CN104662043B - 用于预防、治疗和诊断炎性病症的方法和化合物 - Google Patents

用于预防、治疗和诊断炎性病症的方法和化合物 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种对作为对应于人蛋白S100A9的氨基酸位置63‑79或73‑85的区域的表位具有特异性的抗体。还提供一种对作为对应于人蛋白S100A8的氨基酸位置55‑71的区域的表位具有特异性的抗体。还提供此种抗体在治疗或诊断炎性障碍中的用途。另外提供一种鉴别能够抑制对应于S100A9的上述表位或S100A8的上述表位中的一种的肽与TLR4受体之间的复合物形成的化合物的体外方法，其中使疑似影响复合物形成的化合物与所述肽和所述TLR4受体接触。还提供一种鉴别能够增强S100A9蛋白和S100A8蛋白之间的复合物的稳定性的化合物的体外方法，其中在存在疑似影响复合物形成的化合物的情况下，使所述两个蛋白接触。

Description

用于预防、治疗和诊断炎性病症的方法和化合物
相关申请的交叉引用
本申请要求2011年10月17日向欧洲专利局提交的、并正式分配了序列号EP 12183 736的申请“用于预防、治疗和诊断炎性病症的方法和化合物”的利益和优先权。出于所有目的，所述2011年10月17日提交的申请的内容通过引用全文并入本文，所述全文包括所有表格、附图和权利要求-以及包括并入本文不包括的且根据PCT第4.18条的、PCT第20.5(a)条中涉及的说明书、权利要求书或附图中的任何元素或部分。
发明领域
本发明涉及用于预防、治疗和诊断受试者中的炎性病症的方法和化合物。还提供了鉴定适用于预防、治疗和诊断受试者中的炎性病症的化合物的方法。
发明背景
本发明的背景的下列讨论仅提供用于帮助读者理解本发明，并不承认对本发明进行描述或构成本发明的现有技术。
不受控制的炎性过程在很多疾病如感染、败血症、败血性休克、过敏和自身免疫性疾病以及慢性疾病如动脉硬化中起重要作用。除特异性、非特异性适应性免疫系统之外，先天免疫系统的炎症过程也已成为近期人们的关注焦点。所述先天免疫系统代表抵御入侵的病原体和其他外部有害介质的第一道防线。各种病原体的保守结构通过特异的“模式识别受体”(PRR)进行识别得到充分表征。PRR尤其包括Toll-类受体(TLR)家族，其起始炎性过程的激活，也被称为“病原相关分子模式”(PAMP)。例如，在用革兰氏阴性细菌感染的过程中，脂多糖(LPS)通过吞噬细胞中的LPS受体复合物(TLR4/MD2/CD14)非常有效地诱导炎性反应，特别是促炎细胞因子如TNFα和IL1β的诱导。
阻断TLR4的治疗方法已经在临床研究中检查。此外，在过去几年，已经鉴定出所谓“损伤相关分子模式”(DAMP)，这是细胞应激期间由激活的或坏死的细胞释放的蛋白质。这些内源性配体或“Alarmin”同样激活PRR，由此放大所述炎性免疫应答和增强炎性反应。两个DAMP蛋白是S100蛋白家族的成员，即S100A8和S100A9。
目前，旨在阻断TLR4的治疗方法-直至它们涉及革兰氏阴性细菌内毒素的结合位点-包含感染风险增加，因为这种治疗同样不可避免地阻断对这些细菌产物的响应。因此，能够通过避免此些副作用的方法抑制炎症反应是令人期待的。
发明概述
本文提供适合用于抑制脊椎动物生物体中的炎症反应的方法和化合物。与传统的治疗方法相比，本文所述的方法或用途涉及影响两个内源TLR4配体即S100A8/S100A9的作用。由此这种用途或方法实际上比传统方法更有特异性。
在健康个体的血液中，所述蛋白S100A8和S100A9以无活性复合物的形式存在。对于他们展开的促炎性功能，需要激活所述蛋白。发明人已经鉴别这个活化机制，由此对于抗炎性疗法的新方法也是非常特殊的出发点。
第一方面，本发明提供一种对脊椎动物S100A9蛋白的表位具有结合特异性的化合物。所述表位具有对应于跨Uniprot/Swissprot登录号为P06702的人蛋白S100A9(2012年9月5日的版本147，SEQ ID NO：77)的从氨基酸位置63至氨基酸位置79范围的氨基酸的区域的氨基酸序列。任何对“所述”人蛋白S100A9的提及涉及此数据库条目的序列的蛋白质。这个区域，即人蛋白S100A9的氨基酸位置63-79，也对应于跨牛蛋白S100A9的从氨基酸位置63至氨基酸位置点79范围的氨基酸序列。这个区域还对应于从推定的马蛋白S100A9(Swissprot/Uniprot登录号为F6RM82，2012年9月5日的版本10，SEQ ID NO：79)的氨基酸位置62至氨基酸位置78的氨基酸序列。所述区域还对应于从推定的狨猴蛋白S100A9(Swissprot/Uniprot登录号为F7ID42，2012年9月5日的版本8，SEQ ID NO：80)的氨基酸位置62至氨基酸位置78的氨基酸序列。所述区域还对应于从推定的狨猴蛋白S100A9(Swissprot/Uniprot登录号为F7ID42，2013年7月24日的版本15，SEQ ID NO：81)的氨基酸位置62至氨基酸位置78的氨基酸序列。作为另一例子，这个区域对应于从牛蛋白S100A9(Swissprot/Uniprot登录号为E1BLI9，2013年5月29日的版本14，SEQ ID NO：85)的氨基酸位置63至氨基酸位置79的氨基酸序列。在典型的实施方案中，根据第一方面的化合物为对上述表位具有结合特异性的免疫球蛋白或蛋白质性结合配偶体。
脊椎动物S100A9蛋白被认为包括脊椎动物S100A9蛋白的任何天然存在的变体。在一些实施方案中，根据第一方面的化合物为用作药物或用于诊断的化合物。
第二方面，本发明提供一种对脊椎动物S100A9蛋白的表位具有结合特异性的化合物。所述表位具有对应于跨从SEQ ID NO：77的人蛋白S100A9的氨基酸位置73至氨基酸位置85范围的氨基酸序列的区域的氨基酸序列(参见下文)。这个区域还对应于从推定的马蛋白S100A9(Swissprot/Uniprot登录号为F6RM82，2012年9月5日的版本10，SEQ ID NO：79)的氨基酸位置72至氨基酸位置84的氨基酸序列。在典型的实施方案中，根据第二方面的化合物为对上述表位具有结合特异性的免疫球蛋白或蛋白质性结合配偶体。
在一些实施方案中，根据第二方面的化合物为用作药物或用于诊断的化合物。
第三方面，本发明提供一种对脊椎动物S100A8蛋白的表位具有结合特异性的化合物。所述表位具有对应于跨从人蛋白S100A8的氨基酸位置55至氨基酸位置7的范围的氨基酸序列的区域的氨基酸序列，所述人蛋白S100A8具有Uniprot/Swissprot登录号P05109(2012年9月5日的版本138，SEQ ID NO：78)。任何对“所述”人蛋白S100A8的提及涉及此数据库条目的序列的蛋白质。这个区域，即人蛋白S100A8的氨基酸位置55-71，还对应于从推定的负鼠蛋白S100A8(Swissprot/Uniprot登录号为F6SK92，2012年9月5日的版本9，SEQ IDNO：82)的氨基酸位置58至氨基酸位置73的氨基酸序列。在典型的实施方案中，根据第三方面的化合物为对上述表位具有结合特异性的免疫球蛋白或蛋白质性结合配偶体。
脊椎动物S100A8蛋白被认为包括脊椎动物S100A8蛋白的任何天然存在的变体。在一些实施方案中，根据第三方面的化合物为用作药物或用于诊断的化合物。
第四方面，本发明提供根据所述第一方面的化合物和根据所述第三方面的化合物的组合。在一些实施方案中，所述组合还包括根据所述第二方面的化合物。在一些实施方案中，根据所述第四方面的组合包含在单一的化合物中，所述单一的化合物如单一免疫球蛋白或蛋白质性结合配偶体。这种免疫球蛋白或蛋白质性结合配偶体通常具有至少双重结合特异性。
在一些实施方案中，根据第四方面的组合为用作药物或用于诊断的组合。
第五方面，本发明提供根据所述第二方面的化合物和根据所述第三方面的化合物的组合。在一些实施方案中，根据第五方面的所述组合包含在单一的化合物中，单一的化合物如单一免疫球蛋白或蛋白质性结合配偶体。这种免疫球蛋白或蛋白质性结合配偶体通常具有至少双重结合特异性。
在一些实施方案中，根据第五方面的组合为用作药物或用于诊断的组合。
第六方面，本发明提供根据所述第一方面的化合物和根据所述第二方面的化合物的组合。在一些实施方案中，根据第六方面的组合包含在单一的化合物中，所述单一的化合物如单一免疫球蛋白或蛋白质性结合配偶体。这种免疫球蛋白或蛋白质性结合配偶体通常具有至少双重结合特异性。
在一些实施方案中，根据第六方面的组合为用作药物或用于诊断的组合。
第七方面，本发明提供一种治疗患有炎性障碍的受试者的方法。所述方法包括给所述受试者施用根据第一方面的化合物和/或根据第二方面的化合物。
第八方面，本发明提供一种治疗患有炎性障碍的受试者的方法。所述方法包括给所述受试者施用根据第三方面的化合物。
第九方面，本发明提供一种治疗患有炎性障碍的受试者的方法。所述方法包括给所述受试者施用根据第四、第五或第六方面的组合。
第十方面，本发明提供一种分离肽或拟肽。所述肽或拟肽包含X3EX2X3X1X1X1X1X1X1X5X1X1X6X2X1X1(SEQ ID NO：6)的序列，基本上由X3EX2X3X1X1X1X1X1X1X5X1X1X6X2X1X1(SEQ IDNO：6)的序列组成，或由X3EX2X3X1X1X1X1X1X1X5X1X1X6X2X1X1(SEQ ID NO：6)的序列组成。在这个序列和本文所公开的任何其他序列中，X1代表任何氨基酸。在这个序列和本文所公开的任何其他序列中，X2代表具有携带羧酸基团的侧链的氨基酸。在这个序列和本文所公开的任何其他序列中，X3代表非极性氨基酸。在这个序列和本文所公开的任何其他序列中，X5代表氨基酸D、N、E或Q中的一个。在这个序列和本文所公开的任何其他序列中，X6代表芳香族氨基酸。
通常，根据第十方面的肽不同于全长钙结合蛋白。在一些实施方案中，根据第十方面的拟肽具有不同于全长S100蛋白如S100A9的序列的序列，所述S100A9为全长蛋白钙粒蛋白-B。
根据第十方面的肽通常具有150个氨基酸或更少、例如120个氨基酸或更少的长度。在一些实施方案中，所述肽通常具有100个氨基酸或更少的长度。在一些实施方案中，所述肽通常具有80个氨基酸或更少的长度。在一些实施方案中，所述肽通常具有60个氨基酸或更少的长度。在一些实施方案中，所述肽通常具有50个氨基酸或更少的长度。在一些实施方案中，所述肽通常具有40个氨基酸或更少的长度。在一些实施方案中，所述肽通常具有30个氨基酸或更少的长度。
在一些实施方案中，根据第十方面的分离肽或拟肽包含X3EX2X3X2X1X4X1X5X1X5X1X1X6X2X2X1(SEQ ID NO：66)的序列或其同源物，基本上由X3EX2X3X2X1X4X1X5X1X5X1X1X6X2X2X1(SEQ ID NO：66)的序列或其同源物组成，或由X3EX2X3X2X1X4X1X5X1X5X1X1X6X2X2X1(SEQ IDNO：66)的序列或其同源物组成。
在一些实施方案中，根据第十方面的分离肽或拟肽包含X3EX2X3X2X1X4X1X5X1QX1X6X1EX2X1(SEQ ID NO：64)的序列或其同源物，基本上由X3EX2X3X2X1X4X1X5X1QX1X6X1EX2X1(SEQ ID NO：64)的序列或其同源物组成，或由X3EX2X3X2X1X4X1X5X1QX1X6X1EX2X1(SEQ ID NO：64)的序列或其同源物组成。在这个序列和本文所公开的任何其他序列中，X4代表氨基酸N或Q中的一个。
在一些实施方案中，根据第十方面的分离肽或拟肽包含MEX2X1X1X1NX1X1X1QX1X1FEX1X1(SEQ ID NO：67)的序列或其同源物，基本上由MEX2X1X1X1NX1X1X1QX1X1FEX1X1(SEQ ID NO：67)的序列或其同源物组成，或由MEX2X1X1X1NX1X1X1QX1X1FEX1X1(SEQ ID NO：67)的序列或其同源物组成。
在一些实施方案中，根据第十方面的分离肽或拟肽包含MEX2X3X8X1X1X1X1X1QX1X1FEX8X1(SEQ ID NO：74)的序列或其同源物，基本上由MEX2X3X8X1X1X1X1X1QX1X1FEX8X1(SEQ ID NO：74)的序列或其同源物组成，或由MEX2X3X8X1X1X1X1X1QX1X1FEX8X1(SEQ ID NO：74)的序列或其同源物组成。在这个序列和本文所公开的任何其他序列中，X8代表极性氨基酸。
在一些实施方案中，根据第十方面的分离肽或拟肽包含MEX2X3X8X1X8X1X8X1QX1X1FEX2X1(SEQ ID NO：75)的序列或其同源物，基本上由MEX2X3X8X1X8X1X8X1QX1X1FEX2X1(SEQ ID NO：75)的序列或其同源物组成，或由MEX2X3X8X1X8X1X8X1QX1X1FEX2X1(SEQ ID NO：75)的序列或其同源物组成。
在一些实施方案中，根据第十方面的分离肽或拟肽包含MEX2X3X2X1X2X1X2X1QX1X1FEX8X1(SEQ ID NO：76)的序列或其同源物，基本上由MEX2X3X2X1X2X1X2X1QX1X1FEX8X1(SEQ ID NO：76)的序列或其同源物组成，或由MEX2X3X2X1X2X1X2X1QX1X1FEX8X1(SEQ ID NO：76)的序列或其同源物组成。
在一些实施方案中，根据第十方面的分离肽或拟肽包含MEX2X3DX1NX1DX1QX1X1FEX2X1(SEQ ID NO：7)的序列或其同源物，基本上由MEX2X3DX1NX1DX1QX1X1FEX2X1(SEQ ID NO：7)的序列或其同源物组成，或由MEX2X3DX1NX1DX1QX1X1FEX2X1(SEQ ID NO：7)的序列或其同源物组成。
在一些实施方案中，根据第十方面的分离肽或拟肽包含MEDX3X1X3X1X1DX1QX3X1FEX1X1(SEQ ID NO：72)的序列或其同源物，基本上由MEDX3X1X3X1X1DX1QX3X1FEX1X1(SEQ ID NO：72)的序列或其同源物组成，或由MEDX3X1X3X1X1DX1QX3X1FEX1X1(SEQ ID NO：72)的序列或其同源物组成。
在一些实施方案中，根据第十方面的分离肽或拟肽包含MEDX3X2X3X5X1X5X1QX3X1FEX2X1(SEQ ID NO：73)的序列或其同源物，基本上由MEDX3X2X3X5X1X5X1QX3X1FEX2X1(SEQ ID NO：73)的序列或其同源物组成，或由MEDX3X2X3X5X1X5X1QX3X1FEX2X1(SEQ ID NO：73)的序列或其同源物组成。
在一些实施方案中，根据第十方面的分离肽或拟肽包含MEDX3DX3NX1DX1QX3X1FEEX1(SEQ ID NO：8)的序列或其同源物，基本上由MEDX3DX3NX1DX1QX3X1FEEX1(SEQ ID NO：8)的序列或其同源物组成，或由MEDX3DX3NX1DX1QX3X1FEEX1(SEQ ID NO：8)的序列或其同源物组成。
在一些实施方案中，第十方面的肽或拟肽由SEQ ID NO：6的序列的同源物组成，包含SEQ ID NO：6的序列的同源物，或基本上由SEQ ID NO：6的序列的同源物组成。
第十一方面，本发明提供一种分离肽或拟肽。所述肽或拟肽包含X5X1X1X6X2X1X1X1X3X3X3X3X1(SEQ ID NO：9)的序列，基本上由X5X1X1X6X2X1X1X1X3X3X3X3X1(SEQID NO：9)的序列组成，或由X5X1X1X6X2X1X1X1X3X3X3X3X1(SEQ ID NO：9)的序列组成。这个序列中的X1、X2、X3、X5和X6如上定义。通常，根据第十一方面的肽不同于钙结合蛋白。在一些实施方案中，根据第十一方面的拟肽具有不同于钙结合蛋白的序列的序列。
通常，根据第十一方面的肽不同于全长钙结合蛋白。在一些实施方案中，根据第十一方面的肽具有不同于全长S100蛋白如S100A9的序列的序列，所述S100A9为全长蛋白质钙粒蛋白-B。
根据第十一方面的所述肽通常具有150个氨基酸或更少、例如120个氨基酸或更少的长度。在一些实施方案中，所述肽通常具有100个氨基酸或更少的长度。在一些实施方案中，所述肽通常具有80个氨基酸或更少的长度。在一些实施方案中，所述肽通常具有60个氨基酸或更少的长度。在一些实施方案中，所述肽通常具有50个氨基酸或更少的长度。在一些实施方案中，所述肽通常具有40个氨基酸或更少的长度。在一些实施方案中，所述肽通常具有30个氨基酸或更少的长度。
在一些实施方案中，根据第十一方面的分离肽或拟肽包含X5X1X1X6X2X2X1X1X3X3X3X3X1(SEQ ID NO：68)的序列或其同源物，基本上由X5X1X1X6X2X2X1X1X3X3X3X3X1(SEQ ID NO：68)的序列或其同源物组成，或由X5X1X1X6X2X2X1X1X3X3X3X3X1(SEQ ID NO：68)的序列或其同源物组成。
在一些实施方案中，根据第十一方面的分离肽或拟肽包含QX1X1FEX2X1X1X3X3X3X3X7(SEQ ID NO：10)的序列或其同源物，基本上由QX1X1FEX2X1X1X3X3X3X3X7(SEQ ID NO：10)的序列或其同源物组成，或由QX1X1FEX2X1X1X3X3X3X3X7(SEQ ID NO：10)的序列或其同源物组成。在本文所公开的这个序列和任何其他序列中，X7代表氨基酸R或K中的一个。
在一些实施方案中，根据第十一方面的分离肽或拟肽包含QX1X6X1EX2X1X1X3X3X3X3X7(SEQ ID NO：65)的序列或其同源物，基本上由QX1X6X1EX2X1X1X3X3X3X3X7(SEQ ID NO：65)的序列或其同源物组成，或由QX1X6X1EX2X1X1X3X3X3X3X7(SEQ ID NO：65)的序列或其同源物组成。
在一些实施方案中，根据第十一方面的分离肽或拟肽包含QX3X1FEEX1X1MLMX3X7(SEQ ID NO：11)的序列或其同源物，基本上由QX3X1FEEX1X1MLMX3X7(SEQ ID NO：11)的序列或其同源物组成，或由QX3X1FEEX1X1MLMX3X7(SEQ ID NO：11)的序列或其同源物组成。在一些实施例中，第十一方面的肽或拟肽由SEQ ID NO：6的序列的同源物组成，包含SEQ ID NO：6的序列的同源物，或基本上由SEQ ID NO：6的序列的同源物组成。
第十二方面，本发明提供一种分离肽或拟肽。所述分离肽或拟肽包含X6X8X5X3X1X1X1X1X1X1X1X1NX3X5X1X6(SEQ ID NO：12)的序列或该序列的同源物，基本上由X6X8X5X3X1X1X1X1X1X1X1X1NX3X5X1X6(SEQ ID NO：12)的序列或该序列的同源物组成，或由X6X8X5X3X1X1X1X1X1X1X1X1NX3X5X1X6(SEQ ID NO：12)的序列或该序列的同源物组成。这个序列中的X1、X2、X3、X5和X6如上定义。X5代表D、N、E或Q。在本文所公开的这个序列和任何其它序列中，X8代表极性氨基酸。通常，根据第十二方面的肽或拟肽不同于钙结合蛋白。
在一些实施方案中，根据第十二方面的分离肽或拟肽包含FX8X5X3X1X1X1X1X1X1X1X1NX3X5X1F(SEQ ID NO：2)的序列或其同源物，基本上由FX8X5X3X1X1X1X1X1X1X1X1NX3X5X1F(SEQ ID NO：2)的序列或其同源物组成，或由FX8X5X3X1X1X1X1X1X1X1X1NX3X5X1F(SEQ ID NO：2)的序列或其同源物组成。
在一些实施方案中，根据第十二方面的分离肽或拟肽包含FX8X5X3X1X1X8X1X1X1X1X1NX3X5X1F(SEQ ID NO：4)的序列或其同源物，基本上由FX8X5X3X1X1X8X1X1X1X1X1NX3X5X1F(SEQ ID NO：4)的序列或其同源物组成，或由FX8X5X3X1X1X8X1X1X1X1X1NX3X5X1F(SEQ ID NO：4)的序列或其同源物组成。
在一些实施方案中，根据第十二方面的分离肽或拟肽包含FX8X5X3X2X1X8X1DX1X1X1NX3X5X1F(SEQ ID NO：69)的序列或其同源物，基本上由FX8X5X3X2X1X8X1DX1X1X1NX3X5X1F(SEQ ID NO：69)的序列或其同源物组成，或者由FX8X5X3X2X1X8X1DX1X1X1NX3X5X1F(SEQ ID NO：69)的序列或其同源物组成。
在一些实施方案中，根据第十二方面的分离肽或拟肽包含FX8X5X3X2X1X8X1X1X1X1X1NX3X5EF(SEQ ID NO：70)的序列或其同源物，基本上由FX8X5X3X2X1X8X1X1X1X1X1NX3X5EF(SEQ ID NO：70)的序列或其同源物组成，或由FX8X5X3X2X1X8X1X1X1X1X1NX3X5EF(SEQ ID NO：70)的序列或其同源物组成。
在一些实施方案中，根据第十二方面的分离肽或拟肽包含FX8X5X3X2X1X8X1X1X1X1X1NX3X5EF(SEQ ID NO：71)的序列或其同源物，基本上由FX8X5X3X2X1X8X1X1X1X1X1NX3X5EF(SEQ ID NO：71)的序列或其同源物组成，或由FX8X5X3X2X1X8X1X1X1X1X1NX3X5EF(SEQ ID NO：71)的序列或其同源物组成。
在一些实施方案中，根据第十二方面的分离肽或拟肽包含FX8EX3DX1NX1DX9X1X10NX11X5EF(SEQ ID NO：13)的序列或其同源物，基本上由FX8EX3DX1NX1DX9X1X10NX11X5EF(SEQ ID NO：13)的序列或其同源物组成，或由FX8EX3DX1NX1DX9X1X10NX11X5EF(SEQ ID NO：13)的序列或其同源物组成。在一些实施方案中，第十二方面的分离肽或拟肽由SEQ ID NO：6的序列的同源物组成，包含SEQ ID NO：6的序列的同源物，或基本上由SEQ ID NO：6的序列的同源物组成。
通常，根据第十二方面的分离肽或拟肽不同于全长钙结合蛋白。在一些实施方案中，根据第十二方面的分离肽或拟肽具有不同于全长S100蛋白如S100A8的序列的序列。在一些实施方案中，根据第十二方面的肽或拟肽具有不同于钙调蛋白的序列的序列。
根据第十二方面所述的肽通常具有130个氨基酸或更少、例如120个氨基酸或更少的长度。在一些实施方案中，所述肽通常具有100个氨基酸或更少的长度。在一些实施方案中，所述肽通常具有80个氨基酸或更少的长度。在一些实施方案中，所述肽通常具有60个氨基酸或更少的长度。在一些实施方案中，所述肽通常具有50个氨基酸或更少的长度。在一些实施方案中，所述肽通常具有40个氨基酸或更少的长度。在一些实施方案中，所述肽通常具有30个氨基酸或更少的长度。
对于本文所公开的给定序列，用于序列的选择的氨基酸位置的各个氨基酸的任何实施方案，包含合适的氨基酸如包含在任何序列中的X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X11、X12、X13、X14或X15的组和/或亚组，可以这样与在任何其他同源序列中示出的选择的位置中的任何其他氨基酸、合适的氨基酸的组和/或亚组结合。因此，在本文所公开的肽或拟肽的各种实施方案的位置处的各个氨基酸可以彼此结合以提供相应肽或拟肽的其他实施方案。在作为特定序列的实施方案示出的这种氨基酸、氨基酸的组或亚组对应于另一序列的氨基酸位置时，这些氨基酸、氨基酸的组或亚组可以与上下文所示的任何这种序列的氨基酸、氨基酸的组或亚组单独结合在任一序列中。这同样适用于在由通用变量如X1、X2、X3或X4命名的选择位置处的各个氨基酸的实施方案中，包括如下文所示的合适氨基酸的组和/或亚组，即作为特定序列的实施方案示出的氨基酸或氨基酸的组/亚组的位置。因此，在序列包括例如表示为X7的氨基酸和表示为X5的氨基酸时，如X7为R和X7为K与D、N、E或Q中的任一种代表X5的组合中的任一种都在本文件的公开内容中。作为一个示意性实例，X7为R和X5为D的组合同样包括，如同X7为K和X5为D的组合或X7为R和X5为Q的组合。
第十三方面，本发明提供根据第十方面的分离肽或拟肽和根据第十二方面的分离肽或拟肽的组合。在一些实施方案中，所述组合还包含根据第十一方面的分离肽或拟肽。在一些实施例中，根据第十三方面的肽或拟肽的组合包含在单一的肽或拟肽中。
在一些实施方案中，根据第十三方面的组合为用作药物或用于诊断的组合。
第十四方面，本发明提供根据第十一方面的分离肽或拟肽和根据第十二方面的分离肽或拟肽的组合。在一些实施例中，根据第十四方面的肽或拟肽的组合包含在单一的肽或拟肽中。
在一些实施方案中，根据第十四方面的组合为用作药物或用于诊断的组合。
第十五方面，本发明提供根据第十方面的分离肽或拟肽和根据第十一方面的分离肽或拟肽的组合。在一些实施例中，根据第十五方面的肽或拟肽的组合包含在单一的肽或拟肽中。
在一些实施方案中，根据第十五方面的组合为用作药物或用于诊断的组合。
如上所述根据第十方面的肽或拟肽，根据第十一方面的肽或拟肽和/或根据第十二方面的肽或拟肽在一些实施例中可包含在共同的肽、拟肽或肽和拟肽的杂合物中。在一些实施方案中，第十三、第十四和/或第十五方面的组合被包含在单一的肽或拟肽、或相应的肽/肽的杂合物中。
第十六方面，本发明提供一种分离的核酸分子。所述核酸分子包含编码具有SEQID NO：6的序列的肽的序列。通常，所编码的肽不同于钙结合蛋白的全长序列。所编码的肽通常不同于全长S100蛋白如S100A9，所述S100A9为全长蛋白钙粒蛋白-B。
由第十六方面的核酸分子编码的肽通常具有150个氨基酸或更少、例如120个氨基酸或更少的长度。在一些实施方案中，所编码的肽具有100个氨基酸或更少的长度。在一些实施方案中，所编码的肽具有80个氨基酸或更少、例如75个或70个氨基酸的长度。在一些实施方案中，所编码的肽具有60个氨基酸或更少的长度。在一些实施方案中，所编码的肽具有50个氨基酸或更少、包括例如45个氨基酸的长度。在一些实施方案中，所编码的肽具有40个氨基酸或更少的长度。在一些实施方案中，所编码的肽具有30个氨基酸或更少的长度。
第十七方面，本发明提供一种分离的核酸分子。所述核酸分子包含编码具有SEQID NO：9的序列的肽的序列。通常，所编码的肽不同于钙结合蛋白的全长序列。所编码的肽通常不同于全长S100蛋白如S100A9，所述S100A9为全长蛋白钙粒蛋白-B。
所编码的肽通常具有150个氨基酸或更少、例如120个氨基酸或更少的长度。在一些实施方案中，所编码的肽具有100个氨基酸或更少、例如95、90或85个氨基酸的长度。在一些实施方案中，所编码的肽具有80个氨基酸或更少的长度。在一些实施方案中，所编码的肽具有60个氨基酸或更少的长度。在一些实施方案中，所编码的肽具有50个氨基酸或更少的长度。在一些实施方案中，所编码的肽具有40个氨基酸或更少的长度。在一些实施方案中，所编码的肽具有30个氨基酸或更少的长度。
第十八方面，本发明提供一种分离的核酸分子。所述核酸分子包含编码具有SEQID NO：12的序列的肽的序列或其同源物。通常，所编码的肽不同于钙结合蛋白的全长序列。
通常，由根据第十八方面的核酸分子编码的肽不同于全长钙结合蛋白。在一些实施方案中，所编码的肽具有不同于全长S100蛋白如S100A8的序列的序列。在一些实施方案中，所编码的肽具有不同于钙调蛋白的序列的序列。
由第十八方面的核酸分子编码的肽通常具有130个氨基酸或更少、例如120个氨基酸或更少的长度。在一些实施方案中，所述肽具有100个氨基酸或更少的长度。在一些实施方案中，所述肽具有80个氨基酸或更少的长度。在一些实施方案中，所述肽具有60个氨基酸或更少的长度。在一些实施方案中，所述肽具有50个氨基酸或更少的长度。在一些实施方案中，所述肽通常具有40个氨基酸或更少、例如35个氨基酸的长度。在一些实施方案中，所述肽通常具有30个氨基酸或更少的长度。
第十九方面，本发明提供一种分离的核酸分子。所述核酸分子包含编码具有SEQID NO：6的序列的肽的序列和编码具有SEQ ID NO：12的序列的肽的序列的组合。在一些实施方案中，根据第十九方面的所述核酸分子还包含编码具有SEQ ID NO：9的序列的肽的序列。
第二十方面，本发明提供一种分离的核酸分子。所述核酸分子包含编码具有SEQID NO：9的序列的肽的序列和编码具有SEQ ID NO：12的序列的肽的序列的组合。
第二十一方面，本发明提供一种分离的核酸分子。所述核酸分子包含编码具有SEQID NO：6的序列的肽的序列和编码具有SEQ ID NO：9的序列的肽的序列的组合。
第二十二方面，本发明提供一种鉴别化合物的体外方法，所述化合物能够减少或抑制肽和/或拟肽和Toll-类受体4(TLR4)蛋白或TLR4受体蛋白的功能片段之间的复合物的形成。所述肽和/或拟肽包含：(i)SEQ ID NO：6或9的氨基酸序列，和/或(ii)SEQ ID NO：12的氨基酸序列。所述TLR4受体的功能片段包含适用的对于SEQID NO：1和/或对于SEQ IDNO：3的结合位点。所述方法通常包括提供所述肽和/或拟肽。所述方法通常还包括提供所述TLR4受体或TLR4受体的功能片段。此外，所述方法通常包括提供疑似影响肽和/或拟肽和TLR4受体或TLR4受体的功能片段之间的复合物的形成的化合物。此外，所述方法包括使所述肽和/或拟肽、所述TLR4受体或其功能片段和所述化合物彼此接触。所述方法还包括检测所述肽和/或拟肽和TLR4受体或TLR4受体的功能片段之间的复合物的形成。如上所述，所述具有SEQ ID NO：6或9的序列的肽和/或拟肽和所述具有SEQ ID NO：12的序列的肽和/或拟肽在一些实施例中可包含在共同的肽、拟肽或肽/拟肽杂合物中。
在根据第二十二方面的所述方法的一些实施方案中，所述检测通过合适的光谱学的、光化学的、光度的、荧光的、放射性的、酶的或热力学的技术执行。
在一些实施方案中，根据第二十二方面的所述方法包括将所述复合物的形成与对照测量进行比较。这种对照测量可以例如包括，在不存在疑似影响所述复合物形成的化合物的情况下，检测所述肽和/或拟肽和TLR4蛋白或其功能片段之间的复合物的形成。
第二十三方面，本发明提供一种鉴别化合物的体外方法，所述化合物能够增加S100A8蛋白或S100A8蛋白的功能片段和S100A9蛋白或S100A9蛋白的功能片段之间的复合物的稳定性。所述方法通常包括提供所述S100A8蛋白或S100A8蛋白的功能片段。所述方法通常还包括提供所述S100A9蛋白或S100A9蛋白的功能片段。所述方法通常还包括提供疑似影响S100A8蛋白或S100A8蛋白的功能片段和S100A9蛋白或S100A9蛋白的功能片段之间的复合物形成的化合物。所述方法还包括使所述S100A8蛋白或S100A8蛋白的功能片段、所述S100A9蛋白或S100A9蛋白的功能片段和疑似影响复合物的形成的化合物彼此接触。所述方法还包括检测所述S100A8蛋白或S100A8蛋白的功能片段和所述S100A9蛋白或S100A9蛋白的功能片段之间的复合物的形成。
在根据第二十三方面的所述方法的一些实施方案中，所述S100A8蛋白的功能片段和/或所述S100A9蛋白的功能片段含有EF手形I和EF手形II中的至少一种。在根据第二十三方面的所述方法的一些实施方案中，使所述S100A8蛋白或其功能片段、所述S100A9蛋白或其功能片段和疑似影响复合物形成的化合物在存在钙盐的情况下彼此接触。在根据第二十三方面的所述方法的一些实施方案中，使所述S100A8蛋白或其功能片段、所述S100A9蛋白或其功能片段和各化合物在存在锌盐的情况下彼此接触。在根据第二十三方面的所述方法的一些实施方案中，使所述S100A8蛋白或其功能片段、所述S100A9蛋白或其功能片段和各化合物在存在铜盐的情况下彼此接触。
在一些实施方案中，根据第二十三方面的所述方法包括检测所述S100A8蛋白或其功能片段和所述S100A9蛋白或其功能片段之间的异四聚体复合物的形成。这种实施方案的所述方法是一种鉴别能够增加S100A8蛋白或其功能片段和S100A9蛋白或其功能片段之间的异四聚体复合物的稳定性的化合物的方法。
在根据第二十三方面的所述方法的一些实施方案中，所述检测通过合适的光谱学的、光化学的、光度的、荧光的、放射性的、酶的或热力学的技术执行。
在一些实施方案中，根据第二十三方面的所述方法包括将所述复合物的形成与对照测量进行比较。这种对照测量可以例如包括，在不存在疑似影响所述复合物形成的化合物的情况下，检测蛋白S100A8或其功能片段和蛋白S100A9或其功能片段之间的复合物的形成。
一种增加S100A8蛋白或其功能片段和S100A9蛋白或其功能片段之间的复合物的稳定性的化合物，影响存在于S100A8和S100A9的单体形式之间、异二聚体复合物S100A8/S100A9和异四聚体复合物(S100A8/S100A9)2之间的平衡。因此，通常形成更多的异四聚体复合物。结果，提供较少的异二聚体复合物，其能够结合所述TLR4受体。
在根据第二十三方面的方法的一些实施方案中，使所述S100A8蛋白或S100A8蛋白的功能片段、所述S100A9蛋白或S100A9蛋白的功能片段和疑似影响复合物形成的化合物在存在钙的情况下彼此接触。
在一些实施方案中，根据第二十三方面的方法是一种鉴别化合物的体外方法，所述化合物能够增加S100A8蛋白或S100A8蛋白的功能片段和S100A9蛋白或S100A9蛋白的功能片段之间的异四聚体复合物的稳定性。通常，这种方法包括检测所述S100A8蛋白或S100A8蛋白的功能片段和所述S100A9蛋白或S100A9蛋白的功能片段之间的异四聚体复合物的形成。
第二十四方面，本发明提供一种诊断受试者中与炎症相关的病症的发生风险或存在的方法。所述方法包括检测来自所述受试者的样品中的S100A8蛋白和S100A9蛋白之间的复合物的量。相对于阈值的所述复合物的量减少指示与炎症相关的病症的发生风险提高或存在。
第二十五方面，本发明提供一种治疗患有炎性障碍的受试者的方法。所述方法包括给所述受试者施用通过第二十三方面的方法获得的化合物。施用所述化合物包括使所述受试者的体液中S100A8蛋白和S100A9蛋白之间的复合物的稳定性增加。
第二十六方面，本发明提供一种治疗患有炎性障碍的受试者的方法。所述方法包括给所述受试者施用根据第二十二方面的方法获得的化合物。施用所述化合物包括使S100A8蛋白或S100A9蛋白和所述受试者的细胞上的TLR4受体之间的复合物的形成减少或抑制。
第二十七方面，本发明提供一种鉴别生物体中根据第十、第十一和/或第十二方面的分离肽或拟肽的结合配偶体的方法。所述方法通常是一种体外方法。所述方法包括使所述肽或拟肽与来自生物体的样品接触。所述样品用来分析所述肽或拟肽的结合配偶体的存在。在一些实施方案中，所述样品还用来分析所述肽或拟肽的结合配偶体的身份(identity)。通过使所述肽或拟肽与所述样品接触，形成反应混合物。所述方法还包括使反应混合物中所述分离肽或拟肽和结合配偶体之间形成复合物。此外，所述方法包括从所述反应混合物中分离所述肽或拟肽。所述肽或拟肽仍存在于具有结合配偶体的复合物中。所述方法还包括分析所述结合配偶体。分析所述结合配偶体可以包括确定一个或多个物理性能，如它的分子量。分析所述结合配偶体还可以包括确定它是肽或蛋白、核酸分子、脂质、多糖、细胞、病毒或其他物质中的哪一个。在所述结合配偶体是肽或蛋白、多糖或核酸分子时，可以进一步分析所述结合配偶体的序列。
附图说明
图1：用所示浓度的(A)重组人S100A8、重组人S100A9或人S100A8/S100A9，和(B)重组人S100A8/S100A9、重组人S100A8/S100A9(N69A)或S100A8/S100A9(E78A)刺激人单核细胞四个小时。通过ELISA的方法定量释放到培养基中的TNFα。
图2A显示人S100A9同二聚体的3D结构的截面。所述两个S100单体用灰色阴影示出。只可以同二聚体形式，而不以异二聚体形式接近的区域用白色示出。一些氨基酸用它们在人序列中的位置指示。
图2B显示人S100A9的氨基酸序列的一部分。选择易被溶剂接近并且经由它们的主链未参与钙协调或仅参与钙协调的六个氨基酸(位置64、65、72、73、77和85)用于突变研究。
图3A：指示的时间点的人S100A9的胰蛋白酶消化。用片段的混合物刺激单核细胞四个小时，并且通过ELISA定量TNFα的释放。插图描绘了用于检测仍然完整的S100A9的蛋白质印迹。
图3B：用珠子孵育通过人S100A9的胰蛋白酶消化产生的片段，TLR4/MD2偶联至该珠子。通过MALDI质谱分析鉴别结合至珠子的片段。17个潜在的肽中只有单个的肽可以被检测出(No.15：位置73-85的氨基酸)，显示与TLR4/MD2的特异性相互作用，对应于S100A9的C端EF手形的一部分。
图3C显示如图1B的对照肽消化后的MALDI质谱。所述肽具有S100A9的氨基酸位置63-79(63-795A，分子量：1758g/mol)的序列，其中四个氨基酸鉴定为最有可能对结合TLR4/MD2是重要的(E64A、D65A、Q73A和E77A，沿用S100A9的命名法)，并且另外，氨基酸K72A已交换成丙氨酸。
图3D显示所鉴别的肽的序列。侧翼氨基酸表示在括号中。
图3E示意性地例示S100A9肽和S100A8肽与TLR4/MD2的免疫沉淀试验的建立。1＝琼脂糖珠子；2＝肽；3＝TLR4/MD2。
图4描述通过MALDI-TOF质谱法进行的洗脱液分析。将对应于位置63-79(A)和位置63-79A5(B、C)的肽偶联到TLR4/MD2复合物之后，获得洗脱液。
图5显示通过MALDI-TOF质谱法进行的洗脱液分析。将对应于位置55-71(A)和55-71A3(B)的肽偶联到TLR4/MD2复合物之后，获得洗脱液。
图6A示意性地例示S100A9蛋白和S100A9突变体与TLR4/MD2的结合试验的建立。图6B显示分析结果，其中检测S100A9同二聚体或其突变体结合到TRLR4/MD2。所述突变体包含所示的改变的氨基酸，即在E64、D65、K72、Q73、E77或R85处，由丙氨酸代替天然存在的氨基酸。图6C显示分析结果，其中检测S100A9同二聚体或其突变体结合到TRLR4/MD2。所述突变体包含所示的两个改变的氨基酸，即在E64和D65；Q73和E77；E64和Q73；和D65和Q73处，由丙氨酸代替天然存在的氨基酸。
发明详述
本发明可被认为通常涉及能够用于控制生物体的炎性反应的化合物和方法。更具体地，提供化合物和方法来控制S100A8蛋白和/或S100A9蛋白与TLR4受体的相互作用。
最初选择蛋白命名“S100”是由于在100％硫酸铵中蛋白质的溶解度。S100A8和S100A9，也分别称为MRP8和MRP14，或钙粒蛋白A和钙粒蛋白B，是Ca2+结合蛋白的S100家族的两个成员。S100A8和S100A9在嗜中性粒细胞、单核细胞和一些上皮细胞中组成型表达，而不是在组织巨噬细胞或淋巴细胞中一般表达。单核细胞和嗜中性粒细胞表达大量蛋白质，主要为S100A8/S100A9异二聚体。S100A8和S100A9蛋白促成粒细胞的约40-50％的可溶性胞质含量。嗜中性粒细胞、活化的单核细胞和巨噬细胞在响应应激、感染、炎症、组织损伤和感染性休克时产生这些蛋白质。S100A8和S100A9在炎症部位特异性并且以能量依赖的方式释放，这是受到严格调控的。S100A8和S100A9是重要的损害相关分子模式(DAMP)分子。所述S100A8/S100A9复合物是TLR4在单核细胞上的内源性配体。S100A8和S100A9均直接结合到TLR4受体复合物，并且通过已知的、经典的信号转导级联诱导促炎效应机制。因此，S100A8/S100A9是在炎症发病机理中的重要因素。
S100A8和S100A9已经作为慢性和急性炎症的生化标志物。在许多炎症反应中，两种S100蛋白显示强促炎活性，所述炎症反应例如败血症、肺和皮肤感染、关节炎和自身免疫疾病。例如，直接将S100A8应用到膝关节引起严重的关节炎症和软骨破坏。在T细胞依赖性自身免疫病的实验小鼠模型中，两种蛋白均还诱导自身反应的CD8+T细胞的产生和活化，从而导致增强的IL17介导的免疫应答。
作为钙结合胞质分子，S100蛋白以中央铰链区连接的对钙具有不同亲和力的两个钙-结合EF手形为特征。所述EF手形基序具有两个侧面连接中央钙结合环的α-螺旋，从而形成经典的螺旋-环-螺旋基序。S100A8和S100A9能够形成单价同二聚体和称为S100A8/A9(MRP8/14，钙网蛋白)的异二聚体，在下文中也分别称为同二聚体复合物和异二聚体复合物，以及甚至更高的低聚形式。S100A8和S100A9也已发现形成异四聚体，在下文中也称为异四聚体复合物。四聚体的形成严格依赖于钙的存在，并且在不存在钙的情况下，所述异二聚体是S100A8和S100A9的优选形式。
本发明基于S100A8蛋白中的结合位点和S100A9蛋白中的结合位点对TLR4受体的识别。基于意外的发现，本发明还在于在形成异四聚体复合物期间，S100A9蛋白和S100A8蛋白对于TLR4受体的结合位点变得难以接近，为了便于指代也被称为(S100A8/S100A8)2。如图1A所示，当S100A8和S100A9之间的所述异四聚体复合物不诱导单核细胞的炎性反应时，单个蛋白S100A8和S100A9诱导单核细胞中特别强的促炎反应。这种反应比得上通过LPS的刺激。同样，S100A8和S100A9的同二聚体引起这种反应。
所述Toll-类受体4或TLR4受体，也称为CD284，在生物体的先天免疫系统活化中起着重要作用，因为它检测脂多糖(LPS)，革兰氏阴性细菌外膜的主要组分。在本文所公开的方法或用途的一些实施例中，TLR4是Swissprot/Uniprot登录号为O00206(2012年9月5日的版本132)的人蛋白。在一些实施方案中，TLR4是Swissprot/Uniprot登录号为Q9GL65(2012年7月11日的版本88)或Swissprot/Uniprot登录号为Q8SQ55(2012年3月21日的版本56)的牛蛋白。在一些实施方案中，TLR4是Swissprot/Uniprot登录号为Q9QX05(2012年7月11日的版本99)的大鼠蛋白。在一些实施方案中，TLR4是Swissprot/Uniprot登录号为Q9QUK6(2012年9月5日的版本113)的小鼠蛋白。在一些实施方案中，TLR4是Swissprot/Uniprot登录号为Q68Y56(2012年7月11日的版本62)的猪蛋白。在一些实施方案中，TLR4是Swissprot/Uniprot登录号为H2QXS5(2012年6月13日的版本4)的黑猩猩蛋白。在一些实施方案中，TLR4是Swissprot/Uniprot登录号为F6RL35(2012年7月11日的版本10)的马蛋白。在一些实施方案中，TLR4是Swissprot/Uniprot登录号为C4PCF3(2012年7月11日的版本24)或Swissprot/Uniprot登录号为Q7ZTG5(2012年9月5日的版本67)的鸡蛋白。在一些实施方案中，TLR4是Swissprot/Uniprot登录号为F1PDB9(2012年9月5日的版本14)的狗蛋白。
本发明能够鉴别在S100A8和S100A9各自上的区域，所述区域对各蛋白结合到TLR4受体是必需的。对于所述S100A9蛋白，这个序列对应于人蛋白的氨基酸位置63-85(同上)。本发明人还发现，它足以防止S100A9蛋白的所述区域结合到TLR4受体，例如通过空间上覆盖它，包括通过使上述异四聚体复合物形成，所述区域对应于氨基酸位置63-79。阻断这个区域阻止单核细胞中炎性反应的启始。这个区域也对应于牛蛋白、长臂猿蛋白、阿努比斯狒狒蛋白、倭黑猩猩蛋白、熊猫蛋白、猪蛋白、非洲象蛋白或豚鼠蛋白的氨基酸位置63-79。这个区域也对应于由Genbank(NCBI)基因ID：94195S100a9编码的大鼠蛋白、NCBI登录号为NP—033140.1的小鼠蛋白(SEQ ID NO：83)或NCBI登录号为EDM00535.1的大鼠蛋白(SEQ ID NO：84)的氨基酸位置62-78。作为另一例子，这个区域对应于Swissprot/Uniprot登录号为L5MD39的鼠耳蝠(David鼠耳蝠)的中国特有蝙蝠物种的蛋白(2013年5月29日的版本4，SEQID NO：86)的氨基酸位置61-77，或Swissprot/Uniprot登录号为G9KM87的雪貂蛋白(2013年7月24日的版本10，SEQ ID NO：87)的氨基酸位置122-138。
同样足以阻止对应于氨基酸位置73-85的人S100A9蛋白的区域结合到TLR4受体以便阻断炎性反应。这个区域也对应于牛蛋白、猪蛋白、小耳婴猴蛋白、裸鼹鼠蛋白或豚鼠蛋白的氨基酸位置73-85。
对于S100A8蛋白，本发明人已经鉴定对应于人蛋白的氨基酸位置55-71的序列(同上)是S100A8蛋白结合到TLR4受体所必需的。这个区域也对应于猕猴蛋白、狨猴蛋白、狗蛋白、欧洲兔蛋白、鼬蛋白、马蛋白、牛蛋白、猪蛋白、非洲象蛋白、熊猫蛋白，小鼠蛋白、大鼠蛋白、裸鼹鼠蛋白、中国仓鼠蛋白、兔蛋白、狨猴蛋白或豚鼠蛋白的氨基酸位置55-71。
当用于本公开时，术语“位置”指的是本文所描绘的氨基酸序列中任一氨基酸的位置或本文所描述的核酸序列中核苷酸的位置。本文所用的术语“对应于”也包括不是仅由前述核苷酸/氨基酸的数目来确定，而是在所述序列的周边部分的情况来观察的位置。因此，根据本公开可被取代的给定氨基酸的位置可由于在(突变或野生型)病毒中别处的氨基酸的缺失或添加而变化。在这方面，还应该注意在S100A8蛋白或S100A9蛋白的核酸序列上的数据库条目可在它们的非翻译区变化，由此鉴别不同核酸的位置，尽管编码区的长度不变/相同。同样地，根据本公开可被取代的给定核苷酸的位置可由于在病毒的非翻译区中别处的核苷酸的缺失或添加而变化，所述病毒的非翻译区包括启动子和/或任何其它调节序列或基因(包括外显子和内含子)。
因此，当位置被称为如根据本公开的“对应的位置”时，应理解核苷酸/氨基酸根据指定数字可能不同，但仍可能具有相似的相邻核苷酸/氨基酸。这些可被交换、缺失或添加的核苷酸/氨基酸也包括在术语“对应的位置”中。
具体地，为了确定不同于已知菌株的S100A8蛋白或S100A9蛋白的氨基酸序列的氨基酸残基是否对应于该已知菌株的氨基酸序列中的某个位置，技术人员可以使用本领域公知的手段和方法，例如手动或通过使用计算机程序的序列比对，所述计算机程序如BLAST2.0或ClustalW或任何其它适于产生序列比对的合适的程序，所述BLAST2.0表示局部序列排比检索基本工具(Basic Local Alignment Search Tool)。因此，已知的野生型病毒株可作为“目标序列”或“参考序列”，而不同于野生型病毒株的本文所描述的病毒的氨基酸序列或核酸序列可以作为“查询序列“。所述术语“参考序列”和“野生型序列”在本文可互换使用。
本文所提供的也是一种肽或拟肽，包括包含上述序列或这种序列的同源物(同上)中的一种的类肽(peptoid)。同源物是与多肽的给定序列如SEQ ID NO：11的序列具有至少约70％、包括至少约80％氨基酸序列同一性的生物活性序列。在一些实施方案中，同源物是与天然序列多肽具有至少约85％氨基酸序列同一性的生物活性序列。同源性是本文所描述的分离的核酸分子或分离的肽或蛋白质的功能等同物。关于核酸序列，遗传密码的简并性允许某些密码子由指定相同氨基酸的其他密码子取代，从而产生相同的蛋白质。所述核酸序列可以大幅度变化，因为除甲硫氨酸和色氨酸以外，已知氨基酸可以由一个以上的密码子进行编码。因此，本文所描述的部分或全部的核酸序列都可以合成，以得到显著不同于它们所表示序列所示的核酸序列。然而，其所编码的氨基酸序列将为保守的。
此外，所述核酸序列可包括由至少一个核苷酸在给定序列所示的核酸式的5'端和/或3'端添加、缺失或替换得到的核苷酸序列。任何核苷酸或多核苷酸可以在这方面使用，只要其添加、缺失或替换不改变由核苷酸序列编码的氨基酸序列即可。例如，本发明旨在包括由在本发明的核酸序列或其衍生物的5'端添加ATG作为起始密码子，或由在本发明的核苷酸序列或其衍生物的3'端添加TTA、TAG或TGA作为终止密码子而产生的任何核酸序列。此外，在必要时核酸分子可具有添加到它的5'端和/或3'端的限制性内切酶识别位点。给定的核酸序列的这种功能改变提供促进由融合其上的外源核酸序列编码的异源蛋白质的分泌和/或加工的机会。
另外，以下情况是可能的：缺失密码子或用简并密码子以外的密码子取代一个或多个密码子以产生结构上修饰的多肽，而不是与未修饰的核酸分子所产生的多肽具有大致相同的效用或活性的多肽。作为本领域公认的技术，所述两个多肽在功能上是等价的，如同引起它们产生的两个核酸分子，即使核酸分子之间的区别与遗传密码的简并性是不相关的。
本文所公开的关于氨基酸序列的“序列同一性百分比(％)”定义为，如果需要，在比对序列和引入缺口以达到最大百分比的序列同一性之后，并且不考虑任何保守替换作为序列同一性的一部分，候选序列中与参考序列例如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：12的氨基酸残基相同的氨基酸残基百分比。以确定氨基酸序列同一性百分比为目的的比对可以通过本领域技术范围内的各种方式来实现，例如使用公开可获得的计算机软件诸如BLAST、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于测定比对的适当参数，包括达到对被比较的序列全长的最大比对所需的任何算法。对于本文所公开的核苷酸序列也是如此。
本领域技术人员熟悉对应序列需要被比较的这一事实。对应的序列的使用包括位置并不仅由之前的核苷酸/氨基酸的数目来确定。因此，根据本公开可被替换的的给定氨基酸的位置可以由于在(突变或野生型)蛋白诸如S100A8蛋白或S100A9蛋白中别处的氨基酸的缺失或添加而变化。因此，通过根据所公开的“对应的位置”，应该理解氨基酸可以在指定数目上不同-例如当与数据库条目比较时-但仍然可能具有相似的相邻氨基酸(参见上文)。
如上所述，在一些实施方案中，序列如对应于SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：19的序列包含保守替换。保守替换通常是以下替换，根据被突变的氨基酸列出，每个跟随一个或多个可以被视为保守的替换：Ala→Gly、Ser、Val；Arg→Lys；Asn→Gln、His；Asp→Glu；Cys→Ser；Gln→Asn；Glu→Asp；Gly→Ala；His→Arg、Asn、Gln；Ile→Leu、Val；Leu→Ile、Val；Lys→Arg、Gln、Glu；Met→Leu、Tyr、Ile；Phe→Met、Leu、Tyr；Ser→Thr；Thr→Ser；Trp→Tyr；Tyr→Trp、Phe；Val→Ile、Leu。其它替换也是允许的，并且可以根据经验或根据其他已知保守或非保守的替换来确定。作为另一方向，以下八个组每个包含通常可采取以限定另一个氨基酸的保守替换的氨基酸：
1)丙氨酸(Ala)，甘氨酸(Gly)；
2)天冬氨酸(Asp)，谷氨酸(Glu)；
3)天冬酰胺(Asn)，谷氨酰胺(Gln)；
4)精氨酸(Arg)，赖氨酸(Lys)；
5)异亮氨酸(Ile)，亮氨酸(Leu)，甲硫氨酸(Met)，缬氨酸(Val)；
6)苯丙氨酸(Phe)，酪氨酸(Tyr)，色氨酸(Trp)；
7)丝氨酸(Ser)，苏氨酸(Thr)；和
8)半胱氨酸(Cys)，甲硫氨酸(Met)。
与此相反，如以下的更实质性的变化并不代表保守性替换：Ala→Leu、Ile；Arg→Gln；Asn→Asp、Lys、Arg、His；Asp→Asn；Cys→Ala；Gln→Glu；Glu→Gln；His→Lys；Ile→Met、Ala、Phe；Leu→Ala、Met、正亮氨酸；Lys→Asn；Met→Phe；Phe→Val、Ile、Ala；Trp→Phe；Tyr→Thr、Ser；Val→Met、Phe、Ala。
序列比对和S100A8蛋白(MRP8)和S100A9蛋白(MRP14)的晶体结构的分析先前已经显示哪些氨基酸与钙结合相关。例如Ishikawa等人(Acta Crystallographica Section D[2000]56,559-566)公布了S100A8蛋白的结构。本文在此通过引入全文并入。在相反的情况下，本说明书包括定义将优先。通过在人蛋白的序列FKELDINTDGAVNFQEF(SEQ ID NO：5)中的序列比对，其例如对应于猪蛋白的序列FKELDINKDG AVNFEEF(SEQ ID NO：48)或中国仓鼠蛋白的序列FKELDINQDN AVNFEEF(SEQ ID NO：53)，这些作者鉴定带下划线的氨基酸参与协调钙离子。这些氨基酸对应于SEQ ID NO：5的氨基酸位置5、7、9和16。作者提出S100蛋白的钙-触发的构象变化。然而，哪些氨基酸残基可能参与结合靶蛋白不能在现有的数据上预测。
在人S100A9蛋白的序列MEDLDTNADK QLSFEEF(SEQ ID NO：1)中，其例如对应于牛蛋白的序列MEDLDTNVDK QLSFEEF(SEQ ID NO：15)或狨猴蛋白的序列LEDLDTNADK QLTFEEF(SEQ ID NO：18)，这些作者鉴定带下划线的氨基酸参与协调钙离子。这些氨基酸对应于SEQID NO：1的氨基酸位置5、7、9和16。
在人蛋白S100A9的序列QLSFEEFIML MAR(SEQ ID NO：3)中，作者鉴定带下划线的氨基酸(对应于SEQ ID NO：3的氨基酸位置6)参与协调钙离子。
在其中分析S100A8蛋白和S100A9蛋白之间的异四聚体复合物的形成的用途或方法中，上述保守氨基酸应该相应地出现，因为钙结合是异四聚体复合物形成的必要条件。在其中分析结合到TLR4受体的用途或方法中，上述保守氨基酸通常不需要出现，因为结合到TLR4受体只发生在S100A8蛋白或S100A9蛋白的同二聚体、异二聚体或单体形式中。
在一些实施方案中，提供了一种免疫球蛋白或蛋白质性结合配偶体。所述免疫球蛋白或蛋白质性结合配偶体可以对脊椎动物S100A9蛋白的表位具有结合特异性，所述表位是由对应于人蛋白S100A9的氨基酸位置63-79的区域和/或对应于人蛋白S100A9的氨基酸位置73-85的区域所限定的表位。所述免疫球蛋白或蛋白质性结合配偶体也可对脊椎动物S100A8蛋白的表位具有结合特异性，所述表位是由对应于人蛋白S100A8的氨基酸位置55-71的区域所限定的表位。本文所使用的术语“特异的”和“特异性”被理解为表明该结合配偶体是指向、结合至具有相应蛋白区域的氨基酸序列的肽或与所述肽发生反应。因此，指向、结合至或与其反应包括所述结合配偶体特异性结合至S100A8蛋白或S100A9蛋白的区域(如果适用的话)。在本文中的术语“特异性地”是指结合配偶体与S100A9或S100A8的相应区域或/和其部分反应(如果适用的话)，但至少基本上不与另一种蛋白反应。术语“另一种蛋白”包括任何蛋白，包括与例如S100A9和S100A8密切相关或同源的蛋白，结合配偶体指向这些蛋白。术语“基本上不结合”指相比于对S100A9或S100A8的亲和力时，结合配偶体对另一种蛋白不具有特别的亲和力，即显示出小于约30％、如小于约20％、小于约10％包括小于约9、8、7、6或5％的交叉反应。如上定义的所述结合配偶体是否特异性反应可以很容易地进行检验，特别是通过比较相应的结合配偶体与S100A9或S100A8的反应(如果适用的化)和结合配偶体与其它(另一种)蛋白的反应。术语“特异性识别”，可以与术语“指向”或“与……反应”互换使用，在本公开的上下文中是指特定分子，通常是免疫球蛋白、免疫球蛋白片段或具有免疫球蛋白样功能的蛋白结合分子，能够与如本文所定义的表位的至少两个、包括至少三个、如至少四个或甚至更多个氨基酸特异性相互作用和/或结合。通常，所述免疫球蛋白或蛋白质性结合分子可以由此形成与S100A9或S100A8的各自表位的复合物。这种结合可通过“锁钥原则”的特异性来例示。“特异性结合”，也可以例如，根据蛋白质印迹、ELISA-、RIA-、ECL-、IRMA检验、FACS、IHC和肽扫描来确定。
例如S100A9或S100A8的各自的结合配偶体可以是具有免疫球蛋白样功能的免疫球蛋白、其片段或蛋白质性结合配偶体(即分子)。(重组)抗体片段的例子是免疫球蛋白片段，如Fab片段、Fv片段、单链Fv片段(scFv)、双抗体或结构域抗体(Holt,L.J.等人，TrendsBiotechnol.(2003),1,11,484-490)。具有免疫球蛋白样功能的的蛋白质性结合分子的例子是基于脂质运载蛋白家族的多肽的突变蛋白(WO 03/029462,Beste等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1999)96,1898-1903)。脂质运载蛋白，如后胆色素结合蛋白、人嗜中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白、人载脂蛋白D或胎盘蛋白，具有可被进行修饰的天然配体结合位点，使得它们结合到称为半抗原的选定的小蛋白区。其它蛋白质性结合分子的例子是所谓的glubody(参见例如国际专利申请WO96/23879或Napolitano,E.W.,等人,Chemistry & Biology(1996)3,5,359-367)，基于锚蛋白支架(Mosavi,L.K.,等人,ProteinScience(2004)13,6,1435-1448)或结晶支架(例如国际专利申请WO 01/04144)的蛋白，如Skerra,J.Mol.Recognit.(2000)13,167-187中所描述的蛋白，AdNectin，四连接素(tetranectin)和avimer。avimer包含在几种细胞表面受体中作为多个结构域的链发生的所谓的A-结构域(Silverman,J.等人,Nature Biotechnology(2005)23,1556-1561)。源自人纤连蛋白的结构域的Adnectin含有可工程化用于免疫球蛋白样结合到靶标的三个环(Gill,D.S.&Damle,N.K.,Current Opinion in Biotechnology(2006)17,653-658)。源于各自的人同三聚体蛋白的四连接素同样包含可工程化用于所需结合的C型凝集素结构域中的环区(同上)。可作为蛋白配体的类肽是寡(N-烷基)甘氨酸，其与肽的不同之处在于侧链连接到酰胺氮而不是α碳原子。类肽通常抗蛋白酶和其它修饰酶，并且可以比肽具有更高的细胞渗透性(参见例如Kwon,Y.-U.,和Kodadek,T.,J.Am.Chem.Soc.(2007)129,1508-1509)。与S100A9或S100A8的结合配偶体形成复合物的分子同样是如上所述具有免疫球蛋白样功能的免疫球蛋白、其片段或蛋白质性结合分子。因此，在示例性实施方案中，检测例如S100A9或S100A8的量可通过使用能够特异性结合proSP-B的第一抗体或抗体片段以及能够特异性结合所述第一抗体或抗体片段的第二抗体或抗体片段来实施。上文所引用的文件通过引用全文并入本文。在相反的情况下，本说明书包括定义将优先。
本文所使用的术语“抗体”应理解为包括免疫球蛋白和免疫球蛋白片段，其能够特异性结合选定的蛋白质，如proSP-B，以及相应的具有免疫球蛋白样功能的蛋白质性结合分子。作为说明性例子，抗体可以是骆驼重链免疫球蛋白。作为几个另外的非限制性的例子，抗体可以是EGF-样结构域、Kringle-结构域、纤连蛋白I型结构域、纤连蛋白II型结构域、纤连蛋白III型结构域、PAN结构域、Gla结构域、SRCR结构域、Kunitz/牛胰胰蛋白酶抑制剂结构域、淀粉酶抑肽、Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂结构域、三叶草(P型)结构域、血管假性血友病因子C型结构域、过敏毒素样结构域、CUB结构域、甲状腺球蛋白I型重复片段、LDL受体A类结构域、Sushi结构域、铰链结构域、血小板反应蛋白I型结构域、免疫球蛋白结构域或免疫球蛋白样结构域(参见上述的其他例子)。在一些实施方案中，抗体是适体，包括例如在WO01/92655中所描述的。适体通常是可选自随机核酸库的核酸分子，其根据能力以结合选定的其它分子，例如肽、蛋白、核酸分子或细胞。适体，包括Spiegelmer，能够结合分子如肽、蛋白和低分子化合物。由天然寡核苷酸的L-异构体组成。适体是通过反复几轮体外选择或通过SELEX(通过指数富集的配体的系统进化)技术进行工程化。Spiegelmer到其靶分子的亲和性通常在于皮摩尔至纳摩尔范围内，并且因此可与免疫球蛋白相比。适体也可以是肽。肽适体由短的可变的肽结构域组成，在两端连接到蛋白支架。在整个文本中，术语抗体也可以与术语“蛋白质性结合配偶体”结合使用，即使所述术语“抗体”包括这种结合配偶体。这个冗余双重名称仅意在考虑本领域中单词“抗体”的频繁使用，同义地指定免疫球蛋白为抗体。
指代多肽的“片段”，例如免疫球蛋白或蛋白质性结合分子，是指存在于相应多肽的任何氨基酸序列，只要它比全长序列短，并且只要它能够执行所述蛋白的目标功能-在免疫球蛋白特异性结合期望的靶标例如抗原(例如proSP-B)的情况下。术语“免疫球蛋白片段”指免疫球蛋白的一部分，通常是高变区和周围的重和轻链的部分，其显示对于特定分子的特异性结合亲和力。高变区是在物理上结合到多肽靶标的免疫球蛋白的一部分。
免疫球蛋白可以是单克隆或多克隆的。术语“多克隆”是指这样的免疫球蛋白，其是源自用抗原或其抗原功能衍生物免疫的动物的血清的免疫球蛋白分子的异质群体。为了生产多克隆免疫球蛋白，一个或多个各种宿主动物可通过用抗原注射进行免疫。各种佐剂可用于提高免疫应答，具体取决于宿主物种。“单克隆免疫球蛋白”或“单克隆抗体”是特定抗原的免疫球蛋白的基本上同质种群。它们可以通过提供由在培养基中的连续细胞系进行的免疫球蛋白分子生产的任何技术获得。单克隆免疫球蛋白可通过本领域技术人员公知的方法获得(参见例如，等人，Nature(1975)256，495-497，和美国专利号4,376,110)。仅对例如对应于人蛋白S100A9的氨基酸位置63-79的区域、对对应于人蛋白S100A9的氨基酸位置73-85的区域或对应于人蛋白S100A8的氨基酸位置55-71的区域具有特异性结合亲和力的免疫球蛋白或免疫球蛋白片段可被分离、富集或从原核或真核生物中纯化。本领域技术人员已知的常规方法能够在原核和真核生物中生产免疫球蛋白或免疫球蛋白片段和具有免疫球蛋白样功能的蛋白质性结合分子。
更详细地，免疫球蛋白可通过比较其对目标蛋白例如S100A9或S100A8的结合亲和力与其对其他多肽的结合亲和力来分离。可使用本领域已知的程序中的一个如嵌合或CDR移植来产生抗体的人源化形式。通常，以用制备单克隆抗体和杂交瘤的技术是本领域公知的。任何动物如已知产生抗体的山羊、小鼠或兔可以用所选择的多肽免疫，所述多肽例如具有对应于人蛋白S100A9的氨基酸位置63-79的区域、对应于人蛋白S100A9的氨基酸位置73-85的区域或对应于人蛋白S100A8的氨基酸位置55-71的区域的序列的多肽。
免疫方法在本领域是公知的。这种方法包括多肽的皮下或腹膜内注射。本领域技术人员将认识到，用于免疫的多肽的量和免疫方案将根据被免疫的动物包括免疫的哺乳动物的物种、其免疫状态和哺乳动物的体重、以及多肽的抗原性和注射部位而变化。
所述多肽可以被修饰或在佐剂中施用以便增加所述肽的抗原性。增加多肽的抗原性的方法是本领域中公知的。这个程序包括使抗原偶联异源蛋白(如球蛋白或β半乳糖苷酶)或通过免疫期间包含佐剂。
通常，所述免疫的哺乳动物被放血，且使用适当的筛选测定，测定来自每个血样的血清的特定抗体。作为说明性的例子，抗S100A9或抗S100A8免疫球蛋白可通过从表达多肽的细胞中的125I-标记的细胞裂解物的免疫沉淀来鉴定，所述多肽具有对应于人蛋白S100A9的氨基酸位置63-79的区域、对应于人蛋白S100A9的氨基酸位置73-85的区域或对应于人蛋白S100A8的氨基酸位置55-71的区域的序列。抗S100A9或抗S100A8的免疫球蛋白也可以通过流式细胞术，例如通过测量用被认为识别抗S100A9或抗S100A8的抗体孵育的Ramos细胞的荧光染色来鉴定。
对于单克隆免疫球蛋白，从免疫动物中取出淋巴细胞，通常是脾细胞，与永生细胞系(通常是骨髓瘤细胞，如SP2/0-Agl4骨髓瘤细胞)融合，并使其成为产生单克隆免疫球蛋白的杂交瘤细胞。通常，永生细胞系如骨髓瘤细胞系源自与淋巴细胞相同的哺乳动物物种。示例性的永生细胞系是小鼠骨髓瘤细胞系，其对含有次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷的培养基(“HAT培养基”)敏感。通常，使用1500分子量的聚乙二醇(“PEG 1500”)将HAT-敏感的小鼠骨髓瘤细胞融合到小鼠脾细胞。随后，融合生成的杂交瘤细胞可以使用HAT培养基选择，所述HAT培养基杀死未融合和未生成性融合的骨髓瘤细胞(几天后未融合的脾细胞死亡，因为它们未被转化)。
许多本领域公知的方法中的任何一种可用于鉴定产生具有所需特征的免疫球蛋白的杂交瘤细胞。通常，将杂交瘤细胞的培养物上清液进行筛选获得针对该抗原的免疫球蛋白。合适的方法包括但不限于用ELISA方法、蛋白质印迹分析或放射免疫分析筛选杂交瘤(Lutz等人，Exp.Cell Res.[1988]175,109-124)。制备产生抗-S100A9或抗-S100A8免疫球蛋白的杂交瘤可以例如通过针对具有下述能力的分泌的抗体测试杂交瘤培养物上清液进行筛选：所述能力为结合重组细胞系，所述重组细胞系表达具有对应于人蛋白S100A9的氨基酸位置63-79的区域、对应于人蛋白S100A9的氨基酸位置73-85的区域或对应于人蛋白S100A8的氨基酸位置55-71的区域的序列的多肽。为了产生在本发明的范围内的为完整免疫球蛋白的抗体同系物，包括例如抗-S100A9或抗-S100A8抗体同系物，可以在营养培养基中在足以使杂交瘤细胞将单克隆免疫球蛋白分泌到培养基中的条件和时间下，培养在这些筛选方法中的验证为阳性的杂交瘤细胞。适用于杂交瘤细胞的组织培养技术和培养基是本领域公知的。可收集适应性的杂交瘤培养物上清液，并且例如抗-S100A9免疫球蛋白或抗-S100A8免疫球蛋白任选通过公知的方法进一步纯化。或者，所需的免疫球蛋白可以通过将杂交瘤细胞注入未免疫小鼠的腹腔来产生。杂交瘤细胞在腹腔中增殖，从而分泌积累为腹水的免疫球蛋白。所述免疫球蛋白可以通过用注射器从腹腔中抽出腹水而收获。
克隆分泌所需免疫球蛋白的杂交瘤，并且使用本领域已知的程序来确定类和亚类。对于多克隆免疫球蛋白，从免疫动物中分离含有免疫球蛋白的抗血清，并使用上述程序之一筛选具有所需特异性的免疫球蛋白的存在。上述抗体也可以固定在固体载体上。这些固体载体的例子包括塑料例如聚碳酸酯、复合碳水化合物如琼脂糖和琼脂糖凝胶、丙烯酸树脂和如聚丙烯酰胺和乳胶珠。用于将抗体偶联到这些固体支持物的技术是本领域公知的。
多个传统的展示技术可用来选择免疫球蛋白、免疫球蛋白片段或蛋白质星结合分子。例如，Li等人(Organinc & Biomolecular Chemistry(2006),4,3420-3426)已演示了如何可以使用噬菌体获得能够与选定的DNA适配子形成复合体的单链Fv片段。例如，展示技术允许对选定的靶分子具有高亲和力的工程化的免疫球蛋白和配体的产生。因此，有可能通常通过基因工程的方法展示仅仅轻微地不同的一系列肽或蛋白。由此根据相互作用和生物物理参数的特性，可以筛选和随后演变蛋白或肽。突变和选择的迭代轮次可应用在体外基础上。
进行肽和蛋白质的选择的体外展示技术依赖于所述肽或蛋白和编码相同肽和蛋白的核酸之间的物理连锁。为了这个目的，已建立大量技术，最常用的是噬菌体/病毒展示、核糖体展示、细胞表面展示、“在质粒上的肽”、mRNA展示、DNA展示和包括微珠展示的体外区室化(综述见如例如Rothe,A.等人，FASEB J.(2006)20,1599-1610；Sergeeva,A.等人，Advanced Drug Delivery Reviews(2006)58,1622-1654)。
物理连接蛋白或肽和核酸的不同方法是可得到的。在具有细胞表面分子的细胞上的表达，作为具有病毒/噬菌体外壳蛋白的融合多肽的表达，RNA分子、核糖体和相应的多肽的稳定化体外复合体，通过嘌呤霉素分子或通过微珠的体外共价偶联是本领域中目前使用的蛋白/肽和核酸的连接方法的例子。另一展示技术依赖于油包水乳液。水滴充当单个基因在每一个中转录和翻译的隔室(Tawfik,D.S.,& Griffiths,A.D.,Nature Biotech.(1998)16,652-656,美国专利申请2007/0105117)。肽或蛋白和核酸(编码肽和蛋白)之间的这种物理连锁提供回收编码所选择的蛋白或肽的所述核酸的可能性。因此，相比展示技术中的技术如免疫沉淀反应，不仅选定的靶分子的结合配偶体可以鉴定或选择，而且这种结合配偶体的核酸可以回收并用于进一步加工。因此，现有的展示技术提供例如用于靶标发现、先导发现和先导优化的方法。肽或蛋白如抗体的广阔文库潜在地可以大规模筛选。
如上所述，可检测的标记物可以偶联到多肽的结合配偶体或分子，所述多肽具有对应于人蛋白S100A9的氨基酸位置63-79的区域、对应于人蛋白S100A9的氨基酸位置73-85的区域或对应于人蛋白S100A8的氨基酸位置的55-71的区域的序列，根据具体情况而定，所述分子与这些肽中的一个的结合配偶体形成复合物。可以偶联到这些肽中的一个的结合配偶体或与其形成复合体的分子的各自可检测的标志物可以是光学可检测的标记物、荧光团或发色团。合适的标记物的例子包括但不限于有机分子、酶、放射性的、荧光的和/或发色部分、发光部分、半抗原、地高辛、生物素、金属络合物、金属和胶体金。因此，可激发的荧光染料、放射性氨基酸、荧光蛋白或酶可以例如用于检测例如S100A9和/或S100A8的水平，其中结合到TLR4受体的所需区域是可接近的。合适的荧光染料的例子包括但不限于异硫氰酸荧光素、5,6-羧甲基荧光素、CascadeOregon德克萨斯红、硝基苯-2-氧杂-1,3-二唑-4-基香豆素、丹磺酰氯、罗丹明、氨基-甲基香豆素、DAPI、曙红、赤藓红、芘、丽丝胺、呫吨、吖啶、噁嗪、藻红蛋白、Cy染料如Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5PE、Cy5.5、Cy7、Cy7PE或Cy7APC、Alexa染料如Alexa 647和NBD(萘酚碱性染料)。合适的荧光蛋白的例子包括但不限于EGFP、祖母绿、EYFP、藻胆蛋白如藻红蛋白(PE)或别藻蓝蛋白、单体红色荧光蛋白(MRFP)、mOrange、mPlum和mCherry。在一些实施方案中，可以采用可逆光开关的荧光蛋白如Dronpa、bsDronpa和Padron(Andresen,M.等人,Nature Biotechnology(2008)26,9,1035)。关于合适的酶，碱性磷酸酶、大豆过氧化物酶或辣根过氧化物酶可作为几个说明性的例子。在一些实施方案中，检测方法可以包括电泳、HPLC、流式细胞术、荧光相关光谱法或这些技术的改良方式。这些步骤中一些或全部可以是自动化的分离/检测系统的一部分。
本文所描述的免疫球蛋白或蛋白质性结合配偶体可在一些实施例中用于受试者的生物体中的与炎性过程相关的病症的诊断。如上所述，对应于人蛋白S100A9的氨基酸位置63-79的区域以及对应于人蛋白S100A9的氨基酸位置73-85的区域的可接近性，和对应于人蛋白S100A8的氨基酸位置55-71的区域的可接近性，表明通过S100A9和S100A8结合到TLR4受体可以发生，因为蛋白不在异四聚体复合物中。因此，具有如上定义的结合特异性的免疫球蛋白或蛋白质性结合配偶体可以用于诊断患有其中涉及S100A9和S100A8的炎性病症的受试者。此外，通常可以鉴定受试者的生物体中的至少一些炎症部位。
在一些实施方案中，通过使用具有上述特异性的免疫球蛋白或蛋白质性结合配偶体诊断炎性病症的方法包括使用分子成像技术。为了此目的，所述免疫球蛋白或蛋白质性结合配偶体可以具有放射性标记。合适的放射性标记的两个例证是124I和89Zr，其可以通过螯合部分的方式偶联到免疫球蛋白或蛋白质性结合配偶体。在一些实施方案中，68Ga也可以用作放射性标记。然后可以使用正电子发射断层扫描(PET)成像。本领域所使用的典型的PET扫描器可以检测10-11M和10-12M之间的浓度，其足够检测S100A9和S100A8。PET可定量描绘受试者的生物体内的放射性标记的免疫球蛋白或蛋白质性结合配偶体的分布。可能使用的另一个分子成像技术包括但不限于分子核磁共振成像(MRI)、生物发光、荧光、靶向超声和单光子发射计算机断层显像(SPECT)。分子成像技术的概述已经由Dzik-Jurasz给出(TheBritish Journal of Radiology(2003)76S98-S109)。在一些实施方案中，免疫球蛋白或蛋白质性结合配偶体可以偶联到纳米颗粒如纳米晶体。
在需要时，如上定义的免疫球蛋白或蛋白质性结合配偶体可用在混合成像方法中。例如，PET/CT或SPECT/CT照相机是市售复合系统，其允许依次获取精确融合到单一的检查的解剖和功能的信息。集成的PET/磁共振成像允许校正器官或受试者的运动。磁共振成像还提供关于灌注和血液流动的信息，其可能在PET重建和炎症情况的数据分析中需要。通过免疫球蛋白或蛋白质性结合配偶体的分子成像也可以光声层析成像(PAT)的形式执行，或与PAT结合。PAT基于从光到超声波能量的转换。目前PAT通过使用纳秒脉冲激光束照射将被成像的生物组织以产生热和声学脉冲响应而执行成像。今天，PAT如聚焦扫描光声显微镜(PAM)、光声计算机断层扫描(PACT)和光声内镜(PAE)一样被普遍应用。
本文所公开的免疫球蛋白或蛋白质性结合配偶体可在一些实施方案中用于治疗，尤其用于治疗病症，包括与受试者的生物体中的炎症过程相关的疾病。本文所公开的免疫球蛋白或蛋白质性结合配偶体也可用于预防与受试者的生物体中的炎症过程相关的病症。术语“预防”指降低生物体感染或发展异常病症的概率。在一些实施方案中，这种免疫球蛋白或蛋白质性结合配偶体用于预防或治疗有此需要的受试者中的慢性或急性无菌性炎症、神经性疼痛、原发性移植物衰竭、缺血再灌注损伤、再灌注损伤、再灌注水肿、同种异体移植物功能障碍、肺再植应答和/或器官移植中的原发移植物功能障碍。本文所公开的免疫球蛋白或蛋白质性结合配偶体也可用于治疗感染性休克、哮喘病症、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、再灌注损伤、自身免疫性疾病、炎症性肠疾病、动脉粥样硬化、再狭窄、冠心病、糖尿病、风湿性疾病、皮肤病如银屑病和脂溢性皮炎、移植排斥、和肺、心脏、肾、口腔(例如牙周炎)或子宫的炎症。可以理解免疫球蛋白或蛋白质性结合配偶体也可用于这种病症的诊断。
一个相应的方法包括施用本文所公开的免疫球蛋白或蛋白质性结合配偶体。在一些实施方案中，免疫球蛋白或蛋白质性结合配偶体可以与TLR4抑制剂结合施用。在一些实施方案中，免疫球蛋白或蛋白质性结合配偶体可以与TLR2、MYD88、TICAMI和/或TIRAP抑制剂结合施用。
“治疗(Treating)”或“治疗(treatment)”或“减轻”是指治疗性治疗和预防性或防范性措施，其中目的是预防、减缓(减轻)或至少部分地减轻或消除生物体中的包括病理性的异常病症。需要治疗的那些包括已经患有病症的那些以及倾向于具有所述病症的那些或其中疾病要被预防(防止)的那些。术语“施用”涉及将化合物掺入生物体的细胞或组织中的方法。
如上所述，在一些实施方案中，提供了肽或肽的组合。在肽被提供时，所述肽被分离。同样，在肽的组合被提供时，肽的组合的肽被分离。术语“分离的”表明所述肽或核酸分子已从其的正常生理环境例如天然来源中取出，或肽或核酸被合成。术语“分离的”的使用表明天然存在的序列已从其正常的细胞如染色体的环境中取出。因此，该序列可以是在无细胞培养基中，或放置在不同的细胞环境中。因此，细胞可以被包含在与最初提供的不同的培养基中，如水性溶液，或放置在不同的生理环境中。通常，分离的细胞、肽或核酸分子相比于在获取它们的环境中构成存在于它们的环境中的总细胞、肽或核酸分子的更大部分，例如适用的溶液/悬浮液。指代多肽或核酸分子的“分离的”是指彼此偶联的氨基酸(2个或更多个氨基酸)或核苷酸的聚合物，包括从天然来源分离的或合成的多肽或核酸分子。所述术语“分离的”并不意味着该序列仅仅是存在的氨基酸链或核苷酸链，但它基本上不含有例如分别天然与其相关的非氨基酸材料和/或非核酸材料，如约90–95％纯的或更大。
如上所述，代替肽或除肽之外，拟肽同样可以在本发明的上下文中使用。如本文所用的术语“拟肽”指与相应的多肽具有相同通用结构的化合物，但其含有增加其稳定性或生物功能的修饰。在一些实施方案中，拟肽可包括一个或多个D-氨基酸，基本上由D-氨基酸组成或由D-氨基酸组成。D-氨基酸是天然存在的L-氨基酸的光学异构体。D氨基酸可看做L氨基酸的镜像。D-氨基酸的伸展不易于通过蛋白酶解在宿主生物体中被降解。在一些实施方案中，拟肽可以是反向(inverso)类似物，其是仅由D氨基酸组成的相同序列的类似物。在一些实施方案中，拟肽可以是给定肽的“翻转(reverso)”类似物，其意味着该拟肽包括所述肽的反向序列。在一些实施方案中，拟肽可以是“D-逆-对映异构体肽(D-retro-enantiomerpeptide)”，其是一种类似物，由具有以相反顺序排列的序列的D-氨基酸组成。拟肽还可以包括类肽，基本上由类肽组成或由类肽组成。类肽与肽的区别在于侧链连接到酰胺氮而不是α碳原子。因此，类肽可以被看作是低聚(N-烷基)甘氨酸，其仍具有与对应的多肽相同或基本相同的氨基酸序列。类肽通常对蛋白酶和其它修饰酶有抗性，并且比肽具有更高的细胞渗透性，参见例如Kwon,Y.-U.和Kodadek,T.，J.Am.Chem.Soc.(2007)129,1508-1509。这篇文章提供引用全文并入本文。在相反的情况下，本说明书包括定义将优先。
所述肽或拟肽可以通过任何方法来制备，例如通过合成肽或拟肽，或者通过在细胞中表达编码适当的氨基酸序列的核酸，并从细胞中收获所述肽。也可以使用这些方法的组合。从头合成肽和拟肽的方法和重组产生肽和拟肽的方法在现有技术中是公知的。
本文所公开的所述肽或拟肽或者肽或拟肽的所述组合可能够干扰S100A8蛋白和/或S100A9蛋白与TLR4受体的结合。在所述TLR4受体存在于细胞表面上的情况下，结果，还可以诱导通过各自的S100A8蛋白结合到TLR4受体所诱导的细胞信号传导。术语“信号传导”和“信号转导途径”是指细胞机制和分子响应某一条件、改变或外部刺激而作用于细胞组分。通常，这种机制和分子通过细胞膜传播细胞外信号以成为细胞内信号。然后这个信号可以刺激细胞应答。
本文所公开的核酸分子可以包含编码一个或多个肽/蛋白的一个或多个序列。在一些实施方案中，在这些编码序列或这个编码序列中是编码SEQ ID NO：6的序列或其同源物的序列。在一些实施方案中，在这些编码序列或这个编码序列中是编码SEQ ID NO：9的序列或其同源物的序列。在一些实施方案中，在这些编码序列或这个编码序列中是编码SEQID NO：12的序列或其同源物的序列。在一些实施方案中，在这些编码序列或这个编码序列中是编码SEQ ID NO：6的序列或其同源物二者的序列和编码SEQ ID NO：12的序列或其同源物二者的序列。在一些实施方案中，在这些编码序列或这个编码序列中是编码SEQ ID NO：9的序列或其同源物二者的序列和编码SEQ ID NO：12的序列或其同源物二者的序列。在一些实施方案中，在这些编码序列或这个编码序列中是编码SEQ ID NO：6的序列或其同源物二者的序列和编码SEQ ID NO：9的序列或其同源物二者的序列。
在一些实施方案中，本文所公开的核酸分子包含编码含有SEQ ID NO：6的序列或其同源物的肽的单一序列。在一些实施方案中，本文所公开的核酸分子包含编码具有含有SEQ ID NO：6的序列或其同源物的60个氨基酸或更少长度的肽的单一序列。在一些实施方案中，本文所公开的核酸分子包含编码具有含有SEQ ID NO：6的序列或其同源物的50个氨基酸或更少长度的肽的单一序列。在一些实施方案中，本文所公开的核酸分子包含编码具有含有SEQ ID NO：6的序列或其同源物的18-50个氨基酸长度的肽的单一序列。在一些实施方案中，本文所公开的核酸分子包含编码具有含有SEQ ID NO：6的序列或其同源物的20-50个氨基酸长度的肽的单一序列。在一些实施方案中，本文所公开的核酸分子包含编码具有含有SEQ ID NO：6的序列或其同源物的40个氨基酸或更少长度的肽的单一序列。在一些实施方案中，本文所公开的核酸分子包含编码具有含有SEQ ID NO：6的序列或其同源物的20-40个氨基酸长度的肽的单一序列。在一些实施方案中，本文所公开的核酸分子包含编码具有含有SEQ ID NO：6的序列或其同源物的30个氨基酸或更少长度的肽的单一序列。在一些实施方案中，本文所公开的核酸分子包含编码具有含有SEQ ID NO：6的序列或其同源物的18-30个氨基酸长度的肽的单一序列。在一些实施方案中，本文所公开的核酸分子包含编码具有含有序列SEQ ID NO：6的序列或其同源物的20-30个氨基酸长度的肽的单一序列。在一些实施方案中，本文所公开的核酸分子包含编码基本上由SEQ ID NO：6的序列或其同源物组成的肽的单一序列。在一些实施方案中，核酸分子包含编码由SEQ ID NO：6的序列或其同源物组成的肽的单一序列。
在一些实施方案中，本文所公开的核酸分子包含编码含有SEQ ID NO：9的序列或其同源物的肽的单一序列。在一些实施方案中，本文所公开的核酸分子包含编码具有含有SEQ ID NO：9的序列或其同源物的60个氨基酸或更少长度的肽的单一序列。在一些实施方案中，本文所公开的核酸分子包含编码具有含有序列SEQ ID NO：9的序列或其同源物的50个氨基酸或更少长度的肽的单一序列。在一些实施方案中，本文所公开的核酸分子包含编码具有含有SEQ ID NO：9的序列或其同源物的14-50个氨基酸长度的肽的单一序列。在一些实施方案中，本文所公开的核酸分子包含编码具有含有SEQ ID NO：9的序列或其同源物的20-50个氨基酸长度的肽的单一序列。在一些实施方案中，本文所公开的核酸分子包含编码具有含有SEQ ID NO：9的序列或其同源物的40个氨基酸或更少长度的肽的单一序列。在一些实施方案中，本文所公开的核酸分子包含编码具有含有SEQ ID NO：9的序列或其同源物的14-40个氨基酸长度的肽的单一序列。在一些实施方案中，本文所公开的核酸分子包含编码具有含有SEQ ID NO：9的序列或其同源物的20-40个氨基酸长度的肽的单一序列。在一些实施方案中，本文所公开的核酸分子包含编码具有含有SEQ ID NO：9的序列或其同源物的30个氨基酸或更少长度的肽的单一序列。在一些实施方案中，本文所公开的核酸分子包含编码具有含有SEQ ID NO：9的序列或其同源物的14-30个氨基酸长度的肽的单一序列。在一些实施方案中，本文所公开的核酸分子包含编码具有含有SEQ ID NO：9的序列或其同源物的20-30个氨基酸长度的肽的单一序列。在一些实施方案中，核酸分子包含编码具有28个氨基酸或更少、如25个氨基酸或更少、24个氨基酸或更少、23个氨基酸或更少、22个氨基酸或更少或21个氨基酸或更少的长度的肽的单一序列。在一些实施方案中，核酸分子包含编码具有含有SEQ ID NO：9的序列或其同源物的20个氨基酸或更少长度的肽的单一序列。在一些实施方案中，核酸分子包含编码具有含有SEQ ID NO：9的序列或其同源物的14-20个氨基酸长度的肽的单一序列。在一些实施方案中，核酸分子包含编码基本上由SEQ ID NO：9的序列或其同源物组成的肽的单一序列。在一些实施方案中，本文所公开的核酸分子包含编码由SEQ ID NO：9的序列或其同源物组成的肽的单一序列。
在一些实施方案中，本文所公开的核酸分子包含编码含有SEQ ID NO：12的序列或其同源物的肽的单一序列。在一些实施方案中，本文所公开的核酸分子包含编码具有含有SEQ ID NO：12的序列或其同源物的60个氨基酸或更少长度的肽的单一序列。在一些实施方案中，核酸分子包含编码具有含有SEQ ID NO：12的序列或其同源物的50个氨基酸或更少长度的肽的单一序列。在一些实施方案中，核酸分子包含编码具有含有SEQ ID NO：12的序列或其同源物的18-50个氨基酸长度的肽的单一序列。在一些实施方案中，本文所公开的核酸分子包含编码具有含有SEQ ID NO：12的序列或其同源物的20-50个氨基酸长度的肽的单一序列。在一些实施方案中，核酸分子包含编码具有含有SEQ ID NO：12的序列或其同源物的40个氨基酸或更少长度的肽的单一序列。在一些实施方案中，本文所公开的核酸分子包含编码具有含有SEQ ID NO：12的序列或其同源物的18-40个氨基酸长度的肽的单一序列。在一些实施方案中，核酸分子包含编码具有含有SEQ ID NO：12的序列或其同源物的20-40个氨基酸长度的肽的单一序列。在一些实施方案中，核酸分子包含编码具有含有SEQ ID NO：12的序列或其同源物的30个氨基酸或更少长度的肽的单一序列。在一些实施方案中，核酸分子包含编码具有含有SEQ ID NO：12的序列或其同源物的18-30个氨基酸长度的肽的单一序列。在一些实施方案中，本文所公开的核酸分子包含编码具有含有SEQ ID NO：12的序列或其同源物的20-30个氨基酸长度的肽的单一序列。在一些实施方案中，核酸分子包含编码基本上由SEQ ID NO：12的序列或其同源物组成的肽的单一序列。在一些实施方案中，核酸分子包含编码由SEQ ID NO：12的序列或其同源物组成的肽的单一序列。
如本文所使用的术语“核酸”指处于任何可能结构例如单链、双链或它们的组合的任何核酸分子。核酸包括例如DNA分子、RNA分子、使用核苷酸类似物或使用核酸化学所产生的DNA或RNA的类似物、锁核酸分子(LNA)、蛋白质核酸分子(PNA)和tecto-RNA分子(例如Liu,B.等人,J.Am.Chem.Soc.(2004)126,4076-4077)。PNA分子是核酸分子，其中主链是假肽而不是糖。因此，与例如DNA或RNA相比，PNA通常具有中性电荷主链。然而，PNA能够杂交至少互补和基本上互补的核酸链，就如同例如DNA或RNA(PNA被认为是它们的结构类似物)。LNA分子具有在C4’和O2’之间具有亚甲基桥的修饰的RNA主链，其锁定呋喃糖环为N型构型，从而提供具有更高的双链稳定性和核酸酶抗性的各自的分子。不像PNA分子，LNA分子具有带电荷的主链。DNA或RNA可以是基因组或合成起源的，可能是单链或双链。这种核酸可以是例如mRNA、cRNA、合成的RNA、基因组DNA、cDNA、合成的DNA、DNA和RNA的共聚物、寡核苷酸等。各自的核酸还可以含有非天然核苷酸类似物和/或被链接到亲和标记或标签。
许多核苷酸类似物是已知的，并且可以用于本文所公开的方法中。核苷酸类似物是含有在例如碱基、糖或磷酸酯基团的修饰的核苷酸。作为示例性例子，已知用2’F、2’O-Me或2’H残基替换siRNA的2’-OH残基改善各自RNA的体内稳定性。在所述碱基基团处的修饰包括A、C、G和T/U、不同的嘌呤或嘧啶碱基如尿嘧啶-5-基、次黄嘌呤-9-基和2-氨基腺嘌呤-9-基以及非嘌呤或非嘧啶核苷酸碱基的天然和合成性修饰。其他核苷酸类似物作为通用碱基。通用碱基包括3-硝基吡咯和5-硝基吲哚。通用碱基能够与任何其他碱基形成碱基对。碱基修饰通常可以与例如糖修饰结合，如例如2’-O-甲氧乙基，例如以实现独特的性能，例如增加双链稳定性。
在一些实施方案中，本文所公开的核酸分子能够表达SEQ ID NO：6的序列或其同源物、SEQ ID NO：9的序列或其同源物和/或SEQ ID NO：12的序列或其同源物。在一些实施方案中，核酸分子包括使SEQ ID NO：6的序列或其同源物、SEQ ID NO：9的序列或其同源物和/或SEQ ID NO：12的序列或其同源物表达的序列。所述核酸分子可以例如包括可操作地连接到这些序列中的一个或多个、或者连接到包括这些序列中的一个或多个的序列的启动子。在一些实施方案中，本文所公开的核酸分子包括可操作地连接到这些序列中的一个或多个、或者连接到包括这些序列中的一个或多个的序列的终止信号。在一些实施方案中，根据本发明的核酸分子包括可操作地连接到这些序列中的一个或多个、或者连接到包括这些序列中的一个或多个的序列的调节序列。
术语“调节序列”包括可调控的转录启动子、操纵子、增强子、沉默子、转录终止子、与宿主细胞蛋白相互作用以进行转录和翻译的5’和3’非翻译区和可以控制基因表达的其它元件，包括起始和终止密码子。调节序列对所用的细胞和/或核苷酸序列可以是天然的(同源的)，或可以是外来的(异源的)。基因序列表达所需的调节序列的确切性质从生物体到生物体可能是不同的，但在原核生物中，通常应该包括启动子区，其包含所述启动子(其指导RNA转录的起始)以及当转录成RNA时，发合成起始信号的DNA序列。这种区域通常包括参与转录和翻译的起始的那些5’-非编码序列，如TATA盒、加帽序列或CAAT序列。这些调节序列通常为某个实施方案单独选择的，例如用于待使用的某个细胞。技术人员都知道，在原核细胞中正确表达还需要基因序列编码序列上游的核糖体结合位点的存在。
在一些实施方案中，本文所公开的核酸分子在细胞中表达，以便获得具有SEQ IDNO：6的序列或其同源物、SEQ ID NO：9的序列或其同源物和/或SEQ ID NO：12的序列或其同源物的肽。在一些实施方案中，所述细胞表达S100A9蛋白和/或S100A8蛋白。如下所述，这种肽的表达可包括具有有编码肽的序列的构建体的载体的产生。一旦包含所述构建体的载体或核酸分子已经准备用于表达，所述核酸构建体可以通过各种适当方法中的任一种引入到选定的合适的宿主细胞中，所述方法即转化、转染、接合、原生质体融合、电穿孔、粒子枪技术、磷酸钙沉淀、直接显微注射等。引入载体后，受体细胞在选择性培养基中生长，所述选择培养基选择含有载体的细胞生长。克隆基因的表达导致本文所公开的蛋白或肽或其片段的产生。这可以发生在转化细胞本身中，或之后诱导这些细胞分化。各种培养条件可用于形成本文所公开的肽。可能希望使用模拟生理条件的条件。
本文所使用的术语“表达(expression)”和“表达的(expressed)”以其最广泛的含义使用，以表示包含在核酸分子中且编码肽/蛋白的序列被转化成它的肽/蛋白产物。因此，在所述核酸是DNA时，表达指将DNA的序列转录为RNA和将RNA翻译为蛋白质。在所述核酸是RNA时，表达可以包括该RNA复制为另外的RNA拷贝和/或RNA逆转录为DNA和任选地该DNA转录为另外的RNA分子。总之，RNA的表达包括提供/生成的RNA种类中的任一种翻译为蛋白。因此，表达通过翻译进行，并包括选自转录、逆转录和复制中的一个或多个进程。可使用体外表达系统执行多个肽和/或蛋白的成员的蛋白或肽的表达。这种表达系统可以包括通常来自细菌、兔网织红细胞或小麦胚芽的细胞提取物。许多合适的系统是市售的。根据需要，所使用的氨基酸混合物可以包括需要合成的氨基酸，以增加在文库中产生的蛋白的可能数量或种类。这可以通过用人工氨基酸装载tRNA和使用这些tRNA用于要选择的蛋白的体外翻译来实现。核酸分子如DNA，据说“能够表达”肽/蛋白，如果它包含含有转录和翻译调节信息的核苷酸序列，并且这种序列可操作地连接到编码多肽的核苷酸序列。对于表达目的合适的实施方案是载体的使用，尤其是表达载体。因此，还提供了用表达载体转化/转染的宿主细胞。
在一些实施方案中，本文所公开的核酸分子包括表达盒，所述表达盒能够诱导和/或调节具有SEQ ID NO：6的序列或其同源物、SEQ ID NO：9的序列或其同源物和/或SEQ IDNO：12的序列或其同源物的肽的表达。在一些实施方案中，本文所公开的核酸分子被载体涵盖，所述载体包含在各自的宿主细胞中有效起始转录的启动子(无论内源性还是外源性来源的)。
如本文所用的术语“表达盒”指在适当的宿主细胞中能够指导特定核苷酸序列的表达的核酸分子。表达盒包括可操作地连接到目标核苷酸序列的启动子，其被可操作地连接到一个或多个终止信号。它也可包括核苷酸序列的正确翻译所需要的序列。该编码区能够在有义或反义方向编码目标多肽，也可以编码目的功能性RNA，包括但不限于反义RNA或非翻译RNA。包括目的核苷酸序列的表达盒可以是嵌合的，意思是它的组件中的至少一个相对于它的其它组件中的至少一个是异源的。该表达盒也可以是天然存在的，但以可用于异源表达的重组形式获得。然而，在一些实施方案中，表达盒相对于所述宿主是异源的；即表达盒的特定核酸序列不天然存在于宿主细胞中，并通过转化事件导入到宿主细胞中或宿主细胞的祖先中。仅当宿主细胞暴露一些特定的外部刺激时，在所述表达盒中的核苷酸序列的表达可以在组成型启动子或起始转录的诱导型启动子的控制下。在多细胞生物体例如植物或动物的情况下，所述启动子也可以是特定组织、器官或发育阶段特异的。
“基因”是指占据染色体上的特定基因座的遗传单位，并且是与生物学功能相关的核酸片段。基因包括转录和/或翻译调节序列以及编码区。除了编码序列，基因可包括启动子区、顺式调节序列、是对调节蛋白特异性的识别序列的非表达DNA片段、有助于基因表达的非表达的DNA片段、设计为具有期望参数的DNA片段或它们的组合。基因可以通过多种方法获得，所述方法包括从生物样品中克隆，基于已知或预测的序列信息合成，和现有序列的重组衍生。
术语“载体”有时也指基因递送系统或基因转移载体，涉及包括传递到宿主细胞的多核苷酸的大分子或分子复合物，无论是在体外、离体或在体内。通常，载体是单链或双链环状核酸分子，其允许或促进核酸序列转移到细胞中。载体通常可以转染到细胞中，并在细胞基因组内或独立于细胞基因组复制。环状双链核酸分子可以被剪切，由此在用限制性酶处理后线性化。核酸载体、限制性酶的分类，和通过限制性酶切割的核苷酸序列的知识是本领域技术人员容易获得的。编码肽的核酸分子可以通过用限制性酶切割载体并将两个片段连接在一起而插入到载体中，所述肽诸如包括SEQ ID NO：6的序列或其同系物、SEQ ID NO：9的序列或其同系物和/或SEQ ID NO：12的序列或同系物的肽。载体例如可以是病毒载体，如逆转录病毒载体、慢病毒载体、疱疹病毒基载体或腺病毒载体。载体还可以是质粒载体，其也是原核载体的典型例子。在一些实施方案中，各个质粒可以是能够在大肠杆菌中复制的质粒，诸如例如pBR322、ColEl、pSClOl、pACYC 184或πVX。芽孢杆菌质粒包括pC194、pC221或pT127。合适的链霉菌质粒包括p1J101和链霉菌噬菌体如φC31。载体也可以是基于脂质体的染色体外载体，也称为附加型载体。附加型载体的两个示例性例子是基于oriP的载体和编码EBNA-1的衍生物的载体。淋巴疱疹病毒是在淋巴母细胞中复制的疱疹病毒，并且成为用于其自然生命周期的一部分的质粒。载体也可以基于有机改性的硅酸盐。在一些实施方案中，载体可以是基于转座子的系统，即转座子/转座酶系统，例如所谓的SleepingBeauty、Frog Prince转座子-转座酶系统或TTAA特异性转座子piggyBac系统。转座子是移动的遗传元件，因为它们是可以围绕单个细胞的基因组内的不同位置移动(称为转座的过程)的DNA序列。在这个过程中，转座子可引起突变和改变基因组中DNA的量。
贯穿本文所使用的术语“启动子”指基因序列表达所需要的核酸序列。生物体与生物体的启动子区各不相同，但是对于不同的生物体，启动子区是本领域技术人员所公知的。例如，在原核生物中，启动子区包含启动子(其指导RNA转录的起始)以及当转录成RNA时，发合成起始信号的DNA序列。这种区域通常包括参与转录和翻译起始的那些5’-非编码序列，如TATA盒、加帽序列、CAAT序列等。根据具体实施方案的需要，组成型和诱导型启动子都可以用于本发明的上下文中。被多种潜在宿主细胞识别的大量启动子是公知的。通过从源启动子经由限制性酶消化除去启动子且将分离的启动子序列插入到所选择的载体，选择的启动子可以可操作地连接到编码本文所述的多肽的顺反子DNA。天然启动子序列和许多异源启动子都可用于指导选定的核酸序列的扩增和/或表达。
在本文所公开的方法中，通过用于本领域可用的细胞转化的核酸传递的任何合适的技术，可以将核酸导入宿主细胞中。合适的技术的例子包括但不限于DNA的直接递送，例如经由转染、包括显微注射的注射、电穿孔、磷酸钙沉淀、通过使用DEAE-葡聚糖随后为聚乙二醇、直接声波装载、脂质体介导的转染、受体介导的转染、微粒轰击、用碳化硅纤维搅拌、农杆菌介导的转化、干燥/抑制介导的DNA摄取或它们的任意组合。
如本文所公开的方法还可以包括测量包括SEQ ID NO：6的序列或其同源物、SEQID NO：9的序列或其同源物和/或SEQ ID NO：12的序列或其同源物的序列的表达。这可以例如通过测定从处于选择的启动子的控制下的编码核酸分子转录的RNA分子的数量来实现。本领域常用的方法是使用逆转录酶的RNA到cDNA的后续拷贝和将cDNA分子偶联至DOA荧光染料。该分析可以例如以DNA微芯片的形式来执行。很多的各自服务和试剂盒是商购的，例如来自Affymetrix的的表达阵列。测定转录因子的基因表达的其它方法包括但不限于寡核苷酸阵列和定量实时聚合酶链式反应(RT-PCR)。
在一些实施方案中，校准肽/蛋白表达的数据或评论它们可能是有利的或期望的。因此，在一些实施方案中，本文所公开的方法还包括将获得的结果与一个或多个对照测量的那些进行比较。这种对照测量可包括与主要的测量本身不同的任何条件。它可以包括其下例如各个肽/蛋白不表达的方法的条件。对照测量的另一个方法是相应的肽/蛋白的突变形式的使用，例如不编码包括SEQ ID NO：6的序列或其同源物、SEQ ID NO：9的序列或其同源物和/或SEQ ID NO：12的序列或其同源物的对应的肽/蛋白的核酸序列或基因，或编码非功能性肽/蛋白质。
在一般的基础上，本发明还涉及诊断S100A8和/或S100A9介导的障碍的方法和用途及治疗S100A8和/或S100A9介导的障碍的方法和用途，所述障碍即特征在于由蛋白S100A8和S100A9中的一种或两种诱导的、以TLR4信号传导(包括过多的TLR4信号传导)为特征的障碍、病症或疾病状态。在一个具体方面，所述TLR4信号传导是超过类似非病变细胞或组织中的TLR4信号传导水平的疑似患病的细胞或组织中的TLR4信号传导。在一个具体方面，S100A8和/或S100A9介导的障碍包括炎症。在一些实施方案中，本文所公开的肽或拟肽的使用允许阻断或降低所述TLR4信号传导活性。
在本文所公开的一些方法和用途中，S100A8和/或S100A9和TLR4受体之间的复合物的形成减少，包括阻止。在本文所公开的一些方法和用途中，S100A8和S100A9之间的异四聚体复合物的形成减少，包括阻止。
在一些实施方案中，本文所公开的方法包括S100A8和/或S100A9、或这些蛋白质中的一个的功能片段和TLR4受体或TLR4受体的功能片段之间的复合物的形成的测量。在结合TLR4受体的上下文中，S100A8的功能片段和S100A9的功能片段由两个标准来定义。首先，功能片段能够结合TLR4受体并与TLR4受体形成复合物，所述复合物足够稳定以影响TLR4受体的信号转导。通常，S100A8的这种片段包含具有对应于人S100A8蛋白的从氨基酸位置55到氨基酸位置71范围的氨基酸序列的区域的氨基酸序列的表位。S100A9的这种片段通常包含具有对应于人S100A8蛋白的从氨基酸位置63到氨基酸位置79范围和/或从氨基酸位置73到氨基酸位置85范围的氨基酸序列的区域的氨基酸序列的表位。第二，这样的片段可以分别与S100A8和S100A9的天然存在的变体的对应的氨基酸序列具有至少60％的序列同一性。在一些实施方案中，各自的片段分别与S100A8和S100A9的已知变体的对应的氨基酸序列具有至少80％、例如至少95％的序列同一性。可以理解S100A8或S100A9的功能片段能够被化合物调节，其方式使得其与TLR4受体的复合物形成受到影响。
所述TLR4受体的功能片段由两个标准来定义。首先，功能片段能够结合S100A8蛋白和S100A9蛋白并与S100A8蛋白和S100A9蛋白形成复合物，所述复合物足够稳定以影响TLR4受体的信号转导。第二，这样的片段可以与TLR4受体的天然存在的变体的对应的氨基酸序列具有至少60％的序列同一性。在一些实施方案中，各自的片段与TLR4受体的已知变体的对应的氨基酸序列具有至少80％、例如至少95％的序列同一性。可以理解TLR4受体的功能片段能够被化合物调节，其方式使得其与S100A8蛋白和S100A9蛋白的复合物形成受到影响。
在一些实施方案中，本文所公开的方法包括双分子结合的测量，所述双分子结合即S100A8蛋白或S100A8蛋白的功能片段以及S100A9蛋白或S100A9的功能片段之间的复合物的形成。在一些实施方案中，方法包括四分子结合的测量，所述四分子结合即S100A8或S100A8的功能片段的两个分子和S100A9或S100A9的功能片段的两个分子之间的复合物的形成。
在彼此结合的情况下，S100A8的功能片段和S100A9的功能片段由三个标准来定义。首先，S100A9蛋白的功能片段能够结合S100A8蛋白并与S100A8蛋白形成复合物，所述复合物足够稳定以超过毫秒检测。同样地，S100A8蛋白的功能片段能够结合S100A9蛋白并与S100A9蛋白形成复合物，所述复合物足够稳定以超过毫秒检测。通常，相应聚合物具有在生理条件下超过毫秒的半衰期。第二，这样的片段能够结合钙离子。各片段也可以能够结合锌和/或铜离子。通常，S100A9蛋白和S100A8蛋白的这样的片段具有至少一种功能性的EF手形，即包含已知对于钙结合所需的保守氨基酸的EF手形。第三，这样的片段可以分别与S100A8和S100A9的天然存在的变体的对应的氨基酸序列具有至少60％的序列同一性。在一些实施方案中，各自的片段分别与S100A8和S100A9的已知变体的对应的氨基酸序列具有至少80％、例如至少95％的序列同一性。可以理解S100A8和S100A9的功能片段分别能够被化合物调节，其方式使得其与S100A8和S100A9的复合物形成受到影响。
复合体形成的这种测量可以例如依赖光谱学的、光化学的、光度的、荧光的、放射性的、酶的或热力学的方式，或者依赖细胞效应。光谱学检测方法的例子是荧光相关光谱。光化学方法是例如光化学交联。光活性的、荧光的、放射性的或酶标记的利用分别是光度的、荧光的、放射性的和酶的检测方法的例子。热力学检测方法的例子是等温滴定量热法。使用细胞效应的方法的例子是从单核细胞释放的炎性因子的测量，例如TNFα的释放。这些方法中的一些可以包括另外的分离技术诸如电泳或HPLC。详细地说，标记的使用的例子可以包括作为探针的化合物或带有附加酶的免疫球蛋白，由这些催化的反应产生可检测信号。使用放射性标记和通过电泳分离的方法的例子是电泳迁移率变动分析。
S100A9和S100A8蛋白或相应的片段之间，或S100A9和/或S100A8蛋白或相应的片段之间的复合物形成的测量可包括在鉴别适合于诊断、预防和/或治疗生物体中的与炎性状态相关的病症的化合物的方法中。复合物的形成可以在非变性条件下在对S100A9和/或S100A8特异的免疫球蛋白或具有免疫球蛋白样功能的结合配偶体的靶标的分子量的基础上进行分析。作为示例性例子，可以定量可检测地标记的免疫球蛋白或结合配偶体的信号强度，例如通过荧光部分或产生荧光信号的部分，从而检测出被发现具有增加的分子量的靶标，并用作复合物形成的指示。作为另一例子，S100A9和S100A8或S100A9和/或S100A8与TLR4(任选各自的功能片段)相互作用可以在表面等离子体共振的基础上检测出，例如使用表面等离子光谱、光波导光光谱或等离子体波导共振光谱。表面等离子体共振是一个光电技术，可以无标记地测量或使用标签如纳米颗粒，其可以包括金属或非金属如量子点的形式。在一些实施方案中，纳米颗粒在可见光波长处显示出表面等离子体共振，可能包括在近红外频率。这种纳米颗粒可以包括下述或者由下述组成：贵金属如金或银，即元素周期表中的11族的元素(根据新IUPAC系统，根据旧IUPAC系统和CAS系统为IB族)或元素周期表中的10族的元素(根据新IUPAC系统，根据旧IUPAC系统为VIII族和CAS系统的VIII族)如钯或铂。各个纳米颗粒在可见光谱中显示出强等离子体共振失效带，因此，深色使人想起分子染料。如果该事件照片频率与游离(导通)电子的集体振荡共振，这些失效带发生，也被称为局域性表面等离子体共振(LSPR)。LSPR激发导致具有非常大的摩尔消光系数的波长选择性吸收、高效率的瑞利散射和纳米颗粒表面附近的增强的局部电磁场。可得到多个综述，从而提供表面等离子体共振的介绍，这是一种本领域公知的方法，以及其向传感器的应用(例如参见Willets,K.A.,& Van Duyne,R.P.,Annu.Rev.Phys.Chem.(2007)58,267-297；Homola,J.等人,Anal Bioanal Chem(2003)377,528-539；Schuck,P.,Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.(1997)26,541-566；或Hafner,J.,Laser Focus World(2006)April,99-101)。
在一些实施方案中，包括对应的复合物的测量的各个方法包括与参考值或阈值比较所获得的结果。阈值例如可以是设定来决定复合物是否形成的值。阈值也可以是设定来决定受试者是否患有炎性病症的值。阈值也可以是设定来决定受试者是否患有与S100A9和S100A8相关的炎性病症的值。
在一些实施方案中，包括对应的复合物的测量的方法在从疑似或已知患有炎性病症的受试者的样品上执行。本文中对照测量也被称为参考测量，可以是在从已知未患有炎性病症的受试者的样品上进行的测定。在一些实施方案中，相应的参考测量在从年龄匹配的受试者的(对照)样本上进行。在一些实施方案中，这种参考测量在来自同一受试者的样品上执行，所述样品是在先前的时间点取得的。在本文所公开的方法中，例如在样品中测定的复合物形成的量，可以与这种参考测量进行比较。在一些实施方案中，样品中测定的复合物的量与阈值进行比较。在一些实施方案中，这种阈值可以是预定的阈值。在一些实施方案中，所述阈值基于在对照样品中测定的复合物的量。通常，相应的对照样品可具不同于在主要测量中所用的样品的任何条件。
在一些实施方案中，包括对应的复合物的测量的方法在复合物的富集、纯化或分离的组分的混合物中执行，所述混合物任选地包括疑似影响复合物形成的物质。所使用的蛋白诸如TLR4受体、S100A9或S100A8可已以重组形式、例如在合适的宿主生物体中表达。所述TLR4受体、S100A9或S100A8的片段可同样通过以重组形式的表达来获得。在一些实施方案中，所述TLR4受体、S100A9或S100A8的片段可已通过既定的肽合成技术来合成。这种测量通常在水性溶液中进行，所述水性溶液包括缓冲液和/或盐，例如钙盐或锌盐。众多缓冲液化合物用于本领域中，并且可以用来执行本文所描述的各种过程。缓冲剂的例子包括但不限于下述盐的溶液：磷酸盐、碳酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、甲酸盐、巴比妥酸盐、草酸盐、乳酸盐、邻苯二甲酸盐、马来酸盐、甲次砷酸盐、硼酸盐、N-(2-乙酰氨基)-2氨基-乙磺酸盐(也称为ACES)、N-(2-羟乙基)-哌嗪-N'-2-乙磺酸(也称为HEPES)、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪-丙磺酸(也称为HEPPS)、哌嗪-1,4-双(2-乙-磺酸(也称为PIPES)、(2-[三(羟甲基)-甲氨基]-1-乙磺酸(也称为TES)、2-环己基氨基-乙磺酸(也称为CHES)和N-(2-乙酰氨基)-亚氨基二乙酸盐(也称为ADA)。任何抗衡离子可以用在这些盐中，铵、钠和钾可作为示例性例子。缓冲剂的其它例子包括但不限于三乙醇胺、二乙醇胺、乙胺、三乙基胺、甘氨酸、甘氨酰甘氨酸、组氨酸、三(羟甲基)氨基甲烷(也称为TRIS)、双-(2-羟乙基)亚氨基-三(羟甲基)甲烷(也称为BIS-TRIS)和N-[三(羟甲基)-甲基]甘氨酸(也称为TRICINE)，仅举几例。缓冲剂可以是这些缓冲化合物的水性溶液或在合适的极性有机溶剂中的溶液。作为示例性例子，缓冲剂可以固体形式存储，例如冷冻干燥。在这种情况下，固体缓冲剂例如粉末也可通过合并和或混合溶于水相，例如通过超声波的方法辅助或执行。在这样的情况下，使用的相应的水相的体积的量可以例如用于获得所需的最终的缓冲液浓度。
在这样的实施方案中，即在使用复合物的富集、纯化或分离的组分的混合物时，参考测量可以包括不同于主测量的条件的任何条件的使用。作为示例性例子，在使用TLR4受体、S100A9和/或S100A8的片段时，参考测量可以包括相应的全长蛋白的使用。在其中化合物被包括在主测量中的实施方案中(所述化合物是待检测其在相应复合物形成上的影响的化合物)，参考测量可以其中省略该化合物的测量。
在一些实施方案中，阈值是多个对照样品数据的集合，所述对照样品也可被称为参考样品。在这样的实施方案中，阈值可以被设置为对照和来自目标受试者的样品之间的显著差异。术语“显著的”用来表示增加的水平具有统计相关性。作为示例性例子，包括多个样品的多个测量可已经从目标受试者获得。然后可以确定p值。0.05、0.02、0.01或更低的p值可以用来指示差异。在一些实施方案中，显著的增加是测试样品的值相对于对照样品的值约2倍或以上、包括3倍或更多、例如至少约5至约10倍或甚至更多的偏差。
如上所述，在一些实施方案中，预定的阈值可以在从已知不患有与炎性病症相关的障碍的一个或多个受试者收集的数据基础上设定的。在一些实施方案中，这些数据的某个百分位可以用作阈值，例如在表面等离子体共振测量中所测量的信号强度，或在非变性条件(同上)下检测复合物形成的抗体信号。从受试者的样品或在不存在试验化合物的情况下使用参照条件获得的数据组的值的范围可以划分为100等份，即可以确定范围的百分比。百分位代表数据的某一百分比落入其下的相应范围内的值，换句话说，是小于那个值的值的百分比。例如，第95百分位是发现数据的95％低于其的值。在一些实施方案中，proSP-B的水平，或其有效部分，可以被认为是增加或升高的，如果它是在第90百分位以上、第92百分位以上、第93百分位以上、第94百分位以上、第95百分位以上、第96百分位以上、第97百分位以上、第98百分位以上或第99百分位以上。
与阈值的比较可以以手动、半自动或全自动的方式进行，所述阈值可以是预定的阈值。在一些实施方案中，所述比较可以是计算机辅助的。计算机辅助的比较可以采用存储在数据库中的值，作为用于比较所得到的值或确定的量的参照，例如通过计算机实现的算法。同样，与参照测量的比较可以以手动、半自动或全自动的方式进行，包括以计算机辅助的方式。
在一些实施方案中，上述复合物的形成可通过将复合物的组分中的一个固定在表面上来确定。在所述复合物的组分彼此接触和允许复合物形成之后，将复合物中的任何未结合的组分除去，通常通过交换介质，所述介质例如包含固定化的复合物组分的缓冲液。随后所形成的复合物的组分(未以固定化形式提供)的存在可以被测定以评估复合物是否已经形成，并且任选地这种复合物在何种程度上已经形成。作为示例性例子，可能意在确定是否(包括何种程度上)所述TLR4受体的功能片段和S100A9蛋白和/或S100A8蛋白之间的复合物已经形成。在这种实施方案中，所述TLR4受体的片段可以固定在表面上，例如在多孔板的孔的表面上。在复合物形成和在孔中的培养基交换之后，对S100A9和/或S100A8具有结合特异性的免疫球蛋白或蛋白质性结合配偶体可以用于检测复合物的形成。如上所述，本文所公开的对S100A9和/或S100A8上的区域具有结合特异性的抗体分别与S100A9和S100A8在结合到TLR4受体的位点上相互作用。因此，这种抗体只能检测没有结合TLR4受体的S100A9和/或S100A8。因此，对于在与所述TLR4受体的复合物中的S100A9以及S100A8蛋白的检测，将通常使用具有不同特异性的，即结合到S100A9和/或S100A8上的不同位点的免疫球蛋白或蛋白质性结合配偶体。这种在S100A9上的结合位点是不同于由Uniprot/Swissprot登录号为P06702的人蛋白的氨基酸位置63-79和/或氨基酸位置73-85所限定的区域的表位。在S100A8上的各自的结合位点是不同于由Uniprot/Swissprot登录号为P05109的人蛋白(SEQID NO：78)的氨基酸位置55-71所限定的区域的表位。对于对由人S100A9蛋白的氨基酸位置63-79和/或氨基酸位置73-85所限定的区域具有结合特异性的抗体可以用在对照测量中，以测定是否存在留下的任何S100A9蛋白，其中这个区域是可接近的。
测定样品中S100A9、S100A8和/或TLR4受体的量可以通过任何合适的可用的技术执行。在这方面合适的技术的示例性例子是放射性同位素标记法如放射免疫测定(RIA)或酶免疫测定如酶联免疫吸附测定(ELISA)、沉淀法(特别是免疫沉淀)、夹心酶免疫测试、电化学荧光夹心免疫测定(ECLIA)、解离增强镧系荧光免疫测定(DELFIA)、闪烁亲近测定法(SPA)、比浊法、散射比浊法、乳胶增强比浊法或散射比浊法，或固相免疫测试。本领域已知的其它方法(例如凝胶电泳、2D凝胶电泳、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、蛋白质印迹和质谱)可单独使用或与标记法或本文所描述的其它检测方法组合使用。而RIA基于与在免疫球蛋白或具有免疫球蛋白样功能的蛋白质性结合分子和抗原之间形成的复合物相关的放射性的测量，ELISA基于与在免疫球蛋白或具有免疫球蛋白样功能的蛋白质性结合分子和抗原之间形成的复合物相关的酶反应的测量。通常，放射性同位素标记测定或酶免疫测定法涉及一个或多个分解步骤，其中尚未与S100A9、S100A8和/或TLR4形成复合物的例如S100A9、S100A8和/或TLR4结合配偶体被去除(参见上文)，由此仅留下S100A9、S100A8和/或TLR4的结合配偶体，其已与S100A9、S100A8和/或TLR4形成复合物。这允许源自S100A9、S100A8和/或TLR4的存在的特定信号的生成。
ELISA或RIA试验对S100A9、S100A8和/或TLR4的量，即抗原的量的测量具有竞争性。例如，酶标记的抗原与含抗原的试验样品混合，其竞争有限量的免疫球蛋白或具有免疫球蛋白样功能的蛋白质性结合分子。随后所述反应(结合)的抗原从游离材料中分离，并且它的酶活性通过添加底物来估算。对于抗原测定的另一种方法是双免疫球蛋白/蛋白质性结合分子夹层技术。在这个修改中，固相用特异性免疫球蛋白或具有免疫球蛋白样功能的蛋白质性结合分子涂覆。然后这与来自包含该抗原的受试者的样品反应。然后添加酶标记的特异性免疫球蛋白/蛋白质性结合分子，随后加入酶底物。由此测试样品中的“抗原”被“捕获”并固定在敏感化的固相上，在那里其本身可以固定所述酶标记的免疫球蛋白/蛋白质性结合分子。这种技术类似于免疫放射测定。
在间接ELISA方法中，通过被动吸附到固相上将抗原固定。然后测试血清用固相孵育，并且测试血清中的任何免疫球蛋白与固相上的抗原形成复合物。同样，具有免疫球蛋白样功能的蛋白质性结合分子的溶液可用固相孵育，以使在固相上的抗原和蛋白质性结合分子之间的复合物形成。在洗涤除去未反应的血清组分之后，连接于酶的抗免疫球蛋白的免疫球蛋白、抗蛋白质性结合分子的免疫球蛋白与固相接触并孵育。在所述第二试剂选择为具有免疫球蛋白样功能的蛋白质性结合分子时，使用特异性结合至蛋白质性结合分子或针对抗原的免疫球蛋白的相应的蛋白质性结合分子。结合于抗原的第二蛋白质性结合分子或免疫球蛋白和第一蛋白质性结合分子或免疫球蛋白的复合物形成。再次洗涤去除未反应的物质。在RIA情况下，检测到放射性信号。在ELISA的情况下，加入酶底物。其颜色的变化是涉及抗原的固定的复合物的测量，其与所述测试样品中的抗体水平成正比。
在另一个实施方案中，免疫球蛋白或具有免疫球蛋白样功能的蛋白质性结合分子可以固定在表面上，如聚合物珠子(同上)的表面上，或涂覆在装置的表面上，如聚合物板或玻璃板。这样的实施方案可以与上述复合物的形成的测量组合采用。对S100A9、S100A8和/或TLR4具有结合特异性的免疫球蛋白或蛋白质性结合分子可用于固定结合到表面上的抗体的各个靶标。然后可以在提供所述复合物的其余组分、任选地还提供检测用于影响复合物形成的化合物之后，允许复合物形成。此后，可使用合适的免疫球蛋白或蛋白质性结合分子检测该复合物的形成。在检测技术如ELISA中，通过固定，免疫复合物可易于通过简单洗涤例如珠子或板的表面从存在的其它组分中分离。这是目前在本领域中所用的最常用的方法，并且被称为固相RIA或ELISA。这个实施方案对于确定S100A9、S100A8和/或TLR4的量特别有用。在一般的基础上，在放射性同位素标记测定或酶免疫测定的任何实施方案中，被动吸附到固相可以在第一步骤中使用。可以通过在所有的随后的洗涤和孵育步骤中包含润湿剂来防止其它试剂的吸附。这可有利地进行洗涤以防止从一个步骤到下一个步骤的试剂的遗留。
ELISA的各种其它修改已被用于本领域中。例如，其中第二蛋白质性结合分子或免疫球蛋白用在双抗体夹心方法中的系统是来自不同物种，并且然后这与抗免疫球蛋白酶缀合物或抗蛋白质性结合分子酶缀合物反应。这种技术具有潜在优势，它避免了可以是供不应求和低效力的特异性免疫球蛋白或蛋白质性结合分子的标记。这个同样的技术可以用于测定只有不纯的抗原可得到的免疫球蛋白或蛋白质性结合分子；通过固定在固相上的抗体选择特异性反应抗原。
在对抗原的ELISA分析的另一例子中，表面特异性的抗原被固定在例如所使用板的表面上，然后，所述表面用参照免疫球蛋白或蛋白质性结合分子的混合物和测试样品孵育。如果在测试样品中没有抗原，则参照免疫球蛋白或蛋白质性结合分子被固定到抗原敏感化的表面上。如果在测试溶液中有抗原，这与参照免疫球蛋白或蛋白质性结合分子结合，则免疫球蛋白或蛋白质性结合分子从而无法再与敏感化的固相反应。然后附着的免疫球蛋白/蛋白质性结合分子的量由酶标记的抗球蛋白/抗结合分子缀合物和酶底物指示。测试样品(与参考系统比较)中抑制底物降解的抑制量与测试系统中抗原的量成正比。
在一些实施方案例中，在受试者的样品中或由受试者的样品测定的S100A9和/或S100A8的量或S100A9的比例可以以任何合适的方式与单个对照样品或多个对照样品进行比较，其中对应于人蛋白S100A9的氨基酸位置63-79和/或73-85的区域和/或对应于人蛋白S100A8的氨基酸位置55-71的区域是不可接近的。作为示例性例子，对照样品中S100A9和S100A8的异二聚体和/或异四聚体的水平可以以与标准偏差值偶联的平均值为特征，例如在给定的时间点。在一些实施方案中，受试者中S100A9和S100A8的异二聚体和或异四聚体的水平可以认为增加或减少，当它是一个标准偏差或高于或低于在一个或多个对照样品中所测定的对应的异二聚体/四聚体的平均值时。在一些实施方案中，异二聚体/四聚体的测定的水平被认为增加或减少，其中所获得的值是高于或低于在对照样品中所测定的平均值的约1.5个标准偏差，包括高于或低于在对照样品中所测定的平均值的约2个、约3个、约4或更多个标准差。在一些实施方案中，异二聚体/四聚体所测定的量被认为是不同的，其中所获得的值是对照样品中所测定的蛋白水平的约1.2倍或更高或低，包括是在对照样品中所测定的蛋白水平的约1.5倍、约2倍、约2.5倍、约3倍、约3.5倍、约4倍、约5倍或更高或低。在一些实施方案中，异二聚体/四聚体的测定的水平被看作是增加的，其中所获得的值是在对照样品中所测定的S100A9和S100A8的异二聚体和或异四聚体的量的约0.8倍或更小，包括是在对照样品中所测定的S100A9和S100A8的异二聚体和或异四聚体的量的约70％、约60％、约50％、约40％、约30％、约25％、约20％或更低。
本文所描述的化合物或组合，包括免疫球蛋白或蛋白质性结合配偶体，以及由如本文所公开的方法鉴定的化合物或组合可被施用于细胞、动物或人患者本身，或在药物组合物中，其中它们与其他活性成分混合，如在联合疗法中，或合适的载体或赋形剂(包括稳定剂)中。这样的载体、赋形剂或稳定剂通常是药学上可接受的，原因是以所采用的剂量和浓度它们对暴露于其的细胞或哺乳动物是无毒的。通常，生理学上可接受的载体是pH缓冲水溶液。生理学上可接受的载体的例子包括缓冲剂如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂例如EDTA；糖醇如甘露醇或山梨醇；成盐的抗衡离子诸如钠；和/或非离子表面活性剂如聚乙二醇(PEG)和示例性的途径包括但不限于口服、透皮和胃肠外递送。
合适的给药途径可以例如包括长效(depot)、口服、直肠、经粘膜或肠内给药；肠胃外递送，包括肌内、皮下、静脉内、髓内注射，以及鞘内、直接心室内、腹膜内、鼻内或眼内注射。
或者，可以以局部的而非全身的方式施用化合物或组合，例如通过该化合物或组合直接注射进入组织中，经常在长效或持续释放的制剂中。
此外，可以在靶向药物递送系统中施用药物，例如在涂有肿瘤特异性抗体的脂质体中。所述脂质体将被靶向至肿瘤且被肿瘤选择性摄取。
本文所公开的药物组合物包括如上定义的化合物或组合。这种药物组合物可以以本身已知的方式例如通过常规的混合、溶解、制粒、制锭、磨细、乳化、包封、包埋或冻干方法制造。
因此，用于根据本本发明所使用的药物组合物可以以常规方式来配制，其中使用一种或多种生理学上可接受的载体，包括促进活性化合物或组合加工成可在药学上使用的制剂的赋形剂和助剂。适当的制剂取决于所选择的给药途径。
对于注射，本文所公开的药剂可以在水性溶液中配制，例如在生理学上相容的缓冲液如Hanks’s溶液，Ringer’s溶液或生理盐水缓冲液中。对于经粘膜给药，在制剂中使用适合渗透障碍物的渗透剂。这样的渗透剂通常为本领域已知的。
对于口服给药，化合物或组合可通过组合化合物或组合与本领域公知的药学上可接受的载体而易于配制。这种载体使本文所公开的化合物或组合能够被配制成片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液或悬浮液，用于被待治疗的患者口服。
口服使用的药物制剂可以通过添加固体赋形剂获得，任选地研磨所得混合物，并加工颗粒的混合物，加入合适的助剂之后(如果需要的话)，以获得片剂或糖衣丸芯。合适的赋形剂尤其是填充剂如糖包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；纤维素制剂诸如例如玉米淀粉、小麦淀粉、米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。
如果需要的话，可以加入崩解剂如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或海藻酸或其盐如藻酸钠。
给糖衣丸芯提供合适的包衣。为了这个目的，可以使用浓缩的糖溶液，其可任选含有阿拉伯树胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆凝胶、聚乙二醇和/或二氧化钛、漆溶液和合适的有机溶剂或溶剂混合物。染料或色素可加入片剂或糖衣丸包衣中，用于辨识或表征活性化合物的不同组合或组合剂量。
可口服使用的药物制剂包括由明胶制成的推入配合胶囊，以及由明胶和增塑剂如甘油或山梨醇制成的软的密封胶囊。所述推入配合胶囊可以包含与填充剂例如乳糖、粘合剂如淀粉和/或润滑剂如滑石或硬脂酸镁和任选的稳定剂混合的活性成分。在软胶囊中，活性化合物或组合可溶解或悬浮在合适的液体中，如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇。此外，可以加入稳定剂。用于口服的所有制剂应在适合于这样给药的剂量中。对于口腔给药，所述组合物可以采取以常规方式配制的片剂或锭剂的形式。
对于吸入给药，如本文所公开使用的所述化合物或组合以从加压包装或喷雾器的气溶胶喷雾的形式非常便利地递送，所述喷雾器使用合适的推进剂例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合适的气体。在加压气溶胶的情况下，剂量单位可以通过提供阀门以递送经计量的量来确定。用于吸入器或吹入器的例如明胶的胶囊和药筒可以配制成含有化合物或组合和合适的粉末基质如乳糖或淀粉的粉末混合物。
所述化合物或组合可以配制用于肠胃外注射给药，例如，通过快速浓注或连续输注。用于注射的制剂可以以单位剂型存在，例如在具有添加的防腐剂的安瓿中或在多剂量容器中。该组合物可以采取例如在油性或水性溶媒中的混悬剂、溶液或乳剂的形式，并且可以包含配制剂如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。
用于肠胃外给药的药物制剂包括以水溶性形式的活性化合物或组合的水性溶液。此外，活性化合物或组合的悬浮液可制备成适当的油性注射悬浮液。合适的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油如芝麻油或合成的脂肪酸酯如油酸乙酯或甘油三酯或脂质体。水性注射悬浮液可以含有增加悬浮液的粘度的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。任选地，所述悬浮液还可以含有合适的稳定剂或增加所述化合物或组合的溶解度的试剂以允许高度浓缩溶液的制备。
另外，所述活性成分可以是粉末形式，在使用之前，用于与合适的载体，例如无菌无热原水构建。所述化合物或组合还可以配制成直肠组合物如栓剂或保留灌肠剂，例如含有常规栓剂基质如可可脂或其它甘油酯。
除了先前描述的制剂之外，所述化合物或组合还可以配制成长效制剂。这种长效制剂可以通过植入(例如皮下或肌内)或通过肌内注射施用。因此，例如该化合物或组合可用合适的聚合物或疏水材料(例如作为在可接受的油中的乳剂)或离子交换树脂配制，或配制为微溶的衍生物，例如配制为微溶的盐。
用于本文所公开的疏水性化合物或组合的药物载体是共溶剂系统，其包括苄醇、非极性表面活性剂、水混溶的有机聚合物和水相。该共溶剂系统可为VPD共溶剂系统。VPD是3％w/v的苄醇、8％w/v的的非极性表面活性剂聚山梨醇酯80和65％w/v的聚乙二醇300的溶液，在无水乙醇中补足体积。所述VPD共溶剂系统(VPD：D5W)由在水溶液中用5％右旋糖1:1稀释的VPD组成。
这个共溶剂系统很好地溶解疏水性化合物或组合，并在全身给药下，其本身产生低毒性。自然地，共溶剂系统的比例可以被显着改变，而没有破坏其溶解性和毒性特征。
此外，共溶剂组分的身份可变化：例如可以用其他低毒性非极性表面活性剂来代替聚山梨醇酯80；聚乙二醇的级分大小可以改变；其它生物相容性聚合物可以代替聚乙二醇，例如聚乙烯吡咯烷酮；且其它糖或多糖可替代右旋糖。
用于疏水性药物化合物的其他递送系统也可以使用。脂质体和乳剂是用于疏水性药物的公知的递送媒介物或载体的例子。某些有机溶剂如二甲基亚砜也可以使用，尽管通常以更大的毒性为代价。此外，该化合物或组合可以使用持续释放系统递送，例如包含治疗剂的固体疏水性聚合物的半透性基质。各种类型的持续释放材料已被确定并是本领域技术人员公知的。可以根据其化学性质，持续释放胶囊可释放化合物或组合几周至高达100天。根据治疗剂的化学性质和生物稳定性，使蛋白稳定化的其他策略也可使用。
该药物组合物还可以包括合适的固体或凝胶相载体或赋形剂。
这类载体或赋形剂的例子包括但不限于碳酸钙、磷酸钙、各种糖、淀粉、纤维素衍生物、明胶和聚合物如聚乙二醇。
可用于本发明的上下文中的许多化合物可以作为与药学上相容的抗衡离子的盐提供。药学上相容的盐可以由许多酸形成，所述酸包括但不限于盐酸、硫酸、乙酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、琥珀酸等。盐倾向于更溶于水性或其他质子性溶剂，所述溶剂是对应的游离碱形式。
适用于本发明的上下文中的药物组合物包括其中活性成分以有效达到其预期目的的量包含的组合物。更具体地，治疗有效量指化合物有效预防、缓解或改善疾病症状或延长被治疗的受试者的生存的量。治疗有效量的确定在本领域技术人员的能力范围内，尤其根据本文提供的详细公开。
对于用于本文所公开的方法中的任何化合物，治疗有效剂量最初可以从细胞培养试验中估计。例如，剂量可以在动物模型中制定以达到包括如在细胞培养物中测定的IC50的循环浓度范围(即达到激酶活性的半最大抑制的测试化合物的浓度)。这些信息可用于更准确地确定在人中有用的剂量。
本文所述化合物或组合的毒性和治疗功效可通过在细胞培养物或实验动物中的标准药学程序来确定，例如以确定LD50(50％群体致死的剂量)和ED50(50％群体的治疗有效剂量)。毒性和治疗效果之间的剂量比是治疗指数，它可以表示为LD50和ED50之间的比率。使用表现出高治疗指数的化合物或组合可能是希望的。从这些细胞培养测定和动物研究中获得的数据可用于配制一系列用于人的剂量。这种化合物或组合的剂量优选在包括ED50的循环浓度范围内且具有很少或没有毒性。所述剂量可以在这个范围内而变，这取决于采用的剂型和利用的施用途径。确切的制剂、给药途径和剂量可以通过考虑患者的病情的个体医生来选择。
剂量和间隔可以个别调整以提供活性部分的血浆水平，其足以维持激酶调节作用，或最低有效浓度(MEC)。对于每个化合物或组合，所述MEC将变化，但是可以从体外数据进行估计；例如达到所述激酶的50-90％抑制所需的浓度。达到MEC所需的剂量将取决于个体特征和给药途径。然而，HPLC测定或生物测定可用来测定血浆浓度。
剂量间隔也可使用MEC值来确定。化合物应该使用维持血浆水平高于MEC达10-90％时间，例如从约30至约90％，如从约50至约90％的方案给药。在局部给药或选择性摄取的情况下，药物的有效局部浓度可能与血浆浓度不相关。所施用的组合物的量当然将取决于被治疗的受试者、受试者的体重、痛苦的严重程度、给药方式和处方医师的判断。
如果需要，该组合物可以存在于包装或分配器装置中，其可包括含有活性成分的一个或多个单位剂型。所述包装可以例如包括金属或塑料箔，如泡罩包装。所述包装或分配装置可附有施用说明书。所述包装或分配器也可附有与容器相关联的通知，其为由政府机构规定的规范药品的制造、用途或销售的形式，该通知反映该化合物的形式由该机构批准用于人或兽医给药。这种通知，例如可能是经美国食品和药物管理局或其他政府机构对处方药批准的标签，或批准的产品插页。
本文所公开的在相容的药物载体中配制的组合物也可以制备、放置在适当的容器中，并标记为治疗指定病症。标签上指明的合适的病症可以包括例如癌症的治疗。
如上所述，本发明特别涵盖了能够结合和调制S100A8蛋白和/或S100A9蛋白的活性的免疫球蛋白或蛋白质性结合分子的诊断、预后和治疗用途。根据本发明人的发现，还提供了鉴别能够预防、抑制、阻止或逆转与炎症相关的病症的化合物的方法。这些方法中的一些是体内或离体方法。某些方法是鉴别相应的肽、拟肽或组合的体外方法。
本说明书中之前发表的文件的列表或讨论不一定看作是承认该文件是现有技术的一部分或是公知常识。
在缺乏未在本文具体公开的任何一个或多个元素、一个或多个限制的情况下，可以适当地实施本文示例性描述的本发明。因此，例如，术语“包括”、“包括”、“含有”等应该在广义上理解且没有限制。单数形式例如“一种”、“一个”或“所述”包括复数指代，除非上下文另外清楚地表明。除非另外表明，在一系列元素之前的术语“至少”应理解为是指在该系列中的每一个元素。术语“至少一个”和“……中的至少一个”包括例如一个、两个、三个、四个或五个或更多个元素。在所指出的范围上下的轻微变动可用于实现基本上相同的结果，如同该范围内的值。并且，除非另外表明，范围的公开意为连续的范围，包括在最小值和最大值之间的每一个值。
此外，本文使用的术语和表述被用作描述性术语且非限制，在使用这些术语和表述时，没有排除显示和描述的特征或其部分的等同物的意思，而是应认识到各种修改均可在发明要求保护的范围内。因此，应理解的是，尽管本发明已经通过示例性实施方案和可选特征进行了具体公开，但是本领域技术人员可以寻求对本文其中体现的发明做出修改和变化，并且这样的修改和变化被认为在本发明的范围内。.
本文已经全面且一般地描述了本发明。落入一般公开内容内的每个较窄种类和亚属分组也形成本发明的部分。这包括本发明的一般描述，其具有从属中移除任何主题的条件或否定限制，无论离体材料是否在本文专门叙述。
其他实施方案在所附权利要求范围内。此外，在本发明的功能或方面以马库什组的方式描述时，本领域技术人员将认识到本发明也由此以马库什组的任何个体成员或成员亚组的形式描述。
为了使本发明可以更易于理解和付诸实际效果，具体的实施方案现在将通过下列非限制性例子的方式进行描述。
实施例
使用本领域已知的标准技术，本发明人表达了个体的人蛋白S100A8和S100A9的重组形式，并纯化了它们。在产生同二聚体和异二聚体之后，他们分析了复合物的性质。图1说明了用指定浓度的(A)重组人S100A8、重组人S100A9或人S100A8/S100A9和(B)重组人S100A8/S100A9、重组人S100A8/S100A9(N69A)或S100A8/S100A9(E78A)对人单核细胞刺激四小时。通过ELISA的方法定量释放到培养基中的TNFα。
尽管同二聚体表现出在单核细胞上激活的性能，S100A8和S100A9的异四聚体复合物并没有显示与各个组分可比较的激活性能(图1)。通过定点诱变的方法，从而防止(S100A8/S100A9)2四聚体的形成，本发明人发现四聚物的形成阻断对结合TLR4重要的某些氨基酸。
在S100A9中的第二钙结合EF手形中的突变特异性氨基酸，即N69和E78，导致四聚体形成的抑制。此外，这种突变导致与同二聚体引起的活化可比较的单核细胞的活化(图1B)。因此，S100A8和S100A9的活性通过它们的低聚状态来控制。
S100A8和S100A9蛋白的表达和纯化。对于不具有另外的肽序列的重组(rec)蛋白的表达，将来自野生型S100A8、野生型S100A9和S100A9EF手形突变体的cDNA克隆到pET11/20载体[50-NdeI；30-BamHI]中。基因产物的表达和分离在大肠杆菌菌株BL21(DE3)中获得。细菌在37℃下在2×YT中生长24小时。之后收获细菌，裂解和制备包涵体(IB)。将IB沉淀溶于8M尿素缓冲液中以建立正确的重折叠，并首先通过添加盐酸将样品调节至pH 2.0-2.5。在室温下孵育60分钟后，将样品分步透析以被调节到pH 7.4以在2mM DTT的存在下重折叠。在离心(10分钟，60,000g，4℃)以沉淀聚集的材料之后，将样品进一步透析，并应用到阴离子交换柱和凝胶过滤层析。为了制备异二聚体复合物，将重组蛋白首先以等摩尔浓度1:1混合。将样品储存在-20℃下作为储备溶液。通过SDS-PAGE、CD光谱、MALDI-MS和ESI-MS评估正确的重折叠和复合物的形成。
在S100制剂中的最大内毒素污染是通过鲎变形细胞裂解物(LAL)测定(BioWhitaker,Walkersville,MD)进行测定，并且低于1pg LPS/μg S100蛋白或无法在不同批次进行检测。此外，在对照实验中，将PolymyxinB(50μg/ml；Sigma)加入到S100A8，以排除由于LPS污染的刺激作用。
单核细胞的制剂和刺激。通过Ficoll-Paque和随后的Percoll密度离心(Pharmacia，Freiburg，德国)，将单核细胞从人血沉棕黄层分离。刺激之前，使用补充有15％胎牛血清的McCoy’s 5a培养基将细胞在聚四氟乙烯袋(Biofolie 25；HeraeusInstruments，Hanau，德国)中培养1天。用不同剂量的hS100A8、hS100A9、hS100A8/S100A9或如附图所示的修饰蛋白，将单核细胞孵育4小时，并且通过ELISA(OptEIA，BD Biosciences，德国)测定上清液中TNF-α的浓度。
细胞因子浓度的测定。通过ELISA(OptEIA，BD Biosciences)测定培养物上清液中细胞因子TNF-α的释放。
使用基于本领域已知的同二聚体、异二聚体和异四聚体的3D结构的计算机辅助方法，本发明人鉴定了S100A9的那些在S100A8和S100A9的同二聚体形式和异二聚体中可以自由接近的氨基酸，但它们在异四聚体形式(S100A8/S100A9)2中是被阻断的。他们发现，涉及位于C端的EF手形中的主要氨基酸，也称为EF手形II(图2A)。随后选择这些氨基酸中为不同时参与钙结合的氨基酸的某些，用于突变研究(图2B)，也就是Uniprot/Swissprot登录号为P06702的人蛋白S100A9(2012年9月5日的版本147，SEQ ID NO：77)的位置的氨基酸。
计算机辅助配体/受体相互作用的研究：从RSCB PDB网站上检索S100A8/A9四聚体(PDB ID：1XK4)、S100A9(PDB ID：1IRJ)和S100A8(PDB id：1MR8)的PDB文件。修改所述S100A8/A9pdb文件，使得它仅包含类似异二聚体的E和G链。使用计算机建模程序如Autodock(3D计算机建模程序)、Pymol和Swiss-PDBviewer分析修饰后的S100A8/A9文件以分析在异二聚体或S100A9同二聚体中是自由的，但埋在四聚体中的氨基酸(界面分析)。我们将分析集中在识别除了不参与Ca++结合和对结合TLR4是空间自由的氨基酸。选择S100A9中的氨基酸(位置64、65、72、73、77和85)用于突变研究。
在氨基酸位置64(谷氨酸)、65(天冬氨酸)、73(谷氨酰胺)和77(谷氨酸)处的突变引起对于S100A9同二聚体也是的功能丧失。在氨基酸位置72(赖氨酸)和85(精氨酸)处的突变几乎没有引起任何影响。用纯化的突变蛋白的这些研究表明，EF手形II实际上负责结合TLR4和TLR4的活化。
在方法上非依赖的并行方法中，用胰蛋白酶部分消化S100A9。所得到的肽片段进行了关于它们仍然活化单核细胞的能力的检查。发现S100A9的一个或多个片段显然仍然能够活化单核细胞，即使不如完整S100A9蛋白分子可检测得更多(图3A)。通过已偶联TLR4/MD2的琼脂糖珠子的方法，分离特定的肽。通过质谱法分析所述特定的肽。鉴定所述肽，其由从S100A9的位置73至85的氨基酸序列组成。所述鉴别的肽非常符合基于计算机的模拟方法的结果和突变研究。
人S100A9同二聚体的胰蛋白酶消化：固定化的TPCK胰蛋白酶(25μl沉降的凝胶，Pierce，Rockford)用于在37℃下消化30μg人S100A9达如附图所示的不同的时间点，并且随后使用树脂分离器将样品离心(5min，400xg)以除去胰蛋白酶珠子。从离心液中取出等份试样，并且通过SDS-PAGE/蛋白质印记分析或刺激人单核细胞4小时。通过ELISA(OptEIA，BDBiosciences，德国)测定受刺激的单核细胞的上清液中的TNF-α浓度。
蛋白质印迹分析：在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离S100A9的胰蛋白酶消化的肽片段，并转移至硝酸纤维素膜(Schleicher和Schuell)。用5％脱脂奶粉封闭膜，并且随后用第一抗体a-S100A9(兔，多克隆，1μg/ml)在4℃下探测过夜。然后，用HRP偶联的第二抗体(山羊抗兔-HPP)检测结合的第一抗体，并用增强化学发光系统(ECL)显色。
免疫沉淀研究以鉴别TLR4/MD2结合肽：将抗-His抗体(5μL，0.5mg/mL,Invivogen)和组氨酸标记的rhTLR4/MD2(5μL，1mg/mL，无载体，R&D SYSTEMS)混合并偶联到蛋白A/G琼脂糖(50μl，Pierce，Thermo Scientific)。在4℃下在存在1mM钙的情况下将S100A9的胰蛋白酶消化的肽添加达3小时。在HBS/1mM钙缓冲液中洗涤珠子三次后，通过添加10mM TRIS/2mM EDTA缓冲液洗脱结合的肽片段，并通过ESI-QIT-和MALDI-TOF-质谱进行分析。执行相同的实验以分析S100A9(aa63-79)、S100A8(aa55-71)的化学合成肽和对应的对照肽aa63-79A5和aa55-71A3的结合。免疫沉淀试验的示意图如图3E所示。
在另一个方法中，关于其与TLR4/MD2的结合，本发明人检查了具有对应于氨基酸位置63-79(即S100A9的完整C端EF手形(MEDLDTNADKQLSFEEF，分子量：2032g/mol))的序列的合成肽。具有S100A9的氨基酸位置63-79(63-795A，分子量：1758g/mol)的序列的肽作为对照，其中四个氨基酸鉴定为对于结合TLR4/MD2最可能是重要的(E64A、D65A、Q73A和E77A，沿用S100A9的命名法)，并且此外氨基酸K72A已替换成丙氨酸。图4A和图4B的比较清楚地表明，只有非突变肽(63-79)才能够结合TLR4/MD2。与此相反，对于具有5个突变氨基酸的肽(63-79A5)，没有检测到结合，即使在Y轴上放大(在1758m/z处的峰)。
在平行的方法中，本发明人使用S100A9的突变体，其包含在可能参与结合TLR4/MD2的区域中的突变。这些S100A9突变体以纯化蛋白质的形式使用，并包含一个或两个突变氨基酸，其中在位置63-79的区域中的一个或两个氨基酸被替换为丙氨酸。如图6B所示，当与非突变蛋白(S100A9野生型)相比时，突变的蛋白S100A9E64A、S100A9D65A、S100A9Q73A和S100A9E77A呈较弱地结合到受体。突变蛋白S100A9K72A和S100A9R85A显示不显著不同于野生型蛋白S100A9的结合(图6B)。当与野生型蛋白相比时，包含在两个位置处的氨基酸交换的S100A9的突变蛋白表现出几乎完全丧失了对受体的结合。这一观察进一步证明S100A9的这个区域和氨基酸E54、D65、Q73和E77对受体相互作用的重要性。
S100A9-野生型和突变蛋白对TLR4/MD2的结合：通过修饰的S100A9-ELISA分析S100A9蛋白对TLR4/MD2的结合。简言之，TLR4/MD2偶联到96孔板的孔中，并作为捕获分子。在通过PBS/5％脱脂奶粉阻断非特异性结合位点之后，将平板洗涤三次。以各自2μg/ml的浓度在存在和不存在100μΜ钙的情况下添加S100A9-野生型或突变S100A9蛋白，在室温下孵育两小时。通过洗涤板三次将未结合的S100A9除去，然后加入第一抗S100A9抗体(1μg/ml，多克隆，兔)。在洗涤步骤之后，添加偶联至HRP(来自Cell Signalling的1μg/ml)的第二抗兔-IgG抗体。TMB用作HRP的底物以通过在ELISA读数器(ANTHOS Mirkosysteme)中在450nm处的吸光度读数来量化结合。
最后，关于其与TLR4/MD2的结合，本发明人分析了合成肽，其具有人S100A8(Uniprot/Swissprot登录号为P05109，2012年9月5日的版本138，SEQ ID NO：78)的位置55-71的氨基酸序列，即完整的C-端EF手形(FKELDINTDGAVNFQEF，分子量：1990g/mol)。再次，具有S100A8的氨基酸位置55-71(55-713A，分子量：1815g/mol)的序列的肽作为对照，其中鉴定为对结合TLR4/MD2、类似于S100A9最可能重要的那些氨基酸被替换为丙氨酸。尽管所述肽的纯度不是最佳的，但是图5A和图5B的比较显示只有非突变肽55-71(图5A)能够结合到TLR4/MD2。然而，对于具有3个突变氨基酸的肽55-71A3，没有检测到结合，即使在Y轴上放大(具有1815m/z的峰)。
总之，这些数据表明C端的钙结合手形，对应于人S100A9的氨基酸位置63-79(MEDLDTNADKQLSFEEF，分子量：2032g/mol)和S100A8的氨基酸位置55-71(FKELDINTDGAVNFQEF，分子量：1990g/mol)，介导相应蛋白与TLR4的相互作用。

Claims (11)

1.一种结合脊椎动物S100A9蛋白或其部分的肽的免疫球蛋白或蛋白质性结合配偶体在制备用于降低以S100A8/S100A9诱导的TLR4信号传导为特征的病症中由同二聚体S100A8或S100A9或异二聚体S100A8/S100A9诱导的TLR4信号传导以及TNFα的释放的药物中的用途，其中所述肽具有对应于(i)从Uniprot/Swissprot登录号为P06702的人蛋白S100A9(SEQID NO：77)的氨基酸位置63至氨基酸位置79的氨基酸序列或(ii)从UniProt/Swissprot登录号为P06702的人蛋白S100A9(SEQ ID NO：77)的氨基酸位置73至氨基酸位置85的氨基酸序列的区域的氨基酸序列，
其中所述氨基酸序列是序列MEDLDTNADKQLSFEEF(SEQ ID NO：1)、MEDLDTNEDKQLSFEEF(SEQ ID NO：14)、MEDLDTNVDKQLSFEEF(SEQ ID NO：15)、MEDLDTNLDKQLSFEEF(SEQ ID NO：16)、MEDLDTNGDKQLNFEEF(SEQ ID NO：17)、LEDLDTNADKQLTFEEF(SEQ ID NO：18)、LEDLDTNVDKQLSFEEF(SEQID NO：19)、LEDLDTNEDKQLSFEEF(SEQ ID NO：20)、MEDLDTNGDKELNFEEF(SEQ ID NO：21)、MEDLDTNEDKELSFEE Y(SEQ ID NO：22)、LEDLDTNGDKQLNFEEF(SEQ ID NO：23)、MEDLDTNQDNQLSFEEC(SEQ ID NO：24)、MEDLDTNLDQQLSFEEL(SEQ ID NO：25)、MQDLDTNQDQQLSFEEV(SEQ ID NO：26)、MEDLDTNQDKQLSFEEF(SEQ ID NO：27)、MQELDTNQ NGQVDFKEF(SEQID NO：28)、FEETDLNKDKELTFEEF(SEQ ID NO：29)、QLSFEEFIMLMAR(SEQ ID NO：3)、QLSFEEFIVLMAR(SEQID NO：30)、QLSFEEFIMLVAR(SEQ ID NO：31)、QLTFEEFIMLMGR(SEQ ID NO：32)、QLSFEEFIMLVIR(SEQ ID NO：33)、QL SFEEFIILVAR(SEQ ID NO：34)、QLSFEELTMLLAR(SEQ IDNO：35)、QL SFEEVIMLF AR(SEQ ID NO：36)、QLSFEEFSILMAK(SEQ ID NO：37)、QLSFEEFSMLVAK(SEQ ID NO：38)、QLSFEECMMLMAK(SEQ ID NO：39)、QLSFEECMMLMGK(SEQ IDNO：40)、ELSFEEYIVLVAK(SEQ ID NO：41)、QLSFEEFVILMAR(SEQ ID NO：42)、QLNFEEFSILVGR(SEQ ID NO：43)和QVDFKEFSMMMAR(SEQ ID NO：44)中的一个，和
其中所述病症选自类风湿性关节炎、青少年特发性关节炎、银屑病关节炎，免疫重建炎症综合征(IRIS)、败血症、全身性炎症反应综合征(SIRS)、肺炎、骨髓炎、自身炎症综合征、高血锌症、全身性炎症、动脉粥样硬化、急性冠状动脉综合征、心肌梗塞、糖尿病、炎症性皮肤病、银屑病、炎症性肠道疾病、血管炎、移植排斥、肾小球肾炎、全身性红斑狼疮、胰腺炎、癌症、皮肌炎和多肌炎、多发性硬化症、过敏、感染、肺部炎症、急性肺损伤(ALI)及其最严重的形式、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。
2.一种结合脊椎动物S100A8蛋白或其部分的肽的免疫球蛋白或蛋白质性结合配偶体在制备用于降低以S100A8/S100A9诱导的TLR4信号传导为特征的病症中由同二聚体S100A8或S100A9或异二聚体S100A8/S100A9诱导的TLR4信号传导以及TNFα的释放的药物中的用途，其中所述肽具有对应于从Uniprot/Swissprot登录号为P05109的人蛋白S100A8(SEQ IDNO：78)的氨基酸位置55至氨基酸位置71的氨基酸序列的区域的氨基酸序列，
其中所述氨基酸序列是序列FKELDINTDGAVNFQEF(SEQ ID NO：5)、FKELDINTDGAINFQEF(SEQ ID NO：45)、FKELDINSDGAINFQEF(SEQ ID NO：46)、FKELDINEDGAVNFQEF(SEQ ID NO：47)、FKELDINKDGAVNFEEF(SEQ ID NO：48)、FKELDINSDGASNFQEF(SEQ ID NO：49)、FKELDVNSDGAINFEEF(SEQ ID NO：50)、FKQFDINEDGAVNFQEF(SEQ ID NO：51)、FRQLDINEDGAVNFQEF(SEQ ID NO：52)、FKELDINQDNAVNFEEF(SEQ ID NO：53)、FNELDINSDNAINFQEF(SEQ ID NO：54)、FKELDINQDGGINFEEF(SEQ ID NO：55)、FKELDVNSDSAINFEEF(SEQ ID NO：56)、FKELDVNSDNAINFEEF(SEQ ID NO：57)、FQELDVNSDGAINFEEF(SEQ ID NO：58)，FRELDINSDNAINFEEF(SEQ ID NO：59)、FKELDFTADGAINFEEF(SEQ ID NO：60)、FKELDINQDGGINLEEF(SEQ ID NO：61)、FKELDINQDGFINFEEF(SEQ ID NO：62)和FKELDSNKDQQINFEEF(SEQ ID NO：63)中的一个，和
其中所述病症选自类风湿性关节炎、青少年特发性关节炎、银屑病关节炎，免疫重建炎症综合征(IRIS)、败血症、全身性炎症反应综合征(SIRS)、肺炎、骨髓炎、自身炎症综合征、高血锌症、全身性炎症、动脉粥样硬化、急性冠状动脉综合征、心肌梗塞、糖尿病、炎症性皮肤病、银屑病、炎症性肠道疾病、血管炎、移植排斥、肾小球肾炎、全身性红斑狼疮、胰腺炎、癌症、皮肌炎和多肌炎、多发性硬化症、过敏、感染、肺部炎症、急性肺损伤(ALI)及其最严重的形式、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。
3.一种或多种权利要求1所述的免疫球蛋白或蛋白质性结合配偶体和权利要求2所述的免疫球蛋白或蛋白质性结合配偶体的组合在制备用于降低以S100A8/S100A9诱导的TLR4信号传导为特征的病症中由同二聚体S100A8或S100A9或异二聚体S100A8/S100A9诱导的TLR4信号传导以及TNFα的释放的药物中的用途，
其中所述病症选自类风湿性关节炎、青少年特发性关节炎、银屑病关节炎，免疫重建炎症综合征(IRIS)、败血症、全身性炎症反应综合征(SIRS)、肺炎、骨髓炎、自身炎症综合征、高血锌症、全身性炎症、动脉粥样硬化、急性冠状动脉综合征、心肌梗塞、糖尿病、炎症性皮肤病、银屑病、炎症性肠道疾病、血管炎、移植排斥、肾小球肾炎、全身性红斑狼疮、胰腺炎、癌症、皮肌炎和多肌炎、多发性硬化症、过敏、感染、肺部炎症、急性肺损伤(ALI)及其最严重的形式、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。
4.根据权利要求3所述的用途，其中所述组合包含在单一的免疫球蛋白或蛋白质性结合配偶体中，所述免疫球蛋白或蛋白质性结合配偶体具有至少双结合特异性。
5.一种包含选自SEQ ID NOs1、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28和29的序列的分离肽或拟肽在制备用于降低以S100A8/S100A9诱导的TLR4信号传导为特征的病症中由同二聚体S100A8/S100A9或异二聚体S100A8/A9诱导的TLR4信号传导以及TNFα的释放的药物中的用途，
其中所述病症选自类风湿性关节炎、青少年特发性关节炎、银屑病关节炎，免疫重建炎症综合征(IRIS)、败血症、全身性炎症反应综合征(SIRS)、肺炎、骨髓炎、自身炎症综合征、高血锌症、全身性炎症、动脉粥样硬化、急性冠状动脉综合征、心肌梗塞、糖尿病、炎症性皮肤病、银屑病、炎症性肠道疾病、血管炎、移植排斥、肾小球肾炎、全身性红斑狼疮、胰腺炎、癌症、皮肌炎和多肌炎、多发性硬化症、过敏、感染、肺部炎症、急性肺损伤(ALI)及其最严重的形式、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。
6.一种包含选自SEQ ID NOs3、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43和44的序列的分离肽或拟肽在制备用于降低以S100A8/S100A9诱导的TLR4信号传导为特征的病症中由同二聚体S100A8/S100A9或异二聚体S100A8/A9诱导的TLR4信号传导以及TNFα的释放的药物中的用途，
其中所述病症选自类风湿性关节炎、青少年特发性关节炎、银屑病关节炎，免疫重建炎症综合征(IRIS)、败血症、全身性炎症反应综合征(SIRS)、肺炎、骨髓炎、自身炎症综合征、高血锌症、全身性炎症、动脉粥样硬化、急性冠状动脉综合征、心肌梗塞、糖尿病、炎症性皮肤病、银屑病、炎症性肠道疾病、血管炎、移植排斥、肾小球肾炎、全身性红斑狼疮、胰腺炎、癌症、皮肌炎和多肌炎、多发性硬化症、过敏、感染、肺部炎症、急性肺损伤(ALI)及其最严重的形式、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。
7.一种包含选自SEQ ID NOs5、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62和63的序列的分离肽或拟肽在制备用于降低以S100A8/S100A9诱导的TLR4信号传导为特征的病症中由同二聚体S100A8/S100A9或异二聚体S100A8/A9诱导的TLR4信号传导以及TNFα的释放的药物中的用途，
其中所述病症选自类风湿性关节炎、青少年特发性关节炎、银屑病关节炎，免疫重建炎症综合征(IRIS)、败血症、全身性炎症反应综合征(SIRS)、肺炎、骨髓炎、自身炎症综合征、高血锌症、全身性炎症、动脉粥样硬化、急性冠状动脉综合征、心肌梗塞、糖尿病、炎症性皮肤病、银屑病、炎症性肠道疾病、血管炎、移植排斥、肾小球肾炎、全身性红斑狼疮、胰腺炎、癌症、皮肌炎和多肌炎、多发性硬化症、过敏、感染、肺部炎症、急性肺损伤(ALI)及其最严重的形式、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。
8.权利要求5所述的分离肽或拟肽或者权利要求6所述的分离肽或拟肽和权利要求7所述的分离肽或拟肽的组合在制备用于降低以S100A8/S100A9诱导的TLR4信号传导为特征的病症中由同二聚体S100A8/S100A9或异二聚体S100A8/A9诱导的TLR4信号传导以及TNFα的释放的药物中的用途，
其中所述病症选自类风湿性关节炎、青少年特发性关节炎、银屑病关节炎，免疫重建炎症综合征(IRIS)、败血症、全身性炎症反应综合征(SIRS)、肺炎、骨髓炎、自身炎症综合征、高血锌症、全身性炎症、动脉粥样硬化、急性冠状动脉综合征、心肌梗塞、糖尿病、炎症性皮肤病、银屑病、炎症性肠道疾病、血管炎、移植排斥、肾小球肾炎、全身性红斑狼疮、胰腺炎、癌症、皮肌炎和多肌炎、多发性硬化症、过敏、感染、肺部炎症、急性肺损伤(ALI)及其最严重的形式、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。
9.根据权利要求8所述的用途，其中权利要求5或6所述的肽和权利要求7所述的肽包含在单一的肽链中。
10.根据权利要求1所述的免疫球蛋白或蛋白质性结合配偶体和/或根据权利要求2所述的免疫球蛋白或蛋白质性结合配偶体在制备用于诊断以S100A8/S100A9诱导的TLR4信号传导为特征的病症的组合物中的用途，
其中所述病症选自类风湿性关节炎、青少年特发性关节炎、银屑病关节炎，免疫重建炎症综合征(IRIS)、败血症、全身性炎症反应综合征(SIRS)、肺炎、骨髓炎、自身炎症综合征、高血锌症、全身性炎症、动脉粥样硬化、急性冠状动脉综合征、心肌梗塞、糖尿病、炎症性皮肤病、银屑病、炎症性肠道疾病、血管炎、移植排斥、肾小球肾炎、全身性红斑狼疮、胰腺炎、癌症、皮肌炎和多肌炎、多发性硬化症、过敏、感染、肺部炎症、急性肺损伤(ALI)及其最严重的形式、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。
11.根据权利要求10所述的用途，其中所述用途包括分子成像技术。
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