DE102020130954A1

DE102020130954A1 - Markierungspartikel für Raman-Streuung und/oder Fluoreszenz-Strahlung

Info

Publication number: DE102020130954A1
Application number: DE102020130954.6A
Authority: DE
Inventors: Sebastian Schlücker
Original assignee: Universitaet Duisburg Essen
Current assignee: Universitaet Duisburg Essen
Priority date: 2020-11-23
Filing date: 2020-11-23
Publication date: 2022-05-25

Abstract

Die Erfindung betrifft Markierungspartikel für Raman-Streuung und/oder Fluoreszenz-Strahlung umfassend ein Edelmetallnanopartikel und ein Farbstoffmolekül, wobei das Edelmetallnanopartikel eine Plasmonbande im NIR-Bereich umfasst, das Farbstoffmolekül eine Fluoreszenzemissionsbande im NIR-Bereich umfasst, das Farbstoffmolekül eine Isothiocyanat-Gruppe aufweist und/oder kovalent an eine Isothiocyanat-Gruppe gebunden ist, und das Farbstoffmolekül an das Edelmetallnanopartikel gebunden ist.Weiterhin betrifft die Erfindung ein Konjugat umfassend das obige Markierungspartikel und einen zur Bindung an einen Zielanalyten spezifischen Rezeptor, wobei der Rezeptor an das Markierungspartikel gebunden ist.Ferner betrifft die Erfindung einen Lateralflusstest (10) zum Nachweis eines Zielanalyten in einer Probe (14) umfassend das obige Konjugat.Ferner betrifft die Erfindung die Verwendung des obigen Markierungspartikels und/oder des obigen Konjugates zum Nachweis eines Zielanalyten in einer Probe (14).

Description

Die Erfindung betrifft ein Markierungspartikel für Raman-Streuung und/oder Fluoreszenz-Strahlung.
Weiterhin betrifft die Erfindung ein Konjugat umfassend das obige Markierungspartikel und einen zur Bindung an einen Zielanalyten spezifischen Rezeptor.
Ferner betrifft die Erfindung einen Lateralflusstest zum Nachweis eines Zielanalyten in einer Probe umfassend das obige Konjugat.
Ferner betrifft die Erfindung die Verwendung des obigen Markierungspartikels und/oder des obigen Konjugates zum Nachweis eines Zielanalyten in einer Probe.
Lateralflusstests (LFAs, englisch: lateral flow assays) sind weit verbreitete Schnelltests bei der Vor-Ort-Diagnostik, da sie einfach zu handhaben sowie robust sind. LFAs dienen dem qualitativen Nachweis eines Zielanalyten in einer Probe, wobei der LFA auf einer Kombination aus einer Dünnschichtchromatographie und einer spezifischen Bindungsreaktion des Zielanalyten an einen zielanalytspezifischen Rezeptor beruht. Ein bekanntes Beispiel für einen teststreifenbasierten LFA ist der Schwangerschaftstest.
In der Regel wird bei einem LFA die zu untersuchende Probe auf einen Probenbereich des LFA aufgetragen. Die Probe beginnt nach dem Prinzip der Dünnschichtchromatographie, eventuell nach Zugabe eines Laufmittels, mit der Ausbreitung über den Teststreifen aufgrund von Kapillarkräften. Derart wandert die Probe zu einem Bereich, wo sich getrocknete Konjugate befinden, die einen für den Zielanalyten spezifischen Rezeptor aufweisen. Nach Auflösung der getrockneten Konjugate durch die flüssige Probe und bei Vorhandensein des Zielanalyten in der Probe, bindet der Zielanalyt an den Rezeptor des Konjugates und bildet einen Zielanalyt-Konjugat-Komplex. Der Zielanalyt ist durch die Bindung mit dem Konjugat markiert. Die Flüssigkeit und mit ihr der Zielanalyt-Konjugat-Komplex wandern weiter in einen Kapillarbereich des LFA, wo in einem kleinen Abschnitt ein weiterer zielanalytspezifischer Rezeptor auf dem Teststreifen immobilisiert ist. Der immobilisierte Rezeptor bindet in der Regel an einer anderen Stelle auf der Oberfläche des Zielanalyten als der Rezeptor des Konjugates. Somit wird durch die Bindung des immobilisierten Rezeptors an den Zielanalyten der gesamte Zielanalyt-Konjugat-Komplex im Kapillarbereich des LFAs immobilisiert und reichert sich aufgrund des Fließverhaltens der Probe im Kapillarbereich des LFAs an. Durch diese Anreicherung des Zielanalyt-Konjugat-Komplexes im Kapillarbereich entsteht im Kapillarbereich eine Färbung, eine Fluoreszenzfärbung und/oder eine Markierung, die optisch und/oder mittels spektroskopischer Methoden ausgelesen werden kann. Beispielsweise werden als Konjugate im Schwangerschaftstest Goldnanopartikel-Antikörper-Konjugate verwendet, wobei die Goldnanopartikel als Markierungspartikel für die charakteristische rote Färbung im Kapillarbereich des LSAs bei positivem Schnelltest verantwortlich sind.
Herkömmliche LFAs haben eine Nachweisgrenze für den Zielanalyten von etwa 10 ng/mL. Wird somit in einem Stadium, in dem die Zielanalytenkonzentration unter der Nachweisgrenze liegt, beispielsweise in den ersten Wochen einer Schwangerschaft, versucht mittels herkömmlicher LFAs den Zielanalyten nachzuweisen, kann dies zu einem falsch negativen Testergebnis führen.
Insbesondere zum Nachweis von Antikörpern von Infektionskrankheiten, die schon in einem frühen Stadium hochansteckend sind, ist die Nachweisgrenze von herkömmlichen LFAs problematisch, da viele potentiell hochansteckende Patienten durch den LFA nicht erkannt werden können.
Demnach besteht Bedarf an LFAs, die schon sehr geringe Konzentrationen des Zielanalyten in der Probe nachweisen können.
Die Druckschrift Angew. Chem. Int. Ed. 2019, 58, 442 - 446 beschreibt ein tragbares Raman/SERS-LFA-Lesegerät mit Linienbeleuchtung zum quantitativen und sensitiven Nachweis des Schwangerschaftshormons hCG, wobei die Methode, die auf der oberflächenverstärkten Raman-Streuung (SERS, englisch: surface-enhanced Raman scattering) im Nahinfrarotbereich (NIR-Bereich) basiert, etwa 15-mal empfindlicher ist als konventionelle LFAs.
Davon ausgehend ist es die Aufgabe der Erfindung, die Nachweisgrenze von LFAs zu verringern. Insbesondere sollen Mittel zur Verfügung gestellt werden, die einen Nachweis des Zielanalyten schon bei sehr geringen Konzentrationen, bevorzugt im pg/mL- bis fg/mL-Bereich, ermöglichen.
Diese Aufgabe wird durch den Gegenstand der unabhängigen Ansprüche gelöst. Bevorzugte Weiterbildungen finden sich in den Unteransprüchen.
Erfindungsgemäß wird ein Markierungspartikel für Raman-Streuung und/oder Fluoreszenz-Strahlung umfassend ein Edelmetallnanopartikel und ein Farbstoffmolekül bereitgestellt, wobei das Edelmetallnanopartikel eine Plasmonbande im NIR-Bereich umfasst, das Farbstoffmolekül eine Fluoreszenzemissionsbande im NIR-Bereich umfasst, wobei das Farbstoffmolekül eine Isothiocyanat-Gruppe aufweist und/oder kovalent an eine Isothiocyanat-Gruppe gebunden ist, und wobei das Farbstoffmolekül an das Edelmetallnanopartikel gebunden ist.
Weiterhin wird erfindungsgemäß ein Konjugat bereitgestellt umfassend das obige Markierungspartikel und einen zur Bindung an den Zielanalyten spezifischen Rezeptor, wobei der Rezeptor an das Markierungspartikel gebunden ist.
Ferner wird erfindungsgemäß ein Lateralflusstest (LFA, englisch: lateral flow assay) zum Nachweis des Zielanalyten in der Probe umfassend das obige Konjugat bereitgestellt.
Der Kern der vorliegenden Erfindung ist, die Nachweisgrenze für den Zielanalyten in der Probe zu senken, indem ein Markierungspartikel zur Verfügung gestellt wird, das nach Anregung, bevorzugt nach optischer Anregung im NIR-Bereich, ein besonders intensives Raman-Signal und/oder Fluoreszenz-Signal abgibt. Unter NIR-Bereich wird im Sinne der Erfindung ein Bereich im elektromagnetischen Spektrum von 720 nm bis 1500 nm verstanden. Bei LFAs ist die Verwendung von NIR-Laseranregung - beispielsweise bei 785 nm - vorteilhaft, da viele Nitrozellulosemembranen, die bei LFAs Verwendung finden, eine störende Autofluoreszenz bei Laseranregung im sichtbaren Bereich - beispielsweise bei 532 nm oder 633 nm - aufweisen. Diese Autofluoreszenz kann bei Anregung im NIR-Bereich verringert werden.
Als Raman-Streuung wird die unelastische Streuung von Licht an Materie bezeichnet. Durch die unelastische Wechselwirkung des Lichtes mit der Materie findet eine Energieübertragung statt, wodurch das gestreute Licht eine höhere Energie (Anti-Stokes-Streuung) oder eine niedrigere Energie (Stokes-Streuung) als das einfallende Licht aufweist, wobei der Energieunterschied spezifisch für das streuende Atom bzw. Molekül ist.
Als Fluoreszenz-Strahlung wird die spontane Emission von Licht bezeichnet, die ein Molekül kurz nach Anregung bei einem spinerlaubten energetischem Übergang zwischen zwei elektronischen Zuständen abgibt.
Ohne an eine spezifische Theorie gebunden zu sein, werden die besonders intensiven Raman- und Fluoreszenz-Signale, die vom Markierungspartikel abgegeben werden, auf die räumliche und elektronische Struktur des Markierungspartikels zurückgeführt, wodurch eine Kombination zweier Signalverstärkungs-Effekte, nämlich der Effekt der oberflächenverstärkten Resonanz-Raman-Streuung (SERRS, englisch: surface enhanced resonance Raman scattering) und der Effekt der oberflächenverstärkten Fluoreszenz (SEF, englisch: surface-enhancedfluorescene) erreicht wird. In anderen Worten handelt es sich also beim Markierungspartikel bevorzugt um ein Markierungspartikel für die oberflächenverstärkte Resonanz-Raman-Streuung (SERRS) und Fluoreszenz (SEF) durch resonante Anregung im NIR-Bereich.
Das Farbstoffmolekül ist an das Edelmetallnanopartikel gebunden. Das Edelmetallnanopartikel mit der Plasmonbande im NIR-Bereich kann durch Strahlung im NIR-Bereich resonant angeregt werden (LSPR, englisch: localized surface plasmon resonance). Ohne an eine spezifische Theorie gebunden zu sein wird vermutet, dass diese resonante optische Anregung zu einer starken Erhöhung des lokalen elektrischen Feldes auf und in der Nähe der Oberfläche des Edelmetallnanopartikels führt. Resonante optische Anregung bedeutet in diesem Zusammenhang, dass, bevorzugt mittels eines Lasers, in eine elektronische Absorptionsbande des Farbstoffmoleküls eingestrahlt wird, und derart der für die Fluoreszenz-Emission benötigte elektronischen Übergang angeregt wird. Die Erhöhung des lokalen elektrischen Feldes des Edelmetallnanopartikels wiederum führt zu einer signifikanten elektromagnetischen Verstärkung des Raman- und/oder Fluoreszenz-Signals des Farbstoffmoleküls (SERRS und SEF). Zusätzlich oder alternativ zu diesem vermuteten elektromagnetischen Verstärkungsmechanismus, kann auch insbesondere für SERRS ein chemischer Verstärkungsmechanismus, bei dem ein Ladungstransfer vom Edelmetallnanopartikel zum Farbstoffmolekül und/oder umgekehrt stattfindet, zu einer Signalverstärkung führen.
Somit lässt sich durch das Markierungspartikel die Nachweisempfindlichkeit für den Zielanalyten in der Probe um mehrere Größenordnungen in den pg/mL-Bereich und bis in den fg/mL-Bereich verschieben. Zu diesem Zweck sieht der zweite Aspekt der Erfindung das Konjugat umfassend das Markierungspartikel und den zur Bindung an den Zielanalyten spezifischen Rezeptor vor, wobei der Rezeptor an das Markierungspartikel gebunden ist. Das Konjugat ermöglicht somit, bevorzugt bei Verwendung in einem LFA, den Zielanalyten in der Probe schon bei sehr geringen Konzentrationen nachzuweisen. Bevorzugt wird der Zielanalyt mittels Raman-Spektroskopie und/oder Fluoreszenz-Spektroskopie nachgewiesen. Das Markierungspartikel und/oder das Konjugat eignen sich somit auch besonders für die Verwendung in dem Lateralflusstest.
Unter dem Markierungspartikel für Raman-Streuung und/oder Fluoreszenz-Strahlung wird vorliegend also ein mehratomiges Teilchen verstanden, das bevorzugt nach optischer Anregung im NIR-Bereich Raman-Signale und/oder Fluoreszenz-Signale zeigt.
Unter der Plasmonbande des Edelmetallnanopartikels ist eine optische Bande im Extinktionsspektrum des Edelmetallnanopartikels zu verstehen, die aufgrund der LSPR-Anregung zustande kommt. Das Extinktionsspektrum setzt sich aus der optischen Absorption und der Streuung zusammen. Vereinfacht dargestellt, lässt sich die Plasmonenschwingung als Schwingung der Elektronen im Leitungsband des Edelmetallnanopartikels relativ zu den positiv geladenen Edelmetallkernen im Metallgitter auffassen.
Unter einem Edelmetallnanopartikel ist bevorzugt ein Nanopartikel zu verstehen, das aus einem Edelmetall ist. Das Edelmetallnanopartikel ist bevorzugt in einer Dimension nicht größer als 400 nm.
Unter einem Farbstoffmolekül mit einer Fluoreszenzemissionsbande im NIR-Bereich wird bevorzugt ein organisches Molekül verstanden, das eine Fluoreszenzemission im NIR-Bereich, bevorzugt zwischen 720 nm bis 1500 nm, aufweist. Bevorzugt liegt das spektrale Maximum der Fluoreszenzemission des Farbstoffmoleküls zwischen 720 nm und 1500 nm.
Das Farbstoffmolekül weist eine Isothiocyanat-Gruppe auf und/oder ist kovalent an eine Isothiocyanat-Gruppe gebunden. Unter einer Isothiocyanat-Gruppe wird die funktionelle Gruppe mit der Struktur -N=C=S verstanden. Das exponierte Schwefelatom der Isothiocyanat-Gruppe ermöglicht bevorzugt die Bindung des Farbstoffmoleküls an das Edelmetallnanopartikel.
Die Intensität von Raman-Streuung ist aufgrund der Natur der unelastischen Streuung grundsätzlich gering. Es sind aber unterschiedliche Effekte bekannt, die die Intensität des Raman Signals verstärken: Einer dieser Effekte basiert auf der Resonanz-Raman-Streuung (RRS, englisch: resonance Raman scattering). Dabei wird eine Anregungswellenlänge derart gewählt, dass sie auch der Wellenlänge eines elektronischen Übergangs des zu untersuchenden Moleküls entspricht. Dies führt zu einem Intensitätsanstieg des Raman-Signals. Ein weiterer Effekt, der gegenüber dem klassischen Raman-Signal zu intensiveren Raman-Signalen führt, basiert auf der oberflächenverstärkten Raman-Streuung (SERS, englisch: surface enhanced Raman scattering). Dieser Oberflächenverstärkungsmechanismus kann dann beobachtet werden, wenn das zu untersuchende Molekül an kolloidalen Metallpartikeln oder an Metalloberflächen adsorbiert ist. Ein weiterer Fall tritt auf, wenn der Oberflächenverstärkungsmechanismus des SERS-Effekts und die Resonanz-Raman-Verstärkung (RRS) zusammentreffen. Dies wird als SERRS-Effekt (englisch: surface enhanced resonance Raman scattering) bezeichnet, wobei dieser beobachtbar ist, wenn das zu untersuchende Molekül in der Nähe einer plasmonisch aktiven Metallnanostruktur in Resonanz mit einem elektronischen Übergang angeregt wird. Ähnlich wie beim SERS-Effekt die Intensität der Raman-Streuung durch Absorption des zu untersuchenden Moleküls an kolloidalen Metallpartikeln oder an Metalloberflächen verstärkt werden kann, kann auch die Fluoreszenz-Emission des zu untersuchenden Moleküls durch räumliche Nähe zu einem kolloidalen Metallpartikel oder einer Metalloberfläche verstärkt werden. Dieser Effekt wird als oberflächenverstärkte Fluoreszenz (SEF, englisch: surface-enhanced fluorescene) bezeichnet.
Somit handelt es sich in anderen Worten beim Markierungspartikel bevorzugt um ein Markierungspartikel für oberflächenverstärkte Resonanz-Raman-Streuung im NIR-Bereich und oberflächenverstärkte Fluoreszenz-Strahlung im NIR-Bereich.
Wie bereits erwähnt weist das Farbstoffmolekül eine Isothiocyanat-Gruppe auf und/oder ist kovalent an eine Isothiocyanat-Gruppe gebunden. Hinsichtlich der Bindung des Farbstoffmoleküls an das Edelmetallnanopartikels ist weiter bevorzugt vorgesehen, dass das Farbstoffmolekül über die Isothiocyanat-Gruppe an das Edelmetallnanopartikel gebunden ist. Bevorzugt ist das Farbstoffmolekül durch eine Schwefelbindung an das Edelmetallnanopartikel gebunden.
Weiter bevorzugt ist vorgesehen, dass das Farbstoffmolekül über die Isothiocyanat-Gruppe an eine Oberfläche des Edelmetallnanopartikels gebunden ist. Derart sorgt die Isothiocyanat-Gruppe für einen räumlichen Abstand und eine geometrische Orientierung des Farbstoffmoleküls zum Edelmetallnanopartikel, der ermöglicht, dass das Signal des Markierungspartikels bei resonanter optischer Anregung simultan durch den SERRS-Effekt und den SEF-Effekt verstärkt wird. Dadurch wird eine besonders hohe Intensitätsverstärkung des Signals erreicht, und zwar sowohl für das Raman- als auch für das Fluoreszenz-Signal.
Gemäß einer bevorzugten Weiterbildung der Erfindung ist vorgesehen, dass ein Abstand des Farbstoffmoleküls zum Edelmetallnanopartikel zwischen 0,1 und 10 nm beträgt. Bevorzugt bezieht sich der Abstand auf einen kürzesten Abstand von einem Masseschwerpunkt des Farbstoffmoleküls zu einer Oberfläche des Edelmetallnanopartikels. Es hat sich gezeigt, dass ein Abstand zwischen 0,5 und 2 nm zu besonders intensiven Raman- und/oder Fluoreszenz-Signalen des Markierungspartikels führt. Es wird vermutet, dass der vorliegende Abstand dazu führt, dass das Markierungspartikel bei resonanter optischer Anregung im NIR-Bereich ein oberflächenverstärktes Resonanz-Raman-Signal (SERRS) und/oder ein oberflächenverstärktes Fluoreszenz-Signal (SEF) zeigt.
Gemäß einer bevorzugten Weiterbildung der Erfindung ist in diesem Zusammenhang vorgesehen, dass die Fluoreszenzemissionsbande des Farbstoffmoleküls und die Plasmonbande des Edelmetallnanopartikels einander spektral überlappen und/oder ein spektrales Maximum der Fluoreszenzemissionsbande nicht mehr als 200 nm von einem spektralen Maximum der Plasmonbande entfernt ist. Unter spektralem Überlappen wird vorliegend verstanden, dass Wellenlängenbereiche existieren, bei denen sowohl das Farbstoffmolekül eine - wenn auch geringe - Fluoreszenzemission zeigt, wie auch das Edelmetallnanopartikel eine - wenn auch geringe - Extinktion in der Plasmonbande. Das spektrale Überlappen der Fluoreszenzemissionsbande des Farbstoffmoleküls und der Plasmonbande des Edelmetallnanopartikels sorgt dafür, dass das Markierungspartikel resonant angeregt werden kann und es somit zu einem besonders intensiven Raman- und/oder Fluoreszenz-Signal kommt. Besonders bevorzugt ist in diesem Zusammenhang vorgesehen, dass das spektrale Maximum der Fluoreszenzemissionsbande des Farbstoffmoleküls nicht mehr als 200 nm von einem spektralen Maximum der Plasmonbande entfernt ist. Derart ist einfach sichergestellt, dass sich die Fluoreszenzbande und die Plasmonbande spektral überlappen.
Gemäß einer bevorzugten Weiterbildung der Erfindung umfasst das Markierungspartikel eine Vielzahl an Farbstoffmolekülen. Weiter bevorzugt ist vorgesehen, dass die Vielzahl an Farbstoffmolekülen jeweils über die Isothiocyanat-Gruppe an das Edelmetallnanopartikel gebunden sind. Derart kann ein Markierungspartikel bereitgestellt werden, das bei Anregung besonders intensive Raman- und/oder Fluoreszenz-Signale liefert. Weiter bevorzugt sind die Vielzahl an Farbstoffmoleküle an die Oberfläche des Edelmetallnanopartikels gebunden.
Grundsätzlich können unterschiedliche Farbstoffmoleküle mit einer Fluoreszenzemissionsbande im NIR-Bereich verwendet werden, solange das Farbstoffmolekül eine Isothiocyanat-Gruppe aufweist und/oder kovalent an eine Isothiocyanat-Gruppe gebunden ist. Gemäß einer bevorzugten Weiterbildung der Erfindung ist vorgesehen, dass das Farbstoffmolekül ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Indol-Farbstoffe, Polymethin-Farbstoffe, Cyanin-Farbstoffe, Squarain-Farbstoffe, Phthalocyanin-Farbstoffe, Porphyrin-Farbstoffe, Rhodamin-Farbstoffe, Coumarin-Farbstoffe, Xanthen-Farbstoffe, siliziumsubstituierte Xanthen-Farbstoffe, Phenoxazin-Farbstoffe insbesondere Benzophenoxazine, Naphthalindiimide, Tetracyanochinodimethan-Farbstoffe, zwitterionische Farbstoffe, Dicyanomethylen-4H-chromen, 2-Dicyanomethylen-3-cyano-4,5,5-trimethyl-2,5-dihydrofuran, Spirobenzopyran, NIR ESIPT-Farbstoffe, Bordipyrromethane und AIE-Luminogene.
Bezüglich der Indol-Farbstoffe ist besonders bevorzugt vorgesehen, dass das Farbstoffmolekül ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend die folgenden in Tabelle 1 dargestellten Farbstoffmoleküle: Tabelle 1: Name, CAS- Nummer und Strukturformel der bevorzugten Farbstoffmoleküle.

Name CAS-Nummer Strukturformel

NIR 5e 162411-31-6

NIR 4f 162411-24-7

NIR 797 Isothiocyanat 152111-91-6
In Bezug zum Farbstoffmolekül ist gemäß einer weiteren bevorzugten Weiterbildung der Erfindung vorgesehen, dass das Farbstoffmolekül wenigstens zwei Isothiocyanat-Gruppen umfasst und/oder kovalent an wenigstens zwei Isothiocyanat-Gruppen gebunden ist. Es hat sich gezeigt, dass Markierungspartikel umfassend Farbstoffmoleküle, die zwei Isothiocyanat-Gruppen aufweisen und/oder die kovalent an zwei Isothiocyanat-Gruppen gebunden sind, höhere Signalintensitäten zeigen, als Markierungspartikel umfassend Farbstoffmoleküle, die lediglich eine Isothiocyanat-Gruppe aufweisen.
In diesem Zusammenhang ist weiterhin bevorzugt vorgesehen, dass das Farbstoffmolekül keine Sulfonsäure-Gruppen aufweist und/oder nicht kovalent an Sulfonsäure-Gruppen gebunden ist. Es wird vermutet, dass Sulfonsäure-Gruppen am Farbstoffmolekül dazu führen, dass das Farbstoffmolekül eine höhere Löslichkeit in Wasser aufweist, sich von der Oberfläche des Edelmetallnanopartikel leichter ablöst und derart die Anzahl Farbstoffmoleküle auf der Oberfläche des Edelmetallnanopartikels verringert wird. Dies führt zu einer Verringerung der Signalintensität des Markierungspartikel sowie der Stabilität des Markierungspartikels.
In Zusammenhang mit dem Edelmetallnanopartikel ist gemäß einer bevorzugten Weiterbildung der Erfindung vorgesehen, dass das Edelmetallnanopartikel ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Nanopartikel aus Gold, Silber, Goldlegierungen, Silberlegierungen und bimetallische Edelmetallnanopartikel aus Gold, Silber, Goldlegierungen und Silberlegierungen; und/oder wobei das Edelmetallnanopartikel ausgewählt ist aus der Gruppe anisotroper Nanopartikel umfassend Nanostäbchen, Nanowürfel und Nanosterne.
In anderen Worten, ist bevorzugt vorgesehen, dass das Edelmetall des Edelmetallnanopartikels Gold, Silber sowie Legierungen davon ist. Diese Materialien haben den Vorteil, dass besonders einfach sichergestellt werden kann, dass das Edelmetallnanopartikel eine Plasmonbande im NIR-Bereich aufweist. Grundsätzlich ist es möglich, dass das Nanopartikel vollständig aus Gold, Silber, einer Goldlegierung und/oder Silberlegierung besteht. Alternativ kann es sich um eine bimetallisches Edelmetallnanopartikel handeln, das aus zwei unterschiedlichen Materialien besteht. Beispielsweise kann das bimetallische Edelmetallnanopartikel einen Kern aus Silber und einen Mantel aus Gold aufweisen.
Hinsichtlich der Form des Edelmetallnanopartikels ist bevorzugt vorgesehen, dass es sich nicht um ein sphärisches Nanopartikel handelt, sondern um ein anisotropes Nanopartikel, das nicht in alle Raumrichtung die gleiche Ausdehnung aufweist. Bevorzugt ist das anisotrope Nanopartikel ausgewählt aus der Gruppe umfassend Nanostäbchen, Nanowürfel und Nanosterne. Diese Formen haben den Vorteil, dass sich bei resonanter Anregung des Markierungspartikels ein besonders hoher SERS/SERRS-Effekt einstellt, da an den Spitzen sowie den Kanten dieser Formen besonders hohe Feldüberhöhungen auftreten.
Ein Nanostern ist bevorzugt ein Nanopartikel, das unter dem Transmissionselektronenmikroskop (TEM) eine sternförmige Form aufweist. Nanosterne haben gegenüber sphärischen Nanopartikeln den Vorteil, dass sie einen besonders hohen SERS/SERRS-Effekt bewirken. In Zusammenhang mit dem Nanostern ist gemäß einer weiteren bevorzugten Weiterbildung vorgesehen, dass der Nanostern einen sphärischen Kern und mehrere Arme umfasst. Die Form des Nanostems beeinflusst die Lage der Plasmonbande des Nanosterns. Bevorzugt sind die Arme regelmäßig um den sphärischen Kern angeordnet.
In dieser Hinsicht ist gemäß einer weiteren bevorzugten Weiterbildung der Erfindung vorgesehen, dass der sphärische Kern einen Durchmesser zwischen 20 und 200 nm aufweist und/oder die Arme eine Länge zwischen 5 und 100 nm. Die Länge der Arme wird bevorzugt von einer Spitze des Armes radial bis zur Oberfläche des sphärischen Kerns bestimmt.
Weiterhin kann bevorzugt vorgesehen sein, dass das Edelmetallnanopartikel des Markierungspartikels eine Hülle umfasst. Bevorzugt stabilisiert die Hülle die Bindung des Farbstoffmoleküls an die Oberfläche des Edelmetallnanopartikels. Bevorzugt umfasst die Hülle Polyethylenglykol (PEG) und/oder Polyelektrolyte, weiter bevorzugt thioliertes PEG mit Carbonsäuregruppen (HS-PEG-COOH). Weiter bevorzugt ist vorgesehen, dass die Hülle zusammen mit dem Farbstoffmolekül auf der Oberfläche des Edelmetallpartikels co-adsorbiert wird.
Wie bereits erwähnt, ist ein weiterer Aspekt der Erfindung das Konjugat umfassend das Markierungspartikel und den Rezeptor, wobei der Rezeptor an das Markierungspartikel gebunden ist.
In anderen Worten betrifft die Erfindung also weiterhin das Konjugat, wobei das Konjugat das Markierungspartikel für Raman-Streuung und/oder Fluoreszenz-Strahlung und den zur Bindung an den Zielanalyten spezifischen Rezeptor umfasst, wobei das Markierungspartikel das Edelmetallnanopartikel und das Farbstoffmolekül umfasst, wobei das Edelmetallnanopartikel eine Plasmonbande im NIR-Bereich und das Farbstoffmolekül eine Fluoreszenzemissionsbande im NIR-Bereich umfasst, wobei das Farbstoffmolekül eine Isothiocyanat-Gruppe aufweist und/oder kovalent an eine Isothiocyanat-Gruppe gebunden ist, wobei das Farbstoffmolekül an das Edelmetallnanopartikel gebunden ist, und wobei der Rezeptor an das Markierungspartikel gebunden ist. Aufgrund des Rezeptors am Konjugat, erlaubt das Konjugat, den Zielanalyten in der Probe mittels Raman-Spektroskopie und/oder Fluoreszenz-Spektroskopie, bevorzugt mittels oberflächenverstärkter NIR-Resonanz-Raman-Spektroskopie und/oder oberflächenverstärkter NIR-Fluoreszenz-Spektroskopie nachzuweisen.
In Zusammenhang mit der Bindung des Rezeptors an das Markierungspartikel ist gemäß einer bevorzugten Weiterbildung vorgesehen, dass das Edelmetallnanopartikel des Markierungspartikels eine Hülle umfasst und der Rezeptor an die Hülle gebunden ist. Der Rezeptor ist also bevorzugt nicht an das Farbstoffmolekül gebunden, sondern an die Hülle des Edelmetallnanopartikels. Grundsätzlich kann der Rezeptor elektrostatisch an die Hülle gebunden sein. Bevorzugt ist der Rezeptor kovalent an die Hülle des Edelmetallnanopartikels gebunden. Wie bereits erwähnt, handelt es sich bei der Hülle bevorzugt um eine das Markierungspartikel stabilisierende Hülle, dergestalt, dass die Hülle die Bindung des Farbstoffmoleküls an das Edelmetallnanopartikel stabilisiert. Die Hülle wird bevorzugt mit dem Farbstoffmolekül auf der Oberfläche des Edelmetallpartikels co-adsorbiert und in einem darauffolgenden Schritt wird bevorzugt der Rezeptor mittels etablierter Konjugationschemie an die Hülle konjugieren. Bevorzugt umfasst die Hülle Polyethylenglykol (PEG) und/oder Polyelektrolyte, weiter bevorzugt thioliertes PEG mit Carbonsäuregruppen (HS-PEG-COOH). Zur kovalenten Bindung des Rezeptors an die Carbonsäuregruppen der Hülle kann beispielsweise N-Hydroxysuccinimid (NHS) oder N-Hydroxysulfosuccinimid-Natriumsalz (Sulfo-NHS) und eine Aktivierungsreagenz wie beispielsweise Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) oder 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC) zur Herstellung von NHS-Ester verwendet werden. Der NHS-Ester als „aktivierte Carbonsäure“ lässt sich leicht mit Aminofunktionen von als Rezeptor verwendeten Peptiden und/oder Proteinen umsetzen. Diese Konjugation ist dem Fachmann beispielsweise unter dem Begriff EDC/Sulfo-NHS Kopplung bekannt.
Der Rezeptor des Konjugates ist spezifisch auf den Zielanalyten abgestimmt, so dass der Zielanalyt in der Probe an den Rezeptor binden kann. In diesem Zusammenhang ist gemäß einer weiteren bevorzugten Weiterbildung vorgesehen, dass der Rezeptor einen zielanalytspezifischen Antikörper, ein zielanalytspezifisches Antikörperfragment, ein zielanalytspezifisches Antikörper-Mimetikum und/oder ein zielanalytspezifisches Antigen umfasst. Antikörper, Antikörperfragmente, Antikörper-Mimetika und/oder Antigene gehen hochspezifische Bindungen mit einer sehr hohen Bindungskonstante ein, so dass sie sich als Rezeptoren für den Zielanalyten besonders gut eignen.
Hinsichtlich des Zielanalyten ist bevorzugt vorgesehen, dass es sich beim Zielanalyten um Antigene, bevorzugt virale Proteine und/oder Proteinfragmente, Tumorantigene, Entzündungsmarker, Biomarker und/oder Antikörper handelt.
Wie bereits erwähnt betrifft die Erfindung weiterhin den Lateralflusstest zum Nachweis des Zielanalyten in der Probe umfassend das obige Konjugat. In anderen Worten betrifft die Erfindung also den Lateralflusstest zum Nachweis des Zielanalyten in der Probe umfassend das Konjugat, wobei das Konjugat das Markierungspartikel für Raman-Streuung und/oder Fluoreszenz-Strahlung und den zur Bindung an den Zielanalyten spezifischen Rezeptor umfasst, wobei das Markierungspartikel das Edelmetallnanopartikel und das Farbstoffmolekül umfasst, wobei das Edelmetallnanopartikel eine Plasmonbande im NIR-Bereich und das Farbstoffmolekül eine Fluoreszenzemissionsbande im NIR-Bereich umfasst, wobei das Farbstoffmolekül eine Isothiocyanat-Gruppe aufweist und/oder kovalent an eine Isothiocyanat-Gruppe gebunden ist, wobei das Farbstoffmolekül an das Edelmetallnanopartikel gebunden ist, und wobei der Rezeptor an das Markierungspartikel gebunden ist. Bevorzugt ist der Rezeptor an die Hülle des Edelmetallnanopartikels gebunden.
Der erfindungsgemäße LFA weist aufgrund des Markierungspartikels eine Nachweisempfindlichkeit für den Zielanalyten in der Probe auf, die um mehrere Größenordnungen geringer ist als bei herkömmlichen LFAs. Bevorzugt liegt die Nachweisempfindlichkeit für den Zielanalyten im pg/mL-Bereich bis fg/mL-Bereich.
Hinsichtlich des LFAs ist bevorzugt vorgesehen, dass das Konjugat in getrockneter Form auf einem Teststreifen des LFAs vorliegt. Weiter bevorzugt ist vorgesehen, dass der LFA den Nachweis des Zielanalyten mittels Raman-Spektroskopie und/oder Fluoreszenz-Spektroskopie und besonders bevorzugt mittels oberflächenverstärkter NIR-Resonanz-Raman-Spektroskopie und/oder oberflächenverstärkter NIR-Fluoreszenz-Spektroskopie ermöglicht. Weiter bevorzugt wird zum Nachweis des Zielanalyten das Konjugat umfassend das Markierungspartikel optisch im NIR-Bereich angeregt.
Weiterhin betrifft die Erfindung die Verwendung des Markierungspartikels und/oder des Konjugates zum Nachweis des Zielanalyten in der Probe. Durch die Verwendung des Markierungspartikels und/oder Konjugates kann der Zielanalyt schon bei sehr geringen Konzentrationen nachgewiesen werden.
Bevorzugt wird das Markierungspartikel und/oder das Konjugat in dem Lateralflusstest verwendet. Durch die Verwendung des Markierungspartikels und/oder des Konjugates weist der Lateralflusstest eine sehr geringe Nachweisgrenze für den Zielanalyten auf. Weiter bevorzugt wird bei Verwendung des Markierungspartikels und/oder des Konjugates der Zielanalyt mittels Raman- und/oder Fluoreszenzspektroskopie, besonders bevorzugt mittels oberflächenverstärkter NIR-Resonanz-Raman-Spektroskopie und/oder oberflächenverstärkter NIR-Fluoreszenz-Spektroskopie nachgewiesen. Dabei erfolgt bevorzugt eine optische Anregung des Markierungspartikels im NIR-Bereich.
Nachfolgend wird die Erfindung unter Bezugnahme auf die Zeichnung anhand eines bevorzugen Ausführungsbeispiels exemplarisch erläutert.
In der Zeichnung zeigen

1 eine schematische Darstellung eines Lateralflusstest, gemäß einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der Erfindung,
2 eine schematische Darstellung von Raman-Spektren, die von drei Bereichen des Lateralflusstests aus 1 aufgezeichnet wurden,
3 eine schematische Darstellung eines Raman-Spektrums eines Markierungspartikels gemäß einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der Erfindung, das mit einem Raman-Spektrum eines nicht erfindungsgemäßen Markierungspartikels verglichen wird,
4 eine weitere schematische Darstellung eines Raman-Spektrums eines Markierungspartikels gemäß einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der Erfindung, das mit einem Raman-Spektrum eines nicht erfindungsgemäßen Markierungspartikels verglichen wird,
5 eine weitere schematische Darstellung mehrerer Lateralflusstest gemäß einem weiteren bevorzugten Ausführungsbeispiel der Erfindung, nachdem die Lateralflusstests mit unterschiedlich konzentrierten Proben versehen wurden,
6 eine schematische Darstellung der ortsaufgelösten Intensitäten des Raman-Signales der Lateralflusstests aus 5, parallel zur Flussrichtung des Lateralflusstests,
7, 8, 9 jeweils eine schematische Darstellung aller ortsaufgelösten Intensitäten parallel zur Flussrichtung des Lateralflusstests aus 5 als zweidimensionales Raman-Spektrum,
10 eine schematische Darstellung der ortsaufgelösten Intensität des Raman-Signales eines Lateralflusstests, gemäß einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der Erfindung, die mit der ortaufgelösten Intensität des Raman-Signals eines nicht erfindungsgemäßen Lateralflusstests verglichen wird,
11 eine schematische Darstellung der ortsaufgelösten Intensität des Raman-Signales eines Lateralflusstests, gemäß einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der Erfindung, die mit der ortaufgelösten Intensität des Raman-Signals eines nicht erfindungsgemäßen Lateralflusstests verglichen wird, und
12 eine schematische Darstellung der ortsaufgelösten Intensität des Raman-Signales mehrerer Lateralflusstests, gemäß bevorzugten Ausführungsbeispielen der Erfindung, die mit der ortaufgelösten Intensität des Raman-Signals zweier nicht erfindungsgemäßen Lateralflusstests verglichen werden.

1 zeigt schematischen einen teststreifenbasierten Lateralflusstest 10 (LFA), gemäß einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der Erfindung. Ein Teststreifen 12 des LFA 10 wird zum Nachweis eines Zielanalyten mit einer Probe 14 versehen. Der LFA 10 dieses Ausführungsbeispiel eignet sich zum Nachweis von IgM Antikörpern in der Probe 14, wobei in diesem Beispiel die Probe 14 eine Konzentration von 25 µg/mL IgM Antikörper aufweist.
Der Teststreifen 12 stellt in einem Bereich 16 ein getrocknetes Konjugat bereit, welches durch Auftragen der flüssigen Probe 14 dispergiert wird. Das Konjugat umfasst ein Markierungspartikel für Raman-Streuung und Fluoreszenz-Strahlung und einen zur Bindung an den Zielanalyten spezifischen Rezeptor, wobei der Rezeptor an das Markierungspartikel gebunden ist. In diesem Fall handelt es sich um einen IgM Antikörper spezifischen Rezeptor, der an das Markierungspartikel gebunden ist.
Der Zielanalyt in der Probe 14, sprich der IgM-Antikörper, bindet an den Rezeptor des Konjugates und wird derart mit dem Markierungspartikel markiert. Aufgrund von Kapillarkräften wandert der mit dem Markierungspartikel markierte Zielanalyt den Teststreifen 12 in Laufrichtung 18 entlang, bis zu einem Kapillarbereich 20 des Teststreifens 12, wo ein weiterer IgM-spezifischer Rezeptor auf dem Teststreifen 12 immobilisiert wurde. Der auf dem Teststreifen 12 immobilisierte Rezeptor bindet an einer anderen Stelle auf der Oberfläche des IgM Antikörpers als der IgM spezifische Rezeptor des Konjugates. Somit wird durch die Bindung des auf dem Testreifen immobilisierten Rezeptors an den Zielanalyten der mit dem Markierungspartikel markierte Zielanalyt im Kapillarbereich 20 des LFAs 10 immobilisiert und reichert sich aufgrund des Fließverhaltens der Probe 14 im Kapillarbereich 20 des LFAs 10 an.
Das Markierungspartikel des vorliegend bevorzugten Ausführungsbeispiels umfasst als Edelmetallnanopartikel einen Goldnanostern mit einer Plasmonbande im Nahinfrarot-Bereich (NIR-Bereich) und ein Farbstoffmolekül mit einer Fluoreszenzemissionsbande im NIR-Bereich, wobei das Farbstoffmolekül eine Isothiocyanat-Gruppe aufweist, mittels derer das Farbstoffmolekül an den Goldnanostern gebunden ist. Somit kann mit Bezug auf 2 mittels Raman-Spektroskopie das Vorhandensein des Zielanalyten in der Probe 12 nachgewiesen werden.
2 zeigt eine schematische Darstellung von Raman-Spektren 22, 24, 26, die an drei Bereichen des LFAs 10 aus 1 aufgezeichnet wurden. Es wurden drei Spektren 22 in einem Bereich, der sich auf dem Testreifen 12 in der Laufrichtung 18 vor dem Kapillarbereich 20 befindet, drei Spektren 24 im Kapillarbereich 20 und drei Spektren 26 in einem Bereich nach dem Kapillarbereich 20 aufgezeichnet. In 2 ist die Intensität 28 der erhaltenen Raman-Signale, gegen die Wellenzahl 30 der Raman-Signale in cm^-1 aufgetragen. Die Raman-Signale 24, die im Kapillarbereich 20 aufgezeichnet wurden, sind um ein Vielfaches intensiver als die Raman-Signale 22, 26 vor oder hinter dem Kapillarbereich 20. Dies zeigt, dass sich der mit dem Markierungspartikel markierte Zielanalyt im Kapillarbereich 20 angereichert hat und dort mittels Raman-Spektroskopie nachweisbar ist.
3 und 4 zeigen jeweils ein Raman-Spektrum 32 des Markierungspartikels gemäß einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der Erfindung, wobei dem Raman-Spektrum 32 jeweils ein Vergleichs-Raman-Spektrum 34, 36 eines nicht erfindungsgemäßen Markierungspartikels gegenübergestellt ist.
3 zeigt das Raman-Spektrum 32 des Markierungspartikels AuNS-787 NIR gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung. Das Markierungspartikel AuNS-787 NIR weist als Edelmetallnanopartikel einen Goldnanostern auf, der eine Plasmonbande bei 787 nm also im Nahinfrarotbereich (NIR-Bereich) aufweist. Weiterhin umfasst das Markierungspartikel AuNS-787 NIR das Farbstoffmolekül NIR-797-isothiocyanat, welches eine Fluoreszenzemissionsbande bei 817 nm (in 0,1 M Phosphatpuffer bei pH 7) also ebenfalls im NIR-Bereich aufweist. Das Farbstoffmolekül ist an den Goldnanostern gebunden. Das Markierungspartikel AuNS-787 NIR zeigt bei resonanter optischer Anregung ein sehr intensives Raman-Signal 32.
Als Vergleichsspektrum ist in 3 das Spektrum 34 des nicht erfindungsgemäßen Markierungspartikels AuNS-781 NTB gezeigt ist. AuNS-781 NTB umfasst zwar ebenfalls einen Goldnanostern mit einer Plasmonbande im NIR-Bereich, nämlich bei 781 nm. Allerdings weist das Markierungspartikel AuNS-781 NTB kein Farbstoffmolekül, das eine Isothiocyanat-Gruppe aufweist, auf. Stattdessen ist der Goldnanostern an das Molekül 4-Nitrothiobenzoat (4-NTB) gebunden. Das Molekül 4-Nitrothiobenzoat ist über die Thiolgruppe an den Goldnanostern gebunden. Das Raman-Signal 34 des nicht erfindungsgemäßen Markierungspartikel AuNS-781 NTB ist weitaus weniger intensiv, als das Raman-Signal 32 des Markierungspartikels AuNS-787 NIR.
4 zeigt das Raman-Spektrum 32 des Markierungspartikels AuNS-723 NIR gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung. Der Goldnanostern des Markierungspartikels AuNS-723 NIR weist eine Plasmonbande bei 723 nm also im NIR-Bereich auf. Weiterhin umfasst das Markierungspartikel AuNS-723 NIR ebenfalls das Farbstoffmolekül NIR-797-isothiocyanat. Das Farbstoffmolekül ist mit seiner Isothiocyanat-Gruppe an den Goldnanostern gebunden.
Als Vergleichsspektrum ist in 4 das Spektrum 36 des nicht erfindungsgemäßen Markierungspartikels AuNS-723 MG gezeigt ist. AuNS-723 MG umfasst zwar ebenfalls einen Goldnanostern mit einer Plasmonbande im NIR-Bereich, nämlich bei 723 nm. Das Farbstoffmolekül ist allerdings Malachitgrün, das keine Isothiocyanat-Gruppe aufweist. Das Raman-Signal 36 des nicht erfindungsgemäßen Markierungspartikel AuNS-732 MG ist weitaus weniger intensiv, als das Raman-Signal 32 des Markierungspartikels AuNS-723 NIR.
5 zeigt schematische Darstellung mehrere LFAs 10 gemäß einem weiteren bevorzugten Ausführungsbeispiel der Erfindung, nachdem die LFAs mit unterschiedlich konzentrierten Proben 14 versehen wurden. Das vorliegend verwendete Konjugat für den Teststreifen 12 des LFA 10 umfasst ein Markierungspartikel und den Anti-IgM-Antikörper, als zielanalytspezifischen Rezeptor. Beim Konjugat des vorliegenden Ausführungsbeispiels weist das Edelmetallnanopartikel eine Hülle umfassend thioliertes PEG mit Carbonsäuregruppen (HS-PEG-COOH) auf. Der Anti-IgM-Antikörper ist über die Carbonsäuregruppen an die Hülle des Edelmetallnanopartikels gebunden. Das Konjugat wurde hergestellt, indem das Farbstoffmolekül zusammen mit der HS-PEG-COOH Hülle auf der Oberfläche des Edelmetallnanopartikel co-adsorbiert wurde. Anschließend wurde der Anti-IgM-Antikörper mittels EDC/sNHS kovalent an die Hülle konjugiert.
Als Probe 14 wurden verschieden konzentrierte Lösungen des IgM-Antikörpers in Puffer verwendet. Nach Auftragung der Proben 14 auf die jeweiligen Teststreifen 12, bindet der Zielanalyt, sprich der IgM-Antikörper, an den Rezeptor des Konjugates und wird derart mit dem Markierungspartikel markiert. Die Teststreifen 12 des LFA 10 weisen jeweils eine Testlinie 38 und eine Kontrolllinie 40 auf. Das Markierungspartikel binden immer an die Kontrolllinie 40 des Teststreifens 12 und zeigt derart an, dass der Test funktioniert. Wenn der Zielanalyt, hier also der IgM-Antikörper, in der Probe 14 vorhanden ist, dann bindet das Konjugat auch an die Testlinie 38, da dort ein Sandwich-Assay ausgebildet wird.
In 5 sind mehrere Teststreifen 12 des LFA 10 nebeneinander dargestellt, wobei die Konzentration des IgM-Antikörpers in der Probe 14 jeweils variiert. Der Teststreifen 12, der in 5 ganz oben abgebildet ist, wurde an einer Probe 14 mit einer Konzentration von 1000ng/ml IgM-Antikörper verwendet. Die Konzentration des IgM-Antikörpers in der Probe 14 nimmt in 5 von oben nach unten jeweils um den Faktor 10 ab, so dass der Teststreifen 12, der in 5 zu unterst abgebildet ist, an einer Probe 14 mit einer Konzentration von 1 fg/ml IgM-Antikörper verwendet wurde. Auch wenn die Kontrolllinie 38 bei niedrigerer Konzentration des IgM-Antikörpers in der Probe 14 jeweils nicht mehr von Auge sichtbar ist, zeigen die ortsaufgelösten Intensität des Raman-Signales der Teststreifen in 6, sowie die zweidimensionalen Ramanspektren der Teststreifen 12a, 12b und 12c in den 7 bis 9, dass der Zielanalyt aufgrund des Markierungspartikels auch bei einer Konzentration von 1 pg/ml IgM-Antikörper noch zuverlässig mittels Ramanspektroskopie nachzuweisen ist und sogar bei einer Konzentration von 1 fg/mL noch ein Raman-Signal des Markierungspartikels zu erkennen ist.
6 zeigt die ortsaufgelöste Intensität des Raman-Signals bei einer Wellenzahl von 553 cm^-1 (y-Achse) an unterschiedlichen Ortspositionen der Teststreifen 12 (x-Achse) aus 5. Das Signal 42 bei einer Ortsposition von etwa 1400 µm entspricht dem Ort der Kontrolllinie 40 und ist immer deutlich zu erkennen. Das Signal 44 bei einer Ortsposition von etwa 5800 µm entspricht dem Ort der Testlinie 38 und variiert in seiner Intensität mit der Konzentration des IgM-Antikörpers in der Probe 14. Blank 0 und Blank 1 sind Messungen des Teststreifens 12 ohne dass Markierungspartikel vorhanden waren.
7 bis 9 zeigen jeweils das zweidimensionale Ramanspektrum der Teststreifen 12a, 12b und 12c aus 5. In den 7 bis 9 ist auf der y-Achse die Ortsposition des Testreifens 12 aufgetragen, auf der x-Achse die Wellenzahl in cm^-1 und die Intensität des Raman-Signals wird über Graustufen dargestellt. In anderen Worten entspricht ein Schnitt parallel zur y-Achse bei einer Wellenzahl von 553 cm^-1 in den 7 bis 9 den ortsaufgelösten Intensitäten des Raman-Signals in 6. In den 7 bis 9 ist deutlich das Signal 42 bei einer Ortsposition von etwa 1400 µm zu erkennen, welches dem Signal am Ort der Kontrolllinie 40 entspricht. Ebenfalls ist auch das Signal 44 bei einer Konzentration von 100 fg/ml (9) des IgM-Antikörpers in der Probe 14 bei einer Ortsposition von etwa 5800 µm deutlich zu erkennen.
10 beschreibt den Einfluss des Edelmetallnanopartikels auf die Signalintensität. In 10 ist die ortsaufgelöste Intensität des Raman-Signales 46 eines LFAs 10, gemäß einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der Erfindung, bei einer Wellenzahl von 553 cm^-1 (y-Achse) gezeigt. Das intensive Signal 46 stammt von dem LFA 10 mit dem Markierungspartikel AuNS-785 NIR 797. Das Markierungspartikel AuNS-785 NIR 797 weist als Edelmetallnanopartikel einen Goldnanostern auf, der eine Plasmonbande bei 785 nm also im Nahinfrarotbereich (NIR-Bereich) aufweist. Weiterhin umfasst das Markierungspartikel AuNS-785 NIR 797 das Farbstoffmolekül NIR-797-Isothiocyanat, welches eine Fluoreszenzemissionsbande bei 817 nm (in 0,1 M Phosphatpuffer bei pH 7) also ebenfalls im NIR-Bereich aufweist.
Als Vergleich ist in 10 die ortsaufgelöste Intensität des Raman-Signales 48 eines nicht erfindungsgemäßen Lateralflusstest gezeigt. In diesem nicht erfindungsgemäßen Lateralflusstest wurde das nicht erfindungsgemäße Markierungspartikels AuNP NIR 797 verwendet. Das Markierungspartikels AuNP NIR 797 weist zwar das gleiche Farbstoffmolekül auf, nämlich NIR-797-isothiocyanat, allerdings weist das sphärische Goldnanopartikel als Edelmetallnanopartikel keine Plasmonbande im NIR-Bereich auf. Die ortsaufgelöste Intensität des Raman-Signales 48 des nicht erfindungsgemäßen Lateralflusstests mit dem Markierungspartikel AuNP NIR 797 weist eine geringere Intensität auf als die Intensitäten des LFAs 10 mit dem Markierungspartikel AuNS-785 NIR 797.
11 zeigt den Einfluss des Farbstoffmoleküls auf die Signalintensität. In 11 ist die ortsaufgelöste Intensität des Raman-Signales 46 eines LFAs 10, gemäß einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der Erfindung, bei einer Wellenzahl von 553 cm^-1 (y-Achse) gezeigt. Das intensive Signal 46 stammt - wie in 10 - von dem LFA 10 mit dem Markierungspartikel AuNS-785 NIR 797. Das Markierungspartikel AuNS-785 NIR 797 weist als Edelmetallnanopartikel einen Goldnanostern auf, der eine Plasmonbande bei 785 nm also im Nahinfrarotbereich (NIR-Bereich) aufweist. Weiterhin umfasst das Markierungspartikel AuNS-785 NIR 797 das Farbstoffmolekül NIR-797-Isothiocyanat, welches eine Fluoreszenzemissionsbande bei 817 nm (in 0,1 M Phosphatpuffer bei pH 7) also ebenfalls im NIR-Bereich aufweist.
Als Vergleich ist in 11 die ortsaufgelöste Intensität der Raman-Signales 50, 52 (Intensitäten bei 1326 cm^-1 und 1377 cm^-1) nicht erfindungsgemäßer Lateralflusstest gezeigt. In diesen nicht erfindungsgemäßen Lateralflusstests wurde das nicht erfindungsgemäße Markierungspartikels AuNS 4-NTB und AuNS TN verwendet. Die Markierungspartikel AuNS 4-NTB und AuNS TN weisen zwar das gleiche Edelmetallnanopartikel auf, nämlich den Goldnanostern mit einer Plasmonbande bei 785 nm, allerdings kein Farbstoffmolekül, das eine Fluoreszenzemissionsbande im NIR Bereich zeigt. Die Moleküle 4-NTB (4-Nitrothiobenzoat) und TN (Thio-2-naphthol) weisen ebenfalls keine Isothiocyanat-Gruppe auf. Die ortsaufgelösten Intensitäten der Raman-Signale 50, 52 des nicht erfindungsgemäßen Lateralflusstests weisen eine geringere Intensität auf als die Intensitäten des LFAs 10 mit dem Markierungspartikel AuNS-785 NIR 797.
Mit Bezug auf 12 wird ebenfalls der Einfluss des Farbstoffmoleküls auf die Signalintensität beschrieben. 12 zeigt eine schematische Darstellung der ortsaufgelösten Intensität des Raman-Signales 46, 54, 56 mehrerer Lateralflusstests, gemäß bevorzugten Ausführungsbeispielen der Erfindung, die mit der ortaufgelösten Intensität des Raman-Signals 58, 60 zweier nicht erfindungsgemäßen Lateralflusstests verglichen werden. Das Signal 46 stammt - wie in 10 und 11 - von dem LFA 10 mit dem Markierungspartikel AuNS-785 NIR 797 ITC. Das Markierungspartikel AuNS-785 NIR 797 ITC weist als Edelmetallnanopartikel einen Goldnanostern auf, der eine Plasmonbande bei 785 nm also im Nahinfrarotbereich (NIR-Bereich) aufweist. Weiterhin umfasst das Markierungspartikel AuNS-785 NIR 797 ITC das Farbstoffmolekül NIR-797-Isothiocyanat, welches eine Fluoreszenzemissionsbande bei 817 nm (in 0,1 M Phosphatpuffer bei pH 7) also ebenfalls im NIR-Bereich aufweist, sowie eine Isothiocyanat-Gruppe. Die Signale 54 und 56 stammen von Markierungspartikeln, die den gleichen Goldnanostern umfassen und als Farbstoffmoleküle das Farbstoffmolekül NIR 5e bzw. NIR 4f umfassen. Diese Farbstoffmoleküle weisen nebst einer Fluoreszenzemissionsbande im NIR-Bereich zwei Isothiocyanat-Gruppen auf.
Als Vergleich ist in 12 die ortsaufgelöste Intensität der Raman-Signales 58 und 60 zweier nicht erfindungsgemäßer Lateralflusstest gezeigt. In diesen nicht erfindungsgemäßen Lateralflusstest wurden die nicht erfindungsgemäßen Markierungspartikel AuNS NIR 797 Cl und AuNS NIR 783 verwendet. Die Markierungspartikel AuNS NIR 797 Cl und AuNS NIR 783 weisen zwar das gleiche Edelmetallnanopartikel auf, nämlich den Goldnanostern mit einer Plasmonbande bei 785 nm, sowie auch ein Farbstoffmolekül, das eine Fluoreszenzemissionsbande im NIR Bereich zeigt. Allerdings weisen die Farbstoffmoleküle NIR 797 Cl und AuNS NIR 783 der Markierungspartikel AuNS NIR 797 Cl und AuNS NIR 783, wie an den dargestellten Strukturformeln in Tabelle 2 zu erkennen ist, keine Isothiocyanat-Gruppe auf bzw. sind nicht kovalent an eine Isothiocyanat-Gruppe gebunden. Tabelle 2: Farbstoffmoleküle, die keine Isothiocyanat-Gruppe umfassen.

Name Strukturformel

NIR 783

NIR 797 Cl
Bezugszeichenliste

10: Lateralflusstest, LFA
12: Teststreifen
14: Probe
16: Bereich mit getrocknetem Konjugat
18: Laufrichtung
20: Kapillarbereich
22: Raman-Spektrum von Bereich auf dem Teststreifen vor Kapillarbereich
24: Raman-Spektrum von Kapillarbereich des Teststreifens
26: Raman-Spektrum von Bereich auf dem Teststreifen nach Kapillarbereich
28: Intensität des Raman-Signals
30: Wellenzahl in cm-1
32: Raman-Spektren der Markierungspartikel AuNS-787 NIR und AuNS-723 NIR
34: Vergleichs Raman-Spektrum eines nicht erfindungsgemäßen Markierungspartikels AuNS-781 NTB
36: Vergleichs Raman-Spektrum eines nicht erfindungsgemäßen Markierungspartikels AuNS-723 MG
38: Testlinie
40: Kontrolllinie
42: Raman-Signal am Ort der Kontrolllinie
44: Raman-Signal am Ort der Testlinie
46: ortsaufgelöste Intensität des Raman-Signales des LFA mit dem Markierungspartikel AuNS-785 NIR 797 ITC
48: ortsaufgelöste Vergleichsintensität des Raman-Signales eines nicht erfindungsgemäßen LFAs mit dem nicht erfindungsgemäßen Markierungspartikel AuNP-NIR 797 ITC
50: ortsaufgelöste Vergleichsintensität des Raman-Signales eines nicht erfindungsgemäßen LFAs mit dem nicht erfindungsgemäßen Markierungspartikel AuNS-4-NTB
52: ortsaufgelöste Vergleichsintensität des Raman-Signales eines nicht erfindungsgemäßen LFAs mit dem nicht erfindungsgemäßen Markierungspartikel AuNS-TN
54: ortsaufgelöste Intensität des Raman-Signales des LFA mit dem Markierungspartikel AuNS-785 NIR 5e
56: ortsaufgelöste Intensität des Raman-Signales des LFA mit dem Markierungspartikel AuNS-785 NIR 4f
58: ortsaufgelöste Vergleichsintensität des Raman-Signales eines nicht erfindungsgemäßen LFAs mit dem nicht erfindungsgemäßen Markierungspartikel AuNS-NIR 797 Cl
60: ortsaufgelöste Vergleichsintensität des Raman-Signales eines nicht erfindungsgemäßen LFAs mit dem nicht erfindungsgemäßen Markierungspartikel AuNS-NIR 783

Claims

Markierungspartikel für Raman-Streuung und/oder Fluoreszenz-Strahlung umfassend ein Edelmetallnanopartikel und ein Farbstoffmolekül, wobei das Edelmetallnanopartikel eine Plasmonbande im NIR-Bereich umfasst, das Farbstoffmolekül eine Fluoreszenzemissionsbande im NIR-Bereich umfasst, das Farbstoffmolekül eine Isothiocyanat-Gruppe aufweist und/oder kovalent an eine Isothiocyanat-Gruppe gebunden ist, und das Farbstoffmolekül an das Edelmetallnanopartikel gebunden ist.
Markierungspartikel nach Anspruch 1, wobei das Farbstoffmolekül über die Isothiocyanat-Gruppe an das Edelmetallnanopartikel gebunden ist und/oder ein Abstand des Farbstoffmoleküls zum Edelmetallnanopartikel zwischen 0,1 und 10 nm beträgt.
Markierungspartikel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Fluoreszenzemissionsbande des Farbstoffmoleküls und die Plasmonbande des Edelmetallnanopartikels einander spektral überlappen und/oder ein spektrales Maximum der Fluoreszenzemissionsbande nicht mehr als 200 nm von einem spektralen Maximum der Plasmonbande entfernt ist.
Markierungspartikel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Farbstoffmolekül ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Indol-Farbstoffe, Polymethin-Farbstoffe, Cyanin-Farbstoffe, Squarain-Farbstoffe, Phthalocyanin-Farbstoffe, Porphyrin-Farbstoffe, Rhodamin-Farbstoffe, Coumarin-Farbstoffe, Xanthen-Farbstoffe, siliziumsubstituierte Xanthen-Farbstoffe, Phenoxazin-Farbstoffe insbesondere Benzophenoxazine, Naphthalindiimide, Tetracyanochinodimethan-Farbstoffe, zwitterionische Farbstoffe, Dicyanomethylen-4H-chromen, 2-Dicyanomethylen-3-cyano-4,5,5-trimethyl-2,5-dihydrofuran, Spirobenzopyran, NIR ESIPT-Farbstoffe, Bordipyrromethane und AIE-Luminogene.
Markierungspartikel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Edelmetallnanopartikel ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Nanopartikel aus Gold, Silber, Goldlegierungen, Silberlegierungen und bimetallische Edelmetallnanopartikel aus Gold, Silber, Goldlegierungen und Silberlegierungen; und/oder wobei das Edelmetallnanopartikel ausgewählt ist aus der Gruppe anisotroper Nanopartikel umfassend Nanostäbchen, Nanowürfel und Nanosterne.
Markierungspartikel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Farbstoffmolekül wenigstens zwei Isothiocyanat-Gruppen umfasst und/oder kovalent an wenigstens zwei Isothiocyanat-Gruppen gebunden ist.
Konjugat umfassend das Markierungspartikel nach einem der Ansprüche 1 bis 6 und einen zur Bindung an einen Zielanalyten spezifischen Rezeptor, wobei der Rezeptor an das Markierungspartikel gebunden ist.
Konjugat nach dem vorhergehenden Anspruch, wobei das Edelmetallnanopartikel des Markierungspartikels eine Hülle umfasst und der Rezeptor an die Hülle gebunden ist.
Konjugat nach einem der Ansprüche 7 oder 8, wobei der Rezeptor einen zielanalytspezifischen Antikörper, ein zielanalytspezifisches Antikörperfragment, ein zielanalytspezifisches Antikörper-Mimetikum und/oder ein zielanalytspezifisches Antigen umfasst.
Lateralflusstest (10) zum Nachweis eines Zielanalyten in einer Probe (14) umfassend das Konjugat nach einem der Ansprüche 7 bis 9.
Verwendung eines Markierungspartikels nach einem der Ansprüche 1 bis 6 und/oder eines Konjugates nach einem der Ansprüche 7 bis 9 zum Nachweis eines Zielanalyten in einer Probe (14).
Verwendung des Markierungspartikels und/oder des Konjugates nach Anspruch 11 in einem Lateralflusstest, wobei der Zielanalyt mittels Raman- und/oder Fluoreszenzspektroskopie nachgewiesen wird.