KR101500804B1

KR101500804B1 - Ａｉｍｐ２ 유전자의 스플라이싱 변이체 특이적인 트랜스-스플라이싱 활성을 갖는 핵산 분자 및 이를 이용한 폐암 치료용 약학 조성물 및 폐암 진단용 조성물

Info

Publication number: KR101500804B1
Application number: KR1020120041748A
Authority: KR
Inventors: 이성욱; 원유섭
Original assignee: 단국대학교 산학협력단
Priority date: 2012-04-20
Filing date: 2012-04-20
Publication date: 2015-03-11
Also published as: KR20130118671A

Abstract

본 발명은 AIMP2 유전자의 스플라이싱 변이체를 특이적으로 표적으로 하는 트랜스-스플라이싱 활성을 갖는 핵산 분자, 및 이를 이용한 폐암 치료용 약학 조성물 및 폐암 진단용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 벡터에 의해 코딩되는 트랜스-스플라이싱 리보자임은 AIMP2-DX2를 특이적으로 억제함과 동시에 AIMP2-DX2를 발현하는 폐암조직 특이적으로 자살 유전자 등의 치료 유전자를 발현하여 특이적이며 효과적인 항암효과를 나타낼 수 있다. 따라서, 본 발명의 벡터를 이용하여, 폐암 유전자 치료제로 사용할 수 있다. 또한, AIMP2-DX2를 발현하는 폐암조직 특이적으로 리포터 유전자를 발현시킴으로써, 폐암 진행 여부를 진단할 수 있는 진단제 및 in vivo 영상화 시약으로 사용할 수 있다.

Description

ＡＩＭＰ２ 유전자의 스플라이싱 변이체 특이적인 트랜스-스플라이싱 활성을 갖는 핵산 분자 및 이를 이용한 폐암 치료용 약학 조성물 및 폐암 진단용 조성물 {Trans-splicing enzymatic nucleic acid molecule specific to splicing variant of AIMP2 gene, and pharmaceutical composition for treating lung cancer and composition for diagnosing lung cancer using the same}

본 발명은 AIMP2 유전자의 스플라이싱 변이체를 특이적으로 표적으로 하는 트랜스-스플라이싱 활성을 갖는 핵산 분자, 및 이를 이용한 폐암 치료용 약학 조성물 및 폐암 진단용 조성물에 관한 것이다.

현재까지의 암 치료는 대부분 외과적 제거(수술), 방사선 치료 또는 항암화학요법을 통하여 시행되고 있다. 그러나, 이러한 치료법은 암세포만을 특이적으로 죽이지 못하고 정상세포에도 손상을 주는 등 여러 가지 부작용을 유발한다. 이러한 부작용을 극복하기 위하여 암세포 특이적인 표적 유전자를 찾아 그것을 제거하거나 특정 유전자의 프로모터를 이용하여 독성물질을 암세포 특이적으로 발현시킴으로써 암 세포 사멸을 유도하려는 많은 유전자 치료법들이 시도되어왔다.

그러나, 유전자 치료에 활용될 수 있는 타겟 유전자들의 다수가 세포분열을 많이 하는 일반 세포에도 발현함으로 인해서 부작용이 발생한다. 이를 줄이기 위한 노력으로 조직 특이적(tissue-specific) 프로모터를 쓰는 방법이 고려되고 있으나, 특이성이 높아지는 대신 치료 효능이 떨어지는 단점으로 인해 실용화에 이르지 못하고 있는 실정이다. 또한, 기존의 암 특이적 유전자의 프로모터인 AFP-, CEA-, PSA- 또는 hTERT(human Telomerase Reverse Transcriptase)-프로모터에 대한 연구들은, 이들이 CMV-프로모터를 썼을 때보다 약 50~300배까지 유전자 발현 기능이 떨어진다고 보고하고 있다.

한편, 테트라하이메나 써모필라(Tetrahymena thermophila) 유래 그룹 I 인트론 리보자임이 실험관 내에서 뿐만 아니라 박테리아, 인체 세포 내에서, 표적 RNA을 절단하고 이것의 3'말단에 부착된 엑손을 트랜스 스플라이싱함으로써 별도로 존재하는 두 전사체를 서로 연결시킬 수 있음이 보고되었다(Been, M. and Cech, T. 1986, One binding site determines sequence specificity of Tetrahymena pre-rRNA self-splicing, trans-splicing, and RNA enzyme activity. Cell 47: 207-216; Sullenger, B.A. and Cech, T.R. 1994, Ribozyme-mediated repair of defective mRNA by targeted, trans-splicing. Nature 371: 619-622; Jones, J.T., Lee, S.W., and Sullenger, B.A. 1996, Tagging ribozyme reaction sites to follow trans-splicing in mammalian cells. Nat Med. 2: 643-648). 따라서, 그룹 I 인트론을 기초로 한 트랜스-스플라이싱 리보자임을 이용하여 질환과 관련된 유전자 전사체를 표적으로 함으로써 해당 표적 유전자 전사체가 존재 시에만 질환 특이 전사체를 제거함과 동시에 정상적인 전사체로 보완하거나 또는 새로운 치료용 유전자 전사체로 치환시켜 치료하려는 연구가 진행되고 있다.

그러나, 암세포 등 질환을 가진 세포에서 과발현되는 전사체를 표적으로 하는 경우에는 정상으로 기능하는 전사체가 표적될 수 있는 가능성을 배제할 수 없으므로, 여전히 질환 특이성의 문제가 해결되어야 한다.

본 발명자는 암, 특히 폐암 특이적으로 효과적인 유전자 치료를 할 수 있는 방법에 대하여 연구한 결과, 그룹 I 인트론 리보자임을 이용하여 AIMP2의 스플라이싱 변이체인 AIMP2-DX2에 대한 트랜스-스플라이싱 반응을 유도함으로써, 정상조직에서의 부작용을 현저히 낮추고, 효과적으로 폐암을 치료할 수 있다는 것을 확인하고, 이를 토대로 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 주된 목적은 프로모터; 상기 프로모터와 작동 가능하게 연결된, AIMP2-DX2 전사체에 특이적으로 작용하는 트랜스-스플라이싱 리보자임을 코딩하는 리보자임 영역; 및 상기 리보자임 영역의 3'말단에 연결된 치료 유전자 또는 리포터 유전자를 5'-> 3'의 순서로 포함하는 벡터로서, 상기 AIMP2-DX2 전사체는 AIMP2 (Aminoacyl-tRNA synthetase Interacting Multifunctional Protein 2) 유전자의 엑손 2가 결손된 스플라이싱 변이체이고, 상기 리보자임은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 내부 가이드 서열(IGS)을 포함하는 것인 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 벡터를 유효성분으로 포함하는 폐암 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 상기 벡터를 유효성분으로 포함하는 폐암 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

하나의 실시 양태로서, 본 발명은 프로모터; 상기 프로모터와 작동 가능하게 연결된, AIMP2-DX2 전사체에 특이적으로 작용하는 트랜스-스플라이싱 리보자임을 코딩하는 리보자임 영역; 및 상기 리보자임 영역의 3'말단에 연결된 치료 유전자 또는 리포터 유전자를 5'-> 3'의 순서로 포함하는 벡터로서, 상기 AIMP2-DX2 전사체는 AIMP2 (Aminoacyl-tRNA synthetase Interacting Multifunctional Protein 2) 유전자의 엑손 2가 결손된 스플라이싱 변이체이고, 상기 리보자임은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 내부 가이드 서열(IGS)을 포함하는 것인 벡터를 제공한다. 도 5는 본 발명의 구체적 실시예에서 제조한, CMV 프로모터 - 100개의 뉴클레오티드로 구성된 안티센스 코딩 영역 - AIMP2-DX2의 +138번째 핵산을 표적하는 트랜스-스플라이싱 리보자임 코딩 영역 - HSVtk 유전자로 구성된 벡터, 및 CMV 프로모터 - 100개의 뉴클레오티드로 구성된 안티센스 코딩 영역 - AIMP2-DX2의 +139번째 핵산을 표적하는 트랜스-스플라이싱 리보자임 코딩 영역 - HSVtk 유전자로 구성된 벡터의 모식도이다.

상기 프로모터는 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 다른 핵산 서열의 발현을 조절하는 핵산 서열을 의미하며, 조직특이적 프로모터 또는 암세포 특이적 프로모터일 필요가 없고, 바람직하게는 활성이 좋은 사이토메갈로바이러스(CMV) 또는 로우스 사르코마 바이러스(RSV) 프로모터일 수 있다. 본 발명의 벡터는 조직특이적 프로모터 또는 암세포 특이적 프로모터를 사용하지 않아도, AIMP2-DX2 전사체에 특이적으로 작용하는 트랜스-스플라이싱 리보자임의 작용에 의하여 폐암 세포 특이적으로 치료 유전자 또는 리포터 유전자를 도입할 수 있다. 본 발명의 프로모터는 당업자에게 공지된 방법을 이용하여 용이하게 제조될 수 있는데, 예를 들면 사람의 게놈을 주형으로 하고 적절한 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하거나, 자동 DNA 합성기를 이용하여 제조할 수 있다.

상기 '작동 가능하게 연결된(operably linked)'은 하나의 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 기능적으로 결합되어 그의 기능 또는 발현이 다른 핵산 단편에 의해 영향을 받는 것을 말한다.

상기 AIMP2-DX2 전사체는 AIMP2 (Aminoacyl-tRNA synthetase Interacting Multifunctional Protein 2) 유전자의 엑손 2가 결손된 스플라이싱 변이체를 말한다. AIMP2는 스캐폴딩 단백질로서 마크로분자 tRNA 신테타제 복합체의 집합에 매우 중요한 작용을 하는 p38로 처음 밝혀진 후, TGF-beta의 성장정지신호를 조절함으로써 세포증식을 억제하고, DNA 손상에 대응한 MDM2 매개 분해로부터 p53를 보호함으로써 세포사멸을 증진시키고, TNF-alpha의 세포 자살 신호를 매개함으로써 세포 사멸을 유도하는 것으로 보고되었다. AIMP2는 4개의 엑손 및 3개의 인트론을 포함하는데(도 1A), 이러한 AIMP2의 선택적 스플라이싱(Alternative splicing) 기작에 의하여 2번째 엑손이 결실되어 있는 스플라이싱 변이체인 AIMP2-DX2는 특이적으로 인간 폐암 세포와 환자의 조직에서 많이 발견되고, p53에 경쟁적으로 결합하여 정상적인 AIMP2의 세포 사멸 유도 활성을 방해함으로써 종양 형성을 유도한다.

상기 AIMP2-DX2 전사체에 특이적으로 작용하는 트랜스-스플라이싱 리보자임은 테트라하이메나 써모필라(Tetrahymena thermophila) 그룹 I 인트론으로부터 5'의 21 뉴클레오타이드가 결손된 트랜스-스플라이싱 리보자임(L-21 트랜스-스플라이싱 리보자임)으로부터 유래된 것일 수 있고, 서열번호 1 또는 서열번호 2의 내부 가이드 서열(IGS)을 포함함으로써, AIMP2의 엑손 1과 엑손 3의 연결지점 주변의 우리딘(U) 뉴클레오티드(+138 위치 또는 +139 위치의 우리딘)를 표적하여, 2번째 엑손이 결실되어 있는 스플라이싱 변이체인 AIMP2-DX2 전사체에만 특이적으로 작용할 수 있다(도 1B). 기존의 트랜스-스플라이싱 리보자임 반응이 표적 RNA의 앞부분 만을 표적으로 하였던 것과 달리 본 발명의 리보자임은 표적 RNA의 중간 부분을 표적으로 하는 특징이 있다.

본 발명의 구체적 실시예에서는, 상기 제조된 리보자임의 표적 특이성을 분석하기 위하여, in vitro에서 트랜스-스플라이싱 활성을 분석하였다. 그 결과, 두 리보자임 모두 3' 엑손 태그를 AIM2-DX2 RNA에 트랜스-스플라이싱하였음을 확인하였다(도 2A). 또한, 리보자임 매개 트랜스-스플라이싱 생성물을 서열분석한 결과, 변이체 RNA에 대하여 아주 정확하게 스플라이싱 반응을 한 것을 확인하였다. 대조적으로, 정상 AIMP 전장 전사체와 함께 배양되었을 때에는 어떤 리보자임에서도 트랜스-스플라이싱 생성물이 검출되지 않았다.

6-nt 길이의 IGS만을 가지는 그룹 I 인트론은 포유류 세포 내에서 발현되었을 때 불활성화되거나 비특이적 활성을 나타낸다고 알려져 있기 때문에, 본 발명의 트랜스-스플라이싱 리보자임은, 리보자임과 표적 전사체 간의 비특이적 결합을 감소시키기 위하여, 상기 IGS의 인접한 업스트림 위치에, AIMP2-DX2 전사체 서열에 상보적인 2 내지 4 뉴클레오타이드, 바람직하게는 서열번호 4(gua)로 표시되는 염기서열의 뉴클레오타이드를 더 포함할 수 있다. 상기 IGS 및 그의 업스트림의 2 내지 4 뉴클레오타이드는 표적 AIMP2-DX2 전사체와 상보적 결합을 함으로써 연장된 P1 나선을 형성할 수 있다.

또한, 본 발명의 트랜스-스플라이싱 리보자임은, 리보자임 3'말단에 연결된 치료 유전자 또는 리포터 유전자가 정확히 트랜스-스플라이싱 될 수 있도록, 상기 IGS의 업스트림 위치에, 리보자임 내 스플라이싱 위치의 다운스트림 서열과 상보적 결합하여 P10 나선을 형성할 수 있는 4 내지 7 뉴클레오타이드, 바람직하게는 6 뉴클레오타이드를 더 포함할 수 있다. 더욱 바람직하게는, 상기 리보자임은, 상기 IGS의 업스트림 위치에, 서열번호 5(aucagu)로 표시되는 염기서열을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 구체적 실시예에서, 상기 리보자임은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 IGS 업스트림에 서열번호 16(aucagua)의 서열을 삽입하여 제조되었고, 구체적으로는 서열번호 6 또는 서열번호 7로 표시되는 염기서열을 갖는 리보자임 영역으로부터 코딩되는 것이지만, 이에 한정되지 않고, 상기 본 발명의 리보자임의 특성을 포함하는 한 모두 본 발명의 범위에 포함된다.

본 발명의 벡터는 상기 프로모터와 상기 리보자임 영역 사이에, 35 내지 200개의 뉴클레오타이드, 바람직하게는 90 내지 120개, 더욱 바람직하게는 100개 뉴클레오타이드로 구성되는 안티센스를 코딩하는 안티센스 영역을 더 포함할 수 있고, 상기 안티센스는 AIMP2-DX2 전사체의 표적 우리딘의 다운스트림 영역에 존재하는 서열, 바람직하게는 각각 +147 내지 +181, +147 내지 +246, 또는 +147 내지 +346 잔기와 상보적인 서열을 가질 수 있고, 바람직하게는 서열번호 3으로 표시되는 염기서열을 가질 수 있다.

본 발명의 구체적 실시예에서, 35개, 100개, 200개의 뉴클레오타이드로 구성되는 안티센스를 코딩하는 안티센스 영역을 벡터에 포함시켜 트랜스-스플라이싱 반응을 수행한 결과, AIMP2-DX2 양성 세포에서만 효과적으로 세포 독성을 나타내는 것을 확인하였고, 특히, 100개의 뉴클레오타이드로 구성되는 안티센스를 코딩하는 안티센스 영역을 벡터에 포함시킨 Rib100AS-HSVtk 형질감염은 대조군 벡터(pCMV-HSVtk)와 비교하여 매우 효과적인 세포 독성 활성을 유도하는 것을 확인할 수 있었다(도 3A, 3B). 상기 안티센스의 길이에 의해, 표적 전사체에 본 발명의 트랜스-스플라이싱 리보자임이 효과적으로 접근할 수 있는 정도가 영향을 받을 수 있는 것으로 생각된다. 그러나, 35개, 100개, 200개의 뉴클레오타이드로 구성되는 안티센스 중 100개의 뉴클레오타이드로 구성되는 안티센스의 효과가 가장 좋았던 결과에 비추어, 안티센스의 길이가 길수록 그 효과가 좋은 것은 아니다. 바람직하게는, 상기 안티센스 영역과 상기 리보자임 영역 사이에, 5 내지 10 뉴클레오타이드로 구성된 링커 뉴클레오타이드를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 벡터에 의해 코딩된 트랜스-스플라이싱 리보자임은, 표적 AIMP2-DX2 전사체의 표적 부위를 특이적으로 절단하고, 상기 절단된 위치에, 리보자임의 3'말단에 연결된 치료 유전자 또는 리포터 유전자를 연결하는 반응을 수행한다. 종래의 siRNA 및 shRNA 를 이용한 유전자 치료법이 표적 전사체를 절단, 제거하는 데에 그치는 것에 비하여, 본 발명의 벡터에 의해 코딩된 트랜스-스플라이싱 리보자임은 표적 전사체를 절단하여 제거함과 동시에 표적 전사체 특이적으로 세포사멸 등을 유도할 수 있는 치료 유전자 발현을 유도할 수 있다.

본 발명의 치료 유전자(therapeutic gene)는 암세포 내에서 발현되어 치료학적 효과를 나타내는 핵산 서열을 말한다. 예를 들면, 상기 치료 유전자는 약제감수성유전자, 세포사멸 유전자, 세포증식 억제 유전자, 세포독성 유전자, 종양 억제인자 유전자, 항원성 유전자, 사이토카인 유전자 및 항신생 혈관 생성 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종일 수 있다.

상기 약제감수성 유전자(drug-sensitizing gene)는 독성이 없는 전구체(prodrug)를 독성물질로 전환시키는 효소에 대한 유전자로서, 유전자가 이입된 세포가 사멸하게 되므로 자살 유전자(suicide gene)로도 불린다. 즉, 정상 세포에는 독성이 없는 전구체를 전신적으로 투여했을 때 암세포에서만 전구체가 독성 대사체(toxic metabolite)로 전환되어 약제에 대한 감수성을 변화시킴으로써 암세포를 파괴시키는 방법이다. 대표적으로 HSV-tk(Herpes simplex virus-thymidine kinase) 유전자와 갠시클로비르(ganciclovir), 대장균의 사이토신 탈아미노효소 (cytosine deaminase, CD) 유전자와 5-플루오로시토신(5-fluorocytosine, 5-FC)을 포함한다.

상기 세포사멸 유전자(proapoptotic gene)는 프로그램된 세포 소멸을 유도하는 핵산 서열을 말한다. 당업자에게 공지된 세포사멸 유전자로, p53, 아데노바이러스 E3-11.6K (Ad2 및 Ad5에서 유래) 또는 아데노바이러스 E3-10.5K (Ad에서 유래), 아데노바이러스 E4 유전자, p53 경로 유전자 및 카스파제를 코딩하는 유전자를 포함한다.

상기 세포증식 억제 유전자(cytostatic gene)는 세포 내에서 발현되어 세포 주기 도중에 세포 주기를 정지시키는 핵산 서열을 의미한다. 대표적으로 p21, 망막아세포종 유전자, E2F-Rb 융합 단백질 유전자, 사이클린-종속성 카이네이즈 억제인자를 코딩하는 유전자(예를 들면, p16, p15, p18 및 p19), 성장 중지 특이적 호메오박스(growth arrest specific homeobox, GAX) 유전자 등을 포함한다.

상기 세포독성 유전자(cytotoxic gene)는 세포 내에서 발현되어 독성 효과를 나타내는 핵산 서열을 말한다. 예를 들어, 슈도모나스 외독소(exotoxin), 리신 독소, 디프테리아 독소 등을 코딩하는 핵산 서열 등을 포함한다.

상기 종양 억제인자 유전자(tumor suppressor gene)는 표적 세포 내에서 발현되어 종양 표현형을 억제할 수 있거나 세포사멸을 유도할 수 있는 핵산 서열을 의미한다. 대표적으로 종양 괴사 인자(tumor necrosis factor-α, TNF-α), p53 유전자, APC 유전자, DPC-4/Smad4 유전자, BRCA-1 유전자, BRCA-2 유전자, WT-1 유전자, 망막아세포종 유전자, MMAC-1 유전자, 선종양 폴립증 코일 단백질(adenomatous polyposis coil protein), 결손된 결장 종양 (DCC) 유전자, MMSC-2 유전자, NF-1 유전자, 염색체 3p21.3에 위치한 비인후 종양 억제인자 유전자, MTS1 유전자, CDK4 유전자, NF-1 유전자, NF-2 유전자 및 VHL 유전자 등을 포함한다.

상기 항원성 유전자(antigenic gene)는 표적 세포 내에서 발현되어 면역 시스템에서 인식할 수 있는 세포 표면 항원성 단백질을 생산하는 핵산 서열을 말한다. 예를 들어, 암태아성 항원 (carcinoembryonic antigen, CEA) 및 p53 등을 포함한다.

상기 사이토카인 유전자(cytokine gene)는 세포 내에서 발현되어 사이토카인을 생성하는 핵산 서열을 의미한다. 대표적으로 GM-CSF, 인터류킨(IL-1, IL-2, IL-4, IL-12, IL-10, IL-19,IL-20), 인터페론 α, β, γ(인터페론 α-2b) 및 인터페론 α-2α-1과 같은 융합체 등을 포함한다.

상기 항신생혈관 생성 유전자(anti-angiogenic gene)는 발현되어 항-신생혈관 생성 인자를 세포밖으로 방출하는 핵산 서열을 말한다. 그 예로 안지오스타틴, 혈관 내피 성장 인자(VEGF)의 억제 인자, 엔도스타틴 등을 포함한다.

본 발명의 구체적 실시예에서는, HSVtk(Herpes simplex virus-thymidine kinase)를 암호화하는 유전자, 바람직하게는 서열번호 10으로 표시되는 염기서열을 갖는 유전자를 사용하였으나, Genbank Accession no. AAP13943, P03176, AAA45811, P04407, Q9QNF7, KIBET3, P17402, P06478, P06479, AAB30917, P08333, BAB84107, AAP13885, AAL73990, AAG40842, BAB11942, NP_044624, NP_044492, CAB06747 등에 기재된 것을 사용할 수도 있다.

상기 리포터 유전자는 LacZ, 클로람페니콜 아세틸 전이효소(CAT: chloramphenicol acetyl transferase), 레닐라 루시퍼라제(Renila luciferase), 반딧불이(firefly) 루시퍼라아제, 적색형광단백질(RFP), 녹색형광단백질(GFP) 및 분비성 태반 알칼라인 포스파타아제(secreted placental alkaline phosphatase, SEAP)로 이루어진 군에서 선택된 1종일 수 있다. 본 발명의 트랜스-스플라이싱 리보자임 활성을 통해 폐암 세포 특이적으로 리포터 유전자를 연결함으로써, 발현된 리포터 단백질의 활성 또는 양을 측정하여 폐암 세포를 선택적으로 진단 또는 영상화할 수 있다.

본 발명의 구체적 실시예에서, 상기 벡터는 서열번호 8 또는 서열번호 9로 표시되는 염기서열을 가질 수 있다.

본 발명의 벡터는 당업자에게 공지된 방법에 따라 복제에 필수적인 일련의 유전자, 바람직하게는 E1 및 E3 유전자가 제거된 아데노바이러스에 삽입되어 아데노바이러스 벡터가 될 수 있다. 상기 아데노바이러스는 아데노비리디아에 속에 속하는 바이러스를 의미하고, 상기 아데노비리디아에는 마스트아데노바이러스 속의 동물성 아데노바이러스를 모두 포함할 수 있다. 특히, 인간의 아데노 바이러스는 A-F 아속(subgenera) 및 이의 개개의 혈청형을 포함하며, A-F 아속은 인간의 아데노바이러스 제1형, 제2형, 제3형, 제4형, 제4a형, 제5형, 제6형, 제7형, 제8형, 제9형, 제10형, 제11형(Ad11A 및 Ad11P), 제12형, 제13형, 제14형, 제15형, 제16형, 제17형, 제18형, 제19형, 제19a형, 제20형, 제21형, 제22형, 제23형, 제24형, 제25형, 제26형, 제27형, 제28형, 제29형, 제30형, 제31형, 제32형, 제33형, 제34형, 제34a형, 제35형, 제35p형, 제36형, 제37형, 제38형, 제39형, 제40형, 제41형, 제42형, 제43형, 제44형, 제45형, 제46형, 제47형, 제48형 및 제91형을 포함할 수 있다. 상기 아데노바이러스 벡터는 높은 유전자 전달 효율, 미분화세포로 유전자를 전달하는 능력 및 높은 역가의 바이러스 저장물 제조의 용이성 효과를 가진다.

본 발명의 벡터로부터 코딩된 트랜스-스플라이싱 리보자임은 폐암세포 특이적인 AIMP2-DX2를 특이적으로 인지하여 3'엑손에 연결된 치료 유전자를 폐암 세포 선택적으로 도입할 수 있는 바, 본 발명은 하나의 실시 양태로서, 상기 벡터를 유효성분으로 포함하는 폐암 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 구체적 실시예에서, 암 치료제로서 AIMP2-DX2 특이적 트랜스-스플라이싱 리보자임의 가능성을 확인하기 위하여, WI-26(AIMP2-DX2 음성 정상 폐세포주), WI-26T(AIMP2-DX2 양성 폐세포주), 또는 H460(AIMP2-DX2 양성 폐종양 세포주)를 GFP 발현 벡터와 함께 pRib35AS-HSVtk, pRib100AS-HSVtk, pRib200ASHSVtk로 형질감염시키고, 갠시클로비르(GCV)를 세포에 처리하였다. 그 결과, AIMP2-DX2 양성 세포에서만 효과적으로 세포 독성을 나타내는 것을 확인하였다. GCV 처리가 없는 상태에서는, Rib100AS-HSVtk로 형질감염된 AIMP2-DX2 세포에서도 세포 독성이 관찰되지 않았으므로, 이는 리보자임에 의한 세포 독성이 표적 RNA에 대한 트랜스-절단(trans-cleavage) 또는 안티센스 효과에 의한 것이 아니고, 세포 내에서의 HSVtk 유전자 활성의 AIMP2-DX2 선택적인 유도에 의한 것이라는 것을 확인하였다(도 3).

또한, AIMP2-DX2 양성 세포에서의 특이적인 리보자임에 의한 자살 유전자 활성의 선택적인 유도가 세포내에서의 트랜스-스플라이싱 반응 때문임을 재 확인하기 위하여 형질감염된 세포로부터의 RNA 생성물을 분석한 결과, 트랜스-스플라이싱 생성물 개수의 경향이 세포 독성 정도 경향과 동일하였다(도 4A, lane 4). 또한, WI-26T(AIMP2-DX2 양성 폐세포주) 세포 용해물을 리보자임 형질감염된 AIMP2-DX2 음성 WI-26 세포 용해물과 혼합한 후에 분리된 RNA 샘플에서는 어떤 생성물도 증폭되지 않았다 (도 4A, mix; lane 6 및 7). 따라서, 관찰된 증폭 생성물은 AIMP2-DX2 양성 세포내에서 트랜스-스플라이싱 반응을 통하여 특이적으로 생성된 것이라는 것을 확인하였다. Rib100AS-HSVtk 형질감염된 WI-26T 세포로부터 증폭한 단편의 서열 분석 결과를 통하여, 리보자임이 정확하게 세포 내 AIMP2-DX2 RNA의 표적 잔기에 그의 3' 엑손 태그를 스플라이싱했다는 것을 확인하였다(도 4B).

또한, AIMP2 DX2 발현 암세포로 항암 유전자 활성을 전달하는 특이하고 효과적인 능력과 동시에, 트랜스-스플라이싱 리보자임은 세포에 있는 표적전사체의 농도를 감소시킬 것이다. AIMP2-DX2의 감소는 정상적인 AIMP2의 상대적 농도를 증가시키고 암 성장의 지연으로 이끌어 낼 정상적인 AIMP2에 의해 proapoptotic 활성을 가져올 것이다.

이러한 결과는 본 발명의 벡터를 유효성분으로 포함하는 폐암 치료용 약학적 조성물이, 현재까지 유전자 치료 분야에서 해결하기 어려웠던 높은 특이성 및 높은 효능성을 동시에 해결할 수 있음을 보여준다.

본 발명의 폐암 치료용 약학적 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명의 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있으며, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 비경구 투여가 바람직하고, 예컨대 정맥내 투여, 복강내 투여, 종양내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 흡입 투여 또는 국부 투여를 이용하여 투여할 수 있고, 바람직하게는 흡입 투여를 이용하여 투여할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 단독으로, 또는 외과적 수술요법 등의 보조 치료 방법들과 병행하여 사용할 수 있다. 본 발명의 조성물과 함께 이용될 수 있는 화학 요법제(chemotherapeutic agent)는 시스플라틴(cisplatin), 카르보플라틴 carboplatin), 프로카르바진(procarbazine), 메클로레타민(mechlorethamine), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 이포스파미드 (ifosfamide), 멜팔란(melphalan), 클로라부실(chlorambucil), 비술판(bisulfan), 니트로소우레아 (nitrosourea), 디악티노마이신(dactinomycin), 다우노루비신(daunorubicin), 독소루비신(doxorubicin), 블레오마이신(bleomycin), 플리코마이신(plicomycin), 마이토마이신(mitomycin), 에토포시드(etoposide), 탁목시펜(tamoxifen), 택솔(taxol), 트랜스플라티눔(transplatinum), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 빈크리스틴(vincristin), 빈블라스틴(vinblastin) 및 메토트렉세이트(methotrexate) 등을 포함한다. 발명의 조성물과 함께 이용될 수 있는 방사 요법은 X-선 조사 및 γ-선 조사 등이다. 바람직하게는 갠시클로비르(ganciclovir)와 병용하여 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 트랜스-스플라이싱 리보자임은 폐암 세포 특이적인 AIMP2-DX2 전사체에 특이적으로 리포터 유전자를 연결하므로, 당업계에 공지된 방법을 사용하여 발현된 리포터 단백질을 검출함으로써, 본 발명의 벡터를 이용하여 폐암 세포만을 선택적으로 진단할 수 있다. 따라서, 본 발명은 상기 벡터를 유효성분으로 포함하는 폐암 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 벡터에 의해 코딩되는 트랜스-스플라이싱 리보자임은 AIMP2-DX2를 특이적으로 억제함과 동시에 AIMP2-DX2를 발현하는 폐암조직 특이적으로 자살 유전자 등의 치료 유전자를 발현하여 특이적이며 효과적인 항암효과를 나타낼 수 있다. 따라서, 본 발명의 벡터를 이용하여, 폐암 유전자 치료제로 사용할 수 있다. 또한, AIMP2-DX2를 발현하는 폐암조직 특이적으로 리포터 유전자를 발현시킴으로써, 폐암 진행 여부를 진단할 수 있는 진단제 및 in vivo 영상화 시약으로 사용할 수 있다.

도 1은 AIMP2-DX2 전사체의 생성 및 AIMP2-DX2 RNA가 특이적으로 표적되어 트랜스-스플라이싱되는 과정을 나타내는 모식도이다. (A) AIMP2/p38 구조유전자는 3개의 인트론과 4개의 엑손으로 이루어져 있다. AIMP2-DX2는 엑손 2가 결여된 AIMP2 전사체의 스플라이싱 변이체이다. (B) AIMP2-DX2 RNA의 표적된 트랜스-스플라이싱에 의하여 치료 RNA의 선택적 발현이 리보자임에 의하여 일어나는 과정을 나타내는 모식도이다. 리보자임은 내부 가이드 서열을 통한 염기 결합에 의해 표적 우리딘 잔기(엑손 1-엑손 3 연결 지점)에서 AIMP2-DX2 RNA를 특이적으로 인식할 수 있다. 리보자임은 표적 부위의 다운스트림 서열을 제거하고 이를 치료 RNA 서열을 코딩하는 3' 엑손으로 대체한다.
도 2는 트랜스-스플라이싱 활성 분석 결과 및 트랜스-스플라이싱 리보자임의 구조를 나타내는 모식도이다. (A) in vitro에서 생성된 트랜스-스플라이싱 RNA 생성물을 역전사-PCR 증폭한 결과이다. 일련의 리보자임을 AIMP2 RNA 또는 AIMP2-DX2 RNA과 배양하고, 반응 생성물을 증폭시킨 다음, 2% 아가로즈겔을 이용하여 전기영동을 실시하였다. (B) AIMP2-DX2 전사체의 위치+138에 있는 우리딘 뉴클레오티드를 표적으로 하는 변형된 트랜스-스플라이싱 리보자임의 구조를 나타내는 모식도이다. 표적 전사체에서 스플라이싱 위치 주위 서열을 이탤릭체로 기재하였다. 리보자임과 표적 RNA 간의 잠재적 염기 결합을 수직선으로 표시하였다. 수직 화살표는 5'및 3'스플라이싱 위치를 나타낸다.
도 3은 AIMP2 DX2 발현 세포에서의 특이적인 리보자임에 의한 자살 유전자 활성의 선택적 유도를 나타낸다. AIMP2-DX2 양성 폐 세포(a) 또는 AIMP2-DX2 음성 폐 세포(b)를 HSVtk를 가지는 리보자임을 코딩하는 벡터로 GFP 발현 벡터와 함께 co-transfection 하였다. 각 형질감염체에 존재하는 GFP-양성 세포의 개수를 GCV 처리 후에 계수하고 대조군 벡터로 형질 감염된 GFP-양성 세포의 개수에 대한 백분율로서 정량화하였다. 수치들은 5개의 독립적인 실험으로 얻어진 값의 평균과 표준 편차로 나타내었다. **P<0.01, *P<0.05, NS: 유의하지 않음(P>0.05). 각 형질 감염세포의 대표적인 형광 현미경 사진을 GCV 처리 전후로 나타내었다.
도 4는 WI-26T(AIMP2-DX2 양성) 세포 내에서의 특이적 리보자임에 의한 AIMP2-DX2 RNA의 트랜스-스플라이싱 반응을 나타낸다. (A) 세포에서 생성된 트랜스-스플라이싱 RNA 생성물을 역전사-PCR 증폭한 결과. 각 형질감염된 세포 내에서의 증폭된 트랜스-스플라이싱된 (T/S) RNA, HSVtk RNA 및 GAPDH RNA을 나타내었다. VC는 대조군 벡터를 나타낸다. Mix는 mock-형질전환된 WI-26T 세포를 pRib35AS-HSVtk (Mix1) 또는 pRib100AS-HSVtk (Mix2)로 형질 감염시킨 WI-26 세포(AIMP2-DX2 음성)와 혼합한 것이다. (B) 세포 내의 트랜스-스플라이싱된 전사체의 서열(도 4A, lane 4) 분석 결과이다. 스플라이싱 연결 부위 주위의 예상되는 서열을 화살표로 나타내었고, AIMP2-DX2 RNA 내 리보자임 인식 서열을 박스표시로, 위치 138의 표적 우리딘을 원으로 표시하였다.
도 5는 본 발명의 구체적 실시예에서 제조한, CMV 프로모터 - 100개의 뉴클레오티드로 구성된 안티센스 코딩 영역 - AIMP2-DX2의 +138번째 핵산을 표적하는 트랜스-스플라이싱 리보자임 코딩 영역 - HSVtk 유전자로 구성된 벡터, 및 CMV 프로모터 - 100개의 뉴클레오티드로 구성된 안티센스 코딩 영역 - AIMP2-DX2의 +139번째 핵산을 표적하는 트랜스-스플라이싱 리보자임 코딩 영역 - HSVtk 유전자로 구성된 벡터의 모식도이다.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 보다 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 표적 RNA 제조

AIMP2-전장 또는 AIMP2-DX2 기질 RNA은, 5'프라이머(5-TAATACGACTCACTATAGGGATGCCGATGTACCAGGTA-3, 서열번호 11)와 3'프라이머(5-TCACTTAAGGAGCTTGAG-3, 서열번호 12)를 이용하여 전장 AIMP2 또는 AIMP2-DX2 cDNA로부터 증폭된 DNA 템플렛을 T7 RNA 폴리머라제를 사용하여 in vitro 전사함으로써 제조하였다.

실시예 2. 트랜스-스플라이싱 리보자임의 제조

AIMP2-DX2의 +138번째 핵산을 표적하는 트랜스-스플라이싱 리보자임(Rib+138) 및 AIMP2-DX2 의 +139번째 핵산을 표적하는 트랜스-스플라이싱 리보자임(Rib+139)을 제조하기 위하여, T7 프로모터와 각 리보자임의 내부가이드서열 (IGS)을 포함한 5'프라이머 및 3'엑손 서열에 특이적인 3'프라이머를 이용하여 자연적인 Tetrahymena 그룹 I 인트론의 약간 단축된 버전을 코딩하는 pT7L-21(Sullenger and Cech, 1994)를 주형으로 PCR 증폭하였고, 생성된 DNA 템플렛을 in vitro 전사하였다. 구체적으로, L-21 트랜스-스플라이싱 리보자임에 있는 IGS(5-GGAGGG-3, 서열번호 13)를 Rib+138에서는 5-GTCCTG-3(서열번호 1), Rib+139에서는 5-GATCCT-3(서열번호 2)로 교체하였다.

그 결과, 엑손 1 및 엑손 3의 연결 부위 주변의 우리딘 뉴클레오티드(+138 또는 +139)를 표적으로 하는 리보자임이 제조되었다.

실시예 3. in vitro에서의 트랜스-스플라이싱 활성 분석

제조된 리보자임의 표적 특이성을 분석하기 위하여, in vitro에서 트랜스-스플라이싱 활성을 분석하였다.

구체적으로, 특정 리보자임들을(100 nM) 37℃에서 스플라이싱 조건 하에서(50 mM Hepes, pH 7.0, 150 mM NaCl, 5 mM MgCl₂ 및 100 M 구아노신) 표적 RNA (10 nM)와 3시간 동안 배양하였다. 그리고 나서, 3'엑손 태그 서열에 특이적인 3'프라이머(5-ATGTGCTGCAAGGCGATT-3, 서열번호 14) 및 기질 RNA 에 특이적인 5'프라이머(5-TAATACGACTCACTATAGGGATGCCGATGTACCAGGTA-3, 서열번호 11)를 가지고 역전사 PCR 분석을 수행하였다.

그 결과, 두 리보자임 모두 3' 엑손 태그를 AIM2-DX2 RNA에 트랜스-스플라이싱하였다(도 2A). 리보자임 매개 트랜스-스플라이싱 생성물을 서열분석한 결과, 변이체 RNA에 대하여 아주 정확하게 스플라이싱 반응을 한 것을 확인하였다. 대조적으로, 정상 AIMP 전장 전사체와 함께 배양되었을 때에는 어떤 리보자임에서도 트랜스-스플라이싱 생성물이 검출되지 않았다.

실시예 4. 트랜스-스플라이싱 리보자임의 제조

세포 내에서의 Rib+138의 트랜스-스플라이싱 활성을 분석하기 위하여, 개선된 리보자임 컨스트럭트를 제조하였다(도 2B). 6-nt 길이의 IGS만을 가지는 그룹 I 인트론은 포유류 세포 내에서 발현되었을 때 불활성화되거나 비특이적 활성을 나타낸다고 알려져 있기 때문이다. 개선된 리보자임 컨스트럭트를 제조하기 위하여, Rib+138 리보자임의 IGS 업스트림에 연장된 P1 및 6-nt-길이의 P10 나선을 포함하는 상보적 올리고뉴클레오티드를 삽입함으로써 Rib+138 리보자임을 변형하였다. 구체적으로, IGS 업스트림에 서열번호 16(aucagua)의 서열을 삽입하였다.

또한, pRib-HSVtk를 제조하기 위하여, 리보자임의 3'엑손과 인프레임으로 헤르페스 심플렉스 바이러스 티미딘 키니아제 (HSVtk) cDNA를 삽입하였다.

연장된 IGS 및 HSVtk cDNA를 가지는 Rib +138 서열로 구성된 DNA 절편을, CMV 프로모터(Qbiogene) 하의 전이유전자(transgene)을 코딩하는 pAVQ의 XbaI과 BstBI 위치 사이에 삽입하였다.

또한, pRib35AS-HSVtk, pRib100AS-HSVtk, 또는 pRib200AS-HSVtk를 제조하기 위해서, pRib-HSVtk의 HindIII 위치 (링커 서열) 내로, AIMP2-DX2 RNA의 표적 우리딘의 다운스트림 영역(각각 +147 내지 +181, +147 내지 +246, 또는 +147 내지 +346 잔기)에 상보적인 35-nt, 100-nt, 또는 200-nt 길이의 안티센스 서열을 삽입하였다.

대조군으로서, CMV 프로모터의 조절하에 HSVtk 유전자를 코딩하는 pCMV-HSVtk를 제조하였다.

실시예 5. 세포내에서의 자살 유전자 활성의 선택적 유도 분석

암 치료제로서 AIMP2-DX2 특이적 트랜스-스플라이싱 리보자임의 가능성을 확인하기 위하여, WI-26, WI-26T, 또는 H460 세포를 Lipofectamine 2000(Invitrogen)을 사용하여 500 ng의 pEGFP-N1 (GFP 발현 벡터, Clontech)와 함께 5 μg pAVQ 대조군 벡터, pRib35AS-HSVtk, pRib100AS-HSVtk, pRib200ASHSVtk, 또는 pCMV-HSVtk로 형질감염시키고, 형질감염 24h, 72h 후, 100 μM 갠시클로비르(GCV; Cymevene, Roche)를 세포에 처리하였다.

정상 폐세포주 (WI-26, AIMP2-DX2 음성)는 한국세포주은행에서 구했다. 변형된 폐세포주(WI-26T, AIMP2-DX2 양성)는 서울대학교 김성훈 박사에게서 제공받았다. 폐 종양 세포주(H460,AIMP2-DX2 양성)는 ATCC에서 구하였다. WI-26와 WI-26T 세포는 10% 우태아혈청을 함유하고 있는 Eagle's Minimal Essential Medium에서 배양하였으며, H460 세포는 10% 우태아혈청을 함유하고 있는 RPMI-1640에서 배양하였다.

리보자임 매개 자살 유전자 도입의 정도를 확인하기 위하여 리보자임 형질감염된 세포가 프로드러그인 GCV 처리에 대하여 세포 성장이 어떻게 변화하는지 관찰하였다(도 3). 자살 유전자 활성을 증명하기 위하여, GFP 코딩 벡터와 co-transfection 96h 후, 형광 현미경 (Olympus Optical)하에서, GCV 처리 후 각 형질감염 세포에서 GFP 양성을 나타내는 생존 세포의 상대적인 개수를 비교함으로써 세포 독성을 분석하였다. 구체적으로 형질감염된 세포들의 각 필드에서 GFP를 발현하는 세포의 수를 세어 GCV 처리 없이 GFP 발현하는 세포 수로 보정함으로써 GCV 처리 후에 세포 생존 능력을 정량하였다.

대조군 벡터로 형질감염된 세포에서는 세포 타입 또는 GCV 처리에 관계없이 아무런 세포 독성이 관찰되지 않았다. 그러나, CMV 프로모터(CT) 하의 HSVtk 발현은 AIMP2-DX2 양성 세포 및 음성 세포 모두에서 GCV에 대해 유의한 감수성을 나타내었다(도 3).

반면, 트랜스-스플라이싱 리보자임, 특히 Rib100AS-HSVtk 형질감염은 GCV의 존재 하에서 AIMP2-DX2 양성 세포에서만 효과적으로 세포 독성을 나타내었다(도 3A). AIMP2-DX2 음성 세포는 GCV 처리에도 불구하고 모든 리보자임에 의해 영향을 받지 않았다 (도 3B). GCV가 없는 상태에서는, Rib100AS-HSVtk로 형질감염된 AIMP2-DX2 세포에서도 세포 독성이 관찰되지 않았다. 이는 리보자임에 의한 세포 독성이 표적 RNA에 대한 트랜스-절단(trans-cleavage) 또는 안티센스 효과에 의한 것이 아님을 의미한다. 결과적으로, 특이적 리보자임으로 형질감염된 AIMP2-DX2 양성 세포에서의 GCV 감수성은 주로 세포 내에서의 HSVtk 유전자 활성의 선택적인 유도에 의한 것이다.

실시예 6. 세포내에서의 트란스-스플라이싱 반응 분석

AIMP2-DX2 양성 세포에서의 특이적인 리보자임에 의한 자살 유전자 활성의 선택적인 유도가 세포내에서의 트랜스-스플라이싱 반응 때문임을 확인하기 위하여, 형질감염된 세포로부터의 RNA 생성물을 분석했다 (도 4A).

세포내에서의 트랜스-스플라이싱 생성물을 분석하기 위해, 형질 감염 24 시간 후 리보자임 벡터-형질감염된 세포로부터 총 RNA를 20mM EDTA로 보충된 guanidine isothiocyanate를 이용하여 분리하였다. RNA(5μg)를 10 mM L-argininamide가 존재하에 oligo(dT) 프라이머로 역전사시키고, 생성된 cDNA를 AIMP2-DX2 RNA에 특이적인 5'프라이머 (5-TAATACGACTCACTATAGGGATGCCGATGTACCAGGTA-3, 서열번호 11) 및 3'엑손 HSVtk 서열에 특이적인 3' 프라이머 (5-GTTATCTGGGCGCTTGTCAT-3, 서열번호 15)로 증폭시켰다. 증폭된 cDNA를 AIMP2-DX2 RNA에 특이적인 5' 프라이머 및 HSVtk 서열에 특이적인 네스티드(nested) 3' 프라이머(5-CAGTAGCGTGGGCATTTTCT-3, 서열번호 17)로 재증폭시켰다. 대조군으로서, cDNA는 각 샘플에 존재하는 HSVtk RNA 또는 GAPDH RNA와 함께 증폭시켰다.

그 결과, 세포 독성 분석 결과에서와 같이, Rib100AS-HSVtk의 감염에 의해 가장 많은 수의 트랜스-스플라이싱 생성물이 만들어졌다(도 4A, lane 4). 그러나 대조군 벡터(VC)로 형질감염된 세포는 세포내에서 트랜스-스플라이싱 생성물을 만들지 않았다 (도 4A, lanes 2). 또한, mock-형질전환된 WI-26T 세포 용해물을 리보자임(pRib35AS-HSVtk: Mix1, pRib100AS-HSVtk: Mix2) 형질감염된 AIMP2-DX2 음성 WI-26 세포 용해물과 혼합한 후에 분리된 RNA 샘플에서는 어떤 생성물도 증폭되지 않았다 (도 4A, mix; lane 6 및 7).

따라서, 도 4A에서 관찰된 증폭된 생성물은 AIMP2-DX2 양성 세포내에서 트랜스-스플라이싱 반응을 통하여 특이적으로 생성된 것이고, 정상 AIMP2 RNA와의 반응을 통하여 또는 RNA 조작 중에 생성된 것이 아니라는 것을 확인하였다.

또한, Rib100AS-HSVtk 형질감염된 WI-26T 세포로부터 증폭한 단편(도 4A의 lane 4)의 서열 분석을 통하여, 리보자임이 정확하게 세포 내 AIMP2-DX2 RNA의 표적 잔기에 그의 3' 엑손 태그를 스플라이싱했다는 것을 확인했다(도 4B).

<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Dankook University <120> Trans-splicing enzymatic nucleic acid molecule specific to splicing variant of AIMP2 gene, and pharmaceutical composition for treating lung cancer and composition for diagnosing lung cancer using the same <130> PA120195/KR <160> 17 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Internal guide sequence for Rib+138 <400> 1 gtcctg 6 <210> 2 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> internal guide sequence for Rib+139 <400> 2 gatcct 6 <210> 3 <211> 106 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense region <400> 3 cgtggacagg accctgaagt gctcacagag cagcctgtgc agcacaagca gggagagggg 60 aggggaggcc gggtttgcgt tgatcacgat gtctttcagc aagctt 106 <210> 4 <211> 3 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> extended P1 helix <400> 4 gua 3 <210> 5 <211> 6 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> added P10 helix <400> 5 aucagu 6 <210> 6 <211> 412 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ribozyme region for Rib+138 <400> 6 atcagtagtc ctgaaaagtt atcaggcatg cacctggtag ctagtcttta aaccaataga 60 ttgcatcggt ttaaaaggca agaccgtcaa attgcgggaa aggggtcaac agccgttcag 120 taccaagtct caggggaaac tttgagatgg ccttgcaaag ggtatggtaa taagctgacg 180 gacatggtcc taaccacgca gccaagtcct aagtcaacag atcttctgtt gatatggatg 240 cagttcacag actaaatgtc ggtcggggaa gatgtattct tctcataaga tatagtcgga 300 cctctcctta atgggagcta gcggatgaag tgatgcaaca ctggagccgc tgggaactaa 360 tttgtatgcg aaagtatatt gattagtttt ggagtactcg cactgatagg aa 412 <210> 7 <211> 412 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ribozyme region for Rib+139 <400> 7 tatccgtgat cctaaaagtt atcaggcatg cacctggtag ctagtcttta aaccaataga 60 ttgcatcggt ttaaaaggca agaccgtcaa attgcgggaa aggggtcaac agccgttcag 120 taccaagtct caggggaaac tttgagatgg ccttgcaaag ggtatggtaa taagctgacg 180 gacatggtcc taaccacgca gccaagtcct aagtcaacag atcttctgtt gatatggatg 240 cagttcacag actaaatgtc ggtcggggaa gatgtattct tctcataaga 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ctccgccacc 660 gagggacctg agccagtccg catcgaccgg atcggaaaac ctctcgagaa aggcgtctaa 720 ccagtcacag tcgcaaggta ggctgagcac cgtggcgggc ggcagcgggt ggcggtcggg 780 gttgtttctg gcggaggtgc tgctgatgat gtaattaaag taggcggtct tgagccggcg 840 gatggtcgag gtgaggtgtg gcaggcttga gatccagctg ttggggtgag tactccctct 900 caaaagcggg catgacttct gcgctaagat tgtcagtttc caaaaacgag gaggatttga 960 tattcacctg gcccgatctg gccatacact tgagtgacaa tgacatccac tttgcctttc 1020 tctccacagg tgtccactcc caggtccaag tttggaagat ccagatcccg tggacaggac 1080 cctgaagtgc tcacagagca gcctgtgcag cacaagcagg gagaggggag gggaggccgg 1140 gtttgcgttg atcacgatgt ctttcagcaa gcttatcagt agtcctgaaa agttatcagg 1200 catgcacctg gtagctagtc tttaaaccaa tagattgcat cggtttaaaa ggcaagaccg 1260 tcaaattgcg ggaaaggggt caacagccgt tcagtaccaa gtctcagggg aaactttgag 1320 atggccttgc aaagggtatg gtaataagct gacggacatg gtcctaacca cgcagccaag 1380 tcctaagtca acagatcttc tgttgatatg gatgcagttc acagactaaa tgtcggtcgg 1440 ggaagatgta ttcttctcat aagatatagt cggacctctc cttaatggga gctagcggat 1500 gaagtgatgc aacactggag ccgctgggaa ctaatttgta tgcgaaagta tattgattag 1560 ttttggagta ctcgcactga taggaaatgg cttcgtaccc ctgccatcaa cacgcgtctg 1620 cgttcgacca ggctgcgcgt tctcgcggcc atagcaaccg acgtacggcg ttgcgccctc 1680 gccggcagca agaagccacg gaagtccgcc tggagcagaa aatgcccacg ctactgcggg 1740 tttatataga cggtcctcac gggatgggga aaaccaccac cacgcaactg ctggtggccc 1800 tgggttcgcg cgacgatatc gtctacgtac ccgagccgat gacttactgg caggtgctgg 1860 gggcttccga gacaatcgcg aacatctaca ccacacaaca ccgcctcgac cagggtgaga 1920 tatcggccgg ggacgcggcg gtggtaatga caagcgccca gataacaatg ggcatgcctt 1980 atgccgtgac cgacgccgtt ctggctcctc atgtcggggg ggaggctggg agttcacatg 2040 ccccgccccc ggccctcacc ctcatcttcg accgccatcc catcgccgcc ctcctgtgct 2100 acccggccgc gcgatacctt atgggcagca tgacccccca ggccgtgctg gcgttcgtgg 2160 ccctcatccc gccgaccttg cccggcacaa acatcgtgtt gggggccctt ccggaggaca 2220 gacacatcga ccgcctggcc aaacgccagc gccccggcga gcggcttgac ctggctatgc 2280 tggccgcgat tcgccgcgtt tacgggctgc ttgccaatac ggtgcggtat ctgcagggcg 2340 gcgggtcgtg gtgggaggat tggggacagc tttcggggac ggccgtgccg ccccagggtg 2400 ccgagcccca gagcaacgcg ggcccacgac cccatatcgg ggacacgtta tttaccctgt 2460 ttcgggcccc cgagttgctg gcccccaacg gcgacctgta taacgtgttt gcctgggcct 2520 tggacgtctt ggccaaacgc ctccgtccca tgcacgtctt tatcctggat tacgaccaat 2580 cgcccgccgg ctgccgggac gccctgctgc aacttacctc cgggatggtc cagacccacg 2640 tcaccacccc aggctccata ccgacgatct gcgacctggc gcgcacgttt gcccgggaga 2700 tgggggaggc taactgattc gaaagatccc aacgaaaaga gagaccacat ggtccttctt 2760 gagtttgtaa cagctgctgg gattacacat ggcatggatg aactgtacaa ctgaggatcc 2820 cccgacctcg acctctggct aataaa 2846 <210> 9 <211> 2846 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMV-Rib100AS(+139)-HSVtk <400> 9 cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga cccccgccca 60 ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt 120 caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg 180 ccaagtccgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag 240 tacatgacct tacgggactt tcctacttgg cagtacatct acgtattagt catcgctatt 300 accatggtga tgcggttttg gcagtacacc aatgggcgtg gatagcggtt tgactcacgg 360 ggatttccaa gtctccaccc cattgacgtc aatgggagtt tgttttggca ccaaaatcaa 420 cgggactttc caaaatgtcg taataacccc gccccgttga cgcaaatggg cggtaggcgt 480 gtacggtggg aggtctatat aagcagagct cgtttagtga accgtcagat cctcactctc 540 ttccgcatcg ctgtctgcga gggccagctg ttgggctcgc ggttgaggac aaactcttcg 600 cggtctttcc agtactcttg gatcggaaac ccgtcggcct ccgaacggta ctccgccacc 660 gagggacctg agccagtccg catcgaccgg atcggaaaac ctctcgagaa aggcgtctaa 720 ccagtcacag tcgcaaggta ggctgagcac cgtggcgggc ggcagcgggt ggcggtcggg 780 gttgtttctg gcggaggtgc tgctgatgat gtaattaaag taggcggtct tgagccggcg 840 gatggtcgag gtgaggtgtg gcaggcttga gatccagctg ttggggtgag tactccctct 900 caaaagcggg catgacttct gcgctaagat tgtcagtttc caaaaacgag gaggatttga 960 tattcacctg gcccgatctg gccatacact tgagtgacaa tgacatccac tttgcctttc 1020 tctccacagg tgtccactcc caggtccaag tttggaagat ccagatcccg tggacaggac 1080 cctgaagtgc tcacagagca gcctgtgcag cacaagcagg gagaggggag gggaggccgg 1140 gtttgcgttg atcacgatgt ctttcagcaa gctttatccg tgatcctaaa agttatcagg 1200 catgcacctg gtagctagtc tttaaaccaa tagattgcat cggtttaaaa ggcaagaccg 1260 tcaaattgcg ggaaaggggt caacagccgt tcagtaccaa gtctcagggg aaactttgag 1320 atggccttgc aaagggtatg gtaataagct gacggacatg gtcctaacca cgcagccaag 1380 tcctaagtca acagatcttc tgttgatatg gatgcagttc acagactaaa tgtcggtcgg 1440 ggaagatgta ttcttctcat aagatatagt cggacctctc cttaatggga gctagcggat 1500 gaagtgatgc aacactggag ccgctgggaa ctaatttgta tgcgaaagta tattgattag 1560 ttttggagta ctcgccggat aggaaaatgg cttcgtaccc ctgccatcaa cacgcgtctg 1620 cgttcgacca ggctgcgcgt tctcgcggcc atagcaaccg acgtacggcg ttgcgccctc 1680 gccggcagca agaagccacg gaagtccgcc tggagcagaa aatgcccacg ctactgcggg 1740 tttatataga cggtcctcac gggatgggga aaaccaccac cacgcaactg ctggtggccc 1800 tgggttcgcg cgacgatatc gtctacgtac ccgagccgat gacttactgg caggtgctgg 1860 gggcttccga gacaatcgcg aacatctaca ccacacaaca ccgcctcgac cagggtgaga 1920 tatcggccgg ggacgcggcg gtggtaatga caagcgccca gataacaatg ggcatgcctt 1980 atgccgtgac cgacgccgtt ctggctcctc atgtcggggg ggaggctggg agttcacatg 2040 ccccgccccc ggccctcacc ctcatcttcg accgccatcc catcgccgcc ctcctgtgct 2100 acccggccgc gcgatacctt atgggcagca tgacccccca ggccgtgctg gcgttcgtgg 2160 ccctcatccc gccgaccttg cccggcacaa acatcgtgtt gggggccctt ccggaggaca 2220 gacacatcga ccgcctggcc aaacgccagc gccccggcga gcggcttgac ctggctatgc 2280 tggccgcgat tcgccgcgtt tacgggctgc ttgccaatac ggtgcggtat ctgcagggcg 2340 gcgggtcgtg gtgggaggat tggggacagc tttcggggac ggccgtgccg ccccagggtg 2400 ccgagcccca gagcaacgcg ggcccacgac cccatatcgg ggacacgtta tttaccctgt 2460 ttcgggcccc cgagttgctg gcccccaacg gcgacctgta taacgtgttt gcctgggcct 2520 tggacgtctt ggccaaacgc ctccgtccca tgcacgtctt tatcctggat tacgaccaat 2580 cgcccgccgg ctgccgggac gccctgctgc aacttacctc cgggatggtc cagacccacg 2640 tcaccacccc aggctccata ccgacgatct gcgacctggc gcgcacgttt gcccgggaga 2700 tgggggaggc taactgattc gaaagatccc aacgaaaaga gagaccacat ggtccttctt 2760 gagtttgtaa cagctgctgg gattacacat ggcatggatg aactgtacaa ctgaggatcc 2820 cccgacctcg acctctggct aataaa 2846 <210> 10 <211> 1131 <212> DNA <213> herpes simplex virus tk <400> 10 atggcttcgt acccctgcca tcaacacgcg tctgcgttcg accaggctgc gcgttctcgc 60 ggccatagca accgacgtac ggcgttgcgc cctcgccggc agcaagaagc cacggaagtc 120 cgcctggagc agaaaatgcc cacgctactg cgggtttata tagacggtcc tcacgggatg 180 gggaaaacca ccaccacgca actgctggtg gccctgggtt cgcgcgacga tatcgtctac 240 gtacccgagc cgatgactta ctggcaggtg ctgggggctt ccgagacaat cgcgaacatc 300 tacaccacac aacaccgcct cgaccagggt gagatatcgg ccggggacgc ggcggtggta 360 atgacaagcg cccagataac aatgggcatg ccttatgccg tgaccgacgc cgttctggct 420 cctcatgtcg ggggggaggc tgggagttca catgccccgc ccccggccct caccctcatc 480 ttcgaccgcc atcccatcgc cgccctcctg tgctacccgg ccgcgcgata ccttatgggc 540 agcatgaccc cccaggccgt gctggcgttc gtggccctca tcccgccgac cttgcccggc 600 acaaacatcg tgttgggggc ccttccggag gacagacaca tcgaccgcct ggccaaacgc 660 cagcgccccg gcgagcggct tgacctggct atgctggccg cgattcgccg cgtttacggg 720 ctgcttgcca atacggtgcg gtatctgcag ggcggcgggt cgtggtggga ggattgggga 780 cagctttcgg ggacggccgt gccgccccag ggtgccgagc cccagagcaa cgcgggccca 840 cgaccccata tcggggacac gttatttacc ctgtttcggg cccccgagtt gctggccccc 900 aacggcgacc tgtataacgt gtttgcctgg gccttggacg tcttggccaa acgcctccgt 960 cccatgcacg tctttatcct ggattacgac caatcgcccg ccggctgccg ggacgccctg 1020 ctgcaactta cctccgggat ggtccagacc cacgtcacca ccccaggctc cataccgacg 1080 atctgcgacc tggcgcgcac gtttgcccgg gagatggggg aggctaactg a 1131 <210> 11 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' primer <400> 11 taatacgact cactataggg atgccgatgt accaggta 38 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' primer <400> 12 tcacttaagg agcttgag 18 <210> 13 <211> 6 <212> DNA <213> Tetrahymena thermophila group I intron internal guide sequence <400> 13 ggaggg 6 <210> 14 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' primer <400> 14 atgtgctgca aggcgatt 18 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' primer <400> 15 gttatctggg cgcttgtcat 20 <210> 16 <211> 7 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> extended P1 helix and added P10 helix <400> 16 aucagua 7 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' primer <400> 17 cagtagcgtg ggcattttct 20

Claims

프로모터;
상기 프로모터와 작동 가능하게 연결된, AIMP2-DX2 전사체에 특이적으로 작용하는 트랜스-스플라이싱 리보자임을 코딩하는 리보자임 영역; 및
상기 리보자임 영역의 3'말단에 연결된 치료 유전자 또는 리포터 유전자를 5'-> 3'의 순서로 포함하는 벡터로서,
상기 AIMP2-DX2 전사체는 AIMP2 (Aminoacyl-tRNA synthetase Interacting Multifunctional Protein 2) 유전자의 엑손 2가 결손된 스플라이싱 변이체이고,
상기 리보자임은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 내부 가이드 서열(IGS)을 포함하는 것인 벡터.
제1항에 있어서, 상기 프로모터는 사이토메갈로바이러스(CMV) 또는 로우스 사르코마 바이러스(RSV) 프로모터인 벡터.
삭제
제1항에 있어서, 상기 벡터는 상기 프로모터와 상기 리보자임 영역 사이에, 안티센스를 코딩하는 안티센스 영역을 더 포함하고, 상기 안티센스는 AIMP2-DX2 전사체의 표적 우리딘의 다운스트림 영역에 존재하는 서열과 상보적인 서열을 갖는 것인 벡터.
제4항에 있어서, 상기 안티센스는 35 내지 200개의 뉴클레오타이드로 구성되는 것인 벡터.
제4항에 있어서, 상기 안티센스 영역은 서열번호 3으로 표시되는 염기서열을 갖는 것인 벡터.
제4항에 있어서, 상기 안티센스 영역과 상기 리보자임 영역 사이에, 5 내지 10 뉴클레오타이드로 구성된 링커 뉴클레오타이드를 더 포함하는 벡터.
제1항에 있어서, 상기 리보자임은, 상기 IGS의 인접한 업스트림 위치에, AIMP2-DX2 전사체 서열에 상보적인 2 내지 4 뉴클레오타이드를 더 포함하는 것인 벡터.
제8항에 있어서, 상기 리보자임은, 상기 IGS의 인접한 업스트림 위치에, 서열번호 4로 표시되는 염기서열을 더 포함하는 것인 벡터.
제1항에 있어서, 상기 리보자임은, 상기 IGS의 업스트림 위치에, 리보자임 내 스플라이싱 위치의 다운스트림과 상보적 결합할 수 있는 4 내지 7 뉴클레오타이드를 더 포함하는 것인 벡터.
제10항에 있어서, 상기 리보자임은, 상기 IGS의 업스트림 위치에, 서열번호 5로 표시되는 염기서열을 더 포함하는 것인 벡터.
제1항에 있어서, 상기 리보자임은, 상기 IGS의 업스트림 위치에, 서열번호 16으로 표시되는 염기서열을 더 포함하는 것인 벡터.
제1항에 있어서, 상기 리보자임 영역은 서열번호 6 또는 서열번호 7로 표시되는 염기서열을 갖는 것인 벡터.
제1항에 있어서, 상기 치료 유전자는 약제감수성유전자, 세포사멸 유전자, 세포증식 억제 유전자, 세포독성 유전자, 종양 억제인자 유전자, 항원성 유전자, 사이토카인 유전자 및 항신생 혈관 생성 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종인 벡터.
제1항에 있어서, 상기 치료 유전자는 HSVtk(Herpes simplex virus-thymidine kinase)를 암호화하는 유전자인 벡터.
제1항에 있어서, 상기 벡터는 서열번호 8 또는 서열번호 9로 표시되는 염기서열을 갖는 것인 벡터.
제1항에 있어서, 상기 벡터는 E1 및 E3 유전자가 제거된 아데노바이러스에 삽입되는 것인 벡터.
제1항에 있어서, 상기 리포터 유전자는 LacZ, 클로람페니콜 아세틸 전이효소(CAT: chloramphenicol acetyl transferase), 레닐라 루시퍼라제(Renila luciferase), 반딧불이(firefly) 루시퍼라아제, 적색형광단백질(RFP), 녹색형광단백질(GFP) 및 분비성 태반 알칼라인 포스파타아제(secreted placental alkaline phosphatase, SEAP)로 이루어진 군에서 선택된 1종인 벡터.
제1항, 제2항 및 제4항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 벡터를 유효성분으로 포함하는 폐암 치료용 약학적 조성물.
제19항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 흡입 제형인 조성물.
제1항, 제2항 및 제4항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 벡터를 유효성분으로 포함하는 폐암 진단용 조성물.