WO2015174641A1 - Aimp2-dx2-34s 단백질 및 이의 제조방법 - Google Patents

Aimp2-dx2-34s 단백질 및 이의 제조방법 Download PDF

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WO2015174641A1
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acid molecule
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PCT/KR2015/003690
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김성훈
김대규
한병우
박상호
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재단법인 의약바이오컨버젼스연구단
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids

Definitions

  • the present invention relates to an AIMP2-DX2-34S protein and a method for preparing the same, and more specifically, to an AIMP2-DX2-34S protein having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, which encodes the AIMP2-DX2-34S protein.
  • the present invention relates to antibodies and specific methods for 34S protein development and their use in new drugs.
  • AIMP2 (ARS-interacting mul t-funct ional protein 2) is one of the proteins involved in the formation of aminoacyl-tRNA synthetase (ARSs), p38 / JTV-1 or Also called p38. It is known that AIMP2 is a novel cancer suppressor that enhances TGF- ⁇ signaling through direct interaction with Smad2 / 3.
  • Patent No. 10-0762995 by the present inventors are known to specifically express AIMP2-DX2, a variant of the exon 2 deletion of AIMP2 in cancer cell lines and tissues.
  • the present inventors found that AIMP2 levels were dramatically reduced in AIMP2-DX2-transformed cells irrespective of TGF- ⁇ , resulting in loss of AIMP2 activity and actually transducing AIMP2-DX2 into cells.
  • the conversion resulted in aberrant-functions of TGF- ⁇ signaling, such as increasing c-myc expression, preventing nuclear migration of AIMP2 and stopping cell growth.
  • AIMP2-DX2 forms an inactive heterodimer with AIMP2, demonstrating its close association with cancer formation and progression.
  • the production of AIMP2-DX2 has been observed in various cancers such as lung cancer, liver cancer, skin cancer, breast cancer, kidney cancer, and osteosarcoma.
  • AIMP2 mediates the apoptotic activity of TNF- ⁇ through TRAF2, and this activity is AIMP2-. It was first identified that it is regulated by DX2. In addition, it was confirmed that AIMP2-DX2 also influences the expression of the inflammatory marker Cox-2. Therefore, it is known that a composition comprising an inhibitor of an AIMP2 variant (AIMP2-DX2) polypeptide lacking Axon 2 as an active ingredient can be used for the purpose of preventing and treating inflammatory diseases. As described above, as AIMP2-DX2 protein is linked to various diseases (eg, various types of cancer, inflammatory diseases, etc.), AIMP2-DX2 is a new target for drug development. Is being presented. Therefore, it is expected that if the AIMP2-DX2 protein tertiary structure is revealed, it can provide a starting point for protein structure-based drug designation.
  • AIMP2-DX2 protein has low solubility in water and aggregates between proteins in order to obtain AIMP2-DX2 protein by protein cloning through gene cloning, which is used as a conventional protein mass production method. This phenomenon has made it difficult to crystallize protein crystals for protein tertiary structure. As a result, there was no research on protein structure-based drug development because there was no information on the protein tertiary structure in which substrate or counterung product was bound.
  • the drug design can be efficiently and quickly proceeded based on the structure, and thus, it will be an opportunity to preempt the competitiveness in the pharmaceutical and drug development fields using the AIMP2—DX2 protein. .
  • the present inventors have been studying to express a large amount of AIMP2-DX2 protein as the most basic step for the development of a new drug that targets the inhibition of AIMP2-DX2 activity. It was confirmed that the AIMP2-DX2-34S protein of the present form does not aggregate (aggregat i on) and shows high solubility and the same activity as that of AIMP2-DX2, thus completing the present invention.
  • Another object of the present invention is to provide a nucleic acid molecule encoding the AIMP2-DX2-34S protein.
  • Another object of the present invention is to provide a recombinant vector comprising the nucleic acid molecule.
  • Another object of the present invention is to provide a transformed microorganism transformed with the recombinant vector.
  • Still another object of the present invention is to provide a method for preparing the AIMP2-DX2-34S protein comprising culturing the transformed microorganism.
  • Another object of the present invention is to provide an antibody specific for the AIMP2-DX2-34S protein.
  • Another object of the present invention is to provide a cancer diagnostic kit comprising the antibody.
  • Still another object of the present invention is to provide a sample for analysis; And (b) contacting the sample with an antibody specific for the AIMP2 ′ DX2-34S protein.
  • Another object of the present invention is to provide a siRNA nucleic acid molecule specific for mRNA of the AIMP2-DX2-34S protein.
  • Another object of the present invention is to provide an antisense nucleic acid molecule having a sequence complementary to the mRNA of the AIMP2-DX2-34S protein.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for treating cancer comprising the s iRNA nucleic acid molecule or antisense nucleic acid molecule.
  • Still another object of the present invention is to provide a use of the s iRNA nucleic acid molecule or antisense nucleic acid molecule for the preparation of a cancer therapeutic agent.
  • Still another object of the present invention is to provide a method for treating cancer, wherein the siRNA nucleic acid molecule or antisense nucleic acid molecule is administered to an individual in need thereof in an effective amount.
  • Another object of the present invention is to (a) contact a test substance with a cell expressing the gene encoding the AIMP2-DX2-34S protein, and (b) the AIMP2-DX2-34S protein by the test substance. Screening for an anticancer agent that inhibits the expression of the gene encoding AIMP2-DX2 protein or promotes the degradation of the AIMP2-DX2 protein, including measuring the inhibition of the expression of the gene encoding the protein or promoting the degradation of the AIMP2-DX2-34S protein. It provides a way to do it.
  • Another object of the present invention is to prepare an expression vector comprising a nucleic acid molecule encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1; (b) transforming E. coli with the expression vector of step (a) and culturing; (c) to provide a method for mass production of AIMP2-DX2-34S protein, comprising the step of crushing E. coli cultured in step (b) to obtain AIMP2-DX2-34S protein.
  • the present invention provides an AIMP2-DX2-34S protein having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. ⁇ 49>
  • the present invention provides AIMP2-DX2-34S protein.
  • nucleic acid molecules that encode.
  • the present invention provides a recombinant vector comprising the nucleic acid molecule.
  • the present invention provides a transformant transformed with the recombinant vector.
  • the present invention provides a method for producing the AIMP2-DX2-34S protein comprising the step of culturing the transformant.
  • the present invention provides an antibody specific for the AIMP2-DX2-34S protein.
  • the present invention provides a cancer diagnostic kit comprising the antibody.
  • the present invention provides a method for analyzing a sample to be analyzed.
  • the present invention provides a s iR A nucleic acid molecule specific for the mRNA of the AIMP2-DX2-34S protein.
  • the present invention provides an antisense nucleic acid molecule having a sequence complementary to the mRNA of the AIMP2-DX2-34S protein.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for treating cancer comprising the s iRNA nucleic acid molecule or antisense nucleic acid molecule.
  • the present invention provides a use of the s iRNA nucleic acid molecule or antisense nucleic acid molecule for the manufacture of a cancer therapeutic agent.
  • the present invention provides a method for treating cancer, characterized in that the s iRNA nucleic acid molecule or antisense nucleic acid molecule is administered to an individual in need thereof.
  • the present invention (a) the test substance is
  • the present invention comprises the steps of (a) preparing an expression vector comprising a nucleic acid molecule encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1; (b) transforming E. coli with the expression vector of step (a) and culturing; (c) providing a method for mass production of AIMP2-DX2-34S protein, comprising the step of crushing E. coli cultured in step (b) to obtain AIMP2-DX2-34S protein.
  • the present invention provides an AIMP2-DX2-34S protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1
  • the 'AIMP2-DX2-34S protein' is a protein from which amino acid residues 1 to 33 are removed from the AIMP2-DX2 protein represented by SEQ ID NO: 3, and the amino acid sequence starts from the 34th serine (ser in) ser amino acid. Has an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the AIMP2-DX2 protein refers to a variant in which a region of exon 2 is deleted in the AIMP2 protein sequence.
  • the relevance of is known and can be used for the diagnosis and treatment of various cancers.
  • the present application Application No. 10-2008-0111109 of the present inventors has been found that AIMP2-DX2 also affects the expression of Cox-2, an inflammatory marker, and the correlation between AIMP2-DX2 and inflammatory diseases is known. have.
  • AIMP2-DX2 has become a target of drug development.
  • AIMP2-DX2 protein has low solubility in water and aggregates between proteins in order to obtain AIMP2-DX2 protein by protein cloning through gene cloning, which is used as a normal protein mass production method. This phenomenon has made it difficult to crystallize protein crystals for protein tertiary structure. As a result, there was no research on protein structure-based drug development because there was no information on the protein tertiary structure in which substrate or counterung product was bound.
  • the AIMP2-DX2-34S protein of the present invention solves the problem of mass production of the existing AIMP2-DX2 protein. That is, AIMP2-DX2-34S protein not only has the same activity as AIMP2-DX2, but also has high solubility without causing aggregate ions between purified proteins, and thus is very effective for mass production of proteins. Therefore, the AI P2-DX2-34S protein mass-produced and purified is a three-dimensional structure determination of AIMP2-DX2-34S protein by protein crystallization and X-ray crystallography, which is a necessary step in the process of drug-based drug development. This can be very useful for.
  • Thioredoxin (Trx) fused to pET-32a vector is fused to AIMP2-DX2-protein to AIMP2-DX2-Trx fusion.
  • Protein SEQ ID NO: 5
  • AIMP2-DX2-Trx was transformed into Escherichia coli, followed by mass culture and disruption of the cells to purify the protein in several steps.
  • AIMP2-DX2 was newly isolated by removing Thioredoxin from AIMP2-DX2-Trx obtained through the protein purification.
  • AIMP2-DX2 was identified as a new recombinant protein starting from the 34th serine (Ser, S) of the original AIMP2-DX2 protein (SEQ ID NO: 3) as a result of N-terminal amino acid sequencing. Named AIMP2-DX2-34S (SEQ ID NO: 1).
  • the AIMP2-DX2-34S was transformed into Escherichia coli, and the protein was purified by mass culture and disruption of the cells. As a result, it was possible to mass-produce recombinant AIMP2-DX2-34S protein with a purity of 99% or more through the four-stage purification process, and it was confirmed that the protein was not convoluted with each other and had high solubility.
  • the AIMP2-DX2-34S protein of the present invention may additionally attach a label or the like used in a known detection method, preferably a peptide fragment consisting of 1 to 10 histidines, namely, , Hi s-tag can be used. Most preferably, the peptide fragment consisting of six histidines may be attached.
  • the histidine residue is one of the most commonly used tagosis tags for the purification of the recombinant protein after expression.
  • the specificity (speci f ici ty) must be high and the effect of the desired protein structure is minimal. Should give.
  • one or ten Hi st idines may be composed of pept ides in a row. Since the si ze is small and does not affect the original protein structure, it is not necessary to cut the recombinant protein after making it. There is this.
  • the tag can be created on either the N-terminus (front) or Oterminus (back) of the target protein, depending on the type of vector, and can be determined forward or backward depending on the protein's structure.
  • the AIMP2-DX2-34S protein of the present invention is not only a protein having its native amino acid sequence, but also amino acid sequence variants thereof are also included in the scope of the present invention.
  • Variants of the AIMP2-DX2-34S protein refer to proteins having different sequences by deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution, or a combination of AIMP2-DX2-34S native amino acid sequences and one or more amino acid residues. Amino acid exchange in proteins and peptides that do not alter the activity of the molecule as a whole is known in the art (H. Neurode, R. L. Hi l, The Proteins, Academic Press, New York, 1979).
  • the most commonly occurring exchanges are the amino acid residues Ala / Ser, Val / I le, Asp / Glu, Thr / Ser, Ala / Gly, Ala / Thr, Ser / Asn, Ala / Val, Ser / Gly, Thy / Phe, Ala / Pro, Lys / Arg, Asp / Asn, Leu / I le, Leu / Val, Ala / Glu, Asp / Gly.
  • It may be modified by acrylat ion, glycosyllat ion, methylat ion, farnesylat ion, or the like.
  • the AIMP2-DX2-34S protein or variant thereof is extracted from nature or synthesized (Merrifleld, J. Amer. Chem. Soc .. 85: 2149-2156, 1963) or by recombinant methods based on DNA sequences (Sambrook et al, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA, 2nd edition, 1989).
  • nucleic acid encoding AIMP2-DX2-34S is inserted into an appropriate expression vector, and the host cell is cultured to express AIMP2-DX2-34S in a transformant transformed with a recombinant expression vector. After that, it can be obtained by recovering AIMP2-DX2-34S from the transformant.
  • step (b) transforming E. coli with the expression vector of step (a) and culturing;
  • step (c) providing a method for mass production of AIMP2-DX2-34S protein, comprising the step of crushing E. coli cultured in step (b) to obtain AIMP2-DX2-34S protein.
  • the present invention also provides a nucleic acid molecule encoding the AIMP2-DX2-34S protein.
  • the nucleic acid sequence encoding the AIMP2—DX2-34S protein as described above may be mutated by one or more nucleic acid bases by substitution deletions, insertions, or combinations thereof, as long as they encode a protein having equivalent activity.
  • the above-mentioned AIMP2-DX2-34S protein of SEQ ID NO: 1 is preferably encoded by a nucleic acid molecule having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the sequence of such nucleic acid molecules may be single or double stranded, and may be DNA molecules or RNA (mRNA) molecules.
  • Nucleic acid sequences encoding the AIMP2-DX2-34S protein of the present invention can be isolated from nature or can be prepared by artificially synthetic or genetic recombination.
  • the nucleic acid sequence encoding the AIMP2-DX2-34S protein of the present invention can be operatively linked to a vector capable of expressing it to provide an AIMP2-DX2-34S protein.
  • the present invention provides a recombinant vector comprising the nucleic acid molecule.
  • the term "recombinant vector” means a protein of interest in a suitable host cell or Refers to a gene construct that is capable of expressing a desired RNA and contains essential regulatory elements operably linked to express the gene insert.
  • the term "operably l inked” refers to a function in which a nucleic acid expression control sequence and a nucleic acid sequence encoding a protein or RNA of interest are functionally linked to perform a general function. To say).
  • a promoter and a nucleic acid sequence encoding a protein or RNA can be operably linked to affect the expression of the encoding nucleic acid sequence.
  • Operative linkage with recombinant vectors can be prepared using genetic recombination techniques well known in the art, and site-specific DNA cleavage and ligation uses enzymes commonly known in the art.
  • Vectors of the present invention include, but are not limited to, plasmid vector cozmid vector, bacteriophage vector and viral vector.
  • Suitable expression vectors include signal sequences or leader sequences for membrane targeting or secretion in addition to expression control elements such as promoters, operators, initiation codons, termination codons, polyadenylation signals and enhancers and can be prepared in various ways depending on the purpose.
  • the promoter of the vector may be constitutive or inducible.
  • the expression vector also includes a selection marker for selecting a host cell containing the vector and, in the case of a replicable expression vector, the origin of replication.
  • ⁇ U 8> signal sequence includes the PhoA signal sequence when the host is Escherichia spp.
  • OmpA signal sequence a-amylase signal sequence, subtilisin signal sequence, etc., if the host is Bacillus, MF a signal sequence, SUC2 signal sequence, etc., if the host is yeast, the host is an animal cell
  • an insulin signal sequence, an a-interferon signal sequence, an antibody molecule signal sequence, etc. may be used, but is not limited thereto.
  • the present invention provides a transformed microorganism transformed with the recombinant vector.
  • Transformation may include any method of introducing nucleic acid into an organism, cell, tissue or organ, and may be carried out by selecting appropriate standard techniques according to the host cell as known in the art. These methods include electroporat ion, Protoplast fusion, calcium phosphate (CaP0 4 ) precipitation, calcium chloride (CaCl 2 ) precipitation, agitation with silicon carbide fibers, agro bacterial mediated transformation, PEG, dextran sulfate, lipofectamine, thermal stratification, etc. It is not limited to this.
  • the host cell may be, for example, Escherichia coli (E. coli). , Escherichia col, Bacillus subtilis 03 ⁇ 4c /// ys subtil is prokaryotic host cells such as ococras).
  • fungi eg, Aspergillus C4 spe / 3 ⁇ 4 7 / i; s
  • yeast eg, Peach pastoris (/ Y / a pastor is)
  • Saccharomyces cerevisiae Derived from higher eukaryotes, including lower eukaryotic cells, tortilla cells, plant cells, mammals, etc. May be used as a host cell, but is not limited thereto.
  • the transforming microorganism of the present invention is preferably Escherichia coli (E. coli,
  • Escherichia co // The Escherichia coli strain of the present invention is not limited thereto, but for example, Roset ta2 (DE3) pLysS, BL21-CodonP 1 us (DE3) -RI PL, C43 (DE3) and the like may be used. BL21-CodonPl us (DE3) -RIPL.
  • the present invention comprises the AIMP2- culturing the transforming microorganism
  • a method for preparing DX2-34S protein is provided (the method for preparing AIMP2-DX2-34S protein is the same as the mass production method for AIMP2-DX2-34S protein described above).
  • Cultivation of the transformed microorganism is carried out under appropriate conditions that allow the expression of the target protein AIMP2-DX2-34S, which can be carried out according to methods well known to those skilled in the art.
  • Transformed microorganisms can be cultured in large quantities by conventional culture methods.
  • a medium consisting of a carbon source, a nitrogen source, vitamins and minerals may be used.
  • LB medium Li i a-Bert ani Broth
  • Cultivation of microorganisms is possible under conventional microbial culture conditions and, for example, may be incubated for 10 to 40 hours in the silver range of 15 ° C to 45 ° C.
  • Culture medium in culture Centrifugation or filtration may be performed to remove and recover only the concentrated cells, which steps may be performed by those skilled in the art as needed.
  • the concentrated cells can be frozen or lyophilized according to conventional methods to preserve them without losing their activity.
  • It may be an AIMP2—DX2-34S protein production method comprising the step of inducing DX2-34S protein expression.
  • the culture of the transformed microorganism may be selected by those skilled in the art according to the type of transformed microorganism.
  • the transformant is Escherichia coli (E. coli)
  • the growth conditions may be 35 ° C to 40 ° C, most preferably 37 ° C.
  • the temperature for inducing AIMP2-DX2-34S protein expression from the transformed microorganism cultured in step (b) may preferably be in the temperature range of 15 ° C to 25 ° C, most preferably 18 ° C. To 22 ° C.
  • inducing AIMP2-DX2-34S protein expression at a specific temperature increases the amount of AIMP2-DX2-34S protein expression with high solubility. This is illustrated well in the specification examples of the present invention.
  • Proteins expressed in the transforming microorganism can be purified in a conventional manner, for example, salting out (eg, ammonium sulfate precipitation, sodium phosphate precipitation) and solvent precipitation (acetone, ethane). Precipitating protein fractions using water), dialysis, gel filtration, AIMP2-DX2-34S protein of the present invention can be purified by applying techniques such as on-exchange, column chromatography such as reversed phase column chromatography and ultrafiltration alone or in combination (Maniat is et al, Molecular Cloning: A Laboratory).
  • the AIMP2 of the present invention is combined with various methods of high performance liquid chromatography (FPLC) including fast protein chromatography, adsorption chromatography, partition chromatography, ion exchange chromatography, size exclusion chromatography, and the like.
  • FPLC high performance liquid chromatography
  • -It can purify DX2-34S protein.
  • AIMP2—DX2-34S protein of the present invention is obtained from the lysate of transformed cell culture by performing a combination of stepwise FPLC, ion exchange chromatography, and size exclusion chromatography. It was.
  • the present invention provides an antibody specific for the AIMP2-DX2-34S protein.
  • antibody refers to a specific protein molecule directed to an antigenic site. For the purposes of the present invention, it refers to antibodies that specifically recognize AIMP2-DX2-34S.
  • the 'antibody specific for AIMP2-DX2-34S protein' of the present invention is AIMP2-.
  • the 'antibody specific for AIMP2-DX2-34S protein' is ultimately an antibody that specifically recognizes AIMP2-DX2 separately from AIMP2.
  • Antibodies of the present invention include both polyclonal antibodies and monoclonal antibodies, and as described above, since AIMP2-DX2-34S protein has been identified, the production of antibodies using the same may be performed using techniques well known in the art. It can be manufactured easily.
  • Polyclonal antibodies can be produced by methods well known in the art for injecting the AIMP2-DX2-34S protein antigen described above into an animal and collecting blood from the animal to obtain serum comprising the antibody.
  • These polyclonal antibodies include goat, rabbit, sheep, horse, pig, cow It can be produced from any animal species host such as a dog.
  • Monoclonal antibodies are well known in the art for fusion methods (ohler and
  • Antibodies used in the detection of AIMP2-DX2-34S proteins of the present invention include functional fragments of antibody molecules as well as complete forms having two full length light chains and two full length heavy chains.
  • the functional fragment of an antibody molecule means the fragment which has at least antigen binding function, and includes Fab, F (ab '), F (ab') 2, and Fv.
  • Antibodies specific for AIMP2-DX2-34S of the present invention specifically bind to AIMP2-DX2
  • the antibody can be coupled (eg covalently) with an existing therapeutic agent either directly or indirectly via a linker or the like.
  • Radionuclides include 1311, 90Y, 105Rh, 47Sc, 67Cu, 212Bi, 211At, 67Ga, 1251, 186Re, 188Re, 177Lu, 153Sm, 1231, lllln.
  • Drugs include methotrexate and adriamycin, and lymphokines include interferon.
  • Toxins include lysine, abrin, and dephtheria.
  • heterofunctional antibodies which are antibodies that bind to other antibodies and bind their complexes to both cancer cells and agonist cells (eg, killer cells such as T cells).
  • the antibody may be administered by itself or in a composition comprising the antibody.
  • the therapeutic compositions are prepared in suitable formulations, including an acceptable carrier depending on the mode of administration.
  • Formulations suitable for the mode of administration are known and typically comprise a surfactant that facilitates migration through the membrane.
  • surfactants may be derived from steroids or may be N- [l- (2,3-dioleoyl) propyl- ⁇ , ⁇ , ⁇ -trimethylammonium chloride (D0TMA).
  • D0TMA N- [l- (2,3-dioleoyl) propyl- ⁇ , ⁇ , ⁇ -trimethylammonium chloride
  • various compounds such as cationic lipids or cholesterol hemisuccinate phosphatidyl glycerol.
  • the composition comprising the antibody of the present invention may be administered in a pharmaceutically effective amount to treat cancer cells or their metastases.
  • the pharmaceutical composition may be administered single or multiple.
  • the composition comprising the antibody is administered by a suitable method including parenteral, subcutaneous, intraperitoneal, intrapulmonary, intranasal, and if necessary for local immunosuppressive treatment, including intralesional administration.
  • Parenteral infusions include intramuscular, intravenous, intraarterial, intraperitoneal or subcutaneous administration.
  • Preferred modes of administration and preparations are intravenous, subcutaneous, intradermal, intramuscular, injectable and the like.
  • the pH of the formulation is generally in the range of pH 4 and pH 8 to balance the antibody stability (chemical and physical stability) and to be appropriate for the patient to be administered.
  • the antibody of the present invention can be administered in the form of a nucleic acid encoding the antibody so that the antibody is produced in the cell (W096 / 07321).
  • the present invention provides a cancer diagnostic kit comprising the antibody.
  • Cancer diagnostic kits of the present invention include tools, reagents, and the like commonly used in the art for immunological analysis, as well as antibodies that specifically recognize AIMP2-DX2-34S protein.
  • tools / reagents include, but are not limited to, suitable carriers, labeling agent solubilizers, complete agents, stabilizers, etc., which can produce detectable signals.
  • labeling substance is an enzyme, it may include a substrate and a reaction stopper capable of measuring enzyme activity.
  • Suitable carriers include, but are not limited to, soluble carriers, for example physiologically acceptable lamellae known in the art, such as PBS, insoluble carriers such as polystyrene, polyethylene, polypropylene, poly
  • PBS physiologically acceptable lamellae known in the art
  • insoluble carriers such as polystyrene, polyethylene, polypropylene
  • the ester, polyacrylonitrile, fluororesin crosslinked text may be a polysaccharide, a polymer such as magnetic fine particles plated metal on latex, other paper, glass, metal, agarose and combinations thereof.
  • the cancer diagnostic kit of the present invention is not limited to such forms as ELISA plate dip-stick devices, immunochromatography test strips and radiation split immunoassay devices and f low-through devices. Can have.
  • Cancer diagnosis kit of the present invention includes the 'antibody that specifically recognizes the AIMP2-DX2-34S protein', it is possible to detect AIMP2-DX2, a cancer diagnostic marker.
  • cancer diagnostic marker refers to a substance capable of confirming the onset of cancer by expressing it in cancer tissues and cells and confirming the expression thereof, preferably a protein having a significant difference between normal tissue and cancer tissue, or It refers to an organic biomolecule such as mRNA.
  • the cancer diagnostic marker is AIMP2-DX2 which is specifically expressed only in various cancer tissues and cells, and cancer can be diagnosed by confirming the expression of AIMP2-DX2 at the mRNA level and / or the protein level.
  • the antibody of the present invention can be usefully used to diagnose cancer, more specifically lung cancer, liver cancer, breast cancer, skin cancer, kidney cancer, osteosarcoma cancer and the like.
  • AIMP2-DX2 comprising contacting an antibody specific for an AIMP2-DX2-34S protein.
  • sample to be analyzed refers to a biological sample such as tissue, cells, whole blood, serum, plasma, saliva semen cerebrospinal fluid, or urine, in which a difference in the amount of marker protein can be detected by cancer. It is prepared by treatment in a manner well known in the art.
  • Detection of AIMP2-DX2 protein is performed by contacting a sample with an antibody that specifically recognizes AI P2-DX2-34S and measuring its antigen-antibody complex formation.
  • the 'antibody that specifically recognizes AIMP2-DX2-34S' of the present invention specifically binds to AIMP2-DX2 protein to form an antigen-antibody complex.
  • the term “antigen-antibody complex” refers to an AIMP2-DX2 protein of a biological sample and an antibody that specifically recognizes it (an antibody that specifically recognizes the AIMP2-DX2-34S of the present invention). It means a combination of.
  • Experimental methods to examine antigen-antibody complex formation include tissue immunostaining, radioimmunoassay (RIA), enzyme immunoassay (ELISA), western blotting, immunoprecipitation assay (Immunoprecipitation assay), immunoprecipitation assay Immunodi f fusion assays, complement fixation ion assays, FACS, protein chips, and the like, are not limited thereto.
  • ⁇ 174> a label that allows qualitative or quantitative measurement of the formation of the antigen-antibody complex
  • enzymes fluorescent materials, ligands, luminescent microparticles, redox molecules and radioisotopes, but are not necessarily limited thereto.
  • Enzymes that can be used as detection labels include ⁇ -glucuronidase, ⁇ -D-glucosidase, ⁇ -D—galactosidase, urease , peroxidase, alkaline phosphatase, and acetylcholinesterase Glucose Oxidase, Nucleokinase and GDPase, RNase, Glucose Oxidase and Luciferase, Phosphophate Tokinase, Phosphoenolpyruvate Carboxylase, Aspartate Aminotransferase, Phosphorylpyruvate Decarboxylase, ⁇ -latamases and the like, but are not limited thereto.
  • Fluorescent materials include, but are not limited to, fluorescein, isothiocyanate, rhodamine, phycoerythrin, phycocyanin, allophycocyanin, 0-phthalaldehyde, fluorescamine, and the like.
  • Ligands include, but are not limited to, biotin derivatives.
  • Luminescent materials include, but are not limited to, acridinium ester, luciferin, luciferase, and the like.
  • Microparticles include, but are not limited to, colloidal gold, colored latex, and the like.
  • Redox molecules include ferrocene, ruthenium complex, biologen, quinone, Ti ion Cs silver, diimide 1,4-benzoquinone, hydroquinone, W (CN) 8 , [0s (bpy) 3] 2+ , [RU (bpy) 3] 2+ , [0 (CN) 8] 4 " , but are not limited to these.
  • the present invention provides siRNA nucleic acid molecules specific for mRNA of the AIMP2-DX2-34S protein.
  • RNA refers to cleavage of a specific mRNA.
  • RNAiCRNA interference refers to a short double chain chain that can induce phenomena. It consists of a sense RNA strand having a sequence homologous to the mRNA of the target gene and an antisense RNA strand having a sequence complementary thereto. siRNA is provided as an efficient gene knockdown method or gene therapy because it can inhibit the expression of the target gene. siRNAs are not limited to completely paired double-stranded RNA portions paired with RNA, but can be paired by mismatches (bases not complementary), bulges (no bases on one chain), and the like. Four parts are not made
  • the total length is 10 to 100 bases, preferably 15 to 80 bases, more preferably 20 to 70 bases.
  • the siRNA terminal structure may be blunt-end black or silver adhesion if the expression of the target gene can be suppressed by the RNAi effect. both (cohes ive) ends are possible.
  • the cohesive end structure is possible in both a three-terminal protruding structure and a five-terminal protruding structure.
  • the number of protruding bases is not limited. For example, the number of bases may be 1 to 8 bases, preferably 2 to 6 bases.
  • the full length of the s iRNA herein is expressed as the sum of the length of the central double chain portion and the length constituting the monohedral protrusions at both ends.
  • s iRNA is a low-molecular RNA (e.g., a natural RNA molecule such as tRNA, rRNA, viral RNA, or artificial RNA) at a proximal end of one end thereof in a range capable of maintaining the expression inhibitory effect of the target gene. RNA molecules) may be included.
  • the siRNA terminal structure does not need to have a cleavage structure at both sides, and may be a stem loop structure in which one terminal region of the double chain NA is connected by a linker RNA.
  • the length of the linker is not particularly limited as long as it does not interfere with pairing of stem portions.
  • the term “specific” or “specific” refers to the ability to inhibit only the target gene without affecting other genes in the cell.
  • S iRNA of the present invention is complementary to the sense RNA strand comprising a sequence homologous to mRNA corresponding to the exon 1 and exon 3 boundary points of AIMP2-DX2-34S to specifically operate AIMP2-DX2-V 34S Have an antisense RNA strand comprising the sequence.
  • the term "inhibit on gene expressi on” means that the level of mRNA and / or protein produced in the gene of interest is eliminated or reduced, which means c leavage. RNA interference caused by).
  • the method for preparing s iRNA is a method of directly synthesizing siRNA in vitro and then introducing it into a cell through a transfect ion process, and a s iRNA expression vector or PCR-derived siRNA prepared to express the s iRNA in the cell. There is a method of transforming or infecting an expression cassette into a cell. Determination of how to prepare siRNAs and introduce them into cells or animals may depend on the purpose of the experiment and the cell biological function of the target gene product.
  • the present invention provides an antisense nucleic acid molecule having a sequence complementary to the mRNA of the AIMP2-DX2-34S protein.
  • the term “antisense nucleic acid” refers to a nucleic acid that is complementary to a sequence of a specific mRNA. It refers to DNA or RNA containing a sequence or derivatives thereof, and has the characteristic of inhibiting the translation of mRNA into protein by binding to complementary sequences in the mRNA.
  • the antisense sequence of the present invention refers to a DNA or RNA sequence complementary to AIMP2-DX2-34S mRNA and capable of binding to AIMP2-DX2-34S mRNA, translation of AIMP2-DX2 mRNA, trans locat ion, May inhibit the essential activity of maturat i on or any other overall biological function.
  • the antisense nucleic acid has a length of 6 to 100 bases, preferably 8 to 60 bases, and more preferably 10 to 40 bases.
  • the antisense nucleic acid may be modified at one or more bases, sugars or backbone positions to enhance efficacy (De Mesmaeker et al, Curr Opin Struct Biol., 5 (3): 343-55, 1995).
  • the nucleic acid backbone can be modified with phosphorothioate, phosphoroester, methyl phosphonate, short chain alkyl, cycloalkyl, short chain heteroatomic, heterocyclic intersaccharide linkages and the like.
  • antisense nucleic acids may include one or more substituted sugar moieties.
  • Antisense nucleic acids can include modified bases.
  • Modified bases include hypoxanthine 6-methyladenine, 5-me pyrimidine (particularly 5-methylcytosine), 5-hydroxymethylcytosine (HMC), glycosyl HMC, gentobiosil HMC, 2-aminoadenin, 2-thiouracil, 2-thiothymine, 5-bromouracil, 5-hydroxymethyluracil, 8-azaguanine, 7 -deazaguanine, 6 (6-aminonucleosil) adenine, 2, 6-diaminopurine Etc.
  • the antisense nucleic acids of the present invention may be chemically combined with one or more moieties or conjugates that enhance the activity and cell adhesion of the antisense nucleic acids.
  • the antisense nucleic acid specific for AIMP2-DX2-34S of the present invention preferably includes a sequence complementary to the corresponding sequence of the junction site where exon 1 and exon 3 are linked to AIMP2-DX2 mRNA.
  • antisense RNA may be synthesized in vitro by a conventional method to be administered in vivo or to allow antisense RA to be synthesized in vivo. In vitro antisense
  • RNA polymerase I One example of synthesizing RNA is using RNA polymerase I.
  • MCS vectors with opposite origins of recognition sites
  • antisense RNA is preferably such that the translation stop codon is present in the sequence so that it is not translated into the peptide sequence.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for treating cancer comprising s iRNA or antisense nucleic acid specific for mRNA of the AIMP2-DX2-34S protein.
  • the present invention provides a use of the s iRNA or antisense nucleic acid for the manufacture of a cancer therapeutic agent.
  • the present invention provides a method for treating cancer, characterized in that the s iRNA or antisense nucleic acid is administered to an individual in need thereof.
  • the treatment of AIMP2-DX2 specific s iRNA increases the level of intracellular levels of AIMP2 that the functional disruption of AIMP2 caused by AIMP-DX2 expression induction is recovered. , It was confirmed that the phosphorylation of Sinad2 is induced.
  • AI P2-DX2 acts as a direct cause of cancer by disrupting the function of AIMP2.
  • intracellular AIMP2 or antisense nucleic acids specific to the mRNA of AIMP2—DX2 intracellular levels of AIMP2 are increased. As the function is restored, it is useful for cancer cell-specific cancer treatment.
  • the s iRNA or antisense nucleic acid specific for mRNA of the AIMP2-DX2-34S protein of the present invention binds to AIMP2-DX2 and inhibits the activity of AIMP2-DX2, thereby increasing its intracellular level of intracellular AIMP2. It has the effect of making it recover.
  • s iRNAs or antisense nucleic acids specific for the mRNA of the AIMP2-DX2-34S protein of the present invention can be used to treat all cancers caused by AIMP2-DX2 expression induction.
  • cancers include lung cancer, liver cancer, breast cancer, skin cancer, kidney cancer, osteosarcoma cancer and the like.
  • a pharmaceutical composition comprising one or more s iRNAs or antisense nucleic acids specific for mRNA of the AIMP2-DX2-34S protein may be added to inhibit the proliferation of cancer cells of a patient.
  • agents that promote the influx of siR A or antisense nucleic acid molecules for example liposomes (US Pat. Nos. 4,897,355, 4,394,448 > 4,235,8, 4,231,877, 4,224, 179, 4,753,788, 4, 673,567, 4,247,411, 4,814,270) or cholesteric one of many sterols including cholate and deoxycholic acid It can also be combined with a carrier.
  • Antisense nucleic acids can also be conjugated to peptides that are taken up by cells.
  • useful peptides include peptide hormones, antigens or antibodies and peptide toxins (Haralambid et al, WO 8903849; Lebleu et al, EP 0263740).
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered together with a pharmaceutically acceptable carrier, and upon oral administration, a binder, a lubricant disintegrant, an excipient, a solubilizer, a dispersant, a stabilizer, a suspending agent, a pigment, a perfume Injectables may be used in combination with a laxative, preservative, analgesic, solubilizing agent, isotonic and stabilizing agents. In the case of topical administration, bases, excipients, lubricants, preservatives, etc. may be used. Can be. Formulations of the pharmaceutical compositions of the present invention can be prepared in various ways in combination with the pharmaceutically acceptable carriers described above.
  • oral administration in the case of oral administration, it may be prepared in the form of tablets, troches, capsules, elylsir suspensions, syrup wafers, and the like, and in the case of injections, they may be prepared in unit dosage salt or multiple dosage forms.
  • the effective dosage range of siRNA or antisense nucleic acid specific for mRNA of AIMP2-DX2-34S protein contained in the pharmaceutical composition of the present invention can be varied by sex, severity, age, administration method, target cell, expression level, etc. It may vary depending on factors and can be easily determined by those skilled in the art.
  • compositions according to the invention are administered to humans and animals orally or parenterally, intravenously, subcutaneously, intranasally or intraperitoneally.
  • Parenteral administration includes injection and drip methods such as subcutaneous injection, intramuscular injection and intravenous injection.
  • Other pharmaceutical compositions of the present invention may be prepared according to techniques commonly used in the form of various formulations.
  • the term 'effective amount' refers to an amount that exhibits a therapeutic and prophylactic effect or a cancer metastasis suppression effect when administered to a patient.
  • the 'subject' refers to an animal, preferably a mammal, In particular, it may be an animal including a human, or may be cells, tissues, organs, etc. derived from the animal. The subject may be a patient in need of treatment.
  • step (a) the cell expressing the gene encoding the AIMP2-DX2-34S protein is expressed in cells expressing the AIMP2-DX2-34S protein or AIMP2-DX2-34S protein in its natural state. Possibly genetically engineered cells.
  • the 'genetic manipulation' refers to introducing an external gene (AIMP2—DX2-34S expression gene of the present invention) into a specific cell, and the genetic manipulation method is well known to those skilled in the art and is not limited thereto. It may be a conversion.
  • the expression of the AIMP2-DX2-34S gene may be measured at the mRNA or protein level. If it is desired to detect AI P2-DX2-34S mRNA expression, it can be carried out by RT-PCR, preferably using AIMP2-DX2-34S specific primers. If it is desired to detect AIMP2-DX2-34S protein expression, various immunoassay methods using AIMP2-DX2-34S-specific antibodies as described above can be performed by Western blot.
  • test substance screened through the steps (a) to (b) has the effect of inhibiting the gene expression of AIMP2-DX2-34S or promoting the degradation of AIMP2-DX2-34S protein, as well as AIMP2-DX2. Effect. That is, the test substance screened through (a) to (b) has the effect of inhibiting the gene expression of AIMP2-DX2 or promoting the degradation of AIMP2-DX2 protein.
  • the candidate test material selected in step with the cell expressing the gene encoding the AIMP2-DX2 protein to confirm the activity of AIMP2-DX2 can additionally be performed.
  • the 'cell expressing the gene encoding the AIMP2-DX2 protein' may preferably be a cancer cell.
  • the screening method of the anticancer agent is specifically
  • step (C) contacting the candidate test material selected in step (b) with a cell expressing a gene encoding the AIMP2-DX2 protein to confirm the activity of AIMP2-DX2.
  • a method for screening an anticancer agent that inhibits the expression of a gene encoding a protein or promotes the degradation of an AIMP2-DX2 protein is provided.
  • Confirming the activity of AIMP2-DX2 in step (c) means inhibiting the expression of a gene encoding AIMP2 ⁇ DX2 protein or promoting degradation of AIMP2-DX2 protein by the candidate test substance of step (c). Means to measure, as described above for the measurement method.
  • the AIMP2-DX2-34S protein of the present invention not only has the same activity as that of AIMP2-DX2, but also has high solubility without causing aggregate ions between the purified proteins. effective. Therefore, the mass-produced and purified AIMP2-DX2-34S protein is used for protein crystallization and X- ray crystallography to determine the three-dimensional structure of the AL P2-DX2-34S protein, which is a necessary step in the process of drug-based drug development. There is a possibility of industrial use because it can be used very usefully.
  • Figure 1 shows the chromatogram of the results of the first purification of the AIMP2-DX2-Trx protein from the supernatant obtained from the transformed cell lysate using FPLCXFast protein liquid chromatography.
  • the image inserted at the bottom left of the chromatogram shows the fract ion (chroma) of each of the recombinant proteins isolated through primary purification. It shows the result of electrophoresis for each fract ion in red on the horizontal axis of the togram (LT: loading through, 1 +: IPTG-induced E. coli samp le) Are all the same in the drawing).
  • FIG. 2 shows a chromatogram which appears when the silver separated chromatography loading solution is replaced during the process of secondary purification of the first isolated recombinant protein.
  • FIG. 3 shows the secondary of AIMP2-DX2-Trx protein using ion exchange chromatography from the first isolated recombinant protein (particularly 2 to 5 and 7 to 10 fract ions shown in the chromatogram of FIG. 2). Purification results are shown in chromatograms. The image inserted at the bottom left of the chromatogram is subjected to electrophoresis for each fract i on each of the recombinant proteins separated by secondary purification (the number ing for each fract ion in red on the chromatogram horizontal axis). One result is shown (I +: IPTG-induced E. coli sample).
  • FIG. 4 shows a third purification result of the AIMP2-DX2-Trx protein using size exclusion chromatography from the secondary isolated recombinant protein (particularly, 12 to 16 fract ions shown in the chromatogram of FIG. 3). Is shown in the chromatogram. The image inserted at the bottom left of the chromatogram shows the electrophoresis of each fract ion (number ing for each fract ion on the chromatogram horizontal axis in red) separated by tertiary purification. The results obtained are shown.
  • FIG. 5 is a graph illustrating the fourth purification result of AIMP2-DX2-Trx protein from the tertiary separated recombinant protein (particularly, 25 to 32 fract ions shown in the chromatogram of FIG. 4) by using easy exchange chromatography. It is expressed in grams.
  • the image inserted at the bottom left of the chromatogram shows the electrophoresis of each fract ion (number ing for each fract i on in red on the chromatogram horizontal axis) of the recombinant protein separated by the fourth purification. The results obtained are shown.
  • FIG. 6 shows chromatographic results of the 5th purification of AIMP2-DX2-Trx protein using size exclusion chromatography from the quarantined recombinant protein (especially 8 to 11 fract ions shown in the chromatogram of FIG. 5). It is expressed in grams.
  • the image inserted at the bottom left of the chromatogram performs electrophoresis on each fract ion (numbered for each fract ion in red color on the chromatogram horizontal axis) separated through the 5th purification. One result is shown.
  • FIG. 7 shows that the 5 th isolated recombinant protein was treated with thrombin, and then FPLC was used.
  • the first purification of the AIMP2-DX2 protein is shown as a chromatogram.
  • the image inserted in the upper right of the chromatogram shows the results of electrophoresis on each fract ion (numbered for each fract ion in red color on the chromatogram horizontal axis) separated through primary purification. Indicates.
  • FIG. 8 is a chromatogram showing the results of secondary purification of AIMP2-DX2 protein using size exclusion chromatography from the first isolated protein (specifically, 5 fract ions shown in the chromatogram of FIG. 7).
  • the image inserted at the bottom left of the chromatogram shows the results of electrophoresis on each fract ion (numbered for each fract ion in red on the chromatogram horizontal axis) separated through secondary purification. Indicates.
  • Figure 9 shows the results of the electrophoresis of the secondary isolated AIMP2-DX2 protein (same as the electrophoresis result of Figure 8,?: Secondary isolated AIMP2- newly obtained in the present invention) AIMP2-DX2-34S determined to mean DX2 protein).
  • FIG. 10 is a schematic diagram showing the gene insertion site in the AIMP2-DX2-34S protein cloning vector.
  • FIG. 12 is a chromatogram showing the results of the first purification of the AIMP2-DX2-34S protein using FPLC from the supernatant obtained from the cell lysate transformed with the AIMP2—DX2-34S protein.
  • the image inserted at the bottom left of the chromatogram performs electrophoresis on each fract ion (numbered for each fract ion in red on the chromatogram horizontal axis) of the recombinant protein separated by primary purification.
  • fract ion numbered for each fract ion in red on the chromatogram horizontal axis
  • FIG. 13 is a chromatogram showing the results of secondary purification of AIMP2-DX2-34S protein using size exclusion chromatography from the first isolated recombinant protein (see FIG. 12).
  • the image inserted on the left side of the chromatogram shows the results of electrophoresis on the peak fractions of each of the recombinant proteins separated through the secondary purification (indicated by 1, 2, 3 at each peak).
  • FIG. 14 is a chromatogram of the third purification result of the AIMP2-DX2-34S protein from the secondary isolated recombinant protein (see FIG. 13) using silver exchange chromatography. It is shown. The image inserted at the bottom left of the chromatogram shows the results of electrophoresis on the peak fractions of each of the recombinant proteins separated through tertiary purification (indicated by 1,2,3 at each peak).
  • FIG. 15 is a chromatogram showing the results of the fourth purification of the AIMP2-DX2-34S protein using size exclusion chromatography from the tertiary isolated recombinant protein (see FIG. 14).
  • the image inserted to the left of the chromatogram shows the peak fractions of each of the recombinant proteins separated by the 4th purification (1, 2 and 3 for each peak, and each fract ion in red on the chromatogram horizontal axis.
  • the results of electrophoresis on the numbering of the cells (M: Thermo SCIENTIFIC protein ladder) are shown.
  • Figure 16 shows the results of the analysis of the interaction (binding) between the p53 protein and AIMP2-DX2 or AIMP2-DX2-34S protein by the co-IP method (IP: immunoprecipitation, using anti- streptavidin antibody) , WCL: whole cell lysate, Mock: cells treated with transfect ion reagent without plasmid, + WT: introduction of Strep-AIMP2-DX2 expression plasmid, + 34S: introduction of Strep-AIMP2-DX2-34S expression plasmid) .
  • IP immunoprecipitation, using anti- streptavidin antibody
  • WCL whole cell lysate
  • Mock cells treated with transfect ion reagent without plasmid
  • + WT introduction of Strep-AIMP2-DX2 expression plasmid
  • + 34S introduction of Strep-AIMP2-DX2-34S expression plasmid
  • FIG. 17 shows the results of analyzing the interaction (binding) between p53 protein and AIMP2-DX2 ful l or AIMP2-DX2-34S protein by GST Pul l-down assay method (input: 5 of cel l lysate).
  • % As input EV: GST protein (GST-EV), experimental group incubated, p53: GST labeled p53 protein, experimental group incubated, strep: anti-streptavi din antibody).
  • FIG. 18 shows cell proliferation after 48 hours in each 293T cells overexpressing AIMP2-DX2 or AIMP2-DX2-34S (EV: empty vector).
  • AIMP2-DX2—Trx Two restriction enzyme sites were used to fusion to the AIMP2-DX2 protein to clone a highly expressed and soluble recombinant protein (AIMP2-DX2—Trx, SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6).
  • the recombinant protein AIMP2-DX2-Trx was transformed into Escherichia coli Rosetta2 (DE3) pLysS (Novagen) by thermal striatum, and cultured in LB medium containing empicillin (+50 m g / L). Colonies were selected. Using the selected colonies, seed culture for mass culture was inoculated into LB liquid medium containing empicillin (+50 mg / L) and proceeded at 37t: for 16 hours.
  • a part of the spawn culture was inoculated in the main culture LB medium containing 2% of empicillin, and when the OD 600 became 0.5 at 37 ° C, the temperature was lowered to 20 ° C for 20 minutes, and then 0.5 mM Expression of the recombinant protein was induced by IPTG (Isopropyl-beta-D-thiogalactoside). The expression-induced main culture was incubated until 2 (C at 0D 600 did not change (about 16 hours), and then centrifuged at 6000 g at 4 ° C for 10 minutes to recover the cell precipitate.
  • IPTG Isopropyl-beta-D-thiogalactoside
  • the recovered cell precipitate was subjected to crushing solution [35mM Imidazole, 500mM NaCl, 20mM Tris-
  • Protein purity was confirmed by electrophoresis during each step of purification. Specifically, the protein samples were purified to 10 ⁇ 5X SDS (10% w / v SDS, lOmM beta-mercaptoethanol, 25% Glycerol, 0.2 ⁇ Tris-HCl 6.8, 0.05% w / v Bromophenolblue). Mix at a ratio of 4: 4 and boil at 100 ° C for 5 minutes. The boiled sample was loaded into 12% SDS-PAGE (sodium dodecyl sul fate-polyacrylamide gel electrophoresis), developed at 100V for 10 minutes, developed at 200V for 40 minutes, stained by Coomassie staining, and decolorized to obtain protein purity. It was confirmed (in the following examples, the method of confirming protein purity through electrophoresis is the same). ⁇ 267>
  • AIMP2-DX2 protein was isolated by using a truncation site between AIMP2-DX2 protein and Thioredoxin.
  • the thrombin treatment reaction was carried out for 2 hours in real time using Thrombin Kits (Novagen). Reaction conditions were performed by mixing 1.75ml of 10X thrombin cleavage solution, 1.5ml of recombinant AIMP2-DX2—Trx protein (3.75mg), 350ul of 200-fold distilled thrombin and 14ml of distilled water.
  • the binding buffer consists of 20mM Tris-HCl (pH7.5), 500mM NaCl, 35mM Imidazole.
  • the loaded column was connected to FPLCXGE Healthcare) and AIMP2 with 50% elution (15 min at 1 ⁇ 2 l / min) using eluent [1M Imidazole, 500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH7.5)].
  • -DX2 protein and Thioredoxin were isolated (see Figure 7).
  • Thioredoxin-free AIMP2-DX2 protein was nickel-layered.
  • ⁇ 284> recombinant protein AIMP2-DX2-34S was isolated from E. coli Rosetta2 (DE3) pLysS (Novagen),
  • BL21-CodonP 1 us (DE3) -RI PL (St rat agene), C43 (DE3) (Lu gen) was transformed by thermal striae method and cultured in LB medium containing kanamycin (+30 mg / L) Colonies with kanamycin resistance were selected. Selected colonies were inoculated into LB medium containing kanamycin (+30 mg / L) and incubated at 37 ° C. for 16 hours. In order to determine the expression and solubility of recombinant proteins in different Escherichia coli, a small amount of culture (5 mL) was performed.
  • Part of the spawn culture was inoculated in LB medium containing kanamycin (2%), and the expression of recombinant protein was induced by 0.5 mM IPTG (Isopropyl-beta-D-thiogalactoside) when 0D 600 became 0.5 at 37 ° C. (induct ion).
  • IPTG Isopropyl-beta-D-thiogalactoside
  • the expression-induced main culture was incubated at 37 ° C for 4 hours and then subjected to expression and solubility experiments.
  • the bacterial precipitate was crushed by using B-PER (Thermo SCIENTIFIC) protein extraction reagent, and the expression and solubility were confirmed by electrophoresis.
  • Recombinant protein AIMP2-DX2-34S was found to be the most expressed and soluble in E.
  • Recombinant AIMP2-DX2-34S a portion of the seed culture medium for mass production of protein in the car or the azithromycin containing the culture LB medium () 37 ° C was inoculated in time the 0D 600 is a 0.5, 20 ° C Incubate for 20 minutes by lowering the temperature to 5 mM IPTGdsopropyl-. beta-D-thiogalactoside) was used to induce the expression of the recombinant protein. The expression-induced main culture was incubated at 20 ° C until 0D 600 did not change (about 16 hours), and centrifuged at 6000 g at 4 ° C for 10 minutes to recover the cell precipitate.
  • the recovered cell precipitate is suspended in a crushing solution [35 mM Imidazole, 500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH7.5) I lysis solution per lg of bacteria 10 mL], and lOOmM PMSF (Pheny 1 me t hy 1 su 1 f ony 1 100 uL of lOOmM PMSF per lg of Fluoride I cells) and Protease inhibitor cocktail (lOOuL per 20g of Calbiochem I cells) were added and then disrupted using an ultrasonic crusher (SONICS). After crushing, the supernatant was separated by centrifugation at 18000 rpm for 50 minutes at 4 ° C., and the supernatant was filtered using 0.45um nitrocellulose membrane filter (MILLPORE).
  • MILLPORE 0.45um nitrocellulose membrane filter
  • -AIMP2-DX2-34S Primary Purification: The filtered supernatant was loaded onto a NiT layered HiTrap Chelating HP (GE Healthcare) column using Pump P-KGE Healthcare). Binding buffer consisted of 35mM Imidazole, 500mM NaCl, 20mM Tr is-HCKpH7.5). The loaded column was connected to FPLC (GE Healthcare) and 5% eluent [1M Imidazole, 500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH7.5)] was treated with 1 ⁇ 2 l / min to remove E. coli protein. 40 The recombinant protein was isolated and purified by% gradient elution method (20 min) (see FIG. 12).
  • Recombinant protein separated by second volume was subjected to HiTrap after dilution with loading solution [50 mM HEPES (pH8.0)] in 1: 1 ratio for ion exchange chromatography. Loading on SP HP column (GE Healthcare). As a binding buffer, 50 mM HEPES (pH 8.0) was used. In order to separate the recombinant protein in a third step, the recombinant protein was purified using an elution solution [1M NaCl, 50 mM HEPES (pH8.0)] using a 40% elution method (20 m in at 4 ml / min). (See Figure 14).
  • AIMP2-DX2-34S protein prepared in Example 2 has the same activity as the original AIMP2-DX2 full sequence protein (hereinafter, denoted as AIMP2-DX2 full). The experiment was performed.
  • Plasmids expressing HA labeled p53 protein (hereinafter designated HA-p53)
  • 293T cells were transfected with (addgene), and the strep-AIMP2-DX2 Full or strep-AIMP2-DX2 34S labeled with Streptavidine was overexpressed in 293T cells overexpressed HA-p53.
  • the lysate was immunoprecipitation using a strepant i body (iba, Cat. No. 2-1509-001).
  • the precipitated protein was isolated using SDS-PAGE.
  • Precipitated HA-p53, bound strep-AIMP2-DX2 Full or 34S protein was confirmed by Western blot using HA antibody, strepant i body (iba).
  • the AIMP2-DX2-34S protein of the present invention also binds to the p53 protein as well as the AIMP2-DX2 full protein.
  • GST protein (labeled GST-EV, GE Healthcare) or GST labeled p53 protein (hereinafter referred to as GST-p53 protein) was overexpressed with strep-AIMP2-DX2 Full or strep-AIMP2-DX2 34S labeled with Streptavidine Incubation with cell lysate for 4 hours. After incubation, GST protein was precipitated using Glutathione sepharose 4B (GE Heathcare, Cat. No. 17-0756-01) in each sample. Precipitated protein was isolated using SDS-PAGE.
  • the strep-AIMP2-DX2 Full or strep-AIMP2-DX2-34S protein bound to GST protein was confirmed by Western blot using strep ant i body (iba, Cat. No. 2- 1509-001). GST protein was identified by coomassie staining. ⁇ 306>
  • the AIMP2-DX2-34S of the present invention is inherent.
  • AIMP2-DX2 Ful 1 At the same level as AIMP2-DX2 Ful 1, it was confirmed that cells proliferate. This is consistent with the fact that AIMP2-DX2 competes with AIMP2, inhibiting the proliferation of normal cells and inhibiting the combination of p53 and AIMP2, which induces cancer cell death.
  • Example 3 confirmed that AIMP2-DX2-34S of the present invention has biologically the same activity as AIMP2-DX2 Ful 1.
  • the present invention relates to an AIMP2-DX2-34S protein and a method for preparing the same, and more specifically, to an AIMP2-DX2-34S protein having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, the AIMP2-DX2-34S
  • a method for preparing the AIMP2-DX2-34S protein comprising culturing a nucleic acid molecule encoding a protein, a recombinant vector comprising the nucleic acid molecule, a transformed microorganism transformed with the recombinant vector, and the transforming microorganism, AIMP2—Relates to their use in the development of antibodies and drugs specific to DX2-34S proteins.
  • the AIMP2-DX2-34S protein of the present invention not only has the same activity as that of AIMP2-DX2, but also has high solubility without causing aggregate ions between the purified proteins. Very effective. Thus the mass production and purification The resulting AIMP2-DX2-34S protein can be very useful for the three-dimensional structure determination of AIMP2-DX2-34S protein by ⁇ -ray crystallography and protein crystallization, which is a necessary step in the structure-based drug development process. There is industrial potential.

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Abstract

본 발명은 AIMP2-DX2-34S 단백질 및 이의 제조방법에 관한 것으로， 좀 더 상세하게 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 AIMP2-DX2-34S 단백질, 상기 AIMP2-DX2-34S 단백질을 코딩하는 핵산 분자， 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환 미생물, 상기 형질전환 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 상기 AIMP2-DX2-34S 단백질 제조 방법, 상기 AIMP2-DX2-34S 단백질에 특이적인 항체 및 신약개발에 있어서 이들의 이용방법에 관한 것이다. 본 발명의 AIMP2-DX2-34S 단백질은 AIMP2-DX2와 동일한 활성을 가질뿐만 아니라, 정제된 단백질 이의 웅집 (aggregation)이 일어나지 않고 높은 용해성을 가지기 때문에 단백질의 대량생산에 매우 효과적이다. 따라서 상기 대량생산 및 정제된 AIMP2-DX2-34S 단백질은， 구조에 근거한 신약개발 과정에 필요한 단계인 단백질 결정제작 및 X-ray 크리스탈로그라피에 의한 AIMP2-DX2-34S 단백질의 3차원 구조 결정에 있어 매우 유용하게 사용될 수 있으므로 산업상 이용 가능성이 있다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
AIMP2-DX2-34S 단백질 및 이의 제조방법 【기술분야】
<ι> 본 출원은 2014년 05월 15일에 출원된 대한민국 특허출원 제 10-2014-0058634 호를 우선권으로 주장하고, 상기 명세서 전체는 본 출원의 참고문헌이다.
<2>
<3> 본 발명은 AIMP2-DX2-34S 단백질 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 좀 더 상 세하게 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 AIMP2-DX2-34S 단백질， 상기 AIMP2- DX2-34S 단백질을 코딩하는 핵산 분자， 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 백터， 상기 재조합 백터로 형질전환된 형질전환 미생물, 상기 형질전환 미생물을 배양하 는 단계를 포함하는 상기 AIMP2-DX2-34S 단백질 제조 방법, 상기 AIMP2-DX2-34S 단 백질에 특이적인 항체 및 신약개발에 있어서 이들의 이용 방법에 관한 것이다.
<4>
【배경기술】
<5> AIMP2(ARS-interact ing mul t i-funct ional protein 2)는 아미노아실 -tRNA 합 성효소 복합체 (Aminoacyl-tRNA synthetase: ARSs)의 형성에 관련된 단백질 중의 하 나로, p38/JTV-l 또는 p38로 불려지기도 한다. AIMP2가 신규한 암 억제자 (tumor suppressor)로 Smad2/3과 직접적 상호작용을 통하여 TGF-β의 신호전달을 강화시키 는 기능을 함이 알려져있다.
<6>
<?> 본 발명자에 의한 등록특허 10-0762995 에는 암 세포주 및 조직에서 AIMP2의 엑손 2가 결손된 형태의 변이체인 AIMP2-DX2가 특이적으로 발현되는 것이 공지되어 있다. 본 발명자는 AIMP2-DX2-형질전환된 세포에서는 TGF-β와 상관없이 AIMP2 수 준이 극적으로 감소되는 것으로 AIMP2-DX2 생성이 AIMP2 활성의 상실을 초래하는 것을 확인하였으며， 실제로 세포 내로 AIMP2-DX2를 형질전환시킨 결과 c-myc 발현 을 증가시키고 AIMP2의 핵 이동을 막고 세포 성장을 정지시키는 등의 TGF-β 신호 의 이상-기능이 초래되었다. AIMP2-DX2는 AIMP2와 불활성형의 헤테로다이머를 형성 하고， 이는 암 형성과 진행에 밀접하게 연관되어 있음을 입증하였다. 이러한 AIMP2-DX2의 생성은 폐암， 간암， 피부암， 유방암, 신장암， 골육종 등의 다양한 암 에서 관측되었다. <8>
<9> 또한 본 발명자의 기출원 (출원번호 10-2008-0111109)에서는 AIMP2가 TRAF2를 매개로 하여 TNF- α의 세포사멸활성 (apopt ot ic act ivi ty)을 매개하고, 이 활성은 AIMP2-DX2에 의해 조절된다는 것으로 처음으로 규명하였다. 아울러, AIMP2-DX2는 염증 마커인 Cox-2의 발현에도 영향을 미친다는 점을 규명하였다. 따라서 액손 2가 결여된 AIMP2 변이체 (AIMP2-DX2) 폴리펩티드의 억제제를 유효성분으로 포함하는 조 성물이 염증성 질환의 예방 및 치료의 목적으로 사용될 수 있음이 공지되어있다. <ιο> 상기한 바와 같이， AIMP2-DX2 단백질과 다양한 질환들 (예를 들어， 다양한 종 류의 암， 염증성 질환 등) 사이의 연관성이 밝혀짐에 따라, AIMP2-DX2가 신약개발 의 새로운 표적물질로 제시되고 있다. 따라서 상기 AIMP2-DX2 단백질 3차 구조를 밝히면， 단백질구조기반 신약개발 (protein structurebased drug des ign)의 출발점 을 제공할 수 있을 것으로 기대를 모으고 있다.
<π>
<12> 그러나 AIMP2-DX2 단백질은 물에 대하여 낮은 용해도를 가지며, 통상적인 단 백질 대량생산 방법으로 쓰이는 유전자 클로닝을 통한 단백질 정제 방법으로 AIMP2-DX2 단백질을 수득하고자 할때에 단백질들 간에 웅집 (aggregaion)현상이 일 어나 단백질 3차 구조 연구를 위한 단백질 결정화 (protein crystal 1 i zat ion)가 어 려웠다. 그 결과로 기질 혹은 반웅산물이 결합된 단백질 3차 구조에 대한 정보가 없어서 단백질구조기반 신약개발 연구에 어려움이 있었다.
<13>
<14> 또한 최근 들어, NMR (Nuclear magnet ic resonance spectroscopy)을 사용하 여 신약을 개발하고자 하는 시도가 늘고 있으나 (P. J . Hajduk, J . Greer , Nat . Rev. Drug Di scovery 6 , 211 (2007) ) , 불용성 단백질의 경우에는 단백질의 수용성 화가 선행되어야하므로 NMR을 사용한 분석이 용이하지 않아 신약 개발에 있어 어려 움이 드러나고 있다. AIMP2-DX2 단백질의 경우에도 단백질의 수용성화가 선행되어 야 NMR을 이용한 신약개발이 가능하나 AI P2-DX2 단백질의 수용성화 (solubi l i zat ion)에 대한 연구에 대한 결과보고가 미미한 상황이다. AIMP2-DX2 단 백질의 구조가 밝혀지면 그 구조를 바탕으로 신약 디자인을 효율적이고 신속하게 진행할 수 있으며, 따라서 상기 AIMP2— DX2 단백질을 이용한 제약 및 신약개발 분야 에서 경쟁력을 선점할 수 있는 계기가 될 것이다.
<15>
【발명의 상세한 설명】 【기술적 과제】
<16> 이에 본 발명자는 AIMP2-DX2 활성 억제를 표적으로 하는 신약개발을 위한 가 장 기초적인 단계로서 AIMP2-DX2 단백질을 대량으로 발현하고자 연구하던 중， 상기 단백질의 1 내지 33번째 아미노산 잔기가 제거된 형태의 AIMP2-DX2-34S 단백질이 응집 ( aggregat i on)되지 않고 높은 용해성을 보이며 AIMP2-DX2와 활성이 동일함을 확인하고， 본 발명을 완성하게 되었다.
<17>
<18> 따라서 본 발명의 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 AIMP2-DX2-34S 단백질을 제공하는 것이다.
<19>
<20> 본 발명의 다른 목적은 AIMP2-DX2-34S 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 제공 하는 것이다.
<21>
<22> 본 발명의 또 다른 목적은 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 백터를 제공하 는 것이다.
<23>
<24> 본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합백터로 형질전환된 형질전환 미생물을 제공하는 것이다.
<25>
<26> 본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환 미생물을 배양하는 단계를 포함하 는 상기 AIMP2-DX2-34S 단백질 제조 방법을 제공하는 것이다.
<27>
<28> 본 발명의 또 다른 목적은 상기 AIMP2-DX2-34S 단백질에 특이적인 항체를 제 공하는 것이다.
<29>
<30> 본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체를 포함하는 암 진단키트를 제공하는 것 이다.
<31>
<32> 본 발명의 또 다른 목적은 ( a) 분석할 시료를 제공하는 단계; 및 (b) 상기 시료를 상기 AIMP2ᅳ DX2-34S 단백질에 특이적인 항체와 접촉시키는 단계를 포함하 는, AIMP2-DX2를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
<33> <34> 본 발명의 또 다른 목적은 상기 AIMP2-DX2-34S 단백질의 mRNA에 특이적인 siRNA 핵산 분자를 제공하는 것이다.
<35>
<36> 본 발명의 또 다른 목적은 상기 AIMP2-DX2-34S 단백질의 mRNA에 상보적인 서 열을 갖는 안티센스 핵산 분자를 제공하는 것이다.
<37>
<38> 본 발명의 또 다른 목적은 상기 s iRNA 핵산 분자 또는 안티센스 핵산 분자를 포함하는 암을 치료하기 위한 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
<39>
<40> 본 발명의 또 다른 목적은 상기 s iRNA 핵산 분자 또는 안티센스 핵산 분자의 암 치료제 제조를 위한 용도를 제공하는 것이다.
<41>
<42> 본 발명의 또 다른 목적은 상기 siRNA 핵산 분자 또는 안티센스 핵산 분자를 이를 필요로하는 개체에 유효량으로 투여하는 것을 특징으로 하는 암 치료 방법을 제공하는 것이다.
<43>
<44> 본 발명의 또 다른 목적은 (a) 시험물질을 상기 AIMP2-DX2-34S 단백질을 코 딩하는 유전자를 발현하는 세포와 접촉시키는 단계 및 (b) 시험물질에 의한 AIMP2- DX2-34S 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 억제 또는 AIMP2-DX2-34S 단백질의 분해 촉진을 측정하는 단계를 포함하여， AIMP2-DX2 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 억제 또는 AIMP2-DX2 단백질의 분해를 촉진 하는 항암제를 스크리닝하는 방법을 제 공하는 것이다.
<45>
<46> 본 발명의 또 다른 목적은 ( a ) 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 발현 백터를 제조하는 단계; (b) 상기 (a) 단계의 발현 백터로 대 장균을 형질전환 시키고 배양하는 단계; (c) 상기 (b) 단계에서 배양된 대장균을 파쇄하여 AIMP2-DX2-34S 단백질을 수득하는 단계를 포함하는, AIMP2-DX2-34S 단백 질의 대량생산 방법을 제공하는 것이다.
<47>
【기술적 해결방법】
<48> , 상기의 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 AIMP2-DX2-34S 단백질을 제공한다. <49>
<50> 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 AIMP2-DX2-34S 단백질을
코딩하는 핵산 분자를 제공한다.
<51>
<52> 본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 핵산 분자를 포 함하는 재조합 백터를 제공한다.
<53>
<54> 본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 재조합백터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.
<55>
<56> 본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는 상기 AIMP2-DX2-34S 단백질 제조 방법을 제공한다.
<57>
<58> 본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 AIMP2-DX2-34S 단백질에 특이적인 항체를 제공한다.
<59>
<60> 본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 항체를 포함하 는 암 진단키트를 제공한다.
<61>
<62> 본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여 , 본 발명은 ( a ) 분석할 시료를
제공하는 단계; 및 (b) 상기 시료를 상기 AIMP2-DX2-34S 단백질에 특이적인 항체와 접촉시키는 단계를 포함하는 AIMP2-DX2를 검출하는 방법을 제공한다ᅳ
<63>
<64> 본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 AIMP2-DX2-34S 단백질의 mRNA에 특이적인 s iR A 핵산 분자를 제공한다.
<65>
<66> 본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 상기 AIMP2-DX2-34S 단백질의 mRNA에 상보적인 서열을 갖는 안티센스 핵산 분자를 제공한다.
<67>
<68> 본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 상기 s iRNA 핵산 분 자 또는 안티센스 핵산 분자를 포함하는 암을 치료하기 위한 약제학적 조성물을 제 공한다. <69>
<70> 본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 상기 s iRNA 핵산 분 자 또는 안티센스 핵산 분자의 암 치료제 제조를 위한 용도를 제공한다.
<71 >
<72> 본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 s iRNA 핵산 분 자 또는 안티센스 핵산 분자를 이를 필요로하는 개체에 유효량으로 투여하는 것을 특징으로 하는 암 치료 방법을 제공한다.
<73>
<74> 본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 ( a ) 시험물질을 상기
AIMP2-DX2-34S 단백질을 코딩하는 유전자를 발현하는 세포와 접촉시키는 단계 및 (b) 시험물질에 의한 AIMP2-DX2-34S 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 억제 또는 AIMP2-DX2-34S 단백질의 분해 촉진을 측정하는 단계를 포함하여， AIMP2-DX2 단백질 을 코딩하는 유전자의 발현을 억제 또는 AIMP2-DX2 단백질의 분해를 촉진 하는 항 암제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.
<75>
<76> 본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 ( a ) 서열번호 1의 아 미노산 서열을 코딩하는 핵산분자를 포함하는 발현 백터를 제조하는 단계; (b) 상 기 ( a ) 단계의 발현 백터로 대장균을 형질전환 시키고 배양하는 단계; ( c ) 상기 (b) 단계에서 배양된 대장균을 파쇄하여 AIMP2-DX2-34S 단백질을 수득하는 단계를 포함하는, AIMP2-DX2-34S 단백질의 대량생산 방법을 제공한다.
<77>
<78> 이하 본 발명을 상세히 설명한다.
<79>
<80> 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 AIMP2-DX2-34S 단백질을 제공
한다ᅳ
<81>
<82> 상기 'AIMP2-DX2-34S 단백질' 은 서열번호 3으로 표시되는 AIMP2-DX2 단백질 에서 1 내지 33번째 아미노산 잔기가 제거된 단백질로서 34번째 세린 ( ser in, ser) 아미노산부터 시작되는 아미노산 서열을 가지며, 바람직하게 서열번호 1의 아미노 산서열을 가진다.
<83> 상기 AIMP2-DX2 단백질은 AIMP2 단백질 서열 중 엑손 2의 영역이 결실된 변 이체를 의미하는 것으로， 본 발명자에 의한 대한민국등록특허 10-0762995에서 암과 의 관련성이 보고되어, 다양한 암의 진단 및 치료에 이용될 수 있음이 공지되어있 다. 또한 본 발명자의 기출원 (출원번호 10-2008-0111109)에서는 AIMP2-DX2는 염증 마커인 Cox—2의 발현에도 영향을 미침이 규명되어， AIMP2-DX2와 염증성 질환과의 상관관계가 공지된 바 있다. 상기한 바와 같이， AIMP2-DX2 단백질과 다양한 질환들 (예를 들에 다양한 종류의 암， 염증성 질환 등) 사이의 연관성이 밝혀짐에 따라, AIMP2-DX2가 신약개발의 표적물질이 되고 있다.
<84> 그러나 AIMP2-DX2 단백질은 물에 대하여 낮은 용해도를 가지며， 통상적인 단 백질 대량생산 방법으로 쓰이는 유전자 클로닝을 통한 단백질 정제 방법으로 AIMP2-DX2 단백질을 수득하고자 할때에 단백질들 간에 웅집 (aggregaion)현상이 일 어나 단백질 3차 구조 연구를 위한 단백질 결정화 (protein crystal l i zat ion)가 어 려웠다. 그 결과로 기질 혹은 반웅산물이 결합된 단백질 3차 구조에 대한 정보가 없어서 단백질구조기반 신약개발 연구에 어려움이 있었다.
<85>
<86> 이에， 본 발명의 AIMP2-DX2-34S 단백질은 상기 기존 AIMP2-DX2 단백질 대량 생산시에 문제점을 해결하였다. 즉, AIMP2-DX2-34S 단백질은 AIMP2-DX2와 동일한 활성을 가질뿐만 아니라, 정제된 단백질 사이의 웅집 (aggregat ion)일 일어나지 않 고 높은 용해성을 가지기 때문에 단백질의 대량생산에 매우 효과적이다. 따라서 상 기 대량생산 및 정제된 AI P2-DX2-34S 단백질은， 구조에 근거한 신약개발 과정에 필요한 단계인 단백질 결정제작 및 X-ray 크리스탈로그라피에 의한 AIMP2-DX2-34S 단백질의 3차원 구조 결정에 있어 매우 유용하게 사용될 수 있다.
<87>
<88> 이는 본 발명의 명세서 실시예에 잘 나타나있다.
<89>
<90> 본 발명의 실시예에서는 Human AIMP2-DX2 단백질의 과발현 및 높은 용해성 단백질을 얻기 위하여, pET-32a 백터에 융합되어 있는 Thioredoxin(Trx)을 AIMP2- DX2 단백질에 융합시켜 AIMP2-DX2-Trx 융합 단백질 (서열번호 5)을 클로닝하였다. 상기 재조합 단백질인 AIMP2-DX2-Trx를 대장균에 형질전환하고 균체 대량 배양 및 파쇄하여 여러 단계에 걸쳐 단백질을 정제하였다. 그리고 상기 단백질 정제를 통해 수득된 AIMP2-DX2-Trx에서 Thioredoxin을 제거하여 AIMP2-DX2를 새롭게 분리하였 다. 상기 새롭게 분리된 AIMP2-DX2는, N-말단 아미노산 서열분석 결과 본래 AIMP2- DX2 단백질 (서열번호 3)의 34번째 세린 (Ser ,S)부터 시작하는 새로운 재조합 단백질 인 것을 확인하였고， 본 발명자는 이를 AIMP2-DX2-34S (서열번호 1)로 명명하였다. 상기 AIMP2-DX2-34S를 대장균에 형질전환하여 균체 대량 배양 및 파쇄하여 단백질 을 정제하였다. 그 결과 4단계의 정제과정을 통해 순도 99% 이상의 재조합 AIMP2- DX2-34S 단백질을 대량생산하는 것이 가능했으며， 제조된 단백질 상호간에 웅집되 지 않았을 뿐만아니라 높은 용해성을 가짐을 확인하였다.
<91>
<92> 또한 본 발명의 AIMP2-DX2-34S 단백질은 공지의 검출방법에 사용되는 표지물 질등을 추가로 부착할 수 있는데， 바람 직하게는 1개 내지 10개의 히스티딘 (Hist idine)으로 이루어진 펩타이드 단편 즉, Hi s-태그를 사용할 수 있다. 가장 바 람직하게 6개의 히스티딘으로 이루어진 펩타이드 단편이 부착되는 것일 수 있다.
<93> 상기에서 히스티딘 잔기는 재조합 단백질을 발현시킨 후 정제시 필요한 꼬리 표 ( tag)로 가장 많이 이용되는 tag증 하나로， 특이성 (speci f ici ty)이 높아야 하고 원하는 단백질의 구조에 영향을 최대한 적게 주어야 한다. 바람직하게는 Hi st idine 이 1개 내지는 10개가 연속으로 오는 pept ide로 구성될 수 있는데， si ze가 작고 원 래의 protein 구조에 영향도 별로 주지 않기 때문에 재조합 단백질을 만든 후 따로 잘라주지 않아도 된다는 편의성이있다. tag은 vector의 종류에 따라 target protein의 N-terminus (앞쪽) Oterminus (뒤쪽) 어느 쪽에도 만들 수 있고, 단백질 의 구조의 영향을 주는 것에 따라 앞 또는 뒤쪽을 결정할 수 있다.
<94>
<95> 또한 본 발명의 AIMP2-DX2-34S 단백질은 이의 천연형 아미노산 서열을 갖는 단백질뿐만 아니라 이의 아미노산 서열변이체가 또한 본 발명의 범위에 포함된다. AIMP2-DX2-34S 단백질의 변이체란 AIMP2-DX2-34S 천연 아미노산 서열과 하나 이상 의 아미노산 잔기가 결실， 삽입， 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 단백질을 의미한다. 분자의 활성을 전체적으로 변경 시키지 않는 단백질 및 펩티드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다 (H.Neurath, R.L.Hi l l , The Proteins , Academic Press , New York, 1979) . 가장 통 상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser , Val/I le, Asp/Glu, Thr/Ser , Ala/Gly, Ala/Thr , Ser/Asn,Ala/Val , Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro , Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/I le , Leu/Val , Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.
<96> 경우에 따라서는 인산화 (phosphorylat ion) , 황화 (sul fat ion) , 아크릴화
(acrylat ion) , 당화 (glycosylat ion) , 메틸화 (methylat ion)， 파네실화 (farnesylat ion) 등으로 수식 (modi f i cat ion)될 수도 있다.
<97> 상기 AIMP2-DX2-34S 단백질 또는 이의 변이체는 천연에서 추출하거나 합성 (Merrifleld, J. Amer. chem. Soc..85:2149-2156, 1963) 또는 DNA 서열을 기본으로 하는 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다 (Sambrook et al, Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, USA, 2판， 1989). 유전자 재조 합 기술을 이용할 경우， AIMP2-DX2-34S를 코딩하는 핵산을 적절한 발현 백터에 삽 입하고, 재조합 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체에서 AIMP2-DX2-34S가 발현되도 록 숙주 세포를 배양한 뒤， 형질전환체로부터 AIMP2-DX2-34S를 회수하는 과정으로 수득할 수 있다.
<98>
<99> 따라서 본 발명은
<ioo> (a) 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산분자를 포함하는 발현 백터 를 제조하는 단계;
<ioi> (b) 상기 (a) 단계의 발현 백터로 대장균을 형질전환 시키고 배양하는 단계;
<i02> (c) 상기 (b) 단계에서 배양된 대장균을 파쇄하여 AIMP2-DX2-34S 단백질을 수득하는 단계를 포함하는， AIMP2-DX2-34S 단백질의 대량생산 방법을 제공한다.
<103>
<104> 또한, 본 발명은 AIMP2-DX2-34S 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.
<105>
<106> 상술한 바와 같은 AIMP2— DX2-34S 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 이와 동등 한 활성을 갖는 단백질을 코딩하는한, 하나 이상의 핵산 염기가 치환 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있다. 상기한 서열번호 1의 AIMP2-DX2-34S 단 백질은 바람직하게는 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산 분자에 의해 코딩된다. 이러한 핵산 분자의 서열은 단쇄 또는 이중쇄일 수 있으며, DNA 분자 또 는 RNA(mRNA) 분자일 수 있다.
<107>
<108> 본 발명의 AIMP2-DX2-34S 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 천연에서 분리되 거나 인위적으로 합성 또는 유전적 재조합방법을 통하여 제조할 수 있다. 본 발명 의 AIMP2-DX2-34S 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 이를 발현할 수 있는 백터에 작 동적으로 연결시켜 AIMP2-DX2-34S 단백질을 제공할 수 있다.
<109>
<110> 본 발명은 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 백터를 제공한다.
<111>
<112> 본 발명에서 용어, "재조합 백터" 란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질 또 는 목적 RNA을 발현할 수 있는 백터로서， 유전자 삽입물이 발현되도톡 작동가능하 게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다.
<1 13>
<ι ΐ4> 본 발명에서 용어， "작동가능하게 연결된 (operably l inked) "는 일반적 기능 을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결 (funct ional l inkage)되어 있는 것을 말한다. 예를 들어 프 로모터와 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결되어 코딩하 는 핵산 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 재조합 백터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며， 부위- 특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소등을 사용 한다.
<1 15>
<1 16> 본 발명의 백터는 플라스미드 백테 코즈미드 백터， 박테리오파아지 백터 및 바이러스 백터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적합한 발현백터는 프로모 터， 오퍼레이터， 개시코돈， 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 백터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한 발현백터는 백터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커를 포함하고， 복제 가능한 발현백터인 경우 복제 기원을 포함한다.
<117>
<U 8> 시그널 서열에는 숙주가 에쉐리키아속균인 경우에는 PhoA 시그널 서열，
OmpA 시그널 서열 등이， 숙주가 바실러스속균인 경우에는 a -아밀라아제 시그널 서 열， 서브틸리신 시그널 서열 등이, 숙주가 효모인 경우에는 MF a 시그널 서열， SUC2 시그널 서열 등이， 숙주가 동물세포인 경우에는 인슬린 시그널서열, a -인터 페론 시그널 서열,항체 분자 시그널 서열 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
<1 19>
<120> 본 발명은 상기 재조합백터로 형질전환된 형질전환 미생물을 제공한다.
<121>
<122> 형질전환은 핵산을 유기체， 세포， 조직 또는 기관에 도입하는 어떤 방법도 포함되며， 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주 세포에 따라 적합한 표준 기술을 선 택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 전기충격유전자전달법 (electroporat ion) , 원형질 융합, 인산 칼슘 (CaP04) 침전， 염화 칼슘 (CaCl2) 침전, 실리콘 카바이드 섬 유 이용한 교반， 아그로 박테리아 매개된 형질전환, PEG , 덱스트란 설페이트， 리포 펙타민, 열층격법 등이 포함되나 이로 제한되지 않는다.
<123>
<124> 숙주세포에 따라서 단백질의 발현량과 수식 등이 다르게 나타나므로 당업 자가 목적하는 바에 가장 적합한 숙주세포를 선택하여 사용할수 있으며 이에 제한 되지 않으나, 예를들어 숙주세포로는 에스케리치아 콜라이 (대장균， Escherichia col , 바실러스 서브틸리스 0¾c///ys subtil is) , 스트렙토마이세스 { Streptomyces) , 슈도모나스 (/¾ei7G½702as)， 프로테우스 미라빌리스 (/ o s mirabilis) 또는 스타필로코쿠스 ( 5 ap/?y/ococras)와 같은 원핵 숙주 세포일 수 있 다. 또한, 진균 (예를 들어, 아스페르길러스 C4spe/¾ 7/i;s) ) , 효모 (예를 들어, 피치 아 파스토리스 (/Y /a pastor is) , 사카로마이세스 세르비지애 ( S c ¾aroz?yces cerevisiae) , 4=1 i ( Schi zosaccharomyces) , 뉴로스포라크라 ]· (Neurospora crassa) )등과 같은 하등 진핵 세포, 곤층 세포, 식물 세포, 포유동물 등을 포함하는 고등 진핵생물 유래의 세포를 숙주세포로 사용할 수 있으몌 이에 제한되지 않는다.
<125> 본 발명의 형질전환 미생물은 바람직하게 에스케리치아 콜라이 (대장균,
Escherichia co//)일 수 있다. 상기 본 발명의 에스케리치아 콜라이 균주로는 이에 제한되지 않으나, 예를 들어 Roset ta2(DE3)pLysS , BL21-CodonP 1 us ( DE3 ) -R I PL , C43(DE3) 등이 사용될수 있으며， 바람직하게 BL21-CodonPl us(DE3 )-RIPL일 수 있다.
<126>
<127> 본 발명은 상기 형질전환 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 상기 AIMP2-
DX2-34S 단백질 제조 방법을 제공한다 (AIMP2-DX2-34S 단백질 제조 방법은 상기한 AIMP2-DX2-34S 단백질의 대량생산 방법과 설명을 같이 한다) .
<128>
<129> 형질전환 미생물의 배양은 목적 단백질인 AIMP2-DX2-34S의 발현을 가능하게 하는 적절한 조건하에서 수행하며, 이러한 조건은 당업자에게 익히 공지된 방법에 따라 수행할 수 있다. 형질전환 미생물은 통상적인 배양방법에 의해 대량으로 배양 할 수 있다. 배양배지로는 탄소원， 질소원, 비타민 및 미네랄로 구성된 배지를 사 용할 수 있으며， 예를 들어， LB 배지 (Lur i a-Bert ani Broth)을 사용할 수 있다. 미 생물의 배양은 통상의 미생물 배양 조건상에서 가능하며 예를 들어, 은도범위 15°C 내지 45°C에서 10시간 내지 40시간 동안 배양할 수 있다. 배양액 중의 배양배지를 제거하고 농축된 균체만을 회수하기 위해 원심분리 (centrifugation) 또는 여과 (filtration)과정을 거칠 수 있으며 이러한 단계는 당업자가 필요에 따라 수행할 수 있다. 농축된 균체는 통상적인 방법에 따라 냉동 (frozen)하거나 또는 넁동건조 (lyophilized)하여 그 활성을 잃지 않도특 보존할 수 있다.
<130>
<i3i> 구체적으로 상기 AIMP2-DX2-34S 단백질 제조 방법은
<132> (a) AIMP2-DX2-34S 단백질을 코딩 (coding)하는 재조합백터로 형질전환된 형 질전환 미생물을 배양하는 단계; 및
<133> (b) 15 °C 내지 25°C 온도 범위에서 상기 배양된 형질전환 미생물의 AIMP2-
DX2-34S 단백질 발현을 유도하는 단계를 포함하는 AIMP2— DX2-34S 단백질 제조 방법 일 수 있다.
<134>
<135> 상기 (a) 단계에서 형질전환 미생물의 배양은 형질전환 미생물의 종류에 따 라 알맞은 생육 온도를 당업자가 선택할수 있다. 예를들어 상기 형질전환체가 대장 균 (E.coli)인 경우, 바람직하게 생육조건은 35°C 내지 40°C일 수 있으며， 가장 바 람직하게 37°C일 수 있다.
<136>
<137> 상기 (b) 단계에서 배양된 형질전환 미생물로부터 AIMP2-DX2-34S 단백질 발 현을 유도하는 온도는， 바람직하게 15°C 내지 25°C 온도 범위일수 있고， 가장 바 람직하게 18°C 내지 22°C일 수 있다. (b) 단계와 같이, 특정 온도 (특히 20°C)에서 AIMP2-DX2-34S 단백질 발현을 유도하면, 높은 용해성을 가지는 AIMP2-DX2-34S 단백 질 발현량이 증가된다. 이는 본 발명의 명세서 실시예에 잘 나타나있다.
<138> 본 발명의 일실시예에서는 AIMP2-DX2-34S 단백질을 코딩하는 재조합 백터로 형질전환된 Rosetta2(DE3)pLysS, BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL 및 C43(DE3) 의 서로 다른 대장균에 대하여， 각각 37°C 및 20°C에서 단백질 발현을 유도한 후 상기 AIMP2-DX2-34S 단백질의 발현 및 용해성 정도를 전기영동을 통해 확인하였다. 그 결과 20°C에서 발현 유도된 AIMP2-DX2-34S 단백질이 37°C에서 발현 유도된 단백질 보다 높은 용해성을 갖는 것을 확인하였다.
<139>
<140> 형질전환 미생물 (또는 형질전환체)에서 발현시킨 단백질은 통상의 방식으로 정제될 수 있으며， 예를 들어， 염석 (예를 들어 황산암모늄 침전， 인산나트륨 침전 )ᅳ 용매 침전 (아세톤, 에탄을 등을 이용한 단백질 분획 침전), 투석， 겔 여과, 이 온 교환， 역상 칼럼 크로마토그래피와 같은 칼럼 크로마토그래피 및 한외여과 등의 기법을 단독 또는 조합으로 적용시켜 본 발명의 AIMP2-DX2-34S 단백질을 정제할 수 있다 (Maniat i s et al , Molecular Cloning: A Laboratory Manual , Cold Spr ing Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor , N.Y. ( 1982) ; Sambrook et al , Molecular Cloning: A Laboratory Manual , 2d Ed. , Cold Spr ing Harbor Laboratory Press (1989)； Deutscher , M. , Gui de to Protein Pur i f i cat ion Methods Enzymology, vol . 182. Academic Press . Inc . , San Diego, CA( 1990) ) . 바람직하게 FPLC(Fast protein l iquid chromatography) 및 흡착 크로마토 그래피， 분배 크로마토 그래피, 이온교환크로마토그래피， 크기배제 크로마토그래피 등을 포함하는 HPLC(high performance l iquid chromatography) 의 여러 방법을 조합하여 본 발명의 AIMP2- DX2-34S 단백질을 정제할수 있다.
<i4i> 본 발명의 실시예에서는 단계적으로 FPLC , 이온교환크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피를 조합하여 수행하는 방식으로， 형질전환된 균체 배양물의 파 쇄물로부터 본 발명의 AIMP2— DX2-34S 단백질을 수득하였다.
<142>
<143> 본 발명은 상기 AIMP2-DX2-34S 단백질에 특이적인 항체를 제공한다.
<144>
<145> 발명에서 용어， "항체" 란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상， AIMP2-DX2-34S를 특이적으로 인지하는 항체를 의미한다.
<146> 바람직하게, 본 발명의 'AIMP2-DX2-34S 단백질에 특이적인 항체' 는 AIMP2-
DX2를 특이적으로 인지할 수 있음을 특징으로 한다. 즉, 상기 'AIMP2-DX2-34S 단백 질에 특이적인 항체' 는 궁극적으로 AIMP2와 구분하여 AIMP2-DX2를 특이적으로 인 지하는 항체이다.
<147>
<148> 본 발명의 항체는 다클론 항체 및 단클론 항체를 모두 포함하며， 상기한 바 와 같이 AIMP2-DX2-34S 단백질이 규명되었으므로 이를 이용하여 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다.
<149>
<150> 다클론 항체는 상기한 AIMP2-DX2-34S 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로 부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의 해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소， 토끼 양, 원승이, 말， 돼지, 소 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조 가능하다.
<151>
<152> 단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 융합 방법 (fusion method)( ohler 및
Milstein (1976) European Jounral of Immunology 6:511-519 참조), 재조합 DNA 방 법 (미국특허 계 4, 816,567호) 또는 파지 항체 라이브러리 (Clackson et al, Nature, 352, 624-628, 1991； Marks et al , J. Mol. Biol., 222, 58， 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조될 수 있다.
<153>
<154> 본 발명의 AIMP2-DX2-34S 단백질 검출에 사용되는 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기 능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv등이 있다.
<155>
<156> 본 발명의 AIMP2-DX2-34S에 특이적인 항체는 AIMP2-DX2와 특이적으로 결합
(binding)하여 암 진단에 사용될 뿐만 아니라， 환자에게 투여함으로써 AIMP2-DX2의 활성을 억제하여 암 치료에도 사용될 수 있다. 치료용 항체로 사용될 경우, 항체는 기존의 치료제와 직접 또는 링커 등을 통하여 간접적으로 커플링 (예를 들어， 공유 결합)시킬 수 있다.
<157>
<158> 항체와 결합될 수 있는 치료제에는 방사성핵종 (radionuclide), 약제, 림포카 인， 독소， 이형가능성 항체 등이 있으나 이로 제한되지는 않는다. 방사성핵종에는 1311, 90Y, 105Rh, 47Sc, 67Cu, 212Bi , 211At , 67Ga, 1251, 186Re, 188Re, 177Lu, 153Sm, 1231， lllln 등이 있다. 약제에는 메토트렉세이트 (methotrexate)， 아드리아 마이신 (adriamycin)등이 있고 림포카인에는 인터페론 등이 있다. 독소에는 리신， 아브린, 드프테리아 등이 있다. 그리고 다른 항체와 결합되어서 그 복합체가 암 세 포와 효능 세포 (예를 들면 T 세포와 같은 K 세포 (killer cell) 모두에 결합하는 항체인 이형기능성 항체 (heterofunctional antibodies)가 있다.
<159> 항체는 그 자체 또는 항체를 포함하는 조성물로 투여될 수 있다. 치료용 조 성물의 경우 투여 방식에 따라 허용 가능한 담체를 포함하여 적절한 제제로 제조된 다. 투여 방식에 적합한 제제는 공지되어 있고， 전형적으로 막을 통과한 이동을 용 이하게 하는 계면활성제를 포함한다. 이러한 계면활성제는 스테로이드에서 유도된 것이거나 N-[l-(2,3-디올레오일)프로필 -Ν,Ν,Ν-트리메틸암모늄클로라이드 (D0TMA) 등 의 양이온성 지질， 또는 콜레스테를 헤미숙시네이트 포스파티딜 글리세를 등의 각 종 화합물 등아 있다.
<160> 본 발명의 항체를 포함하는 조성물은 암세포 또는 그들의 전이를 치료하기 위하여 약학적으로 효과적인 양으로 투여될 수 있다. 약학 조성물은 단일 또는 다 중 투여될 수 있다. 항체를 포함하는 조성물은 비경구， 피하, 복강 내， 폐 내， 및 비강 내， 및 국부적 면역억제치료를 위해 필요하다면 병변 내 투여를 포함하는 적 합한 방법에 의해 투여된다. 비경구 주입에는 근육내， 정맥내， 동맥내, 복강내 또 는 피하투여가 포함된다. 바람직한 투여방식 및 제제는 정맥 주사제, 피하 주사제, 피내 주사제, 근육 주사제, 점적 주사제 등이다. 제제의 pH는 항체 안정성 (화학적 및 물리적 안정성)의 균형을 맞추고 투여되는 환자에게 적절하도록 하는데 일반적 으로, pH 4 와 pH 8 범위이다. 그 외에도 경피 투여 및 경구 투여 등의 투여를 위 한 다른 기술들을 적절하게 변형시켜 이용하여 적당한 제제를 고안할 수 있다. 전 형적인 투여량 수준은 표준 임상적 기술을 사용하여 최적화할 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 항체를 암호화하는 핵산의 형태로 투여되어 세포내에서 항체가 생성 되도록 할 수 있다 (W096/07321) .
<161>
<162> 본 발명은 상기 항체를 포함하는 암 진단키트를 제공한다.
<163>
<164> 본 발명의 암 진단 키트에는 AIMP2-DX2-34S 단백질을 특이적으로 인지하는 항체뿐만 아니라 면역학적 분석에 사용되는 당 분야에서 일반적으로 사용되는 도 구, 시약 등이 포함된다. 이러한 도구 /시약으로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호 를 생성할 수 있는 표지 물질 용해제 세정제， 완층제， 안정화제 등이 포함하나 이로 제한되지 않는다. 표지 물질이 효소인 경우에는 효소 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반웅 정지제를 포함할 수 있다. 적합한 담체로는, 이에 한정되지는 않으 나， 가용성 담체， 예를 들어 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완층액， 예 를 들어 PBS, 불용성 담체 예를 들어 폴리스틸렌， 폴리에틸렌, 폴리프로필렌， 폴 리에스테르， 폴리아크릴로니트릴， 불소 수지 가교 텍스트란, 폴리사카라이드, 라 텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이， 유리 , 금속, 아가로 스 및 이들의 조합일 수 있다.
<165> 본 발명의 암 진단 키트는 이에 한정되는 것은 아니나 ELISA 플레이트 딥- 스틱 디바이스, 면역크로마토그래피 시험 스트립 및 방사 분할 면역검정 디바이스ᅳ 및 플로우-쓰로우 ( f low-through) 디바이스 등의 형태를 가질 수 있다. <166> 본 발명의 암 진단 키트는 상기 'AIMP2-DX2-34S 단백질을 특이적으로 인지하 는 항체' 를 포함하고 있어, 암 진단 마커인 AIMP2-DX2를 검출 할 수 있다. 본 발 명에서 용어， "암 진단 마커" 란 암 조직 및 세포에서 발현되고 이의 발현 여부를 확인함으로써 암의 발병을 확인할 수 있는 물질， 바람직하게는 정상조직과 암 조직 에서 유의한 차이를 보이는 단백질 또는 mRNA 등과 같은 유기 생체 분자를 의미한 다. 본 발명의 목적상, 암 진단 마커는 다양한 암 조직 및 세포에서만 특이적으로 발현되는 AIMP2-DX2이며, AIMP2-DX2의 발현을 mRNA 수준 또는 /및 단백질의 수준에 서 확인함으로써 암을 진단할 수 있다. 본 발명의 항체는 암， 보다 구체적으로 폐 암， 간암， 유방암, 피부암， 신장암, 골육종암 등을 진단하는데 유용하게 사용할 수 있다.
<167>
<168> 본 발명은 ( a ) 분석할 시료를 제공하는 단계; 및 ( b ) 상기 시료를 상기
AIMP2-DX2-34S 단백질에 특이적인 항체와 접촉시키는 단계를 포함하는, AIMP2-DX2 를 검출하는 방법을 제공한다.
<169>
<170> 본 발명에서 용어, "분석할 시료" 란 암 발생에 의해 마커 단백질의 발현량 의 차이가 검출될 수 있는 조직, 세포， 전혈， 혈청， 혈장, 타액 정액 뇌척수액 또는 뇨와 같은 생물학적 시료를 의미하며 당 업계에서 널리 공지 된 방법으로 처 리하여 준비된다.
<171>
<i72> AIMP2-DX2 단백질의 검출은, AI P2-DX2-34S를 특이적으로 인지하는 항체를 시료에 접촉하여 이의 항원 -항체 복합체 형성을 측정하여 수행된다. 전술한 바와 같이 본 발명의 'AIMP2-DX2-34S를 특이적으로 인지하는 항체' 는 AIMP2-DX2 단백질 과 특이적으로 결합하여 항원 -항체 복합체를 형성한다.
<173> 본 발명에서 용어, "항원 -항체 복합체" 란 생물학적 시료 증의 AIMP2-DX2 단 백질과 이를 특이적으로 인지하는 항체 (본 발명의 AIMP2-DX2-34S를 특이적으로 인 지하는 항체)의 결합물을 의미한다. 항원 -항체 복합체 형성을 살펴보는 실험방법에 는 조직면역 염색， 방사능면역분석법 (RIA) , 효소면역분석법 (ELISA) , 웨스턴 블랏 팅 (Western Blott ing) , 면역침전 분석법 ( Immunoprecipi tat ion Assay) , 면역확산 분 석법 ( Immunodi f fusion assay) , 보체 고정 분석법 (Complement Fixat ion Assay) , FACS, 단백질 칩 (protein chip)등이 있으며 이로 제한되지 않는다.
<174> 항원 -항체 복합체의 형성을 정성 또는 정량적으로 측정가능하게 하는 라벨에 는 효소， 형광물, 리간드, 발광물 미소입자 (microparticle), 레독스 분자 및 방사 선 동위원소등이 있으며， 반드시 이로 제한되는 것은 아니다. 검출 라벨로 이용 가 능한 효소에는 β-글루쿠로니다제， β-D-글루코시다제， β-D—갈락토시다제, 우레아 제, 퍼옥시다아제, 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라제ᅵ 글루코즈 옥시 다제, 핵소키나제와 GDPase, RNase, 글루코즈 옥시다제와 루시페라제, 포스포프력 토키나제, 포스포에놀피루베이트 카복실라제, 아스파르테이트 아미노트랜스페라제， 포스페놀피루베이트 데카복실라제, β-라타마제 등이 있으며 이로 제한되지 않는 다. 형광물에는 플루오레신, 이소티오시아네이트， 로다민， 피코에리테린， 피코시아 닌, 알로피코시아닌， 0-프탈데히드， 플루오레스카민 등이 있으며 이로 제한되지 않 는다. 리간드에는 바이오틴 유도체 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 발광물에는 아크리디늄 에스테르， 루시페린， 루시퍼라아제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 미소입자에는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 레 독스 분자에는 페로센， 루테늄 착화합물， 바이올로젠， 퀴논， Ti 이온 Cs 이은， 디 이미드 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논, W(CN)8, [0s(bpy)3]2+, [RU(bpy)3]2+, [ 0(CN)8]4" 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 방사선동위원소에는
3„ 14 32„ 35„ 36„ 51 57^ 58„ 59„ 90 , 125, 131 186„ . Λΐ ^ , , _ „ , , Λ1
Η, C, Ρ, S, CI , Cr, Co, Co, Fe, Y, I， I, Re 등이 있으며 이로 제한되지 않 는다.
<175>
<176> 본 발명은 상기 AIMP2-DX2-34S 단백질의 mRNA에 특이적인 siRNA 핵산 분자를 제공한다.
<177> 본 발명에서 용어， "siRNA" 란 특정 mRNA의 절단 (cleavage)을 통하여
RNAiCRNA interference) 현상을 유도할 수 있는 짧은 이중사슬 腿를 의미한다. 표 적유전자의 mRNA와 상동인 서열을 가지는 센스 RNA 가닥과 이와 상보적인 서열을 가지는 안티센스 RNA 가닥으로 구성된다. siRNA는 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효을적인 유전자 넉다운 방법으로서 또는, 유전자치료 (gene therapy) 의 방법으로 제공된다. siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이증사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치 (대웅하는 염기가 상보적이지 않음), 벌 지 (일방의 사슬에 대웅하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포
<178> 함될 수 있다. 전체 길이는 10 내지 100 염기, 바람직하게는 15 내지 80 염 기, 더욱 바람직하게는 20 내지 70 염기이다. siRNA 말단 구조는 표적유전자의 발 현을 RNAi 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면 평활 (blunt)말단 흑은 점착 (cohes ive) 말단 모두 가능하다. 점착 말단 구조는 3 말단 돌출한 구조와 5 말단 쪽이 돌출한 구조 모두 가능하다. 돌출하는 염기 수는 한정되지 않는다. 예를 들 어， 염기 수로는 1 내지 8 염기 , 바람직하게는 2 내지 6 염기로 할 수 있다. 본 명세서에서 s iRNA의 전장은 중앙의 이중사슬 부분의 길이와 양 말단의 단일사술 돌출을 구성하는 길이의 합으로 나타내었다. 또한， s iRNA는 표적유전자의 발현억제 효과를 유지할 수 있는 범위에서 예를 들어， 한 쪽 말단의 돌출 부분에 저분자 RNA (예를 들어， tRNA, rRNA, 바이러스 RNA와 같은 천연의 RNA분자 또는 인공의 RNA 분자)를 포함할 수 있다.. siRNA 말단구조는 양측 모두 절단 구조를 가질 필요는 없 고, 이중사슬 NA의 일방의 말단 부위가 링커 RNA에 의하여 접속된 스템 루프형 구 조일 수도 있다. 링커의 길이는 스템 부분의 쌍을 이루는 데 지장이 없는 길이면 특별히 한정되지 않는다.
<179>
<180> 본 발명에서 용어, "특이적" 또는 "특이적인" 은 세포내에서 다른 유전자 에 영향을 미치지 않고 목적 유전자만 억제하는 능력을 의미하고, 본 발명에서는
AIMP2-DX2-34S에 특이적이다. 본 발명의 s iRNA는 AIMP2-DX2ᅳ 34S 특이적으로 작동하 도록 AIMP2-DX2-34S의 엑손 1과 엑손 3의 경계 지점에 해당하는 mRNA와 상동인 서 열을 포함하는 센스 RNA 가닥과 이와 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 RNA 가닥 을 가진다.
<181>
<182> 상기에서 "유전자 발현의 감소 ( Inhibi t i on of gene expressi on) " 란 목적 유전자에서 생성된 mRNA 및 /또는 단백질의 수준이 제거 또는 감소된 것을 의미하 고， 이는 mRNA의 절단 (c leavage)을 통해 일어나는 RNA 간섭 (RNAi： RNA inter ference) 현상에 의한다. s iRNA를 제조하는 방법은 시험관에서 siRNA를 직접 합성한 뒤, 형질전환 ( transfect ion) 과정을 거쳐 세포 안으로 도입시키는 방법과 s iRNA가 세포 안에서 발현되도록 제조된 s iRNA 발현 백터 또는 PCR-der ived siRNA 발현 카세트를 세포안으로 형질전환 또는 감염 ( infect ion) 시키는 방법이 있다. siRNA를 제조하고 세포 또는 동물로 도입하는 방법의 결정은 실험의 목적 및 표적 유전자 산물의 세포생물학적 기능에 따라 달라질 수 있다.
<183>
<184> 본 발명은 상기 AIMP2-DX2-34S 단백질의 mRNA에 상보적인 서열을 갖는 안티 센스 핵산 분자를 제공한다.
<185> 본 발명에서 용어， "안티센스 핵산" 이란 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체를 의미하고， mRNA내의 상 보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 특징이 있다. 본 발명 의 안티센스 서열은 AIMP2-DX2-34S mRNA에 상보적이고 AIMP2-DX2-34S mRNA에 결합 할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미하고 AIMP2-DX2 mRNA의 번역, 세포질내로의 전위 ( trans locat ion) , 성숙 (maturat i on) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다. 안티센스 핵산의 길이는 6내지 100 염기이 고， 바람직하게는 8내지 60 염기이고， 보다 바람직하게는 10 내 40 염기이다.
<186>
<187> 상기 안티센스 핵산은 효능을 증진시키기 위하여 하나 이상의 염기， 당 또는 골격 (backbone)의 위치에서 변형될 수 있다 (De Mesmaeker et al , Curr Opin Struct Biol . , 5(3) :343-55 , 1995) . 핵산 골격은 포스포로티오에이트, 포스포트리에스테 르， 메틸 포스포네이트, 단쇄 알킬， 시클로알킬， 단쇄 헤테로아토믹， 헤테로시클릭 당간 결합 등으로 변형될 수 있다. 또한， 안티센스 핵산은 하나 이상의 치환된 당 모이어티 (sugar moi ety)를 포함할 수 있다. 안티센스 핵산은 변형된 염기를 포함할 수 있다. 변형된 염기에는 하이포크잔틴 6-메틸아데닌, 5-me 피리미딘 (특히 5-메 틸시토신)， 5-하이드록시메틸시토신 (HMC) , 글리코실 HMC, 젠토비오실 HMC, 2-아미 노아데닌, 2-티오우라실， 2-티오티민， 5-브로모우라실, 5-하이드록시메틸우라실， 8-아자구아닌， 7-데아자구아닌， 6 (6-아미노핵실)아데닌, 2 , 6-디아미노퓨린 등이 있다. 또한 본 발명의 안티센스 핵산은 상기 안티센스 핵산의 활성 및 세포 홉착성 을 향상시키는 하나 이상의 모이어티 (moi ety) 또는 컨쥬게이트 (conj ugate)와 화학 적으로 결합될 수 있다. 콜레스테를 모이어티， 콜레스테릴 모이어티， 콜릭산, 티오 에테르, 티오콜레스테를, 지방성 사슬， 인지질， 폴리아민, 폴리에틸렌 글리콜 사 슬， 아다맨탄 아세트산 팔미틸 모이어티, 옥타데실아민, 핵실아미노-카르보닐-옥 시콜에스테를 모이어티 등의 지용성 모이어티 등이 있고 이에 제한되지는 않는다. 지용성 모이어티를 포함하는 을리고뉴클레오티드와 제조 방법은 본 발명의 기술 분 야에서 이미 잘 알려져 있다 (미국특허 제 5, 138, 045호, 제 5, 218 , 105호 및 제 5 , 459， 255호) . 상기 변형된 핵산은 뉴클레아제에 대한 안정성을 증가시키고 안티센 스 핵산과 표적 mRNA와의 결합 친화력을 증가시킬 수 있다.
<188> 본 발명의 AIMP2-DX2-34S에 특이적인 안티센스 핵산은 AIMP2-DX2 mRNA의 엑 손 1과 엑손 3이 연결되는 접합점 부위의 해당하는 서열에 상보적인 서열을 포함하 는 것이 바람직하다.
<189> <i9o> 안티센스 RNA의 경우 통상의 방법으로 시험관에서 합성되어 생체 내로 투여 하거나 생체 내에서 안티센스 R A가 합성되도록 할 수 있다. 시험관에서 안티센스
RNA를 합성하는 한 예는 RNA 폴리머라제 I를 이용하는 것이다. 생체 내에서 안티센 스 RNA가 합성되도록 하는 한가지 예는 인식부위 (MCS)의 기원이 반대 방향에 있는 백터를 사용하여 안티센스 RNA가 전사되도특 하는 것이다. 이런 안티센스 RNA는 서 열 내에 번역 중지 코돈이 존재하도록하여 펩타이드 서열로 번역되지 않도록 하는 것이 바람직하다.
<191>
<192> 본 발명은 상기 AIMP2-DX2-34S 단백질의 mRNA에 특이적인 s iRNA 또는 안티센 스 핵산을 포함하는 암을 치료하기 위한 약제학적 조성물을 제공한다.
<193> 본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 상기 s iRNA 또는 안 티센스 핵산의 암 치료제 제조를 위한 용도를 제공한다.
<194> 본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 상기 s iRNA 또는 안 티센스 핵산을 이를 필요로하는 개체에 유효량으로 투여하는 것을 특징으로 하는 암 치료 방법을 제공한다.
<195>
<196> 본 발명자에 의한 등록특허 10-0762995에 의하면, AIMP2-DX2 특이적 s iRNA를 처리할 경우, AIMP-DX2 발현유도에 의해 발생된 AIMP2의 기능적 붕괴가 복구되는 것을 AIMP2의 세포내 수준 증가, Sinad2의 인산화가 유도되는 것을 통하여 확인할 수 있었다. 즉, AI P2-DX2는 AIMP2의 기능을 붕괴하여 암을 유발하는 직접적인 원 인으로 작용하는데 AIMP2— DX2의 mRNA에 특이적인 s iRNA 또는 안티센스 핵산을 이용 할 경우， 세포내 AIMP2의 세포내 수준이 증가되면서 기능이 복구되므로 암 세포 특 이적인 암 치료에 유용하다.
<197> 본 발명의 AIMP2-DX2-34S 단백질의 mRNA에 특이적인 s iRNA 또는 안티센스 핵 산은 AIMP2-DX2에 결합 및 AIMP2-DX2의 활성을 억제하여， 세포내 AIMP2의 세포내 수준이 증가되면서 기능이 복구되게하는 효과가 있다.
<198> 따라서 본 발명의 AIMP2-DX2-34S 단백질의 mRNA에 특이적인 s iRNA 또는 안티 센스 핵산을 이용하여 , AIMP2-DX2 발현 유도에 의해 발생한 모든 암을 치료할 수 있다. 이런 암은, 폐암, 간암, 유방암， 피부암, 신장암， 골육종암 등을 포함한다.
<199>
<200> 상기 AIMP2-DX2-34S 단백질의 mRNA에 특이적인 s iRNA 또는 안티센스 핵산 1 종 이상을 포함하는 약제학적 조성물은 환자의 암 세포의 증식을 저해시키는 추가 와 물질을 포함할 수 있으며， 또한 siR A 또는 안티센스 핵산 분자의 유입을 촉진 시키는 제제 예를들어, 리포좀 (미국특허 제 4,897, 355호， 제 4,394,448호> 제 4,235，8기호， 제 4,231,877호, 제 4,224， 179호， 제 4,753,788호， 제 4, 673,567호， 제 4,247,411호， 제 4，814，270)을 이용하거나 콜레스테를 콜레이트 및 데옥시콜산을 비롯한 다수의 스테를류중 1종의 친유성 담체와 함께 배합할 수도 있다. 또한, 안 티센스 핵산은 세포에 의해 흡수되는 펩티드에 접합시킬 수도 있다. 유용한 펩타이 드의 예로는 펩타이드 호르몬， 항원 또는 항체 및 펩파이드 독소 등이 있다 (Haralambid et al， WO 8903849； Lebleu et al, EP 0263740).
<201>
<202> 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 투여될 수 있으며, 경구 투여시에는 결합제,활탁제 붕해제， 부형제, 가용화제, 분산제, 안정 화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완층제, 보존제， 무통화제 , 가용화제， 등장제 , 안정화제 등을 흔합하여 사용할 수 있으며 , 국소 투여용의 경우에는 기제, 부형제， 윤활제， 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 흔합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어， 경구 투여시에는 정제, 트로키， 캡 슐, 엘릴시르 서스펜션， 시럽 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 염플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다.
<203> 본 발명의 약제학적 조성물에 함유되는 AIMP2-DX2-34S 단백질의 mRNA에 특이 적인 siRNA 또는 안티센스 핵산의 유효 투여량의 범위는 성별, 중증도, 연령， 투여 방법 , 표적 세포, 발현 수준 등 다양한 요인에 따라 달라질 수 있으며， 당 분야의 전문가들에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
<204> 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 경구적으로 또는 정맥내 , 피하, 비강내 또는 복강내 등에 비경구적으로 사람과 동물에게 투여된다. 비경구적 투여는 피하 주사, 근육내 주사 및 정맥주사와 같은 주사법 및 점적법을 포함한다. 이외의 본 발명 약제학적 조성물은 각종 제형의 형태로 통용되는 기법에 따라 제조할 수 있 다.
<205> 상기에서 '유효량'이란 환자에게 투여하였을 때， 암의 치료 및 예방 효과 또 는 암 전이 억제효과를 나타내는 양을 말하며 , 상기 '개체 (subject)'란 동물， 바람 직하게는 포유동물, 특히 인간을 포함하는 동물일 수 있으며， 동물에서 유래한 세 포， 조직, 기관 등일 수도 있다. 상기 개체는 치료가 필요한 환자일 수 있다.
<206> <207> 본 발명은
<208> ( a ) 시험물질을 상기 AIMP2-DX2-34S 단백질을 코딩하는 유전자를 발현하는 세포와 접촉시키는 단계; 및
<209> ( b ) 시험물질에 의한 AIMP2-DX2-34S 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 억제 또는 AIMP2-DX2-34S 단백질의 분해 촉진을 측정하는 단계를 포함하여， AIMP2-DX2 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 억제 또는 AIMP2-DX2 단백질의 분해를 촉진 하 는 항암제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.
<210>
<2ΐ ι> 상기 (a) 단계에서 'AIMP2-DX2-34S 단백질을 코딩하는 유전자를 발현하는 세 포' 는 천연 상태에서 AIMP2-DX2-34S 단백질을 발현하는 세포 또는 AIMP2-DX2-34S 단백질이 발현되도록 유전자 조작된 세포일 수 있다. 상기 '유전자 조작' 은 특정 세포에 외부 유전자 (본 발명의 AIMP2— DX2-34S 발현 유전자)를 도입하는 것을 의미 하며， 상기 유전자 조작 방법은 당업자에게 널리 알려져있으며 이에 제한되지 않으 나， 예를 들어 형질전환일 수 있다.
<212>
<213> 상기 ( b ) 단계에서 AIMP2-DX2-34S 유전자의 발현은 mRNA 또는 단백질 수준에 서 측정할 수 있다. AI P2-DX2-34S mRNA 발현을 검출하고자 할 경우, 바람직하게는 AIMP2-DX2-34S 특이적인 프라이머를 사용하여 RT-PCR로 수행할 수 있다. AIMP2- DX2-34S 단백질 발현을 검출하고자 할 경우， 상기한 바와 같은 AIMP2-DX2-34S 특이 적인 항체를 사용하는 다양한 면역 어세이 방법, 예들 들어 웨스턴 블랏으로 수행 할 수 있다.
<214>
<215> 상기 ( a) 내지 (b) 단계를 통해 스크리닝된 시험물질은 AIMP2-DX2-34S의 유 전자 발현 억제 또는 AIMP2-DX2-34S 단백질의 분해 촉진 효과가 있을 뿐만아니라, AIMP2-DX2에도 동일한 효과를 나타낸다. 즉, (a) 내지 (b) 단계를 통해 스크리닝된 시험물질은 AIMP2-DX2의 유전자 발현 억제 또는 AIMP2-DX2 단백질의 분해 촉진 효 과가 있다.
<216>
<217> 상기 (a) 내지 (b) 단계의 수행만으로 시험물질이 AIMP2-DX2의 유전자 발현 억제 또는 AIMP2-DX2 단백질의 분해 촉진 효과가 있는지에 관하여 확신하기 어려운 경우에 한하여, 상기 (b) 단계에서 선정된 후보 시험물질을 AIMP2-DX2 단백질을 코 딩하는 유전자를 발현하는 세포와 접촉시켜 AIMP2-DX2의 활성을 확인하는 단계를 추가적으로 수행할 수 있다. 상기 'AIMP2-DX2 단백질을 코딩하는 유전자를 발현하 는 세포' 는 바람직하게 암 세포일 수 있다.
<218>
<219> 즉 , 상기 항암제의 스크리닝 방법은 구체적으로
<220> (a) 시험물질을 상기 AIMP2-DX2-34S 단백질을 코딩하는 유전자를 발현하는 세포와 접촉시키는 단계;
<22i> ( b ) 시험물질에 의한 AIMP2-DX2— 34S 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 억제 또는 AIMP2-DX2-34S 단백질의 분해 촉진을 측정하여 후보 시험 물질을 선정하는 단 계; 및
<222> ( c ) 상기 ( b) 단계에서 선정된 후보 시험물질을 AIMP2-DX2 단백질을 코딩하 는 유전자를 발현하는 세포와 접촉시켜 AIMP2-DX2의 활성을 확인하는 단계를 포함 하는， AIMP2-DX2 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 억제 또는 AIMP2-DX2 단백질 의 분해를 촉진 하는 항암제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.
<223>
<224> 상기 ( c ) 단계에서 'AIMP2-DX2의 활성을 확인' 한다는 것은 상기 ( c ) 단계의 후보 시험물질에 의한 AIMP2ᅳ DX2 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 억제 또는 AIMP2-DX2 단백질의 분해 촉진을 측정하는 것을 의미하며, 상기 측정 방법에 관하 여는 전술한 바와 같다.
<225>
【유리한 효과】
<226> 본 발명의 AIMP2-DX2-34S 단백질은 AIMP2-DX2와 동일한 활성을 가질뿐만 아 니라, 정제된 단백질 사이의 웅집 (aggregat ion)일 일어나지 않고 높은 용해성을 가 지기 때문에 단백질의 대량생산에 매우 효과적이다. 따라서 상기 대량생산 및 정제 된 AIMP2-DX2-34S 단백질은, 구조에 근거한 신약개발 과정에 필요한 단계인 단백질 결정제작 및 X-ray 크리스탈로그라피에 의한 AL P2-DX2-34S 단백질의 3차원 구조 결정에 있어 매우 유용하게 사용될 수 있으므로 산업상 이용 가능성이 있다.
<227>
【도면의 간단한 설명】
<228> 도 1은 형질전환된 균체 파쇄물로 부터 얻어진 상층액으로부터， FPLCXFast protein l i qui d chromatography)를 이용한 AIMP2-DX2-Trx 단백질의 1차 정제 결과 를 크로마토그램 (chromatogram)으로 나타낸것이다. 상기 크로마토그램 왼쪽 하단에 삽입된 이미지는, 1차 정제를 통해 분리된 재조합 단백질 각각의 fract ion (크로마 토그램 가로축에 붉은 색으로 각각의 fract ion에 대한 number ing이 되어있음)에 대 한 전기영동을 수행한 결과를 나타낸다 (LT : loading through , 1 +： IPTG- induced E. coli samp le을 나타내며 이하의 도면에서 모두 동일함) .
<229> 도 2는 상기 1차 분리된 재조합 단백질을 2차 정제하기 위한 과정 중에 , 이 은교환 크로마토그래피 로딩용액으로 교체하였을 시에 나타나는 크로마토그램을 보 여준다.
<230> 도 3은 상기 1차 분리된 재조합 단백질 (특히 도 2의 크로마토그램에서 나타 나는 2 내지 5 및 7 내지 10 fract ion)로부터, 이온교환 크로마토그래피를 이용한 AIMP2-DX2-Trx 단백질의 2차 정제 결과를 크로마토그램으로 나타낸 것이다. 상기 크로마토그램 왼쪽 하단에 삽입된 이미지는 2차 정제를 통해 분리된 재조합 단백질 각각의 fract i on (크로마토그램 가로축에 붉은 색으로 각각의 fract ion에 대한 number ing이 되어있음)에 대한 전기영동을 수행한 결과를 나타낸다 ( I+ : IPTG- induced E. coli sample) .
<23 i> 도 4는 상기 2차 분리된 재조합 단백질로 (특히 도 3의 크로마토그램에서 나 타나는 12 내지 16 fract ion)부터 크기배제 크로마토그래피를 이용한 AIMP2-DX2- Trx 단백질의 3차 정제 결과를 크로마토그램으로 나타낸 것이다. 상기 크로마토그 램 왼쪽 하단에 삽입된 이미지는 3차 정제를 통해 분리된 재조합 단백질 각각의 fract ion (크로마토그램 가로축에 붉은 색으로 각각의 fract i on에 대한 number ing이 되어있음)에 대한 전기영동을 수행한 결과를 나타낸다.
<232> 도 5는 상기 3차 분리된 재조합 단백질 (특히 도 4의 크로마토그램에서 나타 나는 25 내지 32 fract ion)로부터, 이은교환 크로마토그래피를 이용한 AIMP2-DX2- Trx 단백질의 4차 정제 결과를 크로마토그램으로 나타낸 것이다. 상기 크로마토그 램 왼쪽 하단에 삽입된 이미지는 4차 정제를 통해 분리된 재조합 단백질 각각의 fract ion (크로마토그램 가로축에 붉은 색으로 각각의 fract i on에 대한 number ing이 되어있음)에 대한 전기영동을 수행한 결과를 나타낸다.
<233> 도 6은 상기 4차 분리된 재조합 단백질 (특히 도 5의 크로마토그램에서 나타 나는 8 내지 11 fract ion)로부터, 크기배제 크로마토그래피를 이용한 AIMP2-DX2- Trx 단백질의 5차 정제 결과를 크로마토그램으로 나타낸 것이다. 상기 크로마토그 램 왼쪽 하단에 삽입된 이미지는 5차 정제를 통해 분리된 재조합 단백질 각각의 fract ion (크로마토그램 가로축에 붉은 색으로 각각의 fract ion에 대한 number ing이 되어있음)에 대한 전기영동을 수행한 결과를 나타낸다.
<234> 도 7은 상기 5차 분리된 재조합 단백질에 트름빈을 처리한 후， FPLC를 이용 하여 AIMP2-DX2 단백질을 1차로 정제한 결과를 크로마토그램으로 나타낸 것이다. 상기 크로마토그램 오른쪽 상단에 삽입된 이미지는 1차 정제를 통해 분리된 단백질 각각의 fract ion (크로마토그램 가로축에 붉은 색으로 각각의 fract ion에 대한 numbering이 되어있음)에 대한 전기영동을 수행한 결과를 나타낸다.
<235> 도 8은 상기 1차 분리된 단백질 (특헤 도 7 의 크로마토그램에서 나타나는 5 fract ion)로부터， 크기배제 크로마토그래피를 이용한 AIMP2-DX2 단백질의 2차 정제 결과를 크로마토그램으로 나타낸 것이다. 상기 크로마토그램 왼쪽 하단에 삽입된 이미지는 2차 정제를 통해 분리된 단백질 각각의 fract ion (크로마토그램 가로축에 붉은 색으로 각각의 fract ion에 대한 numbering이 되어있음)에 대한 전기영동을 수 행한 결과를 나타낸다.
<236> 도 9는 상기 2차 분리된 AIMP2-DX2 단백질에 대하여 전기영동을 수행한 결과 를 나타낸것이다 (도 8의 전기영동결과와 동일， ？: 본 발명에서 새롭게 수득된 2차 분리된 AIMP2-DX2 단백질을 의미하는 것으로 AIMP2-DX2-34S로 판정됨) .
<237> 도 10은 AIMP2-DX2-34S 단백질 클로닝 백터에서 유전자 삽입부위를 나타낸 모식도이다.
<238> 도 11은 AIMP2-DX2-34S 단백질이 형질전환된 Roset ta2(DE3)pLysS, BL21-
CodonPlus(DE3)-RIPL 및 C43(DE3) 의 서로 다른 대장균에 대하여, 각각 37°C 및 20 °C에서 단백질 발현을 유도한 후 상기 AIMP2-DX2-34S 단백질의 발현 및 용해성정도 를 전기영동을 통해 확인한 결과이다.
<239> 도 12는 AIMP2— DX2-34S 단백질이 형질전환된 균체 파쇄물로 부터 얻어진 상 층액으로부터， FPLC를 이용한 AIMP2-DX2-34S 단백질의 1차 정제 결과를 크로마토 그램으로 나타낸 것이다. 상기 크로마토그램 왼쪽 하단에 삽입된 이미지는 1차 정 제를 통해 분리된 재조합 단백질 각각의 fract ion (크로마토그램 가로축에 붉은 색 으로 각각의 fract ion에 대한 number ing이 되어있음)에 대한 전기영동을 수행한 결 과를 나타낸다.
<240> 도 13은 상기 1차 분리된 재조합 단백질 (도 12 참조)로부터， 크기배제 크로 마토그래피를 이용한 AIMP2-DX2-34S 단백질의 2차 정제 결과를 크로마토그램으로 나타낸 것이다. 상기 크로마토그램 왼쪽에 삽입된 이미지는 2차 정제를 통해 분리 된 재조합 단백질 각각의 peak 분획들에 대한 (각각의 peak에 1，2，3으로 표시)에 대 한 전기영동을 수행한 결과를 나타낸다.
<24i> 도 14는 상기 2차 분리된 재조합 단백질 (도 13 참조)로부터， 이은교환 크로 마토그래피를 이용한 AIMP2-DX2-34S 단백질의 3차 정제 결과를 크로마토그램으로 나타낸 것이다. 상기 크로마토그램 왼쪽 하단에 삽입된 이미지는 3차 정제를 통해 분리된 재조합 단백질 각각의 peak 분획들에 대한 (각각의 peak에 1，2 ,3으로 표시) 에 대한 전기영동을 수행한 결과를 나타낸다.
<242> 도 15는 상기 3차 분리된 재조합 단백질 (도 14 참조)로부터, 크기배제 크로 마토그래피를 이용한 AIMP2-DX2-34S 단백질의 4차 정제 결과를 크로마토그램으로 나타낸 것이다. 상기 크로마토그램 왼쪽에 삽입된 이미지는 4차 정제를 통해 분리 된 재조합 단백질 각각의 peak 분획들에 대한 (각각의 peak에 1 ,2 , 3으로 표시하며， 크로마토그램 가로축에 붉은 색으로 각각의 fract ion에 대한 number ing이 되어있 음)에 대한 전기영동을 수행한 결과를 나타낸다 (M: Thermo SCIENTIFIC 단백질 ladder) .
<243> 도 16는 p53 단백질과 AIMP2-DX2 ful l 또는 AIMP2-DX2-34S 단백질 사이의 상 호작용 (결합)을 co-IP 방법으로 분석한 결과를 나타낸다 ( IP: 면역침전， 항- streptavidin 항체 이용, WCL: 전체 세포 용해물， Mock : 플라스미드 없이 세포를 transfect ion reagent로 처리한 군, +WT: Strep-AIMP2-DX2 ful l 발현 플라스미드 도입， + 34S: Strep-AIMP2-DX2-34S 발현 플라스미드 도입) .
<244> 도 17은 p53 단백질과 AIMP2-DX2 ful l 또는 AIMP2-DX2-34S 단백질 사이의 상 호작용 (결합)을 GST Pul l -down assay 방법으로 분석한 결과를 나타낸다 ( input : cel l lysate 중 5%를 input으로 사용， EV: GST 단백질 (GST-EV)과 배양된 실험군， p53 : GST 표지된 p53 단백질과 배양된 실험군, strep : 항 -streptavi din 항체 이용 ) .
<245> 도 18은 AIMP2-DX2 ful l 또는 AIMP2-DX2-34S를 과발현시킨 각각의 293T 세포 에서， 48시간 후의 세포 증식를을 나타낸다 (EV: empty vector) .
<246>
【발명의 실시를 위한 형태】
<247> 이하 본 발명을 상세히 설명한다 .
<248> 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실 시예에 한정되는 것은 아니다.
<249>
<250> <실시여 1 1>
<251> 재조합 AIMP2-DX2 단백침 생산
<252>
<253> <1-1> AIMP2-DX2-Thioredoxin융합 단백질 제작 <254> 본 발명자들은 Human AIMP2-DX2 단백질의 과발현 및 높은 용해성 단백질을 얻기 위하여 pET-32a 백터 (Novagen)를 이용하여 재조합 단백질을 제작하였다. pET- 32a 백터에 융합되어 있는 109 아미노산을 가진 Thioredoxin(Trx)을
Figure imgf000029_0001
의 두 제한효소 부위를 이용하여 AIMP2-DX2 단백질에 융합시켜 높은 발현과 용해성 을 가진 재조합 단백질 (AIMP2-DX2— Trx, 서열번호 5 및 서열번호 6 참조)을 클로닝 하였다.
<255>
<256> <1-2> 재조합 AIMP2-DX2-Trx 단백질을 포함한 대장균 배양 및 단백질 과발현
<257> 재조합 단백질인 AIMP2-DX2-Trx를 대장균 Rosetta2(DE3)pLysS (Novagen)에 열층격 방법으로 형질전환하여 엠피실린 (+50 mg/L)이 포함된 LB배지에서 배양하여 저항성을 가진 콜로니를 선별하였다. 선별된 콜로니를 이용하여 대량배양을 위한 종균 배양을 엠피실린 (+50 mg/L)이 포함된 LB액체배지에 접종하여 37t：에서 16시간 진행하였다. 종균 배양액의 일부를 엠피실린이 포함된 본 배양 LB배지 (2%)에 접종 하여 37°C에서 OD600가 0.5가 되었을 때， 20°C로 온도를 낮추어 20분정도 배양을 진 행한 후에 0.5 mM IPTG (Isopropyl-beta-D-thiogalactoside)에 의해 재조합 단백질 의 발현을 유도 (induction) 하였다. 발현이 유도된 본 배양은 2( C에서 0D600가 변 함이 없을 때까지 (16시간정도) 배양된 후, 4°C에서 6000g로 10분간 원심분리를 하 여 균체 침전물을 회수하였다.
<258>
<259> <1-3> 재조합 AIMP2-DX2-Trx 단백질의 정제
<260> 회수된 균체 침전물을 파쇄 용액 [35mM Imidazole, 500mM NaCl, 20mM Tris-
HCl(pH7.5) I 균체 lg당 파쇄용액 10 mL]에 현탁하고， lOOmM PMSF (Phenyl methyl sul fonyl Fluoride I 균체 lg당 lOOmM PMSF 100 uL)를 첨가한 다 음 초음파 파쇄기 (S0NICS)를 이용하여 파쇄하였다. 파쇄 후에 4°C에서 18000 rpm으 로 50분간 원심분리 한 후에 상층액을 분리하여， 0.45um nitrocellulose membrane filter(MILLPORE)를 사용하여 상층액을 여과하였다.
<26i> -AIMP2-DX2-Trx의 1차 정제: 상기 여과된 상층액을 Pump P-KGE Healthcare) 을 사용하여 니켈이 층진이 된 HiTrap Chelating HP(GE Healthcare) 컬럼에 로딩하 였다. binding buffer는 20mM Tris-HCl(pH7.5), 500mM NaCl, 35mM Imidazole로 구 성된 용액을 사용하였다. 로딩을 한 컬럼을 FPLC(GE Healthcare)에 연결하고 3¾ 용 리용액 [1M Imidazole, 500mM NaCl, 20mM Tris-HCKpH7.5)]을 4ml/min 속도로 처리 하여 대장균의 단백질을 제거하고 50% 기울기 용리방법 (15분동안)으로 재조합 단 백질을 순도 이상으로 분리 정제하였다 (도 1 참조).
<262> -AIMP2— DX2-Trx의 2차 정제: 1차 분리된 재조합 단백질을 HiPrep 26/10
Desalt ing(GE Healthcare) 컬럼을 이용하여 이온교환 크로마토그래피의 로딩용액 [50mM NaCl, 5% Glycerol, 5mM Dithiothreitol, 20mM Tr is-HCl (pH8.5)]으로 교체하 고 (도 2 참조)， Hi Trap Q HP(GE Healthcare) 컬럼에 로딩하였다. binding buffer는 20mM Tris-HCl(pH8.5), 10% Glycerol, 5mM Dithiothreitol 50mM NaCl로 구성된 용 액을 사용하였다. 재조합 단백질을 2차적으로 분리하기 위하여 용리용액 [1M NaCl, 10% Glycerol, 5mM Dithiothreitol, 20mM Tris-HCl(pH8.5)]을 이용하여 100% 기을 기 용리방법 (4ml/min의 속도로 15min동안)을 사용하였다 (도 3 참조). 2차 정제로 재조합 단백질을 순도 90% 이상으로 분리 정제하였다.
<263> -AIMP2-DX2-Trx의 3차 정제: 2차 분리된 재조합 단백질을 크기배제 크로마토 그래피 [HiLoadl6/600 Superdex200(GE Healthcare), 150mM NaCl, 5% Glycerol, 5mM Dithiothereitol, 20mM Tris-HCKpH7.5)]를 이용하여 단백질을 순도 95¾> 이상으로 분리 정제를 실시하였다 (도 4 참조).
<264> -AMP2-DX2-TOC의 4차 정제: 상기 3차 정제에서 얻어진 재조합 단백질을 보 다 더 순도 높게 분리 정제하기 위하여 2차 분리 정제에 사용하였던 이온교환 크로 마토그래피를 한번 더 이용하여 5 기울기 용리방법 (4ml/min의 속도로 20분 동안) 을 실시하였다 (도 5 참조). 이때 binding buffer 및 elution buffer (용리 용액)은 상기 2차 분리 정제에서 사용된 것과 동일하다.
<265> -AIMP2-DX2-Trx의 5차 정제: 상기 4차 정제에서 얻어진 재조합 단백질의 저 장용액 [150mM NaCl, 5% Glycerol, 5mM Dithiothereitol , 20mM Tris-HCl (pH7.5)]을 위해 HiLoadl6/600 Superdex200(GE Healthcare)을 사용하여 크기배제 크로마토그래 피를 진행하였다. 5차 정제로 AIMP2-DX2-Trx 단백질을 순도 99% 이상으로 분리 정 제에 성공하였다.
<266> 각 단계별 정제과정에서 전기영동을 통해 단백질의 순도를 확인 하였다. 구 체적으로 각 단계별 정제과정에서 단백질 샘플을 10^를 5X SDS (10% w/v SDS, lOmM beta-mercaptoethanol , 25% Glycerol, 0.2Μ Tris-HCl ρΗ 6.8, 0.05% w/v Bromophenolblue)와 1:4로 비율로 섞어 100°C에서 5분간 끓였다. 끓인 시료를 12% SDS-PAGE( sodium dodecyl sul fate-polyacrylamide gel electrophoresis)에 로딩하 고 100V에서 10분， 200V에서 40분 동안 전개한 다음， 쿠마시 염색 방법으로 염색한 후 탈색하여 단백질의 순도를 확인 하였다 (이하의 실시예에서 전기영동을 통한 단 백질 순도 확인 방법은 동일하다). <267>
<268> <l-4>재조합 AIMP2-DX2-Trx단백질의 Thioredoxin제거
<269> 재조합 AIMP2-DX2 단백질만 얻기 위하여 AIMP2-DX2 단백질과 Thioredoxin 사 이의 트름빈 절단 부위를 이용하여 AIMP2-DX2 단백질만 분리하였다. 트롬빈 처리 반웅은 Thrombin Kits(Novagen)을 이용하여 실은에서 2시간 진행하였다. 반웅조건 은 1.75ml의 10X 트름빈 절단 용액, 1.5ml의 재조합 AIMP2-DX2— Trx 단백질 (3.75mg), 350ul의 200배 회석된 트름빈과 14ml의 증류수를 흔합하여 실험을 진행 하였다.
<270> -1차 정제: 2시간 반응직후에 반웅 흔합액을 니켈이 층진이 된 HiTrap
Chelating HP(GE Healthcare) 컬럼에 로딩하였다. binding buffer는 20mM Tris- HCl(pH7.5), 500mM NaCl, 35mM Imidazole로 구성된다. 로딩을 한 컬럼을 FPLCXGE Healthcare)에 연결하고 용리용액 [1M Imidazole, 500mM NaCl , 20mM Tris- HCl(pH7.5)]을 이용하여 50% 기을기 용리방법 (½l/min 속도로 15min 동안)으로 AIMP2-DX2 단백질과 Thioredoxin을 분리하였다 (도 7 참조).
<27i> -2차 정제: Thioredoxin이 제거된 AIMP2-DX2 단백질은 니켈 층진이 된
HiTrap Chelating HP 컬럼에 친화력이 없기 때문에 컬럼 로딩 후에 용리용액을 사 용하기 전에 분리가 되었고, 분리가 된 AIMP2-DX2 단백질을 고순도 및 저장용액 [150mM NaCl, 5% Glycerol, 5mM Dithiothereitol , 20mM Tris-HCKpH7.5)]을 위해 크기배제 크로마토그래피 [HiLoadl6/600 Super dex200(GE Healthcare)]를 진행하였다 (도 8 참조).
<272> 각 단계별 정제과정에서 전기영동을 통해 단백질의 순도를 확인 하였다. <273>
<274> <1-5> N 말단 아미노산서열 분석
<275> 재조합 AIMP2-DX2-Trx 단백질에서 Thioredoxin을 제거한 결과, AIMP2-DX2 단 백질의 분자량 보다 작은 분자량을 띄는 것을 전기영동을 수행한 결과 알게 되었고 (도 9 참조)， 정확한 단백질의 절단 위치를 파악하기 위하여 단백질 시료를 전기영 동을 거쳐 PVDF(Polyvinylidene fluoride)막에 고정시켜 ^한국질량분석기술에 N 말단 아미노산 서열 분석을 의뢰하였다. N 말단 아미노산 서열 분석은 에드먼 분해 법을 이용하여 N 말단의 5개 아미노산 서열분석이 시행되었다. 분석결과 N말단 서 열은 S-Y-G— P-A 로 분석되었으며， 이로서 AIMP2-DX2 단백질의 34번째 세린 아미노 산부터 시작하는 것을 발견하였다.
<276> <277> <실시예 2>
<278> 재조합 AI P2-DX2-34S 단백질 생산
<279>
<280> <2-l>새로운 재조합 단백질 제작
<28i> N 말단 아미노산 서열 분석을 통해 AIMP2-DX2 단백질의 안정한 형태를 발견 하였고， 이를 바탕으로 34번째 세린 (Ser ,S)부터 시작하는 새로운 재조합 단백질 AIMP2-DX2-34S를 제작하였다. 새로운 재조합 단백질은 pET-28a 백터 (Novagen)의 Atol과 의 제한효소 부위를 이용하여 C말단에 Hi s-Tag을 갖도록 클로닝을 진행 하였다 (도 10 참조) .
<282>
<283> <2-2> 재조합 AIMP2-DX2-34S 단백질을 포함한 대장균 배양 및 단백질 과발현
<284> 재조합 단백질인 AIMP2-DX2-34S를 대장균 Rosetta2(DE3)pLysS(Novagen) ,
BL21-CodonP 1 us ( DE3 ) -R I PL ( St r a t agene ) , C43(DE3) (Lu gen)에 열층격 방법으로 형 질전환하여 카나마이신 (+30 mg/L)이 포함된 LB배지에서 배양하여 카나마이신 저항 성을 가진 콜로니를 선별하였다. 선별된 콜로니를 이용하여 카나마이신 (+30 mg/L) 이 포함된 LB액체배지에 접종하여 37°C에서 16시간 배양하였다. 서로 다른 대장균 에서 재조합 단백질의 발현 및 용해성 정도를 파악하기 위해서 소량 배양 (5mL)을 진행하였다. 종균 배양액의 일부를 카나마이신이 포함된 LB배지 (2%)에 접종하여 37 °C에서 0D600가 0.5가 되었을 때， 0.5 mM IPTG( Isopropyl-beta-D-thiogalactoside) 에 의해 재조합 단백질의 발현을 유도 ( induct ion) 하였다. 발현이 유도된 본 배양 은 37°C에서 4시간 배양된 후 발현 및 용해성 실험을 진행하였다. 균체 침전물은 B-PER(Thermo SCIENTIFIC) 단백질 추출 시약을 사용하여 균체를 파쇄하였고, 발현 및 용해성 정도는 전기영동을 통해 확인 하였다. 재조합 단백질 AIMP2-DX2-34S는 대장균 BL21-CodonPkis(DE3)-RIPL(Stratagene)에서 가장 많이 발현 및 용해성을 띄 는 것을 확인하였고, 이를 바탕으로 용해성을 높이기 위해서 재조합 단백질의 발현 유도를 20°C에서 16시간 진행하였다. 결과적으로 20°C에서 발현이 유도된 AIMP2- DX2-34S 단백질은 비용해성에 비해 45%정도까지 수용성을 가졌다 (도 11 참조) .
<285>
<286> <2-3> 재조합 AIMP2-DX2-34S 단백질의 정제
<287> 재조합 AIMP2-DX2-34S 단백질의 대량 생산을 위해 종균 배양액의 일부를 카 나마이신이 포함된 본 배양 LB배지 ( )에 접종하여 37°C에서 0D600가 0.5가 되었을 때， 20°C로 온도를 낮추어 20분정도 배양을 진행한 후에 으 5 mM IPTGdsopropyl- beta-D-thiogalactoside)에 의해 재조합 단백질의 발현을 유도 (induction) 하였다. 발현이 유도된 본 배양은 20°C에서 0D600가 변함이 없을 때까지 (16시간정도) 배양 된 후, 4°C에서 6000g로 10분간 원심분리를 하여 균체 침전물을 회수하였다. 회수 된 균체 침전물을 파쇄 용액 [35mM Imidazole, 500mM NaCl, 20mM Tris-HCl (pH7.5) I 균체 lg당 파쇄용액 10 mL]에 현탁하고, lOOmM PMSF ( Pheny 1 me t hy 1 su 1 f ony 1 Fluoride I 균체 lg당 lOOmM PMSF 100 uL) 및 Protease inhibitor cocktail (Calbiochem I 균체 20g당 lOOuL)를 첨가한 다음 초음파 파쇄기 (SONICS)를 이용하여 파쇄하였다. 파쇄 후에 4°C에서 18000 rpm으로 50분간 원심분리 한 후에 상층액을 분리하여, 0.45um nitrocellulose membrane f i lter(MILLPORE)를 사용하여 상층액을 여과하였다.
<288> -AIMP2-DX2-34S 1차 정제: 상기 여과된 상층액에 Pump P-KGE Healthcare)을 사용하여 니켈이 층진이 된 HiTrap Chelating HP(GE Healthcare) 컬럼에 로딩하였 다. binding buffer는 35mM Imidazole, 500mM NaCl, 20mM Tr is-HCKpH7.5)로 구성 되었다. 상기 로딩을 한 컬럼을 FPLC(GE Healthcare)에 연결하고 5% 용리용액 [1M Imidazole, 500mM NaCl, 20mM Tris-HCl(pH7.5)]을 ½l/min 으로 처리하여 대장균의 단백질을 제거하고， 40% 기울기 용리방법 (20min 동안)으로 재조합 단백질을 분리 정제하였다 (도 12 참조).
<289> -AIMP2-DX2-34S 2차 정제: 1차 분리된 재조합 단백질을 크기배제 크로마토그 래피 [HiLoadl6/600 Super dex75 (GE Healthcare), lOOmM NaCl, 50mM HEPES(pH8.0)] 를 이용하여 단백질 분리 정제를 실시하였다 (도 13 참조).
<290> -AIMP2-DX2-34S 3차 정제: 2차척으로 분리된 재조합 단백질은 이온교환 크로 마토그래피를 위해 로딩용액 [50mM HEPES(pH8.0)]과 1:1 비율로 회석을 한 후 HiTrap SP HP 컬럼 (GE Healthcare)에 로딩을 하였다. binding buffer는 50mM HEPES(pH8.0)이 사용되었다. 재조합 단백질을 3차적으로 분리하기 위하여 용리용액 [1M NaCl, 50mM HEPES(pH8.0)]을 이용하여 40% 기을기 용리방법 (4ml/min 속도로 20m in동안)을 사용하여 재조합 단백질을 정제하였다 (도 14 참조).
<29i> -AIMP2-DX2-34S 4차 정제: 3차적으로 분리된 재조합 단백질의 저장용액
[lOOmM NaCl, 50mM HEPES(pH8.0)]을 위해 크기배제 크로마토그래피 (HiLoadl6/600 Superdex75 (GE Healthcare))를 한번 더 진행하였다 (도 15 참조).
<292> 각 단계별 정제과정에서 전기영동을 통해 단백질의 순도를 확인 하였다. 4단 계의 정제과정을 통해 순도 99% 이상의 재조합 AIMP2-DX2-34S 단백질을 생산하였 다. <293>
<294> <실시예 3>
<295> 재조합 AI P2-DX2-34S 단백질의 생물학적 활성 평가
<296> 상기 <실시예 2>에서 제조한 AIMP2-DX2-34S 단백질이 본래의 AIMP2-DX2 full sequence 단백질 (이하, AIMP2-DX2 full로 표시)과 동일한 활성을 갖는지를 확 인하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
<297>
<298> <3-1> co-IP( >-i画 unoprecipitation)을 통한 P53 단백질과의 결합 확인
<299> HA 표지된 p53 단백질 (이하, HA-p53으로 표기)을 발현하는 플라스미드
(addgene)로 293T 세포를 형질감염 시키고, 상기 HA-p53이 과발현된 293T 세포에 Streptavidine으로 표지된 strep-AIMP2-DX2 Full 또는 strep-AIMP2-DX2 34S를 과발 현 시켰다.
<300> 각각의 293T 세포를 용해 (lysis) 시킨 후 용해물 (lysate)을 strep ant i body (iba, Cat. No. 2-1509-001)를 이용하여 면역침전 (immunoprecipitation)하 였다. 상기 침전된 단백질은 SDS-PAGE를 이용하여 분리되었다. 침전된 HA-p53, 결 합한 strep-AIMP2-DX2 Full 또는 34S 단백질은 HA antibody, strep ant i body ( iba) 를 이용한 Western blot을 통해 확인되었다.
<301>
<302> 그 결과 [도 16]에서 보는 바와 같이， AIMP2-DX2 full 단백질과 마찬가지로 본원 발명의 AIMP2-DX2-34S단백질 또한 p53 단백질과 결합함을 확인하였다.
<303>
<304> <3-2> GST Pull -down assay를 이용한 P53 단백질과의 결합 확인
<305> AIMP2-DX2-34S와 p53 단백질과의 상호 작용은 GST Pull -down 분석법으로 추 가로 시험되었다. GST 단백질 (GST-EV로 표시, GE Healthcare) 또는 GST 표지된 p53 단백질 (이하, GST-p53 단백질로 표시)을, Streptavidine으로 표지된 strep-AIMP2- DX2 Full 또는 strep-AIMP2-DX2 34S가 과발현된 세포 용해물과 4시간동안 incubation 해주었다. Incubation 후, 각각의 시료에서 GST 단백질은 Glutathione sepharose 4B(GE Heathcare, Cat. No. 17-0756-01)를 이용하여 침전 하였다. 침전 된 단백질은 SDS-PAGE를 이용하여 분리되었다. GST 단백질에 결합한 strep-AIMP2- DX2 Full 또는 strep-AIMP2-DX2-34S 단백질은 strep ant i body (iba, Cat. No. 2- 1509-001)를 이용한 Western blot을 통해 확인되었다. GST 단백질은 coomassie staining을 통해 확인하였다. <306>
<307> 상기 pul l down 실험을 통하여 [도 1기에서 보는 바와 같이, AI P2-DX2 ful l 단백질과 마찬가지로 본원 발명의 AIMP2-DX2-34S 단백질 또한 p53 단백질과 직접적 으로 결합함을 확인하였다.
<308> 이러한 결과는 AIMP2-DX2-34S 단백질이 본래의 AIMP2-DX2 ful l sequence 단 백질과 동일한 활성을 가짐을 나타낸다.
<309>
<3 i o> <3-3> AIMP2-DX2 Ful l 또는 AIMP2-DX2-34S에 의해 유도된 세포 증식 비교
<3 ΐ ι> 293T 세포에 strep-AI P2-DX2 Ful l 또는 strep-AIMP2-DX2 34S를 과발현 시켰 다. 48시간 후 MTT assay(usb, Cat . No. 19265)를 통해 prol i ferat ion을 측정하였 다.
<312>
<313> 그 결과 [도 18]에서 보는 바와 같이, 본 발명의 AIMP2-DX2-34S는 본래의
AIMP2-DX2 Ful l과 동일한 수준으로 세포과증식을 일으키는 것을 확인하였다. 이는 기존에 AIMP2-DX2가 AIMP2와 경쟁적으로 작용하여, 정상 세포의 이상증식을 억제하 고 암세포가 사멸되도록 유도하는 p53과 AIMP2의 결합을 방해한다는 사실과 부합한 다.
<314>
<315> 상기 실시예 3의 실험들을 통해 본원 발명의 AIMP2-DX2-34S는 AIMP2-DX2 Ful l 과 생물학적으로 동일한 활성을 가짐을 확인하였다.
<316>
【산업상 이용가능성】
<317> 이상 살펴본 바와 같이， 본 발명은 AIMP2-DX2-34S 단백질 및 이의 제조방법 에 관한 것으로, 좀 더 상세하게 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 AIMP2-DX2- 34S 단백질, 상기 AIMP2-DX2-34S 단백질을 코딩하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 백터, 상기 재조합 백터로 형질전환된 형질전환 미생물, 상기 형 질전환 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 상기 AIMP2-DX2-34S 단백질 제조 방법, 상기 AIMP2— DX2-34S 단백질에 특이적인 항체 및 신약개발에 있어서 이들의 이용방 법에 관한 것이다.
<318> 본 발명의 AIMP2-DX2-34S 단백질은 AIMP2-DX2와 동일한 활성을 가질뿐만 아 니라， 정제된 단백질 사이의 웅집 (aggregat ion)일 일어나지 않고 높은 용해성을 가 지기 대문에 단백질의 대량생산에 매우 효과적이다. 따라서 상기 대량생산 및 정제 된 AIMP2-DX2-34S 단백질은， 구조에 근거한 신약개발 과정에 필요한 단계인 단백질 결정제작 및 χ-ray 크리스탈로그라피에 의한 AIMP2-DX2-34S 단백질의 3차원 구조 결정에 있어 매우 유용하게 사용될 수 있으므로 산업상 이용 가능성이 있다.

Claims

【청구의 범위】
【청구항 1】
서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 AIMP2-DX2-34S 단백질.
【청구항 2]
제 1항의 AIMP2-DX2-34S 단백질을 코딩하는 핵산 분자.
【청구항 3】
거 12항에 있어서， 상기 핵산 분자는 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열을 가 지는 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
【청구항 4】
제 2항의 핵산 분자를 포함하는 재조합 백터.
【청구항 5]
거 14항의 재조합 백터로 형질전환된 형질전환 미생물.
【청구항 6】
제 5항에 있어서, 상기 형질전환 미생물이 ^ ^^ Eschenchia 인 것을 특징으로 하는 형질전환 미생물.
【청구항 7】
제 5항의 형질전환 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 제 1항의 AIMP2-DX2- 34S 단백질 제조 방법 .
【청구항 8】
계 1항의 AIMP2-DX2-34S 단백질에 특이적인 항체.
【청구항 9】
제 8항의 AIMP2-DX2-34S 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 암 진단 키트
【청구항 10】 (a) 분석할 시료를 제공하는 단계; 및 (b) 상기 시료를 게 8항의 AIMP2-DX2- 34S 단백질에 특이적인 항체와 접촉시키는 단계를 포함하는， AIMP2-DX2를 검출하는 방법.
【청구항 111
제 1항의 AIMP2-DX2-34S 단백질의 mRNA에 특이적인 s iRNA 핵산 분자.
【청구항 12】
제 1항의 AIMP2-DX2-34S 단백질의 mRNA에 상보적인 서열을 갖는 안티센스 핵 산 분자.
【청구항 13]
제 11항의 s iRNA 핵산 분자 또는 제 12항의 안티센스 핵산 분자를 포함하는 암 을 치료하기 위한 약제학적 조성물.
【청구항 14]
제 11항의 s iRNA 핵산 분자 또는 제 12항의 안티센스 핵산 분자의 암 치료제 제조를 위한 용도.
【청구항 15]
제 11항의 siRNA 핵산 분자 또는 제 12항의 안티센스 핵산 분자를 이를 필요로 하는 개체에 유효량으로 투여하는 것을 특징으로 하는 암 치료 방법 .
【청구항 16】
(a) 시험물질을 제 1항의 AIMP2-DX2-34S 단백질을 코딩하는 유전자를 발현하 는 세포와 접촉시키는 단계 및 (b) 시험물질에 의한 AIMP2-DX2-34S 단백질을 코딩 하는 유전자의 발현 억제 또는 AIMP2-DX2-34S 단백질의 분해 촉진을 측정하는 단계 를 포함하여, AIMP2-DX2 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 억제 또는 AIMP2-DX2 단백질의 분해를 촉진 하는 항암제를 스크리닝하는 방법.
【청구항 17】
제 16항에 있어서， RT-PCR또는 웨스턴 블랏으로 스크리닝하는 방법 . 【청구항 18】
(a) 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산분자를 포함하는 발현 백터 를 제조하는 단계 ;
(b) 상기 (a) 단계의 발현 백터로 대장균을 형질전환 시키고 배양하는 단계;
(c) 상기 (b) 단계에서 배양된 대장균을 파쇄하여 AIMP2-DX2-34S 단백질을 수득하는 단계를 포함하는, AIMP2-DX2-34S 단백질의 대량생산 방법ᅳ.
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