CN102018963B

CN102018963B - 调节RANTES表达的miR-125a、其组合物及其用途

Info

Publication number: CN102018963B
Application number: CN2009101955235A
Authority: CN
Inventors: 沈南; 唐元家; 赵遐; 曲波; 崔慧娟; 王树军
Original assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Current assignee: Shanghai Institute of Nutrition and Health of CAS
Priority date: 2009-09-11
Filing date: 2009-09-11
Publication date: 2013-03-13
Anticipated expiration: 2029-09-11
Also published as: WO2011029404A1; CN102018963A

Abstract

本发明涉及调节RANTES表达的miR-125a、其组合物及其用途。具体而言，本发明涉及miR-125a、其在制备调节RANTES表达用的药物中的用途、以及含有miR-125a的药物组合物。本发明还涉及体外调节组织或细胞的炎症性趋化因子RANTES表达的方法，以及筛选能调节炎症性趋化因子RANTES的表达的物质的方法。

Description

调节RANTES表达的miR-125a、其组合物及其用途

技术领域

本发明涉及调节RANTES表达的miR-125a、其组合物及其用途。

背景技术

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)是一种常见的累及多脏器的慢性炎症性自身免疫病，其临床表现复杂多样，累积全身多系统的炎症反应，但其病因复杂，发病的分子机制尚不明确，炎症是其主要的病理改变[1]。目前治疗主要是糖皮质激素、免疫抑制剂等非特异性炎症抑制剂，尚缺乏特异的治疗手段，无法从根本上提高疾病防治水平[2]。

目前已有大量的相关研究报道炎症性趋化因子在SLE发病中发挥重要作用[11-14]，特别是在肾炎发病中发挥重要作用。RANTES是一种典型的C-C亚族成员炎症性趋化因子，诱导T细胞、树突状细胞、嗜酸性细胞等多种免疫细胞向炎症部位浸润，在器官炎症反应中发挥重要作用[18-20]。在病理情况下可以增强细胞毒性、招募免疫细胞、增强炎症过程，加重关节炎、异位性皮炎、肾炎、结肠炎等疾病[21]。多项研究表明RANTES在组织中表达水平与疾病的活动性相关，可以作为疾病活动的生物标志物。更值得关注的是RANTES的受体CCR5是HIV进入靶细胞的辅助受体，在HIV病毒融合和进入靶细胞过程中起重要作用。RANTES作为药物靶点，已成为慢性炎症、减轻移植排斥反应、HIV感染等疾病新药研发的热点[22-27]。

微小RNA(microRNA，miRNA)是动植物体内普遍存在的内源性表达的一类长度约21-25nt的非编码蛋白质单链小分子RNA，通过核酸序列互补性结合到特定的靶mRNA上来调节靶mRNA翻译或降解靶mRNA，是一种起转录后负调控作用的分子[3，4]，参与生命过程中的一系列重要进程，包括发育、细胞增殖、凋亡、分化以及病毒感染和癌症等多种生物学作用[5-7]。

miRNAs是近年来科学研究的一项重大突破，不仅有助于人类对基因的自身调节机制更全面深刻地认识，也为疾病发生、预防及治疗研究提供新的思路。众多研究表明miRNA参与了免疫系统调节作用的各个环节，包括固有免疫、适应性免疫反应，免疫细胞发育等[8-10]，对免疫系统进行精细的调节。但是miRNA与SLE炎症反应的关系至今还未有相关报道。

发明内容

本申请人发现miR-125a在SLE患者中表达降低，体外实验发现在T细胞中过表达miR-125a可以降低炎症性趋化因子RANTES的表达水平。miR-125a表达信号可作为SLE临床诊断的一个重要生物标志物；并可能作为一个新的药物干预靶点，特异性干预miR-125a的表达水平可发展为新的治疗手段，进而调节组织、细胞的RANTES表达，为治疗包括狼疮肾炎、关节炎等慢性炎症、减轻移植排斥反应等疾病带来新的希望。

因此，本发明第一方面涉及miR-125a在制备治疗炎症性趋化因子RANTES介导的疾病用的物质中的用途。

在一个具体实施方式中，所述疾病选自慢性炎症、移植排斥反应和HIV感染。

在一个具体实施方式中，所述疾病是系统性红斑狼疮、狼疮肾炎或关节炎。

在一个具体实施方式中，所述物质选自：含有miR-125a前体、成熟体或其类似物的药物组合物；miR-125a表达激动剂；含有miR-125a表达激动剂的药物组合物；表达miR-125a前体、成熟体或其类似物的表达载体；和含所述表达载体的药物组合物。

在一个具体实施方式中，所述miR-125a表达激动剂选自脂多糖和植物血球凝聚集素。

在一个具体实施方式中，所述物质为含有miR-125a表达激动剂的药物组合物。

本发明第二方面提供一种药物组合物，该组合物含有miR-125a前体、成熟体、miR-125a表达激动剂、和/或表达miR-125a成熟体的表达载体，以及药学上可接受的运载体。

在一个具体实施方式中，所述药物组合物含有miR-125a成熟体。

在一个具体实施方式中，所述药物组合物含有miR-125a表达激动剂。

在一个具体实施方式中，所述药物组合物含有表达miR-125a成熟体的表达载体。

本发明还提供一种体外调节组织或细胞的炎症性趋化因子RANTES表达的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)提供所述组织或细胞；和

(2)向所述组织或细胞施与miR-125a前体、成熟体、miR-125a表达激动剂、和/或表达miR-125a成熟体的表达载体，从而调节所述组织或细胞中的RANTES表达。

在一个具体实施方式中，所述调节为抑制所述组织或细胞中的RANTES表达。

本发明还提供一种筛选能抑制炎症性趋化因子RANTES的表达的物质的方法，该方法包括以下步骤：

(1)提供组织或细胞；

(2)作为试验组，向所述组织或细胞施与miR-125a前体、成熟体、miR-125a表达激动剂、和/或表达miR-125a成熟体的表达载体，和候选物质；和

(3)作为对照组，向所述组织或细胞施与miR-125a前体、成熟体、miR-125a表达激动剂、和/或表达miR-125a成熟体的表达载体，而未加入候选物质；

(4)检测试验组和对照组中KLF13和/或RANTES的表达，其中，与对照组相比，试验组中能使所述组织或细胞中的KLF13和/或RANTES的表达降低的候选物质确定为能抑制炎症性趋化因子RANTES的表达的物质。

在一个具体实施方式中，所述方法还包括：

(5)向所述组织或细胞施与miR-125a前体、成熟体、miR-125a表达激动剂、和/或表达miR-125a成熟体的表达载体，和脂多糖或植物血球凝聚集素；检测此组织或细胞中的KLF13和/或RANTES的表达；和将检测结果与步骤(2)的检测结果进行比较，以确定能抑制炎症性趋化因子RANTES的表达的物质。

本发明也包括由上述筛选方法筛选得到的物质。

附图说明

图1显示，55个SLE患者和正常对照组外周血单个核细胞miR-125a表达量明显下降(P＜0.001)。

图2显示人原代T淋巴细胞在体外分别转染miR-125a和对照miRNA，8小时后，用植物血球凝聚集素(Phytohemagglutinin，PHA-P)激活所得的结果。图A：原代T淋巴细胞过表达miR-125a，PHA激活7天后，RT-PCR检测miR-125a的表达。图B：表示7天后，检测细胞上清RNATES水平差异，图C表示检测细胞KLF13在mRNA水平表达差异。

图3显示miR-125a抑制内源性KLF13表达。图A表示在Hela细胞过表达miR-125a，Hela细胞内源性KLF13表达受抑制，而过表达其它miRNA(miR-98)则不影响KLF13的表达。反之，在Hela细胞抑制miR-125a表达，Hela细胞内源性KLF13表达增高。图B表示miR-125a浓度依赖性抑制KLF13的表达。图C表示抑制miR-125a的表达，KLF13表达增高也呈浓度依赖性。

图4显示荧光素酶报告基因方法和点突变技术验证miR-125a直接作用于KLF13 3’UTR。(A)生物信息学预测KLF13 3’UTR与miR-125a结合的2个位点，克隆KLF13 3’UTR 3个片段至psi-CHECK-TM2，命名K1、K2、K3，其中K1和K2预测有结合miR-125a位点，K3没有结合miR-125a位点。(B)Hela细胞共转染K1和miR-125a，K1荧光素酶活性与对照miRNA相比，明显下降。K1与miR-98共转染则K1荧光素酶活性与对照miRNA相比无明显变化。共转染K1和miR-125a抑制物，K1荧光素酶活性与对照miRNA相比，明显上升。K1与miR-98共转染则K1荧光素酶活性与对照miRNA相比无明显变化。miR-98作为非相关miRNA对照。(C)Hela细胞共转染K2和miR-125a，K1荧光素酶活性与对照miRNA相比，明显下降。共转染K2和miR-125a抑制物，K2荧光素酶活性与对照miRNA相比，明显上升。(D)Hela细胞共转染K1和miR-125a，与对照miRNA相比，K1荧光素酶活性下降与miR-125a呈浓度依赖性。(E)表示K2荧光素酶活性下降与miR-125a呈浓度依赖性。(F)Hela细胞共转染miR-125a和K1突变体或k2突变体，K1突变体或k2突变体荧光素酶活性与对照miRNA相比，无明显变化。Hela细胞共转染K3和miR-125a，K3荧光素酶活性与对照miRNA相比，无明显变化。

具体实施方式

本发明涉及RANTES介导的疾病的治疗。

RANTES是一种典型的C-C亚族成员炎症性趋化因子，它可加重关节炎、异位性皮炎、肾炎、结肠炎等疾病[21]。此外，RANTES的受体CCR5是HIV进入靶细胞的辅助受体，在HIV病毒融合和进入靶细胞过程中起重要作用。RANTES作为药物靶点，已成为慢性炎症、减轻移植排斥反应、HIV感染等疾病新药研发的热点。

因此，本发明所述的“RANTES介导的疾病”可包括各种慢性炎症、减轻移植排斥反应、HIV感染等疾病。在具体实施方式中，本发明所述的“RANTES介导的疾病”包括关节炎、异位性皮炎、肾炎、结肠炎、系统性红斑狼疮、狼疮肾炎等[28-31]。

本发明治疗RANTES介导的疾病的方法包括过表达对象体内的miR-125a。

miR-125a的前体序列为UGCCAGUCUCUAGGUCCCUGAGACCCUUUAACCUGUGAGGACAUCCAGGGUCACAGGUGAGGUUCUUGGGAGCCUGGCGUCUGGCC(SEQ ID NO：17)；

miR-125a的成熟体序列为：UCCCUGAGACCCUUUAACCUGUGA(SEQ IDNO：18)。

过表达miR-125a的方法包括：给予miR-125a的表达激动剂，以促进其表达；和/或转染miR-125a成熟体或表达miR-125a成熟体的表达载体到对象细胞中，以使其在该细胞中表达。

转染的方法是本领域周知的。目前，将外源DNA导入哺乳动物细胞的方法大致可分为两大类，即生物方法和物理化学方法。物理化学方法中常用的有磷酸钙法、显微注射、电穿孔、脂质体介导的转染，以及以高分子聚合物为载体的基因传递技术。生物方法则主要是以病毒作为载体，通过病毒感染的方式将外源DNA导入到细胞中，其中以逆转录病毒及腺病毒转染系统最为常用。在本发明一个优选实施例中，使用LipofectamineaTM2000脂质体转染方法转染本发明的miR-125a。

促进miR125a在细胞内表达的物质包括LPS(脂多糖)[32]等。Bazzoni F等[32]发现LPS(脂多糖)刺激原代单核细胞miR-125a表达在8小时内明显增高。本文将该文以引用的方式纳入参考。此外，我们实验也发现PHA-P刺激原代T细胞3-5天后，miR-125a表达明显增高。

构建含有miR-125a的表达载体也是本领域周知的。例如，可从OligoEngine公司购得载体pSuper.gfp/neo，从人基因组中PCR得到miR-125a前体片段，使用的引物包括上游引物CGTAGATCTGCCCCTCCCGATAT，下游引物ATGCTCGAGGTCAGGTTTCAGTT。双酶切质粒载体和PCR片段，酶切位点为Bgl 2和Xho 1。T4连接酶连接PCR片段和酶切质粒。连接产物转化感受态大肠杆菌后，测序质粒插入序列，扩增纯化质粒，从而可获得含有miR-125a的表达载体。

本发明所述“转染miR-125a或含有miR-125a的表达载体”也包括转染miR-125a的类似物或含有该类似物的表达载体。在本文中，miR-125a的类似物指在miR-125a的序列中取代、缺失或添加一个或几个碱基且仍能够结合KLF13第+247位到第+255位和/或第+1616位到第+1622位的短RNA序列。本领域技术人员知晓哪个位置上的突变能产生仍能与LKF13的所述位置特异性结合的miR-125a类似物。这样的类似物也包括miRIDIAN^TM(Dharmacon公司设计并合成)，它是一种microRNA模拟物，是经化学修饰的双链RNA核苷酸分子。

miR-125a模拟物序列(双链)：5`UCCCUGAGACCCUUUAACCUGUGA 3`

3`AGGGACUCUGGGAAAUUGGACACU 5`

microRNA抑制物是化学修饰的提高其稳定性的单链RNA核苷酸分子，用于抑制内源性microRNA的表达。对照模拟物和抑制物序列基于线虫miRNA而设计，通过与所有的人、小鼠和大鼠基因组序列以及miRBase序列数据库miRNA序列进行比对确保无同源性；从而作为人、小鼠和大鼠细胞的阴性实验对照产品。在miRNA实验中可作为无序列特异性效应的无靶模拟物，可将模拟物活性和本底效应有效区分。均为Dharmacon公司设计并合成。

miR-125a抑制物序列(单链)：5`UCACAGGUUAAAGGGUCUCAGGGA 3`。

本发明也涉及miR-125a在制备治疗RANTES介导的疾病用的物质中的用途。在一个具体实施方式中，所述miR-125a包括其类似物。

在一个具体实施方式中，所述物质包括含有miR-125a前体、成熟体或其类似物的药物组合物；miR-125a表达激动剂；含有miR-125a表达激动剂的药物组合物；表达miR-125a成熟体或其类似物的表达载体；和含所述表达载体的药物组合物。所述物质也包括适用于通过不同递送方式给予的物质，例如适用于通过转染给予的物质。

本发明的药物组合物可含有miR-125a前体、成熟体或其类似物，和药学上可接受的运载体。本发明的药物组合物还可含有miR-125a表达激动剂或表达miR-125a前体、成熟体或其类似物的表达载体，和药学上可接受的运载体。

本发明药物组合物中还含有溶于或分散于药学上可接受的运载体或赋形剂中的一种或多种其它制剂。短语“药学上可接受的”是指当用于动物时，例如人，不会产生副作用、过敏或其它不良反应的分子实体和组合物。通过本文所公开的内容，本领域技术人员将会知道含有至少一种多肽、在某些实施方式中还含有一种或多种其它活性成分的药物组合物的制备，例如见《雷明顿药物科学》第18版，MackPrinting Company，1990(纳入本文参考文献)。另外，对动物(如人)给药，可以理解的是制品应符合无菌、无致热原，总体安全和纯度标准。

本文使用的“药学上可接受的运载体”包括任何和所有的溶剂、分散介质、包衣剂、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(如抗菌剂，抗真菌剂)、等渗剂、吸收延缓剂、盐类、防腐剂、药物、药物稳定剂、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、增甜剂、调味剂、染料等物质和它们的组合，这是本领域普通技术人员知道的(见例如，《雷明顿药物科学》第18版，Mack Printing Company，1990，1289-1329页，纳入本文参考文献)。除了与活性成分不相容的常规运载体外，认为均可用于治疗或药物组合物中。

给予患病动物本发明组合物的实际剂量由物理和生理因素，如体重、疾病严重性、待治疗疾病的类型、原有和共同的治疗措施、受试者的特发病和给药途径所决定。负责给药的医生将决定组合物中活性成分的浓度和受试者个体的合适剂量。

某些实施方式中，药物组合物可含有，例如至少约0.001重量％的活性成分。在其它实施方式中，药物组合物可含有例如0.01-99.9重量％、0.01-50重量％、0.01-10重量％等的本发明多肽。在一个具体实施方式中，给予的药物组合物中多肽的浓度可为0.01-5mM，例如0.01-3mM、0.05-1mM。给药的方式是常规的，可由临床医师根据患者的具体情况来确定。例如，可直接注射入侧脑室或蛛网膜下腔。

本发明药物组合物可含有各种抗氧化剂以防止一种或多种组分的氧化。此外可用防腐剂来预防微生物的作用，如各种抗菌和抗真菌剂，包括但不仅限于对羟基苯丙酸酯(如甲基对羟基苯丙酸酯、丙基对羟基苯丙酸酯)、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞或其组合。

在该组合物是液体形式的实施方式中，运载体可以是溶剂或分散介质，包括但不限于：水、多元醇(如甘油、丙烯二醇、液态聚乙二醇等)、脂质(如甘油三酯、植物油、脂质体)和它们的组合。例如，可通过采用包衣如卵磷酯；通过用运载体如液体多元醇或脂分散维持所需颗粒大小；用表面活性剂如羟丙基纤维素；或这些方法的组合来维持适当的流动性。许多情况下，优选包含等渗剂如糖、氯化钠或其组合。

可采用本领域常规的方法配置本发明的药物组合物。

该组合物在制备和贮存条件下必须稳定，防止微生物如细菌和真菌的污染。需知应将内毒素的污染控制到最低，处在安全水平内，例如低于0.5ng/mg蛋白质。

本发明还提供一种体外调节组织或细胞的炎症性趋化因子RANTES表达的方法，以及筛选能抑制炎症性趋化因子RANTES的表达的物质的方法。在知晓miR-125a在炎症性趋化因子RANTES的表达以及KLF13的表达中的作用的情况下，本领域技术不难在此基础上体外调节组织或细胞的炎症性趋化因子RANTES表达，以及根据此原理筛选能抑制炎症性趋化因子RANTES的表达的物质。所述调节包括上调和下调(抑制)。上述方法中，所述组织或细胞包括任何本身能表达KLF13和/或RANTES的组织或细胞，这是本领域周知的。

本发明也包括一种试剂盒，其含有miR-125a或其成熟体、其编码序列、含所述编码序列的表达载体等活性成分，任选地包括各种适用于将所述活性成分转染入细胞中的试剂以及指导说明书。

本发明的实施除非另外说明，将使用本领域技术人员已知的化学、生物化学、重组DNA技术和免疫学的常规方法。这些技术在文献中有完整的解释。参见，如《基础免疫学》(Fundamental Virology)，第二版，第I和II卷(B.N.Fields和D.M.Knipe编)；《实验免疫学手册》(Handbook of Experimental Immunology)，第I-IV卷(D.M.Weir和C.C.Blackwell编，Blackwell Scientific Publications)；T.E.Creighton，《蛋白质：结构和分子特性》(Proteins：Structures and Molecularproperties)(W.H.Freeman and Company，1993)；A.L.Lehninger，《生物化学》(Biochemistry)(Worth Publishers，Inc.最新版)；Sambrook等，《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning：a Laboratory Manual)，第二版，1989；《酶学方法》(Methods in Engymology)(S.Colowick和N.Kaplan编，Academic Press，Inc.)。

一.实验方法及材料

1.研究对象

SLE患者共55例，均为上海仁济医院风湿免疫科门诊与病房病人，诊断均符合美国风湿病学会SLE分类标准推荐的11项标准中的至少4项；正常对照组40例，来自上海市瑞金医院体检正常人群。各组性别和年龄差异无统计学意义，研究组与对照组每人采外周静脉ACD抗凝血5ml。

2.引物和探针设计

miRNAs逆转录引物和Real-time PCR反应探针直接从ABI(AppliedBiosystems公司)购买获得。靶基因定量引物以核糖体蛋白L13a(RPL13A)作为内参照基因，检索NCBI数据库查到人类KLF13基因cDNA全长序列，以Oligo 6.71软件设计扩增模板的引物如下：

KLF13正义链5’CCGCAGAGGAAGCACAA3’(SEQ ID NO：1)，反义链5’CTTCTTCTCGCCCGTGT3’(SEQ ID NO：2)；

RANTES正义链5’AGTCGTCTTTGTCACCCGAAA3’(SEQ ID NO：3)，反义链5’AGCTCATCTCCAAAGAGTTGATGTAC3’(SEQ ID NO：4)。

引物设计好后通过BLAST分析(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)避免扩增的目的片段序列存在非特异性，由上海生工公司合成。RPL13A引物来源于QuantitativePCR Primer Database(QPPD)网站所报导序列，正义链5’CCTGGAGGAGAAGAGGAAAGAGA3’(SEQ ID NO：5)，反义链5’TTGAGGACCTCTGTGTATTTGTCAA3’(SEQ ID NO：6)，为上海生工公司合成。

3.实时荧光定量PCR(Real-time PCR)

应用酚氯仿法抽提Trizol(Invitrogen公司产品)总RNA，得到的RNA用毛细管电泳(NanoDrop Specthophotometer)鉴定其完整性，紫外分光光度计测定其浓度。总RNA一部分用做oligo dT逆转录，使用PrimeScript RT reagent Kit逆转录酶试剂盒(Takala公司产品)逆转录为cDNA；另一部分用做miRNAs特异性引物逆转录，加样体系为dNTP 0.03ul、MMLV 0.2ul、10×Buffer 0.3ul、RNase抑制剂0.02ul、ddH₂O(无RNase)0.45ul、引物1ul和RNA 1ul，逆转录反应条件为16℃，30min；42℃，30min；85℃，5min。实时荧光定量PCR(Real-time PCR)在ABI Prism7900测序仪(Applied B iosystems公司)上进行实时荧光定量PCR操作。

4.报告基因载体和突变质粒构建

KLF13基因3’UTR的3个片段，由基因组DNA扩增。酶切位点Not I和XhoI插入psi-check质粒(购于Promega公司)(命名K1，K2，K3)。K1、K2包含KLF13基因3’UTR与miR-125a的结合位点基因片段，所有质粒都测序鉴定。使用以下引物：

K1上游引物5’CCGCTCGAGAGCAGCCCCACCATCAG3’(SEQ ID NO：7)；下游引物5’ATTTGCGGCCGCCGGGCAAACTCGGAACT3’(SEQ ID NO：8)；

K2上游引物5’CCGCTCGAGCTGTGTGAGCGGCTGTG3’(SEQ ID NO：9)；下游引物5’ATTTGCGGCCGCTCCCACCACAGCAGAAAC3’(SEQ ID NO：10)；

K3上游引物5’CCGCTCGAGTCTGCTGTGGTGGGAACT3’)SEQ ID NO：11)；下游引物5’ATTTGCGGCCGCTGGAGGCTGTTTCAGGAG3’(SEQ ID NO：12)；

点突变系统使用KOD Plus酶(TOYOBO公司)。突变K1、K2载体连接片段与mir-125a互补结合的4个碱基序列，使用以下引物：

K1突变体上游引物5’TGTTGAACCCCCTTTCTCTCCCATGGACACGTTTC3’(SEQ ID NO：13)；下游引物5’GAAACGTGTCCATGGGAGAGAAAGGGGGTTCAACA3’(SEQ ID NO：14)；

k3突变体上游引物5’GGGGATTGGGTGGACTGTCCGTATCTTGCCAGAGA3’SEQ ID NO：15)；下游引物5’TCTCTGGCAAGATACGGACAGTCCACCCAATCCCC3’(SEQ ID NO：16)。

5.细胞分选和培养

人原代单个核细胞(PBMC)来自上海市血液中心健康献血者。人外周血T淋巴细胞用磁珠法(Miltenyi Biotec CD3 MicroBeads)阳性分选出，培养于10％小牛血清的1640营养液中，T淋巴细胞用PHA(sigma)20μg/ml刺激7天。Hela细胞来源于来源于美国菌种保藏中心(ATCC)，购至中国科学院上海生命科学研究院细胞所，培养于10％小牛血清的DMEM加100U/ml青霉素-链霉素营养液中，37℃5％CO₂孵育，2～3天换液一次。

6.荧光素酶报告基因系统和突变系统

Hela细胞培养于96孔板，细胞80％融合时，用LipofectamineaTM2000脂质体(Invitrogen公司)转染方法共转染KLF13 3’UTR报告基因载体和miR-125a的成熟体，转染24小时后用双荧光酶报告基因分析系统检测荧光素酶活性。KLF133’UTR突变体用同样的方法转染和检测荧光素酶活性。

7.转染人原代T淋巴细胞

按照interferin siRNA transfection reagent(polyplus公司)说明书方法进行转染。MiR-125a成熟体(mimic)及抑制体(inhibitor)及相应阴性对照(control)来自ThermoSCIENTIFIC Dharmacon公司。

8.酶联免疫吸附实验(ELISA)

分别转染miR-125a mimic和对照miRNA mimic的T淋巴细胞，PHA活化7天后，用ELISA法(西塘生物)检测细胞上清RANTES水平。

9.数据分析

分析各孔CT值，选取CT值位于可信区间范围内的样本(不包括CT值大于33的样本)，计算出标化后的2(-ΔΔCT)值，即代表该样本该基因初始拷贝数的数量。第一批表达数据首先运用SAM 2.20软件(Stanford University，http://www-stat.stanford.edu/～tibs/SAM/)分析，然后将表达有差异的数据导入HCE3.0软件(University of Maryland http://www.cs.umd.edu/hcil/hce/)作聚类分析。后一批扩大样本数据用Graph Pad 4.03软件(GraphPad Software公司)进行分析，两组独立样本数据比较应用非参数Mann-Whitney检验，相关分析应用Spearman相关性检验。P值小于0.05代表有统计学意义。

二.结果

1.miR-125a在SLE患者中的表达水平明显低于正常人

我们应用Real-time PCR方法对SLE患者和正常对照组外周血156个成熟miRNAs表达水平差异进行了研究，发现有42个miRNAs表达水平在SLE患者中明显低于正常人，其中包括miR-125a。进一步扩大样本检测55个SLE病人和40个健康对照者外周血单个核细胞miR-125a，结果证实其表达水平在SLE患者中显著低于正常对照组，具有统计学意义(P＜0.001，见图1)。

2.miR-125a能调节T细胞产生炎症性趋化因子RANTES

为探索miR-125a的生物学功能，我们利用生物信息学软件Target Scan、miRanda、PicTar等多个软件(来自于网上数据库http://www.targetscan.org/http://www.microrna.org/http://pictar.bio.nyu.edu/)同时预测miR-125a的靶基因。生物信息学分析发现，一种T淋巴细胞激活晚期促RANTES分泌的主要转录因子KLF13是miR-125a的靶基因。我们检测SLE患者血清中RANTES的水平，发现SLE患者RANTES的水平明显高于正常对照组(9300±2955vs.3971±1003pg/ml，p＜0.05)，这与文献报道的一致[11-14]。SLE患者中miR-125表达不足可能是RANTES异常升高的原因之一。

为探索miR-125a在T细胞分泌RANTES过程中的作用，我们在原代培养的T淋巴细胞中过表达miR-125a，分析miR-125a对PHA活化T细胞分泌RANTES的影响。研究结果显示，miR-125a能明显抑制T细胞分泌RANTES(见图2B)。我们同时检测了KLF13的表达，发现过表达miR-125a能显著抑制KLF13的表达(见图4C)。

3.miR-125a直接负向调节KLF13的表达

我们利用功能缺少和功能获得的策略研究miR-125a对KLF13的调节作用，发现：在Hela细胞系中过表达miR-125a能明显抑制KLF13的表达，反之，抑制miR-125a的表达，KLF13表达则升高。miR-125a对KLF13的调节具有浓度依赖性(见图3)。

4.生物信息学分析显示KLF13 3’UTR序列上有两个miR-125a的作用位点(+247～+255和+1616～+1622)。我们分别将含有这两段序列的UTR片段克隆到报告基因载体中，得到克隆的载体K1和K2，同时也克隆不含miR-125a作用位点的序列，得到载体K3(见图4A)。荧光素酶报告基因系统证实，过表达miR-125a能抑制K1、K2载体荧光素酶活性。反之，抑制miR-125a功能，K1、K2载体荧光素酶活性则升高(见图4B和C)。miR-125a对K3载体荧光素酶活性的影响不显著(见图4F)。miR-125a对K1、K2载体荧光素酶活性的影响呈浓度依赖性(见图4D和E)。利用定点突变将K1、K2载体上的miR-125a的作用位点突变掉，然后分析miR-125a对荧光素酶活性的影响，发现miR-125a对K1、K2突变体的影响不明显(见图4F)。这些研究结果充分表明miR-125a能直接调节KLF13的表达。

三.讨论

miRNA作为一种调控分子，在人类多种疾病的发生和发展过程都有着重要作用。不同于以往的有或无的调节特点，miRNA主要是在数量上对靶基因进行调节。这一特点是siRNA单靶点强大的调节作用或一些分子的拮抗剂和激动剂所无法比拟的。这展示了miRNA在临床应用方面的巨大前景。本申请发现miR-125a在SLE患者中表达降低，体外实验发现在T细胞中过表达miR-125a可以降低炎症性趋化因子RANTES的表达水平。miR-125a表达信号可作为SLE临床诊断的一个重要生物标志物；并可能作为一个新的药物干预靶点，特异性干预miR-125a的表达水平可发展为新的治疗手段，进而调节组织、细胞的RANTES表达，为治疗包括狼疮肾炎、关节炎等慢性炎症、减轻移植排斥反应等疾病带来新的希望。

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序列表

<110>中国科学院上海生命科学研究院

<120>调节RANTES表达的miR-125a、其组合物及其用途

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<170>PatentIn version 3.3

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Claims

1.miR-125a在制备治疗炎症性趋化因子RANTES介导的疾病用的物质中的用途，其中，所述疾病选自系统性红斑狼疮和狼疮肾炎。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述物质选自：含有miR-125a前体或miR-125a成熟体的药物组合物；含miR-125a前体或miR-125a成熟体的表达载体；和含所述表达载体的药物组合物。

3.一种体外调节组织或细胞的炎症性趋化因子RANTES表达的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

（1）提供所述组织或细胞；和

（2）向所述组织或细胞施与miR-125a前体、miR-125a成熟体、和/或表达miR-125a成熟体的表达载体，从而调节所述组织或细胞中的RANTES表达。