CN116670172A - 表达免疫检查点抑制剂的癌症特异性反式剪接核酶及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及癌症特异性反式剪接核酶及其用途。本发明的反式剪接核酶不会作用于正常组织，而是在癌组织中特异性表达，因此具有安全性高，并且转录后水平下表达效率优秀的特点。并且，本发明的核酶的3'外显子上连接有一个以上靶基因，在进入体内时，可以表达癌症治疗基因以及免疫检查点抑制剂，可有效用于癌症治疗。

Description

表达免疫检查点抑制剂的癌症特异性反式剪接核酶及其用途

【技术领域】

本发明涉及在癌细胞中表达免疫检查点抑制剂的癌症特异性反式剪接核酶及其用途。

【背景技术】

随着医疗技术的进步，癌症治疗技术也在不断发展。特别是最近开发出的利用人体免疫系统的免疫抗癌疗法的治疗效果得到了证实，由此进入了新的模式，即从使用传统化疗药物和靶向治疗药物的抗癌疗法转向了使用免疫治疗药物的免疫抗癌疗法。

传统的抗癌治疗是通过手术来切除肿瘤。为了在切除手术前缩小肿瘤大小或在切除手术后杀死残留的癌细胞并防止复发，会同时进行放射治疗和化疗。放射疗法和化疗被称为第一代抗癌药(自1970年代以来)，它们通过干扰癌细胞无限分裂和无限增殖的过程来诱导癌细胞死亡。然而放射疗法和化疗不仅会杀灭癌细胞，还会产生诱导正常细胞死亡的副作用。

2000年代以来，开发出选择性攻击与正常细胞不同的癌细胞的靶向抗癌药，并被称为第二代抗癌药，其可显著降低第一代抗癌药的副作用。仅作用于特定靶蛋白的靶向抗癌药通过仅作用于致癌蛋白，由此选择性地抑制癌细胞而显示出治疗效果。根据癌症的类型，诱导蛋白或表现出治疗效果的蛋白不同，因此必须使用适合靶蛋白类型的抗癌药。靶向抗癌药的另一个局限性在于癌细胞对靶向抗癌药物会产生耐药性。即，由于癌细胞可以通过自身突变来防止成为抗癌药物的目标，因此靶向抗癌药可能无法识别癌细胞。

免疫抗癌药是第三代抗癌药，其通过激活人体免疫系统增强自身免疫力，使免疫细胞攻击并消灭癌细胞。免疫抗癌药物增强了免疫细胞攻击癌细胞的能力，并且只要癌细胞没有完全改变功能和性质，免疫细胞就能够记住并持续攻击最初攻击的癌细胞。

免疫抗癌药物主要分为免疫检查点抑制剂(immune checkpoint inhibitor)、免疫细胞治疗剂(immune cell therapy)、治疗性抗体(therapeutic antibody)和抗癌疫苗(anticancer vaccine)。免疫检查点抑制剂是通过阻断参与T细胞抑制的免疫检查点蛋白的活性来激活T细胞，作为攻击癌细胞的代表性药物通常使用识别CTLA 4、PD-1、PD-L1等的抗体。

然而，癌症患者对免疫抗癌药物的反应率保持在15％至45％，反应率因癌症类型和患者而异，而且不仅会影响肿瘤，还影响皮肤和胃肠、甲状腺和肾上腺等身体各器官，对于副作用的报道也越来越多。

【发明内容】

【要解决的技术问题】

本发明用于解决上述技术问题，提供包括包含免疫检查点抑制基因的两个以上不同癌症治疗基因的反式剪接核酶，可以表达所述核酶的载体以及基因传递系统。

并且，所述反式剪接核酶可以靶向癌症特异性基因，从而主动作用于癌细胞，本发明提供所述核酶、载体或基因传递系统的癌症治疗用途。

然而，本发明要解决的技术问题并不受限于上述言及课题，未言及的其他课题将通过下面的记载由本领域普通技术人员明确理解。

【解决问题的技术方案】

为解决上述问题，本发明提供一种靶向癌症特异性基因的反式剪接核酶，所述核酶包括可操作地连接至3'外显子的靶基因，所述靶基因是包括免疫检查点抑制基因的两个以上癌症治疗基因。

作为本发明的一实施例，所述反式剪接核酶的结构为5'-反式剪接核酶-癌症治疗基因-免疫检查点抑制基因-3'。

作为本发明的一实施例，所述两个以上的癌症治疗基因中的一个是对免疫检查点抑制剂进行编码的基因，另一个是与此不同的癌症治疗基因，是从由药物敏感性基因、细胞凋亡基因、细胞抑制基因、细胞毒性基因、抑癌基因、抗原基因、细胞因子基因以及抗血管生成基因组成的群组中选择的一种。

作为本发明的另一实施例，所述药物敏感性基因是单纯疱疹病毒胸苷激酶(Herpes Simplex Virus thymidine kinase，HSVtk)，包括序列号5的碱基序列或由其构成。

作为本发明的另一实施例，所述癌症特异性基因是从由端粒酶逆转录酶(Telomerase reverse transcriptase，TERT)mRNA、甲胎蛋白(alphafetoprotein，AFP)mRNA、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)mRNA、前列腺特异性抗原(Prostate-specific antigen，PSA)mRNA、细胞骨架相关蛋白2(Cytoskeleton-associated protein2，CKAP2)mRNA，或者突变大鼠肉瘤(Rat sarcoma，RAS)mRNA组成的群组中选择的一种。

根据本发明的一实施例，所述反式剪接核酶可以靶向TERT基因，并且包括序列号4的碱基序列或由其构成。

作为本发明的另一实施例，所述免疫检查点抑制剂是CTLA-4、PD-1、PD-L1、PD-L2、LAG-3、BTLA、B7H3、B7H4、TIM3、KIR、TIGIT、CD47、VISTA或A2aR的抑制剂。

作为本发明的另一实施例，所述反式剪接核酶在3'末端还包括至少1拷贝(copy)的部分或全部微RNA-122a(miR-122a)的互补序列，并且包括序列号6的碱基序列或由其构成，包括所述序列重复2～10次的序列。

作为本发明的另一实施例，所述反式剪接核酶中免疫检查点抑制基因与排除其的癌症治疗基因是通过对自裂解肽(self-cleaving peptide)进行编码的基因实现连接。

作为本发明的另一实施例，所述自裂解肽是P2A，可以由序列号7的碱基序列编码。

并且，本发明提供可以表达所述反式剪接核酶的表达载体。

作为本发明的一实施例，所述表达载体还包括与所述核酶基因可操作地连接的启动子，所述启动子可以是组织特异性操作的启动子。

并且，本发明提供包括所述表达载体的基因传递系统以及通过所述表达载体转染的细胞。

本发明提供一种治疗癌症的药物组合物，包括从由反式剪接核酶、表达载体，以及基因传递系统组成的群组中选择的至少一种作为有效成分。

并且，本发明提供一种癌症治疗方法，包括从由反式剪接核酶、表达载体，以及基因传递系统组成的群组中选择至少任一种向个体给药的步骤。

并且，本发明提供用于制备抗癌药剂的所述反式剪接核酶、所述表达载体，和/或所述基因传递系统的用途。

作为本发明的一实施例，所述药物组合物以及抗癌药剂是口服给药或以注射剂形式静脉内、动脉内、癌症组织内或皮下给药，在所述癌症治疗方法中，向个体给药可以是口服给药。

作为本发明的另一实施例，所述癌症是从由肝癌、成胶质细胞瘤、胆道癌、肺癌、胰腺癌、黑色素瘤、骨癌、乳腺癌、结肠癌、胃癌、前列腺癌、白血病、子宫癌、卵巢癌、淋巴瘤或脑癌组成的群组中选择的一种以上癌症。

作为本发明的另一实施例，所述癌症是免疫检查点抑制剂抗性癌症。

【发明效果】

本发明的反式剪接核酶不会作用于正常组织，而是在癌组织中特异性表达，因此具有安全性高，并且转录后水平下表达效率优秀的特点。并且，本发明的核酶的3'外显子上连接有一个以上靶基因，在进入体内时，可以表达癌症治疗基因以及免疫检查点抑制剂，由此来提高免疫细胞的作用与活性，可以与所表达的癌症治疗基因一起起到协同抗癌的功效，可有效用于癌症治疗。

【附图说明】

图1是概略显示本发明的CRT-122T/ICI的基本结构及抗癌机理的附图。CRT-122T/ICI是癌症特异性地表达癌症治疗基因(HSVtk)与免疫检查点抑制剂(ICI)，并且可以表达在3'末端具有miR-122a的互补序列(mir-T)的靶向TERT的反式剪接核酶的载体。

图2是概略显示表达PD1scFv(对于PD1的scFv)或PDL1scFv(对于PDL1的scFv)的CRT-122T/ICI的结构的附图。

图3是通过确认各种RZ-001+在肝癌细胞株中诱导细胞死亡的活性来确认与RZ-001的等效性的结果。RZ-001+是能够表达包括CRT-122T/ICI的载体的病毒载体。RZ-001是癌症特异性地表达癌症治疗基因(HSVtk)，并且可以表达在3'末端具有miR-122a互补序列(mir-T)的靶向hTERT的反式剪接核酶的病毒载体(专利授权号：10-2252423)。

图4是通过确认各种RZ-001+在脑肿瘤细胞株中诱导细胞死亡的活性来确认与RZ-001的等效性的结果。

图5是通过确认各种RZ-001+在肺癌细胞株以及黑色素瘤细胞株中诱导细胞死亡的活性来确认与RZ-001的等效性的结果。

图6是在制备表达免疫检查点抑制剂scFvPD1(N)或scFvPD1(I)的稳定细胞株后确认免疫检查点抑制剂的表达水平的结果。

图7是对表达人PD1(hPD1)或小鼠PD1(mPD1)的细胞裂解物与从表达scFvPD1的稳定细胞株回收的scFvPD1进行反应的结果。

图8是在用小鼠肝癌细胞株Hepa1-6细胞制备表达小鼠PD1(mPD1)的稳定细胞株后确认是否表达mPD1的结果。

图9是用mRZ-001+对每个表达Hepa1-6细胞以及小鼠PD1(mPD1)的Hepa1-6细胞(Hepa1-6/mPD1)进行处理后确认病毒感染程度的结果。mRZ-001+是癌症特异性地表达癌症治疗基因(HSVtk)与免疫检查点抑制剂(ICI)，并且可以表达在3'末端具有miR-122a的互补序列(mir-T)的靶向小鼠TERT的反式剪接核酶的病毒载体。

图10是用mRZ-001+分别对Hepa1-6、Hepa1-6/mPD1以及Hepa1c1c7细胞进行处理后确认细胞存活率(cell viability)的结果。

图11是用mRZ-001+分别对Hepa1-6、Hepa1-6/mPD1以及Hepa1c1c7细胞进行处理后确认免疫检查点抑制剂的表达水平的结果。

图12是用mRZ-001+处理Hepa1-6细胞后通过流式细胞分析仪确认细胞凋亡(apoptosis)水平的结果。

图13是用mRZ-001+处理Hepa1-6/mPDL1细胞后通过流式细胞分析仪确认细胞凋亡水平的结果。

图14是用RZ-001+处理Hep3b和SNU398细胞后，测量各个细胞的靶基因(HSVtk和scFv)表达水平的结果。

图15是确认是否基于用RZ-001+处理的肝癌细胞株中表达的核酶发生靶向TERTmRNA的反式剪接以及反式剪接位置的结果。

图16是用RZ-001+处理Hep3b和SNU398细胞，并进行PD1/PDL1阻断生物测定(PD1/PDL1 blockade bioassay)的结果。

图17是确认人肝癌细胞株SNU398和人脑肿瘤细胞株U87MG的每个细胞中PD-L1表达的结果。

图18是确认用10MOI或20MOI浓度的RZ-001+处理的U87MG细胞中免疫检查点抑制剂的表达水平的结果。

图19是通过逐渐增加RZ-001+的量来处理U87MG细胞，并进行PD1/PDL1阻断生物测定的结果。作为对照组，利用阿替利珠单抗(Atezolizumab)(抗-PDL1)进行PD1/PDL1阻断生物测定。

图20a至20c分别显示在PBMC-人源化肝癌模型中施用RZ-001、施用RZ-001+_At或联合施用RZ-001与At(RZ-001/At)的肿瘤生长抑制程度、体重减轻程度以及药物的肝毒性的结果。

图21是原位(orthotopic)脑肿瘤同基因(syngeneic)模型的各给药组的MRI照片。

图22是在原位脑肿瘤同基因模型中比较和确认施用mRZ-001和施用mRZ-001+的肿瘤大小减小程度的结果。

图23是在原位脑肿瘤同基因模型中确认mRZ-001和mRZ-001+给药组的血清ALT和AST水平的结果。

图24是在异种移植原位(xenograft orthotopic)脑肿瘤模型中确认RZ-001+的效果的实验示意图。

图25是在异种移植原位脑肿瘤模型中随着施用RZ-001或RZ-001+的小鼠实验过程的IVIS图像。

图26是在异种移植原位脑肿瘤模型中随着施用RZ-001或RZ-001+的小鼠实验过程确认的体重变化的结果。

图27是在异种移植原位脑肿瘤模型中确认RZ-001或RZ-001+的抗癌效果的结果。

【具体实施方式】

本发明人在之前的研究中利用癌症特异性基因，具体利用靶向TERT mRNA的反式剪接核酶抑制了癌症的增殖和生长，并在所述核酶结合靶基因，特别是结合癌症治疗基因来诱导癌细胞凋亡，由此制备出了治疗癌症的反式剪接核酶和表达其的载体。

在之前的研究中，将反式剪接核酶表达载体命名为CRT-122T，其基本结构包括以下结构。

[5'-启动子-靶向TERT的核酶(TERT targeting ribozyme)-靶基因(HSVtk)-miR-122T-3']

将能够表达在CRT-122T添加了SD/SA和WPRE序列的载体的病毒载体命名为RZ-001(KR 10-2252423)，RZ-001作用于多种癌症，可以诱导细胞死亡并抑制肿瘤生长，从而可应用于癌症治疗。

本发明人为了在前期研究的基础上开发出更有效治疗癌症的反式剪接核酶，将基于核酶表达的靶基因扩展为两种，并在所述靶基因中包含免疫检查点抑制基因，开发出了CRT-122T/ICI作为能够表达核酶的载体。本发明的CRT-122T/ICI的基本结构如下(图1)。

[5'-启动子-靶向TERT的核酶-靶基因-自裂解肽基因-免疫检查点抑制基因-miR-122T-3']

同时，本说明书中根据CRT-122T/ICI编码的免疫检查点抑制剂，在“/”后面标记出目的免疫检查点蛋白或免疫检查点抑制剂。例如，表达阿替利珠单抗(Atezolizumab)的载体表示为CRT-122T/At。

本发明人通过具体实验发现CRT-122T/ICI在肝癌细胞株、脑肿瘤细胞株、肺癌细胞株以及黑色素瘤细胞株中具有与CRT-122T相似的诱导细胞死亡的活性(实施例2)。

此外，本发明人制备了表达CRT-122T/ICI的腺病毒(以下称为“RZ-001+”)，并通过具体实验证实了其在多种细胞株中的作用。

同时，在本说明书中，根据加载的CRT-122T/ICI的类型，将RZ-001+标记为RZ-001+_(目的免疫检查点蛋白或免疫检查点抑制剂)来进行区分。例如，含有CRT-122T/At的腺病毒表示为RZ-001+_At。

具体而言，在用RZ-001+感染癌细胞后，测量所述癌细胞的存活率来确认基于RZ-001+感染的细胞凋亡程度，并确认根据RZ-001感染所导入的CRT-122T/ICI+是否能够表达与免疫检查点蛋白结合并阻断其功能的抗体，然后确认是否能够顺利分泌该抗体并起到作用。结果证明，随着RZ-001+感染，癌细胞的细胞死亡增加，所述抗体的表达增加，并且表达的抗体得到充分分泌(实施例5和6)。

然后，本发明人为了确认在细胞实验中得到证实的RZ-001+的抗癌活性是否可以在体内同等表达，制备了各种癌症动物模型并施用RZ-001+测量了肿瘤的大小和重量。特别地，为了评估作为脑肿瘤治疗药物的疗效，制备了BBB等模拟大脑微环境的原位(orthotopic)脑肿瘤模型来确认RZ-001+作为脑肿瘤治疗剂的可能性。其结果，通过使用RZ-001+对肝癌动物模型和脑肿瘤动物模型进行处理，肿瘤大小和重量均有所减小。特别是在人源化肝癌动物模型中，RZ-001+_At给药组与RZ-001以及阿替利珠单抗(Atezolizumab)联合给药组相似程度地减小了肿瘤大小，而且RZ-001+_At给药组相比联合给药组肝毒性较低，可知其可作为无副作用或副作用小的抗癌药剂(实施例7)进行使用。此外，在原位(orthotopic)脑肿瘤同基因(syngeneic)模型中，mRZ-001+_I(mCRT-122T_scFvPD1(I))给药组显示出比mRZ-001给药组更有效的抗癌活性。此外，在移植了人源性脑肿瘤细胞的异种移植原位脑肿瘤模型中，RZ-001+的有效抗癌活性也得到证实，本发明人提供了可用于治疗癌症的反式剪接核酶，该反式剪接核酶在细胞内靶向癌症特异性基因，并且可以表达免疫检查点抑制剂以及治疗癌症的物质。

本发明的反式剪接核酶包含的各组分及其基本结构如下。

[5'-靶向癌症特异性基因的核酶-靶基因-自裂解肽基因-免疫检查点抑制基因-miR-122T-3']

所述反式剪接核酶可以在靶细胞中与癌症特异性基因的mRNA互补结合来切割该基因，并在靶基因下方表达转录组。

本发明的反式剪接核酶包括以5'→3'顺序靶向癌症特异性基因的核酶、靶基因、自裂解肽基因、免疫检查点抑制基因以及miR-122T，各组分可以在维持其功能的范围内以直接或间接的方式可操作地连接，并且所述反式剪接核酶可以在各组分之间进一步包含调控因子以提高靶基因的功能。

本发明中使用的术语“核酶(ribozyme)”是指起到酶作用的RNA分子或由含有该RNA分子的蛋白构成的分子，也称作RNA酶或催化RNA。其利用具有明确的三级结构的RNA分子进行化学反应，并具有催化或自催化特性。正如公知，部分核酶可以剪切自身或其他RNA分子来抑制活性，其他核酶可以催化核糖体的转氨酶(aminotransferase)活性。这样的核酶有锤头型(hammerhead)核酶，VS核酶以及发夹型(hairpin)核酶等。

本发明的核酶通过I组内含子的反式剪接反应抑制癌症特异性基因的活性，从而表现出选择性抗癌作用，并以与癌症治疗基因接合的方式表达来激活癌症治疗基因。因此，可以使用任何类型核梅，只要表现出使癌症特异性基因失活并激活癌症治疗基因的特性即可。

根据本发明的核酶可以优选为上述说明的靶向hTERT mRNA的核酶，其靶向过表达hTERT的癌细胞从而特异性切割hTERT mRNA来抑制其表达，并起到特异性表达靶基因的作用。

本发明中使用的术语“反式剪接(trans-splicing)”是指将来自不同基因的RNA相互连接。优选地，可以使用靶向hTERT的反式剪接组I核酶，其可以识别癌症特异性hTERTmRNA来进行反式剪接，并且该能力已经得到证实。

本发明中使用的术语“靶基因(target gene)”是指通过所述核酶与癌症特异性基因的mRNA连接来诱导表达的基因。

本发明的靶基因优选可以是用于癌症治疗的基因或报告基因，并且最优选是用于癌症治疗的基因。

本发明中使用的术语“癌症治疗基因(anti-cancer therapeutic gene)”是指在癌细胞中表达时对具有治疗效果的多肽进行编码的多核苷酸序列。所述癌症治疗基因可以以与核酶接合的形式表达或独立表达来表现出抗癌活性。该癌症治疗基因优选是从由药物敏感性基因、细胞凋亡基因、细胞抑制基因、细胞毒性基因、抑癌基因、抗原基因、细胞因子基因和抗血管生成基因组成的群组中选择的一种以上，最优选为药物敏感性基因。

在本发明中，所述癌症治疗基因可以单独使用，也可以组合使用两种以上基因。

本发明的药物敏感性基因(drug-sensitizing gene)是对将无毒前体(prodrug)转变为有毒物质的酶进行编码的基因，由于被导入该基因的细胞会被杀死，也称作自杀基因(suicide gene)。即，当全身施用对正常细胞而言无毒的前体时，前体仅在癌细胞中转变为有毒代谢物(toxic metabolite)，由此来改变对药物的敏感性，从而破坏癌细胞。这些药物敏感性基因优选为使用更昔洛韦(ganciclovir)作为前体的单纯疱疹病毒胸苷激酶(Herpes simplex virus-thymidine kinase，HSVtk)基因，或使用5-氟胞嘧啶(5-fluorocytosine，5-FC)作为前体的大肠杆菌的胞嘧啶脱氨酶(cytosine deaminase，CD)基因，最优选为HSVtk基因。

本发明的细胞凋亡基因(proapoptotic gene)是指在表达时诱导程序性细胞死亡的核苷酸序列。可以包括本领域技术人员已知的细胞凋亡基因，可以包括对p53、腺病毒E3-11.6K(来源于Ad2和Ad5)或腺病毒E3-10.5K(来源于Ad)、腺病毒E4基因、p53通路基因和胱天蛋白酶基因进行编码的基因。

本发明的细胞抑制基因(cytostatic gene)是指在细胞中表达并在细胞周期中停止细胞周期的核苷酸序列。非限制性示例有对p21、视网膜母细胞瘤基因、E2F-Rb融合蛋白基因、周期蛋白依赖性激酶抑制剂进行编码的基因(例如，p16、p15、p18和p19)、生长终止特异性同源盒(growth arrest specific homeobox，GAX)基因等。

根据本发明的细胞毒性基因(cytotoxic gene)是指在细胞中表达并表现出毒性作用的核苷酸序列。非限制性示例有对假单胞菌外毒素(exotoxin)、蓖麻毒素、白喉毒素等进行编码的核苷酸序列。

本发明的抑癌基因(tumor suppressor gene)是指能够通过在靶细胞中表达来抑制肿瘤表型或诱导细胞凋亡的核苷酸序列。代表性示例有肿瘤坏死因子(tumornecrosisfactor-α，TNF-α)、p53基因、APC基因、DPC-4/Smad4基因、BRCA-1基因、BRCA-2基因、WT-1基因、视网膜母细胞瘤基因、MMAC-1基因、腺瘤息肉病螺旋蛋白(adenomatouspolyposis coil protein)、结肠肿瘤缺失(DCC)基因、MMSC-2基因、NF-1基因、位于染色体3p21.3的鼻咽抑癌基因、MTS1基因、CDK4基因、NF-1基因、NF-2基因、VHL基因或程序性死亡1(sPD-1)。

本发明的抗原基因(antigenic gene)是指在靶细胞中表达并产生可被免疫系统识别的细胞表面抗原蛋白的核苷酸序列。本领域技术人员已知的抗原基因的示例有癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)和p53。

本发明的细胞因子基因(cytokine gene)是指在细胞中表达以产生细胞因子的核苷酸序列。代表性示例有GMCSF、白细胞介素(IL-1、IL-2、IL-4、IL-12、IL-10、IL-19、IL-20)、干扰素α、β、γ(干扰素α-2b)和干扰素α-2α-1等融合体。

本发明的抗血管生成基因(anti-angiogenic gene)是指通过表达在细胞外释放抗血管生成因子的核苷酸序列。其示例有血管抑制素、血管内皮生长因子(VEGF)抑制剂、内皮抑素等。

本发明中使用的术语“HSVtk(Herpes simplex virus-thymidine kinase)”是指来源于单纯疱疹病毒的胸苷激酶。这种酶是药物敏感性基因的一个典型例子，其将无毒的前体(prodrug)转变为有毒物质，使得导入该基因的细胞被杀死。本发明中HSVtk基因以与本发明的核酶接合的形式表达并且可以用作表现出抗癌活性的癌症治疗基因。该HSVtk基因优选为基因银行(genbank)中编号为AAP13943、P03176、AAA45811、P04407、Q9QNF7、KIBET3、P17402、P06478、P06479、AAB30917、P08333、BAB84107、AAP13885、AAL73990、AAG40842、BAB11942、NP_044624、NP_044492、CAB06747等的基因。

本发明中使用的术语“报告基因”是根据本发明一实施例的监测重组载体的引入或核酶的表达效率的基因，可以使用在监测的过程中不损害感染细胞或组织的任意基因。优选地，可以是荧光素酶(luciferase)、绿色荧光蛋白(GFP)、修饰绿色荧光蛋白(modifiedgreen fluorescent protein；mGFP)、增强型绿色荧光蛋白(enhanced greenfluorescentprotein；EGFP)、红色荧光蛋白(RFP)、修饰型红色荧光蛋白(modified redfluorescent protein；mRFP)、增强型红色荧光蛋白(ERFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)、增强型蓝色荧光蛋白(EBFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、增强型黄色荧光蛋白(EYFP)、靛蓝荧光蛋白(CFP)或增强型靛蓝荧光蛋白(ECFP)。

通过将报告基因插入靶基因，可以观察癌细胞特异性核酶的表达水平，特别是本发明的核酶含有启动子和microRNA靶位点，因此不会在正常细胞中表达而只对癌细胞具有特异性。对本领域技术人员而言显而易见的是，该特点可以应用于诊断特定组织是否发生癌症。

在本说明书中，将与miR-122的部分或全部互补的碱基序列称为miR-122T(microRNA-122靶位点(target site))。在本发明中，只要miR-122T能够与miR-122互补形成dsRNA即可，具体序列可以有差异。miR-122T可重复一次或多次包含与miR-122的部分或全部互补的核苷酸序列，例如可重复包含1至10次，优选可重复包含1至5次，更优选可重复包含1至3次。miR-122可以在正常肝细胞中正常表达，但在肝癌细胞中表达水平降低。利用这一点，可以开发出对肝癌细胞具有更高敏感性和特异性的治疗剂。在本发明中，通过将识别miR-122的核酸序列连接到与靶基因连接的核酶上，使得肝癌细胞特异性核酶实现表达。

本发明中使用的术语“癌症特异性基因”是指仅在癌细胞中特异性表达或显著过表达的基因。所述癌症特异性基因向根据本发明的核酶添加了以癌症特异性方式起作用的特征。该癌症特异性基因优选是端粒酶逆转录酶(Telomerase reverse transcriptase，TERT)mRNA、甲胎蛋白(alphafetoprotein，AFP)mRNA、癌胚抗原(carcinoembryonicantigen，CEA)mRNA、前列腺特异性抗原(Prostate-specific antigen，PSA)mRNA、细胞骨架相关蛋白2(Cytoskeleton-associated protein 2，CKAP2)mRNA，或者突变大鼠肉瘤(Ratsarcoma，RAS)mRNA，更优选端粒酶逆转录酶(Telomerase reverse transcriptase，TERT)mRNA，最优选人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)mRNA序列。本发明的反式剪接核酶诱导靶向癌症特异性基因的反式剪接以表达与核酶连接的靶基因，可以确认到其具有在成胶质细胞瘤细胞株、黑素瘤细胞株、肝癌细胞株和肺癌细胞株中诱导细胞死亡的效果。

在本发明中使用的术语“TERT(Telomerase reverse transcriptase)”是调控癌细胞永生性(immortality)和增殖(proliferation)能力的最重要的酶之一，这种酶在染色体上形成端粒(telomere)结构来保护染色体末端，由此抑制细胞老化。在正常细胞中，在每一次细胞分裂后端粒的长度都会一点点缩短，最终丢失遗传物质直至死亡。然而，这种酶会在癌细胞中不断延长端粒导致细胞不会死亡，它直接促进癌细胞的永生，因此被认为是癌症治疗中的严重障碍。在本发明中，hTERT mRNA可以用作癌症特异性基因，但并不受限于此。

本发明中使用的术语“基因传递系统(gene delivery system)”是指能够通过增加所需基因和/或核酸序列进入细胞的传递效率来提高表达效率的系统，并可以分为病毒介导的系统以及非病毒系统。

病毒介导的系统使用逆转录病毒载体、腺病毒载体等病毒载体，并且由于利用感染人体细胞的病毒所固有的细胞内渗透机制，因此相比非病毒系统的细胞内基因传递效率相对较高。另外，非病毒载体在进入细胞后会在内体与溶酶体融合后发生基因在内溶酶体中分解的问题，而病毒载体不通过溶酶体就可以将基因传递到细胞核内，因此具有基因损失小，基因传递效率高的优点。

如上文中对重组载体的说明，可用于本发明的病毒载体可以是源于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒等的载体。这些病毒载体可以在组合至病毒粒子之后，利用感染(infection)等转导(transduction)方法导入至细胞内部。

在本发明的一实施例中，设计了一种含有上述重组载体的重组腺病毒作为基因传递载体。也就是说，重组腺病毒将表达对癌症特异性基因具有特异性的反式剪接核酶的重组载体递送至靶细胞(例如癌细胞)，被递送到细胞中的重组载体通过细胞内转录系统得到表达。表达的反式剪接核酶可以将与核酶连接的靶基因插入至癌细胞中大量存在的癌症特异性基因的转录组中。

在本说明书中，RZ-001是指表达CRT-122T的腺病毒，RZ-001+是指表达CRT-122T/ICI的腺病毒。

所述非病毒系统是使用阳离子脂质载体或阳离子聚合物载体等作为核酸和/或基因递送介质的方法，或者是使用电穿孔法的方法。

阳离子脂质载体主要利用由阳离子脂质构成的纳米级脂质体或脂质纳米粒的正电荷来与负电荷基因、包括基因的表达载体或核酸形成复合体之后，利用吞噬作用将该复合体传递至细胞内的方法。传递至细胞内的复合体从内体向溶酶体得到1次传递之后释放到细胞质中进行表达。阳离子聚合物载体除了使用聚合物体代替脂质之外，以与阳离子脂质载体类似的方式传递基因，代表性的阳离子聚合物有聚乙烯亚胺(polyethyleneimine)、多聚-L-赖氨酸(poly-L-lysine)、壳聚糖(chitosan)等。

由此，本发明的重组载体与阳离子脂质载体或阳离子聚合物载体结合形成的复合体可以用作基因传递载体。

在本发明中，所述基因传递系统包括所述说明的重组载体，并且可以使用病毒介导系统及非病毒系统，优选使用病毒介导系统。

在本发明中使用的术语“载体”是可以在适当的宿主细胞表达靶基因的表达载体，是指包括调控要素的基因结构，该调控要素被可操作地连接从而使得载体内的基因插入片段得到表达。

在本发明中使用的术语“可操作地连接(operably linked)”是指执行常规功能的核酸表达调控序列与对靶基因进行编码的核酸序列在功能上实现连接(functionallinkage)。本发明中核酶或载体的各结构中，除了明确说明是直接连接的情况之外，均视为可操作地连接。

例如，将核酶编码序列可操作地连接至启动子时，核酶编码序列的表达会受到启动子的影响或调控。若两个核酸序列(核酶编码序列及该序列的5'末端的启动子位点序列)在启动子的诱导下使得核酶编码序列被转录则为可操作地连接，并且，上述两个序列之间的连接特性不会诱导移码突变(frame-shift mutation)，并且表达调控序列不会抑制核酶的表达，则可以认为是可操作地连接。与重组载体可操作地连接可以通过本领域公知的基因重组技术实现，位置-特异性DNA剪切及连接则可以使用本领域公知的酶等来实现。

根据本发明的载体除了启动子、操纵子、起始密码子、终止密码子、多聚腺苷酸化信号、增强子等表达调控因素之外，还包括用于靶向或分泌膜的信号序列或前导序列，并且可以根据目的制备成多种形式。此外，本发明的载体还可以包括能够提高细胞中反式剪接核酶的表达水平的调控因子。提高核酶表达的调控因子的非限制性示例包括剪接供体/剪接受体序列(SD/SA)和WPRE。载体的启动子可以是结构性或诱导性的。并且，表达载体可以包括用于选择含有载体的宿主细胞的选择性标记，对于可复制的表达载体而言，可以包括复制起点。载体可以自我复制或与宿主DNA整合。

根据本发明的载体优选为质粒载体、粘粒载体或病毒载体，最优选可以为病毒载体。优选地，所述病毒载体可以是来源于例如人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiencyvirus，HIV)、鼠白血病病毒(Murine leukemia virus，MLV)、禽肉瘤/白血病病毒(Aviansarcoma/leucosis virus，ASLV)、脾坏死病毒(Spleen necrosis virus，SNV)、劳氏肉瘤病毒(Rous sarcoma virus，RSV)、鼠乳腺肿瘤病毒(Mouse mammary tumor virus，MMTV)等的逆转录病毒(Retrovirus)、腺病毒(Adenovirus)、腺相关病毒(Adeno-associated virus，AAV)，或者单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus，HSV)等的载体，但并不受限于此。最优选地，根据本发明的重组载体可以是重组腺相关病毒载体。

本发明中使用的术语“启动子”参与RNA聚合酶的结合来转录为DNA的一部分。通常，启动子邻近靶基因并位于其上游，是诱导RNA聚合酶或RNA聚合酶的蛋白的转录因子(transcription factor)结合的位点，可以诱导所述酶或蛋白位于正确的转录起始位点。即，启动子具有特定基因序列，其位于在有义链(sense strand)中要转录的基因的5'位点，使得RNA聚合酶直接或通过转录因子结合至相应位点，从而诱导对于靶基因的mRNA合成。

一方面，本发明的反式剪接核酶在多种癌症中具有诱导细胞死亡的活性，并且没有或只具有非常低的肝毒性，因此可用于治疗癌症。

本发明中使用的术语“癌症”是指细胞的正常分裂、分化和死亡的调控功能出现问题，导致细胞异常过度增殖，从而浸润周围组织器官而形成肿块，破坏原有结构或变形的状态。.

本发明的癌症可以优选是肝癌、成胶质细胞瘤、胆道癌、肺癌、胰腺癌、黑色素瘤、骨癌、乳腺癌、结肠癌、胃癌、前列腺癌、白血病、子宫癌、卵巢癌、淋巴瘤或脑癌，更优选肝癌、肺癌、黑色素瘤、成胶质细胞瘤和/或胆道癌，最优选肝癌和/或脑癌。

此外，优选地，本发明的癌症在癌组织中表达的miR-122的拷贝数(表达水平)是基于所述药物组合物在癌组织中表达的核酶拷贝数的不到100倍。

一方面，本发明人比较了之前研究中能够诱导细胞死亡具有miR-122T的hTERT靶核酶的表达量与细胞内miR-122的表达水平，其miR-122相对于核酶的比例越高，核酶的表达降低，诱导细胞死亡的效果降低。因此，可以根据癌组织中miR-122的表达水平来推导出发挥抗癌作用的核酶量，从而确定表达核酶的腺病毒注入量。具体而言，如果miR-122的最小拷贝数是核酶拷贝数的约100倍或更多，则具有miR-122靶位点的核酶的功能(表达)会被削弱，因此，在癌组织中表达的miR-122的拷贝数是基于本发明的药物组合物在癌组织中表达的核酶拷贝数的不到100倍时，具有较高的抗癌功效。

此外，优选地，本发明的癌症可以是在癌组织中实质上不表达miR-122的癌症。术语“在癌组织中实质上不表达miR-122的癌症”是指虽然在癌组织中表达miR-122，但它在癌组织中表达的miR-122的拷贝数较少，不足以对具有miR-122靶位点的核酶的功能产生实质影响的癌症。

本发明人通过研究证明了本发明的核酶对于在癌组织中实质上不表达miR-122的结肠癌、成胶质细胞瘤、黑色素瘤、宫颈癌、肺癌、骨肉瘤、乳腺癌和胆道癌细胞株的抗癌功效。

在本发明中的免疫检查点抑制剂((Immune checkpoint inhibitor，ICI)通过抑制PD-L1与PD-1结合来维持T细胞的免疫功能，其通过抑制对浸润到肿瘤内部的T细胞活性进行抑制的PD-1或PDL-1，由此最大化T细胞的活性来增加抗癌效果。在具体的实验中，本发明的具体实验中在本发明的核酶中包含了序列号1-3的免疫检查点抑制剂的表达序列，从而在细胞中诱导表达并确认其功能，但只要是为了T细胞活性而靶向免疫检查点蛋白的免疫检查点抑制剂，则没有任何限制。

本发明中使用的术语“预防”是指通过施用本发明的联合物或药物组合物来抑制癌症或延迟癌症发作的全部行为。

本发明中使用的术语“治疗”是指通过施用本发明的联合物或药物组合物来改善癌症或有益地改善症状的全部行为。

根据本发明的药物组合物还可以包括允许入药的载体、赋形剂或稀释剂。本发明的可以用于药物组合物的允许入药的载体、赋形剂及稀释剂的示例有乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯树胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、碳酸钙、纤维素、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、对羟基苯甲酸甲酯，对羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁、矿物油等。

本发明的药物组合物可以根据所需方法口服给药或肠胃外给药，优选为肠胃外给药。

根据本发明的一实施例，本发明的药物组合物可以静脉内、动脉内、癌症组织内或皮下直接给药，并且可以注射给药。本发明的注射剂可以分散在无菌介质中以便直接向患者直接给药，也可以在注射时加入注射用蒸馏水分散为适当浓度后给药。此外，当制成注射剂时，可与缓冲剂、防腐剂、镇痛剂、增溶剂、等渗剂、稳定剂等混合，并且可以制成单位剂量安瓿或多剂型。

本发明的药物组合物给药量根据患者的病症和体重、疾病的严重程度、药物形式，给药途径和时间有所不同，但能够由本领域普通技术人员进行适当选择。一方面，本发明的药物组合物可以单独使用，也可以与外科手术等辅助治疗方法组合使用。

下面，将参照附图对实施例进行详细说明。应当理解，可以对实施例进行多种改变，本申请的权利范围并不受限于下面的实施例。对实施例进行的所有改变、及其等同物乃至其替代物均属于本发明的权利范围。

实施例中使用的术语仅用于说明特定实施例，并非用于限定范围。在内容中没有特别说明的情况下，单数表达包括复数含义。在本说明书中，“包括”或者“具有”等术语用于表达存在说明书中所记载的特征、数字、步骤、操作、构成要素、配件或其组合，并不排除存在或者额外附加一个或一个以上其他特征、数字、步骤、操作、构成要素、配件或其组合的可能性。

在没有其他定义的情况下，包括技术或者科学术语在内的本文使用的全部术语，都具有本领域普通技术人员所理解的通常含义。通常使用的如词典定义的术语，应理解为相关技术内容中的含义，在本说明书中没有明确定义的情况下，不能解释为理想化或过于形式化的含义。

并且，在参照附图进行说明的过程中，与附图编号无关，相同的构成要素使用相同的附图标记，并省略重复说明。在说明实施例的过程中，当判断对于相关公知技术的具体说明会不必要地混淆实施例时，省略其详细说明。

【实施例1：制备表达免疫检查点抑制剂的反式剪接核酶】

将之前制备的反式剪接核酶进行修饰来设计重组载体。具体地，含有CMV启动子，靶向包括hTERT mRNA的+21尿苷(uridine)的位点，并具有326个核苷酸的反义(anti-sense)长度，并具有作为miR122靶位点的miR-122T，并且，在包含HSV-tk的表达反式剪接核酶的构建体中的HSV-tk末端额外引入了对肽切割位点进行编码的核酸序列P2A与免疫检查点抑制剂表达序列作为治疗基因。

作为免疫检查点抑制剂，使用了应用本领域已知的PD1抗体、PDL1抗体序列制备的单链可变片段PD1(single chain variable fragment PD1，scFvPD1)和scFvPDL1。本发明中，scFvPD1使用了两种氨基酸序列不同的抗体，并且将对每种抗体进行编码的基因分别表示在序列号1和序列号2(以下分别称为scFvPD1(I)和scFvPD1(N))。另外，编码scFvPDL1的基因序列表示在序列号3(以下称为scFvPDL1(A))。

在免疫检查点抑制剂末端导入FLAG标签(FLAG Tag)序列，在构建体(construct)的3'末端插入3个拷贝(copy)的miR-122T，由此可通过miR-122来调控核酶的表达。

一方面，除了核酸靶向包括小鼠TERT(mTERT)mRNA的+67位尿苷的位点，并具有100个核苷酸长度的反义之外，还制备了与上述结构相同的重组载体(mCRT-122T/免疫检检查点抑制剂)。

设计的反式剪接核酶的表达载体被命名为mCRT-122T/ICI，其载体结构如图2所示。

一方面，在下面的实验中，比较和确认了之前研究中制备的mCRT-122T和mCRT-122T/ICI的活性，mCRT-122T的结构如下。

5'-CMV启动子-mTERT核酶-HSVtk-miR-122T(3X)-3'。

一方面，分别将表达CRT-122T/ICI载体的腺病毒命名为RZ-001+，将表达mCRT-122T/ICI载体的腺病毒命名为mRZ-001+，将表达CRT-122T载体的腺病毒命名为RZ-001。

【实施例2.通过RZ-001+细胞死亡诱导实验确认与RZ-001的等效性】

【2-1.确认人肝癌细胞株的等效性】

为了比较与之前研究中制备的RZ-001的等效性，在人肝癌细胞株中进行了细胞死亡诱导实验。

具体地，将SNU398和Hep3b以1×10⁴个细胞/孔/100ul接种于96孔板中，次日去除用过的培养基，然后在FBS 2％培养基中将RZ-001和RZ-001+分别以不同的感染复数(Multiplicity of Infection，MOI)进行处理(0.01～10MOI)。在病毒处理24小时后，以2天为间隔用100uM GCV处理3次。最后在用GCV处理后的第二天，每孔用10ul EZ-Cytoxregent(DOGEN,EZ-1000)进行处理，并在37℃培养后，在Abs 450nm测量吸光度。

其结果，确认到肝癌细胞的凋亡会随着RZ-001或RZ-001+的处理浓度的增加而增加，表明添加免疫检查点抑制基因后，基于靶向hTERT的核酶的诱导细胞死亡的活性没有问题。此外，在没有免疫系统条件的体外(in vitro)细胞株水平上，发现RZ-001+与RZ-001具有相同基于靶向hTERT的核酶的活性(图3)。

【2-2.确认人脑肿瘤细胞株的等效性】

将人脑肿瘤细胞株U87MG以1×10⁴个细胞/孔/100ul接种于96孔板中，次日去除用过的培养基，然后在FBS 2％培养基中将RZ-001和RZ-001+分别以不同的感染复数(Multiplicity of Infection，MOI)进行处理(0.01～10MOI)。在病毒处理24小时后，以2天为间隔用100uM GCV处理3次。最后在用GCV处理后的第二天，每孔用10ul EZ-Cytoxregent(DOGEN,EZ-1000)进行处理，并在37℃培养后，在Abs 450nm测量吸光度。

由于模拟物(Mock)不包含转基因(transgene)，作为不表达转基因(transgene)的腺病毒对照组(adenovirus control)，并且用作阴性对照组(negative control)以确认不存在由腺病毒感染引起的非特异性细胞死亡诱导。此外，CT作为CMV-HSVtk，用作阳性对照组(positive control)以确认通过基于HSVtk的GCV磷酸化发生的细胞死亡诱导。

根据吸光度测量结果，确认到在RZ-001和所有RZ-001+处理组中诱导了细胞死亡。由此可见，所有RZ-001+均表现出对脑肿瘤细胞的细胞死亡诱导活性，特别是所有RZ-001+在0.5MOI以上时表现出与RZ-001相同的效果(图4)。

【2-3.确认在肺癌细胞株以及黑色素瘤细胞株中的等效性】

以人肺癌细胞株A549细胞株与人黑色素瘤细胞株A375P以及A375SM为对象确认了RZ-001+的细胞凋亡效果。将每个细胞株以1×10⁴个细胞/孔/100ul接种于96孔板中，次日去除用过的培养基，然后在FBS 2％培养基中将RZ-001+以不同浓度进行处理。在病毒处理24小时后，以2天为间隔用100uM GCV处理3次。最后在用GCV处理后的第二天，每孔用10ulEZ-Cytox regent(DOGEN,EZ-1000)进行处理，并在37℃培养后，在Abs 450nm测量吸光度。

其结果，RZ-001+在黑色素瘤细胞和肺癌细胞中诱导细胞凋亡，并且在1MOI以上时，除RZ-001+_PD1(I)外的RZ-001+具有与RZ-001相似水平的诱导细胞死亡的活性(图5)。

【实施例3.制备表达免疫检查点抑制剂的稳定细胞株】

【3-1.制备稳定细胞株】

在确认实施例1中制备的载体的效果之前，如下制备表达免疫检查点抑制剂的稳定细胞株(stable cell line)。

在35mm培养皿中接种2×10⁵个293A细胞后，在37℃、5％ CO₂培养箱中培养24小时。然后，将1μg免疫检查点抑制剂表达载体和100μl的Opti-MEM装入1.5ml试管中混合，将5μl的Lipofectamine 2000和100μl的无血清培养基放入另一个1.5ml试管中混合，然后在室温下静置5分钟。然后将两个试管中的内容物混合并在室温下保管20分钟以形成脂质体(liposome)形式的复合物。20分钟后，将试管离心分离10秒后洒在每个细胞上进行转染(transfection)，4小时后更换新培养基。在37℃、5％CO₂培养箱中培养24小时后，用1X PBS洗涤细胞，然后用胰蛋白酶(trypsin)处理以解离细胞后转移到100mm培养皿中培养。每2天至3天将培养基更换为含有5μg/ml浓度的抗生素遗传霉素(geneticin，G418)的培养基。在筛选并培养细胞克隆后，确认了是否表达免疫检查点抑制剂。

从细胞上清液中分离蛋白质来执行蛋白质印迹(Western Bloting)，从细胞中提取RNA并用RT-PCR确认免疫检查点抑制剂的表达水平。

【3-2.确认是否表达免疫检查点抑制剂以及亲和力】

培养3-1中制备的稳定细胞株后，通过从细胞上清液(supernatant)中分离蛋白质来进行蛋白质印迹，从细胞中提取RNA，并通过RT-PCR确认是否表达免疫检查点抑制剂。

其结果，确认导入293A细胞的所有免疫检查点抑制剂均得到很好表达(图6的A)，并且确认到在mRNA水平的结果中也得到很好地表达(图6B)。

【3-3.确认表达的scFvPD1的亲和力】

培养表达人PD1(hPD1)或小鼠PD1(mPD1)的细胞来制备细胞裂解物，将其附着于96孔板。然后，通过与从所述2-1的稳定细胞株培养液中回收的scFvPD1(I)进行反应，通过ELISA法确认了抗体亲和力。作为对照组，使用了293A细胞培养基。其结果，确认到吸光度随着细胞裂解物浓度的增加而增加，表明scFvPD1(I)作为抗体很好地发挥作用(图7)。

【3-4.制备表达小鼠PDL1的稳定细胞株】

为了确认癌症治疗基因和免疫检查点抑制剂同时表达的联合作用，按照与实施例2-1相同的方式制备表达小鼠PDL1的稳定细胞株(mPDL1)。简而言之，将mPDL1/pCMV6导入来源于小鼠的肝癌细胞株Hepa1-6细胞株，并通过遗传霉素(geneticin)处理，并经过三周筛选出细胞克隆。通过培养筛选的细胞克隆来确认mPDL1的表达水平，其结果确认到与其他小鼠肝癌细胞株(Hepa1-6、Hepa1c1c7)相比以高水平表达mPDL1(图8)。

下面，将导入了mPDL1的Hepa1-6稳定化细胞株称为Hepa1-6/mPDL1。

【实施例4.确认RZ-001+表达载体在Hepa1-6稳定细胞株中的效果】

【4-1.感染测试】

Hepa1-6或Hepa1-6/mPDL1细胞株用实施例1中制备的mRZ-001+以10MOI的浓度处理。

使用的载体如下：

mCRT-122T(CMV启动子+mTERT核酶+HSVtk+miR-122T(3X))，

mCRT-122T/scFvPD1(I)(CMV启动子+mTERT核酶+HSVtk+scFvPD1(I)+miR-122T(3X))，

病毒处理24小时后，从细胞中提取基因组DNA(genomic DNA)，通过靶向E4的RT-PCR确认了病毒感染程度。

其结果，确认到E4的平均Ct值在每个实验组中显示出相似水平(图9)。

【4-2.确认细胞存活率】

将Hepa1-6、Hepa1-6/mPDL1和Hepa1c1c7细胞分别以1×10⁴接种于96孔板中，然后将含有实施例1制备的mRZ-001+表达载体的腺病毒以不同的MOI进行处理。在处理腺病毒24小时后，将更昔洛韦(ganciclovir,GCV)在细胞培养基中稀释至最终浓度为100μM，然后添加到每个孔中。以2天为间隔共处理3次GCV，在最后一次GCV处理24小时后，加入MTS测定试剂并在450nm波长下测量吸光度，由此来确认细胞活力。

其结果，确认到经过核酶表达载体处理的实验组与对照组(EGFP)相比细胞死亡增加，特别是与mCRT-122T处理组进行比较，在免疫检查点抑制剂表达载体处理组(mCRT-122T/scFvPD1(I))中确认到细胞凋亡水平显著升高(图10)。

【4-3.比较PD1或PDL1抗体的表达】

在Hepa1-6、Hepa1-6/mPDL1和Hepa1c1c7细胞中用含有免疫检查点抑制剂表达载体的腺病毒以50MOI进行处理，在24小时后，从细胞中分离蛋白质来确认免疫检查点抑制剂的表达水平。包括信号肽的蛋白质的预期大小约为28kDa。

其结果，确认到免疫检查点抑制剂在所有三种细胞株中得到表达(图11)。

【4-4.细胞死亡效果】

将Hepa1-6和Hepa1-6/mPDL1细胞分别以2×10⁵个接种在6孔板中，并用含有mRZ-001+表达载体的腺病毒以5MOI进行处理。病毒处理24小时后，将GCV在细胞培养液中稀释至最终浓度为100μM，然后添加到每个孔中。再培养24小时后，每孔用碘化丙锭(Propidiumiodide，PI)进行处理，然后用流式细胞分析仪来分析细胞凋亡(apoptosis)程度。

作为分析结果，在mCRT-122T载体处理组中，Hepa1-6及Hepa1-6/mPDL1细胞在经过GCV处理后，其早期细胞凋亡水平几乎没有变化；但在免疫检查点抑制剂表达载体处理组中，经过GCV处理后，早期细胞凋亡水平显著提高(图12以及图13)。

【实施例5.人肝癌细胞株中导入RZ-001+表达载体】

【5-1.确认导入RZ-001+后的免疫检查点抑制剂分泌】

将人肝癌细胞株Hep3b与SNU398细胞以1×10⁶个细胞接种于60π培养皿(culturedish)中，次日将所用培养基更换为2％ FBS培养基后对含有RZ-001+表达载体的腺病毒载体以30MOI进行处理。病毒处理48小时后将培养基置于15ml试管中，以1500rpm离心5分钟来通过离心分离去除细胞碎片。将每个样品转移到10kcentricon并以3000rpm浓缩15-30分钟，使样品的总体积为500ul。使用5x样品缓冲液(sample buffer)制备浓缩样品，并在100℃下诱导5分钟变性(denaturation)。将准备好的样品在12％ SDS-PAGE上各加载40ul。用PBS洗涤来收集每个细胞，并放入RIPA缓冲液(buffer)在4℃下处理20分钟后以13000rpm离心10分钟以获得上清液，将所述上清液转移到新试管中并通过BCA定量方法进行定量。将定量的蛋白制作成30μg/孔的样品，并以与上述相同的方式加载到SDS-PAGE。完成PAGE分离后转移至PVDF，在含5％脱脂牛奶的PBS-T中封闭30分钟，并将抗-FLAG按1:1000稀释并在4℃O/N进行反应。次日，用PBS-T洗涤后，将抗鼠/HRP二抗按1:2000稀释，在反应1小时后用ECL溶液(ECL solution)检测表达量。

其结果，确认到经过RZ-001+处理的肝癌细胞株中分泌scFv。特别地，在RZ-001+_PDL1(At)中确认到最高水平的scFv分泌水平。由此可见，导入了RZ-001+表达载体的细胞活跃地分泌scFv，表明RZ-001+可应用于癌细胞(图14)。

【5-2.确认导入RZ-001+后的反式剪接反应】

在实施例5-1中，确认了在经过腺病毒处理的肝癌细胞株中，RZ-001+是否对目标TERT mRNA有效地进行反式剪接。将实施例5-1中用30MOI病毒处理的细胞进行病毒处理48小时后，使用TRIzol制备RNA来进行定量。使用RT试剂盒(Genet bio#SR3000)将3ug RNA和1uL RT引物混合并进行反应(50℃60min，70℃10min)。使用下表1所示的引物预混液(Bionia，#k-2611)进行PCR，在95℃30秒、59℃30秒、72℃30秒的条件下进行40个循环的PCR。随后将扩增产物在2％琼脂糖凝胶(agarose gel)上进行电泳以确认目标大小的条带。在目标大小带中，通过凝胶洗脱使用TA载体进行克隆并分析碱基序列。

【表1】

RT引物(HSV-tk)	5′-agttagcctc ccccatctc-3′
		hTERT	5′-GGAATTCGCA GCGCTGCGTC CTGCT-3′
HSVtk	5′-GTGAGGACCG TCTATATAAA CCCGCAGTAG-3′

其结果，在经过RZ-001+处理的肝癌细胞株样本中确认到发生反式剪接时可产生的产物大小的条带，确认到所述条带的产物碱基序列在靶RNA(target RNA)的靶位点发生反式剪接。由此可知，RZ-θθ1+可在导入的肝癌细胞内与靶RNA(ta rget RNA)在靶位点准确反应而诱导反式剪接反应(图15)。

【5-3.确认分泌型免疫检查点抑制剂的生物活性(bioactivity)】

随后，进行PD1/PDL1阻断生物测定(Promega，#J1250)以确认导入RZ-θθ1+的肝癌细胞株分泌的免疫检查点抑制剂是否能有效结合免疫检查点蛋白来阻断信号。PD1/PDL1阻断生物测定(PD1/PDL1 blockade bioassay)的原理如下：在没有PD-1或PDL-1免疫抗癌药剂的条件下，在PD-1效应细胞(effector cell)表面的PD-1与APC细胞或癌细胞上存在的PDL1结合时，PD1/PDL1的相互作用会抑制TCR介导发光，使得无法检测到荧光素酶信号；然而在存在免疫抗癌药剂的条件下，PDL1和PD1的结合会受到免疫抗癌药剂结合的阻碍，这会激活TCR并通过激活NFAT signal的活性来诱导荧光素酶信号的增加。实验是根据制造商推荐的方案进行。具体地，在白板上释放PDL1 aAPC/CHO-K1细胞来制备。次日去除细胞的培养基，将40u1实施例4-1的浓缩样品加载到孔板上，在加载了浓缩样本的板上释放PD-1效应细胞，在37℃诱导6小时反应。随后，添加bio-Glo试剂并在室温下培养5-10分钟，并使用光度计(1uminometer)测量荧光。

利用经过RZ-001+处理的肝癌细胞株样品的培养基来测量所分泌的免疫抗癌药剂的活性，确认到经RZ-001+处理的所有细胞的生物活性均有所增加，并且可以看出从上述RZ-001+病毒感染在细胞内生成并分泌了免疫检查点抑制剂。特别地，响应于实施例5-1的结果，在RZ-001+_At的生物活性增加最多，因此产生和分泌最多的免疫抗癌药剂，并且可以看出分泌的免疫抗癌药剂具有优异的活性(图16)。

【实施例6.在人脑肿瘤细胞株中导入RZ-001+表达载体】

【6-1.确认导入RZ-001+的细胞株中PD-L1表达】

将人肝癌细胞株SNU398和人脑肿瘤细胞株U87MG以5×104个细胞/孔/1mL接种于12孔板中培养2天。使用RIPA缓冲液裂解细胞以提取总蛋白(total protein)。提取的总蛋白采用BCA定量法进行定量使得所有样品均为等量蛋白，将制备的蛋白样品加载到SDS-PAGE后转移到PVDF中，并在TBS-T中的5％脱脂牛奶中进行抗原抗体反应来测量目标蛋白的表达水平。

其结果，确认到肝癌细胞株SNU398和脑肿瘤细胞株U87MG都表达了PD-L1蛋白，可知表达免疫检查点抑制剂的RZ-θθ1+_PDL1在肝癌及脑癌中具有有效性(图17)。

【6-2.确认导入RZ-θθ1+后的免疫检查点抑制剂分泌】

以与实施例5-1中相同的方式，在感染含有RZ-θθ1+表达载体的腺病毒的脑肿瘤细胞株中确认scFv的分泌。除了病毒处理浓度为10MOI和20MOI之外，实验方法与实施例5-1相同。

其结果，在胶质母细胞瘤(Glioblastoma)细胞株U87MG中，通过导入RZ-001+表达载体确认到细胞中分泌scFv，特别是在导入了RZ-001+_At表达载体的细胞中确认到分泌最多的scFv(图18)。

【6-3.确认分泌的免疫检查点抑制剂的生物活性(bioactivity)】

接下来，分离用含有RZ-001+_PDL1(At)表达载体的病毒处理的细胞的上清液，并以与实施例5-3相同的方式进行PD1/PDL1阻断生物测定(Promega，#J1250)。作为对照组使用市售的阿替利珠单抗(Atezolizumab)。

其结果，确认到随着对浓缩样品进行处理，荧光素酶活性逐渐增加(图19)，其中浓缩样品是从用高MOI进行病毒处理的细胞中获得的。

【实施例7.在体内确认RZ-001+的抗癌效果】

【7-1.在PBMC-人源化肝癌模型中确认RZ-001+的效果】

对小鼠异种移植皮下模型(mouse xenograft subcutaneous model:6周龄雄性NOG)小鼠注射5×10⁶个细胞/只的人PBMC来制备人源化PBMC小鼠(PBMC-humice)，连续7～10天确认小鼠的体重与状态后，皮下注射5×10⁶个细胞/50μl SNU-398细胞并培养2周，由此来构建肝癌肿瘤模型。随后，测量肿瘤生长和重量后进行分组，并对各组进行给药。此外，还测量了AST/ALT水平以确认药物的肝毒性。

每组分为对照组、阿替利珠单抗(Atezolizumab)(At)给药组、RZ-001给药组、RZ-001+_At给药组、RZ-001与阿替利珠单抗(Atezolizumab)联合给药组，给药方式为1×10⁹VP/只，并且间隔48小时向肿瘤内直接给药(intratumoralinjection)两次，阿替利珠单抗(Atezolizumab)联合给药是以5mg/kg的剂量从病毒给药后2天后开始，每隔2天静脉给药(intravenous injection)3次。

其结果，与分别单独施用RZ-001和阿替利珠单抗(Atezolizumab)相比，施用RZ-001+_At时肿瘤大小或重量减小，并且确认到与RZ-001以及At联合给药类似，肿瘤大幅度减小。另一方面，作为测量肝毒性的结果，RZ-001+_At给药组与Atzolizumab单独或联合给药组相比，AST/ALT水平降低，并且与Ad-Mock相比显示出相似的水平，可见肝毒性得到显著降低(图20)。

【7-2.确认RZ-001+在同基因原位脑肿瘤模型中的效果】

将具有免疫活性的5周龄雄性C57BL/6小鼠麻醉后，用立体定向工具在头皮正中切出1cm切口，然后以前囟(bregma)为基准在前1mm、侧2.3mm、和深3mm处移植1×10⁵个细胞/只来源于小鼠的脑癌细胞株(GL261)，由此来制备原位脑肿瘤模型。7天后，测量肿瘤生长情况并进行分组，并对各组进行给药。

给药剂量和用法如下：

对于mRZ-001和mRZ-001+，将3×10⁹VP/5uL直接注射到肿瘤中一次。

GCV在100ul液体体积中以50mg/kg给药，从病毒给药结束后的次日开始每天给药一次，共给药10次。

实验动物组分为mRZ-001给药组和mRZ-001+给药组，并分出PBS给药组作为对照组。

为了测量肿瘤的大小，包括给药后的第二天每3天进行一次MRI，并以肿瘤植入位置为基准选择5个切片，并使用ImageJ系统基于时间执行肿瘤关心区域(region ofinterest，ROI)分析(图21)。具体地，MRI成像是使用Biospec 47/40USR(Bruker，Ettlingen，德国)的水平孔磁铁(horizontal bore magnet)进行。在成像过程中，动物被麻醉，在图像采集过程中，使用动物监测-门控系统(animal monitoring-gating system)观察呼吸数、心率和体温，并使用暖床(warm bed)来维持体温。用于确认肿瘤生长和生长抑制的图像是使用15个连续轴向切片的RARE序列拍摄，相关条件如下：

重复时间(TR)＝2200ms

回波时间(TE)＝40ms

切片厚度＝0.75mm

矩阵＝192×192

翻转角(FA)＝90

视野(FOV)＝18×18mm²

平均值＝4

回声列车长度(ETL)＝8

肿瘤的体积以mRZ-001为基准将第二天设定为第1天，是与GCV治疗一起处理至第10天的共计10次处理的结果，确认了与PBS给药组相比的肿瘤体积的减小程度。其结果，基于病毒感染，肿瘤体积减小，并且施用mRZ-001+与施用mRZ-001相比，更显著地减小了肿瘤的体积(图22)。

另一方面，mRZ-001+给药组显示出比对照组更低的AST和ALT水平，表明经处理的样品在体内具有非常低的毒性(图23)。

【7-3.在异种移植原位脑肿瘤模型中确认RZ-001+的效果】

在实施例7-3中，将在移植了人源性脑肿瘤细胞的动物模型中确认RZ-001+的抗癌作用。为此，使用5周龄雄性BALB/C裸鼠将稳定表达荧光素酶的人源性脑肿瘤细胞U87MG-Luci按照与实施例7-3相同的方法移植到小鼠体内，制备出异种原位小鼠脑肿瘤模型。7天后，通过IVIS成像测量肿瘤生长情况并进行分组，对各组进行给药(图24)。

给药剂量和用法如下：

对于RZ-001和RZ-001+_AT，将1×10¹⁰VP/只直接注射到肿瘤中一次。

GCV从病毒给药结束后的次日开始以50mg/kg每天给药一次，共10次。

病毒给药后，每隔3天进行IVIS成像以跟踪表达荧光素酶(luciferase)的肿瘤细胞的生长情况，并在病毒给药19天后，在IVIS成像后的第二天(第20天)牺牲小鼠并进行尸检(图25)。由于各给药组小鼠在实验期间体重保持稳定，可见RZ-001+无毒性或毒性极低(图26)。另一方面，RZ-001和RZ-001+均具有优异的抗癌效果，特别是RZ-001+_At的抗癌活性优于RZ-001，对于脑肿瘤，RZ-001+具有优秀的抗癌效果(图27)。

综上，通过有限的附图对实施例进行了说明，本领域普通技术人员能够基于所述记载进行多种更改与变形。例如，所说明的技术按照与说明的方法不同的顺序执行，和/或所说明的构成要素按照与说明的方法不同的形态进行结合或组合，或者由其他构成要素或者等同物置换或代替，也能得到适当的结果。虽然本公开包括具体的实例，但是对于本领域的普通技术人员来说显而易见的是，在不脱离权利要求及其等同内容的精神和范围的情况下，可以在这些实例中对形式和细节进行各种改变。本文所描述的示例仅在描述性意义上考虑，而不是出于限制的目的。每个示例中的特征或方面的描述应被视为适用于其他示例中的类似特征或方面。如果所说明的技术按照不同的顺序执行，和/或如果所说明的系统、架构、装置或电路中的构成要素按照不同的形态进行结合或组合，或者由其他构成要素或者等同物置换或代替，也能得到适当的结果。

因此，本发明的范围不是由说明书具体内容限定的，而是由权利要求书及其等同内容限定的，并且权利要求书及其等同内容范围内的所有变化都应被解释为包括在本公开中。

【工业实用性】

本发明的靶向癌症特异性基因的反式剪接核酶可以同时表达癌症治疗基因和免疫检查点抑制剂，可以在抗癌功效上表现出协同作用，能够有效地应用于癌症治疗。

序列表

<110> RZNOMICS INC.

<120> 表达免疫检查点抑制剂的癌症特异性反式剪接核酶及其用途

<130> APC-2021-0824

<150> KR 10-2021-0010416

<151> 2021-01-25

<150> KR 10-2021-0193826

<151> 2021-12-31

<160> 10

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 744

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码scFv PD1(I)的基因

<400> 1

caggtacaac ttgttcagtc cggagctgaa gtgaaaaagc cgggcgcgtc tgttaaggta 60

agctgcaagg cttcaggcta tactttcacg gcgcagtaca tgcattgggt cagacaagct 120

ccaggccaag gtcttgaatg gatggggatc atcaacccga gtgggggtga aacaggctat 180

gctcaaaagt tccagggtcg agtcaccatg actcgggata cctccacgtc taccgtttac 240

atggagctga gcagtttgag gagcgaagat actgccgtat actattgtgc caaggaaggt 300

gttgcggacg gttatgggct cgttgatgta tgggggcaag gcacgatggt taccgtctca 360

tctggtggag gaggttctgg gggtggaggc tcaggaggag gggggtcagg tggcggagga 420

tccgaaatcg tgttgaccca gagtcctgca acactgagtc tgtccccagg ggagagagcc 480

accttgtcct gtagagcgag ccagtctgta agctcttatc tggcttggta tcagcaaaaa 540

cctgggcagg cgccgcgcct cctcatctat gacgcgagca agagggcaac agggatacca 600

gcgagattct ctgggtcagg atcagggaca gacttcacac tcacgatcag ctctttggaa 660

ccagaagatt ttgcagtcta ctattgtgat caacgaaaca actggcctct cacgttcgga 720

ggagggacta aagtagaaat taaa 744

<210> 2

<211> 720

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码scFv PD1(N)的基因

<400> 2

caggtccaac ttgtcgagag cggcggtgga gtggtacagc ctgggcgatc cttgcggctt 60

gattgcaagg cgagcggaat aaccttcagc aacagtggga tgcactgggt aagacaagcg 120

ccaggcaagg ggctcgagtg ggtcgctgtc atctggtatg acggaagtaa acgatattac 180

gccgatagtg taaagggaag gtttacgatc agtagggata actctaaaaa tacgctcttt 240

cttcaaatga acagtcttcg agcagaagat acagcggtgt attattgtgc tactaatgac 300

gattattggg gccagggtac tctcgttacg gtaagctctg gtggaggagg aagtggtggc 360

ggaggtagtg gaggtggcgg ctccgggggt ggaggatccg agatagtact cacacaaagt 420

cctgctacgc tttcactctc ccctggagag agagctactc tctcatgccg agcctcccag 480

agtgtgagtt catatttggc gtggtaccag cagaagcccg gccaagcccc ccgattgctc 540

atatatgacg ccagtaatcg cgcgactggt atacctgccc ggtttagcgg aagtggatcc 600

gggacggact ttaccctgac aatttcttca ctggagcctg aagacttcgc cgtatattat 660

tgtcaacaat cctccaattg gccaagaact tttggccaag gaacgaaagt tgagataaaa 720

720

<210> 3

<211> 735

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码scFv PDL1(A)的基因

<400> 3

gaagttcaac tggtggagtc tggagggggt ttggtgcagc caggcgggag tttgaggctc 60

agctgcgccg cctctggatt caccttctcc gatagctgga tccattgggt caggcaagcg 120

cctggtaaag ggttggagtg ggtcgcatgg atatctcctt atggagggtc tacatattat 180

gccgactctg tcaagggaag attcacgata tccgcagaca caagtaagaa tacagcatac 240

cttcaaatga actccctgcg cgctgaagac acggcggttt attattgcgc taggcggcac 300

tggccagggg gttttgacta ttggggtcaa ggtaccttgg tcacggtttc atccggcggc 360

ggtggtagcg gtggtggagg tagcgggggt ggtggaagtg ggggtggagg ctcagacatc 420

caaatgacac aaagcccatc ctccctgagc gctagtgtgg gggaccgggt cacgataacc 480

tgccgggcta gccaagatgt gagcacagca gtcgcctggt atcagcagaa gcccgggaag 540

gccccaaaac tcctcatata ctctgcttct tttctctatt ccggtgtgcc ctctcgattc 600

tcaggcagtg ggtcaggaac cgacttcacg ctgaccatct caagtttgca gccggaagac 660

ttcgcaacgt attattgcca gcaatacctc taccatcctg ccactttcgg tcaggggacg 720

aaagtagaga ttaaa 735

<210> 4

<211> 393

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码hTERT靶向核酶的序列

<400> 4

ggcaggaaaa gttatcaggc atgcacctgg tagctagtct ttaaaccaat agattgcatc 60

ggtttaaaag gcaagaccgt caaattgcgg gaaaggggtc aacagccgtt cagtaccaag 120

tctcagggga aactttgaga tggccttgca aagggtatgg taataagctg acggacatgg 180

tcctaaccac gcagccaagt cctaagtcaa cagatcttct gttgatatgg atgcagttca 240

cagactaaat gtcggtcggg gaagatgtat tcttctcata agatatagtc ggacctctcc 300

ttaatgggag ctagcggatg aagtgatgca acactggagc cgctgggaac taatttgtat 360

gcgaaagtat attgattagt tttggagtac tcg 393

<210> 5

<211> 1128

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码HSVkt的序列

<400> 5

atggcttcgt acccctgcca tcaacacgcg tctgcgttcg accaggctgc gcgttctcgc 60

ggccatagca accgacgtac ggcgttgcgc cctcgccggc agcaagaagc cacggaagtc 120

cgcctggagc agaaaatgcc cacgctactg cgggtttata tagacggtcc tcacgggatg 180

gggaaaacca ccaccacgca actgctggtg gccctgggtt cgcgcgacga tatcgtctac 240

gtacccgagc cgatgactta ctggcaggtg ctgggggctt ccgagacaat cgcgaacatc 300

tacaccacac aacaccgcct cgaccagggt gagatatcgg ccggggacgc ggcggtggta 360

atgacaagcg cccagataac aatgggcatg ccttatgccg tgaccgacgc cgttctggct 420

cctcatatcg ggggggaggc tgggagctca catgccccgc ccccggccct caccctcatc 480

ttcgaccgcc atcccatcgc cgccctcctg tgctacccgg ccgcgcgata ccttatgggc 540

agcatgaccc cccaggccgt gctggcgttc gtggccctca tcccgccgac cttgcccggc 600

acaaacatcg tgttgggggc ccttccggag gacagacaca tcgaccgcct ggccaaacgc 660

cagcgccccg gcgagcggct tgacctggct atgctggccg cgattcgccg cgtttacggg 720

ctgcttgcca atacggtgcg gtatctgcag ggcggcgggt cgtggcggga ggattgggga 780

cagctttcgg ggacggccgt gccgccccag ggtgccgagc cccagagcaa cgcgggccca 840

cgaccccata tcggggacac gttatttacc ctgtttcggg cccccgagtt gctggccccc 900

aacggcgacc tgtacaacgt gtttgcctgg gccttggacg tcttggccaa acgcctccgt 960

cccatgcacg tctttatcct ggattacgac caatcgcccg ccggctgccg ggacgccctg 1020

ctgcaactta cctccgggat ggtccagacc cacgtcacca cccccggctc cataccgacg 1080

atctgcgacc tggcgcgcac gtttgcccgg gagatggggg aggctaac 1128

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码miR-122T的序列

<400> 6

caaacaccat tgtcacactc ca 22

<210> 7

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码p2a的序列

<400> 7

gccacaaact tctctctgct aaagcaagca ggtgatgttg aagaaaaccc cgggcct 57

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物预混物的RT引物(HSV-tk)

<400> 8

agttagcctc ccccatctc 19

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物预混物的hTERT引物

<400> 9

ggaattcgca gcgctgcgtc ctgct 25

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物预混物的HSVkt引物

<400> 10

gtgaggaccg tctatataaa cccgcagtag 30

Claims (19)

1.靶向癌症特异性基因的反式剪接核酶，其中

所述核酶包括可操作地连接至3'外显子的靶基因，

所述靶基因是包括免疫检查点抑制基因的两个以上癌症治疗基因。

2.根据权利要求1所述的反式剪接核酶，其中

所述反式剪接核酶的结构为5'-反式剪接核酶-癌症治疗基因-免疫检查点抑制基因-3'，

所述癌症治疗基因与免疫检查点抑制基因不同。

3.根据权利要求1所述的反式剪接核酶，其中所述癌症特异性基因是从由端粒酶逆转录酶mRNA、甲胎蛋白mRNA、癌胚抗原mRNA、前列腺特异性抗原mRNA、细胞骨架相关蛋白2mRNA，或者突变大鼠肉瘤mRNA组成的群组中选择的一种。

4.根据权利要求1所述的反式剪接核酶，其中所述治疗基因是从由药物敏感性基因、细胞凋亡基因、细胞抑制基因、细胞毒性基因、抑癌基因、抗原基因、细胞因子基因以及抗血管生成基因组成的群组中选择的一种基因。

5.根据权利要求1所述的反式剪接核酶，其中所述药物敏感性基因是单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVtk)。

6.根据权利要求1所述的反式剪接核酶，其中所述免疫检查点抑制剂是CTLA-4、PD-1、PD-L1、PD-L2、LAG-3、BTLA、B7H3、B7H4、TIM3、KIR、TIGIT、CD47、VISTA或A2aR的抑制剂。

7.根据权利要求1所述的反式剪接核酶，其中所述反式剪接核酶在3'末端还包括至少1拷贝的部分或全部微RNA-122a(miR-122a)的互补序列。

8.根据权利要求1所述的反式剪接核酶，其中所述两个以上的癌症治疗基因是通过对自裂解肽进行编码的基因实现连接。

9.根据权利要求8所述的反式剪接核酶，其中所述自裂解肽是P2A。

10.包括权利要求1～9之任一项所述的反式剪接核酶的非病毒基因传递系统。

11.表达权利要求1～9之任一项所述的反式剪接核酶的表达载体。

12.根据权利要求11所述的表达载体，其中所述表达载体还包括与所述核酶基因可操作地连接的启动子。

13.表达权利要求11或12所述的表达载体的基因传递系统。

14.用权利要求11或12所述的表达载体转染的细胞。

15.治疗癌症的药物组合物，其包括从由权利要求1～9之任一项所述的反式剪接核酶、权利要求10所述的非病毒基因传递系统、权利要求11或12所述的表达载体、权利要求13所述的基因传递系统组成的群组中选择的任一种作为有效成分。

16.根据权利要求15所述的药物组合物，其中所述药物组合物是口服给药或以注射剂形式静脉内、动脉内、癌症组织内或皮下给药。

17.根据权利要求15所述的药物组合物，其中所述癌症是从由肝癌、成胶质细胞瘤、胆道癌、肺癌、胰腺癌、黑色素瘤、骨癌、乳腺癌、结肠癌、胃癌、前列腺癌、白血病、子宫癌、卵巢癌、淋巴瘤或脑癌组成的群组中选择的至少一种癌症。

18.根据权利要求15所述的药物组合物，其中所述癌症是免疫检查点抑制剂抗性癌症。

19.癌症治疗方法，其包括将权利要求15所述的组合物向人类外的个体给药的步骤。