表观遗传过程，虽然不改变基因型，但在基因表达调控中是重要的。DNA甲基转移酶催化甲基基团转移到DNA链上。在癌症中，DNA甲基转移酶可能导致超甲基化(hypermethylation)发生，其中DNA变得过甲基化，起使基因包括例如肿瘤抑制基因和DNA修复基因沉默的作用。甲基化-DNA结合(MBD)蛋白还可以在癌症发展和进展期间促进DNA超甲基化。MBD蛋白起“表观遗传读取者(epigenetic reader)”的作用，募集辅阻遏物复合物来促进基因抑制。例如，当MBD蛋白MBD2在癌细胞中异常甲基化时，其结合GSTP1启动子CpG岛。GSTP1启动子CpG岛的超甲基化和伴随的GSTP1的表观遗传基因沉默经常发生在若干癌症类型包括例如前列腺癌、乳腺癌和肝癌中。因此，抑制MBD介导的阻遏已经变成癌症研究中的兴趣。
因此，认为DNA甲基化可能是表观遗传癌症研究的课题中的一种重要机制。某些DNA甲基转移酶抑制剂，诸如地西他滨(decitabine)，已经展示出化学治疗功效。然而，甲基化-DNA结合蛋白抑制剂和DNA甲基转移酶抑制剂药物诸如地西他滨至少部分由于它们的无效或治疗有效剂量的毒性而在临床环境中具有有限的成功。
除了表观遗传化合物之外，目前还存在可用于治疗的各种各样的化学治疗剂。然而，化学治疗剂可能具有若干缺点，包括对健康细胞的高毒性水平和多种功效水平。
一种已知的化学治疗剂是极光(Aurora)激酶A抑制剂。极光激酶是与蛋白质表达相关的酶，其对于有丝分裂过程包括中心体成熟、染色体列对(chromosome alignment)、染色体分离和胞质分裂是不可或缺的。极光激酶A的过表达是许多人类恶性肿瘤的显著特征。因此，极光激酶A抑制剂是癌症研究人员感兴趣的。然而，像地西他滨一样，极光激酶A抑制剂，诸如alisertib，在体内仅显示出适度的化学治疗活性，并且还部分由于在实现这种适度的活性所需的剂量的毒性而被限制。
另一种已知的化学治疗剂包括视黄酸受体(RAR)激动剂，诸如异维甲酸。视黄酸受体通过与靶基因的视黄酸响应元件结合来介导身体中的类视黄醇(retinoid)的响应。在结合视黄酸或其他激动剂后，RAR可以募集共活化物(coactivator)蛋白并且介导靶基因的转录。类视黄醇与其他信号传导途径相互作用，并且可以促进分化和抗增殖信号；类视黄醇信号传导途径的抑制已经与癌症中的肿瘤发展相关。然而，RAR激动剂诸如异维甲酸，像极光激酶A抑制剂alisertib一样，作为单独的剂尚未对大多数癌症类型显示出有希望的体内化学治疗活性。
因此，本领域中对于改善的化学治疗性治疗和鉴定用表观遗传疗法诱导癌细胞的合成致死性(synthetic lethality)的化合物的继续研究存在需求。此外，对于对非恶性细胞具有最小细胞毒性或无细胞毒性的有效化学治疗性治疗存在需求。
发明概述
本文公开了筛选当与至少一种表观遗传化合物组合时诱导癌细胞杀伤的化合物的方法，所述方法包括用表观遗传化合物处理癌细胞，其中已经使所述癌细胞丢失至少一种基因或基因产物的功能。例如，在某些实施方案中，可以用被认为抑制靶基因或基因产物的剂的文库处理癌细胞。在示例性实施方案中，剂的文库可以选自shRNA文库、siRNA文库、小分子文库、插入诱变文库、CRISPR/Cas sgRNA文库和CRISPR/无催化活性的dCas sgRNA文库。
在实施方案中，本文公开了一种用于筛选当与至少一种表观遗传化合物组合时诱导癌细胞杀伤的化合物的方法，该方法包括用表观遗传化合物处理癌细胞，其中所述癌细胞已经例如用shRNA文库转导，其中shRNA文库包含多于一种shRNA，每一种shRNA是对靶基因特异的，和鉴定经表观遗传化合物的处理无法存活的经转导的癌细胞的shRNA，和将当与表观遗传化合物组合时诱导癌细胞杀伤的化合物鉴定为对经表观遗传化合物的处理无法存活的经转导的癌细胞的shRNA的靶基因的抑制剂或由靶基因编码的多肽的抑制剂。在某些实施方案中，表观遗传化合物选自DNA脱甲基化剂、组蛋白脱乙酰酶抑制剂、组蛋白甲基转移酶抑制剂和甲基化-DNA结合蛋白抑制剂。在某些实施方案中，表观遗传化合物是DNA甲基转移酶抑制剂，并且在某些实施方案中，表观遗传化合物是地西他滨。在其他实施方案中，表观遗传化合物是甲基化-DNA结合蛋白抑制剂，并且在某些实施方案中，表观遗传化合物是KCC-08。在某些实施方案中，shRNA文库是汇集的(pooled)慢病毒shRNA文库。
本文还公开了用于治疗癌症的方法，所述方法包括向有相应需要的受试者施用有效量的至少一种表观遗传化合物和有效量的至少一种化学治疗剂。在某些实施方案中，有效量的至少一种表观遗传化合物和有效量的至少一种化学治疗剂协同地起作用以抑制癌细胞的生长。在某些实施方案中，本文公开了一种治疗癌症的方法，该方法包括向有相应需要的受试者施用有效量的至少一种DNA甲基转移酶抑制剂和有效量的至少一种极光激酶A抑制剂，并且在其他实施方案中，本文公开了一种治疗癌症的方法，该方法包括向有相应需要的受试者施用有效量的至少一种MBD蛋白抑制剂和有效量的至少一种RAR激动剂。在某些实施方案中，有效量的至少一种表观遗传化合物(诸如DNA甲基转移酶抑制剂或MBD蛋白抑制剂)和有效量的至少一种化学治疗剂(诸如极光激酶A抑制剂或RAR激动剂)协同地起作用以抑制癌细胞的生长。在某些实施方案中，至少一种DNA甲基转移酶抑制剂是地西他滨，并且在某些实施方案中，至少一种极光激酶A抑制剂是alisertib。在本文公开的其他实施方案中，至少一种MBD蛋白抑制剂是KCC-08，并且至少一种RAR激动剂是异维甲酸。
在某些实施方案中，在24小时时间段内以单次施用被施用的地西他滨的有效量小于25mg/m2，并且在某些实施方案中，在24小时时间段内以多于单次施用被施用的地西他滨的有效量小于150mg/m2。在一些方面中，在一个周期中施用的至少一种极光激酶A抑制剂的有效量在从小于约70mg至约1050mg的范围内。
在某些实施方案中，在24小时时间段内以单次施用被施用的KCC-08的有效量小于约5mg/kg，并且在某些实施方案中，在24小时时间段内以多于单次施用被施用的KCC-08的有效量小于约25mg/kg，诸如约1mg/kg/天或约0.5mg/kg/天。在一些方面中，在一个周期中施用的至少一种RAR激动剂的有效量在从小于约30mg/kg/天至小于约60mg/kg/天的范围内，诸如约30mg/kg/天。
在本文公开的某些实施方案中，癌症选自前列腺癌、卵巢癌、肺癌、结肠直肠癌、中枢神经系统癌和乳腺癌。在某些实施方案中，需要治疗的受试者是人类。
在本文公开的特定实施方案中，至少一种表观遗传化合物的施用和至少一种化学治疗剂的施用是依次的。在某些实施方案中，当依次施用至少一种表观遗传化合物和至少一种化学治疗剂时，先施用至少一种表观遗传化合物。在本文公开的其他实施方案中，至少一种表观遗传化合物的施用和至少一种化学治疗剂的施用是同时的。
本文还公开了一种增强化学治疗剂针对癌症的治疗效果的方法，该方法包括向具有癌症的受试者施用有效增强化学治疗剂针对癌症的治疗效果的量的表观遗传化合物。在某些方面中，该方法还包括向受试者施用治疗有效量的化学治疗剂，并且在某些方面中，治疗有效量的化学治疗剂当在不施用表观遗传化合物的情况下施用时是治疗无效的。在本文公开的方法的某些实施方案中，表观遗传化合物是DNA甲基转移酶抑制剂，诸如地西他滨，并且在本文公开的方法的某些实施方案中，化学治疗剂是极光激酶A抑制剂，诸如alisertib。在本文公开的方法的某些实施方案中，表观遗传化合物是MBD蛋白抑制剂，诸如KCC-08，并且在本文公开的方法的某些实施方案中，化学治疗剂是RAR激动剂，诸如异维甲酸。
附图简述
图1A是地西他滨处理的细胞群体对比对照细胞群体中改变的shRNA条形码的瀑布图，其中x-轴[log2(地西他滨/对照)上落在0.0之下的柱指示shRNA对地西他滨敏感，并且x轴上落在0.0之上的柱指示shRNA对地西他滨耐受。
图1B是柱状图，其图示了包括具有靶向AURKA的shRNA与100nM地西他滨的组合的DU145细胞的五个样品，与具有媒介物对照的DU145细胞和具有地西他滨但没有AURKA的DU145细胞对比。
图2A是示出了DU145前列腺癌细胞对于单独的地西他滨和alisertib、媒介物对照以及地西他滨和alisertib的组合的生长曲线的图。
图2B是示出了A549肺癌细胞对于单独的地西他滨和alisertib、媒介物对照以及地西他滨和alisertib的组合的生长曲线的图。
图2C是示出了肝细胞对于单独的地西他滨和alisertib、媒介物对照以及地西他滨和alisertib的组合的生长曲线的图。
图3是图示了关于地西他滨和alisertib的组合治疗对18种癌细胞系的Bliss协同作用评分的柱状图。
图4示出了用于施用实施例3的裸鼠接受的地西他滨和alisertib的治疗方案的图示。
图5A是示出了来自施用媒介物对照、单独的地西他滨、单独的高剂量alisertib、单独的低剂量alisertib、与高剂量alisertib同时的地西他滨和与低剂量alisertib同时的地西他滨、以及作为起始物(primer)的地西他滨随后是高剂量alisertib和作为起始物的地西他滨随后是低剂量alisertib的小鼠的肿瘤的体积的倍数变化的图。
图5B是示出了施用媒介物对照、单独的地西他滨、单独的高剂量alisertib、单独的低剂量alisertib、与高剂量alisertib同时的地西他滨和与低剂量alisertib同时的地西他滨、以及作为起始物的地西他滨随后是高剂量alisertib和作为起始物的地西他滨随后是低剂量alisertib的小鼠在多天中的存活率的图。
图6A是示出了在施用媒介物对照期间小鼠体重随时间的变化的图。
图6B是示出了在施用地西他滨期间小鼠体重随时间的变化的图。
图6C是示出了在施用低剂量(15mg/kg)的alisertib期间小鼠体重随时间的变化的图。
图6D是示出了在施用高剂量(25mg/kg)的alisertib期间小鼠体重随时间的变化的图。
图6E是示出了在施用地西他滨和低剂量(15mg/kg)的alisertib的组合期间小鼠体重随时间的变化的图。
图6F是示出了在施用地西他滨和高剂量(25mg/kg)的alisertib的组合期间小鼠体重随时间的变化的图。
图6G是示出了在施用作为起始物的地西他滨和低剂量(15mg/kg)的alisertib的组合期间小鼠体重随时间的变化的图。
图6H是示出了在施用作为起始物的地西他滨和高剂量(25mg/kg)的alisertib的组合期间小鼠体重随时间的变化的图。
图7A是柱状图，其示出了施用媒介物对照、单独的地西他滨、单独的高剂量alisertib、单独的低剂量alisertib、与高剂量alisertib同时的地西他滨和与低剂量alisertib同时的地西他滨、以及作为起始物的地西他滨然后接着是高剂量alisertib和作为起始物的地西他滨然后接着是低剂量alisertib后的小鼠血小板(PLT)水平。
图7B是柱状图，其示出了施用媒介物对照、单独的地西他滨、单独的高剂量alisertib、单独的低剂量alisertib、与高剂量alisertib同时的地西他滨和与低剂量alisertib同时的地西他滨、以及作为起始物的地西他滨然后接着是高剂量alisertib和作为起始物的地西他滨然后接着是低剂量alisertib后的小鼠嗜中性粒细胞(NEUT)水平。
图7C是柱状图，其示出了施用媒介物对照、单独的地西他滨、单独的高剂量alisertib、单独的低剂量alisertib、与高剂量alisertib同时的地西他滨和与低剂量alisertib同时的地西他滨、以及作为起始物的地西他滨然后接着是高剂量alisertib和作为起始物的地西他滨然后接着是低剂量alisertib后的小鼠碱性磷酸酶(ALP)水平。
图7D是柱状图，其示出了施用媒介物对照、单独的地西他滨、单独的高剂量alisertib、单独的低剂量alisertib、与高剂量alisertib同时的地西他滨和与低剂量alisertib同时的地西他滨、以及作为起始物的地西他滨然后接着是高剂量alisertib和作为起始物的地西他滨然后接着是低剂量alisertib后的小鼠天冬氨酸转氨酶(AST)水平。
图7E是柱状图，其示出了施用媒介物对照、单独的地西他滨、单独的高剂量alisertib、单独的低剂量alisertib、与高剂量alisertib同时的地西他滨和与低剂量alisertib同时的地西他滨、以及作为起始物的地西他滨然后接着是高剂量alisertib和作为起始物的地西他滨然后接着是低剂量alisertib后的小鼠丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平。
图8A是示出了在施用媒介物对照后小鼠中的肿瘤体积随天数的变化的图。
图8B是示出了在用地西他滨(DAC)预处理后小鼠中的肿瘤体积随天数的变化的图。
图8C是示出了在没有地西他滨的预处理的情况下在施用alisertib(MLN8237)后小鼠中的肿瘤体积随天数的变化的图。
图8D是示出了在用地西他滨(DAC)预处理随后施用alisertib(MLN8237)后肿瘤体积随天数的变化的图。
图9是图示了施用媒介物对照和alisertib的小鼠对比用地西他滨预处理并且然后施用alisertib的小鼠的存活率的图。
图10A是来自实施例5的媒介物对照的用KI-67染色的样品细胞的图像。
图10B是来自实施例5的用地西他滨预处理的、用KI-67染色的样品细胞的图像。
图10C是来自实施例5的未用地西他滨预处理且施用alisertib的、用KI-67染色的样品细胞的图像。
图10D是来自实施例5的用地西他滨预处理且施用alisertib的、用KI-67染色的样品细胞的图像。
图10E是来自实施例5的媒介物对照的使用胱天蛋白酶3A染色的样品细胞的图像。
图10F是来自实施例5的用地西他滨预处理的、使用胱天蛋白酶3A染色的样品细胞的图像。
图10G是来自实施例5的未用地西他滨预处理并且施用alisertib的、使用胱天蛋白酶3A染色的样品细胞的图像。
图10H是来自实施例5的用地西他滨预处理并且施用alisertib的、使用胱天蛋白酶3A染色的样品细胞的图像。
图11A是对用媒介物对照；单独的100nM alisertib；单独的100nM地西他滨；和100nM地西他滨与100nM alisertib的组合处理的DU145细胞组织样品进行的针对极光激酶A的蛋白质印迹分析的图像。
图11B是对用媒介物对照；单独的100nM alisertib；单独的100nM地西他滨；和100nM地西他滨与100nM alisertib的组合处理的DU145细胞组织样品进行的针对DNA甲基转移酶3-β(DNMT3B)的蛋白质印迹分析的图像。
图12A是图示了包含媒介物对照的DU145细胞中与包含单独的地西他滨或alisertib的细胞以及包含地西他滨和alisertib的组合的细胞相比，如通过LUMA测定测量的甲基化百分比的柱状图。
图12B是图示了在亚硫酸氢盐基因组测序后，包含媒介物对照的DU145细胞中与包含单独的地西他滨或alisertib的细胞以及包含地西他滨和alisertib的组合的细胞相比，卫星2(Satellite 2)甲基化的百分比的柱状图。
图13A是示出了与媒介物对照或用单独的地西他滨或alisertib的处理相比，在地西他滨和alisertib的组合处理后H3S10-磷酸化(H3S10-phospho)阳性细胞的柱状图。
图13B是示出了与媒介物对照或用单独的地西他滨或alisertib的处理相比，在地西他滨和alisertib的组合处理后多核细胞的百分比的柱状图。
图13C是示出了与媒介物对照或用单独的地西他滨或alisertib的处理相比，在地西他滨和alisertib的组合处理后具有微核的细胞的百分比的柱状图。
图14是地西他滨处理的细胞群体对比对照细胞群体中改变的shRNA条形码的瀑布图，鉴定了具有对地西他滨敏感的shRNA的149种基因，因为它们在x-轴[log2(地西他滨/对照)]上落在0.0之下。
图15是柱状图，其图示了用靶向CHST3的shRNA序列与媒介物对照或100nM地西他滨的组合处理的DU145细胞，与用非靶向shRNA(shGFP)与媒介物对照和与100nM地西他滨的组合处理的DU145细胞相比。
图16是柱状图，其图示了用两种不同的靶向CRAT的shRNA序列(各自与媒介物对照或100nM地西他滨组合)处理的DU145细胞，与用非靶向shRNA(shGFP)与媒介物对照和与100nM地西他滨的组合处理的DU145细胞相比。
图17是柱状图，其图示了用两种不同的靶向DCT的shRNA序列(各自与媒介物对照或100nM地西他滨组合)处理的DU145细胞，与用非靶向shRNA(shGFP)与媒介物对照和与100nM地西他滨的组合处理的DU145细胞相比。
图18是柱状图，其图示了用靶向FUT5的shRNA序列与媒介物对照或100nM地西他滨的组合处理的DU145细胞，与用非靶向shRNA(shGFP)与媒介物对照和与100nM地西他滨的组合处理的DU145细胞相比。
图19是柱状图，其图示了用两种不同的靶向GNAZ的shRNA序列(各自与媒介物对照或100nM地西他滨组合)处理的DU145细胞，与用非靶向shRNA(shGFP)与媒介物对照和与100nM地西他滨的组合处理的DU145细胞相比。
图20是柱状图，其图示了用靶向HSD3B2的shRNA序列与媒介物对照或100nM地西他滨的组合处理的DU145细胞，与用非靶向shRNA(shGFP)与媒介物对照和与100nM地西他滨的组合处理的DU145细胞相比。
图21是柱状图，其图示了用两种不同的靶向IL17D的shRNA序列(各自与媒介物对照或100nM地西他滨组合)处理的DU145细胞，与用非靶向shRNA(shGFP)与媒介物对照和与100nM地西他滨的组合处理的DU145细胞相比。
图22是柱状图，其图示了用两种不同的靶向ITK的shRNA序列(各自与媒介物对照或100nM地西他滨组合)处理的DU145细胞，与用非靶向shRNA(shGFP)与媒介物对照和与100nM地西他滨的组合处理的DU145细胞相比。
图23是柱状图，其图示了用两种不同的靶向MAP2K2的shRNA序列(各自与媒介物对照或100nM地西他滨组合)处理的DU145细胞，与用非靶向shRNA(shGFP)与媒介物对照和与100nM地西他滨的组合处理的DU145细胞相比。
图24是柱状图，其图示了用两种不同的靶向MEF2C的shRNA序列(各自与媒介物对照或100nM地西他滨组合)处理的DU145细胞，与用非靶向shRNA(shGFP)与媒介物对照和与100nM地西他滨的组合处理的DU145细胞相比。
图25是柱状图，其图示了用两种不同的靶向PDE1B的shRNA序列(各自与媒介物对照或100nM地西他滨组合)处理的DU145细胞，与用非靶向shRNA(shGFP)与媒介物对照和与100nM地西他滨的组合处理的DU145细胞相比。
图26是柱状图，其图示了用四种不同的靶向PDE4B的shRNA序列(各自与媒介物对照或100nM地西他滨组合)处理的DU145细胞，与用非靶向shRNA(shGFP)与媒介物对照和与100nM地西他滨的组合处理的DU145细胞相比。
图27是柱状图，其图示了用四种不同的靶向PDE4C的shRNA序列(各自与媒介物对照或100nM地西他滨组合)处理的DU145细胞，与用非靶向shRNA(shGFP)与媒介物对照和与100nM地西他滨的组合处理的DU145细胞相比。
图28是柱状图，其图示了用两种不同的靶向STAT5A的shRNA序列(各自与媒介物对照或100nM地西他滨组合)处理的DU145细胞，与用非靶向shRNA(shGFP)与媒介物对照和与100nM地西他滨的组合处理的DU145细胞相比。
图29A是示出了在有异维甲酸和没有异维甲酸二者的情况下用KCC-08处理的PC-3细胞中类视黄醇信号传导的再活化的柱状图。
图29B是示出了在有异维甲酸和没有异维甲酸二者的情况下用KCC-08处理的PC-3细胞的克隆存活(clonogenic survival)的柱状图。
图29C是示出了用以实施例8中指示的剂量和时间表给予的媒介物对照、单独的KCC-08、单独的异维甲酸以及KCC-08和异维甲酸二者的组合处理的裸鼠中的PC-3异种移植物肿瘤生长的图。
图30是示出了用地西他滨处理的(在施用22种不同化合物之前施用)PC-3癌细胞超过Bliss独立性评分值的超出值(excess over Bliss Independence score values)的柱状图。
发明详述
本文公开了筛选用于用表观遗传疗法诱导合成致死性(ISLET)的化合物的方法。在过去，通常通过将已知各自具有一定治疗效果的两种药物随机组合并且评估该组合的治疗效果和毒性来鉴定新的药物组合。在另一方面，ISLET筛选方法提供了用于鉴定独特药物组合的新的系统性平台。通常，药物组合包括表观遗传化合物和化学治疗剂。不意图受任何理论束缚，似乎是暴露于通常以很小至无毒性的低剂量给予的表观遗传化合物以这样的方式改变癌细胞：使癌细胞暴露新的弱点因而使癌细胞易受靶向新暴露的弱点中的一种的其他化学治疗剂的影响。使用这种筛选平台已经鉴定出的化学治疗剂当以无毒性剂量而不与表观遗传化合物一起施用时对癌细胞具有很小至无治疗效果，但当与表观遗传化合物组合施用时出乎意料地展示出治疗效果。除表观遗传化合物和/或化学治疗剂以外的化合物也可被引入到这种独特的筛选平台设计中以鉴定用于癌症的新的治疗药物组合。
在某些实施方案中，筛选方法包括用剂处理癌细胞，使得癌细胞丢失至少一种基因或基因产物的功能，例如用剂的文库处理癌细胞，其中至少一种剂抑制靶基因或基因产物；然后用化合物诸如表观遗传化合物处理癌细胞；鉴定经表观遗传化合物的处理无法存活的被处理的癌细胞的靶基因；并且将当与表观遗传化合物组合时诱导癌细胞杀伤的化合物鉴定为经表观遗传化合物的处理无法存活的癌细胞的靶基因或基因产物的抑制剂。如本文使用的，术语“基因产物”是指从基因的表达得到的任何物质，诸如RNA、多肽和蛋白质。
在某些实施方案中，筛选方法包括用shRNA文库转导癌细胞，用化合物诸如表观遗传化合物处理经转导的癌细胞，并且鉴定经化合物的处理无法存活的经转导的癌细胞的shRNA。在某些实施方案中，表观遗传化合物是DNA脱甲基化剂、组蛋白脱乙酰酶抑制剂、组蛋白甲基转移酶抑制剂或MBD蛋白抑制剂。在某些实施方案中，化合物是DNA甲基转移酶抑制剂，并且在某些实施方案中，化合物是地西他滨。在某些其他实施方案中，化合物是MBD蛋白抑制剂，诸如KCC-08、KCC-03和KCC-07。在某些实施方案中，shRNA文库是汇集的慢病毒shRNA文库。在某些实施方案中，筛选方法包括用CRISPR-Cas9 sgRNA筛选文库转导癌细胞以产生汇集的敲除细胞文库、用化合物诸如表观遗传化合物处理经转导的癌细胞、并且鉴定经化合物的处理无法存活的经转导的癌细胞的sgRNA，该CRISPR-Cas9 sgRNA筛选文库例如可以包括Cas9内切核酸酶或dCas9无催化活性突变体、CRISPR RNA(crRNA)和反式活化RNA(tracrRNA)。crRNA和tracrRNA可以组合成单一指导RNA(“sgRNA”)。
表观遗传疗法涉及在不改变一个或更多个基因的核酸序列的情况下使用影响基因表达的药物。如本文使用的，“表观遗传化合物”是在不改变基因的核酸序列(基因型)的情况下影响基因的表达的化合物。例如，DNA甲基转移酶通过使DNA的某些胞嘧啶残基(其后是鸟嘌呤残基)甲基化而起作用以对DNA进行化学修饰。作为其他实例，MBD蛋白抑制剂起抑制甲基-CpG结合蛋白与DNA结合的作用，这进而导致减少对染色质缩合和失活的促进。表观遗传修饰的其他实例包括组蛋白修饰和微小RNA调控。这些表观遗传过程，虽然不改变基因型，但在基因表达和蛋白质调控中是重要的。此外，由表观遗传化合物诱导的修饰通常对癌细胞的影响不同于非癌细胞。例如，在癌症中，DNA甲基转移酶可能导致超甲基化(hypermethylation)发生，其中DNA变得过甲基化，起使基因包括例如肿瘤抑制基因和DNA修复基因沉默的作用。表观遗传化合物，诸如DNA甲基转移酶抑制剂，因此可以通过抑制在恶性细胞中有活性的DNA甲基转移酶的作用而具有化学治疗效果。然而，许多已知的DNA甲基转移酶抑制剂，诸如地西他滨，在体内具有低的化学治疗活性或者它们在化学治疗水平上对非恶性细胞的毒性是不可耐受的，限制了它们作为化学治疗剂的用途。
如本文公开的，已经发现表观遗传化合物可以与其他化学治疗剂组合以在癌细胞中诱导合成致死性。如下文讨论的，在某些实施方案中，表观遗传化合物与化学治疗剂的组合的治疗效果可以是协同的，意味着组合的治疗效果大于单独的表观遗传化合物或化学治疗剂或两者的总和。这种用表观遗传疗法诱导合成致死性是出乎意料且意想不到的。
ISLET提供了用于鉴定独特的化学治疗剂组合的新的筛选平台。在某些实施方案中，本文公开了用于筛选用于ISLET的化合物的方法，所述方法包括用剂的文库处理癌细胞，其中至少一种剂抑制靶基因或基因产物(诸如多肽)。例如，在某些实施方案中，本文公开的筛选方法可以包括用shRNA文库转导癌细胞、用化合物处理经转导的细胞、并且鉴定经化合物的处理无法存活的细胞的shRNA。shRNA是短发夹RNA，其是人工合成的包括发夹转角(turn)的小RNA分子并且是本领域已知的。Schlabach M.R.等,Cancer ProliferationGene Discovery through Functional Genomics,SCIENCE,319,5863:620-4(2008)。shRNA包括与感兴趣的靶基因的一部分互补的区域，从而使shRNA对感兴趣的靶基因特异。如此，shRNA可以被用于下调或上调感兴趣的特定靶基因的表达。
在某些实施方案中，癌细胞通过逆转录病毒或慢病毒递送shRNA被shRNA转导。在某些实施方案中，癌细胞通过慢病毒载体被shRNA转导。在某些实施方案中，慢病毒载体包括对靶基因特异的shRNA；用于鉴定shRNA的工具，诸如具有独特标识性核苷酸序列的核酸；抗生素抗性基因；和追踪转导水平的标志物基因，诸如荧光标志物基因。在某些实施方案中，靶基因是编码已知或怀疑在癌症中起作用的蛋白质的基因。
然后可以收获shRNA转导的癌细胞并且通过本领域已知的手段分离DNA。在某些实施方案中，用于鉴定shRNA的工具，诸如独特标识性核苷酸序列(或shRNA“条形码”)，可以被扩增并且通过核酸测序(例如，下一代测序)鉴定。独特标识性核苷酸序列，诸如60个核苷酸的“条形码”，例如在Silva,J.M.,等,Second-Generation shRNA Libraries Covering theMouse and Human Genomes,NATURE GENETICS,37:11,1281-88(2005)和Westbrook,T.F.,等,A Genetic Screen for Candidate Tumor Suppressors Identifies REST,CELL,121:837-48(2005)中描述。其他独特标识性核苷酸序列可以包括，例如，半发夹标签和全长发夹标签，诸如在Boettcher,M.和Hoheisel,J.D.,Pooled RNAi Screens-Technical andBiological Aspects,CURRGENOMICS,11(3):162-67(2010)中描述的那些。通过使用PCR扩增随后与包含互补探针序列的DNA微阵列杂交，独特标识性核苷酸序列可以被用于鉴定特定shRNA的存在并且确定特定shRNA的相对频率。在本文公开的筛选方法中，在处理步骤后未被鉴定到的shRNA代表来自经怀疑的表观遗传化合物的处理(与该shRNA组合使用时)无法存活的细胞的shRNA。
在本公开内容的某些实施方案中，shRNA靶向特定癌基因并且抑制这些癌基因的表达。在某些实施方案中，shRNA靶向特定肿瘤抑制基因并且增加这些肿瘤抑制基因的表达。如本文公开的，在某些实施方案中，当癌细胞暴露于表观遗传化合物和靶向特定基因的shRNA时，癌细胞无法存活。因此，直接或间接降低或增加被这样的shRNA靶向的特定基因的表达(或者通过降低或增加多肽的表达来改变由基因编码的多肽的表达)的剂可以被选择作为具有表观遗传化合物的组合疗法的ISLET靶。
在本文公开的筛选方法的某些实施方案中，剂的文库可以包括代替shRNA文库的本领域普通技术人员已知的siRNA文库、CRISPR-Cas9sgRNA文库、插入诱变文库或其他小分子和/或核酸抑制剂分子文库。例如，在某些实施方案中，可以使用CRISPR系统。通常，CRISPR系统包括Cas9内切核酸酶、CRISPRRNA(crRNA)和反式活化RNA(tracrRNA)，并且可以被用于产生经转导的细胞文库以便汇集的敲除筛选。crRNA和tracrRNA可以组合成单一指导RNA(“sgRNA”)。CRISPR代表成簇的规律间隔的短回文重复(Clustered RegularlyInterspaced Short Palindromic Repeats)并且是一种用于基因组工程化的系统，该系统可以被用于产生基因敲除池。crRNA包含可以被用作靶向序列的约20个核苷酸的核苷酸序列以及与tracrRNA杂交的其他核酸。该靶向序列可以被改变以抑制或活化特定基因以产生定制的敲除池。tracrRNA与crRNA杂交并且与Cas9内切核酸酶结合，使该复合物活化以在靶序列内的特定位点处产生双链断裂，随后在裂解后修复双链断裂。Shalem等,Genome-ScaleCRISPR-Cas9 Knockout Screening in Human Cells,SCIENCE,343；6166,84-87(2014)。以这种方式，可以产生特定基因敲除池。
本文还公开了用于治疗癌症的方法，所述方法包括向需要治疗的受试者施用有效量的至少一种表观遗传化合物(诸如DNA甲基转移酶抑制剂或MBD蛋白抑制剂)和有效量的至少一种化学治疗剂。在某些实施方案中，至少一种化学治疗剂选自RAR激动剂、激酶抑制剂诸如极光激酶A抑制剂、G蛋白偶联受体抑制剂、鸟嘌呤核苷酸交换因子抑制剂、磷酸酶抑制剂、磺基转移酶抑制剂、乙酰转移酶抑制剂、多巴色素互变异构酶抑制剂、岩藻糖基转移酶抑制剂、类固醇激素生物合成抑制剂、细胞因子抑制剂、磷酸二酯酶抑制剂、JAK/Stat抑制剂、微管剂、核苷类似物和抗生素。在某些实施方案中，至少一种表观遗传化合物和至少一种化学治疗剂靶向选自缺氧途径、顶端连接途径(apical junction pathways)、DNA修复途径、补体途径、糖酵解途径、凝血途径、脂肪酸代谢途径、同种异体移植物排斥途径、炎性应答途径、MTORC1信号传导途径、氧化磷酸化途径和过氧化物酶体途径的至少一种途径。
在某些实施方案中，DNA甲基转移酶抑制剂是地西他滨，并且在某些实施方案中，极光激酶A抑制剂是alisertib。在本文公开的其他实施方案中，MBD蛋白抑制剂是KCC-08，并且在某些实施方案中，RAR激动剂是异维甲酸。在某些方面中，癌症选自前列腺癌、卵巢癌、肺癌、结肠癌、中枢神经系统癌和乳腺癌。
如本文使用的，动物中的“癌症”是指具有致癌细胞的典型特征的细胞的存在，致癌细胞的典型特征例如，不受控制的增殖、专有功能(specialized function)的丢失、永生性、明显的转移潜能、抗凋亡活性的显著增加、快速生长和增殖速率以及某些特征性形态学和细胞标志物。在一些情况中，癌细胞将呈肿瘤的形式；这样的细胞可以局部地存在于动物内，或者作为独立的细胞例如白血病细胞在血流中循环。癌症可以包括但不限于肺癌、乳腺癌、前列腺癌、中枢神经系统癌、结肠直肠癌、食道癌、胃癌、白血病/淋巴瘤、子宫癌、皮肤癌、内分泌癌、泌尿癌、胰腺癌、胃肠癌、卵巢癌、宫颈癌和腺瘤。在某些实施方案中，癌症选自前列腺癌、卵巢癌、肺癌、结肠直肠癌和乳腺癌。
本文使用的术语“有效量”是指足以治疗指定的紊乱、状况或疾病，诸如改善、缓和、减轻和/或延迟其一种或更多种症状的化合物或组合物的量。在提及癌症或其他不期望的细胞增殖时，有效量包括足以导致肿瘤缩小和/或减小肿瘤的生长速率(诸如抑制肿瘤生长)或者预防或延迟其他不期望的细胞增殖的量。在一些变化形式中，有效量是足以预防或延迟发病和/或复发的量。有效量可以以一次或更多次施用被施用。在癌症的情况中，有效量的化合物或组合物可以：(i)降低癌细胞的数目；(ii)减少肿瘤尺寸；(iii)在一定程度上抑制、延缓、减缓并且在一些实施方案中停止癌细胞向周围器官的浸润；(iv)抑制(即，在一定程度上减缓并且在一些实施方案中停止)肿瘤转移；(v)抑制肿瘤生长；(vi)预防或延迟肿瘤的发生和/或复发；和/或(vii)在一定程度上减轻一种或更多种与癌症相关的症状。
在某些实施方案中，表观遗传化合物是组蛋白脱乙酰酶抑制剂或组蛋白甲基转移酶抑制剂。组蛋白脱乙酰酶抑制剂抑制组蛋白脱乙酰酶，组蛋白脱乙酰酶是负责去除组蛋白上的乙酰基基团，允许DNA更紧密地缠绕在组蛋白周围的酶。组蛋白脱乙酰酶抑制剂导致组蛋白的超乙酰化，从而影响基因表达。示例性组蛋白脱乙酰酶包括作用于I类、II类、III类和IV类组蛋白脱乙酰酶的那些，诸如羟肟酸类(hydroxymates)、环状四肽、缩肽、苯甲酰胺、酮和脂肪族酸化合物诸如苯丁酸盐和丙戊酸。可被提及的组蛋白脱乙酰酶抑制剂包括，例如，罗咪酯肽(romidepsin)
Figure BDA0002383848710000171
伏立诺他(vorinostat)和etinostat(SNDX-275、MS-275)。同样地，组蛋白甲基转移酶抑制剂也影响基因表达。通过抑制组蛋白在例如组蛋白的赖氨酸或精氨酸甲基化位点处的甲基化，组蛋白甲基转移酶抑制剂起作用以使基因表达沉默，或在一些情况中活化基因表达。示例性组蛋白甲基转移酶抑制剂包括pinometostat(EPZ5676)、EPZ005687、GSK343、BIX01294、tazemetostat(EPZ-6438)、MI-503、MI-463、EPZ020411、MS049、UNC3866、CPI-1205、A-366、MI-136、GSK591、HLCL061盐酸盐、UNC1999、MM-102、SGC0946、UNC0379、EPZ015666(GSK3235025)、PFI-2、UNC0631、SGC707、MS023、MI-3(Menin-MLL抑制剂)、BRD4770、MI-2(Menin-MLL抑制剂)、EI1、GSK503、EPZ004777、GSK126、CPI-360、CPI-169、AMI-1和OICR-9429。
在某些实施方案中，组蛋白脱乙酰酶抑制剂是靶向编码组蛋白脱乙酰酶的基因的核酸抑制剂分子。在某些实施方案中，组蛋白甲基转移酶抑制剂是靶向编码组蛋白甲基转移酶的基因的核酸抑制剂分子。核酸抑制剂分子包括但不限于反义寡核苷酸或RNA干扰分子，诸如微小RNA、短干扰RNA或piwi-相互作用RNA。
在某些实施方案中，表观遗传化合物是MBD蛋白抑制剂。如本文使用的，MBD蛋白抑制剂是可以抑制甲基-CpG结合蛋白的结合的化合物。在一些实施方案中，MBD蛋白抑制剂是MBD2蛋白抑制剂。在特定实施方案中，MBD2蛋白抑制剂可以选自化合物KCC-08、KCC-03和KCC-07。KCC-08由下式(I)表示：
Figure BDA0002383848710000181
KCC-03由下式(II)表示，并且KCC-07由下式(III)表示：
Figure BDA0002383848710000182
Figure BDA0002383848710000191
另一种示例性表观遗传化合物是DNA脱甲基化剂。如本文使用的，DNA脱甲基化剂是可以抑制DNA的甲基化的化合物。在一些实施方案中，DNA脱甲基化剂是DNA甲基转移酶抑制剂。DNA甲基转移酶抑制剂是抑制催化甲基基团转移到DNA的酶的化合物。在特定的实施方案中，DNA甲基转移酶抑制剂可以选自5-阿扎胞苷(5-azacitidine)(氮杂胞苷(azacytidine)，4-氨基-1-β-D-呋喃核糖基-s-三嗪-2(1H)-酮，
Figure BDA0002383848710000192
)、地西他滨(5-氮杂-2’-脱氧胞苷，
Figure BDA0002383848710000193
)、SGI-110(2’-脱氧-5-氮杂胞苷基-(3’-5’)-脱氧鸟苷)、RG108(N-邻苯二甲酰-L-色氨酸)、DZNep(SGI-1036，3-deazaneplanocin A)、Zebularine(嘧啶-2-酮β-呋喃核糖苷)、双硫仑(disulfiram)(DNMT1抑制剂)、普鲁卡因酰胺(procainamide)和ASTX-727。
在某些实施方案中，DNA甲基转移酶抑制剂是靶向编码DNA甲基转移酶的基因的核酸抑制剂分子。该核酸抑制剂分子包括但不限于反义寡核苷酸或RNA干扰分子，诸如微小RNA、短干扰RNA或piwi-相互作用RNA。
本文还公开了可以与表观遗传化合物组合使用的化学治疗剂。在某些实施方案中，该化学治疗剂以协同抑制癌细胞的生长的量与表观遗传化合物一起使用。可以使用任何已知的化学治疗剂。在某些实施方案中，化学治疗剂是核酸抑制剂分子，诸如反义寡核苷酸或RNA干扰分子，诸如微小RNA、短干扰RNA或piwi-相互作用RNA。
如本文使用的，RAR激动剂是可以增强靶基因表达的示例性化学治疗剂。视黄酸受体可以与辅阻遏物蛋白结合以抑制基因表达；RAR激动剂导致辅阻遏物蛋白的解离，并且进而促进共活化物蛋白的结合和募集，导致靶基因的下游表达。在特定实施方案中，RAR激动剂可以选自例如异维甲酸、阿利特维甲酸(alitretinoin)、维甲酸、蓓萨罗丁(bexarotene)、他扎罗汀(tazarotene)、MDI 301、R667、9-顺式UAB30、阿达帕林(Adapalene)、AC261066、AC 55649、AM 580、AM 80、BMS 753、CD 1530、CD 2314、CD 437、Ch55、TTNPB、BMS 453、EC 19、EC 23和芬维A胺(fenretinide)。
如本文使用的，极光激酶抑制剂是可以抑制细胞通过有丝分裂进展的另一种示例性化学治疗性化合物。已知极光激酶在细胞有丝分裂中起关键作用，包括调控以下功能，诸如中心体成熟、染色体列队、染色体分离和胞质分裂。人类细胞包含极光激酶家族的酶，其包括极光激酶A、极光激酶B和极光激酶C，每一种在有丝分裂过程期间起不同作用。例如，已经发现极光激酶A可以在某些类型的癌症中过表达。因此，极光激酶A抑制剂的研究因其潜在的化学治疗性质是研究人员感兴趣的。在特定实施方案中，本文公开的极光激酶A抑制剂可以选自alisertib(MLN8237)、AMG-900、barasertib、CYC116、danusertib(PHA-739358)、MLN8054、VX-680(MK-0457、tozasertib)和TAS-119。
在某些实施方案中，化学治疗剂是因为其抑制与癌症相关的基因或被认为与癌症相关的基因而被选择的化合物。在本文公开的某些实施方案中，化学治疗剂是抑制以下基因中的至少一种的化合物：PLAS2G12A、EIF4A2、GNAZ、DCT、SULT1C4、HLX、ITK、AURKA、CHST3、MAP2K2、AADAT、CRAT、SULT4A1、PDE4D、THY1、PDE1B、BDH2、QPRT、STAT5A、PHF21A、MEF2C、IL17D、SEL1L、COMT、GLRX、AKR1C4、GNA12、B4GALT1、LEF1、XYLT1、GNAQ、GCA、AGXT2、DPM2、OGDHL、UGT2B10、PDE5A、GPSM1、LIG3、PDE4B、LCMT1、DHX58、GBGT1、DUSP9、DCI、B4GALT2、MTR、NT5C2、HSD3B2、ARL4D、GPT2、OAT、RFXAP、PDE11A、BCR、GNA11、PDE4C、DHRS3、FOXN1、PDE6G、G6PC2、RPIA、IDI1、ACSS1、FHIT、UGT1A3、FARS2、A4GALT、GATM、CHST1、AGPAT4、NT5M、MVK、UGT2B17、ARHGEF1、NEURL、QPCT、GNAI3、ATIC、PLA2G12A、DARS、AKRIC1、B4GALT5、FUT5、COX10、AKAP13、AGXT、GNMT、HOXB4、CAND1、CLC、TFAP2A、HMGN1、RAD9A、GNB3、ECGF1、ARPC3、ACVR1B、CKS1B、SLC1A2、UROS、CHST4、NT5E、PIGL、CIGALT1、PDE1A、ACP6、NOS1、RECQL4、NOS3、RNF2、LSS、ANP32A、RAG2、BCL2L2、CPE、CAPN9、PRKAR2A、EP300、FGFR2、ISYNA1、ARF3、IPMK、BCL11B、HMGCS1、GALNT14、GALNS、FAH、AK3L1、SULT1C2、GLP1R、AGPAT2和FOXP1。
在一些实施方案中，表观遗传化合物或化学治疗剂可以是无活性的直到在受试者体内转化为活性形式。例如，地西他滨的无活性形式诸如SGI-110
Figure BDA0002383848710000211
在本公开内容的范围内，因为它们可以在体内转化为地西他滨。
在一些实施方案中，甲基化-DNA结合蛋白抑制剂是KCC-08，并且在24小时时间段内以单次施用被施用的剂量可以小于约25mg/kg，诸如小于约20mg/kg、小于约10mg/kg、小于约5mg/kg、或小于约2mg/kg、或约1mg/kg。在某些实施方案中，KCC-08可以在连续多天的过程中被施用，诸如例如一天施用一次持续2天-7天、诸如一天施用一次持续5天。KCC-08还可以在多个周期(例如，2个、3个、4个或多于4个周期)中被施用，通常每一个周期之间为0-6周，诸如例如，在3周的周期内或在4周的周期内每5天施用。在某些实施方案中，KCC-08可以在4周的周期期间每5天以约1mg/kg/天的量被施用。
在一些实施方案中，DNA甲基转移酶抑制剂是地西他滨，并且在24小时时间段内以单次施用被施用的剂量可以小于约25mg/m2，诸如小于约20mg/m2、小于约10mg/m2、小于约5mg/m2、或小于约3.5mg/m2。在某些实施方案中，当地西他滨在24小时时间段内被施用多于一次时，在24小时时间段内施用的剂量可以小于150mg/m2，诸如小于约125mg/m2、小于约100mg/m2、小于约40mg/m2、小于约35mg/m2、小于约30mg/m2、小于约25mg/m2、小于约20mg/m2或小于约15mg/m2。在某些实施方案中，地西他滨可以在连续多天的过程中被施用，诸如例如一天施用一次持续2天-7天、诸如一天施用一次持续5天。地西他滨还可以在多个周期(例如，2个、3个、4个或多于4个周期)中被施用，通常每一个周期之间为4-6周，诸如例如，在4周的周期内每5天施用。在某些实施方案中，在4周的周期期间，地西他滨可以每5天以约20mg/m2的量被施用。在某些实施方案中，在4周的周期期间，地西他滨可以每5天以约5mg/m2或更少的量被施用，并且在某些其他实施方案中，在4周的周期期间，地西他滨可以每5天以约3.5mg/m2或更少的量被施用。在其他实施方案中，剂量浓度可以在从约1nM至约500nM的范围内，诸如约10nM至约250nM、或约100nM。
在一些实施方案中，RAR激动剂是异维甲酸，并且剂量浓度可以在从每剂量约5mg/kg至约150mg/kg的范围内，诸如每剂量约90mg/kg、60mg/kg、约30mg/kg、约15mg/kg和10mg/kg。在某些实施方案中，RAR激动剂可以每天施用一次或两次，诸如例如，每天施用两次15mg/kg或每天施用一次约30mg/kg。在某些实施方案中，剂量可以小于每剂量约60mg/kg。在某些实施方案中，当RAR激动剂在一个周期中被施用时，在整个周期期间施用的剂量可以在从约30mg/kg至约300mg/kg的范围内，诸如约90mg/kg至约250mg/kg、或约150mg/kg。在某些实施方案中，在整个周期期间施用的剂量可以小于约200mg/kg。
在一些实施方案中，极光激酶A抑制剂是alisertib，并且剂量浓度可以在从约5nM至约150nM的范围内，诸如约10nM、约50nM或约100nM。在某些实施方案中，剂量浓度可以在从约10mg/kg至约30mg/kg的范围内，诸如约15mg/kg或约25mg/kg。在某些实施方案中，施用的剂量可以在从每剂量约25mg至约75mg的范围内，诸如每剂量约10mg、30mg、约35mg、约40mg和50mg。在某些实施方案中，极光激酶A抑制剂可以每天施用一次或两次，诸如例如，每天施用两次30mg或每天施用两次50mg。在某些实施方案中，剂量可以小于每剂量约50mg。在某些实施方案中，当极光激酶A抑制剂在一个周期中被施用时，在整个周期期间施用的剂量可以在从约70mg至约1050mg的范围内，诸如在约350mg至约700mg、约1050mg或约700mg的范围内。在某些实施方案中，在整个周期期间施用的剂量可以小于约700mg。
在某些实施方案中，至少一种表观遗传化合物，诸如DNA脱甲基化剂或甲基化-DNA结合蛋白抑制剂，可以与至少一种化学治疗剂诸如极光激酶A抑制剂或RAR激动剂依次施用，并且在某些实施方案中，它可以与该至少一种化学治疗剂同时施用。如本文使用的，术语“依次施用”意指至少一种表观遗传化合物和至少一种化学治疗剂以多于约一天的时间间隔被施用。在某些实施方案中，当至少一种表观遗传剂被依次施用时，它可以在施用至少一种化学治疗剂之前或之后被施用，并且在某些实施方案中，施用可以重叠使得它是依次的和同时的(例如，首先施用至少一种表观遗传化合物持续一定时间段，随后单独施用至少一种化学治疗剂，随后同时施用至少一种表观遗传化合物和至少一种化学治疗剂二者)。在一些实施方案中，至少一种表观遗传化合物可以被施用持续数天的时间段，诸如约1天至约12天，或持续数周的时间段，诸如约1周至约10周，或者可以在一个周期中诸如在28天的周期中约每5天至约每7天被施用。
如本文使用的，术语“同时施用”意指化合物以不多于约1天，诸如不多于约12小时、不多于约6小时或不多于约1小时的时间间隔被施用。在同时施用的某些实施方案中，化合物以不多于约15分钟，诸如不多于约10分钟、不多于约5分钟或不多于约1分钟的时间间隔被施用。当化合物被同时施用时，它们可以被包含在同一组合物(例如，包含表观遗传化合物和化学治疗剂二者的药物组合物)中，或分开的组合物中(例如，至少一种表观遗传化合物被包含在一种组合物中，并且至少一种化学治疗剂被包含在另一种组合物中)。
在本文公开的某些实施方案中，至少一种表观遗传化合物和至少一种化学治疗剂的施用是同时的，即至少一种表观遗传化合物和至少一种化学治疗剂的施用时间段彼此重叠。在一些实施方案中，至少一种表观遗传化合物和至少一种化学治疗剂的施用是非同时的。例如，在一些实施方案中，至少一种表观遗传化合物的施用在施用至少一种化学治疗剂前终止。在一些实施方案中，至少一种化学治疗剂的施用在施用至少一种表观遗传化合物前终止。在某些实施方案中，这两次非同时施用之间的时间段可以在从约一天至约八周的范围内，诸如约两周或约四周。
根据本文公开的方法，治疗可以导致癌症的完全消除或治愈、或癌症的一种或更多种症状的部分改善，并且可以是暂时的或永久的。在某些实施方案中，在本文公开的方法中，施用有效量的至少一种表观遗传化合物和有效量的至少一种化学治疗剂，诸如地西他滨和极光激酶A抑制剂或者MBD蛋白抑制剂和RAR激动剂，可以导致受试者中的癌症减少至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％以及受试者中癌症的100％减少。
在一些实施方案中，至少一种表观遗传化合物(诸如DNA甲基转移酶抑制剂或MBD蛋白抑制剂)和至少一种化学治疗剂(诸如极光激酶A抑制剂或RAR激动剂)的效果是协同的。如本文使用的，术语“协同作用(synergy)”、“协同地(synergistically)”及其派生词指示至少一种表观遗传化合物和至少一种化学治疗剂的组合的生物活性大于相应的剂单独施用时的生物活性的总和。协同作用可以发生在同时施用相应的剂时，或如果一种剂在另一种之前施用时。在一些实施方案中，至少一种表观遗传化合物和至少一种化学治疗剂当分开地向患者施用时具有最小的肿瘤生长抑制活性；然而，相同剂量的至少一种表观遗传化合物和至少一种化学治疗剂当组合地向患者施用时可以具有高的肿瘤生长抑制活性。至少一种表观遗传化合物和至少一种化学治疗剂的这种协同作用是出乎意料且意想不到的。
协同作用可以通过多种方法包括例如Bliss协同作用方法来测量。参见Bliss,C.I.,The Toxicity of Poisons Applied Jointly,ANN.APPL.BIO.26:3 585-615(1939)。Bliss值可以被定义为实验响应和计算的Bliss独立性值之间的差。Bliss值指示两种化合物组合时的效果仅仅是加和性的还是协同的。Bliss值为零被认为是加和性的，其中术语“加和性的(additive)”意指两种化合物的组合的结果是单独的每一种化合物的总和，并且这些化合物不被认为是协同的。负的Bliss值指示拮抗作用，其中一种化合物起抑制另一种化合物的效果的作用。正的Bliss值指示协同作用，其中两种化合物的组合的效果大于它们的总和。正的Bliss值越高，两种化合物的协同作用越大。
在本文公开的某些实施方案中，至少一种表观遗传化合物和至少一种化学治疗剂对癌细胞具有的Bliss协同作用值大于约0，诸如大于约0.1、大于约0.25、大于约0.4、大于约0.5或大于约0.7。
在本文公开的一种实施方案中，至少一种表观遗传化合物(诸如DNA甲基转移酶抑制剂，诸如地西他滨)和至少一种化学治疗剂(诸如极光激酶A抑制剂，诸如alisertib)的协同作用使得所施用的实现治疗有效量的表观遗传化合物和/或化学治疗剂的剂量可以低于单独施用每一种剂时通常所需要的剂量。在某些实施方案中，MBD蛋白抑制剂诸如KCC-08和至少一种化学治疗剂(诸如RAR激动剂，诸如异维甲酸)的协同作用使得所施用的实现治疗有效量的MBD蛋白抑制剂和/或化学治疗剂的剂量可以低于单独施用每一种剂时通常所需要的剂量。因此，在一些实施方案中，可以施用亚治疗量的至少一种表观遗传化合物和/或至少一种化学治疗剂。“亚治疗量”或“亚治疗水平”是指小于治疗量的量，其小于出于化学治疗或表观遗传学的目的单独施用化合物时通常使用的量。该降低可以根据降低的施用量和/或降低的施用频率来反映。
向患者施用治疗方案可以通过任何合适的施用途径发生，所述任何合适的施用途径包括，例如，口服、经鼻、经粘膜、眼、直肠、阴道内、肠胃外(包括肌肉内、皮下、髓内注射以及鞘内、直接心室内、静脉内、关节内、胸骨内、滑膜内、肝内、病灶内、颅内、腹膜内、鼻内或眼内注射)、脑池内、局部地，如通过粉末、软膏或滴剂(包括眼滴剂)，包括含服和舌下、透皮，通过吸入喷雾剂、或本领域中已知的其他递送模式。
本文还公开了用于治疗癌症的药学上可接受的组合物，所述组合物包含有效量的至少一种表观遗传化合物(诸如DNA甲基转移酶抑制剂或MBD蛋白抑制剂)和有效量的至少一种化学治疗剂(诸如极光激酶A抑制剂或RAR激动剂)，其中至少一种表观遗传化合物和至少一种化学治疗性化合物协同地抑制癌细胞的生长。包含本文公开的组合的药学上可接受的组合物可以与任何药学上可接受的载体诸如无毒性药物有机载体或无机载体混合，以提供药学上可接受的组合物。典型的药学上可接受的载体包括，例如，甘露醇、尿素、右旋糖、乳糖、马铃薯淀粉、玉米淀粉、硬脂酸镁、滑石、植物油、聚亚烷基二醇、乙基纤维素、聚(乙烯吡咯烷酮)、碳酸钙、油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯、苯甲酸苄酯、碳酸钠、明胶、碳酸钾、硅酸和其他常规使用的可接受的载体。药物剂型还可以包含无毒性辅助物质，诸如乳化剂、防腐剂、润湿剂等。
本文还公开了用于治疗癌症的试剂盒，其中试剂盒包含有效量的至少一种表观遗传化合物(诸如DNA甲基转移酶抑制剂或MBD蛋白抑制剂)和有效量的至少一种化学治疗剂(诸如极光激酶A抑制剂或RAR激动剂)，并且其中至少一种表观遗传剂和至少一种化学治疗剂协同地抑制癌细胞的生长。在某些实施方案中，试剂盒中的至少一种表观遗传化合物可以是地西他滨，并且在某些实施方案中，试剂盒中的至少一种化学治疗剂可以是alisertib。在某些实施方案中，试剂盒中的至少一种表观遗传化合物可以是KCC-08，并且在某些实施方案中，试剂盒中的至少一种化学治疗剂可以是异维甲酸。在另外的实施方案中，试剂盒可以包括用于施用或配制化合物的说明书。
至少一种表观遗传化合物和至少一种化学治疗剂的给药频率可以基于施用人员的判断在治疗的过程中调整。当单独施用时，至少一种表观遗传化合物和至少一种化学治疗剂可以以不同的频率和/或间隔施用。至少一种表观遗传化合物和至少一种化学治疗剂可以使用相同的施用途径或不同的施用途径来施用。
在某些实施方案中，本文公开了至少一种表观遗传化合物和至少一种化学治疗剂的组合，其中该组合有效地协同抑制癌细胞生长，不协同地抑制非癌细胞生长，使得对非癌细胞的效果仅是加和性的或低于加和性的。在某些实施方案中，非癌细胞为原代肝细胞。在本公开内容的某些实施方案中，DNA甲基转移酶抑制剂诸如地西他滨和极光激酶A抑制剂诸如alisertib的组合不协同地抑制非癌细胞生长，使得对非癌细胞的效果仅是加和性的或低于加和性的，并且在某些实施方案中，MBD蛋白抑制剂诸如KCC-08和RAR激动剂诸如异维甲酸的组合不协同地抑制非癌细胞生长，使得对非癌细胞的效果仅是加和性的或低于加和性的。在本文公开的某些实施方案中，至少一种表观遗传化合物和至少一种化学治疗剂对非癌细胞具有的Bliss协同作用值为0或小于约0，诸如约-0.05或约-0.10。
在本文公开的某些实施方案中，至少一种表观遗传化合物，诸如DNA甲基转移酶抑制剂或MBD蛋白抑制剂，是可遗传的，使得即使在去除初始表观遗传化合物后它诱导的表观遗传记忆持续存在并且对至少一种靶向剂诸如极光激酶A抑制剂或RAR激动剂敏感。这允许依次治疗的可能性，其可以进一步使不期望的毒性最小化。因此，在另一种实施方案中，本文公开了一种用于使细胞对化学治疗剂(诸如极光激酶A抑制剂或RAR激动剂)敏感的方法，该方法包括使细胞与有效量的低剂量的表观遗传化合物接触，之后使细胞与有效量的化学治疗剂接触。在某些实施方案中，低剂量的表观遗传化合物可以是约100nM的DNA甲基转移酶抑制剂，诸如地西他滨。在某些实施方案中，低剂量的表观遗传化合物可以是约1mg/kg/天的MBD蛋白抑制剂，诸如KCC-08。在某些实施方案中，使细胞敏感的化学治疗剂是极光激酶A抑制剂诸如alisertib，并且在某些实施方案中，使细胞敏感的化学治疗剂是RAR激动剂诸如异维甲酸。
实施例
实施例1-极光激酶A的鉴定
对DU145前列腺癌细胞的样品进行汇集的慢病毒shRNA负向功能筛选方案(negative functional screen)，该筛选方案从先前在Schlabach M.R.等,CancerProliferation Gene Discovery through Functional Genomics,SCIENCE,319,5863:620-4(2008)中描述的程序修改得到。先将DU145前列腺癌细胞用汇集的慢病毒shRNA处理，导致RNA文库的转导。然后用仅对选择性数目的经转导的细胞(即，shRNA“脱出(dropout)”或“击中(hit)”)致死的地西他滨处理慢病毒转导的DU145细胞。因此，鉴定出相对于对照处理的细胞，当敲低时在用DNA甲基转移酶抑制剂(DNMTi)地西他滨处理时在DU145细胞中是选择性致死的靶。
将多个烧瓶的DU145细胞用来自
Figure BDA0002383848710000271
(the Decipher Collection)的基因组规模的汇集的慢病毒shRNA文库转导。池中的每一种慢病毒编码27,000种shRNA构建体、shRNA特异性条形码、嘌呤霉素抗性基因和追踪转导水平的荧光标志物基因中的每一种。5,000种人类基因中的每一种被池中的5至6个shRNA的编码慢病毒靶向，并且以低的感染复数(multiplicity of infection)(MOI为约0.3)进行转导，以便确保大多数经转导的细胞将仅接受单个慢病毒颗粒。对足够的病毒和细胞进行转导，使得在这种低MOI下，每一种shRNA将在群体中呈现约100倍至1000倍。
然后用地西他滨(100nM或500nM)或媒介物对照(全部以2个至3个重复实验进行)处理经转导的细胞的文库，持续4天或7天。在处理后，收获细胞，分离DNA，并且使用50μg的基因组DNA扩增存活细胞中的shRNA特异性条形码。然后通过下一代测序鉴定这些条形码，并且与群体中的个体shRNA对应的每一种条形码的数目被用作该shRNA在媒介物和地西他滨处理的细胞中的呈现的量度。“击中”被鉴定为与媒介物处理的细胞群体相比，在地西他滨处理的细胞群体中“脱出”的那些shRNA。相反，与媒介物处理的细胞群体相比，在地西他滨处理的细胞群体中被富集的shRNA被认为提供对地西他滨处理的耐受性。图1A示出了地西他滨处理的细胞群体对比对照细胞群体中的所有显著改变的shRNA条形码的瀑布图，其中在x-轴上落在0.0之下的柱指示对地西他滨敏感的shRNA，并且在x-轴上落在0.0之上的柱指示提供对地西他滨的耐受性的shRNA。
在高敏感击中中，具有log2(DAC/媒介物)值为-1.13的靶向极光激酶A(AURKA)基因的shRNA是针对其的药物(pharmacological agent)已经在临床开发下的高击中。图1B示出了与地西他滨组合的作为用表观遗传疗法诱导合成致死性(ISLET)的靶的AURKA的独立验证。与单独的AURKA shRNA或单独的地西他滨相比，与100nM地西他滨组合的五种不同的靶向AURKA的shRNA各自导致DU145癌细胞生存力显著降低。因此，AURKA被选择作为针对快速翻译的ISLET靶。如图1B中示出的，对于媒介物对照与地西他滨、但没有AURKA的DU145细胞的总体生存力明显比包含具有靶向AURKA的shRNA以及地西他滨的DU145的五个样品中的任何一个更高。
实施例2-DNMTi和AURKA对癌细胞的协同生长抑制作用
测试了极光激酶的药理学抑制剂与地西他滨的组合。AURKA选择性(例如，alisertib和MLN8054)和非选择性(例如，AMG-900)极光激酶抑制剂二者显示出对DU-145细胞的协同生长抑制，并且在临床开发中最深入的alisertib被选择用于另外的研究。alisertib和地西他滨在体外在大量的癌细胞系中显示出细胞生存力、细胞生长和克隆存活测定方面的显著协同作用。
除了用不同浓度的地西他滨(0nM、50nM、100nM和250nM)之外，用不同浓度(0nM、10nM、50nM和100nM)的alisertib处理DU145前列腺癌细胞和A549肺癌细胞。代表性数据在图2A和图2B以及下文的表中示出。下表1示出了不同量的alisertib以及不同量的地西他滨对DU145前列腺癌细胞的生长抑制百分比。如表1中示出的，100nM的alisertib和250nM的地西他滨呈现出最大的生长抑制百分比(0.93)。
表1-对DU145前列腺癌细胞的生长抑制百分比
Figure BDA0002383848710000291
下表2示出了不同量的alisertib以及不同量的地西他滨在DU145前列腺癌细胞中的Bliss协同作用值。如表2中示出的，在100nM的alisertib与100nM的地西他滨组合的情况下，观察到最高的Bliss协同作用值(0.72)。在每一个组中，在Alamar blue细胞生存力测定中使用了单独的或组合的每一种药物的剂量响应。
表2-对DU145前列腺癌细胞的Bliss协同作用值
Figure BDA0002383848710000292
同样地，表3示出了不同量的alisertib以及不同量的地西他滨在A549肺癌细胞中的生长抑制百分比并且表4示出了Bliss协同作用值。如表4中示出的，在100nM的alisertib与250nM的地西他滨组合的情况下，观察到最高的Bliss协同作用值(0.68)。
表3–对A549肺癌细胞的生长抑制百分比
Figure BDA0002383848710000301
表4–对A549肺癌细胞的Bliss协同作用值
Figure BDA0002383848710000302
尽管在测试的剂量，单独的每一种药物对DU-145和A549癌细胞系的细胞生存力具有最小影响，但组合的两种药物显示出细胞生存力的显著降低。正式协同作用分析(formalsynergy analyse)使用Bliss独立性评分进行(其中大于零的值指示大于加和性作用)。
对于显示出最大协同作用的每一种剂的剂量(即，对于DU145 100nM alisertib和100nM地西他滨，以及对于A549 100nM alisertib和250nM地西他滨)，还在图2A和图2B的图中示出了生长曲线。图2A的图是DU145前列腺癌细胞对于单独的剂(单独的地西他滨和alisertib)、媒介物对照和组合的剂(地西他滨以及alisertib)的生长曲线。如图2A中示出的，地西他滨以及alisertib的组合协同地起作用以抑制DU145细胞的细胞生长。同样地，图2B的图是A549肺癌细胞对于单独的剂(单独的地西他滨和alisertib)、媒介物对照和组合的剂(地西他滨以及alisertib)的生长曲线。如图2B中示出的，地西他滨以及alisertib的组合协同地起作用以抑制A549肺癌细胞的细胞生长。
有趣地，尽管地西他滨和alisertib的组合显示出对于多种癌细胞系的生长抑制的显著协同作用，但该组合未显著地改变原代肝细胞的生长，正式协同作用分析显示出低于加和性作用。如下表5中示出的，单独起作用的alisertib和地西他滨都具有对原代肝细胞的一定程度的生长抑制。因此，人们将至少预期加和性作用；然而，如下表6中示出的，正式协同作用分析指示地西他滨和alisertib对肝细胞的组合作用具有低于加和性的作用(即，负的Bliss协同作用值)。
表5-对原代肝细胞的生长抑制百分比
Figure BDA0002383848710000311
表6-对原代肝细胞的Bliss协同作用值
Figure BDA0002383848710000312
图2C的图是肝细胞对于单独的剂(单独的地西他滨和alisertib)、媒介物对照和组合的剂(地西他滨以及alisertib)的生长曲线。如图2C中示出的，地西他滨以及alisertib一起的组合随时间变化未显著地影响细胞生长。
在一系列18种癌细胞系(9种前列腺癌细胞系、1种卵巢癌细胞系、1种肺癌细胞系、2种结肠癌细胞系、2种中枢神经系统癌细胞系和3种乳腺癌细胞系)和2种非癌细胞模型中评价了地西他滨和alisertib的组合的协同作用分析。基于来自0nM、10nM、50nM和100nM的alisertib以及0nM、50nM、100nM和250nM的地西他滨的16种组合的每一种的协同作用值的总和计算最终累积Bliss协同作用评分。如图3中示出的并且如下表7中列出的，被评价的大多数癌细胞系被地西他滨和alisertib的组合协同地抑制，累积Bliss协同作用评分大于0.5(即，跨越所有测试的剂量组合的Bliss协同作用的总和)。
表7-对癌细胞系的累积Bliss协同作用评分
细胞系 器官 Bliss协同作用评分
HEK293T 正常 0.205527622
HEPS 正常 -0.736108968
E006 前列腺 2.826403774
PC3 前列腺 2.431564737
DU145 前列腺 2.350314854
C42B 前列腺 1.264130879
LAPC4 前列腺 0.932239125
CWR 前列腺 0.843192034
VCaP 前列腺 0.395932069
LNCaP-ABL 前列腺 0.298191692
LNCaP 前列腺 -1.207701763
SKOV3 卵巢 2.280471702
A549 肺 2.498945516
HCT116 结肠 1.822309858
DLD1 结肠 1.365102134
SNB19 CNS 3.383951368
SF539 CNS 2.3571
MCF7 乳腺 2.235554779
MDA-MB-231 乳腺 1.240749909
T47D 乳腺 -1.781394458
两种非癌细胞模型(肝细胞和HEK293T细胞)未被该组合协同地抑制。尽管地西他滨和alisertib的组合在LNCaP细胞和T47D细胞中是拮抗的，但仍在进行对这种拮抗作用的机制剖析。尽管如此，这些数据表明DNMTi和AURKAi的组合疗法可能在多种癌症类型中具有广泛的治疗益处。另外，单独的剂跨越测试的剂量在癌细胞中的极低活性以及组合的高程度生长抑制与ISLET范式的预测一致。
实施例3-DNMTi和AURKAi的组合在体内显示出癌症生长抑制
使用DU145前列腺癌细胞系的体内异种移植物研究，探索了两种剂量水平的单独的alisertib或与地西他滨的组合在7周的时间段内(使用两种不同的治疗时间方案)的治疗效果。首先，用DU145细胞接种裸鼠，允许DU145细胞孵育10天-12天以建立异种移植物肿瘤。然后，将接种的小鼠在前两周中同时用高剂量的alisertib和地西他滨以及低剂量的alisertib和地西他滨治疗，或者在第一个周期中用单独的地西他滨起始两周随后是单独的alisertib。治疗时间方案和剂量水平在图4中示出。如图4中指示的，地西他滨的剂量保持恒定为0.75mg/kg，并且被给予低剂量(15mg/kg)或高剂量(25mg/kg)的alisertib。在两个方案的所有组合治疗组中，地西他滨和alisertib的累积给药次数是相同的。
这些研究的结果在图5A和图5B以及在下表8和表9中示出，指示肿瘤尺寸从初始肿瘤尺寸的倍数变化，即给定时间的肿瘤尺寸与初始肿瘤尺寸的比率。与媒介物对照相比，用测试的剂量的单独的地西他滨或alisertib的单剂疗法未显著改变异种移植物的组织生长或存活。
表8–肿瘤尺寸的倍数变化
Figure BDA0002383848710000331
表9–肿瘤尺寸的倍数变化
Figure BDA0002383848710000341
如图5A中示出的，对于用媒介物对照、单独的地西他滨、高剂量alisertib和低剂量alisertib接种的小鼠，肿瘤继续都以显著的速率生长。相反，对于接种地西他滨同时低剂量alisertib和高剂量alisertib的小鼠以及接种地西他滨起始之后施用低剂量alisertib和高剂量alisertib的小鼠，观察到很小的(如果有的话)显著肿瘤生长。
除了导致DU145异种移植物的显著增强的生长抑制之外，在两个alisertib剂量水平和时间方案下地西他滨和alisertib的组合还增强了裸鼠的存活期。如图5B中示出的，用媒介物对照、单独的地西他滨、高剂量alisertib和低剂量alisertib接种的小鼠都仅具有少于接种后40天的平均存活期。相反，用地西他滨和alisertib的组合以两个alisertib剂量水平和时间方案接种的小鼠具有超过实验阈值的平均存活时间。
实施例4-地西他滨和alisertib的组合的体内毒性概况
观察被治疗的小鼠的毒性概况，并且在实验过程中对动物称重。如图6A-图6H中示出的，在整个实验时间过程中，所有治疗组中小鼠体重保持相对稳定，表明该方案是相对被良好耐受的。
如图7A-图7E中示出的，与单独的每一种药物相比，组合疗法未显示出恶化任何血液学参数，诸如血小板减少症和中性粒细胞减少症。在血小板减少症的情况中，与单独的alisertib相比，该组合显示出是保护性的，如图7A中示出的。
关于肝功能，用单剂alisertib治疗观察到升高的AST和ALT。参见图7D和图7E。然而，如这些图图示的，地西他滨和alisertib的组合在这方面再次显示出是保护性的。总之，这些研究证明了地西他滨和alisertib的组合在动物模型中的保护作用且没有加和性毒性。
实施例5-DNMTi可以诱导对AURKAi的长期敏感
本文研究了用DNMTi(地西他滨)治疗是否将诱导之后能够对极光激酶A抑制剂(AURKAi)诸如alisertib敏感的持久表观遗传重编程和表观遗传记忆。在组织培养中，用媒介物对照或低剂量地西他滨(100nM，与上文的实施例中使用的类似)处理DU145细胞。在该低剂量下，大多数细胞存活并且允许在没有药物的情况下恢复4天。
然后将媒介物和地西他滨预处理的细胞植入裸鼠中并且允许建立异种移植肿瘤，持续3周。然后每天用媒介物对照或alisertib(MLN8237，以15mg/kg，通过口服管饲)治疗动物，持续5周。因此，建立了四个组：(1)接受媒介物对照的未治疗的DU145小鼠；(2)接受alisertib的未治疗的DU145小鼠；(3)接受媒介物对照的地西他滨预处理的DU145小鼠；和(4)接受alisertib的地西他滨预处理的DU145小鼠。
图8A是图示了施用了媒介物对照的组的异种移植物生长的蜘蛛图。异种移植物生长的蜘蛛图揭示了，与如图8B和图8C中示出的单独的地西他滨预处理或单独的alisertib相比，如图8D中示出的，在培养物中用地西他滨预处理并进行体内alisertib(MLN8237)处理的组具有显著降低的异种移植物生长。这被转化为显著改善的存活，如图9中示出的。因此，在体外用地西他滨预处理显示出诱导对AURKAi的长期敏感，这种长期敏感甚至在允许细胞恢复并且在多周时间段内将其建立为异种移植物肿瘤后仍可观察到。
然后检查了来自地西他滨预处理实验的剩余异种移植物肿瘤的增殖指数和凋亡分数。将来自媒介物对照、单独的地西他滨预处理、单独的alisertib、以及地西他滨预处理与alisertib的组合的每一种的样品细胞用KI-67或胱天蛋白酶3A染色。如图10A-图10D中示出的，存在KI-67染色的明显减少(指示降低的细胞增殖)。此外，如图10E-图10H中示出的，在地西他滨预处理和alisertib处理的组中，存在胱天蛋白酶3A染色的显著增加(指示增加的凋亡)。然而，在媒介物对照组、单独的地西他滨预处理组和单独的alisertib处理组中，几乎不存在KI-67和胱天蛋白酶3A免疫组织化学(IHC)水平的变化。参见图10A-图10H。这表明用地西他滨预处理诱导了对AURKAi的长期敏感，这表现为在动物中用AURKAi治疗后，甚至在肿瘤细胞最初用低剂量的地西他滨治疗后数周，增殖的明显降低和凋亡的增加。
实施例6-通过DNMTi和AURKAi的ISLET的作用机制
为了开始研究通过DNMTi(地西他滨)和AURKAi(alisertib)诱导的合成致死性的作用机制，检查了每一种抑制剂对DU145细胞中的DNA甲基转移酶和极光激酶A蛋白表达水平的作用。对用媒介物对照；单独的100nM alisertib；单独的100nM地西他滨；和100nM地西他滨与100nM alisertib的组合处理的DU145细胞组织样品进行针对AURKA的蛋白质印迹分析。发现低剂量的地西他滨处理可以显著诱导AURKA蛋白水平并且在与alisertib组合时该诱导被进一步增强。参见图11A。
DNA甲基转移酶包括一个酶家族，包括DNMT1、DNMT3A和DNMT3B。已知地西他滨经由共价捕获和降解显著降低DNMT1水平；然而，认为单独的地西他滨无法显著降低DNMT3B水平。这后一种观察结果在对DU-145细胞的研究中被证实，如图11B中示出的。在本研究中，对用媒介物对照；单独的100nM alisertib；单独的100nM地西他滨；和100nM地西他滨与100nMalisertib的组合处理的DU145细胞组织样品进行针对DNMT3B的蛋白质印迹分析。地西他滨显著降低DNMT1水平(数据未示出)，但无法显著改变DNMT3B水平。单独的alisertib无法显著影响DNMT1或DNMT3A水平(数据未示出)，但确实显著降低DNMT3B水平，如图11B中示出的。这种DNMT3B消耗在地西他滨和alisertib的组合治疗中被进一步增强。在另外的初步研究中，已经观察到通过alisertib对DNMT3B的消耗可能是由于alisertib治疗后降低的蛋白质稳定性和增强的DNMT3B的蛋白酶体降解，而不是由于DNMT3B产生减少。
这些数据表明AURKA可能在DNMT3B的稳定化中起作用，该假设可被进一步研究。总之，这些数据表明AURKAi和DNMTi可以导致它们的靶酶的彼此相反的调控，地西他滨导致AURKA的预料不到的上调，而alisertib导致DNA甲基转移酶DNMT3B的预料不到的下调。
因为地西他滨和alisertib的组合导致DNMT1和DNMT3B二者的显著降低，所以假设该组合治疗可以导致增强的DNA脱甲基化。发光定量甲基化测定(LuminometricMethylation Assay)(LUMA)被用于测量包含媒介物对照；地西他滨；alisertib；和地西他滨与alisertib的组合的DU145细胞的DNA甲基化。发现，通过LUMA测定测量的整体甲基化(global methylation)水平在DU145细胞的组合治疗中与包含单独的地西他滨或alisertib的细胞相比显著降低。参见图12A。
如图12B中示出的，对多个类别的重复元件的亚硫酸氢盐基因组测序显示出，着丝粒周围(peri-centromeric)序列，诸如卫星2序列在地西他滨和alisertib的组合治疗中显示出与单独的任一种药物相比特别增强的脱甲基化。与全部高于30％的媒介物对照或单独的任一种药物相比，在组合治疗中，卫星2甲基化的百分比显著降低到低于10％。对于媒介物对照，CpG卫星2甲基化的百分比为45.09％，而对于单独的地西他滨为33.33％，并且对于单独的alisertib为40.6％。然而，地西他滨和alisertib的组合导致卫星II甲基化为5.46％。参见图12B。这些发现表明通过地西他滨和alisertib的组合耗尽DNMT1和DNMT3B二者可能能够急剧降低着丝粒周围序列处的DNA甲基化。
着丝粒周围区域处适当的表观遗传标志物(包括DNA甲基化)的建立和维持对于染色体缩合、着丝粒异染色质化(heterchromatinization)和适当的着丝粒功能可能是有重大关系的。AURKA活性对于有丝分裂期间合适的着丝粒结构和纺锤体附着也是重要的。因此，假设了地西他滨和alisertib的组合通过改变着丝粒周围的DNA甲基化并防止合适的AURKA活性将导致与单独的任一种剂相比增加的有丝分裂障碍(mitotic catastrophe)。
此外，测量了H3S10-磷酸化阳性细胞的累积，并且如图13A中示出的，地西他滨和alisertib的组合治疗导致与媒介物对照或用单独的地西他滨或alisertib的治疗相比增加的有丝分裂阻滞。同样地，如图13B中示出的，相比于用媒介物对照、单独的地西他滨或单独的alisertib的治疗，地西他滨和alisertib的组合治疗增加了多核细胞的形成。最后，如图13C中示出的，相比于用媒介物对照、单独的地西他滨或单独的alisertib的治疗，地西他滨和alisertib的组合治疗增加了具有微核的细胞的分数。有丝分裂阻滞、多核细胞和具有微核的细胞都是有丝分裂障碍的指示物。综上，这些初始的机制研究提供了对一种观点的支持，即DNMTi和AURKAi的组合可以通过使着丝粒区域的表观遗传失调而在癌细胞中造成有丝分裂障碍。
实施例7-根据功能基因组筛选进一步鉴定对于地西他滨的ISLET击中
根据上文实施例1中描述的且从先前在Schlabach M.R.等,CancerProliferation Gene Discovery through Functional Genomics,SCIENCE,319,5863:620-4(2008)中描述的程序修改得到的方法，对DU145前列腺癌细胞的样品进行汇集的慢病毒shRNA负向功能筛选。先将DU145前列腺癌细胞用汇集的慢病毒shRNA处理，导致RNA文库的转导。然后用地西他滨处理慢病毒转导的DU145细胞。因此，相对于对照处理的细胞，在用地西他滨处理时的DU145细胞中鉴定到的靶是选择性致死的。
将多个烧瓶的DU145细胞用基因组规模的汇集的慢病毒shRNA文库转导。池中的每一种慢病毒编码27,500种shRNA构建体、shRNA特异性条形码、嘌呤霉素抗性基因和追踪转导水平的荧光标志物基因中的每一种。5,000种人类基因的每一种被池中的5至6个shRNA的编码慢病毒靶向，并且以低的感染复数(MOI为约0.3)进行转导，以便确保大多数经转导的细胞将仅接受单个慢病毒颗粒。对足够的病毒和细胞进行转导，使得在这种低MOI下，每一种shRNA将在群体中呈现约100倍至1000倍。
然后用地西他滨(100nM或500nM)或媒介物对照(全部以2个至3个重复实验进行)处理经转导的细胞的文库，持续4天或7天。在处理后，收获细胞，分离DNA，并且使用50μg的基因组DNA扩增存活细胞中的shRNA特异性条形码。然后通过下一代测序鉴定这些条形码，并且与群体中的个体shRNA对应的每一种条形码的数目被用作该shRNA在媒介物和地西他滨处理的细胞中的呈现的量度。“击中”被鉴定为与媒介物处理的细胞群体相比，在地西他滨处理的细胞群体中“脱出”的那些shRNA。相反，与媒介物处理的细胞群体相比，在地西他滨处理的细胞群体中被富集的shRNA被认为提供对地西他滨处理的耐受性。
在汇集的功能基因组筛选中测试的27,000种shRNA中，鉴定到149种，它们被认为是显著的ISLET“击中”，具有约1％的错误发现率。图14是示出了shRNA的在有地西他滨和没有地西他滨的情况下的选择性杀伤程度的瀑布图，所述程度被绘制为用地西他滨处理的计数与用对照处理的计数的比率的Log2转换。与上文的图1A一样，与单独的shRNA相比，值越负，shRNA与地西他滨的组合的选择性杀伤的水平越大。下表10详细描述了鉴定到的149种潜在靶基因的每一种。
表10-来自shRNA功能基因组筛选的ISLET击中
Figure BDA0002383848710000391
Figure BDA0002383848710000401
Figure BDA0002383848710000411
Figure BDA0002383848710000421
Figure BDA0002383848710000431
Figure BDA0002383848710000441
表10中列出的shRNA化合物的靶代表用于开发抑制剂的潜在靶，所述抑制剂当与地西他滨组合时可以在癌细胞中诱导合成致死性。在这些潜在的shRNA靶中，在本文中鉴定出16种并且在图14中以白色柱表示。这16种潜在靶经历了用独立靶向shRNA的进一步验证以确认它们是有效的ISLET组合。鉴定的16种靶包括针对以下的shRNA：GNAZ、两种DCTshRNA、ITK、AURKA、CHST3、MAP2K2、CRAT、PDE1B、STAT5A、MEF2C、IL17D、PDE48、HSD3B2、PDE4C和FUT5。
图15示出了与地西他滨组合的作为用表观遗传疗法诱导合成致死性(ISLET)的靶的CHST的独立验证。与单独的CHST shRNA或单独的地西他滨相比，与100nM地西他滨组合的特异性靶向CHST的shRNA导致DU145癌细胞生存力显著降低。如图15中示出的，对于媒介物对照与地西他滨、但没有靶向CHST的shRNA的DU145细胞的总体生存力显著比包含具有靶向CHST的shRNA以及地西他滨的DU145的样品更高。
图16示出了与单独的CRAT shRNA或单独的地西他滨相比，与100nM地西他滨组合的两种不同的靶向CRAT的shRNA各自导致DU145癌细胞生存力显著降低。如图16中示出的，对于媒介物对照与地西他滨但没有靶向CRAT的shRNA的DU145细胞的总体生存力明显比包含具有靶向CRAT的shRNA以及地西他滨的DU145的两个样品中的任一个更高。
图17示出了与单独的DCT shRNA或单独的地西他滨相比，与100nM地西他滨组合的两种不同的靶向DCT的shRNA各自导致DU145癌细胞生存力显著降低。如图17中示出的，对于媒介物对照与地西他滨但没有靶向DCT的shRNA的DU145细胞的总体生存力明显比包含具有靶向DCT的shRNA以及地西他滨的DU145的两个样品中的任一个更高。
图18示出了与单独的FUT5 shRNA或单独的地西他滨相比，与100nM地西他滨组合的靶向FUT5的shRNA各自导致DU145癌细胞生存力显著降低。如图18中示出的，对于媒介物对照与地西他滨但没有靶向FUT5的shRNA的DU145细胞的总体生存力明显比包含具有靶向FUT5的shRNA以及地西他滨的DU145的样品更高。
图19示出了与单独的GNAZ shRNA或单独的地西他滨相比，与100nM地西他滨组合的两种不同的靶向GNAZ的shRNA各自导致DU145癌细胞生存力显著降低。如图19中示出的，对于媒介物对照与地西他滨但没有靶向GNAZ的shRNA的DU145细胞的总体生存力明显比包含具有靶向GNAZ的shRNA以及地西他滨的DU145的两个样品中的任一个更高。
图20示出了与单独的HSD3B2 shRNA或单独的地西他滨相比，与100nM地西他滨组合的靶向HSD3B2的shRNA各自导致DU145癌细胞生存力显著降低。如图20中示出的，对于媒介物对照与地西他滨但没有靶向HSD3B2的shRNA的DU145细胞的总体生存力明显比包含具有靶向HSD3B2的shRNA以及地西他滨的DU145的样品更高。
图21示出了与单独的IL17D shRNA或单独的地西他滨相比，与100nM地西他滨组合的两种不同的靶向IL17D的shRNA各自导致DU145癌细胞生存力显著降低。如图21中示出的，对于媒介物对照与地西他滨但没有靶向IL17D的shRNA的DU145细胞的总体生存力明显比包含具有靶向IL17D的shRNA以及地西他滨的DU145的两个样品中的任一个更高。
图22示出了与单独的ITKshRNA或单独的地西他滨相比，与100nM地西他滨组合的两种不同的靶向ITK的shRNA各自导致DU145癌细胞生存力显著降低。如图22中示出的，对于媒介物对照与地西他滨但没有靶向ITK的shRNA的DU145细胞的总体生存力明显比包含具有靶向ITK的shRNA以及地西他滨的DU145的两个样品中的任一个更高。
图23示出了与单独的MAP2K2 shRNA或单独的地西他滨相比，与100nM地西他滨组合的两种不同的靶向MAP2K2的shRNA各自导致DU145癌细胞生存力显著降低。如图23中示出的，对于媒介物对照与地西他滨但没有靶向GNAZ的shRNA的DU145细胞的总体生存力明显比包含具有靶向MAP2K2的shRNA以及地西他滨的DU145的两个样品中的任一个更高。
图24示出了与单独的MEF2C shRNA或单独的地西他滨相比，与100nM地西他滨组合的两种不同的靶向MEF2C的shRNA各自导致DU145癌细胞生存力显著降低。如图24中示出的，对于媒介物对照与地西他滨但没有靶向MEF2C的shRNA的DU145细胞的总体生存力明显比包含具有靶向MEF2C的shRNA以及地西他滨的DU145的两个样品中的任一个更高。
图25示出了与单独的PDE1B shRNA或单独的地西他滨相比，与100nM地西他滨组合的两种不同的靶向PDE1B的shRNA各自导致的DU145癌细胞生存力显著降低。如图25中示出的，对于媒介物对照与地西他滨但没有靶向PDE1B的shRNA的DU145细胞的总体生存力明显比包含具有靶向PDE1B的shRNA以及地西他滨的DU145的两个样品中的任一个更高。
图26示出了与单独的PDE4B shRNA或单独的地西他滨相比，与100nM地西他滨组合的四种不同的靶向PDE4B的shRNA各自导致DU145癌细胞生存力显著降低。如图26中示出的，对于媒介物对照与地西他滨但没有靶向PDE4B的shRNA的DU145细胞的总体生存力明显比包含具有靶向PDE4B的shRNA以及地西他滨的DU145的四个样品中的任一个更高。
图27示出了与单独的PDE4C shRNA或单独的地西他滨相比，与100nM地西他滨组合的四种不同的靶向PDE4C的shRNA各自导致DU145癌细胞生存力显著降低。如图27中示出的，对于媒介物对照与地西他滨但没有靶向PDE4C的shRNA的DU145细胞的总体生存力明显比包含具有靶向PDE4C的shRNA以及地西他滨的DU145的四个样品中的任一个更高。
图28示出了与单独的STAT5AshRNA或单独的地西他滨相比，与100nM地西他滨组合的两种不同的靶向STAT5A的shRNA各自导致DU145癌细胞生存力显著降低。如图28中示出的，对于媒介物对照与地西他滨但没有靶向STAT5A的shRNA的DU145细胞的总体生存力明显比包含具有靶向STAT5A的shRNA以及地西他滨的DU145的两个样品中的任一个更高。
实施例8-MBD蛋白抑制剂和RAR激动剂的组合显示出体外和体内肿瘤抑制
视黄酸途径活化
为了确定MBD2蛋白抑制剂是否触发视黄酸信号传导途径活化，将KCC-08施用至转染有对视黄酸信号传导途径的存在响应的异源报告物质粒(pRARE-荧光素酶)的PC-3人类前列腺癌细胞，并且使用这些细胞评估视黄酸响应信号传导途径的再活化。在有异维甲酸(5μM)和没有异维甲酸(5μM)二者的情况下用媒介物对照或KCC-08(10μM)处理癌细胞72小时，并且然后测定荧光素酶报告物产生。
如图29A中示出的和如下表11中详细描述的，荧光素酶活性被KCC-08增强，并且甚至在通过异维甲酸与KCC-08的组合刺激后进一步增强，使得KCC-08和异维甲酸的组合协同地增强视黄酸信号传导途径活化。
表11-在有异维甲酸和没有异维甲酸的情况下KCC-08的RAR报告物活性
Figure BDA0002383848710000481
为了测定癌症克隆存活，将PC-3癌细胞以5,000个细胞/孔接种到6孔板中并且允许附着过夜。接下来，在有异维甲酸和没有异维甲酸二者的情况下，将细胞用媒介物对照或KCC-08处理72小时，用磷酸盐缓冲盐水洗涤三次，并且然后放回到完全生长培养基中。10天后，使用结晶紫染色检测由存活细胞建立的克隆。于是确定了，KCC-08和异维甲酸对视黄酸信号传导途径的恢复降低了克隆在72小时暴露后的存活，如图29B和下表12中示出的，示出了12-27个独立重复的平均值。
表12–相对于对照的克隆存活
Figure BDA0002383848710000482
体内肿瘤抑制
对于癌症异种移植物生长抑制，将一百万个人类PC-3前列腺癌细胞悬浮在Matrigel中，并且接种到由Jackson Laboratory(Bar Harbor,ME)提供的雄性Fox1裸鼠的侧腹。在两周后能够测量所得的异种移植物肿瘤时，用KCC-08治疗荷瘤小鼠(在盐水中通过腹膜内感染给予)，对于第1周的7天中的5天以1mg/kg并且然后对于第2周的7天中的5天以0.5mg/kg。在花生油中的异维甲酸以30mg/kg通过口服管饲给予，对于第1周和第2周的7天中的5天与KCC-08相同。对于第3周，在花生油中的异维甲酸以30mg/kg通过口服管饲在7天中的5天给予，并且不施用KCC-08。一周3次测量肿瘤，持续3周，并且通过使用公式4/3*Π*宽度*长度*深度来估计体积。
如图29C和下表13中示出的，即使在KCC-08施用已经停止后施用异维甲酸时，KCC-08和异维甲酸的组合协同地抑制体内肿瘤生长。
表13-相对于基线的异种移植物肿瘤体积平均百分比
Figure BDA0002383848710000491
实施例9-用地西他滨鉴定ISLET击中的化学文库筛选
在有DNMT抑制剂地西他滨和没有DNMT抑制剂地西他滨的情况下使用化学文库筛选(Johns Hopkins Drug Library,JHDL)，以便鉴定文库中与单独的地西他滨或化合物相比协同地抑制癌细胞生长的那些化合物。进行两个阶段的筛选。在第一阶段中，在暴露于100nM地西他滨或媒介物对照4天后，将JHDL文库中的3800种化合物以5微摩尔的单次剂量施用至PC-3前列腺癌细胞，暴露持续3天。鉴定出131种化合物显示出>50％的生长抑制。
在第二阶段中，在单独的(0-10μM)和与地西他滨(0-10μM)组合的64种化合物的每一种的全剂量响应矩阵中评估鉴定到的131种化合物中的64种。使细胞暴露于每一个剂量的地西他滨，持续连续的四天，之后添加每一个剂量的鉴定的化合物，持续连续的三天。如果跨越所有剂量组合的Bliss独立性评分总和大于零，则化合物被鉴定为当与地西他滨组合时具有协同生长抑制。图30是图示了鉴定的化合物对细胞的Bliss独立性评分值的柱状图。鉴定出以下22种化合物：秋水仙碱、毒毛旋花子苷元(strophanthidin)、长春瑞滨(vinorelbine)、NH125、多西他赛(docetaxel)、杠柳麻苷(periplocymarin)、拓扑替康(topotecan)、克拉屈滨(cladribine)、阿糖胞苷(cytarabine)、RO31-8220、哇巴因(ouabain)、吉西他滨(gemcitabine)、PI828、霉酚酸、GW843682、博来霉素、阿柔比星(aclarubicin)、ER27319、卡铂、茴香霉素、SB218078和缬氨霉素。
这种化学文库筛选方法将多个类别的药物包括激酶抑制剂、微管剂(microtubules agent)、核苷类似物、抗生素和其他剂鉴定为显著的ISLET击中。

Claims (26)

1.一种鉴定当与至少一种表观遗传化合物组合时诱导癌细胞杀伤的化合物的方法，所述方法包括：
用表观遗传化合物处理癌细胞，其中所述癌细胞已经用剂的文库处理，其中至少一种剂抑制靶基因或基因产物；
鉴定经所述表观遗传化合物的处理无法存活的被处理的癌细胞的所述靶基因；和
将当与所述表观遗传化合物组合时诱导癌细胞杀伤的所述化合物鉴定为经所述表观遗传化合物的处理无法存活的所述被处理的癌细胞的所述靶基因的抑制剂。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述表观遗传化合物是DNA甲基转移酶抑制剂、组蛋白脱乙酰酶抑制剂、组蛋白甲基转移酶抑制剂或甲基化-DNA结合蛋白抑制剂。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述剂的文库选自由shRNA文库、siRNA文库、小分子文库、插入诱变文库和CRISPR-Cas sgRNA文库组成的组。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述剂的文库是shRNA文库，所述shRNA文库是汇集的慢病毒shRNA文库。
5.一种用于治疗癌症的方法，所述方法包括向有相应需要的受试者施用有效量的至少一种表观遗传化合物和有效量的至少一种化学治疗剂，所述至少一种表观遗传化合物选自DNA甲基转移酶抑制剂和甲基化-DNA结合蛋白抑制剂。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述至少一种DNA甲基转移酶抑制剂是地西他滨。
7.根据权利要求5所述的方法，其中所述至少一种甲基化-DNA结合蛋白抑制剂是KCC-08。
8.根据权利要求5所述的方法，其中所述DNA甲基转移酶是地西他滨，并且所述至少一种化学治疗剂选自抑制以下基因中的至少一种的化合物：PLAS2G12A、EIF4A2、GNAZ、DCT、SULT1C4、HLX、ITK、AURKA、CHST3、MAP2K2、AADAT、CRAT、SULT4A1、PDE4D、THY1、PDE1B、BDH2、QPRT、STAT5A、PHF21A、MEF2C、IL17D、SEL1L、COMT、GLRX、AKR1C4、GNA12、B4GALT1、LEF1、XYLT1、GNAQ、GCA、AGXT2、DPM2、OGDHL、UGT2B10、PDE5A、GPSM1、LIG3、PDE4B、LCMT1、DHX58、GBGT1、DUSP9、DCI、B4GALT2、MTR、NT5C2、HSD3B2、ARL4D、GPT2、OAT、RFXAP、PDE11A、BCR、GNA11、PDE4C、DHRS3、FOXN1、PDE6G、G6PC2、RPIA、IDI1、ACSS1、FHIT、UGT1A3、FARS2、A4GALT、GATM、CHST1、AGPAT4、NT5M、MVK、UGT2B17、ARHGEF1、NEURL、QPCT、GNAI3、ATIC、PLA2G12A、DARS、AKRIC1、B4GALT5、FUT5、COX10、AKAP13、AGXT、GNMT、HOXB4、CAND1、CLC、TFAP2A、HMGN1、RAD9A、GNB3、ECGF1、ARPC3、ACVR1B、CKS1B、SLC1A2、UROS、CHST4、NT5E、PIGL、CIGALT1、PDE1A、ACP6、NOS1、RECQL4、NOS3、RNF2、LSS、ANP32A、RAG2、BCL2L2、CPE、CAPN9、PRKAR2A、EP300、FGFR2、ISYNA1、ARF3、IPMK、BCL11B、HMGCS1、GALNT14、GALNS、FAH、AK3L1、SULT1C2、GLP1R、AGPAT2和FOXP1。
9.根据权利要求5所述的方法，其中所述至少一种化学治疗剂是极光激酶A抑制剂。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述极光激酶A抑制剂是alisertib。
11.根据权利要求5所述的方法，其中所述至少一种化学治疗剂是视黄酸受体激动剂。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述视黄酸受体激动剂是异维甲酸。
13.根据权利要求5所述的方法，其中所述癌症选自前列腺癌、卵巢癌、肺癌、结肠直肠癌、中枢神经系统癌和乳腺癌。
14.根据权利要求5所述的方法，其中所述受试者是人类。
15.根据权利要求5所述的方法，其中所述至少一种表观遗传化合物的施用和所述至少一种化学治疗剂的施用是依次的。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述至少一种表观遗传化合物在施用所述至少一种化学治疗剂前被施用。
17.根据权利要求5所述的方法，其中所述至少一种表观遗传化合物的施用和所述至少一种化学治疗剂的施用是同时的。
18.一种增强化学治疗剂针对癌症的治疗效果的方法，所述方法包括向具有所述癌症的受试者施用有效增强所述化学治疗剂针对所述癌症的治疗效果的量的表观遗传化合物。
19.根据权利要求18所述的方法，所述方法还包括向所述受试者施用治疗有效量的所述化学治疗剂。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述治疗有效量的所述化学治疗剂当在不施用所述表观遗传化合物的情况下施用时是治疗无效的。
21.根据权利要求18所述的方法，其中所述表观遗传化合物是DNA甲基转移酶抑制剂或甲基化-DNA结合蛋白抑制剂。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述DNA甲基转移酶抑制剂是地西他滨。
23.根据权利要求21所述的方法，其中所述甲基化-DNA结合蛋白抑制剂是KCC-08。
24.根据权利要求18所述的方法，其中所述化学治疗剂是极光激酶A抑制剂或视黄酸受体激动剂。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述极光激酶A抑制剂是alisertib。
26.根据权利要求24所述的方法，其中所述视黄酸受体激动剂是异维甲酸。
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