KR102234957B1 - shRNA와 항-EpCAM 항체를 포함하는 바이러스 복합체 및 그의 용도 - Google Patents

shRNA와 항-EpCAM 항체를 포함하는 바이러스 복합체 및 그의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 상피세포 성장인자 수용체(EGFR)의 발현을 억제하는 shRNA를 세포에 전달할 수 있는 바이러스 벡터 및 상기 바이러스 벡터에 결합된 항-상피세포접착분자(EpCAM) 항체를 포함하는, 바이러스 복합체, 상기 바이러스 복합체를 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 상기 바이러스 복합체 또는 약학 조성물을 EpCAM가 과발현되는 암질환이 발병된 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암의 치료방법에 관한 것이다. 본 발명에서 제공하는 항-EpCAM 항체-AAV2/shEGFR 복합체는 생체내에서 면역반응을 유발하지 않으면서도, EpCAM를 과발현하는 종양세포에서 EGFR의 발현수준을 현저히 감소시켜서, 종양세포의 사멸을 유도할 수 있으므로, 보다 효과적이면서도 안전한 항암치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

shRNA와 항-EpCAM 항체를 포함하는 바이러스 복합체 및 그의 용도{Novel viral complex comprising shRNA and anti-EpCAM andtobody and uses thereof}
본 발명은 shRNA와 항-EpCAM 항체를 포함하는 바이러스 복합체 및 그의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 상피세포 성장인자 수용체(EGFR)의 발현을 억제하는 shRNA를 세포에 전달할 수 있는 AAV2와 같은 바이러스 벡터 및 상기 바이러스 벡터에 결합된 항-상피세포접착분자(EpCAM) 항체를 포함하는 바이러스 복합체, 상기 바이러스 복합체를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 암조직에 EGFR shRNA를 포함하는 바이러스 벡터를 선택적으로 전달할 수 있는 상기 바이러스 복합체 또는 약학 조성물을 EpCAM가 과발현되는 암질환이 발병된 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료방법에 관한 것이다.
RNA 간섭현상(RNA interference, RNAi)은 표적 유전자의 mRNA와 상동인 서열을 가지는 센스 RNA와 이것과 상보적인 서열을 가지는 안티센스 RNA로 구성되는 이중사슬 RNA(double strand RNA)을 세포 등에 도입하여 선택적으로 표적 유전자의 mRNA의 분해를 유도하거나 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있는 현상을 말한다. RNAi 는 처음에 선충에서 발견되었지만, 현재는 효모, 곤충, 식물, 인간 등 각종 동식물에서 매우 잘 보존이 되어 있는 생명현상으로 관찰되고 있다.
이러한 RNAi를 유도하는 물질로는 siRNA(small interference RNA), miRNA(microRNA) 등이 알려져 있는데, 이중 인위적으로 합성이 가능한 siRNA는 약 20 내지 30개의 뉴클레오타이드로 구성된 RNA 이중나선 가닥의 형태이며, 세포 내에서 발현되면 이와 염기서열이 상보적인 mRNA를 분해하여, 관련 유전자의 발현을 억제하게 된다. siRNA는 질병에 대한 치료 효과를 가지며, 쉬운 제조법 및 높은 표적 선택성 등으로 인해 표적이 되는 생명 프로세스를 조절할 수 있는 효과적인 수단으로 각광을 받고 있다.
이에 따라, siRNA를 이용하여 암, 바이러스 감염 질환, 자가면역 질환, 신경퇴행성 질환 등의 다양한 질환을 치료하는 방법이 연구되고 있는데, 예를 들어, 노인성 황반변성 (베바시라닙; Opko Health, Inc., Miami, FL, USA; 임상 3상), 호흡기 신시치아 바이러스 감염증 (ALN-RSV01; Alnylam, Cambridge, MA, USA; 임상 2상)에 대한 치료제의 개발이 임상수준에서 진행되고 있다(Melnikova I. Nat Rev Drug Discov 2007, 6, 863-864). 또한, 트랜스페린을 표적으로 하는 사이클로덱스트린 기반의 나노입자 중합체 (CALAA-01; Calando Pharmaceuticals, Pasadena, CA, USA; 임상 1상)를 이용하여 암을 치료하는 방법에 있어서도 siRNA가 사용되고 있다(Oh YK. et al., Adv Drug Deliver Rev 2009, 61, 850-862).
그러나, siRNA를 이용한 유전자 발현억제 방법은 그의 지속시간이 2 내지 4 일 정도에 불과할 정도로 짧다는 문제점을 가지고 있는데, 세포질내의 각종 핵산분해효소로 인해 siRNA가 쉽게 분해되고 세포분열이 일어날 경우에는 siRNA의 농도가 희석되기 때문이다. 이러한 짧은 지속성 문제로 인해 합성 siRNA를 빈번하게 주입해야 하는 문제점이 발생하고 있을 뿐만 아니라, 상대적으로 장기간의 반감기를 가지는 표적단백질의 발현을 억제하기에는 그 지속성이 너무 짧아서 효율이 매우 저조하다는 단점이 있다.
기존의 유전자 사일런싱 지속성을 향상시키려는 노력들은 바이러스 벡터의 개발로 이어져왔다. 유전자 사일런싱의 지속성이 오랫동안 (예를 들어, 여러 주 동안) 나타날 수 있는 adeno virus, lenti virus와 같은 retroviral 벡터의 경우, 그 우수한 지속성에도 불구하고 생체내에서의 면역반응, 감염된 숙주 생체 내에서의 숙주 게놈으로의 바이러스 유전자 삽입 및 돌연변이 유발로 인해 체내 안정성이 보장되지 못하는 문제가 지적되었고 이로 인해 인체적용에 제한을 가질 수 밖에 없어 왔다.
한편, adeno-associated virus (AAV)는 상기 언급된 retrovirus와 다른 차별성으로 인해 인체적용이 유리하다고 알려져 있다 (Stilwell JL. et al., BioTechniques 2003, 34, 148-150). AAV 바이러스는 신체 내 면역반응을 최소화할 수 있으며 기존 바이러스들이 dividing cell에서만 감염효율이 높은 반면 non-dividing cell에서는 감염효율이 낮다는 한계점을 갖는데 비해 non-dividing cell에서도 높은 감염효율을 보여준다. 또한 adeno virus와는 달리 T cell에 손상을 입히지 않으면서도 인체에 해로운 병원성을 가지고 있지 않고, 감염된 세포에서 바이러스 복제를 하지 않는다. 또한 감염숙주내의 게놈으로의 바이러스 유전자 삽입이 일어나지 않기 때문에 인체적용의 위험성을 내재하고 있지 않다.
그러나, AAV 바이러스의 host tropism은 매우 광범위하기 때문에 특정 질환조직으로의 선택적 전달이 어렵다는 문제점을 가지고 있다. 이러한 이유는 AAV 바이러스가 주로 heparin sulfate proteoglycan (HSPG) 수용체를 결합하여 세포로 투과되는 메커니즘을 가지기 때문인데 HSPG 수용체는 생체 내 수많은 조직과 세포 타입에 광범위하게 분포되어 있다고 알려져 있다. 또한 마우스 혹은 non-human primate에 정맥주사 될 경우, AAV 바이러스는 주로 liver 혹은 spleen에 축적이 됨으로써 원하는 질환 조직으로의 선택적 유전자 전달이 불가능하다는 한계점을 가지고 있으며 결과적으로 종양선택적으로 작용해야만 하는 항암제로의 응용을 위해서는 우선적으로 이러한 natural tropism의 한계를 해결해야만 한다 (Stone D. et al., J. Virol. 2008, 82, 7711-7715).
이러한 배경하에서, 본 발명자들은 AAV를 이용하여 보다 효과적으로 shRNA를 표적세포에 전달할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 연구노력한 결과, shRNA를 세포에 전달할 수 있는 바이러스 벡터 및 상기 바이러스 벡터에 결합된 항-상피세포접착분자(EpCAM) 항체를 포함하는 바이러스 복합체를 사용할 경우, 표적세포에 효과적으로 shRNA를 전달할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 주된 목적은 상피세포 성장인자 수용체(EGFR)의 발현을 억제하는 shRNA를 세포에 전달할 수 있는 바이러스 벡터 및 상기 바이러스 벡터에 결합된 항-상피세포접착분자(EpCAM) 항체를 포함하는, 바이러스 복합체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 바이러스 복합체를 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 암조직에 EGFR shRNA를 포함하는 바이러스 벡터를 선택적으로 전달할 수 있는 상기 바이러스 복합체 또는 약학 조성물을 EpCAM가 과발현되는 암질환이 발병된 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암의 치료방법을 제공하는 것이다.
상술한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 실시양태는 상피세포 성장인자 수용체(Epidermal Growth Factor Receptor; EGFR)의 발현을 억제하는 shRNA를 세포에 전달할 수 있는 바이러스 벡터 및 상기 바이러스 벡터에 결합된 항-상피세포접착분자(epithelial cell adhesion molecule, EpCAM) 항체를 포함하는, 바이러스 복합체를 제공한다.
본 발명의 용어 "상피세포 성장인자 수용체(Epidermal Growth Factor Receptor; EGFR)"란, 세포 외 단백질 리간드의 EGF(epidermal growth factor) 패밀리에 대한 막투과 단백질의 형태를 갖는 수용체 단백질을 의미한다. 돌연변이에 의해 상기 EGFR이 과발현될 경우, 다양한 종류의 암질환을 발병시킬 수 있다고 알려져 있다. 뿐만 아니라, EGFR은 알츠하이머의 발병기작과도 연관성이 있다고 보고된 바 있다. 최근 연구에 의하면, 암세포에서 EGFR의 발현을 억제할 경우, 암질환의 예후를 개선시킬 수 있다고 보고되었다.
본 발명의 용어 "shRNA(small hairpin RNA, short hairpin RNA)"란, mRNA에 결합하여 이의 해독을 억제함으로써, 유전자의 발현을 억제할 수 있는 작은 헤어핀(hair pin) 구조를 가진 RNA를 의미한다. 상기 shRNA가 세포내로 도입되면 세포내 효소에 의해 절단되어 siRNA를 형성하고, 이처럼 형성된 siRNA가 이와 상보성 염기서열을 갖는 mRNA에 결합하여 상기 mRNA를 분해시킨다.
본 발명에 있어서, 상기 shRNA는 EGFR의 발현을 억제하는 shRNA인 것으로 해석될 수 있는데, 일 예로서, 서열번호 1 및 2의 염기서열로 구성된 shRNA로 해석될 수 있다.
5'-GTTAAC(GGCACGAGTAACAAGCTCA)TTCAAGAGA(TGAGCTTGTTACTCGTGCC)TTTTTCTCGA G-3'(서열번호 1)
5'-CTCGAGAAAAA(GGCACGAGTAACAAGCTCA)TCTCTTGAA(TGAGCTTGTTACTCGTGCC)GTTAA C-3'(서열번호 2)
본 발명의 용어 "바이러스 벡터"란, 야생형의 바이러스를 개량하여 생체내에서 독성을 유발하지 않으면서도, 세포를 감염시켜서 바이러스내에 존재하는 유전자를 세포내로 전달하는 유전자 전달수단을 의미한다.
상기 바이러스 벡터로는 레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 아데노연관바이러스(adeno-associated virus), 허피스심플렉스바이러스(herpes simplex virus) 등의 바이러스가 사용될 수 있다. 본 발명의 실시예에서는 바이러스 벡터로서 무독화된 아데노연관바이러스를 사용하였다.
본 발명의 용어 "항-상피세포접착분자(epithelial cell adhesion molecule, EpCAM) 항체"란, 상기 EpCAM에 특이적으로 결합하는 항체 단백질을 의미한다.
본 발명의 용어 "상피세포접착분자(epithelial cell adhesion molecule, EpCAM)"란, 상피조직에 존재하고, 동종의 수용체에 대하여 특이적인 접착성을 나타내는 세포접착분자의 일종을 의미한다.
본 발명의 용어 "세포접착분자(cell adhesion molecule, CAM)"란, 세포 외 기질을 구성하는 피브로넥틴(fibronectin), 교질(collagen), 라미닌(laminine) 등의 분자와 상기 분자를 수용하는 세포표면에 존재하는 수용체를 통칭하는 용어를 의미한다. 이들 중 카테린(cadherin), NCAM(Neural Cell Adhesion Molecule) 등은 동종의 수용체에 대하여 특이적인 접착성을 나타내지만, 이들을 제외한 대부분의 세포접착분자는 이종의 접착분자에 대하여도 접착활성을 나타내는 것으로 알려져 있다.
본 발명에 있어서, 상기 EpCAM은 암세포의 표면에 과발현되어, 본 발명에서 제공하는 바이러스 복합체가 암세포에 표적화되는 매개체로서 사용된다.
본 발명의 용어 "바이러스 복합체"란, 목적 유전자가 포함된 바이러스 벡터와 표적 세포의 표면항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항체가 결합된 형태의 분자를 의미하는데, 상기 항체에 의하여 표적세포에 대한 특이성을 나타내고, 상기 바이러스 벡터에 의하여 상기 표적세포에 목적 유전자를 전달할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 바이러스 복합체는 EGFR의 발현을 억제하는 shRNA를 세포에 전달할 수 있는 바이러스 벡터에 항-EpCAM 항체가 결합된 형태의 바이러스 복합체인 것으로 해석될 수 있다. 특히, 암조직과 같은 표적질환이 유발된 조직에 EGFR shRNA를 포함하는 바이러스 벡터를 선택적으로 전달할 수 있도록 상기 바이러스 벡터에 항-EpCAM 항체를 결합시킨 형태로서, 암조직의 세포표면에서는 EpCAM이 과발현되기 때문에, 상기 과발현된 EpCAM과 상기 바이러스 복합체에 결합된 항-EpCAM 항체로 인하여 상기 바이러스 복합체는 암조직을 구성하는 암세포에 특이적으로 결합되어, 상기 암세포에 EGFR shRNA를 감염시켜서, 결과적으로는 암세포의 성장을 억제하고, 암세포를 사멸시킬 수 있다.
본 발명에서 제공하는 상기 바이러스 복합체는 EGFR의 발현을 억제하는 shRNA를 코딩하는 유전자를 포함하는 아데노연관바이러스에 스트렙타비딘을 결합시키고, 이에 바이오틴이 결합된 항-EpCAM 항체를 결합시켜서 제조될 수 있는데, 이처럼 제조된 상기 바이러스 복합체는 표면에 EpCAM가 과발현된 표적세포에 특이적으로 결합하여, 상기 표적세포내로 EGFR의 발현을 억제하는 shRNA를 전달함으로써, 상기 표적세포내에서 EGFR의 발현을 효과적으로 억제할 수 있다. 이러한 전체적인 과정은 도 1에 도시되어 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 본 발명의 바이러스 복합체는 이에 포함된 항-EpCAM 항체에 의하여 표면에 EpCAM이 과발현된 암세포에 특이적으로 결합하여 표적화되는 특징을 나타낸다(도 4a 내지 4c). 또한, 상기 바이러스 복합체에 포함된 바이러스 벡터의 특성상 이에 포함된 shRNA를 표적 세포의 세포막을 투과하여 세포내로 전달함으로써, 표적 세포내에서 EGFR의 발현을 효과적으로 억제할 수 있고(도 5a 및 5b); 이로 인하여 표적세포의 콜로니 형성을 억제할 수 있으며(도 5c); 표적세포의 사멸을 유도할 수 있다(도 5d). 이러한 바이러스 복합체는 상술한 효과를 세포수준 뿐만 아니라 생체내에서도 동일하게 나타낼 수 있다(도 6a).
본 발명의 다른 실시예에 의하면, 본 발명의 바이러스 복합체는 이에 포함된 바이러스로 인하여 생체내에서 면역반응을 유발시킬 것으로 예상될 수 있으나, 놀랍게도 생체내에서 면역반응을 전혀 유발시키지 않음을 확인하였다(도 6b ?? 6c).
본 발명의 다른 실시양태는 상기 바이러스 복합체를 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
이때, 상기 “바이러스 복합체”에 대한 설명은 상기에서 서술한 바와 같다.
본 발명에서는, 상기 바이러스 복합체를 이용하여 약학 조성물을 제조할 수 있고, 구체적으로 암의 예방 또는 치료를 위한 약학 조성물을 제공할 수 있다.
암 치료를 위한 약학 조성물로 사용하기 위해서는, 본 발명에서 전달하고자 하는 바이러스 복합체를 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물의 유효성분으로 사용할 수 있다.
아울러, 본 발명의 바이러스 복합체 이외의 추가적인 항암활성을 갖는 구성요소를 사용하여 암의 예방 또는 치료 효능을 보다 향상시킬 수 있다.
본 발명의 용어 "예방"이란, 본 발명에 따른 약학 조성물의 투여에 의해 암의 발병을 억제시키거나 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 용어 "치료"이란, 상기 약학 조성물의 투여에 의해 암의 발명이 의심되거나 또는 암의 발병이 확인된 개체의 증상이 호전되거나 이롭게 변경시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 제공하는 약학 조성물은 암의 예방 또는 치료에 사용될 수 있는데, 이러한 예방 또는 치료의 대상이 되는 암은 표면에 EpCAM이 과발현되는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 췌장암, 유방암, 전립선암, 뇌종양, 두경부암종, 흑색종, 골수종, 백혈병, 림프종, 간암, 위암, 결장암, 골암, 자궁암, 난소암, 직장암, 식도암, 소장암, 항문부근암, 결장암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병, 방광암, 신장암, 수뇨관암, 신장세포암종, 신장골반암종, 중추신경계 종양 등이 될 수 있고, 다른 예로서, 난소암이 될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 암의 동물모델에 본 발명의 바이러스 복합체를 투여할 경우, 암조직의 부피 및 중량이 대폭적으로 감소되고(도 7a 및 7b), 이러한 암조직의 부피감소는 동물모델의 외관으로도 충분히 확인할 수 있으며(도 7c), 실제로 상기 암조직내에서 세포사멸이 활발히 진행됨을 확인하였다(도 7d). 이러한 항암활성은 본 발명의 바이러스 복합체에 의하여 암조직의 세포내에서 EGFR의 발현이 감소되었기 때문임을 확인하였다(도 7e 내지 7g).
이처럼, 본 발명의 바이러스 복합체는 생체내에서 암조직에 특이적으로 작용하여 항암활성을 나타내므로, 적어도 EpCAM이 과발현되는 암질환에 대하여 효과적인 항암활성을 나타낼 수 있을 것으로 분석되었다.
본 발명의 용어 "약학 조성물"이란, 질병의 예방 또는 치료를 목적으로 제조된 조성물을 의미하며, 각각 통상의 방법에 따라 다양한 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은, 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있는데, 상기 담체는 비자연적 담체(non-naturally occuring carrier)를 포함할 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 폴리카프로락톤(polycaprolactone), 폴리락틱액시드(Poly Lactic Acid), 폴리-L-락틱액시드(poly-L-lactic acid), 광물유 등을 들 수 있다.
상기 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 담체의 형태로는 각종 부정형의 담체, 마이크로 스피어, 나노파이버 등을 포함할 수 있다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 임상 투여 시에 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 유효성분인 바이러스 복합체의 특성상 비경구 방법으로 투여함이 보다 바람직하다.
경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 추출물과 이의 분획물들에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다.
경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제 등이 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물에 포함된 메조포러스 생활성 글라스 나노 파티클의 함량은 특별히 이에 제한되지않으나, 최종 조성물 총 중량을 기준으로 0.0001 내지 80 중량%, 0.0001 내지 50 중량%, 보다 구체적으로 0.01 내지 20 중량%의 함량으로 포함될 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시양태는 상기 바이러스 복합체 또는 약학 조성물을 EpCAM가 과발현되는 암질환이 발병된 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암의 치료방법을 제공한다.
이때, 상기 "암질환", “바이러스 복합체”, "예방" 및 "치료"에 대한 설명은 상기에서 서술한 바와 같다.
본 발명의 약학 조성물은 EpCAM가 과발현되는 암질환의 예방 또는 치료 효과를 나타내므로, 이를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 본 발명의 암의 치료방법은 암질환의 치료에 유용하게 활용될 수 있다.
본 발명의 용어, "투여"는 적절한 방법으로 개체에게 상기 바이러스 복합체 또는 약학 조성물을 도입하는 일체의 행위를 의미한다.
본 발명의 용어, "개체"는 암질환이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 쥐, 생쥐, 가축 등의 모든 동물을 의미하고, 구체적인 예로, 인간을 포함한 포유동물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있는데, 상기 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료 또는 예방에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 본 발명 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율 치료기간, 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 단독으로 투여하거나 공지된 익상편 치료제와 병용하여 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하다.
본 발명의 약학적 조성물은 경구, 정맥 내, 피하, 피 내, 비강 내, 복강 내, 근육 내, 경피 등 다양한 방식을 이용하여 투여할 수 있으나, 유효성분인 바이러스 복합체의 특성상 비경구 방법으로 투여함이 보다 바람직하고, 이의 투여량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
또한, 상기 약학 조성물의 투여량은 사용목적, 질환의 중독도, 환자의 연령, 체중, 성별, 기왕력, 또는 유효성분으로서 사용되는 물질의 종류 등을 고려하여 당업자가 결정할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약학 조성물은 성인 1인당 1㎎/㎏ 내지 200 ㎎/㎏, 구체적으로 1 ㎎/㎏ 내지 100 ㎎/㎏, 더욱 구체적으로 20 내지 40 ㎎/㎏로 투여할 수 있고, 상기 약학 조성물의 투여빈도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 1일 1회 투여하거나 또는 용량을 분할하여 수회 투여할 수 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
또한, 상기 약학 조성물의 투여량은 본 발명의 바이러스 복합체가 80 내지 120 ㎎/㎏, 더욱 구체적으로 100 ㎎/㎏로 투여되게 조절할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 제공하는 항-EpCAM 항체-AAV2/shEGFR 복합체는 생체내에서 면역반응을 유발하지 않으면서도, EpCAM를 과발현하는 종양세포에서 EGFR의 발현수준을 현저히 감소시켜서, 종양세포의 사멸을 유도할 수 있으므로, 보다 효과적이면서도 안전한 항암치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.
도 1은 본 발명에서 제공하는 항-EpCAM 항체-AAV2/shEGFR 복합체의 제조과정 및 EpCAM 과발현 종양세포에 대한 작용효과를 나타내는 개략도이다.
도 2a는 세포내에서 발현된 shEGFR의 형태를 나타내는 개략도이다.
도 2b는 재조합 벡터 pAAV/shEGFR의 합성과정을 나타내는 개략도이다.
도 3a는 스트렙타비딘이 결합된 재조합 바이러스를 합성을 검증한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다.
도 3b는 본 발명에서 제공하는 재조합 AAV2 바이러스와 항-EpCAM 항체-AAV2 복합체의 형태를 촬영한 투과전자현미경 사진으로서, 좌측은 재조합 AAV2 바이러스를 나타내고, 우측은 항-EpCAM 항체-AAV2 복합체를 나타낸다.
도 4a는 EpCAM-양성 OVCAR3 세포주와 EpCAM-음성 A2780 세포주에 항-EpCAM 항체-AAV2/mCh 복합체를 감염시키고, 감염된 세포주에서 발현되는 적색형광단백질인 mCherry의 발현수준을 FACS 분석을 통해 비교한 결과를 나타내는 다이어그램이다.
도 4b는 티로글로불린이 전처리되거나 또는 전처리되지 않은 EpCAM-양성 OVCAR3 세포주에 항-EpCAM 항체-AAV2/mCh 복합체를 감염시키고, 감염된 세포주에서 발현되는 적색형광단백질인 mCherry의 발현수준을 FACS 분석을 통해 비교한 결과를 나타내는 다이어그램이다.
도 4c는 EpCAM-양성 OVCAR3 세포주에 재조합 바이러스 AAV2/mCh 또는 항-EpCAM 항체-AAV2/mCh 복합체를 감염시키고, 감염된 세포주에서 발현되는 적색형광단백질인 mCherry의 발현수준을 공초점현미경으로 촬영한 사진이다.
도 5a는 항-EpCAM 항체-AAV2 복합체(Ab-AAV2/shEGFR), scrambled 항-EpCAM 항체-AAV2/scEGFR 복합체(Ab-AAV2/scEGFR) 및 화학적으로 합성한 EGFR siRNA를 탑재한 DOPC 리포좀(DOPC/siEGFR)을 처리한 OVCAR3 세포주에서 발현된 EGFR의 단백질 수준을 측정한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진 및 정량그래프이다.
도 5b는 항-EpCAM 항체-AAV2 복합체(Ab-AAV2/shEGFR), scrambled 항-EpCAM 항체-AAV2/scEGFR 복합체(Ab-AAV2/scEGFR) 및 화학적으로 합성한 EGFR siRNA를 탑재한 DOPC 리포좀(DOPC/siEGFR)을 처리한 OVCAR3 세포주에서 발현된 EGFR의 mRNA 수준을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5c는 항-EpCAM 항체(EpCAM Ab), scrambled 항-EpCAM 항체-AAV2/scEGFR 복합체(Ab-AAV2/scEGFR), 상기 실시예 2에서 제작된 항-EpCAM 항체-AAV2 복합체(Ab-AAV2/shEGFR) 및 화학적으로 합성한 EGFR siRNA를 탑재한 DOPC 리포좀(DOPC/siEGFR)을 처리한 OVCAR3 세포주를 배양하여 형성된 콜로니의 수를 비교한 결과를 나타내는 사진 및 정량그래프이다.
도 5d는 항-EpCAM 항체-AAV2 복합체(Ab-AAV2/shEGFR) 및 scrambled 항-EpCAM 항체-AAV2/scEGFR 복합체(Ab-AAV2/scEGFR)를 처리한 OVCAR3 세포주의 세포사멸 수준을 FACS 분석을 통해 측정한 결과를 나타내는 다이어그램 및 정량그래프이다.
도 6a는 Cy5.5로 형광표지된 scrambled AAV2/scEGFR 재조합 바이러스(Cy5.5-AAV2) 및 Cy5.5로 형광표지된 scrambled 항-EpCAM 항체-AAV2/scEGFR 복합체(Cy5.5-Ab-AAV2)의 생체내 표적화 수준을 분석한 결과를 나타내는 형광사진 및 정량그래프이다.
도 6b는 재조합 바이러스(AAV2/shEGFR) 또는 복합체(Ab-AAV2/shEGFR)가 투여된 면역결핍 동물모델에서, 면역반응 유도효과를 분석하기 위하여 TNF-α의 수준과 INF-γ의 수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6c는 재조합 바이러스(AAV2/shEGFR), 복합체(Ab-AAV2/shEGFR) 또는 LPS가 투여된 사람유래 PBMC에서, 면역반응 유도효과를 분석하기 위하여 TNF-α의 수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7a는 재조합 바이러스(AAV2/shEGFR), 복합체(Ab-AAV2/shEGFR), 비교복합체(Ab-AAV2/scEGFR) 및 DOPC 리포좀(DOPC/siEGFR)이 1주당 1회 투여된 동물모델에서, 시간의 경과에 따른 종양조직의 부피 및 중량변화를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7b는 복합체(Ab-AAV2/shEGFR) 및 DOPC 리포좀(DOPC/siEGFR)이 2주당 1회 투여된 동물모델에서, 시간의 경과에 따른 종양조직의 부피 및 중량변화를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7c는 재조합 바이러스(AAV2/shEGFR), 복합체(Ab-AAV2/shEGFR), 비교복합체(Ab-AAV2/scEGFR) 및 DOPC 리포좀(DOPC/siEGFR)이 1주당 1회 투여된 동물모델 및 복합체(Ab-AAV2/shEGFR) 및 DOPC 리포좀(DOPC/siEGFR)이 2주당 1회 투여된 동물모델의 종양부위의 부피를 육안으로 관찰한 결과를 나타내는 사진이다.
도 7d는 재조합 바이러스(AAV2/shEGFR), 복합체(Ab-AAV2/shEGFR), 비교복합체(Ab-AAV2/scEGFR) 및 DOPC 리포좀(DOPC/siEGFR)이 1주당 1회 투여된 동물모델 및 복합체(Ab-AAV2/shEGFR) 및 DOPC 리포좀(DOPC/siEGFR)이 2주당 1회 투여된 동물모델에서 적출된 각각의 종양조직을 대상으로 TUNEL 분석을 수행한 결과를 나타내는 형광현미경 사진이다.
도 7e는 재조합 바이러스(AAV2/shEGFR), 복합체(Ab-AAV2/shEGFR), 비교복합체(Ab-AAV2/scEGFR) 및 DOPC 리포좀(DOPC/siEGFR)이 1주당 1회 투여된 동물모델 및 복합체(Ab-AAV2/shEGFR) 및 DOPC 리포좀(DOPC/siEGFR)이 2주당 1회 투여된 동물모델에서 적출된 각각의 종양조직에서 발현된 EGFR의 mRNA 수준을 정량분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7f는 재조합 바이러스(AAV2/shEGFR), 복합체(Ab-AAV2/shEGFR), 비교복합체(Ab-AAV2/scEGFR) 및 DOPC 리포좀(DOPC/siEGFR)이 1주당 1회 투여된 동물모델 및 복합체(Ab-AAV2/shEGFR) 및 DOPC 리포좀(DOPC/siEGFR)이 2주당 1회 투여된 동물모델에서 적출된 각각의 종양조직에서 발현된 EGFR의 단백질 수준을 분석한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 사진 및 정량그래프이다.
도 7g는 재조합 바이러스(AAV2/shEGFR), 복합체(Ab-AAV2/shEGFR), 비교복합체(Ab-AAV2/scEGFR) 및 DOPC 리포좀(DOPC/siEGFR)이 1주당 1회 투여된 동물모델 및 복합체(Ab-AAV2/shEGFR) 및 DOPC 리포좀(DOPC/siEGFR)이 2주당 1회 투여된 동물모델에서 적출된 각각의 종양조직을 에서 발현된 EGFR의 세포내 수준을 면역염색을 통해 확인한 결과를 나타내는 공초점현미경 사진이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: EGFR shRNA 발현용 재조합 벡터 및 재조합 바이러스의 제작
본 발명자들은 하기 서열번호 1 및 2로 구성된 dsDNA 올리고머(shEGFR)를 HpaI-XhoI 제한효소자리를 이용하여 pSicoR plasmid (Addgene, UK)에 삽입하여, 재조합 벡터 pSicoR/shEGFR를 수득하였다. 이때, 하기 서열번호 1 및 2에서 밑줄 친 서열은 EGFR 유전자 (NM_005228.3)에 대한 센스 및 안티센스 서열을 나타내고, 양 말단은 HpaI-XhoI 제한효소자리가 포함되어 있으며, 상기 dsDNA 올리고머(shEGFR)가 세포내에서 발현될 경우, 작은 헤어핀 구조를 갖게 된다(도 2a). 도 2a는 세포내에서 발현된 shEGFR의 형태를 나타내는 개략도이다.
5'-GTTAAC(GGCACGAGTAACAAGCTCA)TTCAAGAGA(TGAGCTTGTTACTCGTGCC)TTTTTCTC GA G-3'(서열번호 1)
5'-CTCGAGAAAAA(GGCACGAGTAACAAGCTCA)TCTCTTGAA(TGAGCTTGTTACTCGTGCC)GTTAA C-3'(서열번호 2)
상기 pSicoR/shEGFR에 XbaI-HindIII 제한효소를 처리하여 U6 promoter-driven shEGFR 발현카세트 단편을 수득하고, 상기 발현카세트 단편을 pAAV-MCS(Stratagene, US) 플라스미드에 있는 ITR (inverted terminal repeat) 서열에 삽입하여, 재조합 벡터 pAAV/shEGFR을 수득하였다(도 2b). 도 2b는 재조합 벡터 pAAV/shEGFR의 합성과정을 나타내는 개략도이다. 상기 도 2b에서 보듯이, U6 promoter에 조절되는 shEGFR 발현 카세트는 2개의 ITR 서열 사이에 위치하게 된다.
상기 수득한 pAAV/shEGFR을 pHelper 플라스미드와 함께 293 세포에 도입하여, 재조합 AAV2 바이러스를 제작하였다. 상기 제작된 재조합 AAV2 바이러스는 농도구배 초원심분리 방법(gradient ultracentrifugation )으로 정제하였고, 정제된 바이러스의 역가는 QuickTiter AAV Quantitation Kit (Cell Biolabs)를 이용하여 측정하였으며, 측정된 역가는 4.0 × 1011 GC/㎖임을 확인하였다.
실시예 2: 항-EpCAM 항체와 재조합 바이러스가 결합된 복합체의 제작
먼저, 상기 실시예 1에서 제작된 재조합 바이러스 1 x 1011개를 Streptavidin Conjugation Kit (ab102921, Abcam)에 적용하여, 스트렙타비딘이 결합된 재조합 바이러스를 수득하였다. 대략적으로, 상기 키트에 포함된 sulfo NHS-streptavidin이 포함된 50 mM amine-free PBS buffer (pH 7.0)에 재조합 바이러스를 가하고, 4시간동안 약하게 저어주면서 반응시켜서, 스트렙타비딘이 결합된 재조합 바이러스를 수득하였다. 이때 streptavidin/capsid proteins의 비율은 1:10으로 유지하였다. 이어, 상기 키트에 포함된 Quencher reagent를 첨가한 후 결합하지 않은 스트렙타비딘은 센트리콘을 사용한 원심분리방법을 사용하여 제거하였다. 제조된 스트렙타비딘이 결합된 재조합 바이러스는 Biotin-HRP(biotinylated peroxidase, Thermo Fisher Scientific)을 이용한 면역블럿 분석법으로 확인하였다(도 3a).
도 3a는 스트렙타비딘이 결합된 재조합 바이러스를 합성을 검증한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다.
상기 수득한 스트렙타비딘이 결합된 재조합 바이러스 1 x 1011개에 10 ㎍ 바이오틴이 결합된 항-EpCAM 항체(ab79079, Abcam)를 가하고 24시간 동안 반응시켜서, 항-EpCAM 항체-AAV2 복합체를 제작하였다. 이때, 상기 항체와 바이러스의 혼합비는 2:10(몰비)으로 하였고, 제작된 복합체는 센트리콘을 사용한 원심분리방법을 사용하여 농축하였다.
상기 제작된 복합체를 투과 전자현미경에 적용하여, 상기 복합체의 형태를 분석하였다(도 3b).
도 3b는 본 발명에서 제공하는 재조합 AAV2 바이러스와 항-EpCAM 항체-AAV2 복합체의 형태를 촬영한 투과전자현미경 사진으로서, 좌측은 재조합 AAV2 바이러스를 나타내고, 우측은 항-EpCAM 항체-AAV2 복합체를 나타낸다.
도 3b에서 보듯이, 형태 및 크기면에서 재조합 AAV2 바이러스와 항-EpCAM 항체-AAV2 복합체는 별다른 차이를 나타내지 않음을 확인하였다.
따라서, 상기 재조합 AAV2 바이러스에 항-EpCAM 항체를 결합시켜도, 재조합 AAV2 바이러스의 형태 및 기능에 영향을 미치지는 않을 것으로 분석되었다.
실시예 3: 항-EpCAM 항체-AAV2 복합체의 암세포 표적화 특성 분석
실시예 3-1: EpCAM 발현여부에 따른 항-EpCAM 항체-AAV2 복합체의 효과
다양한 난소암 세포주 중에서, EpCAM-양성 OVCAR3 세포주와 EpCAM-음성 A2780 세포주를 대상으로, 항-EpCAM 항체가 결합된 AAV2의 감염효율을 FACS 분석을 이용하여 비교하였다.
먼저, shEGFR를 코딩하는 뉴클레오티드 대신에, 적색형광단백질인 mCherry를 코딩하는 뉴클레오티드를 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 1 및 2와 동일한 방법을 수행하여, 항-EpCAM 항체-AAV2/mCh 복합체를 제작하였다.
다음으로, 상기 제작된 항-EpCAM 항체-AAV2/mCh 복합체를 OVCAR3 세포주 또는 A2780 세포주에 각각 접종하고 4시간 동안 감염시킨 후, 각 세포를 세척하고 68시간 동안 배양하였다. 배양이 종료된 후, FACS 분석법을 이용하여 각 세포에서 mCherry의 발현수준을 측정하였다(도 4a). 이때, 대조군으로는 항-EpCAM 항체-AAV2/mCh 복합체를 접종하지 않은 OVCAR3 세포주 또는 A2780 세포주를 사용하였다.
도 4a는 EpCAM-양성 OVCAR3 세포주와 EpCAM-음성 A2780 세포주에 항-EpCAM 항체-AAV2/mCh 복합체를 감염시키고, 감염된 세포주에서 발현되는 적색형광단백질인 mCherry의 발현수준을 FACS 분석을 통해 비교한 결과를 나타내는 다이어그램이다.
도 4a에서 보듯이, EpCAM-양성 OVCAR3 세포주에서는 mCherry의 발현수준이 63.5%를 나타내었으나, EpCAM-음성 A2780 세포주에서는 mCherry의 발현수준이 7.3%에 불과함을 확인하였다.
따라서, 본 발명에서 제공하는 항-EpCAM 항체-AAV2 복합체는 EpCAM-양성 암세포에 효과를 나타냄을 알 수 있었다.
실시예 3-2: 항-EpCAM 항체-AAV2 복합체의 작용에 미치는 항-EpCAM 항체의 효과(I)
상기 실시예 3-1에서 얻어진 결과에 항-EpCAM 항체의 역할을 확인하기 위하여, 항-EpCAM 항체가 인식하는 EpCAM의 에피토프와 동일한 에피토프를 갖는 것으로 알려진 티로글로불린(thyroglobulin)의 전처리 여부에 따른 항-EpCAM 항체-AAV2 복합체의 효과를 분석하였다.
대략적으로, 500 ㎍/㎖의 티로글로불린을 전처리하거나 또는 처리하지 않은 EpCAM-양성 OVCAR3 세포주에 항-EpCAM 항체-AAV2/mCh 복합체를 감염시키는 것을 제외하고는, 상기 실시예 3-1과 동일한 방법을 수행하여, mCherry의 발현수준을 분석하였다(도 4b).
도 4b는 티로글로불린이 전처리되거나 또는 전처리되지 않은 EpCAM-양성 OVCAR3 세포주에 항-EpCAM 항체-AAV2/mCh 복합체를 감염시키고, 감염된 세포주에서 발현되는 적색형광단백질인 mCherry의 발현수준을 FACS 분석을 통해 비교한 결과를 나타내는 다이어그램이다.
도 4b에서 보듯이, 티로글로불린이 전처리된 OVCAR3 세포주에서는 mCherry의 발현수준이 63.5%를 나타내었으나, 티로글로불린이 전처리되지 않은 OVCAR3 세포주에서는 mCherry의 발현수준이 27.1%를 나타냄을 확인하였다.
따라서, 상기 항-EpCAM 항체-AAV2/mCh 복합체의 작용효과는 OVCAR3 세포주에서 발현되는 EpCAM에 의존적인 것으로 분석되었다.
실시예 3-3: 항-EpCAM 항체-AAV2 복합체의 작용에 미치는 항-EpCAM 항체의 효과(II)
상기 실시예 3-2에서 확인된 항-EpCAM 항체의 역할을 검증하기 위하여, 면역염색분석을 수행하였다.
대략적으로, shEGFR를 코딩하는 뉴클레오티드 대신에, 적색형광단백질인 mCherry를 코딩하는 뉴클레오티드를 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 1 및 2와 동일한 방법을 수행하여, 재조합 바이러스 AAV2/mCh와 항-EpCAM 항체-AAV2/mCh 복합체를 각각 제작하였다. 이어, 상기 제작된 AAV2/mCh와 항-EpCAM 항체-AAV2/mCh 복합체를 1 x 1010 GC/㎖의 OVCAR3 세포주에 가하여 4시간 동안 감염시킨 후, 각 세포를 세척하고 68시간 동안 배양하였다. 배양이 종료된 후, 각 세포를 공초점현미경으로 촬영하였다(도 4c). 이때, 대조염색은 DAPI를 사용하여 수행되었다.
도 4c는 EpCAM-양성 OVCAR3 세포주에 재조합 바이러스 AAV2/mCh 또는 항-EpCAM 항체-AAV2/mCh 복합체를 감염시키고, 감염된 세포주에서 발현되는 적색형광단백질인 mCherry의 발현수준을 공초점현미경으로 촬영한 사진이다.
도 4c에서 보듯이, 항 EpCAM 항체-AAV2/mCh 복합체를 감염시킨 세포주에서는 mCherry 단백질 형광이 강하게 관찰되는 반면, native AAV2/mCh 바이러스를 감염시킨 세포주에서는 mCherry 단백질 형광이 약하게 관찰됨을 확인하였다.
따라서, 항-EpCAM 항체와 OVCAR3 세포표면에 발현된 EpCAM 단백질간의 상호작용에 의하여 AAV2 바이러스의 감염이 효과적으로 수행됨을 알 수 있었다.
실시예 4: 세포 수준에서 항-EpCAM 항체-AAV2/shEGFR 복합체의 효과분석
실시예 4-1: EGFR 단백질 수준 감소효과
6-웰 플레이트에 배양된 OVCAR3 세포주에, 상기 실시예 2에서 제작된 항-EpCAM 항체-AAV2 복합체, scrambled 항-EpCAM 항체-AAV2/scEGFR 복합체 및 화학적으로 합성한 EGFR siRNA를 탑재한 DOPC 리포좀을 각각 4시간 동안 처리한 다음, 68시간 동안 배양하였다. 배양이 종료된 후, 배양물을 원심분리하여 세포를 수득하고, 상기 수득한 각 세포를 파쇄하여 각각의 세포파쇄물을 수득하였다. 상기 수득한 세포파쇄물을 대상으로, 항 EGFR 항체(A10, Santa Cruz Biotechnology), 이차항체(HRP-conjugated anti-mouse IgG secondary antibodies; SC-2031, Santa Cruz Biotechnology) 및 ECL 용액(Bio-Rad, US)을 사용한 웨스턴블럿 분석을 수행하여, 상기 각 세포에서 발현된 EGFR의 발현수준을 비교하였다(도 5a). 이때, 대조군으로는 PBS만을 처리한 OVCAR3 세포주를 사용하고, 웨스턴블럿 분석시의 내부대조군으로는 β-액틴을 사용하였다.
도 5a는 항-EpCAM 항체-AAV2 복합체(Ab-AAV2/shEGFR), scrambled 항-EpCAM 항체-AAV2/scEGFR 복합체(Ab-AAV2/scEGFR) 및 화학적으로 합성한 EGFR siRNA를 탑재한 DOPC 리포좀(DOPC/siEGFR)을 처리한 OVCAR3 세포주에서 발현된 EGFR의 단백질 수준을 측정한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진 및 정량그래프이다.
도 5a에서 보듯이, 대조군과 비교하여 Ab-AAV2/scEGFR을 처리한 경우에는 EGFR 수준이 다소 감소되었으나, Ab-AAV2/shEGFR 및 DOPC/siEGFR을 처리한 경우에는 EGFR 수준이 큰 폭으로 감소되었고, 특히 Ab-AAV2/shEGFR 을 처리한 경우에 가장 작은 EGFR 수준(대조군 대비 약 31~39%)을 나타냄을 확인하였다.
실시예 4-2: EGFR mRNA 수준 감소효과
상기 실시예 4-1에서 수득한 각각의 세포파쇄물을 RNeasy mini kit (Qiagen, US)에 적용하여 각 세포의 총 RNA를 추출하고, 상기 추출된 총 RNA를 TOPscript cDNA synthesis kit (Enzynomics, Korea)에 적용하여 각각의 cDNA를 합성하였다. 상기 합성된 cDNA, EGFR 유전자에 특이적인 프라이머 (서열번호 3 및 4) 및 StepOne qRT-PCR system (Thermo Fisher scientific)을 이용한 qRT-PCR을 수행하여, 각 세포에서 발현된 EGFR의 mRNA 수준을 비교하였다(도 5b). 이때, 내부대조군으로는 β-액틴을 사용하였다.
EGFR F: 5'-TGCCCATGAGAAATTTACAGG-3'(서열번호 3)
EGFR R: 5'-ATGTTGCTGAGAAAGTCACTGC-3'(서열번호 4)
도 5b는 항-EpCAM 항체-AAV2 복합체(Ab-AAV2/shEGFR), scrambled 항-EpCAM 항체-AAV2/scEGFR 복합체(Ab-AAV2/scEGFR) 및 화학적으로 합성한 EGFR siRNA를 탑재한 DOPC 리포좀(DOPC/siEGFR)을 처리한 OVCAR3 세포주에서 발현된 EGFR의 mRNA 수준을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5b에서 보듯이, 대조군과 비교하여 Ab-AAV2/scEGFR을 처리한 경우에는 EGFR의 mRNA수준이 변화되지 않았으나, Ab-AAV2/shEGFR 및 DOPC/siEGFR을 처리한 경우에는 EGFR의 mRNA수준이 감소되었고, 특히 Ab-AAV2/shEGFR 을 처리한 경우에 가장 작은 EGFR의 mRNA수준을 나타냄을 확인하였다.
실시예 4-3: 콜로니 형성 억제효과
상기 항-EpCAM 항체-AAV2/shEGFR 복합체가 감염된 OVCAR3 세포주에서 EGFR의 발현억제가 세포의 콜로니 형성에 미치는 효과를 분석하였다.
대략적으로, 6-웰 플레이트에 배양된 OVCAR3 세포주를 24시간 동안 배양한 후, 항-EpCAM 항체, scrambled 항-EpCAM 항체-AAV2/scEGFR 복합체, 상기 실시예 2에서 제작된 항-EpCAM 항체-AAV2 복합체 및 화학적으로 합성한 EGFR siRNA를 탑재한 DOPC 리포좀을 각각 4시간 동안 처리한 다음, 68시간 동안 배양하였다. 배양이 종료된 후, 각 세포에 4%(v/v) 파라포름알데히드를 처리하여 고정시키고, 0.5%(w/v) 크리스탈 바이올렌 용액을 처리하여 염색한 다음, Minibis Bioimaging system (DNR Bio-Imaging Systems Ltd., Israel)을 이용하여 염색된 콜로니를 계수하였다(도 5c). 이때, 대조군으로는 PBS만을 처리한 OVCAR3 세포주를 사용하였다.
도 5c는 항-EpCAM 항체(EpCAM Ab), scrambled 항-EpCAM 항체-AAV2/scEGFR 복합체(Ab-AAV2/scEGFR), 상기 실시예 2에서 제작된 항-EpCAM 항체-AAV2 복합체(Ab-AAV2/shEGFR) 및 화학적으로 합성한 EGFR siRNA를 탑재한 DOPC 리포좀(DOPC/siEGFR)을 처리한 OVCAR3 세포주를 배양하여 형성된 콜로니의 수를 비교한 결과를 나타내는 사진 및 정량그래프이다.
도 5c에서 보듯이, EpCAM Ab 및 Ab-AAV2/scEGFR의 경우에는 대조군과 별다른 차이를 보이지 않았으나, Ab-AAV2/shEGFR 및 DOPC/siEGFR의 경우에는 대조군 보다도 콜로니 수준이 현저히 감소되었고, 특히 Ab-AAV2/shEGFR의 경우에는 가장 낮은 콜로니 수준(대조군 대비 약 29.5%)을 나타냄을 확인하였다.
따라서, 항-EpCAM 항체-AAV2/shEGFR 복합체를 사용하면 EGFR 발현억제를 유도함으로써 OVCAR3 세포주에서 anchorage-dependent clonogenicity를 억제할 것으로 분석되었다.
실시예 4-4: 세포사멸 유도효과
상기 항-EpCAM 항체-AAV2/shEGFR 복합체가 감염된 OVCAR3 세포주에서 EGFR의 발현억제가 세포사멸에 미치는 효과를 분석하였다.
대략적으로, 5 ×105개의 OVCAR3 세포에, 1×1010 GC/㎖의 상기 실시예 2에서 제작된 항-EpCAM 항체-AAV2 복합체 또는 scrambled 항-EpCAM 항체-AAV2/scEGFR 복합체를 각각 4시간 동안 처리한 다음, 68시간 동안 배양하였다. 배양이 종료된 후, 배양물을 원심분리하여 각 세포를 수득하고, 수득한 세포를 propidium iodide 및 FITC-labeled Annexin-V로 염색한 후, Guava easyCyte flow cytometry system으로 분석하였다(도 5d). 이때, 대조군으로는 PBS만을 처리한 OVCAR3 세포주를 사용하였다.
도 5d는 항-EpCAM 항체-AAV2 복합체(Ab-AAV2/shEGFR) 및 scrambled 항-EpCAM 항체-AAV2/scEGFR 복합체(Ab-AAV2/scEGFR)를 처리한 OVCAR3 세포주의 세포사멸 수준을 FACS 분석을 통해 측정한 결과를 나타내는 다이어그램 및 정량그래프이다.
도 5d에서 보듯이, 대조군 및 Ab-AAV2/scEGFR의 경우에는 사멸된 세포가 특별히 검출되지 않았으나, Ab-AAV2/shEGFR의 경우에는 세포사멸이 87.4%만큼 증가하였고 necrotic cell death도 8.6%로 증가됨을 확인하였다.
따라서, 항-EpCAM 항체-AAV2/shEGFR 복합체를 사용하면 EGFR 발현억제를 유도함으로써 OVCAR3 세포주에서 세포사멸을 유도할 것으로 분석되었다.
실시예 5: 동물모델에서 항-EpCAM 항체-AAV2/shEGFR 복합체의 효과분석
실시예 5-1: 항-EpCAM 항체-AAV2 복합체의 생체내 표적화 수준
EpCAM-양성 난소암 세포주인 OVCAR3 세포주(1 ⅹ 108)를 5주 주령의 암컷 BALB/c 누드 마우스의 왼쪽 허벅지에 이식한 후, 암조직의 부피가 200 ㎣가 될 때까지 사육하였다.
형광물질(Cy5.5, 0.5 ㎍), Cy5.5로 형광표지된 scrambled AAV2/scEGFR 재조합 바이러스(Cy5.5-AAV2, 1 x 1012 GC/㎖) 또는 Cy5.5로 형광표지된 scrambled 항-EpCAM 항체-AAV2/scEGFR 복합체(Cy5.5-Ab-AAV2, 1 x 1012 GC/㎖)를 상기 마우스의 꼬리혈관을 통해 정맥주사하고, 4시간 및 24시간이 경과한 시점에서, 주요 장기(간, 비장, 신장, 심장 및 폐)와 종양조직을 적출하고, 적출된 각 장기 및 종양조직을 IVIS Spectrum (Caliper Life Science Inc., USA)에 적용하여 형광표지의 축적수준을 비교하였다(도 6a).
도 6a는 Cy5.5로 형광표지된 scrambled AAV2/scEGFR 재조합 바이러스(Cy5.5-AAV2) 및 Cy5.5로 형광표지된 scrambled 항-EpCAM 항체-AAV2/scEGFR 복합체(Cy5.5-Ab-AAV2)의 생체내 표적화 수준을 분석한 결과를 나타내는 형광사진 및 정량그래프이다.
도 6a에서 보듯이, 항체가 결합되지 않은 대조군(Cy5.5) 및 재조합 바이러스(Cy5.5-AAV2)의 경우에는, 간에서 가장 많이 검출되었고, 그 다음으로 신장에서 검출되었으나, 항체가 결합된 복합체(Cy5.5-Ab-AAV2)는 종양조직에서 가장 많이 검출되었고, 그 다음으로 신장에서 검출됨을 확인하였다.
신장의 경우, 체내에서 잔류하지 못한 성분이 소변을 통해 배출되기 위한 것으로 분석되었으므로, 실질적으로 항체가 결합되지 않은 대조군(Cy5.5) 및 재조합 바이러스(Cy5.5-AAV2)는 간에 축적되고, 항체가 결합된 복합체(Cy5.5-Ab-AAV2)은 종양조직에 축적됨을 알 수 있었다.
상기 결과는, 항체가 결합된 복합체(Cy5.5-Ab-AAV2)가 항-EpCAM 항체에 의하여 종양에 대해 표적화되어 종양조직에 축적되는 것으로 분석되었다.
실시예 5-2: 항-EpCAM 항체-AAV2/shEGFR 복합체의 면역반응 유도효과
면역결핍 동물모델인 C57BL/6J 마우스에, 상기 실시예 1에서 제작한 재조합 바이러스(AAV2/shEGFR) 또는 상기 실시예 2에서 제작한 복합체(Ab-AAV2/shEGFR)를 PBS 100 ㎕ 당 1 x 1012 GC/㎖의 수준으로 정맥주사하고, 6시간 또는 24시간이 경과된 시점에서, 상기 마우스의 심장에서 채혈하였다. 상기 채혈된 혈액으로부터 얻어진 혈청을 원심분리하여 혈장을 수득하고, TNF-α Mouse ELISA Kit (Thermo Fisher Scientific) 및 INF-γ Mouse ELISA Kit (Thermo Fisher Scientific)을 이용하여 상기 수득한 혈장에 포함된 TNF-α의 수준과 INF-γ의 수준을 측정한 후, 비교하였다(도 6b).
도 6b는 재조합 바이러스(AAV2/shEGFR) 또는 복합체(Ab-AAV2/shEGFR)가 투여된 면역결핍 동물모델에서, 면역반응 유도효과를 분석하기 위하여 TNF-α의 수준과 INF-γ의 수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6b에서 보듯이, 어떠한 경우에도 TNF-α 및 INF-γ의 수준이 유의하게 증가되지 않음을 확인하였다.
따라서, 항-EpCAM 항체-AAV2/shEGFR 복합체는 면역반응을 유도하지는 않는 것으로 분석되었다.
실시예 5-3: 사람유래 세포에 미치는 항-EpCAM 항체-AAV2/shEGFR 복합체의 면역반응 유도효과
공지된 방법(standard Ficoll-Paque density-gradient centrifugation method)에 따라, 사람의 혈액으로부터 말초혈액 단핵세포(Peripheral blood mononuclear cells, PBMC)를 분리하고, 분리된 PBMC를 96-웰 플레이트에 웰당 1 x 104 세포수를 접종한 다음, 이에 RPMI 1640 배지(10% FBS, 1% penicillin-streptomycin, 1% L-glutamine 포함)를 가하고 12시간 동안 배양하였다. 배양이 종료된 후, 상기 PBMC에 상기 실시예 1에서 제작한 재조합 바이러스(AAV2/shEGFR, 1 x 1010 GC/㎖), 상기 실시예 2에서 제작한 복합체(Ab-AAV2/shEGFR, 1 x 1010 GC/㎖) 또는 LPS(lipopolysaccharide, 50 ng/㎖)를 처리하고, 6시간 또는 24시간이 경과된 시점에서, 상기 PBMC에서 발현된 TNF-α(hTNF-α)의 수준을 TNF-α Mouse ELISA Kit (Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 측정하였다(도 6c). 이때, 대조군으로는 PBS를 처리한 PBMC를 사용하였다.
도 6c는 재조합 바이러스(AAV2/shEGFR), 복합체(Ab-AAV2/shEGFR) 또는 LPS가 투여된 사람유래 PBMC에서, 면역반응 유도효과를 분석하기 위하여 TNF-α의 수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6c에서 보듯이, AAV2/shEGFR 및 Ab-AAV2/shEGFR의 경우에는 대조군과 별다른 차이를 나타내지 않았으나, LPS를 처리한 경우에는 현저히 높은 수준의 TNF-α가 검출됨을 확인하였다.
따라서, 마우스가 아닌 사람에게서도 항-EpCAM 항체-AAV2/shEGFR 복합체는 면역반응을 유도하지는 않을 것으로 분석되었다.
실시예 6: 동물모델에서 항-EpCAM 항체-AAV2/shEGFR 복합체의 항암효과 분석
실시예 6-1: 항-EpCAM 항체-AAV2/shEGFR 복합체의 투여에 따른 생체내 종양부피의 변화(I)
OVCAR3 세포주(1 ⅹ 108)를 5주 주령의 암컷 BALB/c 누드 마우스의 왼쪽 허벅지에 이식한 후, 암조직의 부피가 200 ㎣가 될 때까지 사육하였다.
scrambled 항-EpCAM 항체-AAV2/scEGFR 복합체(Ab-AAV2/scEGFR, 1 x 1012 GC/㎖), 상기 실시예 1에서 제작한 재조합 바이러스(AAV2/shEGFR, 1 x 1010 GC/㎖), 상기 실시예 2에서 제작한 복합체(Ab-AAV2/shEGFR, 1 x 1010 GC/㎖) 또는 화학적으로 합성한 EGFR siRNA를 탑재한 DOPC 리포좀(DOPC/siEGFR, 4 ㎍)을 상기 마우스의 꼬리혈관을 통해 5주일 동안 일주일 간격으로 5회 정맥주사하고 사육하면서, 사육기간의 경과에 따른 종양조직의 부피 및 중량변화를 분석하였다(도 7a). 이때, 대조군으로는 PBS를 투여한 마우스를 사용하였다.
도 7a는 재조합 바이러스(AAV2/shEGFR), 복합체(Ab-AAV2/shEGFR), 비교복합체(Ab-AAV2/scEGFR) 및 DOPC 리포좀(DOPC/siEGFR)이 1주당 1회 투여된 동물모델에서, 시간의 경과에 따른 종양조직의 부피 및 중량변화를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7a에서 보듯이, 대조군과는 달리 Ab-AAV2/shEGFR 및 DOPC/siEGFR의 경우에만 시간의 경과에 따라, 종양의 부피 및 중량이 감소되었고, DOPC/siEGFR 보다도 Ab-AAV2/shEGFR의 경우에 가장 높은 수준으로 종양의 부피 및 중량이 감소됨을 확인하였다.
실시예 6-2: 항-EpCAM 항체-AAV2/shEGFR 복합체의 투여에 따른 생체내 종양부피의 변화(II)
상기 실시예 2에서 제작한 복합체(Ab-AAV2/shEGFR, 1 x 1010 GC/㎖) 또는 화학적으로 합성한 EGFR siRNA를 탑재한 DOPC 리포좀(DOPC/siEGFR, 4 ㎍)을 상기 마우스의 꼬리혈관을 통해 이주일 간격으로 3회 정맥주사하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 6-1과 동일한 방법을 사용하여, 사육기간의 경과에 따른 종양조직의 부피 및 중량변화를 분석하였다(도 7b).
도 7b는 복합체(Ab-AAV2/shEGFR) 및 DOPC 리포좀(DOPC/siEGFR)이 2주당 1회 투여된 동물모델에서, 시간의 경과에 따른 종양조직의 부피 및 중량변화를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7b에서 보듯이, 도 7a의 결과와는 달리, Ab-AAV2/shEGFR의 경우에만 시간의 경과에 따라, 종양의 부피 및 중량이 감소됨을 확인하였다.
실시예 6-3: 종양의 부피변화
상기 실시예 6-1 및 6-2에서 최종 정맥주사 후, 1주일이 경과된 시점에서, 각 마우스의 종양이식 부위의 부피를 육안으로 관찰하여 비교하였다(도 7c).
도 7c는 재조합 바이러스(AAV2/shEGFR), 복합체(Ab-AAV2/shEGFR), 비교복합체(Ab-AAV2/scEGFR) 및 DOPC 리포좀(DOPC/siEGFR)이 1주당 1회 투여된 동물모델 및 복합체(Ab-AAV2/shEGFR) 및 DOPC 리포좀(DOPC/siEGFR)이 2주당 1회 투여된 동물모델의 종양부위의 부피를 육안으로 관찰한 결과를 나타내는 사진이다.
도 7c에서 보듯이, 1주당 1회 투여된 동물모델에서는 Ab-AAV2/shEGFR 및 DOPC/siEGFR의 경우에만 종양세포의 부피가 현저히 감소하였고, 2주당 1회 투여된 동물모델에서는 Ab-AAV2/shEGFR의 경우에만 종양세포의 부피가 현저히 감소됨을 확인하였다.
실시예 6-4: TUNEL 분석
상기 실시예 6-1 및 6-2에서 최종 정맥주사 후, 1주일이 경과된 시점에서, 각 마우스로부터 종양조직을 적출하고, 상기 적출된 종양조직에서 세포사멸이 발생되었는지를 확인하기 위하여, TUNEL 분석을 수행하였다(도 7d).
도 7d는 재조합 바이러스(AAV2/shEGFR), 복합체(Ab-AAV2/shEGFR), 비교복합체(Ab-AAV2/scEGFR) 및 DOPC 리포좀(DOPC/siEGFR)이 1주당 1회 투여된 동물모델 및 복합체(Ab-AAV2/shEGFR) 및 DOPC 리포좀(DOPC/siEGFR)이 2주당 1회 투여된 동물모델에서 적출된 각각의 종양조직을 대상으로 TUNEL 분석을 수행한 결과를 나타내는 형광현미경 사진이다.
도 7d에서 보듯이, 1주당 1회 투여된 동물모델에서는 Ab-AAV2/shEGFR 및 DOPC/siEGFR의 경우에만 종양세포의 사멸이 발생되었고, 2주당 1회 투여된 동물모델에서는 Ab-AAV2/shEGFR의 경우에만 종양세포의 사멸이 발생됨을 확인하였다.
따라서, 본 발명에서 제공하는 항-EpCAM 항체-AAV2/shEGFR 복합체는 생체내에서 종양세포의 사멸을 유도함을 알 수 있었다.
실시예 6-5: qRT-PCR 분석
상기 실시예 6-1 및 6-2에서 최종 정맥주사 후, 1주일이 경과된 시점에서, 각 마우스로부터 종양조직을 적출하고, 상기 적출된 종양조직에서 발현된 EGFR의 mRNA 수준을, 실시예 4-2에서 수행된 qRT-PCR 분석방법에 의해 분석하였다(도 7e).
도 7e는 재조합 바이러스(AAV2/shEGFR), 복합체(Ab-AAV2/shEGFR), 비교복합체(Ab-AAV2/scEGFR) 및 DOPC 리포좀(DOPC/siEGFR)이 1주당 1회 투여된 동물모델 및 복합체(Ab-AAV2/shEGFR) 및 DOPC 리포좀(DOPC/siEGFR)이 2주당 1회 투여된 동물모델에서 적출된 각각의 종양조직에서 발현된 EGFR의 mRNA 수준을 정량분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7e에서 보듯이, 1주당 1회 및 2주당 1회 투여된 모든 동물에서 Ab-AAV2/shEGFR을 투여한 경우에 가장 낮은 수준으로 EGFR의 mRNA가 검출됨을 확인하였다.
실시예 6-6: 웨스턴블럿 분석
상기 실시예 6-1 및 6-2에서 최종 정맥주사 후, 1주일이 경과된 시점에서, 각 마우스로부터 종양조직을 적출하고, 상기 적출된 종양조직에서 발현된 EGFR의 단백질 수준을, 실시예 4-1에서 수행된 웨스턴블럿 분석방법에 의해 분석하였다(도 7f).
도 7f는 재조합 바이러스(AAV2/shEGFR), 복합체(Ab-AAV2/shEGFR), 비교복합체(Ab-AAV2/scEGFR) 및 DOPC 리포좀(DOPC/siEGFR)이 1주당 1회 투여된 동물모델 및 복합체(Ab-AAV2/shEGFR) 및 DOPC 리포좀(DOPC/siEGFR)이 2주당 1회 투여된 동물모델에서 적출된 각각의 종양조직에서 발현된 EGFR의 단백질 수준을 분석한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 사진 및 정량그래프이다.
도 7f에서 보듯이, 1주당 1회 및 2주당 1회 투여된 모든 동물에서 Ab-AAV2/shEGFR을 투여한 경우에 가장 낮은 수준으로 EGFR 단백질이 검출됨을 확인하였다.
실시예 6-7: 면역염색 분석
상기 실시예 6-1 및 6-2에서 최종 정맥주사 후, 1주일이 경과된 시점에서, 각 마우스로부터 종양조직을 적출하고, 상기 적출된 종양조직을 IHC(immunohistochemistry) 염색방법에 의해 면역염색하였다.
대략적으로, 적출된 종양조직에 10% 포르말린을 24시간 동안 가하여 고정시키고, 이를 파라핀 블럭에 포매시킨 후, 6㎛ 두께의 종양조직박편을 수득하였다. 상기 수득한 종양조직박편을 Triton X-100 (0.0125%) 이 포함된 DPBS 완충액으로 세척하고, 1% BSA를 포함하는 DPBS 완충액을 가하여 블로킹 하였다. 이어, 상기 박편에 항-EGFR 항체(A10)를 처리하여 12시간동안 반응시키고, 바이오틴이 결합된 2차 항체를 가하여 30분 동안 반응시킨 다음, DPBS 완충액으로 세척하였다. 마지막으로, 상기 박편에 Vectastain ABC Reagent를 가하고 20분동안 반응시킨 후, DAB(3,3'-diaminobenzidine)을 처리하여 발색시켰다(도 7g).
도 7g는 재조합 바이러스(AAV2/shEGFR), 복합체(Ab-AAV2/shEGFR), 비교복합체(Ab-AAV2/scEGFR) 및 DOPC 리포좀(DOPC/siEGFR)이 1주당 1회 투여된 동물모델 및 복합체(Ab-AAV2/shEGFR) 및 DOPC 리포좀(DOPC/siEGFR)이 2주당 1회 투여된 동물모델에서 적출된 각각의 종양조직을 에서 발현된 EGFR의 세포내 수준을 면역염색을 통해 확인한 결과를 나타내는 공초점현미경 사진이다.
도 7g에서 보듯이, 1주당 1회 및 2주당 1회 투여된 모든 동물에서 Ab-AAV2/shEGFR을 투여한 경우에 세포내 EGFR의 수준이 가장 낮은 수준을 나타냄을 확인하였다.
상기 실시예 6-1 내지 6-7의 결과를 종합하면, 본 발명에서 제공하는 항-EpCAM 항체-AAV2/shEGFR 복합체는 생체내에 존재하는 EpCAM을 발현하는 종양세포에 특이적으로 작용하여, 세포내 EGFR의 수준을 감소시키고, 이에 의하여 종양세포를 소멸시키는 효과를 나타냄을 알 수 있었다.
따라서, 상기 항-EpCAM 항체-AAV2/shEGFR 복합체는 EpCAM을 발현하는 종양세포에 특이적으로 작용하는 항암제로서 사용될 수 있을 것으로 분석되었다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> KOREA INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY <120> Novel viral complex comprising shRNA and anti-EpCAM andtobody and uses thereof <130> KPA181638-KR <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA <400> 1 gttaacggca cgagtaacaa gctcattcaa gagatgagct tgttactcgt gcctttttct 60 cgag 64 <210> 2 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA <400> 2 ctcgagaaaa aggcacgagt aacaagctca tctcttgaat gagcttgtta ctcgtgccgt 60 taac 64 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 tgcccatgag aaatttacag g 21 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA <400> 4 atgttgctga gaaagtcact gc 22

Claims (10)

  1. 상피세포 성장인자 수용체(Epidermal Growth Factor Receptor; EGFR)의 발현을 억제하는 shRNA를 세포에 전달할 수 있는 아데노연관바이러스(adeno-associated virus) 벡터 및 상기 아데노연관바이러스 벡터에 결합된 항-상피세포접착분자(epithelial cell adhesion molecule, EpCAM) 항체를 포함하는, 바이러스 복합체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 shRNA는 서열번호 1 및 2로 구성된 이중가닥 DNA(dsDNA)인 것인, 바이러스 복합체.
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서,
    상기 바이러스 복합체는 생체내에서 면역반응을 유발하지 않는 것인, 바이러스 복합체.
  5. 제1항, 제2항 및 제4항 중 어느 한 항의 바이러스 복합체를 포함하는, 암 예방 또는 치료용 약학 조성물
  6. 제5항에 있어서,
    상기 바이러스 복합체는 EpCAM가 과발현되는 암세포에 특이적으로 작용하는 것인, 약학 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 암세포는 췌장암, 유방암, 전립선암, 뇌종양, 두경부암종, 흑색종, 골수종, 백혈병, 림프종, 간암, 위암, 결장암, 골암, 자궁암, 난소암, 직장암, 식도암, 소장암, 항문부근암, 결장암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병, 방광암, 신장암, 수뇨관암, 신장세포암종, 신장골반암종, 중추신경계 종양 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 암조직의 세포인 것인, 약학 조성물.
  8. 제5항에 있어서,
    상기 바이러스 복합체는 암세포 내에 EGFR의 발현을 억제하는 shRNA를 전달하여, 암세포내에서 EGFR의 발현을 억제하는 것인, 약학 조성물.
  9. 제5항에 있어서,
    약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 것인, 약학 조성물.
  10. 제1항, 제2항 및 제4항 중 어느 한 항의 바이러스 복합체를, EpCAM가 과발현되는 암질환이 발병된, 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암 치료방법.
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