CN104994861A - 使用miRNA的癌症疗法 - Google Patents

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Abstract

本发明总体上涉及使用微小RNA miR-7-5p治疗表达1型胰岛素样生长因子受体(IGF1R)或IGF1R信号传导通路的成分的癌症，特别是黑色素瘤的方法和组合物。还提供用于增加这类癌症对治疗剂的敏感性的方法。

Description

使用miRNA的癌症疗法
技术领域
本发明总体上涉及使用微小RNA miR-7-5p治疗表达1型胰岛素样生长因子受体(IGF1R)或IGF1R信号传导通路的成分的癌症，特别是黑色素瘤的方法和组合物。还提供用于增加这类癌症对治疗剂的敏感性的方法。
相关申请
本申请要求2012年10月18日提交的题为“Cancer Therapy UsingmiRNAs”的澳大利亚临时申请号2012904570的优先权。澳大利亚临时申请号2012904570的主题以引用的方式整体并入本文。
背景技术
黑色素瘤是最具侵袭性形式的皮肤癌并且是全世界日益增加的健康问题，发病率呈逐年上升趋势。一旦黑色素瘤已经转移，几乎不存在有效治疗，并且死亡率较高。黑色素瘤能够快速转移并且经常是常规化学疗法和放射疗法难治的。这种抗性是改善患者存活的主要障碍，并且随着有效治疗剂的缺乏，需要开发新颖的、治疗有效的治疗方法来治疗黑色素瘤。
对黑色素瘤的分子生物学，包括作为潜在药物靶标的基因突变和在黑色素瘤中活化的特定信号传导通路(如胰岛素样生长因子1受体(IGF1R)通路)的鉴定的理解增加为开发改善的疗法提供希望。IGF1R与良性痣相比在恶性黑色素瘤中过度表达并且介导过程如存活、增殖和运动。IGF1R刺激导致两个主要下游信号传导通路的活化：PI3K-Akt_TOR通路和Ras-Raf-MEK-ERK通路，所述两种通路对于黑色素瘤发病机制是重要的。突变发生在这些通路的关键分子中，包括NRAS(9％-15％的黑色素瘤)、BRAF(66％的黑色素瘤)和PTEN(30％-60％的黑色素瘤)，从而导致所述通路的组成型活化，促进细胞增殖、存活、迁移和侵袭。虽然使用突变体BRAF抑制剂PLX4032(RG7204/威罗菲尼(vemurafenib)/)的最近临床试验已经产生了转移性黑色素瘤肿瘤的急剧收缩，但是几乎所有患者发展抗性。重要的是，IGF1R信号传导的上调是对BRAF抑制的ERK独立的抗性。因此，IGF1R及其下游信号传导通路是癌症治疗的潜在靶标。
微小RNA(miRNA)是至少部分地通过其经由miRNA的“种子区”结合靶基因的3′-UTR的能力调控mRNA降解和翻译两者的一类高度保守的小型(通常21-25个核苷酸)非编码RNA。miRNA是从通常包含从非编码DNA的区域转录的几百个核苷酸的RNA前体(初始-miRNA)产生。初始-miRNA在细胞核中通过RNA酶III核酸内切酶加工以形成大约70个核苷酸的茎-环前体(前体-miRNA)。前体-miRNA被主动地转运至细胞质中，在细胞质中它们被进一步加工成通常21-23个核苷酸的短RNA双链体。功能性miRNA链从其互补非功能性链解离并且位于RNA-诱导的沉默复合物(RISC)内。(或者，RISC可直接负载前体-miRNA发夹结构。)miRNA结合靶mRNA的3′UTR并且在所述结合中重要的是在miRNA的5′末端附近的大约6-7个核苷酸的“种子区”(通常核苷酸位置2至8)。miRNA-诱导的基因表达调控通常通过翻译阻抑实现，从而在蛋白质从核糖体或“冻结”核糖体出现时降解蛋白质、和/或促进靶mRNA移动到RNA破坏的位点。
miRNA对于许多正常细胞功能来说是重要的，并且参与过程如干细胞分裂、胚胎发育、细胞分化、炎症和免疫。越来越多地，特定miRNA和个体miRNA的表达模式和改变的表达调控也被牵涉在多种疾病病状(包括癌症)中。miR-7-5p被表征为几种癌症类型中的肿瘤抑制miRNA，其中其靶向且阻抑分子如IGF1R(胰岛素样生长因子1受体)、PAK1(p21-活化激酶1)、IRS-1/2(胰岛素受体底物1和2)、EGFR(表皮生长因子受体)、FAK(粘着斑激酶)和RAF1(v-raf-1鼠白血病病毒致癌基因同源物1)。
发明内容
在第一方面，本发明提供一种用于治疗表达IGF1R或IGF1R信号传导通路的成分的癌症或肿瘤的协同组合物，所述组合物包含miR-7-5p miRNA、其前体或变体或包含含有序列GGAAGA的种子区的miRNA，以及BRAF抑制剂、IGF1R抑制剂和DNA烷化化学治疗剂中的至少一种。
在一个具体实施方案中，癌症是黑色素瘤。黑色素瘤可以是恶性黑色素瘤。黑色素瘤可包含表达BRAF、NRAS或PTEN中的一个或多个中的突变的细胞。
miR-7-5p miRNA可以是hsa-miR-7-5p，并且可包含SEQ ID NO：1中列出的核苷酸序列。miR-7-5p miRNA前体可选自hsa-miR-7-1、hsa-miR-7-2和hsa-miR-7-3，并且可包含如在SEQ ID No：2至4中的任一项中列出的序列。
BRAF抑制剂可以是突变体BRAF特异性抑制剂或突变体BRAF选择性抑制剂。突变体BRAF可包含例如V600E、V600D、V600K或V600R突变。在一个具体实施方案中，BRAF抑制剂是PLX4032(威罗菲尼；如)。在一个具体实施方案中，IGF1R抑制剂是酪氨酸激酶抑制剂，并且可选自苦鬼臼脂素(picropodophyllin)(PPP)和NVP-AEW541。在一个具体实施方案中，化学治疗剂是替莫唑胺(TMZ；如)。
本发明的第二方面提供一种用于治疗受试者中的表达IGF1R或IGF1R信号传导通路的成分的癌症或肿瘤的方法，所述方法包括向所述受试者施用协同有效量的miR-7-5p miRNA、其前体或变体或包含含有序列GGAAGA的种子区的miRNA，以及选自BRAF抑制剂、IGF1R抑制剂和DNA烷化化学治疗剂的至少一种治疗剂。
所述治疗剂和miRNA可以单一组合物施用，与药学上可接受的载体、赋形剂或佐剂一起配制或可以分开的组合物施用。在一个实施方案中，所述方法包括向所述受试者施用有效量的第一方面的组合物。当药剂分开施用时，可同时或顺序施用。在具体实施方案中，施用miRNA使得癌症易感于低于在不存在miRNA的情况下所需的细胞生长抑制或细胞毒性剂量的治疗剂的细胞生长抑制或细胞毒性剂量。因此，当顺序施用时，通常在治疗剂之前施用miRNA。
本发明的第三方面提供一种用于使表达IGF1R或IGF1R信号传导通路的成分的癌症或肿瘤细胞对选自BRAF抑制剂、IGF1R抑制剂和DNA烷化化学治疗剂的治疗剂敏感的方法，所述方法包括使所述细胞与有效量的miR-7-5p miRNA、其前体或变体或包含含有序列GGAAGA的种子区的miRNA相接触。
所述癌症或肿瘤细胞或所述细胞所源自的癌症或肿瘤在不存在治疗的情况下可展示对治疗剂的抗性。所展示的抗性可以是固有抗性或获得性抗性。
通常，敏化作用使得细胞易感于低于在不存在miRNA的情况下所需的细胞生长抑制或细胞毒性剂量的治疗剂的细胞生长抑制或细胞毒性剂量。
本发明的第四方面提供一种用于抑制或预防癌症转移或癌细胞迁移的方法，其中所述癌症表达IGF1R或IGF1R信号传导通路的成分，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的miR-7-5p miRNA、其前体或变体或包含含有序列GGAAGA的种子区的miRNA。
通常，根据上述方面和实施方案，所述miRNA抑制胰岛素受体底物2(IRS-2)、p21-活化的激酶1(PAK1)和粘着斑激酶(FAK)中的一种或多种的表达。
本文还提供miR-7-5p miRNA、其前体或变体或包含含有序列GGAAGA的种子区的miRNA以及选自BRAF抑制剂、IGF1R抑制剂和化学治疗剂的至少一种治疗剂用于治疗表达IGF1R或IGF1R信号传导通路的成分的癌症或肿瘤的用途。
本文还提供miR-7-5p miRNA、其前体或变体或包含含有序列GGAAGA的种子区的miRNA用于使表达IGF1R或IGF1R信号传导通路的成分的癌症或肿瘤细胞对选自BRAF抑制剂、IGF1R抑制剂和DNA烷化化学治疗剂的治疗剂敏感的用途。
本文还提供miR-7-5p miRNA、其前体或变体或包含含有序列GGAAGA的种子区的miRNA用于抑制或预防癌症转移或癌细胞迁移的用途，其中所述癌症表达IGF1R或IGF1R信号传导通路的成分。
附图说明
本发明的实施方案仅通过非限制性实施例参考以下图进行了描述。
图1.miR-7-5p降低IGF1R通路的分子的表达并且消除在黑色素瘤细胞中信号传导的Akt和ERK1/2的活化。使用从用15nM的miR-NC或miR-7-5p前体转染的SK-MEL-28、WM266-4、MM96L和A2058黑色素瘤细胞系收获的蛋白质提取物免疫印迹检测所指示的蛋白质(在转染后3天)。β-肌动蛋白，上样对照。数据代表三个独立实验。
图2.miR-7-5p降低黑色素瘤细胞存活力。A.用所指示浓度的miR-NC或miR-7-5p前体转染后5天MM96L细胞存活力的细胞滴度分析。B.如A中转染A2058细胞并且分析细胞存活力。数据已被标准化至仅Lipofectamine 2000(媒介物)并且代表三个独立的实验。条形代表S.D.，**指示与miR-NC(p＜0.01)的显著差异，并且***指示与miR-NC(p＜0.001)的显著差异。
图3.黑色素瘤细胞系对IGF1R激酶抑制剂NVP-AEW541具有抗性并且miR-7-5p可使黑色素瘤细胞系对BRAF抑制剂、IGF1R抑制剂和DNA烷化化学治疗剂敏感。A.将A2058、MM96L和MCF-7(阳性对照)用一定浓度范围内(0.001-100μM)的NVP-AEW541处理并且在4天之后分析细胞存活力。数据已被标准化至最低药物浓度。条形表示细胞存活力的平均差异±S.D.。数据代表三个独立实验。B-E.将A2058细胞用5nM下的miR-NC或miR-7-5p前体转染并且在转染后3天用所指示的药物(B，5μM NVP-AEW541；C，100nMPLX4032；D，100nM PPP；E，150μM TMZ)或DMSO处理。数据表示在添加药物或DMSO之后4天的细胞存活力(转染后7天)。数据已被标准化至用DMSO处理的miR-NC并且代表至少两个独立的实验。条形代表S.D.，***指示与miR-NC(p＜0.001)的显著差异，指示miR-7-5p与所指示的药物处理之间的协同作用。
图4.miR-7-5p抑制黑色素瘤细胞迁移并且阻断几种促迁移分子的表达。A.将A2058细胞用30nM下的miR-NC或miR-7-5p前体转染并且在48小时之后接种到CIM-板16中并且用xCELLigence RTCADP仪器监测迁移持续24小时。数据表示平均细胞指数±S.D.。数据代表三个独立实验。B.将WM266-4和A2058细胞如A中进行转染并且在相同时间点收获蛋白质用于迁移测定。通过免疫印迹检测FAK、IRS-2和PAK1的蛋白质表达的变化。β肌动蛋白，上样对照。数据代表三个独立实验。
图5.miR-7-5p抑制A2058、WM266-4和A375黑色素瘤细胞迁移。在用miR-7-5p或miR-NC转染之后A2058、WM266-4和A375黑色素瘤细胞系的迁移(由细胞指数表示)的实时xCELLigence分析。
图6.miR-7-5p抑制A2058、WM266-4和A375黑色素瘤细胞侵袭。在用miR-7-5p或miR-NC转染之后A2058、WM266-4和A375黑色素瘤细胞系的侵袭(由细胞指数表示)的实时xCELLigence分析。
图7.miR-7-5p抑制1205Lu黑色素瘤细胞迁移和侵袭。A.在用miR-7-5p或miR-NC转染之后1205Lu黑色素瘤细胞系的迁移(由细胞指数表示)的实时xCELLigence分析。B.在用miR-7-5p或miR-NC转染之后1205Lu黑色素瘤细胞系的侵袭(由细胞指数表示)的实时xCELLigence分析。
图8.IRS-2是黑色素瘤细胞系中的miR-7-5p的靶标。A.在用miR-7-5p或miR-NC转染WM266-4和A2058细胞之后72小时IRS-2、P-IRS-2和β-肌动蛋白表达的蛋白质免疫印迹。光密度测定法用于定量泳带强度(每个泳带下方所示的值)。B.在用miR-7-5p或miR-NC转染WM266-4和A2058细胞之后24小时IRS-2mRNA表达的RT-qPCR。数据被标准化至GAPDH表达并且对于每个细胞系相对于miR-NC表达。误差条表示标准偏差。*，p＜0.001；**，p＜0.01。
图9.IRS-2 RNAi-介导的敲低抑制Akt活性。A.在用IRS-2siRNA(si-IRS-2#1，si-IRS-2#2)或NC siRNA(si-NC)转染WM266-4细胞之后24小时IRS-2mRNA表达的RT-qPCR。数据被标准化至GAPDH表达并且对于每个细胞系相对于miR-NC表达。误差条表示标准偏差。*，p＜0.0002。B.在用IRS-2 siRNA(si-IRS-2#1，si-IRS-2#2)或NC siRNA(si-NC)转染WM266-4细胞之后72小时IRS-2、P-IRS-2、Akt、P-Akt、ERK1/2、P-ERK1/2和β-肌动蛋白表达的蛋白质印迹。示出一式两份泳带并且光密度测定法用于定量泳带强度(在每组一式两份泳带的下方示出平均强度值)。
图10.IRS-2RNAi-介导的敲低抑制黑色素瘤细胞系迁移。A.在用si-NC、si-IRS-2#1或si-IRS-2#2转染之后WM266-4黑色素瘤细胞的迁移(由细胞指数表示)的实时xCELLigence分析。B.用si-NC、si-IRS-2#1或si-IRS-2#2转染的WM266-4细胞在12小时内迁移速率(斜率，1/小时)的图形表示。
图11.miR-7-5p和PLX4032协同作用来抑制黑色素瘤细胞增殖。在用miR-7-5p或miR-NC转染并且随后用PLX4032处理之后A375pBp.NRAS(A)或WM266-4pBp.NRAS(B)的细胞滴度分析，各自稳定地表达赋予BRAF抑制剂抗性的突变体Q61NRAS基因。数据相对于DMSO(媒介物)处理的/miR-NC转染的细胞表示并且呈现为平均值±标准偏差。使用Blissdditivism模型评价miR-7-5p与PLX4032的组合之间的协同作用。指示miR-7-5p与PLX4032之间的协同作用，并且*指示在PLX4032的所述浓度下miR-NC与miR-7-5p之间的显著差异(p-值＜0.05)。
提供了对应于在本说明书中提及的序列标识符的核苷酸序列的列表。成熟人miR-7-5p、人miR-7-5p前体和种子区的核苷酸序列在SEQ ID No：1至5中列出。
具体实施方式
冠词“一”在本文中用来指代冠词的语法对象中的一个或多于一个(即，指代“至少一个”)。举例来说，“要素”意指一个要素或多于一个要素。
贯穿本说明书和以下的权利要求书，除非上下文另有要求，否则词语“包括”和如“包含”或“含有”的变型应理解为暗示包括所陈述的整体或步骤或者整体或步骤的组，但不排除任何其它整体或步骤或者整体或步骤的组。
如本文所用，术语“寡核苷酸”是指核糖核苷酸碱基或脱氧核糖核苷酸碱基、天然核苷酸的已知类似物或其混合物的单链序列。“寡核苷酸”包含基于核酸的分子，包括DNA、RNA、PNA、LNA或其任何组合。主要包含核糖核苷酸碱基(天然或非天然)的寡核苷酸可被称为RNA寡核苷酸。寡核苷酸是可通过任何适合的方法包括例如直接化学合成或克隆和适当序列的限制性酶切制备的通常较短(长度例如小于50个核苷酸)的序列。“反义寡核苷酸”是与特定DNA或RNA序列互补的寡核苷酸。通常，在本发明的背景下，反义寡核苷酸是与特定miRNA互补的RNA寡核苷酸。反义寡核苷酸结合并沉默或阻抑(部分地或全部)其互补miRNA的活性。并非反义寡核苷酸中的所有碱基需要与“靶标”或miRNA序列互补；寡核苷酸仅需要包含足够的互补碱基来使寡核苷酸能够识别靶标。寡核苷酸还可包括另外的碱基。反义寡核苷酸序列可以是未修饰的核糖核苷酸序列或可通过如本文所述的多种方式化学修饰或缀合。
如本文所用的术语“多核苷酸”是指脱氧核糖核苷酸碱基、核糖核苷酸碱基或天然核苷酸的已知类似物或其混合物的单链或双链聚合物。“多核苷酸”包含基于核酸的分子，包括DNA、RNA、PNA、LNA或其任何组合。除非另外指明，所述术语包括对指定序列以及对与其互补的序列的引用。多核苷酸可通过本领域技术人员已知的多种方式进行化学修饰。因此，“多核苷酸”包含基于核酸的分子，包括DNA、RNA、PNA、LNA或其任何组合。
术语“序列同一性”或“序列同一性百分比”可通过在比较窗或跨度上比较两个最优对准的序列或子序列来确定，其中比较窗中的多核苷酸序列的部分可相较于参照序列(其不包含添加或缺失)任选地包含添加或缺失(即空位)以用于两个序列的最优比对。
如本文所用术语“治疗”以及语法等效物是指补救病状或症状、预防病状或疾病的形成或以另外方式无论如何预防、阻碍、延迟或逆转病状或疾病或其它所不希望症状的进展的任何和所有用途。因此术语“治疗”被认为是其广义意义。例如，治疗未必暗示治疗患者直至完全康复。在展示或特征在于多种症状的病状中，治疗不一定补救、预防、阻碍、延迟或逆转所有所述症状，但可预防、阻碍、延迟或逆转所述症状中的一种或多种。
如本文所用术语“有效量”在其含义内包括药剂或化合物的无毒但足以提供所需作用的量或剂量。所需的精确量或剂量将随受试者而变化，取决于如所治疗的物种、受试者的年龄和一般状况、所治疗病状的严重性、所施用的具体药剂以及施用方式等因素。因此，不可能指明精确的“有效量”。然而，对于任何给定情况，适当的“有效量”可由本领域普通技术人员仅使用常规实验确定。
如本文所用，术语“协同有效量”当应用于miR-7-5p或其前体与另一种治疗剂的组合时是指呈组合有效于抑制癌细胞的生长或降低癌细胞的存活力并且产生大于单独任一组分的反应的每种组分的量。
如本文所用，术语“IGF1R信号传导通路”是指通过从IGF1R直接或间接信号传导活化或以其它方式调控的任何通路，通常细胞内通路。示例性IGF1R信号传导通路是PI3K-Akt-mTOR通路和Ras-Raf-MEK-ERK通路。IGF1R信号传导通路的成分包括任何分子，所述分子的表达被调节作为通过IGF1R活化或以另外的方式调控的通路的信号传导级联的一部分，并且包括IGF1R与下游通路之间中间的分子，如IRS-1、IRS-2和PAK-1。术语IGF1R信号传导通路由本领域的技术人员容易地理解(参见，例如，Chitnis等，2008)。
如本文所用，术语“抑制剂”当在IGF1R抑制剂或BRAF抑制剂的背景下使用时是指能够直接地或间接地抑制IGF1R或突变体BRAF的表达或活性或两者，或IGF1R或BRAF相关通路如信号传导通路的一种或多种成分的表达或活性的任何药剂。这类成分可以是在IGF1R或突变体BRAF活性之前、结合IGF1R或突变体BRAF活性或作为IGF1R或突变体BRAF活性的结果活化、抑制或以其它方式调节的分子。通常，IGF1R或BRAF相关通路是下游信号传导通路。本发明考虑IGF1R信号传导通路的成分的抑制剂，如此术语在本文在“IGF1R抑制剂”的含义内定义。抑制剂可操作以通过直接或间接作用以任何方式阻止转录、翻译、转录后或翻译后加工或以其它方式抑制IGF1R或BRAF或IGF1R或BRAF相关通路的成分的活性。抑制剂可以是例如核酸、肽、任何其它适合的化学化合物或分子或这些的任何组合。应理解，在间接损害IGF1R或突变体BRAF或IGF1R或BRAF相关通路的成分的活性中，抑制剂可能影响调控IGF1R或BRAF或IGF1R或BRAF相关通路的组分或本身经受通过IGF1R或BRAF或IGF1R或BRAF相关通路的组分调控或调节的分子的活性。此外，在本公开的背景下“抑制剂”不需要全部或完全抑制IGF1R或BRAF的表达或活性。而是，抑制可以是达到足以产生所需作用的程度和/或持续足以产生所需作用的时间。如此，抑制可以是本质上数量级的和/或暂时的。
如本文所用，术语“BRAF”抑制剂是指突变体BRAF蛋白的抑制剂。
如本文所用，术语“敏感性”在其广义意义上用于指细胞在暴露于被设计用于抑制细胞的生长、杀死细胞或抑制一种或多种细胞功能的药剂情况下存活的能力。
如本文所用，术语“抗性”在其广义意义上用于指治疗剂(例如IGF1R或BRAF抑制剂)抑制细胞的生长、杀死细胞或抑制一种或多种细胞功能的有效性降低和细胞在暴露于被设计用于抑制细胞的生长、杀死细胞或抑制一种或多种细胞功能的药剂的情况下存活的能力。由细胞展示的抗性可例如通过在暴露于药剂之前获得，或可以是固有的或先天的。由细胞展示的抗性可以是完全的，在于使得药剂针对细胞完全无效；或可以是部分的，在于药剂的有效性被降低。
如本文所用的术语“受试者”是指哺乳动物并且包括人、灵长类、家畜动物(例如绵羊、猪、牛、马、驴)、实验室测试动物(例如小鼠、兔、大鼠、豚鼠)、表演和展览动物(例如马、家畜、狗、猫)、伴侣动物(例如狗、猫)和捕获的野生动物。优选地，哺乳动物是人或实验室测试动物。甚至更优选地，哺乳动物是人。
除非另外指明，本文所描述的本发明的实施方案采用本领域技术人员已知且在本领域技术人员普通技能范围内的常规分子生物学和药理学。这类技术描述于例如“Molecular Cloning：A LaboratoryManual”，第2版(由Sambrook、Fritsch和Maniatis编辑)(Cold SpringHarbor Laboratory Press：1989)；“Nucleic Acid Hybridization”，(Hames&Higgins编辑1984)；“Oligonucleotide Synthesis”(Gait编辑1984)；Remington′s Pharmaceutical Sciences，第17版，Mack PublishingCompany，Easton，Pennsylvania，USA.；“The Merck Index”，第12版(1996)，Therapeutic Category and Biological Activity Index和“Transcription&Translation”(Hames&Higgins编辑1984)。
如本文所描述和例示，发明人已经鉴定了miRNAmiR-7-5p适用于治疗表达IGF1R或IGF1R信号传导通路的成分的癌症和肿瘤、特别是黑色素瘤的治疗效用。本文公开了miR-7-5p抑制黑色素瘤细胞中IGF1R下游信号传导通路中的分子包括胰岛素受体底物2(IRS-2)、p21活化激酶1(PAK1)和粘着斑激酶(FAK)的表达(这进而消除Akt和ERK的下游活性)和降低黑色素瘤细胞存活力的能力。miR-7-5p使黑色素瘤癌细胞对用于治疗黑色素瘤并且针对其发展抗性的多种治疗剂敏感并且与所述多种治疗剂协同作用，所述治疗剂包括BRAF抑制剂、IGF1R抑制剂和DNA烷化化学治疗剂。还已发现miR-7-5p抑制黑色素瘤细胞的迁移和侵袭，从而指示miR-7-5p在预防或抑制黑色素瘤转移中的作用。
一方面，本文描述的本发明提供一种用于治疗表达IGF1R或IGF1R信号传导通路的成分的癌症或肿瘤的协同组合物，所述组合物包含miR-7-5p miRNA、其前体或变体或包含含有序列GGAAGA的种子区的miRNA，以及BRAF抑制剂、IGF1R抑制剂和DNA烷化化学治疗剂中的至少一种。
另一方面，本发明提供一种用于治疗受试者中的表达IGF1R或IGF1R信号传导通路的成分的癌症或肿瘤的方法，所述方法包括向所述受试者施用协同有效量的miR-7-5p miRNA、其前体或变体或包含含有序列GGAAGA的种子区的miRNA，以及选自BRAF抑制剂、IGF1R抑制剂和DNA烷化化学治疗剂的至少一种治疗剂。
另一方面，本发明提供一种用于使表达IGF1R或IGF1R信号传导通路的成分的癌症或肿瘤细胞对选自BRAF抑制剂、IGF1R抑制剂和DNA烷化化学治疗剂的治疗剂敏感的方法，所述方法包括使所述细胞与有效量的miR-7-5p miRNA、其前体或变体或包含含有序列GGAAGA的种子区的miRNA相接触。
另一方面，本发明提供一种用于抑制或预防癌症转移或癌细胞迁移的方法，其中所述癌症表达IGF1R或IGF1R信号传导通路的成分，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的miR-7-5p miRNA、其前体或变体或包含含有序列GGAAGA的种子区的miRNA。
在具体实施方案中，癌症是黑色素瘤。根据本文公开的方面和实施方案待治疗的黑色素瘤可以是任何阶段，包括例如，原位黑色素瘤、侵袭性黑色素瘤、转移性黑色素瘤和弥散性黑色素瘤(IV期转移性黑色素瘤)。类似地，黑色素瘤可以是任何类型，包括例如恶性雀斑样痣、恶性雀斑样痣黑色素瘤、浅表扩散性黑色素瘤、肢端雀斑样痣黑色素瘤、粘膜黑色素瘤、结节性黑色素瘤、息肉状黑色素瘤、促纤维增生性黑色素瘤、无黑色素性黑色素瘤以及软组织黑色素瘤。在具体实施方案中，黑色素瘤是转移性黑色素瘤。
黑色素瘤可包含表达突变体BRAF、NRAS和/或PTEN的细胞。仅作为举例，已经鉴定了与黑色素瘤相关的多种BRAF突变，这类突变包括R461I、I462S、G463E、G463V、G465A、G465E、G465V、G468A、G468E、N580S、E585K、D593V、F594L、G595R、L596V、T598I、V599D、V599E(现在V600E)、V599K、V599R、K600E和A727V。本公开考虑黑色素瘤的治疗，其中可存在任何这些突变，或其中可存在其它BRAF突变、NRAS或PTEN突变。
本文公开的具体实施方案考虑癌症和细胞对BRAF抑制剂、IGF1R抑制剂和DNA烷化化学治疗剂的敏化作用和BRAF抑制剂、IGF1R抑制剂和DNA烷化化学治疗剂的施用。可使癌症和癌细胞对多种抑制剂和化学治疗剂敏化。例如，适合的IGF1R和BRAF抑制剂包括能够阻断、抑制或以另外方式防止IGF1R或BRAF在表达它们的癌细胞中进行其生物功能的任何化合物。通常，BRAF是突变体BRAF并且BRAF抑制剂可以是突变体BRAF特异性抑制剂或突变体BRAF选择性抑制剂。突变体BRAF可包含V600E突变。适合的抑制剂可以是天然存在的或天然来源的分子或可以是合成来源的或产生的，并且可以是例如小分子、抗体(如单克隆抗体)和反义核酸。适合的BRAF抑制剂包括PLX4032(RG7204；威罗菲尼；如)、PLX4720、GDC-0879和甲苯磺酸索拉非尼(Bay 43-9006)。在具体实施方案中，BRAF抑制剂是PLX4032。在具体实施方案中，IGF1R抑制剂是酪氨酸激酶抑制剂，并且可选自苦鬼臼脂素(PPP)和NVP-AEW541。在具体实施方案中，化学治疗剂是替莫唑胺(TMZ；如)。其它适合的BRAF抑制剂、IGF1R抑制剂和DNA烷化剂将是本领域的技术人员已知的，并且熟练技术人员将会理解，本公开的范围不受提及本文公开的具体抑制剂或药剂限制。
本文公开的方面和实施方案所涉及的癌症和癌细胞可以是BRAF抑制剂抗性或BRAF抑制剂敏感性的，或者可以是BRAF抑制剂初试的(即，先前未暴露于BRAF抑制剂的癌症或细胞)。类似地，本文公开的方面和实施方案所涉及的癌症和癌细胞可以是IGF1R抑制剂抗性或IGF1R抑制剂敏感性的，或者可以是IGF1R抑制剂初试的(即，先前未暴露于IGF1R抑制剂的癌症或细胞)。类似地，本文公开的方面和实施方案所涉及癌症和癌细胞可以是对DNA烷化试剂抗性或敏感性的，或可能未曾暴露于这类药剂。
本文公开的方面和实施方案所涉及的对BRAF抑制剂、IGF1R抑制剂或DNA烷化剂抗性的癌症和细胞可以是内在抗性的或可具有获得性抗性。在黑色素瘤的情况下，发展对突变体BRAF的抑制剂的抗性是特定和正在发展的问题。还已知，许多黑色素瘤获得MEK(Ras-Raf-MEK-ERK通路中Raf的分子下游)的突变，特别是对BRAF抑制剂具有获得性抗性的黑色素瘤。因此，本发明的实施方案还考虑癌症和细胞对MEK抑制剂的敏化作用。几种MEK抑制剂目前正在研发中，作为非限制性实例包括AZD6244和ARRY-162。
本发明的方面和实施方案提供miRNA的施用。miRNA结合靶mRNA的3’-UTR并且在此结合中重要的是在miRNA的5’端附近的大约6-7个核苷酸的所谓“种子”区(通常是核苷酸位置2至8)。因此，本发明的实施方案广泛地考虑使细胞或组织接触或向有需要的受试者施用一种或多种miRNA，所述miRNA中的至少一种包含miR-7-5p的种子区。在具体实施方案中，所述种子区包含序列GGAAGA(SEQID NO：5)。
在具体实施方案中，采用miR-7-5p。成熟人miR-7-5p(hsa-miR-7-5p)的核苷酸序列提供在SEQ ID NO：1中。关于miR-7-5p miRNA的另外序列信息可在http：//microrna.sanqer.ac.uk/sequehces/index.shtml找到。与大多数miRNA一样，miR-7-5p是在不同物种之间高度保守的。因此，虽然通常miRNA可来源于待治疗的受试者的物种，或构成与来自所述物种的miRNA相同的序列，但鉴于例如物种之间miRNA序列的高水平的序列保守性，不必是这种情况。
本发明的实施方案还考虑施用miR-7-5p的miRNA变体。变体包括与本文公开的miRNA的序列大致上类似的核苷酸序列。变体包括与本文公开的miRNA的序列大致上类似的核苷酸序列。在一些实施方案中，待施用的变体miRNA包含展示出与人miR-7-5p的序列(SEQID NO：1)至少80％序列同一性的序列。在一些实施方案中，待施用的miRNA包含展示出与SEQ ID NO：1至少90％序列同一性的序列。在其它实施方案中，待施用的miRNA包含展示出与SEQ ID NO：1至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。或者或此外，变体可包含修饰，如在相对于miR-7-5p序列的一个或多个位置处的非天然残基。
还考虑施用miR-7-5p的前体分子或包含含有序列GGAAGA的种子区的miRNA。miRNA是从通常包含从非编码DNA的区域转录的几百个核苷酸的RNA转录物(初始-miRNA)产生。初始-miRNA在细胞核中通过RNA酶III核酸内切酶加工以形成大约70个核苷酸的茎-环前体(前体-miRNA)。前体-miRNA被主动地转运至细胞质中，在细胞质中它们被进一步加工成通常21-23个核苷酸的短RNA双链体，所述双链体中的一个表示功能性miRNA链。本文考虑这类初始-miRNA和前体-miRNA前体的施用，其中所述初始-miRNA和前体-miRNA被裂解并且内细胞化以产生功能性miRNA。本发明考虑的hsa-miR-7-5p的示例性前体包括但不限于hsa-miR-7-5p-1、hsa-miR-7-5p-2或has-miR-7-5p-3，如分别在SEQ ID NO：2至4中所列出。
除了全长miR-7-5p分子，如在SEQ ID NO：1中所示的分子，术语“miR-7-5p”还包括miR-7-5p分子的片段，条件是所述片段是功能性片段。术语miRNA分子的“片段”意指全长分子的一部分。所述片段的大小被限制，仅在于它必须是功能性片段，即能够调节IGF1R或IGF1R信号传导通路的组分的表达并且具有针对如本文所述的表达IGF1R的癌细胞的治疗性效用。通常，所述片段将包含至少种子区序列GGAAGA(SEQ ID NO：5)。
miRNA的施用可以是直接至需要治疗的受试者，或者可离体施用至源自受试者的细胞或组织。待施用的miRNA可以是合成产生的或天然源自细胞来源的。
本发明的实施方案还考虑施用能够刺激或增强本文所述的miRNA的表达或活性的药剂。这类药剂可以是蛋白质、非蛋白质或基于核酸的，并且包括例如能够结合miRNA基因的调控序列以便由此诱导或增强miRNA的内源表达水平的分子和化合物。本领域的技术人员将理解，本发明的范围不限于此，并且能够刺激或增强miRNA表达或活性的任何药剂在本公开的范围内考虑并且落入本公开的范围内。
本发明的实施方案还考虑施用与能够递送miRNA至所需部位的另外药剂连接的miRNA。在一些实施方案中，miRNA与另外药剂之间的连接是可裂解连接。可裂解连接的存在允许miRNA与另外药剂的裂解，例如在内化至表达IGF1R的细胞中之后。
使细胞或癌症与能够刺激或增强miR-7-5p miRNA的表达或活性的miRNA或药剂相接触可通过本领域已知的任何方法来实现。在一些实施方案中，使细胞与miRNA相接触在体内发生。可使miRNA或能够刺激或增强miR-7-5p miRNA的表达或活性的药剂与细胞直接接触，即直接应用于需要对治疗剂敏化的细胞，或可替代地可与细胞间接组合，例如通过将分子注射至受试者的血流中，血流然后将分子携带至需要对治疗剂敏化的细胞。此外，可从受试者除去样品并且在将至少一部分样品返回至受试者之前与miRNA或能够体外刺激或增强miR-7-5p miRNA的表达或活性的药剂组合。例如，样品可以是血液样品，所述血液样品从受试者除去并且在将至少一部分血液注射回至受试者中之前与miRNA组合。
本发明的实施方案还提供用于测定表达IGF1R或IGF1R信号传导通路的成分的癌症或癌细胞对IGF1R抑制剂、BRAF抑制剂或DNA烷化化学治疗剂的敏感性变化的方法。所述方法可包括
(a)向受试者施用miR-7-5p miRNA、其前体或变体或包含含有序列GGAAGA的种子区的miRNA；
(b)测定来自所述受试者的生物样品中对IGF1R抑制剂、BRAF抑制剂或DNA烷化化学治疗剂的敏感性或抗性；
(c)在一段时间内重复步骤(a)和(b)至少一次；以及
(d)比较所述样品中的所述敏感性或抗性。
本发明的实施方案还提供用于评价患有癌症的受试者中治疗方案的功效的方法，其中癌性细胞表达IGF1R或IGF1R信号传导通路的成分。所述方法可包括：
(a)用(i)IGF1R抑制剂、BRAF抑制剂或DNA烷化化学治疗剂与(ii)miR-7-5p miRNA、其前体或变体或包含含有序列GGAAGA的种子区的miRNA治疗所述受试者，持续足以评价所述方案的功效的一段时间；
(b)从所述受试者获得生物样品；
(c)测定所述样品中对IGF1R抑制剂、B-RAF抑制剂或DNA烷化化学治疗剂的敏感性或抗性；
(d)在一段治疗时间内重复步骤(b)和(c)至少一次；以及
(e)测定在所述时间段内所述敏感性或抗性是否变化，
其中所述敏感性或抗性的变化指示所述治疗方案的功效。
可根据本发明的方面和实施方案以药物组合物的形式将miRNA、IGF1R抑制剂、BRAF抑制剂和化学治疗剂抑制剂施用至受试者或与细胞接触，所述组合物可包含适用于体内施用至受试者的一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。在多种药剂待施用的情况下，例如在如本文公开的协同组合中，所述组合中的每种药剂可被配制成单独组合物，或可被共同配制成单一组合物。如果配制在不同组合物中，所述组合物可共同施用。“共同施用”意指在同一制剂中同时施用，或在两种不同制剂中通过相同或不同途径同时施用或通过相同或不同途径顺序施用。“顺序”施用意指在两种组合物的施用之间数秒、数分钟、数小时或数天的时间差。所述组合物可以任何顺序施用，但在具体实施方案中，可能有利的是在IGF1R抑制剂、BRAF抑制剂或DNA烷化化学治疗剂之前施用miRNA。
组合物可通过任何方便或适合的途径施用至有需要的受试者，如通过局部(包括皮肤、经皮、皮下等)、胃肠外(包括例如动脉内、静脉内、肌内、皮下)、口服、鼻、粘膜(包括舌下)或腔内途径。因此组合物可被配制成各种形式，包括溶液、悬浮液、乳液和固体形式，并且通常被配制以便适合于所选择的给药途径，例如作为胶囊、片剂、囊片、酏剂用于口服摄取，呈气雾剂形式适合于通过吸入施用(如通过鼻内吸入或口腔吸入)，软膏、乳膏、凝胶、凝胶剂或洗剂适合于局部施用，或呈可注射制剂适合于胃肠外施用。优选的给药途径将取决于多种因素，包括待治疗的病状和所需结果。
对于任何给定情况最有利的途径可由本领域技术人员确定。例如，在需要适当浓度的所需药剂被直接递送至待治疗的身体部位的情况下，可区域性而不是全身施用。区域性施用提供将非常高局部浓度的所需药剂递送至所需部位的能力，并且因此适用于实现所需治疗或预防作用，同时避免身体的其它器官暴露于所述化合物，并且由此潜在地减少副作用。
为了治疗黑色素瘤，局部施用可在许多情况下是适合和方便的给药途径。
一般来说，适合的组合物可根据本领域的普通技术人员已知的方法进行制备并且可包含药学上可接受的稀释剂、佐剂和/或赋形剂。稀释剂、佐剂和赋形剂在可与组合物的其它成分相容以及不对其接受者有害的意义上必须是“可接受的”。
适于局部施用的组合物可呈任何适合的形式，配制为例如搽剂、洗剂、乳膏、凝胶、软膏或糊剂。药学上可接受的稀释剂的实例是脱矿质或蒸馏水；盐水溶液；基于植物的油，如花生油、红花油、橄榄油、棉子油、玉米油、芝麻油、花生油或椰子油；硅油，包括聚硅氧烷，如聚甲基硅氧烷、聚苯基硅氧烷和聚甲基苯基硅氧烷；挥发性硅酮；矿物油，如液体石蜡、软石蜡或角鲨烷；纤维素衍生物如甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠或羟丙基甲基纤维素；低级烷醇，例如乙醇或异丙醇；低级芳烷醇；低级聚亚烷基二醇或低级亚烷基二醇，例如聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇、丙二醇，1，3-丁二醇或甘油；脂肪酸酯如棕榈酸异丙酯、肉豆蔻酸异丙酯或油酸乙酯；聚乙烯基吡咯烷酮；琼脂；角叉菜胶；黄蓍胶或阿拉伯胶以及凡士林。通常，一种或多种载体将形成1重量％至99.9重量％的组合物。
组合物还可被浸入透皮贴片、石膏和伤口敷料，如绷带或水胶体敷料，优选地呈液体或半液体形式。
为了作为可注射溶液或悬浮液施用，无毒胃肠外可接受的稀释剂或载体可包括林格氏溶液、中链甘油三酯(MCT)、等渗盐水、磷酸盐缓冲盐水、乙醇和1，2丙二醇。用于口服使用的适合的载体、稀释剂、赋形剂和佐剂的一些实例包括花生油、液体石蜡、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、海藻酸钠、阿拉伯胶、黄蓍胶、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、明胶和卵磷脂。此外，这些口服制剂可含有适合的调味剂和着色剂。当以胶囊形式使用时，胶囊可包覆有延迟崩解的化合物如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。
佐剂通常包括软化剂、乳化剂、增稠剂、防腐剂、杀菌剂和缓冲剂。
用于口服施用的固体形式可含有在人和兽医药学实践中可接受的粘合剂、甜味剂、崩解剂、稀释剂、调味剂、包覆剂、防腐剂、润滑剂和/或延时剂。适合的粘合剂包括阿拉伯胶、明胶、玉米淀粉、黄蓍胶、藻酸钠、羧甲基纤维素或聚乙二醇。适合的甜味剂包括蔗糖、乳糖、葡萄糖、阿斯巴甜或糖精。适合的崩解剂包括玉米淀粉、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、瓜尔胶、黄原胶、膨润土、藻酸或琼脂。适合的稀释剂包括乳糖、山梨醇、甘露醇、葡萄糖、高岭土、纤维素、碳酸钙、硅酸钙或磷酸二钙。适合的调味剂包括薄荷油、冬青油、樱桃、橙子或覆盆子调味剂。适合的包覆剂包括丙烯酸和/或甲基丙烯酸和/或其酯的聚合物或共聚物、蜡、脂肪醇、玉米蛋白、虫胶或谷蛋白。适合的防腐剂包括苯甲酸钠、维生素E、α-生育酚、抗坏血酸、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯或亚硫酸氢钠。适合的润滑剂包括硬脂酸镁、硬脂酸、油酸钠、氯化钠或滑石。适合的延时剂包括单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。
除了上述药剂以外，用于口服施用的液体形式还可含有液体载体。适合的液体载体包括水，油如橄榄油、花生油、芝麻油、葵花油、红花油、花生油、椰子油、液体石蜡、乙二醇、丙二醇、聚乙二醇、乙醇、丙醇、异丙醇、甘油、脂肪醇、甘油三酯或其混合物。
用于口服施用的悬浮液还可包括分散剂和/或悬浮剂。适合的悬浮剂包括羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、藻酸钠或鲸蜡醇。适合的分散剂包括卵磷脂，脂肪酸如硬脂酸的聚氧乙烯酯，聚氧乙烯脱水山梨糖醇单-或二-油酸酯、-硬脂酸酯或-月桂酸酯，聚氧乙烯脱水山梨糖醇单-或二-油酸酯、-硬脂酸酯或-月桂酸酯等。
用于口服施用的乳液还可包含一种或多种乳化剂。适合的乳化剂包括如上文例举的分散剂或天然树胶，如瓜尔胶、阿拉伯胶或黄蓍胶。
用于制备可胃肠外施用的组合物的方法对于本领域技术人员来说是清楚的，并且更详细描述于例如Remington′s PharmaceuticalScience，第15版，Mack Publishing Company，Easton，Pa.中，特此以引用的方式并入本文。所述组合物可并入任何适合的表面活性剂如阴离子型、阳离子型或非离子型表面活性剂，如脱水山梨糖醇酯或其聚氧乙烯衍生物。还可包括悬浮剂(如天然树胶、纤维素衍生物)或无机材料(如硅酸盐质硅石)和其它成分(如羊毛脂)。
用于制备药物组合物的方法和药物载体是本领域中熟知的，如在教科书如Remington′s Pharmaceutical Sciences，第20版，Williams&Wilkins，Pennsylvania，USA中所列出。载体将取决于施用途径，并且再次本领域的技术人员将能够容易地确定针对每个具体病例的最适合的制剂。
所述组合物还可以脂质体形式施用。脂质体通常源自磷脂或其它脂质物质，并且通过分散于水性介质中的单层或多层水合液体晶体形成。可使用能够形成脂质体的任何无毒、生理学上可接受和可代谢的脂质。脂质体形式的组合物可含有稳定剂、防腐剂、赋形剂等。优选的脂质是磷脂和磷脂酰胆碱(卵磷脂)，天然的和合成的。用于形成脂质体的方法是本领域中已知的，并且关于此具体参考：Prescott，编辑，Methods in Cell Biology，第XIV卷，Academic Press，New York，N.Y.(1976)，第33页以及下列等等，所述文献的内容以引用的方式并入本文。
在本说明书中对任何现有出版物(或源自其的信息)或对任何已知内容的引用，不被并且不应被认为是认同、承认或任何形式的暗示所述现有出版物(或源自其的信息)或已知内容形成本说明书所涉及致力领域的公知常识的一部分。
现将参考以下具体实施例描述本发明，所述实施例不应被解释为以任何方式限制本发明的范围。
实施例
以下实施例说明本发明并且不应被解释为以任何方式限制贯穿本说明书的描述的本公开的总体性质。
一般方法
化学品和试剂
NVP-AEW541(Cayman Chemical，Ann Arbor，MI)和苦鬼臼脂素(PPP；Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)被制备为二甲亚砜(DMSO)(Sigma-Aldrich；Sydney，Australia)中的10mM储备溶液。替莫唑胺(TMZ；Sigma-Aldrich)和PLX4032(Selleck Chemicals，Houston，TX)分别被制备为DMSO中的50mM和100mM储备溶液。出于实验目的，在添加至细胞培养物之前将药物稀释在新鲜培养基中。将对应于人miR-7-5p的合成miRNA前体分子(前体-miR miRNA前体产品编号：PM10047)(Ambion；Victoria，Australia)和阴性对照miRNA(miR-NC；前体-miR miRNA前体阴性对照#1，产品编号：AM17110)(Ambion)制备为不含RNA酶的水(Ambion)中的50μM储备溶液。在测试miR-7-5p和/或药物的作用的实验中，将媒介物对照细胞培养物用DMSO(代替药物)或Lipofectamine 2000(Invitrogen；Victoria，Australia)(代替miR-7-5p和miR-NC)的等效v/v稀释液进行处理。
细胞系和细胞培养物
WM266-4、A375和SK-MEL-28黑色素瘤细胞是自美国典型培养物保藏所(ATCC)获得。MM96L和A2058黑色素瘤细胞由西澳医学研究所(Westem Australian Institute for Medical Research)(WAIMR)的Peter Klinken教授惠赠。将WM266-4、SK-MEL-28、MM96L和A2058细胞在37℃下在5％CO2中用补充有10％胎牛血清(FBS)的RPMI1640培养基进行培养。IGF1R抑制剂敏感性乳腺癌细胞系(MCF-7)是自ATCC获得并且在37℃下在5％CO2中用补充有10％FBS的RPMI 1640培养基进行培养。稳定地表达Q61 NRAS突变体基因的BRAF抑制剂抗性黑色素瘤细胞A375和WM266-4由彼得·麦卡伦癌症中心(Peter MacCallum Cancer Centre)的Grant McArthur副教授惠赠。1205Lu黑色素瘤细胞由昆士兰大学迪亚曼蒂纳研究所(Universityof Queensland Diamantina Institute)的Nikolas Haas副教授惠赠。
药物敏感性测定
将细胞以2.5×103个细胞/孔的密度接种在96孔板中并且在过夜孵育之后，用一定浓度范围的药物进行处理。在4天之后按照制造商的说明书使用CellTitre 96Aqueous One Solution细胞增殖测定试剂盒(Promega；Sydney，Australia)和FLUOstar OPTIMA酶标仪(BMGLabtech；Victoria，Australia)测量细胞存活力。
miRNA前体和siRNA转染
将最佳细胞数目使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)用miR-7-5p(SEQ ID NO：1；由Ambion合成)或miR-NC前体分子(下文“miR-NC”；AmbionAM17110)以1-30nM范围的最终浓度进行转染。对于siRNA转染，将沉默子选择siRNA(Invitrogen)阴性对照1号(si-NC；4390843)、si-IRS-2#1(s16486)、si-IRS-2#2(s16487)使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)根据制造商的方案进行转染。细胞在24小时之后收获用于RNA提取或在转染之后2-3天收获用于蛋白质提取。
蛋白质提取
用含有细胞质提取物缓冲液(CEB)的PhosSTOP磷酸酶抑制剂(Roche；New South Wales，Australia)和不含EDTA的完全蛋白酶抑制剂(Roche)收获蛋白质。将细胞溶解产物在-80℃下冷冻过夜，通过在13,000×g下离心5分钟澄清并且收集上清液。根据制造商的说明书通过Bio-Rad蛋白质测定(Bio-Rad；New South Wales，Australia)并且使用FLUOstar OPTIMA酶标仪测定总单蛋白质浓度。
蛋白质印迹
将15μg的总蛋白质样品在NuPAGE NOVEX 4％-12％Bis-Tris凝胶(Invitrogen)上进行解析并且转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)蛋白质印迹膜(Roche)。将印迹用Odyssey封闭缓冲液(Millennium Science，Victoria，Australia)封闭1小时并且在4℃下用抗-IGF1R、抗-磷酸基-IGF1R、抗-IRS-1、抗-IRS-2、抗-磷酸基-IRS-2、抗-ERK 1/2、抗-磷酸基-ERK 1/2、抗-Akt、抗-磷酸基-Akt(Ser-473)、抗-PAK1(全部来自Cell Signaling Technology，Beverly，MA)或抗-FAK(Santa CruzBiotechnology)、抗-磷酸基-IRS-2(Ser-731；Abcam，Cambridge，MA)或抗-β-肌动蛋白(Abcam)孵育过夜，接着用红外缀合的第二抗体在室温下孵育1小时。将所述膜用Odyssey SA扫描仪进行扫描以便可视化蛋白质表达(LICOR Biosciences，Lincoln，NE)。
细胞存活力测定
将细胞以2.5×103个细胞/孔的密度接种在96孔板中并且如上用miRNA前体分子转染。在转染后5天使用CellTitre 96Aqueous OneSolution细胞增殖测定试剂盒(MTS测定)和FLUOstar OPTIMA酶标仪测量细胞存活力。对于药物与miR-7-5p之间的协同作用分析，将细胞如上接种并且在用miR-7-5p或miR-NC转染4天之后3天添加药物或DMSO，此时测量细胞存活力(在转染之后7天)。
细胞迁移和侵袭测定
用实时细胞分析仪双板(RTCA DP)xCELLigence系统(RocheApplied Science；Mannheim，Germany)监测细胞迁移和侵入。这种仪器采用细胞迁移板(CIM-板16)，所述板在Boyden-样上部腔室和含有培养基或化学吸引剂的下部腔室的8μm微孔聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)膜的底侧上包括微电子传感器。随着细胞从上部腔室迁移或侵袭至下部腔室，它们与传感器相互作用，从而引起电阻抗的增加。细胞阻抗随时间推移的变化与同传感器相互作用的细胞的数目的变化相关，从而允许将细胞迁移实时测量为细胞指数值。对于迁移测定，将细胞以5×105个细胞/孔的密度接种在6孔板中并且如上以30nM的最终浓度用miRNA前体分子转染。在48小时孵育之后，将细胞进行胰蛋白酶消化、再悬浮于不含血清的培养基中并且接种至CIM-板的上部腔室中。下部腔室填充有含有10％FBS(化学吸引剂)的培养基或作为对照的不含血清的培养基。在24小时时间段内以每15分钟阻抗测量监测迁移。对于侵袭测定，在接种细胞之前大约4小时将CIM-板涂覆Matrigel(BD Biosciences；以1∶20的比例稀释于不含血清的培养基中)。
绕计学
所有结果被呈现为平均值±标准偏差(S.D.)。使用学生t检验(单尾，未配对)计算统计显著性并且显著性水平设定在p＜0.05下。使用GraphPad软件(GraphPad Prism，版本5.04)计算药物敏感性(IC50)。Blissadditivism模型用于协同作用分析。使用公式：Ebliss＝(EA+EB)-(EA×EB)进行计算，其中EA和EB是由在特定浓度下的单独药物A(miR-7-5p)和单独药物B(替莫唑胺、PLX4032、PPP或NVP-AEW541)获得的抑制分数。在此，如果miR-7-5p与药物B的组合是确切相加的，则Ebliss是所预期的抑制分数。如果实验测量的抑制分数大于Ebliss，则组合是协同作用的。
实施例1-miR-7-5p降低IGF1R通路的分子的表达并且消除Akt和ERK信号传导的活化
一组四种转移性黑色素瘤细胞系用于本研究中(SK-MEL-28、WM266-4、MM96L和A2058)，其中三种拥有V600E BRAF突变，一种具有V600D BRAF突变，两种具有PTEN突变并且两种具有p53突变，从而涵盖在黑色素瘤的背景下重要的广谱突变。将这些细胞系用miR-NC或miR-7-5p前体分子以15nM最终浓度瞬时转染。在3天孵育之后，收获蛋白质样品并且通过SDS-PAGE解析，接着针对IGF1R、P-IGF1R、IRS-1、IRS-2、P-IRS-2、Akt、P-Akt、PAK1、ERK1/2、P-ERK 1/2和β-肌动蛋白(上样对照)免疫印迹。四种细胞系的miR-NC泳道之间的比较(图1)显示针对每种细胞系变化的IGF1R信号传导分子的表达和活化，从而反映其不同的突变特征。在SK-MEL-28、MM96L和A2058细胞中检测IGF1R和P-IGF1R。跨细胞系以较低水平检测到IRS-1，其中MM96L具有最高表达。MM96L和A2058细胞具有IRS-2的最高表达；但是在所有细胞系中检测到P-IRS-2。跨所有细胞系以高水平检测到PAK1、Akt和ERK 1/2。P-Akt在PTEN突变体细胞系WM266-4和A2058中最高并且P-ERK 1/2跨细胞系较高，这与由于其BRAF突变体状态所致的ERK通路的组成型活化一致。
接着评估miR-7-5p降低IGF1R信号传导通路分子的表达的能力。如图1中所示，当用miR-7-5p转染每种细胞系时，始终观察到PAK1的蛋白质水平的降低。未检测到IGF1R表达的变化。IGF1R磷酸化对于SK-MEL-28来说未变化，在MM96L中增加并且在A2058中减少。当用miR-7-5p转染时，IRS-1表达跨细胞系变化，从而导致用miR-7-5p转染的SK-MEL-28和WM266-4中的适度增加和A2058中的减少。IRS-2表达和磷酸化分别在A2058和SK-MEL-28中减少。重要地，用miR-7-5p转染下调P-Akt(SK-MEL-28、WM266-4和MM96L)和P-ERK 1/2(A2058)，从而证实miR-7-5p调控这些关键下游信号传导通路的能力。
实施例2-miR-7-5p降低黑色素瘤细胞的存活力
通过miR-7-5p负调控黑色素瘤细胞中的Akt和ERK 1/2活性表明递送miR-7-5p可能在这种疾病中具有治疗效用。为了评价这一点，将黑色素瘤细胞系用miR-7-5p或miR-NC转染，并且通过MTS测定评估对细胞生长的作用。比较miR-NC和miR-7-5p转染的细胞揭示miR-7-5p显著降低MM96L、A2058(图2)、SK-MEL-28和WM266-4细胞中的细胞存活力(数据未示出)。存活力在1nM的最终miR-7-5p浓度下显著降低，从而表明miR-7-5p中的较小增加可对黑色素瘤细胞存活力具有显著影响。
实施例3-miR-7-5p使黑色素瘤细胞系对NVP-AEW541和其它疗法敏感
为了进一步评价miR-7-5p在黑色素瘤中的治疗效用，评价了其与不同疗法协同作用的能力。初始地，针对四种不同治疗建立不同黑色素瘤细胞系的敏感性：IGF1R激酶抑制剂NVP-AEW541和苦鬼臼脂素(PPP)、BRAF突变体抑制剂PLX4032和DNA烷化化学治疗剂替莫唑胺(TMZ)。
与文献一致，拥有p53突变的细胞系是对TMZ治疗高度抗性的并且因此不能检测到精确IC50值，而对于野生型p53细胞系，IC50值对于WM266-4和A2058分别是73.09μM和167.3μM。几种黑色素瘤细胞系被报道是对IGF1R激酶抑制剂PPP敏感性的。与这一点一致，本文使用的黑色素瘤细胞系是对所述抑制剂敏感的，具有0.15-0.3μM的IC50值。令人感兴趣的是，黑色素瘤细胞系是对IGF1R激酶抑制剂NVP-AEW541(IC50值8.27-25.05μM)抗性的，相较于被报道是对此药物敏感性的并且因此被包括作为阳性对照(图3A)的乳腺癌细胞系MCF-7(IC50＝1.5μM)。敏感性的差异可能是由于MCF-7中高水平的IRS-1，IRS-1被报道为对NVP-AEW541的敏感性的决定簇，而通过比较，黑色素瘤细胞系具有较低IRS-1表达和较高IRS-2表达(数据未示出)。还观察到在MCF-7乳腺癌细胞中，NVP-AEW541治疗减弱IGF-1诱导的Akt和ERK 1/2信号传导通路的活化，而在黑色素瘤细胞系中仅Akt活性被消除(数据未示出)。不管IGF1R抑制，ERK 1/2活性的这种持续可能与黑色素瘤细胞系中活化BRAF突变的存在相关。所有黑色素瘤细胞系是对PLX4032高度敏感性的，这是与文献一致的结果，其中IC50值是0.08-0.23μM。
接着将细胞用miR-NC或miR-7-5p转染，并且在3天之后用次最优剂量(低于IC50)的NVP-AEW541、PPP、PLX4032、TMZ或DMSO(媒介物)处理，并且孵育另外4天，之后通过MTS测定评估对细胞存活力的作用。相较于A2058细胞中的miR-NC，miR-7-5p与用NVP-AEW541、PPP、PLX4032或TMZ治疗的组合导致细胞存活力的显著降低(图3B)。对于每种药物，Bliss additivism模型指示所观察到的抑制分数大于所计算的相加抑制，并且因此这些组合是协同作用的。将协同作用分析延伸至其它黑色素瘤细胞系中并且结果在表1中示出。这些结果证明miR-7-5p能够增强现有化学治疗剂的活性。
表1
在EObs/EBliss是＞1的情况下，治疗与miR-7-5p的组合被认为是协同作用的。
实施例4-miR-7-5p抑制黑色素瘤细胞迁移并且阻断几种促迁移分子的表达
为了评估miR-7-5p过度表达对黑色素瘤细胞迁移的作用，将WM266-4和A2058黑色素瘤细胞用miR-NC或miR-7-5p前体转染，并且在48小时之后将细胞收获并且接种至CIM-板中以用于监测在24小时时间段内的细胞迁移。miR-7-5p显著抑制A2058和WM266-4细胞的迁移(图4A并且数据未示出)。
为了验证miR-7-5p对迁移的作用是否可能是由于其下调FAK、IRS-2和/或PAK1，在同时用于迁移测定的每种细胞系中评价这些分子的表达(图4B)。蛋白质印迹指示FAK、IRS-2和PAK1表达在用miR-7-5p转染的WM266-4和A2058细胞两者中的降低，从而表明miR-7-5p在至少部分地通过这些miR-7-5p靶分子介导的黑色素瘤细胞迁移和侵袭中的潜在抑制作用。
进行另一研究以进一步验证和延伸这些发现。简言之，如上所述进行瞬时转染以上调A2058、WM266-4、A375和高度转移性1205Lu黑色素瘤细胞中的miR-7-5p表达，并且xCELLigence系统然后用于实时监测细胞迁移和侵袭。在每种黑色素瘤细胞系中，miR-7-5p过度表达显著降低或甚至阻断，将在20-25小时时间段内的细胞迁移(图5和7A)和侵袭(图6和7B)速率与非靶向阴性对照miRNA(miR-NC)进行比较。TaqMan miRNA RT-qPCR证实了在用miR-7-5p瞬时转染之后每种黑色素瘤细胞系中的显著miR-7-5p过度表达(数据未示出)。
这些结果一起指示miR-7-5p体外抑制黑色素瘤细胞系的迁移和侵袭。
实施例5-胰岛素受体底物-2(IRS-2)是黑色素瘤细胞系中的
miR-7-5p的靶标
在实施例1中描述的研究指示miR-7-5p降低IGFR1R通路中的分子(包括IRS-2)的表达。为了证实这一点，将WM266-4和A2058黑色素瘤细胞系用miR-7-5p或miR-NC转染，并且分别通过RT-qPCR和免疫印迹评估IRS-2mRNA和蛋白质表达。对于每种黑色素瘤细胞系，miR-7-5p降低IRS-2蛋白质的表达以及IRS-2(P-IRS-2)的活性形式(图8A)，并且显著降低IRS-2mRNA的水平(图8B)，从而表明miR-7-5p促进黑色素瘤细胞系中IRS-2mRNA的降解。
实施例6-IRS-2抑制减少Akt信号传导和黑色素瘤细胞迁移
为了确定miR-7-5p体外抑制黑色素瘤细胞迁移和侵袭的能力是否是部分地由于其调控IRS-2表达，进行RNAi试验以敲低WM266-4黑色素瘤细胞中的IRS-2表达。简言之，将WM266-4黑色素瘤细胞用两种可商购的验证的针对IRS-2的siRNA(si-IRS-2#1、si-IRS-2#2)进行转染，并且如上所述评估IRS-2、Akt和ERK 1/2表达以及WM266-4细胞迁移。
当与仅媒介物(LF2000)或非靶向siRNA(si-NC)相比时，用si-IRS-2#1或si-IRS-2#2转染WM266-4黑色素瘤细胞导致IRS-2mRNA(图9A)和蛋白质(图9B)两者表达以及P-IRS-2(图9B)水平的显著降低。令人感兴趣的是，RNAi介导的IRS-2敲低伴随降低的Akt活性(P-Akt；图9B)，Akt是IRS-2和PI3K下游的调控多种致癌过程(包括细胞迁移)的关键效应分子。这种作用与IRS-2在调控PI3K活性中的已确立的作用一致(Shaw，2001)。相比之下，IRS-2RNAi对ERK1/2的活性不存在显著作用(P-ERK1/2；图9B)。
然后如上所述用xCELLigence仪器实时评估用si-IRS-2#1或si-IRS-2#2转染的WM266-4细胞的迁移和侵袭。相对于si-NC，WM266-4细胞的迁移速率在si-IRS-2#1或si-IRS-2#2转染之后降低(图10A和10B)。IRS-2RNAi介导的IRS-2敲低未改变体外WM266-4细胞的侵袭(数据未示出)。这些数据指示miR-7-5p至少部分地通过直接调控IRS-2的表达来抑制转移性黑色素瘤细胞的迁移。
实施例7-miR-7-5p和PLX4032对黑色素瘤细胞协同作用
为了进一步调查miR-7-5p和BRAF抑制剂协同作用的能力，对miR-7-5p与BRAF抑制剂PLX4032的组合对展示对BRAF抑制剂的抗性的黑色素瘤细胞系的作用进行了评估。
简言之，将各自稳定地表达赋予BRAF抑制剂抗性的突变体Q61NRAS基因的黑色素瘤细胞系A375pBp.NRAS或WM266-4pBp.NRAS用合成miR-7-5p或miR-NC前体分子(最终浓度1nM；Ambion；前体-miR-7miRNA前体产品编号：PM 10047；前体-miRmiRNA前体阴性对照#1，产品编号：AM17110)逆转录并且以5×103个细胞/孔接种在96孔组织培养板中。在miRNA转染之后3天，将细胞用DMSO(媒介物)，0.0001、0.001、0.01、0.1、1、2.5、5或10μM PLX4032(Selleck Chem，cat#S1267)处理另外4天，此时根据制造商的说明书通过MTS测定(CellTitre 96Aqueous One Solution细胞增殖测定试剂盒；Promega)评估每个孔中存活细胞的数目。数据相对于DMSO(媒介物)处理的/miR-NC转染的细胞表示并且呈现为平均值±标准偏差(SD)。使用Bliss additivism模型(参见Bliss C，1939)评价miR-7-5p与PLX4032的组合之间的协同作用。如图11A和11B中所示(出于清楚，仅示出0、2.5和5μM PLX4032)，miR-7-5p和PLX4032协同作用来降低A375pBp.NRAS和WM266-4pBp.NRAS细胞两者的存活力。
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Claims (19)

1.一种用于治疗表达IGF1R或IGF1R信号传导通路的成分的癌症或肿瘤的协同组合物，所述组合物包含miR-7-5p miRNA、其前体或变体或包含含有序列GGAAGA的种子区的miRNA，以及BRAF抑制剂、IGF1R抑制剂和DNA烷化化学治疗剂中的至少一种。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述癌症是黑色素瘤。
3.如权利要求1所述的组合物，其中所述黑色素瘤是恶性黑色素瘤。
4.如权利要求2或3所述的组合物，其中所述黑色素瘤包含表达BRAF、NRAS或PTEN中的一个或多个中的突变的细胞。
5.如权利要求1至4中任一项所述的组合物，其中所述miR-7-5pmiRNA是包含SEQ ID NO：1中列出的核苷酸序列的hsa-miR-7-5p。
6.如权利要求1至4中任一项所述的组合物，其中所述miR-7-5pmiRNA前体选自hsa-miR-7-1、hsa-miR-7-2和hsa-miR-7-3，其包含如在SEQ ID No：2至4中的任一项中列出的序列。
7.如权利要求1至6中任一项所述的组合物，其中所述BRAF抑制剂是突变体BRAF特异性抑制剂或突变体BRAF选择性抑制剂。
8.如权利要求7所述的组合物，其中所述突变体BRAF包含V600E突变。
9.如权利要求7所述的组合物，其中所述BRAF抑制剂是PLX4032(威罗菲尼)。
10.如权利要求1至6中任一项所述的组合物，其中所述IGF1R抑制剂是选自苦鬼臼脂素(PPP)和NVP-AEW541的酪氨酸激酶抑制剂。
11.如权利要求1至6中任一项所述的组合物，其中所述化学治疗剂是替莫唑胺(TMZ)。
12.一种用于治疗受试者中的表达IGF1R或IGF1R信号传导通路的成分的癌症或肿瘤的方法，所述方法包括向所述受试者施用协同有效量的miR-7-5p miRNA、其前体或变体或包含含有序列GGAAGA的种子区的miRNA，以及选自BRAF抑制剂、IGF1R抑制剂和DNA烷化化学治疗剂的至少一种治疗剂。
13.如权利要求12所述的方法，其包括向所述受试者施用有效量的如权利要求1至11中任一项所述的组合物。
14.如权利要求12所述的方法，其中施用所述miRNA使得所述癌症易感于低于在不存在所述miRNA的情况下所需的细胞生长抑制或细胞毒性剂量的所述治疗剂的细胞生长抑制或细胞毒性剂量。
15.如权利要求12或14所述的方法，其中在所述治疗剂之前施用所述miRNA。
16.一种用于使表达IGF1R或IGF1R信号传导通路的成分的癌症或肿瘤细胞对选自BRAF抑制剂、IGF1R抑制剂和DNA烷化化学治疗剂的治疗剂敏感的方法，所述方法包括使所述细胞与有效量的miR-7-5p miRNA、其前体或变体或包含含有序列GGAAGA的种子区的miRNA相接触。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述癌症或肿瘤细胞或所述细胞所源自的所述癌症或肿瘤在不存在治疗的情况下展示对所述治疗剂的抗性。
18.如权利要求16或17所述的方法，其中所述敏化使得所述细胞易感于低于在不存在所述miRNA的情况下所需的细胞生长抑制或细胞毒性剂量的所述治疗剂的细胞生长抑制或细胞毒性剂量。
19.一种用于抑制或预防癌症转移或癌细胞迁移的方法，其中所述癌症表达IGF1R或IGF1R信号传导通路的成分，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的miR-7-5p miRNA、其前体或变体或包含含有序列GGAAGA的种子区的miRNA。
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