CN101827601A

CN101827601A - 包含微小rna分子的抗癌组合物

Info

Publication number: CN101827601A
Application number: CN200880019112A
Authority: CN
Inventors: 朴种培; 李承勋; 朴恩庆; 李东熙; 梁喜锡; 刘宪; 金惠镇; 金泰勋; 郭喜镇
Original assignee: National Cancer Center Korea
Current assignee: National Cancer Center Korea
Priority date: 2008-07-18
Filing date: 2008-07-25
Publication date: 2010-09-08
Also published as: US20110124712A1; WO2010008114A1; JP2010533212A; EP2320914A4; EP2320914A1; KR20100009268A; CA2690838A1; KR101043433B1

Abstract

公开了用于治疗包括癌症在内的与低氧诱导的血管生成相关的疾病的抗癌组合物。其包含微小RNA-125核酸分子。还有，提供了抑制血管生成、抑制癌细胞侵袭和转移以及治疗癌症的方法。

Description

包含微小RNA分子的抗癌组合物

【技术领域】

本发明涉及微小RNA125(mir-125)的新的用途。更具体而言，本发明涉及治疗包括癌症在内的与低氧诱导的血管生成相关的疾病的组合物。还有，本发明涉及抑制血管生成和阻抑癌细胞侵袭和转移的方法，所述癌细胞的特征在于微小RNA-125表达水平低。

【背景技术】

微小RNA是一类新发现的极小的调节分子，其似乎控制细胞内许多生物过程。它们由动物和植物细胞中基因组编码并且结合到mRNAs，以调节相应基因的表达(He and Harmon，2004)。有越来越多的证据表明，微小RNA也与许多疾病的发生和进展有关，包括癌症、病毒感染、心脏病、神经病等。因此，在临床应用中已经作出了许多努力来使用微小RNA。例如，基于微小RNA-122刺激肝炎病毒的公开(Science 309，1577～1781；2005)，Santaris Pharma最近已经开发出锁定核酸(LNA)，其为肝特异性微小RNA-122的拮抗剂，已知其降低血液胆固醇水平和阻滞丙型肝炎病毒(HCV)(Nature 452，896-900；2008)。

一般而言，癌细胞比内皮细胞增殖快，血管内皮形成血管内衬(lining)。随着癌细胞快速地生长，肿瘤组织新形成的血管在其中分布不足，因此不能供给肿瘤组织足够的血液。这种对癌细胞血液供应不足引起肿瘤组织中营养和氧缺乏和肿瘤组织的酸化。事实上，在正常组织中测得的氧分压具有从40至60mmHg的中值，但在实体癌中大部分为10mmHg或更低的中值(Brown JM，Cancer Res 59，5863-5870，1999)。在癌组织内的这种低含氧量的条件下，已经发现癌细胞产生用于供应它们生存和增殖所必需的营养和氧的蛋白质。在本上下文中，低氧诱导的蛋白质包括血管内皮细胞生长因子(VEGF)、EPO(促红细胞生成素)、糖酵解酶等。

相应地，VEGF——负责癌细胞血管生成的代表性的激素蛋白——的调节可能导致癌转移的抑制。特别是对于实体癌，已知化学治疗或放射治疗没有效，这是因为肿瘤内部含氧量低。因此，对靶向特异性调节因子的基因治疗存在需求。

另外，防止癌症侵袭和转移到其它组织中以及抑制癌本身的生长在癌症治疗中是重要的。特别是，大部分的脑癌病例由于侵袭而再发，手术对其治疗是无效的，以及它们用化学治疗或放射治疗被有限地治疗。因此，抑制侵袭对于脑癌的治疗是必需的。

如果开发，则能够在含氧量低的条件下调节癌细胞中血管生成的遗传因子可以作为治疗效果用于各种癌症的治疗中，所述各种癌症由于预后难以用手术、化学治疗和放射治疗来治疗。

导入本发明，本发明人使用微阵技术在含氧量低的条件下在正常细胞和各种癌细胞之间测定微小RNA，对在含氧量低的条件下有活性的抗血管生成因子进行了深入和透彻的研究，结果发现微小RNA-125的表达在含氧量低的癌细胞中被特异性地降低以及通过在低氧状态下调节VEGF分泌而充当抗血管生成因子。

【发明内容】

【技术问题】

因此，本发明的一个目的是提供包含微小RNA-125核酸分子的抗癌组合物。

本发明的另一个目的是提供用于治疗与低氧诱导的血管生成相关的疾病的组合物，其包含微小RNA-125核酸。

本发明的进一步的目的是提供脑癌和脑肿瘤诊断的标记组合物，其包含测量微小RNA-125表达水平的药剂。

本发明的仍旧进一步的目的是提供抑制低氧诱导的血管生成的方法，其包括使用微小RNA-125核酸分子。

本发明的仍旧另一个目的是提供抑制癌细胞侵袭和转移的方法，其包括使用微小RNA-125核酸分子。

还有，本发明的另一个目的是提供治疗与低氧诱导的血管生成相关的疾病，特别是癌症的方法，其包括使用微小RNA-125核酸分子。

【技术方案】

根据其一个方面，本发明涉及抗癌组合物，其包含微小RNA-125核酸分子。

如本文所用，术语“微小RNA-125核酸分子”含义是组成微小RNA-125的单链或双链核酸分子。在整个说明书中，‘微小RNA-125’与‘mir-125’可交替使用。

一般来说，微小RNA由染色体上的内含子编码并且转录为初级转录物，所述初级转录物然后在细胞核中被Drosha加工成较短的结构，已知为前体微小RNA(前miRNA)。在核输出蛋白的调节下核输出之后，这些前miRNA在细胞质中通过与Dicer相互作用被进一步加工成成熟的、约22bp长的miRNA，所述Dicer与进行基因沉默功能的RNA干扰沉默复合体(RISC)相关(Nat Rev Mol Cell Biol 6，376-385；2005)。

微小RNA-125(mir125)是多种微小RNA的家族，包括mir125a、125b1和125b2，它们共享相同的种子序列。mir-125作为其同系物，已知为lin-4，首次在线虫(C.elegans)中被发现以及Lagos-Quintana在2002年描述了小鼠同系物。针对人mir-125，Lee等在2005年报道了，miR125b1位于染色体11q24.1上功能未知的基因的外显子区以及miR125b2位于染色体21q21.1上基因的内含子区。Gross等于2007年在染色体19q13.4上发现了miR125a(参见图6)。

用于本发明的是源自人和非人动物的微小RNA-125同系物，非人动物包括猴子、猪、马、牛、羊、狗、猫、鼠、兔等等。优选的实例包括人微小RNA-125a、微小RNA-125b1和微小RNA-125b2，但不限于这些。

根据本发明的微小RNA-125核酸分子的长度范围可以从18至100nt(核苷酸)以及可以是成熟的微小RNA-125，长度优选从19至25nt以及更优选从21至23nt。可选地，本发明的微小RNA-125核酸分子可以作为前体微小RNA-125分子提供，所述前体微小RNA-125分子的长度从50至100nt以及优选从65至95nt。成熟的和前体微小RNA-125分子的核苷酸序列可以通过参考如下公开地获得：美国国立卫生研究院(NIH)的数据库，GenBank mir125a(406910)、mir125b1(406911)、mir125b2(406912)和参考miRBASE(http://microRNA.sanger.ac.uk/)，例如，mir125a(前体形式的登录号MI0000469(ID：hsa-mir-125a)，以及成熟形式的登录号MIMAT0000443(ID：hsa-miR-125a-5p，SEQ ID NO.1)和MIMAT0004602(ID：hsa-miR-125a-3p，SEQ ID NO.2))、mir125b1(前体形式的登录号MI0000446(ID：hsa-mir-125b-1)，以及成熟形式的登录号MIMAT0000423(ID：hsa-miR-125b，SEQ ID NO.3)和MIMAT0004592(ID：hsa-miR-125b-1，SEQ ID NO.4))以及mir125b2(前体形式的登录号MI0000470(ID：hsa-mir-125b-2)，以及成熟形式的登录号MIMAT0000423(ID：hsa-miR-125b，SEQ ID NO.3)和MIMAT0004603(ID：hsa-miR-125b-2，SEQ ID NO.5))(图6)。应该知道，本发明的微小RNA-125核酸分子包括组成型核酸分子的功能等同物，即，变体，其显示与完整微小RNA-125核酸分子相同的功能——尽管它们通过一些核苷酸残基的缺失、置换或插入而突变。

进一步，本发明的微小RNA-125核酸分子可以以单链或双链形式存在。成熟的微小RNA分子主要是呈单链形式，而前体微小RNA是部分自互补的，以形成双链结构(例如，茎环结构)。在可选的实施方式中，本发明的核酸分子可以是RNA、DNA、PNA(肽核酸)或LNA(锁定核酸)的形式。

本发明的核酸分子可以使用例如化学合成或重组技术的标准分子生物学技术分离或制备，或者可以商业获得。

除微小RNA-125(mir-125)核酸分子之外，本发明的抗癌组合物可以包含能够提高细胞中微小RNA-125表达的物质，诸如合成的或天然的化合物或蛋白质等。

如本文所用，术语“抗癌”拟含义是在癌症的治疗和预防中抑制癌细胞生长、杀死癌细胞、和/或阻抑或压制癌细胞转移。本文中，术语“癌症的预防”拟指通过给予组合物导致阻抑癌发生或延迟癌症的任意作用。如本文所用，术语“癌症的治疗”拟指通过给予组合物导致癌症症状改善或癌症状态的有益改变的任意作用。

因为它们在低氧条件中抑制血管生成，所以本发明的微小RNA-125核酸分子具有抗癌活性。在低氧状态下抑制血管生成是由于血管内皮细胞生长因子(VEGF)分泌的阻抑。

如本文所用，术语“含氧量低的条件”或“低氧”拟指细胞或组织氧水平低于生理上可接受的水平，例如，正常细胞或组织活性所必需的最佳氧水平。

一般而言，癌细胞以高于邻近血管内皮细胞的速度增殖，因此遭受营养和氧的缺乏和酸化，这是因为它们血液供应不足。因此，肿瘤组织表达蛋白质，所述蛋白质的功能为它们生存和增殖供应必需的营养和氧。VEGF是这些分泌的蛋白质的代表。

由于阻抑低氧诱导的VEGF(血管内皮细胞生长因子)分泌，本发明的微小RNA-125核酸分子可以抑制VEGF介导的血管生成。具体而言，本发明的微小RNA-125核酸分子阻抑由PTEN(第10号染色体上缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物)失活所诱导的VEGF表达，从而导致血管生成的抑制。

另外，本发明的微小RNA-125核酸分子通过阻抑癌细胞的侵袭和转移显示抗癌活性。如本文所用，术语“癌细胞的转移”含义是癌细胞从原发肿瘤迁移至远处的组织或器官。在转移中，癌细胞渗入邻近的组织中并且进入到血管中，这通常被称为侵袭。然后，癌细胞通过血流循环以及驻留在身体其它部位的正常组织中生长。因此，侵袭与癌细胞的转移和迁移密切相关。本发明的微小RNA-125核酸分子具体阻抑癌细胞的侵袭，从而也防止癌细胞转移和增殖。

本发明所述的抗癌组合物可用于治疗任意癌症——只要其发病与微小RNA-125的异常表达相关——例如，癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病。优选地，本发明的抗癌组合物可以治疗上应用的癌症的实例包括脑癌、宫颈癌、乳腺癌、膀胱癌、肝癌、前列腺癌和成神经细胞瘤。具体而言，本发明的抗癌组合物用于预防和治疗微小RNA-125表达水平低的癌症，以及这些优选治疗的具有低微小RNA-125水平的癌症如下列表1中所列出，以及更优选脑癌，但不限于这些。如本文所用，术语“脑癌”拟含义是在脑中出现的所有癌组织，包括脑肿瘤。表1

根据其另一个方面，本发明涉及治疗与低氧诱导的血管生成相关的疾病的组合物，其包含微小RNA-125核酸分子。

由于在含氧量低的条件通过阻抑VEGF分泌而对血管生成具有抑制活性，本发明的微小RNA-125核酸分子可以用作与低氧诱导的血管生成相关的疾病的治疗剂。本发明的微小RNA-125核酸分子可以应用的与血管生成相关的疾病的实例包括癌、血管瘤、血管纤维瘤、动脉硬化、血管粘附、硬皮病、新生血管性青光眼、糖尿病视网膜病、新生血管性角膜病、关节炎、牛皮癣、毛细血管扩张、化脓性肉芽肿和阿尔茨海默病，但不限于这些。优选地，将组合物用于具有低微小RNA-125表达水平的病灶组织。

在本发明的实践中，本发明人使用微阵技术分析了在含氧量低的条件下正常细胞和各种癌细胞中微小RNA水平以及考查了降低微小RNA水平对癌细胞中低氧诱导的VEGF表达的影响，结果发现微小RNA-125(mir-125a和mir-125b)在含氧量低的条件下降低VEGF分泌水平(图1和2)。另外，考查了调节选择的微小RNA-125的细胞机制。

在含氧量低的条件下，微小RNA-125或PTEN而不是HIF-1调节VEGF分泌。还有，当在常氧和低氧中HIF-1抑制或PTEN表达被诱导时，观察到在低氧中微小RNA-125的表达由PTEN而不是HIF-1进行调节(图3)。

另外，发现在含氧量低的条件下PTEN的调节导致VEGF水平明显增加，以及当用微小RNA-125处理时，测得低氧中的细胞将增加的VEGF水平降至正常水平(图3)，这共同表明微小RNA-125可以阻抑PTEN失活所诱导的血管生成。

微小RNA-125的抗癌活性在对宫颈癌细胞以及脑癌细胞侵袭的抑制活性方面也得到了证实(图4和8)。

也对微小RNA-125进行抗癌活性体内测定。移植有微小RNA-125表达细胞系的小鼠比未移植的对照小鼠存活得更长并且体重没有减轻(图5)。

因此，在含氧量低的脑癌细胞中PTEN的失活使微小RNA-125表达水平降低，从而使VEGF表达免受微小RNA-125的阻滞，这导致血管生成增加。因此，微小RNA-125作为遏制脑癌发病中的重要因素发挥作用。其升高的表达水平阻抑癌细胞的低氧诱导的血管生成，从而限制癌症侵袭和转移。

根据本发明的实施方式，抗癌组合物包含运载微小RNA-125(mir-125)的表达载体。

可以使用DEAE-葡聚糖-、核蛋白-或脂质体-介导的DNA转染将本发明的微小RNA-125核酸分子导入细胞中。就这一点而言，微小RNA-125核酸分子可以锚在运载体(carrier)上，所述运载体允许将核酸分子有效输送进入细胞中。优选地，运载体是载体——不论病毒或非病毒。用于本发明的病毒载体的实例包括源自慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、疱疹病毒和禽痘病毒的载体，优选源自慢病毒，但不限于这些。慢病毒——一种逆转录病毒——可以有效地感染分裂细胞和非分裂细胞，这是因为其预整合复合物(病毒“壳”)可以穿过核孔或使目标细胞的完整核膜。

在优选的实施方式中，运载微小RNA-125核酸分子的载体进一步锚定在其中的选择标记物。如本文所用，术语“选择标记物”拟含义是容易选择导入微小RNA-125核酸分子的细胞的标记物。对标记物没有给予具体的限制——只要其能够使载体的导入容易被检测或测量。通常，标记物赋予转化体以选择性表型，诸如药物抗性、营养缺陷型、对细胞毒性剂的抗性、或表面蛋白表达。标记物的实例包括绿色荧光蛋白(GFP)、嘌呤霉素、新霉素(Neo)、潮霉素(Hyg)、组胺醇脱氢酶基因(hisD)和鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Gpt)，优选GFP和嘌呤霉素。

根据本发明的另一个实施方式，抗癌组合物包含细胞，该细胞中导入了微小RNA-125(mir-125)核酸分子。

如本文所用，术语“导入”拟含义是将外源DNA通过转染或转导输送进入细胞。转染可以使用本领域中周知的各种方法实施，包括磷酸钙-DNA共沉淀、DEAE-葡聚糖-介导的转染、聚凝胺(polybrene)-介导的转染、电穿孔、显微注射、脂质体融合、脂质转染胺试剂转染和原生质体融合。转导指外源DNA在感染的基础上经由病毒或病毒载体转移到另一个细胞的过程。

当移植进入癌组织时，由于微小RNA-125的高表达水平，具有导入其中的微小RNA-125核酸分子的细胞可以阻抑癌症的侵袭和转移。因此，包含微小RNA-125核酸分子所导入的细胞的组合物可以用作癌症的治疗剂。

在实施方式中，包含本发明所述的微小RNA-125核酸分子的抗癌组合物可以进一步包含药学上可接受的载体以及用药学上可接受的载体配制。如本文所用，术语“药学上可接受的载体(vehicle)”拟指运载体或稀释剂，其不破坏成分的药学活性和性质以及不刺激待被处理的对象。为了用于本发明组合物的液体配制物，药学上可接受的运载体优选适于灭菌和活体。本发明的活性成分可以用选自下列的一种进行配制：盐水、无菌水、林格氏液、缓冲盐水、白蛋白注射液、葡萄糖溶液、麦芽糖溶液、甘油、乙醇及其组合，以及如果需要，结合其它传统的添加剂，包括抗氧化剂、缓冲剂、制菌剂等。可选地，本发明的组合物可以用稀释剂、分散剂、表面活性剂、黏合剂和/或润滑剂配制成注射剂、丸剂、胶囊、颗粒剂或片剂。

本发明所述的包含微小RNA-125核酸分子和药学上可接受的载体的抗癌组合物可以配制成任意剂型——不论口服或非口服。本发明所述的药物配制物可以经下列途径给药：口服、直肠、经鼻、局部(包括推注(bolus)和舌下)、透皮、阴道或肠胃外(包括肌内、皮下、静脉内)途径或通过吸入或吹入。

用本发明的组合物配制的口服剂型的实例包括片剂、锭剂(troches)、锭剂(lozenges)、水溶性或油性悬浮液、粉末、颗粒、乳状液、硬或软胶囊、糖浆或酏剂。对于片剂或胶囊配制物，有用的是添加剂，包括黏合剂，诸如乳糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、支链淀粉、纤维素或明胶；赋形剂，诸如磷酸二钙；崩解剂，诸如玉米淀粉或甘薯淀粉；以及润滑剂，诸如硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酰富马酸钠或聚乙二醇。除这些添加剂外，对于胶囊配制物，也可以使用液体运载体，诸如脂肪油。

为了用于肠胃外给药，本发明的组合物可以配制成经由皮下、静脉内或肌肉途径的注射剂，栓剂，或经由吸入的喷雾剂，诸如气雾剂。注射剂可以通过这样的方式进行制备：将本发明的组合物与稳定剂或缓冲剂在水中混合，以得到溶液或悬浮液，所述溶液或悬浮液以单位剂量被包装，诸如安瓿或小瓶。对于栓剂，本发明的组合物可以用传统的基质诸如可可脂或甘油酯，或灌肠剂进行配制。呈水分散浓缩物或湿粉末形式的本发明的组合物可以用抛射剂进行配制，以制备气雾喷雾剂。

根据其另一个方面，本发明涉及治疗癌症的方法，所述癌症的特征在于低微小RNA-125表达水平，所述方法包括给予包含微小RNA-125核酸分子的抗癌组合物。

如本文所用，术语“给药、给予或施用”拟含义是使用任意适合的方法将本发明的药物组合物导入到对象，例如，使用病毒或非病毒技术输送微小RNA-125核酸分子或移植表达微小RNA-125的细胞。只要其确保使本发明的组合物到达感兴趣的组织，可以采用任意途径给药。例如，本发明的组合物可以口服、经直肠、局部、静脉内、腹膜内、肌肉内、动脉内、透皮、鼻内、胸内、眼内或皮内给药。优选地，本发明的抗癌组合物可以局部给药于癌症组织中。

本发明的治疗方法包括以药学有效量给于本发明的抗癌组合物。适合的总日剂量可以由主治医师在合理的医学判断范围内确定，这对本领域技术人员而言是明显的。任意具体患者的具体治疗有效剂量水平可以根据许多因素而变化，包括期望的反应的种类和程度、具体的组合物，包括根据拟用途任意其它药剂的使用、患者的年龄、体重、总体健康状态、性别和饮食、给药时间、给药途径，以及组合物的排泄速率；治疗持续时间；与具体组合物联合或同时使用的其它药物；以及医学领域中周知的类似因素。相应地，适于本发明目的的抗癌组合物的有效量优选充分考虑上述因素进行确定。在一些情况下，本发明的抗癌组合物也可以结合周知的抗癌剂给药，以提供增加的抗癌效果。

进一步，本发明所述的治疗方法可以应用于遭受癌症的任意动物，所述癌症的特征在于微小RNA-125表达水平低。动物的实例包括牛、猪、羊、马、狗和猫以及人和灵长类动物。

根据其另一个方面，本发明涉及使用微小RNA-125核酸分子阻抑癌细胞侵袭和转移的方法。

根据其另一个方面，本发明涉及抑制低氧诱导的血管生成的方法。当在癌细胞中表达时，本发明的微小RNA-125核酸分子可以阻抑VEGF(血管内皮细胞生长因子)的分泌，以抑制其中的血管生成，从而导致抑制癌细胞侵袭和转移。具体而言，本发明的微小RNA-125核酸分子有效抑制由PTEN(第10号染色体上缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物)失活所诱导的血管生成，而不抑制由HIF-1在低氧诱导的血管生成，这表明PTEN调节细胞中微小RNA-125的表达。因此，当在低氧中PTEN的表达增加时，微小RNA-125的表达也增加，阻抑血管生成，从而预防癌细胞的侵袭和转移。

为了用本发明的微小RNA-125核酸分子治疗癌细胞，可以使用病毒或非病毒输送系统。病毒输送系统的实例包括源自慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、疱疹病毒和禽痘病毒的载体，但不限于这些。用于非病毒输送系统的是脂质介导的转染、脂质体、免疫脂质体、脂转染剂、阴离子表面两亲物，以及其组合。

根据其另一个方面，本发明涉及用于诊断脑癌和脑肿瘤的标记组合物，其包含用于测量微小RNA-125表达水平的药剂和包含微小RNA-125的诊断试剂盒。

如本文所用，术语“用于测量微小RNA-125表达水平的药剂”拟指与微小RNA-125反应以测定微小RNA-125表达水平的分子。作为测量微小RNA-125表达水平的药剂，引物或探针特异性微小RNA-125是有用的。微小RNA-125的表达水平可以使用引物进行PCR或探针杂交测定。基于标记组合物的诊断试剂盒可以包含已知在检测中有用的各种工具和试剂，诸如适合的运载体、可检测的产生信号的标记、增溶剂、清洁剂、缓冲剂、稳定剂等。

根据其另一个方面，本发明涉及使用本发明的微小RNA-125核酸分子筛选治疗脑癌或脑肿瘤化合物的方法。其包括用调节微小RNA-125(mir-125)的候选物处理脑癌或肿瘤细胞；以及在含氧量低的条件下测量微小RNA-125表达水平。在用治疗候选物处理脑癌或肿瘤细胞后，测量细胞中微小RNA-125表达水平，以便选择诱导微小RNA-125表达水平增加的化合物，用于治疗微小RNA-125介导的癌症。

【有利效果】

由于显示出通过阻抑癌细胞中低氧诱导的VEGF分泌抑制血管生成的能力，包含本发明所述的微小RNA-125核酸分子的抗癌组合物有效地抑制癌细胞的侵袭和转移以及用作各种癌症的基因治疗。

【附图说明】

图1显示在低氧和常氧中微小RNA表达图谱的微阵测定。A)为说明选择对低氧特异性的微小RNA的示意性图。从脑癌细胞的星形胶质细胞分离微小RNA，所述脑癌细胞已经在正常的和含氧量低的状态下进行了培养，接着比较微小RNA。B)为显示在各种脑癌细胞系中微小RNA的表达图谱的微阵测定结果。

图2是显示在常氧和含氧量低的条件下在各种微小RNA存在的情况下VEGF分泌水平的图。

图3提供说明细胞中miRNA125的控制机制的各种结果。A)为对于HIF-1在siRNA存在的情况下VEGF的分泌水平，B)为对于HIF-1在siRNA存在的情况下miRNA125的表达水平，C)为显示在siHIF和mir-125a存在的情况下HIF-1蛋白表达图谱的蛋白质印迹，D)为在PTEN失活后低氧中VEGF的表达图谱，E)为在单独用PTEN和结合微小RNA-125拮抗剂处理的PTEN失活的细胞中VEGF的分泌水平。

图4以图表和照片显示mir125对脑癌细胞侵袭的抑制活性。

图5显示在植入有表达mir125的细胞的小鼠中mir125的抗癌效果的实验数据。A)为小鼠模型，B)为说明将脑癌细胞注入脑中的过程的示意图，C)为当用表达mir125的细胞处理时脑癌诱导的小鼠的存活，D)为当用表达mir125的细胞处理时脑癌诱导的小鼠的体重。

图6显示前体mir125和成熟mir125基因组上的核苷酸序列和位置。miR-125在人基因组上的核苷酸序列和位置指NCBI基因ID号mir125a(406910)、mir125b1(406911)和mir125b2(406912)，以及miRBASE(http://microRNA.sanger.ac.uk/)登录号mir125a(MI0000469)、mir125b1(MI0000446)和mir125b2(MI0000470)。

图7是显示用于表达微小RNA-125的慢病毒的结构的示意图。

图8以照片和柱状图显示mir125对宫颈癌细胞系HeLa的侵袭的抑制活性。

【具体实施方式】

本发明的更好的理解可以通过下列实施例获得，所述实施例被提出，以说明而不被解释为限制本发明。

实施例1：细胞培养

在具有5％CO₂/21％O₂大气的培养箱中，在添加有10％FBS(胎牛血清)的DMEM/高葡萄糖(4500mg/L)培养基(Hyclone)中，培养正常的初级星形胶质细胞和各种脑肿瘤细胞(LN-18(CRL-2610)、U-87MG(HTB-14)、LN-229(CRL-2611)、U251、U373和LN428)。为了在含氧量低的条件下温育，将氧浓度降至1％。源自宫颈癌细胞的HeLa细胞系也以相同的方式培养。

实施例2：瞬时转染

使用Cell Line Nucleofector试剂盒T溶液(Amaxa)通过电穿孔将miRNA(微小RNA)、siRNA和运输感兴趣的基因的载体转染入细胞中。为了该目的，首先，使用血细胞计数器对细胞进行计数并且将其以1.5×10⁶个细胞/管的群落等份分入1.5mLE管中，接着以1000rpm离心3min，收获细胞。用DPBS将它们洗涤1次并且与100μl的T溶液以及2μg DNA或100nM siRNA或微小RNA混合，然后使用Amaxa电穿孔仪进行电穿孔。电穿孔后立即将细胞与1ml添加有10％FBS的DMEM混合，转移入100mm培养皿中并且添加10ml培养基。然后，在下一个实验前，将所述培养基在细胞培养箱中温育48hrs。

实施例3：通过微阵测定比较微小RNA表达方式

进行微阵测定，以比较在含氧量低或含氧量正常的条件下各种细胞系中微小RNA表达方式(图1)。在常氧或低氧(1％O₂)中温育24hrs后，用Triozol(Invitrogen)使正常星形胶质脑细胞和各种脑肿瘤细胞进行RNA分离。由E-biogen Inc.使用Agilent Microarray(Agilent technology，USA)在各自的条件下对所分离的RNA进行miRNA表达水平分析。

实施例4：各种微小RNA调节低氧诱导的VEGF分泌

从Ambion，U.S.A订购miRNA，所述miRNA被发现在低氧和常氧之间表达水平改变，如实施例3的微阵所测定。通过电穿孔(电穿孔仪，Amaxa)将它们转染入脑癌细胞系U373中，温育48hrs，以及然后在常氧和低氧下再温育24hrs。获得培养基上清液并且使用ELISA测定VEGF分泌水平。

对于VEGF ELISA测定，使用人VEGF QuantiGlo ELISA Kit(R&D Systems)。详细地，以150μl的量向试剂盒的每个孔加入AssayDiluent，以及50μl标准溶液和50μl培养基样品，以测定其VEGF水平，并且在室温下振荡温育2hrs。从每个孔抽吸所述液体，然后将每个孔洗涤四次。向每个孔加入200μl偶联物(conjugator)，并且室温下振荡温育3hrs。再次抽吸液体，然后洗涤四次。在不存在光的情况下用100μl Working Glo Reagent将每个孔温育20min。为此，将其用箔包裹并在黑暗的房间内温育。在反应完成后，使用发光计测定VEGF水平。

在考查各种微小RNA在常氧和低氧中对VEGF分泌的影响后，发现mir-125a和mir-125b均抑制低氧诱导的VEGF分泌(图2)。

实施例5：慢病毒的产生和表达微小RNA的细胞系的构建

构建这样的载体，所述载体运输微小RNA125a和125b并且允许产生具有图7结构的慢病毒。结合ViraPower^TM Packaging Mix(9μg，Invitrogen)使用所形成的载体(3μg)，以产生病毒，ViraPower^TMPackaging Mix包含pLP/VSVG、pLP1和pLP2，每个均编码病毒结构蛋白。为了用作产生病毒的宿主，在根据制造商的方案制备的适合的培养基中培养293FT细胞。根据制造商的方案用Fugene6(Roche)进行转染。将转染的293FT细胞进一步培养48hrs以及从培养基上清液收集子代病毒。

利用锚在载体的GFP通过FACS测定病毒效价。为此，将收集的病毒从10^-1连续稀释到10^-9，以每孔1ml的量加入到之前等份分入6孔板的U373细胞。在加入后48小时，用胰蛋白酶-EDTA分离细胞并且用DPBS洗涤。在它们中，使用FACS对表达GFP的细胞进行计数并且将其用于以其百分比测定病毒效价。用有效价的病毒以10TU(转导单位)/细胞的MOI感染U373细胞，以构建分别转录miR-125a和miR-125b的U373细胞系。

实施例6：考查微小RNA-125的调控机制

为了确定细胞中控制微小RNA-125的机制，考查了转录因子HIF-1(低氧诱导因子1)和肿瘤抑制基因PTEN——两者已知均在VEGF表达中起重要作用——与微小RNA-125的关系。为了用作微小RNA拮抗剂来研究miRNA功能，核苷酸被设计成特异性地结合到细胞中的miRNA。对于本实验，微小RNA拮抗剂购自Dharmacon。实施例5所述的慢病毒载体用作miRNA 125表达载体。miRNA和siRNA均以100nM的浓度使用，以分别感染入细胞中。

为了考查HIF-1抑制、PTEN表达和微小RNA-125表达对血管生成的控制，通过电穿孔用siHIF-1、siHIF-2、PTEN和mir-125a分别转染U373细胞并且培养48hrs。将转染的细胞在常氧和低氧中再温育24hrs之后，使用ELISA试剂盒(R&D System)测定细胞培养基上清液的VEGF分泌水平(图3A)。

从图3A的数据明显看出，当siHIF-1在低氧中抑制HIF-1时或当PTEN或微小RNA-125被表达时，VEGF分泌被阻抑。明显地，微小RNA-125或PTEN表达导致VEGF分泌的抑制程度比HIF-1活性抑制高。

考查了在常氧和低氧中HIF-1抑制或PTEN表达对微小RNA-125表达的影响。为了该目的，通过电穿孔用siHIF、PTEN和mir-125a分别转染U373细胞并且培养48hrs。在常氧和低氧中再温育24hrs后，用Trizol(Invitrogen，USA)使细胞经受RNA分离。将所获得的RNA通过实时PCR扩增，以测定在每个条件下mir-125a表达水平(图3B)。

如在图3B的图表中所理解，PTEN表达而不是HIF-1抑制增加了低氧中微小RNA-125表达水平，这表明微小RNA-125表达可以由PTEN表达控制。

另外，通过蛋白质印迹测定考查了siHIF和mir-125a对HIF-1翻译的影响。在用siHIF和mir-125a分别电穿孔后，将U373细胞在常氧中温育48hrs，然后再在常氧和低氧中温育24hrs。从细胞中分离蛋白质并使用蛋白质印迹法测定HIF-1a表达水平。如在图3c的表达图谱中所见，siHIF-1a极大地诱导了HIF-1a表达。

在低氧中，也考查了VEGF表达图谱——当调节PTEN时以及当过量表达微小RNA-125同时调节PTEN时。更详细地，用表达siPTEN的慢病毒感染以使其中的PTEN失活后，再用mir-125a或mir-125b慢病毒感染LN229细胞，以构建稳定的细胞系，所述细胞系分别表达mir-125a和mir-125b。使用ELISA试剂盒，在细胞中测量VEGF表达水平，在所述细胞中，PTEN被调节成失活以及mir-125a或mir-125b被过量表达同时PTEN失活(图3D)。

如图3D中所见，在含氧量低的条件下，PTEN调节引起VEGF表达水平增加，以致在培养基中检测到VEGF分泌水平增加。还有，观察到在细胞——其中PTEN调节增加了VEGF表达——中微小RNA-125的过量表达降低了升高的VEGF表达水平，这表明微小RNA-125可以调节PTEN失活所引起的血管生成。

另外，考查了PTEN抑制VEGF分泌是否由微小RNA-125在低氧中调节。为此，当将PTEN加入到它们中时从PTEN调节的细胞测量VEGF分泌。另一方面，当结合微小RNA-125antagomirs(通过化学方法合成的寡核苷酸)、抗125a或抗125b用PTEN处理细胞时，比较分泌的VEGF浓度(图3E)。例如，通过电穿孔用PTEN转染U373细胞系——其中PTEN通过突变而失活——之后，测量VEGF分泌到培养基中的浓度。还有，在结合mir-125a和mir-125b的拮抗剂将PTEN导入细胞系之后使用ELISA试剂盒测量VEFG表达水平。

如图3E中所见，发现将PTEN导入具有失活的PTEN的细胞中在低氧中诱导VEGF表达的阻抑。还有，当用PTEN并结合微小RNA-125antogomir处理细胞时，VEGF表达被抑制的程度比单独用PTEN处理细胞时低。相应地，图3E的数据显示PTEN抑制低氧诱导的血管生成通过微小RNA-125进行调节。

上述获得的结果共同表明，在具有失活的PTEN的脑癌细胞中，微小RNA-125表达水平被减少从而增加VEGF表达，导致低氧诱导的血管生成，以及微小RNA-125在脑癌中起重要作用。

实施例7：微小RNA-125对癌细胞侵袭的影响

为了考查微小RNA-125对脑癌细胞侵袭的影响，mir-125a、mir125b和阴性对照miRNA(Dharmacon)被导入各自的U373细胞(图4)。详细地，在实验前一天对细胞进行计数以及将mir-125a、mir125b和阴性对照miRNA分别电穿孔入1.5×10⁶个细胞，细胞然后温育48hrs。将Matrigel(生长因子降低的BD Matrigel基质)放入24-孔transwell的上室中以用于侵袭测定。将细胞悬浮在不含血清的DMEM培养基中以及将细胞悬浮液以1.5×10⁶个细胞/孔的浓度放置在transwell上室中的matrigel上。将包含1％BSA的DMEM培养基填充在transwell的下室中，接着将transwell在37℃下在CO₂培养箱中温育24hrs。随后，将细胞固定并且用Diff-Quick试剂盒(Sysmex)对细胞质和核染色。用棉签将transwell上部未被侵袭的细胞擦除以及对渗入到transwell中的侵袭细胞进行计数。

图4的数据显示与阴性对照相比，mir125a和mir125b分别降低侵袭约60％和约40％。

实施例8：微小RNA-125的抗癌活性

为了考查miR-125b和HIF1a是否可以调节癌症，构建了产生miR-125b和HIF1a的细胞系并且将其移植入小鼠中，接着测量小鼠的存活和体重(图5)。

更详细地，用携带miR-125b、HIF1a或空白载体的慢病毒感染U373-MG细胞，以构建产生miR-125b或HIF1a的稳定细胞系。将导螺(塑料导螺)固定在15只6周龄雌性裸鼠(Balb-C/nu-nu，Halan)中每只的颅骨前卤左侧1mm和下方2mm位置处。将假件(dummy)(塑料的)插入每个导螺中。约10天后，用显微注射插管(Hamilton)替代假件，通过该插管将每个构建的细胞系的5×10⁵个细胞注射入尾状核4mm深。从假件重新插入导螺后第10天起，监测小鼠体重、行为和健康状态的变化约120天。

如图5中所见，对照小鼠遭遇体重减轻并且在约40天内死亡而移植有表达mir-125b细胞系的小鼠生存了约120天并且体重相对恒定，这表明mir-125b在动物组织中显示出足以抑制癌生长的抗癌活性。

实施例9：微小RNA-125对宫颈癌细胞侵袭的影响

为了考查mir-125对除脑癌细胞之外的癌细胞的影响，用宫颈癌细胞系HeLa进行与实施例7中相同的侵袭测定(图8)。详细地，在实验前一天对细胞进行计数以及将mir-125a或阴性对照miRNA(Dharmacon)电穿孔入1.5×10⁶个HeLa细胞，细胞然后温育48hrs。将Matrigel(生长因子降低的BD Matrigel基质)放入24-孔transwell的上室中以用于侵袭测定。将细胞悬浮在不含血清的DMEM培养基中以及将细胞悬浮液以1.5×10⁶个细胞/孔的浓度放置在transwell上室中的matrigel上。将包含1％BSA的DMEM培养基填充在transwell的下室中，接着将transwell在37℃下在CO₂培养箱中温育24hrs。随后，将细胞固定并且用Diff-Quick试剂盒(Sysmex)对细胞质和核染色。用棉签将transwell上部未侵袭的细胞擦除，以及对渗入到transwell中的侵袭的细胞进行计数。

图8的数据显示，与阴性对照相比mir125a显著降低侵袭，表明微小RNA-125通过阻抑两类细胞的侵袭对宫颈癌以及脑癌具有抑制活性。

【工业应用】

由于发现抑制低氧诱导的癌细胞的血管生成和阻抑癌细胞生长、侵袭和转移，如上文所述，包含本发明所述的微小RNA-125的抗癌组合物可以用于对各种癌症有效的基因治疗，特别是，难以用手术、化学疗法或放射疗法进行治疗的癌症。

序列表

<110>国立癌症中心

<120>包含微小RNA分子的抗癌组合物

<130>OPA08050PCT

<150>KR10-2008-0070087

<151>2008-07-18

<160>5

<170>KopatentIn 1.71

<210>1

<211>24

<212>RNA

<213>hsa-miR-125a-5p的成熟序列

<400>1

ucccugagac ccuuuaaccu guga 24

<210>2

<211>22

<212>RNA

<213>hsa-miR-125a-3p的成熟序列

<400>2

acaggugagg uucuugggag cc 22

<210>3

<211>22

<212>RNA

<213>hsa-miR-125b的成熟序列

<400>3

ucccugagac ccuaacuugu ga 22

<210>4

<211>22

<212>RNA

<213>hsa-miR-125b-1的成熟序列

<400>4

acggguuagg cucuugggag cu 22

<210>5

<211>22

<212>RNA

<213>hsa-miR-125b-2的成熟序列

<400>5

ucacaaguca ggcucuuggg ac 22

Claims

1.抗癌组合物，其包含微小RNA-125核酸分子。

2.根据权利要求1所述的抗癌组合物，其中所述微小RNA-125是人微小RNA-125a、微小RNA-125b1或微小RNA-125b2。

3.根据权利要求1所述的抗癌组合物，其中所述癌症的微小RNA-125表达水平低。

4.根据权利要求1所述的抗癌组合物，其对癌细胞的侵袭和转移具有抑制活性。

5.根据权利要求1所述的抗癌组合物，其对低氧诱导的血管生成具有抑制活性。

6.根据权利要求1所述的抗癌组合物，其中所述癌症选自脑癌、宫颈癌、乳腺癌、膀胱癌、肝癌、前列腺癌和成神经细胞瘤。

7.根据权利要求1所述的抗癌组合物，其中所述微小RNA-125核酸分子存在于表达载体中。

8.根据权利要求7所述的抗癌组合物，其中所述载体是源自慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、疱疹病毒和禽痘病毒的病毒载体。

9.根据权利要求1所述的抗癌组合物，其中所述微小RNA-125核酸分子被导入细胞中。

10.根据权利要求1所述的抗癌组合物，进一步包含药学上可接受的载体。

11.用于治疗与低氧诱导的血管生成相关的疾病的组合物，其包含微小RNA-125核酸分子。

12.根据权利要求11所述的组合物，其中所述与低氧诱导的血管生成相关的疾病选自癌症、血管瘤、血管纤维瘤、动脉硬化、血管粘附、硬皮病、新生血管性青光眼、糖尿病视网膜病、新生血管性角膜病、关节炎、牛皮癣、毛细血管扩张、化脓性肉芽肿和阿尔茨海默病。

13.用于诊断脑癌和脑肿瘤的标记组合物，其包含用于测量微小RNA-125表达水平的药剂。

14.阻抑癌细胞侵袭和转移的方法，其包含使用微小RNA-125(mir-125)核酸分子。

15.抑制低氧诱导的血管生成的方法，其包含使用微小RNA-125(mir-125)。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述血管生成通过用所述微小RNA-125阻抑VEGF(血管内皮细胞生长因子)分泌来抑制。

17.根据权利要求15或16所述的方法，其中所述血管生成通过包括PTEN(第10号染色体上缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物)失活的途径进行调节。

18.治疗癌症的方法，包括给予权利要求1所述的组合物，所述癌症具有低的微小RNA-125(mir-125)表达水平。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述癌症选自脑癌、宫颈癌、乳腺癌、膀胱癌、肝癌、前列腺癌和成神经细胞瘤。

20.治疗与低氧诱导的血管生成相关的疾病的方法，包括给予权利要求1所述的组合物。