KR20150131655A

KR20150131655A - Aimp2-dx2-34s 단백질 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR20150131655A
Application number: KR1020140058634A
Authority: KR
Inventors: 김성훈; 김대규; 한병우; 박상호
Original assignee: 재단법인 의약바이오컨버젼스연구단
Priority date: 2014-05-15
Filing date: 2014-05-15
Publication date: 2015-11-25
Also published as: WO2015174641A1

Abstract

본 발명은 AIMP2-DX2-34S 단백질 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 좀 더 상세하게 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 AIMP2-DX2-34S 단백질, 상기 AIMP2-DX2-34S 단백질을 코딩하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환 미생물, 상기 형질전환 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 상기 AIMP2-DX2-34S 단백질 제조 방법, 상기 AIMP2-DX2-34S 단백질에 특이적인 항체 및 신약개발에 있어서 이들의 이용방법에 관한 것이다.
본 발명의 AIMP2-DX2-34S 단백질은 AIMP2-DX2와 동일한 활성을 가질뿐만 아니라, 정제된 단백질 사이의 응집(aggregation)일 일어나지 않고 높은 용해성을 가지기 대문에 단백질의 대량생산에 매우 효과적이다. 따라서 상기 대량생산 및 정제된 AIMP2-DX2-34S 단백질은, 구조에 근거한 신약개발 과정에 필요한 단계인 단백질 결정제작 및 X-ray 크리스탈로그라피에 의한 AIMP2-DX2-34S 단백질의 3차원 구조 결정에 있어 매우 유용하게 사용될 수 있으므로 산업상 이용 가능성이 있다.

Description

AIMP2-DX2-34S 단백질 및 이의 제조방법{AIMP2-DX2-34S protein and method for manufacturing the same}

본 발명은 AIMP2-DX2-34S 단백질 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 좀 더 상세하게 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 AIMP2-DX2-34S 단백질, 상기 AIMP2-DX2-34S 단백질을 코딩하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환 미생물, 상기 형질전환 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 상기 AIMP2-DX2-34S 단백질 제조 방법, 상기 AIMP2-DX2-34S 단백질에 특이적인 항체 및 신약개발에 있어서 이들의 이용 방법에 관한 것이다.

AIMP2(ARS-interacting multi-functional protein 2)는 아미노아실-tRNA 합성효소 복합체(Aminoacyl-tRNA synthetase: ARSs)의 형성에 관련된 단백질 중의 하나로, p38/JTV-1 또는 p38로 불려지기도 한다. AIMP2가 신규한 암 억제자(tumor suppressor)로 Smad2/3과 직접적 상호작용을 통하여 TGF-β의 신호전달을 강화시키는 기능을 함이 알려져있다.

본 발명자에 의한 등록특허 10-0762995 에는 암 세포주 및 조직에서 AIMP2의 엑손 2가 결손된 형태의 변이체인 AIMP2-DX2가 특이적으로 발현되는 것이 공지되어있다. 본 발명자는 AIMP2-DX2-형질전환된 세포에서는 TGF-β와 상관없이 AIMP2 수준이 극적으로 감소되는 것으로 AIMP2-DX2 생성이 AIMP2 활성의 상실을 초래하는 것을 확인하였으며, 실제로 세포 내로 AIMP2-DX2를 형질전환시킨 결과 c-myc 발현을 증가시키고 AIMP2의 핵 이동을 막고 세포 성장을 정지시키는 등의 TGF-β 신호의 이상-기능이 초래되었다. AIMP2-DX2는 AIMP2와 불활성형의 헤테로다이머를 형성하고, 이는 암 형성과 진행에 밀접하게 연관되어 있음을 입증하였다. 이러한 AIMP2-DX2의 생성은 폐암, 간암, 피부암, 유방암, 신장암, 골육종 등의 다양한 암에서 관측되었다.

또한 본 발명자의 기출원(출원번호 10-2008-0111109)에서는 AIMP2가 TRAF2를 매개로 하여 TNF-α의 세포사멸활성(apoptotic activity)을 매개하고, 이 활성은 AIMP2-DX2에 의해 조절된다는 것으로 처음으로 규명하였다. 아울러, AIMP2-DX2는 염증 마커인 Cox-2의 발현에도 영향을 미친다는 점을 규명하였다. 따라서 엑손 2가 결여된 AIMP2 변이체(AIMP2-DX2) 폴리펩티드의 억제제를 유효성분으로 포함하는 조성물이 염증성 질환의 예방 및 치료의 목적으로 사용될 수 있음이 공지되어있다.

상기한 바와 같이, AIMP2-DX2 단백질과 다양한 질환들(예를 들어, 다양한 종류의 암, 염증성 질환 등) 사이의 연관성이 밝혀짐에 따라, AIMP2-DX2가 신약개발의 새로운 표적물질로 제시되고 있다. 따라서 상기 AIMP2-DX2 단백질 3차 구조를 밝히면, 단백질구조기반 신약개발(protein structurebased drug design)의 출발점을 제공할 수 있을 것으로 기대를 모으고 있다.

그러나 AIMP2-DX2 단백질은 물에 대하여 낮은 용해도를 가지며, 통상적인 단백질 대량생산 방법으로 쓰이는 유전자 클로닝을 통한 단백질 정제 방법으로 AIMP2-DX2 단백질을 수득하고자 할때에 단백질들 간에 응집(aggregaion)현상이 일어나 단백질 3차 구조 연구를 위한 단백질 결정화(protein crystallization)가 어려웠다. 그 결과로 기질 혹은 반응산물이 결합된 단백질 3차 구조에 대한 정보가 없어서 단백질구조기반 신약개발 연구에 어려움이 있었다.

또한 최근 들어, NMR (Nuclear magnetic resonance spectroscopy)을 사용하여 신약을 개발하고자 하는 시도가 늘고 있으나 (P. J. Hajduk, J. Greer, Nat. Rev. Drug Discovery 6, 211 (2007)), 불용성 단백질의 경우에는 단백질의 수용성화가 선행되어야하므로 NMR을 사용한 분석이 용이하지 않아 신약 개발에 있어 어려움이 드러나고 있다. AIMP2-DX2 단백질의 경우에도 단백질의 수용성화가 선행되어야 NMR을 이용한 신약개발이 가능하나 AIMP2-DX2 단백질의 수용성화(solubilization)에 대한 연구에 대한 결과보고가 미미한 상황이다. AIMP2-DX2 단백질의 구조가 밝혀지면 그 구조를 바탕으로 신약 디자인을 효율적이고 신속하게 진행할 수 있으며, 따라서 상기 AIMP2-DX2 단백질을 이용한 제약 및 신약개발 분야에서 경쟁력을 선점할 수 있는 계기가 될 것이다.

이에 본 발명자는 AIMP2-DX2 활성 억제를 표적으로 하는 신약개발을 위한 가장 기초적인 단계로서 AIMP2-DX2 단백질을 대량으로 발현하고자 연구하던 중, 상기 단백질의 1 내지 33번째 아미노산 잔기가 제거된 형태의 AIMP2-DX2-34S 단백질이 응집(aggregation)되지 않고 높은 용해성을 보이며 AIMP2-DX2와 활성이 동일함을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 AIMP2-DX2-34S 단백질을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 AIMP2-DX2-34S 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합벡터로 형질전환된 형질전환 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 상기 AIMP2-DX2-34S 단백질 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 AIMP2-DX2-34S 단백질에 특이적인 항체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체를 포함하는 암 진단키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 (a) 분석할 시료를 제공하는 단계; 및 (b) 상기 시료를 상기 AIMP2-DX2-34S 단백질에 특이적인 항체와 접촉시키는 단계를 포함하는, AIMP2-DX2를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 AIMP2-DX2-34S 단백질의 mRNA에 특이적인 siRNA 핵산 분자를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 siRNA 핵산 분자를 포함하는, 암을 치료하기 위한 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 AIMP2-DX2-34S 단백질의 mRNA에 상보적인 서열을 갖는 안티센스 핵산 분자를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 안티센스 핵산 분자를 포함하는 암을 치료하기 위한 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 (a) 시험물질을 상기 AIMP2-DX2-34S 단백질을 코딩하는 유전자를 발현하는 세포와 접촉시키는 단계 및 (b) 시험물질에 의한 AIMP2-DX2-34S 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 억제 또는 AIMP2-DX2-34S 단백질의 분해 촉진을 측정하는 단계를 포함하여, AIMP2-DX2 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 억제 또는 AIMP2-DX2 단백질의 분해를 촉진 하는 항암제를 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 (a) 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산분자를 포함하는 발현 벡터를 제조하는 단계; (b) 상기 (a) 단계의 발현 벡터로 대장균을 형질전환 시키고 배양하는 단계; (c) 상기 (b) 단계에서 배양된 대장균을 파쇄하여 AIMP2-DX2-34S 단백질을 수득하는 단계를 포함하는, AIMP2-DX2-34S 단백질의 대량생산 방법을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 AIMP2-DX2-34S 단백질을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 AIMP2-DX2-34S 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 재조합벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는 상기 AIMP2-DX2-34S 단백질 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 AIMP2-DX2-34S 단백질에 특이적인 항체를 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 항체를 포함하는 암 진단키트를 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 분석할 시료를 제공하는 단계; 및 (b) 상기 시료를 상기 AIMP2-DX2-34S 단백질에 특이적인 항체와 접촉시키는 단계를 포함하는, AIMP2-DX2를 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 AIMP2-DX2-34S 단백질의 mRNA에 특이적인 siRNA 핵산 분자를 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 siRNA 핵산 분자를 포함하는, 암을 치료하기 위한 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 AIMP2-DX2-34S 단백질의 mRNA에 상보적인 서열을 갖는 안티센스 핵산 분자를 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 안티센스 핵산 분자를 포함하는 암을 치료하기 위한 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 시험물질을 상기 AIMP2-DX2-34S 단백질을 코딩하는 유전자를 발현하는 세포와 접촉시키는 단계 및 (b) 시험물질에 의한 AIMP2-DX2-34S 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 억제 또는 AIMP2-DX2-34S 단백질의 분해 촉진을 측정하는 단계를 포함하여, AIMP2-DX2 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 억제 또는 AIMP2-DX2 단백질의 분해를 촉진 하는 항암제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산분자를 포함하는 발현 벡터를 제조하는 단계; (b) 상기 (a) 단계의 발현 벡터로 대장균을 형질전환 시키고 배양하는 단계; (c) 상기 (b) 단계에서 배양된 대장균을 파쇄하여 AIMP2-DX2-34S 단백질을 수득하는 단계를 포함하는, AIMP2-DX2-34S 단백질의 대량생산 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 AIMP2-DX2-34S 단백질을 제공한다.

상기‘AIMP2-DX2-34S 단백질’은 서열번호 3으로 표시되는 AIMP2-DX2 단백질에서 1 내지 33번째 아미노산 잔기가 제거된 단백질로서 34번째 세린(serin, ser) 아미노산부터 시작되는 아미노산 서열을 가지며, 바람직하게 서열번호 1의 아미노산 서열을 가진다.

상기 AIMP2-DX2 단백질은 AIMP2 단백질 서열 중 엑손 2의 영역이 결실된 변이체를 의미하는 것으로, 본 발명자에 의한 대한민국등록특허 10-0762995에서 암과의 관련성이 보고되어, 다양한 암의 진단 및 치료에 이용될 수 있음이 공지되어있다. 또한 본 발명자의 기출원(출원번호 10-2008-0111109)에서는 AIMP2-DX2는 염증 마커인 Cox-2의 발현에도 영향을 미침이 규명되어, AIMP2-DX2와 염증성 질환과의 상관관계가 공지된 바 있다. 상기한 바와 같이, AIMP2-DX2 단백질과 다양한 질환들(예를 들어, 다양한 종류의 암, 염증성 질환 등) 사이의 연관성이 밝혀짐에 따라, AIMP2-DX2가 신약개발의 표적물질이 되고 있다.

이에, 본 발명의 AIMP2-DX2-34S 단백질은 상기 기존 AIMP2-DX2 단백질 대량생산시에 문제점을 해결하였다. 즉, AIMP2-DX2-34S 단백질은 AIMP2-DX2와 동일한 활성을 가질뿐만 아니라, 정제된 단백질 사이의 응집(aggregation)일 일어나지 않고 높은 용해성을 가지기 때문에 단백질의 대량생산에 매우 효과적이다. 따라서 상기 대량생산 및 정제된 AIMP2-DX2-34S 단백질은, 구조에 근거한 신약개발 과정에 필요한 단계인 단백질 결정제작 및 X-ray 크리스탈로그라피에 의한 AIMP2-DX2-34S 단백질의 3차원 구조 결정에 있어 매우 유용하게 사용될 수 있다.

이는 본 발명의 명세서 실시예에 잘 나타나있다.

본 발명의 실시예에서는 Human AIMP2-DX2 단백질의 과발현 및 높은 용해성 단백질을 얻기 위하여, pET-32a 벡터에 융합되어 있는 Thioredoxin(Trx)을 AIMP2-DX2 단백질에 융합시켜 AIMP2-DX2-Trx 융합 단백질(서열번호 5)을 클로닝하였다. 상기 재조합 단백질인 AIMP2-DX2-Trx를 대장균에 형질전환하고 균체 대량 배양 및 파쇄하여 여러 단계에 걸쳐 단백질을 정제하였다. 그리고 상기 단백질 정제를 통해 수득된 AIMP2-DX2-Trx에서 Thioredoxin을 제거하여 AIMP2-DX2를 새롭게 분리하였다. 상기 새롭게 분리된 AIMP2-DX2는, N-말단 아미노산 서열분석 결과 본래 AIMP2-DX2 단백질(서열번호 3)의 34번째 세린(Ser,S)부터 시작하는 새로운 재조합 단백질인 것을 확인하였고, 본 발명자는 이를 AIMP2-DX2-34S(서열번호 1)로 명명하였다. 상기 AIMP2-DX2-34S를 대장균에 형질전환하여 균체 대량 배양 및 파쇄하여 단백질을 정제하였다. 그 결과 4단계의 정제과정을 통해 순도 99% 이상의 재조합 AIMP2-DX2-34S 단백질을 대량생산하는 것이 가능했으며, 제조된 단백질 상호간에 응집되지 않았을 뿐만아니라 높은 용해성을 가짐을 확인하였다.

또한 본 발명의 AIMP2-DX2-34S 단백질은 공지의 검출방법에 사용되는 표지물질등을 추가로 부착할 수 있는데, 바람 직하게는 1개 내지 10개의 히스티딘(Histidine)으로 이루어진 펩타이드 단편 즉, His-태그를 사용할 수 있다. 가장 바람직하게 6개의 히스티딘으로 이루어진 펩타이드 단편이 부착되는 것일 수 있다.

상기에서 히스티딘 잔기는 재조합 단백질을 발현시킨 후 정제시 필요한 꼬리표(tag)로 가장 많이 이용되는 tag중 하나로, 특이성(specificity)이 높아야 하고 원하는 단백질의 구조에 영향을 최대한 적게 주어야 한다. 바람직하게는 Histidine이 1개 내지는 10개가 연속으로 오는 peptide로 구성될 수 있는데, size가 작고 원래의protein 구조에 영향도 별로 주지 않기 때문에 재조합 단백질을 만든 후 따로 잘라주지 않아도 된다는 편의성이있다. tag은 vector의 종류에 따라 target protein의 N-terminus(앞쪽), C-terminus(뒤쪽) 어느 쪽에도 만들 수 있고, 단백질의 구조의 영향을 주는 것에 따라 앞 또는 뒤쪽을 결정할 수 있다.

또한, 본 발명의 AIMP2-DX2-34S 단백질은 이의 천연형 아미노산 서열을 갖는 단백질뿐만 아니라 이의 아미노산 서열변이체가 또한 본 발명의 범위에 포함된다. AIMP2-DX2-34S 단백질의 변이체란 AIMP2-DX2-34S 천연 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 단백질을 의미한다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn,Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.

경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation) 등으로 수식(modification)될 수도 있다.

상기 AIMP2-DX2-34S 단백질 또는 이의 변이체는 천연에서 추출하거나 합성(Merrifleld, J. Amer. chem. Soc..85:2149-2156, 1963) 또는 DNA 서열을 기본으로 하는 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다(Sambrook et al, Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, USA, 2판, 1989). 유전자 재조합 기술을 이용할 경우, AIMP2-DX2-34S를 코딩하는 핵산을 적절한 발현 벡터에 삽입하고, 재조합 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체에서 AIMP2-DX2-34S가 발현되도록 숙주 세포를 배양한 뒤, 형질전환체로부터 AIMP2-DX2-34S를 회수하는 과정으로 수득할 수 있다.

따라서 본 발명은

(a) 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산분자를 포함하는 발현 벡터를 제조하는 단계;

(b) 상기 (a) 단계의 발현 벡터로 대장균을 형질전환 시키고 배양하는 단계;

(c) 상기 (b) 단계에서 배양된 대장균을 파쇄하여 AIMP2-DX2-34S 단백질을 수득하는 단계를 포함하는, AIMP2-DX2-34S 단백질의 대량생산 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 AIMP2-DX2-34S 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.

상술한 바와 같은 AIMP2-DX2-34S 단백질을 코딩하는 핵산 서열은, 이와 동등한 활성을 갖는 단백질을 코딩하는한, 하나 이상의 핵산 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있다. 상기한 서열번호 1의 AIMP2-DX2-34S 단백질은 바람직하게는 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산 분자에 의해 코딩된다. 이러한 핵산 분자의 서열은 단쇄 또는 이중쇄일 수 있으며, DNA 분자 또는 RNA(mRNA) 분자일 수 있다.

본 발명의 AIMP2-DX2-34S 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 천연에서 분리되거나 인위적으로 합성 또는 유전적 재조합방법을 통하여 제조할 수 있다. 본 발명의 AIMP2-DX2-34S 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 이를 발현할 수 있는 벡터에 작동적으로 연결시켜 AIMP2-DX2-34S 단백질을 제공할 수 있다.

본 발명은 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명에서 용어, “재조합 벡터”란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질 또는 목적 RNA을 발현할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다.

본 발명에서 용어, “작동가능하게 연결된(operably linked)"는 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 것을 말한다. 예를 들어 프로모터와 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결되어 코딩하는 핵산 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소등을 사용한다.

본 발명의 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적합한 발현벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커를 포함하고, 복제 가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함한다.

시그널 서열에는 숙주가 에쉐리키아속균인 경우에는 PhoA 시그널 서열, OmpA 시그널 서열 등이, 숙주가 바실러스속균인 경우에는 α-아밀라아제 시그널 서열, 서브틸리신 시그널 서열 등이, 숙주가 효모인 경우에는 MFα 시그널 서열, SUC2 시그널 서열 등이, 숙주가 동물세포인 경우에는 인슐린 시그널서열, α-인터페론 시그널 서열,항체 분자 시그널 서열 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 상기 재조합벡터로 형질전환된 형질전환 미생물을 제공한다.

형질전환은 핵산을 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주 세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 전기충격유전자전달법(electroporation), 원형질 융합, 인산 칼슘(CaPO₄) 침전, 염화 칼슘(CaCl₂) 침전, 실리콘 카바이드 섬유 이용한 교반, 아그로 박테리아 매개된 형질전환, PEG, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민, 열충격법 등이 포함되나 이로 제한되지 않는다.

숙주세포에 따라서 단백질의 발현량과 수식 등이 다르게 나타나므로, 당업자가 목적하는 바에 가장 적합한 숙주세포를 선택하여 사용할수 있으며 이에 제한되지 않으나, 예를들어 숙주세포로는 에스케리치아 콜라이(대장균, Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 또는 스타필로코쿠스(Staphylococcus)와 같은 원핵 숙주 세포일 수 있다. 또한, 진균(예를 들어, 아스페르길러스(Aspergillus)), 효모(예를 들어, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세르비지애(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마세스(Schizosaccharomyces), 뉴로스포라크라사(Neurospora crassa))등과 같은 하등 진핵 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 포유동물 등을 포함하는 고등 진핵생물 유래의 세포를 숙주세포로 사용할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 형질전환 미생물은 바람직하게 에스케리치아 콜라이(대장균, Escherichia coli)일 수 있다. 상기 본 발명의 에스케리치아 콜라이 균주로는 이에 제한되지 않으나, 예를 들어 Rosetta2(DE3)pLysS, BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL, C43(DE3) 등이 사용될수 있으며, 바람직하게 BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL일 수 있다.

본 발명은 상기 형질전환 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 상기 AIMP2-DX2-34S 단백질 제조 방법을 제공한다 (AIMP2-DX2-34S 단백질 제조 방법은 상기한 AIMP2-DX2-34S 단백질의 대량생산 방법과 설명을 같이 한다).

형질전환 미생물의 배양은 목적 단백질인 AIMP2-DX2-34S의 발현을 가능하게 하는 적절한 조건하에서 수행하며, 이러한 조건은 당업자에게 익히 공지된 방법에 따라 수행할 수 있다. 형질전환 미생물은 통상적인 배양방법에 의해 대량으로 배양할 수 있다. 배양배지로는 탄소원, 질소원, 비타민 및 미네랄로 구성된 배지를 사용할 수 있으며, 예를 들어, LB 배지(Luria-Bertani Broth)을 사용할 수 있다. 미생물의 배양은 통상의 미생물 배양 조건상에서 가능하며 예를 들어, 온도범위 15℃ 내지 45℃에서 10시간 내지 40시간 동안 배양할 수 있다. 배양액 중의 배양배지를 제거하고 농축된 균체만을 회수하기 위해 원심분리(centrifugation) 또는 여과 (filtration)과정을 거칠 수 있으며 이러한 단계는 당업자가 필요에 따라 수행할 수 있다. 농축된 균체는 통상적인 방법에 따라 냉동(frozen)하거나 또는 냉동건조(lyophilized)하여 그 활성을 잃지 않도록 보존할 수 있다.

구체적으로 상기 AIMP2-DX2-34S 단백질 제조 방법은

(a) AIMP2-DX2-34S 단백질을 코딩(coding)하는 재조합벡터로 형질전환된 형질전환 미생물을 배양하는 단계; 및

(b) 15℃ 내지 25℃ 온도 범위에서 상기 배양된 형질전환 미생물의 AIMP2-DX2-34S 단백질 발현을 유도하는 단계를 포함하는 AIMP2-DX2-34S 단백질 제조 방법일 수 있다.

상기 (a) 단계에서 형질전환 미생물의 배양은 형질전환 미생물의 종류에 따라 알맞은 생육 온도를 당업자가 선택할수 있다. 예를들어 상기 형질전환체가 대장균(E.coli)인 경우, 바람직하게 생육조건은 35℃ 내지 40℃일 수 있으며, 가장 바람직하게 37℃일 수 있다.

상기 (b) 단계에서 배양된 형질전환 미생물로부터 AIMP2-DX2-34S 단백질 발현을 유도하는 온도는, 바람직하게 15℃ 내지 25℃ 온도 범위일수 있고, 가장 바람직하게 18℃ 내지 22℃일 수 있다. (b) 단계와 같이, 특정 온도(특히 20℃)에서 AIMP2-DX2-34S 단백질 발현을 유도하면, 높은 용해성을 가지는 AIMP2-DX2-34S 단백질 발현량이 증가된다. 이는 본 발명의 명세서 실시예에 잘 나타나있다.

본 발명의 일실시예에서는 AIMP2-DX2-34S 단백질을 코딩하는 재조합 벡터로 형질전환된 Rosetta2(DE3)pLysS, BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL 및 C43(DE3) 의 서로 다른 대장균에 대하여, 각각 37℃ 및 20℃에서 단백질 발현을 유도한 후 상기 AIMP2-DX2-34S 단백질의 발현 및 용해성 정도를 전기영동을 통해 확인하였다. 그 결과 20℃에서 발현 유도된 AIMP2-DX2-34S 단백질이 37℃에서 발현 유도된 단백질보다 높은 용해성을 갖는 것을 확인하였다.

형질전환 미생물(또는 형질전환체)에서 발현시킨 단백질은 통상의 방식으로 정제될 수 있으며, 예를 들어, 염석(예를 들어 황산암모늄 침전, 인산나트륨 침전), 용매 침전(아세톤, 에탄올 등을 이용한 단백질 분획 침전), 투석, 겔 여과, 이온 교환, 역상 칼럼 크로마토그래피와 같은 칼럼 크로마토그래피 및 한외여과 등의 기법을 단독 또는 조합으로 적용시켜 본 발명의 AIMP2-DX2-34S 단백질을 정제할 수 있다(Maniatis et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.(1982); Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989); Deutscher, M., Guide to Protein Purification Methods Enzymology, vol. 182. Academic Press. Inc., San Diego, CA(1990)). 바람직하게 FPLC(Fast protein liquid chromatography) 및 흡착 크로마토 그래피, 분배 크로마토 그래피, 이온교환크로마토그래피, 크기배제 크로마토그래피 등을 포함하는 HPLC(high performance liquid chromatography) 의 여러 방법을 조합하여 본 발명의 AIMP2-DX2-34S 단백질을 정제할수 있다.

본 발명의 실시예에서는 단계적으로 FPLC , 이온교환크로마토그래피 및 크기배제 크로마토그래피를 조합하여 수행하는 방식으로, 형질전환된 균체 배양물의 파쇄물로부터 본 발명의 AIMP2-DX2-34S 단백질을 수득하였다.

본 발명은 상기 AIMP2-DX2-34S 단백질에 특이적인 항체를 제공한다.

발명에서 용어, “항체”란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, AIMP2-DX2-34S를 특이적으로 인지하는 항체를 의미한다.

바람직하게, 본 발명의‘AIMP2-DX2-34S 단백질에 특이적인 항체’는 AIMP2-DX2를 특이적으로 인지할 수 있음을 특징으로 한다. 즉, 상기‘AIMP2-DX2-34S 단백질에 특이적인 항체’는 궁극적으로 AIMP2와 구분하여 AIMP2-DX2를 특이적으로 인지하는 항체이다.

본 발명의 항체는 다클론 항체 및 단클론 항체를 모두 포함하며, 상기한 바와 같이 AIMP2-DX2-34S 단백질이 규명되었으므로 이를 이용하여 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다.

다클론 항체는 상기한 AIMP2-DX2-34S 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조 가능하다.

단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 융합 방법(fusion method)(Kohler 및 Milstein (1976) European Jounral of Immunology 6:511-519 참조), 재조합 DNA 방법(미국특허 제4,816,567호) 또는 파지 항체 라이브러리 (Clackson et al, Nature, 352, 624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol., 222, 58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조될 수 있다.

본 발명의 AIMP2-DX2-34S 단백질 검출에 사용되는 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등이 있다.

본 발명의 AIMP2-DX2-34S에 특이적인 항체는 AIMP2-DX2와 특이적으로 결합(binding)하여 암 진단에 사용될 뿐만 아니라, 환자에게 투여함으로써 AIMP2-DX2의 활성을 억제하여 암 치료에도 사용될 수 있다. 치료용 항체로 사용될 경우, 항체는 기존의 치료제와 직접 또는 링커 등을 통하여 간접적으로 커플링(예를 들어, 공유결합)시킬 수 있다.

항체와 결합될 수 있는 치료제에는 방사성핵종(radionuclide), 약제, 림포카인, 독소, 이형가능성 항체 등이 있으나 이로 제한되지는 않는다. 방사성핵종에는 131I, 90Y, 105Rh, 47Sc, 67Cu, 212Bi, 211At, 67Ga, 125I, 186Re, 188Re, 177Lu, 153Sm, 123I, 111In 등이 있다. 약제에는 메토트렉세이트(methotrexate), 아드리아마이신(adriamycin)등이 있고 림포카인에는 인터페론 등이 있다. 독소에는 리신, 아브린, 드프테리아 등이 있다. 그리고 다른 항체와 결합되어서 그 복합체가 암 세포와 효능 세포 (예를 들면, T 세포와 같은 K 세포(killer cell) 모두에 결합하는 항체인 이형기능성 항체(heterofunctional antibodies)가 있다.

항체는 그 자체 또는 항체를 포함하는 조성물로 투여될 수 있다. 치료용 조성물의 경우 투여 방식에 따라 허용 가능한 담체를 포함하여 적절한 제제로 제조된다. 투여 방식에 적합한 제제는 공지되어 있고, 전형적으로 막을 통과한 이동을 용이하게 하는 계면활성제를 포함한다. 이러한 계면활성제는 스테로이드에서 유도된 것이거나 N-[1-(2,3-디올레오일)프로필-N,N,N-트리메틸암모늄클로라이드(DOTMA) 등의 양이온성 지질, 또는 콜레스테롤 헤미숙시네이트, 포스파티딜 글리세롤 등의 각종 화합물 등이 있다.

본 발명의 항체를 포함하는 조성물은 암세포 또는 그들의 전이를 치료하기 위하여 약학적으로 효과적인 양으로 투여될 수 있다. 약학 조성물은 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 항체를 포함하는 조성물은 비경구, 피하, 복강 내, 폐 내, 및 비강 내, 및 국부적 면역억제치료를 위해 필요하다면 병변 내 투여를 포함하는 적합한 방법에 의해 투여된다. 비경구 주입에는 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하투여가 포함된다. 바람직한 투여방식 및 제제는 정맥 주사제, 피하 주사제, 피내 주사제, 근육 주사제, 점적 주사제 등이다. 제제의 pH는 항체 안정성(화학적 및 물리적 안정성)의 균형을 맞추고 투여되는 환자에게 적절하도록 하는데 일반적으로, pH 4 와 pH 8 범위이다. 그 외에도 경피 투여 및 경구 투여 등의 투여를 위한 다른 기술들을 적절하게 변형시켜 이용하여, 적당한 제제를 고안할 수 있다. 전형적인 투여량 수준은 표준 임상적 기술을 사용하여 최적화할 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 항체를 암호화하는 핵산의 형태로 투여되어 세포내에서 항체가 생성되도록 할 수 있다(WO96/07321).

본 발명은 상기 항체를 포함하는 암 진단키트를 제공한다.

본 발명의 암 진단 키트에는 AIMP2-DX2-34S 단백질을 특이적으로 인지하는 항체뿐만 아니라 면역학적 분석에 사용되는 당 분야에서 일반적으로 사용되는 도구, 시약 등이 포함된다. 이러한 도구/시약으로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 용해제, 세정제, 완충제, 안정화제 등이 포함하나 이로 제한되지 않는다. 표지 물질이 효소인 경우에는 효소 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다. 적합한 담체로는, 이에 한정되지는 않으나, 가용성 담체, 예를 들어 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS, 불용성 담체, 예를 들어 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로스 및 이들의 조합일 수 있다.

본 발명의 암 진단 키트는 이에 한정되는 것은 아니나 ELISA 플레이트, 딥-스틱 디바이스, 면역크로마토그래피 시험 스트립 및 방사 분할 면역검정 디바이스, 및 플로우-쓰로우(flow-through) 디바이스 등의 형태를 가질 수 있다.

본 발명의 암 진단 키트는 상기‘AIMP2-DX2-34S 단백질을 특이적으로 인지하는 항체’를 포함하고 있어, 암 진단 마커인 AIMP2-DX2를 검출 할 수 있다. 본 발명에서 용어, “암 진단 마커”란 암 조직 및 세포에서 발현되고 이의 발현 여부를 확인함으로써 암의 발병을 확인할 수 있는 물질, 바람직하게는 정상조직과 암 조직에서 유의한 차이를 보이는 단백질 또는 mRNA 등과 같은 유기 생체 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 암 진단 마커는 다양한 암 조직 및 세포에서만 특이적으로 발현되는 AIMP2-DX2이며, AIMP2-DX2의 발현을 mRNA 수준 또는/및 단백질의 수준에서 확인함으로써 암을 진단할 수 있다. 본 발명의 항체는 암, 보다 구체적으로 폐암, 간암, 유방암, 피부암, 신장암, 골육종암 등을 진단하는데 유용하게 사용할 수 있다.

본 발명은 (a) 분석할 시료를 제공하는 단계; 및 (b) 상기 시료를 상기AIMP2-DX2-34S 단백질에 특이적인 항체와 접촉시키는 단계를 포함하는, AIMP2-DX2를 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명에서 용어, “분석할 시료”란 암 발생에 의해 마커 단백질의 발현량의 차이가 검출될 수 있는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 정액, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 생물학적 시료를 의미하며 당 업계에서 널리 공지 된 방법으로 처리하여 준비된다.

AIMP2-DX2 단백질의 검출은, AIMP2-DX2-34S를 특이적으로 인지하는 항체를 시료에 접촉하여 이의 항원-항체 복합체 형성을 측정하여 수행된다. 전술한 바와 같이 본 발명의‘AIMP2-DX2-34S를 특이적으로 인지하는 항체’는 AIMP2-DX2 단백질과 특이적으로 결합하여 항원-항체 복합체를 형성한다.

본 발명에서 용어,“항원-항체 복합체”란 생물학적 시료 중의 AIMP2-DX2 단백질과 이를 특이적으로 인지하는 항체(본 발명의 AIMP2-DX2-34S를 특이적으로 인지하는 항체)의 결합물을 의미한다. 항원-항체 복합체 형성을 살펴보는 실험방법에는 조직면역 염색, 방사능면역분석법 (RIA), 효소면역분석법 (ELISA), 웨스턴 블랏팅(Western Blotting), 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 면역확산 분석법(Immunodiffusion assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS, 단백질 칩(protein chip)등이 있으며 이로 제한되지 않는다.

항원-항체 복합체의 형성을 정성 또는 정량적으로 측정가능하게 하는 라벨에는 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소등이 있으며, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다. 검출 라벨로 이용 가능한 효소에는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제, 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라제, 글루코즈 옥시다제, 헥소키나제와 GDPase, RNase, 글루코즈 옥시다제와 루시페라제, 포스포프럭토키나제, 포스포에놀피루베이트 카복실라제, 아스파르테이트 아미노트랜스페라제, 포스페놀피루베이트 데카복실라제, β-라타마제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 형광물에는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드, 플루오레스카민 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 리간드에는 바이오틴 유도체 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 발광물에는 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 미소입자에는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 레독스 분자에는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논, K₄ W(CN)⁸, [Os(bpy)3]²⁺, [RU(bpy)3]²⁺, [MO(CN)8]^4-등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 방사선동위원소에는 ³H,¹⁴C,³²P,³⁵S,³⁶Cl,⁵¹Cr,⁵⁷Co,⁵⁸Co,⁵⁹Fe,⁹⁰Y,¹²⁵I,¹³¹I,¹⁸⁶Re 등이 있으며 이로 제한되지 않는다.

본 발명은 상기 AIMP2-DX2-34S 단백질의 mRNA에 특이적인 siRNA 핵산 분자를 제공한다.

본 발명에서 용어, "siRNA”란 특정 mRNA의 절단(cleavage)을 통하여 RNAi(RNA interference) 현상을 유도할 수 있는 짧은 이중사슬 RNA를 의미한다. 표적유전자의 mRNA와 상동인 서열을 가지는 센스 RNA 가닥과 이와 상보적인 서열을 가지는 안티센스 RNA 가닥으로 구성된다. siRNA는 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉다운 방법으로서 또는, 유전자치료(gene therapy)의 방법으로 제공된다. siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포

함될 수 있다. 전체 길이는 10 내지 100 염기, 바람직하게는 15 내지 80 염기, 더욱 바람직하게는 20 내지 70 염기이다. siRNA 말단 구조는 표적유전자의 발현을 RNAi 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면 평활(blunt)말단 혹은 점착(cohesive) 말단 모두 가능하다. 점착 말단 구조는 3 말단 돌출한 구조와 5 말단 쪽이 돌출한 구조 모두 가능하다. 돌출하는 염기 수는 한정되지 않는다. 예를 들어, 염기 수로는 1 내지 8 염기 , 바람직하게는 2 내지 6 염기로 할 수 있다. 본 명세서에서 siRNA의 전장은, 중앙의 이중사슬 부분의 길이와 양 말단의 단일사슬 돌출을 구성하는 길이의 합으로 나타내었다. 또한, siRNA는 표적유전자의 발현억제 효과를 유지할 수 있는 범위에서 예를 들어, 한 쪽 말단의 돌출 부분에 저분자 RNA(예를 들어, tRNA, rRNA, 바이러스 RNA와 같은 천연의 RNA분자 또는 인공의 RNA분자)를 포함할 수 있다. siRNA 말단구조는 양측 모두 절단 구조를 가질 필요는 없고, 이중사슬 RNA의 일방의 말단 부위가 링커 RNA에 의하여 접속된 스템 루프형 구조일 수도 있다. 링커의 길이는 스템 부분의 쌍을 이루는 데 지장이 없는 길이면 특별히 한정되지 않는다.

본 발명에서 용어,“특이적” 또는 “특이적인”은 세포내에서 다른 유전자에 영향을 미치지 않고 목적 유전자만 억제하는 능력을 의미하고, 본 발명에서는 AIMP2-DX2-34S에 특이적이다. 본 발명의 siRNA는 AIMP2-DX2-34S 특이적으로 작동하도록 AIMP2-DX2-34S의 엑손 1과 엑손 3의 경계 지점에 해당하는 mRNA와 상동인 서열을 포함하는 센스 RNA 가닥과 이와 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 RNA 가닥을 가진다.

상기에서 “유전자 발현의 감소(Inhibition of gene expression)”란 목적 유전자에서 생성된 mRNA 및/또는 단백질의 수준이 제거 또는 감소된 것을 의미하고, 이는 mRNA의 절단(cleavage)을 통해 일어나는 RNA 간섭 (RNAi: RNA interference) 현상에 의한다. siRNA를 제조하는 방법은 시험관에서 siRNA를 직접 합성한 뒤, 형질전환(transfection) 과정을 거쳐 세포 안으로 도입시키는 방법과 siRNA가 세포 안에서 발현되도록 제조된 siRNA 발현 벡터 또는 PCR-derived siRNA 발현 카세트를 세포안으로 형질전환 또는 감염(infection) 시키는 방법이 있다. siRNA를 제조하고 세포 또는 동물로 도입하는 방법의 결정은 실험의 목적 및 표적 유전자 산물의 세포생물학적 기능에 따라 달라질 수 있다.

본 발명은 상기 AIMP2-DX2-34S 단백질의 mRNA에 상보적인 서열을 갖는 안티센스 핵산 분자를 제공한다.

본 발명에서 용어, "안티센스 핵산”이란 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체를 의미하고, mRNA내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 특징이 있다. 본 발명의 안티센스 서열은 AIMP2-DX2-34S mRNA에 상보적이고 AIMP2-DX2-34S mRNA에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미하고 AIMP2-DX2 mRNA의 번역, 세포질내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다. 안티센스 핵산의 길이는 6내지 100 염기이고, 바람직하게는 8내지 60 염기이고, 보다 바람직하게는 10 내 40 염기이다.

상기 안티센스 핵산은 효능을 증진시키기 위하여 하나 이상의 염기, 당 또는 골격(backbone)의 위치에서 변형될 수 있다(De Mesmaeker et al, Curr Opin Struct Biol., 5(3):343-55, 1995). 핵산 골격은 포스포로티오에이트, 포스포트리에스테르, 메틸 포스포네이트, 단쇄 알킬, 시클로알킬, 단쇄 헤테로아토믹, 헤테로시클릭 당간 결합 등으로 변형될 수 있다. 또한, 안티센스 핵산은 하나 이상의 치환된 당 모이어티(sugar moiety)를 포함할 수 있다. 안티센스 핵산은 변형된 염기를 포함할 수 있다. 변형된 염기에는 하이포크잔틴, 6-메틸아데닌, 5-me 피리미딘(특히 5-메틸시토신), 5-하이드록시메틸시토신(HMC), 글리코실 HMC, 젠토비오실 HMC, 2-아미노아데닌, 2-티오우라실, 2-티오티민, 5-브로모우라실, 5-하이드록시메틸우라실, 8-아자구아닌, 7-데아자구아닌, N6 (6-아미노헥실)아데닌, 2,6-디아미노퓨린 등이 있다. 또한 본 발명의 안티센스 핵산은 상기 안티센스 핵산의 활성 및 세포 흡착성을 향상시키는 하나 이상의 모이어티(moiety) 또는 컨쥬게이트(conjugate)와 화학적으로 결합될 수 있다. 콜레스테롤 모이어티, 콜레스테릴 모이어티, 콜릭산, 티오에테르, 티오콜레스테롤, 지방성 사슬, 인지질, 폴리아민, 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 아다맨탄 아세트산, 팔미틸 모이어티, 옥타데실아민, 헥실아미노-카르보닐-옥시콜에스테롤 모이어티 등의 지용성 모이어티 등이 있고 이에 제한되지는 않는다. 지용성 모이어티를 포함하는 올리고뉴클레오티드와 제조 방법은 본 발명의 기술 분야에서 이미 잘 알려져 있다(미국특허 제5,138,045호, 제5,218,105호 및 제5,459,255호). 상기 변형된 핵산은 뉴클레아제에 대한 안정성을 증가시키고 안티센스 핵산과 표적 mRNA와의 결합 친화력을 증가시킬 수 있다.

본 발명의 AIMP2-DX2-34S에 특이적인 안티센스 핵산은 AIMP2-DX2 mRNA의 엑손 1과 엑손 3이 연결되는 접합점 부위의 해당하는 서열에 상보적인 서열을 포함하는 것이 바람직하다.

안티센스 RNA의 경우 통상의 방법으로 시험관에서 합성되어 생체 내로 투여하거나 생체 내에서 안티센스 RNA가 합성되도록 할 수 있다. 시험관에서 안티센스 RNA를 합성하는 한 예는 RNA 폴리머라제Ⅰ를 이용하는 것이다. 생체 내에서 안티센스 RNA가 합성되도록 하는 한가지 예는 인식부위(MCS)의 기원이 반대 방향에 있는 벡터를 사용하여 안티센스 RNA가 전사되도록 하는 것이다. 이런 안티센스 RNA는 서열 내에 번역 중지 코돈이 존재하도록하여 펩타이드 서열로 번역되지 않도록 하는 것이 바람직하다.

본 발명은 상기 AIMP2-DX2-34S 단백질의 mRNA에 특이적인 siRNA 또는 안티센스 핵산을 포함하는 암을 치료하기 위한 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명자에 의한 등록특허 10-0762995에 의하면, AIMP2-DX2 특이적 siRNA를 처리할 경우, AIMP-DX2 발현유도에 의해 발생된 AIMP2의 기능적 붕괴가 복구되는 것을 AIMP2의 세포내 수준 증가, Smad2의 인산화가 유도되는 것을 통하여 확인할 수 있었다. 즉, AIMP2-DX2는 AIMP2의 기능을 붕괴하여 암을 유발하는 직접적인 원인으로 작용하는데 AIMP2-DX2의 mRNA에 특이적인 siRNA 또는 안티센스 핵산을 이용할 경우, 세포내 AIMP2의 세포내 수준이 증가되면서 기능이 복구되므로 암 세포 특이적인 암 치료에 유용하다.

본 발명의 AIMP2-DX2-34S 단백질의 mRNA에 특이적인 siRNA 또는 안티센스 핵산은 AIMP2-DX2에 결합 및 AIMP2-DX2의 활성을 억제하여, 세포내 AIMP2의 세포내 수준이 증가되면서 기능이 복구되게하는 효과가 있다.

따라서 본 발명의 AIMP2-DX2-34S 단백질의 mRNA에 특이적인 siRNA 또는 안티센스 핵산을 이용하여, AIMP2-DX2 발현 유도에 의해 발생한 모든 암을 치료할 수 있다. 이런 암은, 폐암, 간암, 유방암, 피부암, 신장암, 골육종암 등을 포함한다.

상기 AIMP2-DX2-34S 단백질의 mRNA에 특이적인 siRNA 또는 안티센스 핵산 1종 이상을 포함하는 약제학적 조성물은 환자의 암 세포의 증식을 저해시키는 추가의 물질을 포함할 수 있으며, 또한 siRNA 또는 안티센스 핵산 분자의 유입을 촉진시키는 제제 예를들어, 리포좀 (미국특허 제4,897,355호, 제4,394,448호, 제4,235,871호, 제4,231,877호, 제4,224,179호, 제4,753,788호, 제4,673,567호, 제4,247,411호, 제4,814,270)을 이용하거나 콜레스테롤, 콜레이트 및 데옥시콜산을 비롯한 다수의 스테롤류중 1종의 친유성 담체와 함께 배합할 수도 있다. 또한, 안티센스 핵산은 세포에 의해 흡수되는 펩티드에 접합시킬 수도 있다. 유용한 펩타이드의 예로는 펩타이드 호르몬, 항원 또는 항체 및 펩파이드 독소 등이 있다(Haralambid et al, WO 8903849; Lebleu et al, EP 0263740).

본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 투여될 수 있으며, 경구 투여시에는 결합제,활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소 투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릴시르, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물에 함유되는 AIMP2-DX2-34S 단백질의 mRNA에 특이적인 siRNA 또는 안티센스 핵산의 유효 투여량의 범위는 성별, 중증도, 연령, 투여 방법, 표적 세포, 발현 수준 등 다양한 요인에 따라 달라질 수 있으며, 당 분야의 전문가들에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물은 경구적으로 또는 정맥내, 피하, 비강내 또는 복강내 등에 비경구적으로 사람과 동물에게 투여된다. 비경구적 투여는 피하주사, 근육내 주사 및 정맥주사와 같은 주사법 및 점적법을 포함한다. 이외의 본 발명 약제학적 조성물은 각종 제형의 형태로 통용되는 기법에 따라 제조할 수 있다.

본 발명은

(a) 시험물질을 상기 AIMP2-DX2-34S 단백질을 코딩하는 유전자를 발현하는 세포와 접촉시키는 단계; 및

(b) 시험물질에 의한 AIMP2-DX2-34S 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 억제 또는 AIMP2-DX2-34S 단백질의 분해 촉진을 측정하는 단계를 포함하여, AIMP2-DX2 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 억제 또는 AIMP2-DX2 단백질의 분해를 촉진 하는 항암제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.

상기 (a) 단계에서‘AIMP2-DX2-34S 단백질을 코딩하는 유전자를 발현하는 세포’는 천연 상태에서 AIMP2-DX2-34S 단백질을 발현하는 세포 또는 AIMP2-DX2-34S 단백질이 발현되도록 유전자 조작된 세포일 수 있다. 상기 ‘유전자 조작’은 특정 세포에 외부 유전자(본 발명의 AIMP2-DX2-34S 발현 유전자)를 도입하는 것을 의미하며, 상기 유전자 조작 방법은 당업자에게 널리 알려져있으며 이에 제한되지 않으나, 예를 들어 형질전환일 수 있다.

상기 (b) 단계에서 AIMP2-DX2-34S 유전자의 발현은 mRNA 또는 단백질 수준에서 측정할 수 있다. AIMP2-DX2-34S mRNA 발현을 검출하고자 할 경우, 바람직하게는 AIMP2-DX2-34S 특이적인 프라이머를 사용하여 RT-PCR로 수행할 수 있다. AIMP2-DX2-34S 단백질 발현을 검출하고자 할 경우, 상기한 바와 같은 AIMP2-DX2-34S 특이적인 항체를 사용하는 다양한 면역 어세이 방법, 예들 들어 웨스턴 블랏으로 수행할 수 있다.

상기 (a) 내지 (b) 단계를 통해 스크리닝된 시험물질은 AIMP2-DX2-34S의 유전자 발현 억제 또는 AIMP2-DX2-34S 단백질의 분해 촉진 효과가 있을 뿐만아니라, AIMP2-DX2에도 동일한 효과를 나타낸다. 즉, (a) 내지 (b) 단계를 통해 스크리닝된 시험물질은 AIMP2-DX2의 유전자 발현 억제 또는 AIMP2-DX2 단백질의 분해 촉진 효과가 있다.

상기 (a) 내지 (b) 단계의 수행만으로 시험물질이 AIMP2-DX2의 유전자 발현 억제 또는 AIMP2-DX2 단백질의 분해 촉진 효과가 있는지에 관하여 확신하기 어려운 경우에 한하여, 상기 (b) 단계에서 선정된 후보 시험물질을 AIMP2-DX2 단백질을 코딩하는 유전자를 발현하는 세포와 접촉시켜 AIMP2-DX2의 활성을 확인하는 단계를 추가적으로 수행할 수 있다. 상기 ‘AIMP2-DX2 단백질을 코딩하는 유전자를 발현하는 세포’는 바람직하게 암 세포일 수 있다.

즉, 상기 항암제의 스크리닝 방법은 구체적으로

(a) 시험물질을 상기 AIMP2-DX2-34S 단백질을 코딩하는 유전자를 발현하는 세포와 접촉시키는 단계;

(b) 시험물질에 의한 AIMP2-DX2-34S 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 억제 또는 AIMP2-DX2-34S 단백질의 분해 촉진을 측정하여 후보 시험 물질을 선정하는 단계; 및

(c) 상기 (b) 단계에서 선정된 후보 시험물질을 AIMP2-DX2 단백질을 코딩하는 유전자를 발현하는 세포와 접촉시켜 AIMP2-DX2의 활성을 확인하는 단계를 포함하는, AIMP2-DX2 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 억제 또는 AIMP2-DX2 단백질의 분해를 촉진 하는 항암제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.

상기 (c) 단계에서‘AIMP2-DX2의 활성을 확인’한다는 것은 상기 (c) 단계의 후보 시험물질에 의한 AIMP2-DX2 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 억제 또는 AIMP2-DX2 단백질의 분해 촉진을 측정하는 것을 의미하며, 상기 측정 방법에 관하여는 전술한 바와 같다.

본 발명의 AIMP2-DX2-34S 단백질은 AIMP2-DX2와 동일한 활성을 가질뿐만 아니라, 정제된 단백질 사이의 응집(aggregation)일 일어나지 않고 높은 용해성을 가지기 때문에 단백질의 대량생산에 매우 효과적이다. 따라서 상기 대량생산 및 정제된 AIMP2-DX2-34S 단백질은, 구조에 근거한 신약개발 과정에 필요한 단계인 단백질 결정제작 및 X-ray 크리스탈로그라피에 의한 AIMP2-DX2-34S 단백질의 3차원 구조 결정에 있어 매우 유용하게 사용될 수 있으므로 산업상 이용 가능성이 있다.

도 1은 형질전환된 균체 파쇄물로 부터 얻어진 상층액으로부터, FPLC(Fast protein liquid chromatography)를 이용한 AIMP2-DX2-Trx 단백질의 1차 정제 결과를 크로마토그램(chromatogram)으로 나타낸것이다. 상기 크로마토그램 왼쪽 하단에 삽입된 이미지는, 1차 정제를 통해 분리된 재조합 단백질 각각의 fraction(크로마토그램 가로축에 붉은 색으로 각각의 fraction에 대한 numbering이 되어있음)에 대한 전기영동을 수행한 결과를 나타낸다(LT: loading through, I+: IPTG-induced E.coli sample을 나타내며 이하의 도면에서 모두 동일함).
도 2는 상기 1차 분리된 재조합 단백질을 2차 정제하기 위한 과정 중에, 이온교환 크로마토그래피 로딩용액으로 교체하였을 시에 나타나는 크로마토그램을 보여준다.
도 3은 상기 1차 분리된 재조합 단백질(특히 도 2의 크로마토그램에서 나타나는 2 내지 5 및 7 내지 10 fraction)로부터, 이온교환 크로마토그래피를 이용한 AIMP2-DX2-Trx 단백질의 2차 정제 결과를 크로마토그램으로 나타낸 것이다. 상기 크로마토그램 왼쪽 하단에 삽입된 이미지는 2차 정제를 통해 분리된 재조합 단백질 각각의 fraction(크로마토그램 가로축에 붉은 색으로 각각의 fraction에 대한 numbering이 되어있음)에 대한 전기영동을 수행한 결과를 나타낸다(I+: IPTG-induced E.coli sample).
도 4는 상기 2차 분리된 재조합 단백질로(특히 도 3의 크로마토그램에서 나타나는 12 내지 16 fraction)부터, 크기배제 크로마토그래피를 이용한 AIMP2-DX2-Trx 단백질의 3차 정제 결과를 크로마토그램으로 나타낸 것이다. 상기 크로마토그램 왼쪽 하단에 삽입된 이미지는 3차 정제를 통해 분리된 재조합 단백질 각각의 fraction(크로마토그램 가로축에 붉은 색으로 각각의 fraction에 대한 numbering이 되어있음)에 대한 전기영동을 수행한 결과를 나타낸다.
도 5는 상기 3차 분리된 재조합 단백질(특히 도 4의 크로마토그램에서 나타나는 25 내지 32 fraction)로부터, 이온교환 크로마토그래피를 이용한 AIMP2-DX2-Trx 단백질의 4차 정제 결과를 크로마토그램으로 나타낸 것이다. 상기 크로마토그램 왼쪽 하단에 삽입된 이미지는 4차 정제를 통해 분리된 재조합 단백질 각각의 fraction(크로마토그램 가로축에 붉은 색으로 각각의 fraction에 대한 numbering이 되어있음)에 대한 전기영동을 수행한 결과를 나타낸다.
도 6은 상기 4차 분리된 재조합 단백질(특히 도 5의 크로마토그램에서 나타나는 8 내지 11 fraction)로부터, 크기배제 크로마토그래피를 이용한 AIMP2-DX2-Trx 단백질의 5차 정제 결과를 크로마토그램으로 나타낸 것이다. 상기 크로마토그램 왼쪽 하단에 삽입된 이미지는 5차 정제를 통해 분리된 재조합 단백질 각각의 fraction(크로마토그램 가로축에 붉은 색으로 각각의 fraction에 대한 numbering이 되어있음)에 대한 전기영동을 수행한 결과를 나타낸다.
도 7은 상기 5차 분리된 재조합 단백질에 트롬빈을 처리한 후, FPLC를 이용하여 AIMP2-DX2 단백질을 1차로 정제한 결과를 크로마토그램으로 나타낸 것이다. 상기 크로마토그램 오른쪽 상단에 삽입된 이미지는 1차 정제를 통해 분리된 단백질 각각의 fraction(크로마토그램 가로축에 붉은 색으로 각각의 fraction에 대한 numbering이 되어있음)에 대한 전기영동을 수행한 결과를 나타낸다.
도 8은 상기 1차 분리된 단백질(특히, 도 7 의 크로마토그램에서 나타나는 5 fraction)로부터, 크기배제 크로마토그래피를 이용한 AIMP2-DX2 단백질의 2차 정제 결과를 크로마토그램으로 나타낸 것이다. 상기 크로마토그램 왼쪽 하단에 삽입된 이미지는 2차 정제를 통해 분리된 단백질 각각의 fraction(크로마토그램 가로축에 붉은 색으로 각각의 fraction에 대한 numbering이 되어있음)에 대한 전기영동을 수행한 결과를 나타낸다.
도 9는 상기 2차 분리된 AIMP2-DX2 단백질에 대하여 전기영동을 수행한 결과를 나타낸것이다(도 8의 전기영동결과와 동일, ?: 본 발명에서 새롭게 수득된 2차 분리된 AIMP2-DX2 단백질을 의미하는 것으로 AIMP2-DX2-34S로 판정됨).
도 10은 AIMP2-DX2-34S 단백질 클로닝 벡터에서 유전자 삽입부위를 나타낸 모식도이다.
도 11은 AIMP2-DX2-34S 단백질이 형질전환된 Rosetta2(DE3)pLysS, BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL 및 C43(DE3) 의 서로 다른 대장균에 대하여, 각각 37℃ 및 20℃에서 단백질 발현을 유도한 후 상기 AIMP2-DX2-34S 단백질의 발현 및 용해성정도를 전기영동을 통해 확인한 결과이다.
도 12는 AIMP2-DX2-34S 단백질이 형질전환된 균체 파쇄물로 부터 얻어진 상층액으로부터, FPLC를 이용한 AIMP2-DX2-34S 단백질의 1차 정제 결과를 크로마토그램으로 나타낸 것이다. 상기 크로마토그램 왼쪽 하단에 삽입된 이미지는 1차 정제를 통해 분리된 재조합 단백질 각각의 fraction(크로마토그램 가로축에 붉은 색으로 각각의 fraction에 대한 numbering이 되어있음)에 대한 전기영동을 수행한 결과를 나타낸다.
도 13은 상기 1차 분리된 재조합 단백질(도 12 참조)로부터, 크기배제 크로마토그래피를 이용한 AIMP2-DX2-34S 단백질의 2차 정제 결과를 크로마토그램으로 나타낸 것이다. 상기 크로마토그램 왼쪽에 삽입된 이미지는 2차 정제를 통해 분리된 재조합 단백질 각각의 peak 분획들에 대한(각각의 peak에 1,2,3으로 표시)에 대한 전기영동을 수행한 결과를 나타낸다.
도 14는 상기 2차 분리된 재조합 단백질(도 13 참조)로부터, 이온교환 크로마토그래피를 이용한 AIMP2-DX2-34S 단백질의 3차 정제 결과를 크로마토그램으로 나타낸 것이다. 상기 크로마토그램 왼쪽 하단에 삽입된 이미지는 3차 정제를 통해 분리된 재조합 단백질 각각의 peak 분획들에 대한(각각의 peak에 1,2,3으로 표시)에 대한 전기영동을 수행한 결과를 나타낸다.
도 15는 상기 3차 분리된 재조합 단백질(도 14 참조)로부터, 크기배제 크로마토그래피를 이용한 AIMP2-DX2-34S 단백질의 4차 정제 결과를 크로마토그램으로 나타낸 것이다. 상기 크로마토그램 왼쪽에 삽입된 이미지는 4차 정제를 통해 분리된 재조합 단백질 각각의 peak 분획들에 대한(각각의 peak에 1,2,3으로 표시하며, 크로마토그램 가로축에 붉은 색으로 각각의 fraction에 대한 numbering이 되어있음)에 대한 전기영동을 수행한 결과를 나타낸다(M: Thermo SCIENTIFIC 단백질 ladder).
도 16는 p53 단백질과 AIMP2-DX2 full 또는 AIMP2-DX2-34S 단백질 사이의 상호작용(결합)을 co-IP 방법으로 분석한 결과를 나타낸다 (IP: 면역침전, 항-streptavidin 항체 이용, WCL: 전체 세포 용해물, Mock: 플라스미드 없이 세포를 transfection reagent로 처리한 군, +WT: Strep-AIMP2-DX2 full 발현 플라스미드 도입, + 34S: Strep-AIMP2-DX2-34S 발현 플라스미드 도입).
도 17은 p53 단백질과 AIMP2-DX2 full 또는 AIMP2-DX2-34S 단백질 사이의 상호작용(결합)을 GST Pull-down assay 방법으로 분석한 결과를 나타낸다(input: cell lysate 중 5%를 input으로 사용, EV: GST 단백질(GST-EV)과 배양된 실험군, p53: GST 표지된 p53 단백질과 배양된 실험군, strep: 항-streptavidin 항체 이용).
도 18은 AIMP2-DX2 full 또는 AIMP2-DX2-34S를 과발현시킨 각각의 293T 세포에서, 48시간 후의 세포 증식률을 나타낸다(EV: empty vector).

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

재조합 AIMP2-DX2 단백질 생산

<1-1> AIMP2-DX2-Thioredoxin 융합 단백질 제작

본 발명자들은 Human AIMP2-DX2 단백질의 과발현 및 높은 용해성 단백질을 얻기 위하여 pET-32a 벡터(Novagen)를 이용하여 재조합 단백질을 제작하였다. pET-32a 벡터에 융합되어 있는 109 아미노산을 가진 Thioredoxin(Trx)을 BamHI과 XhoI의 두 제한효소 부위를 이용하여 AIMP2-DX2 단백질에 융합시켜 높은 발현과 용해성을 가진 재조합 단백질(AIMP2-DX2-Trx, 서열번호 5 및 서열번호 6 참조)을 클로닝 하였다.

<1-2> 재조합 AIMP2-DX2-Trx 단백질을 포함한 대장균 배양 및 단백질 과발현

재조합 단백질인 AIMP2-DX2-Trx를 대장균 Rosetta2(DE3)pLysS (Novagen)에 열충격 방법으로 형질전환하여 엠피실린(+50 mg/L)이 포함된 LB배지에서 배양하여 저항성을 가진 콜로니를 선별하였다. 선별된 콜로니를 이용하여 대량배양을 위한 종균 배양을 엠피실린(+50 mg/L)이 포함된 LB액체배지에 접종하여 37℃에서 16시간 진행하였다. 종균 배양액의 일부를 엠피실린이 포함된 본 배양 LB배지(2%)에 접종하여 37℃에서 OD₆₀₀가 0.5가 되었을 때, 20℃로 온도를 낮추어 20분정도 배양을 진행한 후에 0.5 mM IPTG (Isopropyl-beta-D-thiogalactoside)에 의해 재조합 단백질의 발현을 유도(induction) 하였다. 발현이 유도된 본 배양은 20℃에서 OD₆₀₀가 변함이 없을 때까지 (16시간정도) 배양된 후, 4℃에서 6000g로 10분간 원심분리를 하여 균체 침전물을 회수하였다.

<1-3> 재조합 AIMP2-DX2-Trx 단백질의 정제

회수된 균체 침전물을 파쇄 용액[35mM Imidazole, 500mM NaCl, 20mM Tris-HCl(pH7.5) / 균체 1g당 파쇄용액 10 mL]에 현탁하고, 100mM PMSF(Phenylmethylsulfonyl Fluoride / 균체 1g당 100mM PMSF 100 uL)를 첨가한 다음 초음파 파쇄기(SONICS)를 이용하여 파쇄하였다. 파쇄 후에 4℃에서 18000 rpm으로 50분간 원심분리 한 후에 상층액을 분리하여, 0.45um nitrocellulose membrane filter(MILLPORE)를 사용하여 상층액을 여과하였다.

-AIMP2-DX2-Trx의 1차 정제: 상기 여과된 상층액을 Pump P-1(GE Healthcare)을 사용하여 니켈이 충진이 된 HiTrap Chelating HP(GE Healthcare) 컬럼에 로딩하였다. binding buffer는 20mM Tris-HCl(pH7.5), 500mM NaCl, 35mM Imidazole로 구성된 용액을 사용하였다. 로딩을 한 컬럼을 FPLC(GE Healthcare)에 연결하고 3% 용리용액[1M Imidazole, 500mM NaCl, 20mM Tris-HCl(pH7.5)]을 4ml/min 속도로 처리하여 대장균의 단백질을 제거하고, 50% 기울기 용리방법(15분동안)으로 재조합 단백질을 순도 80% 이상으로 분리 정제하였다(도 1 참조).

-AIMP2-DX2-Trx의 2차 정제: 1차 분리된 재조합 단백질을 HiPrep 26/10 Desalting(GE Healthcare) 컬럼을 이용하여 이온교환 크로마토그래피의 로딩용액[50mM NaCl, 5% Glycerol, 5mM Dithiothreitol, 20mM Tris-HCl(pH8.5)]으로 교체하고(도 2 참조), HiTrap Q HP(GE Healthcare) 컬럼에 로딩하였다. binding buffer는 20mM Tris-HCl(pH8.5), 10% Glycerol, 5mM Dithiothreitol 50mM NaCl로 구성된 용액을 사용하였다. 재조합 단백질을 2차적으로 분리하기 위하여 용리용액[1M NaCl, 10% Glycerol, 5mM Dithiothreitol, 20mM Tris-HCl(pH8.5)]을 이용하여 100% 기울기 용리방법(4ml/min의 속도로 15min동안)을 사용하였다(도 3 참조). 2차 정제로 재조합 단백질을 순도 90% 이상으로 분리 정제하였다.

-AIMP2-DX2-Trx의 3차 정제: 2차 분리된 재조합 단백질을 크기배제 크로마토그래피[HiLoad16/600 Superdex200(GE Healthcare), 150mM NaCl, 5% Glycerol, 5mM Dithiothereitol, 20mM Tris-HCl(pH7.5)]를 이용하여 단백질을 순도 95% 이상으로 분리 정제를 실시하였다(도 4 참조).

-AIMP2-DX2-Trx의 4차 정제: 상기 3차 정제에서 얻어진 재조합 단백질을 보다 더 순도 높게 분리 정제하기 위하여 2차 분리 정제에 사용하였던 이온교환 크로마토그래피를 한번 더 이용하여 50% 기울기 용리방법(4ml/min의 속도로 20분 동안)을 실시하였다(도 5 참조). 이때 binding buffer 및 elution buffer(용리 용액)은 상기 2차 분리 정제에서 사용된 것과 동일하다.

-AIMP2-DX2-Trx의 5차 정제: 상기 4차 정제에서 얻어진 재조합 단백질의 저장용액[150mM NaCl, 5% Glycerol, 5mM Dithiothereitol, 20mM Tris-HCl(pH7.5)]을 위해 HiLoad16/600 Superdex200(GE Healthcare)을 사용하여 크기배제 크로마토그래피를 진행하였다. 5차 정제로 AIMP2-DX2-Trx 단백질을 순도 99% 이상으로 분리 정제에 성공하였다.

각 단계별 정제과정에서 전기영동을 통해 단백질의 순도를 확인 하였다. 구체적으로 각 단계별 정제과정에서 단백질 샘플을 10㎕를 5X SDS (10% w/v SDS, 10mM beta-mercaptoethanol, 25% Glycerol, 0.2M Tris-HCl pH 6.8, 0.05% w/v Bromophenolblue)와 1:4로 비율로 섞어 100℃에서 5분간 끓였다. 끓인 시료를 12% SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)에 로딩하고 100V에서 10분, 200V에서 40분 동안 전개한 다음, 쿠마시 염색 방법으로 염색한 후 탈색하여 단백질의 순도를 확인 하였다(이하의 실시예에서 전기영동을 통한 단백질 순도 확인 방법은 동일하다).

<1-4> 재조합 AIMP2-DX2-Trx 단백질의 Thioredoxin 제거

재조합 AIMP2-DX2 단백질만 얻기 위하여 AIMP2-DX2 단백질과 Thioredoxin 사이의 트롬빈 절단 부위를 이용하여 AIMP2-DX2 단백질만 분리하였다. 트롬빈 처리 반응은 Thrombin Kits(Novagen)을 이용하여 실온에서 2시간 진행하였다. 반응조건은 1.75ml의 10X 트롬빈 절단 용액, 1.5ml의 재조합 AIMP2-DX2-Trx 단백질(3.75mg), 350ul의 200배 희석된 트롬빈과 14ml의 증류수를 혼합하여 실험을 진행하였다.

-1차 정제: 2시간 반응직후에 반응 혼합액을 니켈이 충진이 된 HiTrap Chelating HP(GE Healthcare) 컬럼에 로딩하였다. binding buffer는 20mM Tris-HCl(pH7.5), 500mM NaCl, 35mM Imidazole로 구성된다. 로딩을 한 컬럼을 FPLC(GE Healthcare)에 연결하고 용리용액[1M Imidazole, 500mM NaCl, 20mM Tris-HCl(pH7.5)]을 이용하여 50% 기울기 용리방법(4ml/min 속도로 15min 동안)으로 AIMP2-DX2 단백질과 Thioredoxin을 분리하였다(도 7 참조).

-2차 정제: Thioredoxin이 제거된 AIMP2-DX2 단백질은 니켈 충진이 된 HiTrap Chelating HP 컬럼에 친화력이 없기 때문에 컬럼 로딩 후에 용리용액을 사용하기 전에 분리가 되었고, 분리가 된 AIMP2-DX2 단백질을 고순도 및 저장용액[150mM NaCl, 5% Glycerol, 5mM Dithiothereitol, 20mM Tris-HCl(pH7.5)]을 위해 크기배제 크로마토그래피[HiLoad16/600 Superdex200(GE Healthcare)]를 진행하였다(도 8 참조).

각 단계별 정제과정에서 전기영동을 통해 단백질의 순도를 확인 하였다.

<1-5> N 말단 아미노산 서열 분석

재조합 AIMP2-DX2-Trx 단백질에서 Thioredoxin을 제거한 결과, AIMP2-DX2 단백질의 분자량 보다 작은 분자량을 띄는 것을 전기영동을 수행한 결과 알게 되었고(도 9 참조), 정확한 단백질의 절단 위치를 파악하기 위하여 단백질 시료를 전기영동을 거쳐 PVDF(Polyvinylidene fluoride)막에 고정시켜 ㈜한국질량분석기술에 N 말단 아미노산 서열 분석을 의뢰하였다. N 말단 아미노산 서열 분석은 에드먼 분해법을 이용하여 N 말단의 5개 아미노산 서열분석이 시행되었다. 분석결과 N말단 서열은 S-Y-G-P-A 로 분석되었으며, 이로서 AIMP2-DX2 단백질의 34번째 세린 아미노산부터 시작하는 것을 발견하였다.

<실시예 2>

재조합 AIMP2-DX2-34S 단백질 생산

<2-1> 새로운 재조합 단백질 제작

N 말단 아미노산 서열 분석을 통해 AIMP2-DX2 단백질의 안정한 형태를 발견 하였고, 이를 바탕으로 34번째 세린(Ser,S)부터 시작하는 새로운 재조합 단백질 AIMP2-DX2-34S를 제작하였다. 새로운 재조합 단백질은 pET-28a 벡터(Novagen)의 NcoI과 XhoI의 제한효소 부위를 이용하여 C말단에 His-Tag을 갖도록 클로닝을 진행하였다(도 10 참조).

<2-2> 재조합 AIMP2 - DX2 -34S 단백질을 포함한 대장균 배양 및 단백질 과발현

재조합 단백질인 AIMP2-DX2-34S를 대장균 Rosetta2(DE3)pLysS(Novagen), BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL(Stratagene), C43(DE3)(Lucigen)에 열충격 방법으로 형질전환하여 카나마이신(+30 mg/L)이 포함된 LB배지에서 배양하여 카나마이신 저항성을 가진 콜로니를 선별하였다. 선별된 콜로니를 이용하여 카나마이신(+30 mg/L)이 포함된 LB액체배지에 접종하여 37℃에서 16시간 배양하였다. 서로 다른 대장균에서 재조합 단백질의 발현 및 용해성 정도를 파악하기 위해서 소량 배양(5mL)을 진행하였다. 종균 배양액의 일부를 카나마이신이 포함된 LB배지(2%)에 접종하여 37℃에서 OD₆₀₀가 0.5가 되었을 때, 0.5 mM IPTG(Isopropyl-beta-D-thiogalactoside)에 의해 재조합 단백질의 발현을 유도(induction) 하였다. 발현이 유도된 본 배양은 37℃에서 4시간 배양된 후 발현 및 용해성 실험을 진행하였다. 균체 침전물은 B-PER(Thermo SCIENTIFIC) 단백질 추출 시약을 사용하여 균체를 파쇄하였고, 발현 및 용해성 정도는 전기영동을 통해 확인 하였다. 재조합 단백질 AIMP2-DX2-34S는 대장균 BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL(Stratagene)에서 가장 많이 발현 및 용해성을 띄는 것을 확인하였고, 이를 바탕으로 용해성을 높이기 위해서 재조합 단백질의 발현 유도를 20℃에서 16시간 진행하였다. 결과적으로 20℃에서 발현이 유도된 AIMP2-DX2-34S 단백질은 비용해성에 비해 45%정도까지 수용성을 가졌다(도 11 참조).

<2-3> 재조합 AIMP2-DX2-34S 단백질의 정제

재조합 AIMP2-DX2-34S 단백질의 대량 생산을 위해 종균 배양액의 일부를 카나마이신이 포함된 본 배양 LB배지(2%)에 접종하여 37℃에서 OD₆₀₀가 0.5가 되었을 때, 20℃로 온도를 낮추어 20분정도 배양을 진행한 후에 0.5 mM IPTG(Isopropyl-beta-D-thiogalactoside)에 의해 재조합 단백질의 발현을 유도(induction) 하였다. 발현이 유도된 본 배양은 20℃에서 OD₆₀₀가 변함이 없을 때까지 (16시간정도) 배양된 후, 4℃에서 6000g로 10분간 원심분리를 하여 균체 침전물을 회수하였다. 회수된 균체 침전물을 파쇄 용액[35mM Imidazole, 500mM NaCl, 20mM Tris-HCl(pH7.5) / 균체 1g당 파쇄용액 10 mL]에 현탁하고, 100mM PMSF(Phenylmethylsulfonyl Fluoride / 균체 1g당 100mM PMSF 100 uL) 및 Protease inhibitor cocktail(Calbiochem / 균체 20g당 100uL)를 첨가한 다음 초음파 파쇄기(SONICS)를 이용하여 파쇄하였다. 파쇄 후에 4℃에서 18000 rpm으로 50분간 원심분리 한 후에 상층액을 분리하여, 0.45um nitrocellulose membrane filter(MILLPORE)를 사용하여 상층액을 여과하였다.

-AIMP2-DX2-34S 1차 정제: 상기 여과된 상층액에 Pump P-1(GE Healthcare)을 사용하여 니켈이 충진이 된 HiTrap Chelating HP(GE Healthcare) 컬럼에 로딩하였다. binding buffer는 35mM Imidazole, 500mM NaCl, 20mM Tris-HCl(pH7.5)로 구성되었다. 상기 로딩을 한 컬럼을 FPLC(GE Healthcare)에 연결하고 5% 용리용액[1M Imidazole, 500mM NaCl, 20mM Tris-HCl(pH7.5)]을 4ml/min 으로 처리하여 대장균의 단백질을 제거하고, 40% 기울기 용리방법(20min 동안)으로 재조합 단백질을 분리 정제하였다(도 12 참조).

-AIMP2-DX2-34S 2차 정제: 1차 분리된 재조합 단백질을 크기배제 크로마토그래피[HiLoad16/600 Superdex75 (GE Healthcare), 100mM NaCl, 50mM HEPES(pH8.0)]를 이용하여 단백질 분리 정제를 실시하였다(도 13 참조).

-AIMP2-DX2-34S 3차 정제: 2차척으로 분리된 재조합 단백질은 이온교환 크로마토그래피를 위해 로딩용액[50mM HEPES(pH8.0)]과 1:1 비율로 희석을 한 후 HiTrap SP HP 컬럼(GE Healthcare)에 로딩을 하였다. binding buffer는 50mM HEPES(pH8.0)이 사용되었다. 재조합 단백질을 3차적으로 분리하기 위하여 용리용액[1M NaCl, 50mM HEPES(pH8.0)]을 이용하여 40% 기울기 용리방법(4ml/min 속도로 20min 동안)을 사용하여 재조합 단백질을 정제하였다(도 14 참조).

-AIMP2-DX2-34S 4차 정제: 3차적으로 분리된 재조합 단백질의 저장용액[100mM NaCl, 50mM HEPES(pH8.0)]을 위해 크기배제 크로마토그래피(HiLoad16/600 Superdex75 (GE Healthcare))를 한번 더 진행하였다(도 15 참조).

각 단계별 정제과정에서 전기영동을 통해 단백질의 순도를 확인 하였다. 4단계의 정제과정을 통해 순도 99% 이상의 재조합 AIMP2-DX2-34S 단백질을 생산하였다.

< 실시예 3>

재조합 AIMP2 - DX2 -34S 단백질의 생물학적 활성 평가

상기 <실시예 2>에서 제조한 AIMP2-DX2-34S 단백질이 본래의 AIMP2-DX2 full sequence 단백질(이하, AIMP2-DX2 full로 표시)과 동일한 활성을 갖는지를 확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

<3-1> co - IP ( co - immunoprecipitation )을 통한 P53 단백질과의 결합 확인

HA 표지된 p53 단백질(이하, HA-p53으로 표기)을 발현하는 플라스미드(addgene)로 293T 세포를 형질감염 시키고, 상기 HA-p53이 과발현된 293T 세포에 Streptavidine으로 표지된 strep-AIMP2-DX2 Full 또는 strep-AIMP2-DX2 34S를 과발현 시켰다.

각각의 293T 세포를 용해(lysis) 시킨 후 용해물(lysate)을 strep antibody(iba, Cat. No. 2-1509-001)를 이용하여 면역침전(immunoprecipitation)하였다. 상기 침전된 단백질은 SDS-PAGE를 이용하여 분리되었다. 침전된 HA-p53, 결합한 strep-AIMP2-DX2 Full 또는 34S 단백질은 HA antibody, strep antibody(iba)를 이용한 Western blot을 통해 확인되었다.

그 결과 [도 16]에서 보는 바와 같이, AIMP2-DX2 full 단백질과 마찬가지로 본원 발명의 AIMP2-DX2-34S 단백질 또한 p53 단백질과 결합함을 확인하였다.

<3-2> GST Pull - down assay 를 이용한 P53 단백질과의 결합 확인

AIMP2-DX2-34S와 p53 단백질과의 상호 작용은 GST Pull-down 분석법으로 추가로 시험되었다. GST 단백질(GST-EV로 표시, GE Healthcare) 또는 GST 표지된 p53 단백질(이하, GST-p53 단백질로 표시)을, Streptavidine으로 표지된 strep-AIMP2-DX2 Full 또는 strep-AIMP2-DX2 34S가 과발현된 세포 용해물과 4시간동안 incubation 해주었다. Incubation 후, 각각의 시료에서 GST 단백질은 Glutathione sepharose 4B(GE Heathcare, Cat. No. 17-0756-01)를 이용하여 침전 하였다. 침전된 단백질은 SDS-PAGE를 이용하여 분리되었다. GST 단백질에 결합한 strep-AIMP2-DX2 Full 또는 strep-AIMP2-DX2-34S 단백질은 strep antibody(iba, Cat. No. 2-1509-001)를 이용한 Western blot을 통해 확인되었다. GST 단백질은 coomassie staining을 통해 확인하였다.

상기 pull down 실험을 통하여 [도 17]에서 보는 바와 같이, AIMP2-DX2 full 단백질과 마찬가지로 본원 발명의 AIMP2-DX2-34S 단백질 또한 p53 단백질과 직접적으로 결합함을 확인하였다.

이러한 결과는 AIMP2-DX2-34S 단백질이 본래의 AIMP2-DX2 full sequence 단백질과 동일한 활성을 가짐을 나타낸다.

<3-3> AIMP2 - DX2 Full 또는 AIMP2 - DX2 -34S에 의해 유도된 세포 증식 비교

293T 세포에 strep-AIMP2-DX2 Full 또는 strep-AIMP2-DX2 34S를 과발현 시켰다. 48시간 후 MTT assay(usb, Cat. No. 19265)를 통해 proliferation을 측정하였다.

그 결과 [도 18]에서 보는 바와 같이, 본 발명의 AIMP2-DX2-34S는 본래의 AIMP2-DX2 Full과 동일한 수준으로 세포과증식을 일으키는 것을 확인하였다. 이는 기존에 AIMP2-DX2가 AIMP2와 경쟁적으로 작용하여, 정상 세포의 이상증식을 억제하고 암세포가 사멸되도록 유도하는 p53과 AIMP2의 결합을 방해한다는 사실과 부합한다.

상기 실시예3의 실험들을 통해 본원 발명의 AIMP2-DX2-34S는 AIMP2-DX2 Full과 생물학적으로 동일한 활성을 가짐을 확인하였다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명은 AIMP2-DX2-34S 단백질 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 좀 더 상세하게 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 AIMP2-DX2-34S 단백질, 상기 AIMP2-DX2-34S 단백질을 코딩하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환 미생물, 상기 형질전환 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 상기 AIMP2-DX2-34S 단백질 제조 방법, 상기 AIMP2-DX2-34S 단백질에 특이적인 항체 및 신약개발에 있어서 이들의 이용방법에 관한 것이다.

본 발명의 AIMP2-DX2-34S 단백질은 AIMP2-DX2와 동일한 활성을 가질뿐만 아니라, 정제된 단백질 사이의 응집(aggregation)일 일어나지 않고 높은 용해성을 가지기 대문에 단백질의 대량생산에 매우 효과적이다. 따라서 상기 대량생산 및 정제된 AIMP2-DX2-34S 단백질은, 구조에 근거한 신약개발 과정에 필요한 단계인 단백질 결정제작 및 X-ray 크리스탈로그라피에 의한 AIMP2-DX2-34S 단백질의 3차원 구조 결정에 있어 매우 유용하게 사용될 수 있으므로 산업상 이용 가능성이 있다.

<110> Medicinal Bioconvergence Research Center <120> AIMP2-DX2-34S protein and method for manufacturing the same <130> NP13-0098 <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 218 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AIMP2-DX2-34S (amino acid sequence) <400> 1 Ser Tyr Gly Pro Ala Pro Gly Ala Gly His Val Gln Asp Tyr Gly Ala 1 5 10 15 Leu Lys Asp Ile Val Ile Asn Ala Asn Pro Ala Ser Pro Pro Leu Ser 20 25 30 Leu Leu Val Leu His Arg Leu Leu Cys Glu His Phe Arg Val Leu Ser 35 40 45 Thr Val His Thr His Ser Ser Val Lys Ser Val Pro Glu Asn Leu Leu 50 55 60 Lys Cys Phe Gly Glu Gln Asn Lys Lys Gln Pro Arg Gln Asp Tyr Gln 65 70 75 80 Leu Gly Phe Thr Leu Ile Trp Lys Asn Val Pro Lys Thr Gln Met Lys 85 90 95 Phe Ser Ile Gln Thr Met Cys Pro Ile Glu Gly Glu Gly Asn Ile Ala 100 105 110 Arg Phe Leu Phe Ser Leu Phe Gly Gln Lys His Asn Ala Val Asn Ala 115 120 125 Thr Leu Ile Asp Ser Trp Val Asp Ile Ala Ile Phe Gln Leu Lys Glu 130 135 140 Gly Ser Ser Lys Glu Lys Ala Ala Val Phe Arg Ser Met Asn Ser Ala 145 150 155 160 Leu Gly Lys Ser Pro Trp Leu Ala Gly Asn Glu Leu Thr Val Ala Asp 165 170 175 Val Val Leu Trp Ser Val Leu Gln Gln Ile Gly Gly Cys Ser Val Thr 180 185 190 Val Pro Ala Asn Val Gln Arg Trp Met Arg Ser Cys Glu Asn Leu Ala 195 200 205 Pro Phe Asn Thr Ala Leu Lys Leu Leu Lys 210 215 <210> 2 <211> 657 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AIMP2-DX2-34S (nucleotide sequence) <400> 2 agctacggcc cagcgccggg cgctggccac gtgcaggatt acggggcgct gaaagacatc 60 gtgatcaacg caaacccggc ctcccctccc ctctccctgc ttgtgctgca caggctgctc 120 tgtgagcact tcagggtcct gtccacggtg cacacgcact cctcggtcaa gagcgtgcct 180 gaaaaccttc tcaagtgctt tggagaacag aataaaaaac agccccgcca agactatcag 240 ctgggattca ctttaatttg gaagaatgtg ccgaagacgc agatgaaatt cagcatccag 300 acgatgtgcc ccatcgaagg cgaagggaac attgcacgtt tcttgttctc tctgtttggc 360 cagaagcata atgctgtcaa cgcaaccctt atagatagct gggtagatat tgcgattttt 420 cagttaaaag agggaagcag taaagaaaaa gccgctgttt tccgctccat gaactctgct 480 cttgggaaga gcccttggct cgctgggaat gaactcaccg tagcagacgt ggtgctgtgg 540 tctgtactcc agcagatcgg aggctgcagt gtgacagtgc cagccaatgt gcagaggtgg 600 atgaggtctt gtgaaaacct ggctcctttt aacacggccc tcaagctcct taagtga 657 <210> 3 <211> 251 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AIMP2-DX2(amino acid sequence) <400> 3 Met Pro Met Tyr Gln Val Lys Pro Tyr His Gly Gly Gly Ala Pro Leu 1 5 10 15 Arg Val Glu Leu Pro Thr Cys Met Tyr Arg Leu Pro Asn Val His Gly 20 25 30 Arg Ser Tyr Gly Pro Ala Pro Gly Ala Gly His Val Gln Asp Tyr Gly 35 40 45 Ala Leu Lys Asp Ile Val Ile Asn Ala Asn Pro Ala Ser Pro Pro Leu 50 55 60 Ser Leu Leu Val Leu His Arg Leu Leu Cys Glu His Phe Arg Val Leu 65 70 75 80 Ser Thr Val His Thr His Ser Ser Val Lys Ser Val Pro Glu Asn Leu 85 90 95 Leu Lys Cys Phe Gly Glu Gln Asn Lys Lys Gln Pro Arg Gln Asp Tyr 100 105 110 Gln Leu Gly Phe Thr Leu Ile Trp Lys Asn Val Pro Lys Thr Gln Met 115 120 125 Lys Phe Ser Ile Gln Thr Met Cys Pro Ile Glu Gly Glu Gly Asn Ile 130 135 140 Ala Arg Phe Leu Phe Ser Leu Phe Gly Gln Lys His Asn Ala Val Asn 145 150 155 160 Ala Thr Leu Ile Asp Ser Trp Val Asp Ile Ala Ile Phe Gln Leu Lys 165 170 175 Glu Gly Ser Ser Lys Glu Lys Ala Ala Val Phe Arg Ser Met Asn Ser 180 185 190 Ala Leu Gly Lys Ser Pro Trp Leu Ala Gly Asn Glu Leu Thr Val Ala 195 200 205 Asp Val Val Leu Trp Ser Val Leu Gln Gln Ile Gly Gly Cys Ser Val 210 215 220 Thr Val Pro Ala Asn Val Gln Arg Trp Met Arg Ser Cys Glu Asn Leu 225 230 235 240 Ala Pro Phe Asn Thr Ala Leu Lys Leu Leu Lys 245 250 <210> 4 <211> 756 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AIMP2-DX2(nucleotide sequence) <400> 4 atgccgatgt accaggtaaa gccctatcac gggggcggcg cgcctctccg tgtggagctt 60 cccacctgca tgtaccggct ccccaacgtg cacggcagga gctacggccc agcgccgggc 120 gctggccacg tgcaggatta cggggcgctg aaagacatcg tgatcaacgc aaacccggcc 180 tcccctcccc tctccctgct tgtgctgcac aggctgctct gtgagcactt cagggtcctg 240 tccacggtgc acacgcactc ctcggtcaag agcgtgcctg aaaaccttct caagtgcttt 300 ggagaacaga ataaaaaaca gccccgccaa gactatcagc tgggattcac tttaatttgg 360 aagaatgtgc cgaagacgca gatgaaattc agcatccaga cgatgtgccc catcgaaggc 420 gaagggaaca ttgcacgttt cttgttctct ctgtttggcc agaagcataa tgctgtcaac 480 gcaaccctta tagatagctg ggtagatatt gcgatttttc agttaaaaga gggaagcagt 540 aaagaaaaag ccgctgtttt ccgctccatg aactctgctc ttgggaagag cccttggctc 600 gctgggaatg aactcaccgt agcagacgtg gtgctgtggt ctgtactcca gcagatcgga 660 ggctgcagtg tgacagtgcc agccaatgtg cagaggtgga tgaggtcttg tgaaaacctg 720 gctcctttta acacggccct caagctcctt aagtga 756 <210> 5 <211> 416 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AIMP2-DX2-Trx(amino acid sequence) <400> 5 Met Ser Asp Lys Ile Ile His Leu Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr Asp 1 5 10 15 Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile Leu Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp 20 25 30 Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala Pro Ile Leu Asp Glu Ile Ala Asp 35 40 45 Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr Val Ala Lys Leu Asn Ile Asp Gln Asn 50 55 60 Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly Ile Arg Gly Ile Pro Thr Leu Leu 65 70 75 80 Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu Ser 85 90 95 Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe Leu Asp Ala Asn Leu Ala Gly Ser Gly 100 105 110 Ser Gly His Met His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro 115 120 125 Arg Gly Ser Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln 130 135 140 His Met Asp Ser Pro Asp Leu Gly Thr Asp Asp Asp Asp Lys Ala Met 145 150 155 160 Ala Asp Ile Gly Ser Met Pro Met Tyr Gln Val Lys Pro Tyr His Gly 165 170 175 Gly Gly Ala Pro Leu Arg Val Glu Leu Pro Thr Cys Met Tyr Arg Leu 180 185 190 Pro Asn Val His Gly Arg Ser Tyr Gly Pro Ala Pro Gly Ala Gly His 195 200 205 Val Gln Asp Tyr Gly Ala Leu Lys Asp Ile Val Ile Asn Ala Asn Pro 210 215 220 Ala Ser Pro Pro Leu Ser Leu Leu Val Leu His Arg Leu Leu Cys Glu 225 230 235 240 His Phe Arg Val Leu Ser Thr Val His Thr His Ser Ser Val Lys Ser 245 250 255 Val Pro Glu Asn Leu Leu Lys Cys Phe Gly Glu Gln Asn Lys Lys Gln 260 265 270 Pro Arg Gln Asp Tyr Gln Leu Gly Phe Thr Leu Ile Trp Lys Asn Val 275 280 285 Pro Lys Thr Gln Met Lys Phe Ser Ile Gln Thr Met Cys Pro Ile Glu 290 295 300 Gly Glu Gly Asn Ile Ala Arg Phe Leu Phe Ser Leu Phe Gly Gln Lys 305 310 315 320 His Asn Ala Val Asn Ala Thr Leu Ile Asp Ser Trp Val Asp Ile Ala 325 330 335 Ile Phe Gln Leu Lys Glu Gly Ser Ser Lys Glu Lys Ala Ala Val Phe 340 345 350 Arg Ser Met Asn Ser Ala Leu Gly Lys Ser Pro Trp Leu Ala Gly Asn 355 360 365 Glu Leu Thr Val Ala Asp Val Val Leu Trp Ser Val Leu Gln Gln Ile 370 375 380 Gly Gly Cys Ser Val Thr Val Pro Ala Asn Val Gln Arg Trp Met Arg 385 390 395 400 Ser Cys Glu Asn Leu Ala Pro Phe Asn Thr Ala Leu Lys Leu Leu Lys 405 410 415 <210> 6 <211> 1251 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AIMP2-DX2-Trx(nucleotide sequence) <400> 6 atgagcgata aaattattca cctgactgac gacagttttg acacggatgt actcaaagcg 60 gacggggcga tcctcgtcga tttctgggca gagtggtgcg gtccgtgcaa aatgatcgcc 120 ccgattctgg atgaaatcgc tgacgaatat cagggcaaac tgaccgttgc aaaactgaac 180 atcgatcaaa accctggcac tgcgccgaaa tatggcatcc gtggtatccc gactctgctg 240 ctgttcaaaa acggtgaagt ggcggcaacc aaagtgggtg cactgtctaa aggtcagttg 300 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tcggaggctg cagtgtgaca gtgccagcca atgtgcagag gtggatgagg 1200 tcttgtgaaa acctggctcc ttttaacacg gccctcaagc tccttaagtg a 1251

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 AIMP2-DX2-34S 단백질.
제1항의 AIMP2-DX2-34S 단백질을 코딩하는 핵산 분자.
제2항에 있어서, 상기 핵산 분자는 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
제2항의 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터.
제4항의 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환 미생물.
제5항에 있어서, 상기 형질전환 미생물이 대장균(Escherichia coli)인 것을 특징으로 하는 형질전환 미생물.
제5항의 형질전환 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 제1항의 AIMP2-DX2-34S 단백질 제조 방법.
제1항의 AIMP2-DX2-34S 단백질에 특이적인 항체.
제8항의 AIMP2-DX2-34S 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 암 진단 키트.
(a) 분석할 시료를 제공하는 단계; 및 (b) 상기 시료를 제8항의 AIMP2-DX2-34S 단백질에 특이적인 항체와 접촉시키는 단계를 포함하는, AIMP2-DX2를 검출하는 방법.
제1항의 AIMP2-DX2-34S 단백질의 mRNA에 특이적인 siRNA 핵산 분자.
제11항의 siRNA 핵산 분자를 포함하는, 암을 치료하기 위한 약제학적 조성물.
제1항의 AIMP2-DX2-34S 단백질의 mRNA에 상보적인 서열을 갖는 안티센스 핵산 분자.
제13항의 안티센스 핵산 분자를 포함하는 암을 치료하기 위한 약제학적 조성물.
(a) 시험물질을 제1항의 AIMP2-DX2-34S 단백질을 코딩하는 유전자를 발현하는 세포와 접촉시키는 단계 및 (b) 시험물질에 의한 AIMP2-DX2-34S 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 억제 또는 AIMP2-DX2-34S 단백질의 분해 촉진을 측정하는 단계를 포함하여, AIMP2-DX2 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 억제 또는 AIMP2-DX2 단백질의 분해를 촉진 하는 항암제를 스크리닝하는 방법.
제15항에 있어서, RT-PCR 또는 웨스턴 블랏으로 스크리닝하는 방법.
(a) 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산분자를 포함하는 발현 벡터를 제조하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계의 발현 벡터로 대장균을 형질전환 시키고 배양하는 단계;
(c) 상기 (b) 단계에서 배양된 대장균을 파쇄하여 AIMP2-DX2-34S 단백질을 수득하는 단계를 포함하는, AIMP2-DX2-34S 단백질의 대량생산 방법.