DE60027578T2

DE60027578T2 - Verfahren zum Nachweis von Bioanalyten unter Verwendung metallischer Nanohüllen

Info

Publication number: DE60027578T2
Application number: DE60027578T
Authority: DE
Inventors: L. Jennifer Pearland WEST; L. Nancy Houston HALAS; J. Steven OLDENBURG; D. Richard Los Alamos AVERITT
Original assignee: William Marsh Rice University
Current assignee: William Marsh Rice University
Priority date: 1999-07-16
Filing date: 2000-07-14
Publication date: 2007-01-25
Anticipated expiration: 2020-07-15
Also published as: EP1210600A1; JP2003504642A; EP1210600B1; ATE324587T1; CA2377722A1; JP2010230679A; WO2001006257A1; WO2001006257A8; EP1210600A4; DE60027578D1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich allgemein auf Teilchen die aus einem mit einer sehr dünnen metallischen Lage beschichteten nichtleitenden Kern bestehen, sowie auf ein Verfahren für die Verwendung dieser Teilchen zum Erfassen eines chemischen oder biologischen Analyts. Genauer bezieht sich die Erfindung auf solche Teilchen, die definierte maximale Absorptions- oder Streuungswellenlängen aufweisen, wobei optional eines oder mehrere Biomoleküle mit der metallischen Lage konjugiert sein können.
Seit langem ist beobachtet worden, dass eine enorme Verstärkung von Raman-Streuungsintensitäten mit vielen biologisch signifikanten organischen Molekülen möglich ist, wenn diese auf aufgeraute Silberelektroden oder in einer Lösung aus sich zusammenballendem Kolloid adsorbiert sind (Fleischmann, M. et al. J. Chem. Soc. Commun. 80 (1973); Duff D. G., et al. Langmuir 9: 2301 (1993)). Dieser Effekt, der als oberflächenverstärkte Raman-Streuung (SERS) bekannt ist, kann ein Raman-Spektrum erbringen, das bis zu eine Million mal stärker als das Spektrum des gleichen Moleküls in Lösung ist. Obgleich dieser Ansatz bei der Raman-Spektrosokopie unter Verwendung einer sichtbaren Anregung beliebt ist, wird eine SERS-Verstärkung nahezu ein Muss, wenn eine im nahen Infrarotbereich liegende Anregungsquelle wie im Falle der FT-Raman-Spektrosokopie verwendet wird. Obgleich eine Anregung im Nahinfrarotbereich die Fluoreszenz der Probe eliminiert, führt sie ebenfalls zu einer deutlichen Abnahme der Empfindlichkeit, wodurch der Bedarf nach einem Sensibilisierungsverfahren zusätzlich begründet ist. Für eine SERS-Verstärkung der FT-Raman-Spektrosokopie im Nahinfrarotbereich derzeit verwendete Verfahren leiden häufig an einer schwierigen Substratherstellung, einer schlechten Reproduzierbarkeit, einer Anfälligkeit für Verunreinigungen oder an der begrenzten Eignung für die In-Vivo-Verwendung.
Der SERS-Effekt steht hauptsächlich mit der Feldstärke in der Nähe der Oberfläche des Substrats bei der Beleuchtung in Beziehung, und zwar sowohl wenn das Substrat eine aufgeraute Metalloberfläche wie eine Anhäufung von metallischen Nanoteilchen ist. Die stärkste Feldanreicherung ist bei der Plasmonresonanz des metallischen Substrats oder Teilchens erreichbar. Aus diesem Grund ist Goldkolloid (Plasmonresonanz = 520 nm) ein derart effizienter SERS-Verstärkungsstoff unter der sichtbaren Raman-Anregung (typischerweise mit einem Argonionenlaser bei 514 nm). Diese Resonanz fällt jedoch mit dem Absorptionsmaximum von Hämoglobin zusammen (Gordy, E. et al./.Biol. Chem. 227: 285–299 (1957)), was die Verwendung der Raman-Spektrosokopie bei einer sichtbaren Anregung an biologischen Systemen signifikant begrenzt.
Die Idee einer Ausnutzung der SERS in biologischen Erfassungsanwendungen unter Verwendung anderer Strategien ist für eine ziemlich lange Zeit betrieben worden. Vorgängige Arbeiten haben die SERS zur Messung der Bindung zwischen biologischen Molekülen mit beiderseitiger Affinität einschließlich Antikörper-Antigen-Interaktionen verwendet (Rohr, T. E., et al. Anal. Biochem. 182: 388–398 (1989)). Der Ansatz in dieser Studie beinhaltete die Verwendung eines mit Avidin beschichteten Silberfilms als Substrat und Farbstoff-Antikörper-Konjugate für eine optimale Ausweitung des SERS-Effekts. Obgleich dieses Verfahren in einem erfolgreichen Sandwich-Immuntest zur Anwendung kam, begrenzt die Verwendung eines mikroskopischen Silbersubstrats sowie die Notwendigkeit einer Konjugation der Biomoleküle mit spezifischen (karzinogenen) Chromophoren für den Resonanz-Raman-Nachweis das Anpassungsvermögen dieses Ansatzes drastisch.
US-Patent Nr. 5 567 628 (Tarcha et al.) beschreibt ein Immuntestverfahren zur Durchführung einer oberflächenverstärkten Raman-Spektrosokopie. Es sind verschiedene Substrate einschließlich Feststoffteilchen aus Gold oder Silber beschrieben. US-Patent Nr. 5 869 346 (Xiaoming et al.) beschreibt eine Vorrichtung und ein Verfahren zum Messen der oberflächensensibilisierten Raman-Streuung durch ein Antigen-Antikörper-Komplex, das an festen Gold-, Silber- oder Kupferteilchen adsorbiert ist.
Die optische Glucoseüberwachung ist ein Beispiel für ein äußerst wichtiges und aktives Forschungsgebiet. Das Ziel dieses Ansatzes besteht in der Bereitstellung eines nicht-invasiven Verfahrens zur Überwachung und optimaleren Behandlung von Diabetes, einer Krankheit, an der weltweit Millionen Menschen leiden. Derzeit wird einer Vielzahl von Ansätzen einschließlich der Spektrosokopie im nahen und mittleren Infrarotbereich, der photoakustischen Spektrosokopie, der Polarimetrie, der Diffuslichtstreuung und der Raman-Spektrosokopie nachgegangen (Waynant, R. W., et al. IEEE-LEOS Newsletter 12: 3–6 (1998)). Verglichen mit den anderen in Verwendung stehenden Ansätzen bietet die Raman-Spektrosokopie mit einer Anregung im Nahinfrarotbereich ein einzigartiges Diskriminationsvermögen zwischen Spektren von unterschiedlichen Analyten selbst in dem Fall, wenn die Signale klein ausfallen. Derzeit wird davon ausgegangen, dass die Raman-Spektrosokopie die einzige volloptische Technik ist, mit der die gesamte Spektralsignatur einer chemischen Spezies erhalten werden kann. Die Spektralsignatur wird nicht durch Wasser undeutlich gemacht und die mit einer Nahinfrarot-Anregung erhältliche signifikante Eindringtiefe (> 1 mm) erleichtert eine Vielzahl von In Vivo-Überwachungsansätzen. Raman-Spektroskopiemessungen der Glucose in menschlichem Blutserum und Augenwasser (unter Verwendung von sowohl der konventionellen Raman- wie der stimulierten Raman-Verstärkungsspektrosokopie) sind ebenfalls berichtet worden (Wicksted, J. P., et al. App. Spectroscopy 49: 987–993 (1995), und US-Patent Nr. 5 243 983, ausgegeben an Tarr et al.). Da eine Anregung im Nahinfrarotbereich zu einer drastischen Empfindlichkeitsabnahme relativ zu der sichtbaren Raman-Anregung führt, besteht die derzeit herausragendste Begrenzung einer Raman-basierenden Glucoseüberwachung in dem Mangel an Empfindlichkeit. Dies führt zu der Notwendigkeit einer Datenerhebung über einen langen Zeitraum hinweg sowie zur Verwendung multivariater Analysetechniken für die Signalextraktion.
Die Verwendung von Goldkolloid in biologischen Anwendungen begann 1971 mit der Entwicklung des Immunogold-Färbungsverfahrens durch Faulk und Taylor. Seit dieser Zeit hat das Markieren der Zielmoleküle, insbesondere Proteine, mit Goldnanoteilchen die Visualisierung von Zell- oder Gewebekomponenten mittels Elektronenmikroskopie revolutioniert (M. A. Hayat, Hrg. Colloidal Gold: Principles, Methods and Applications Academic Press, San Diego, CA 1989). Die optischen und Elektronenstrahl-Kontrastqualitäten von Goldkolloid haben ausgezeichnete Nachweisqualitäten für solche Techniken wie das Immunoblotting, die Durchflusszytometrie und von Hybridisierungstests bereitgestellt. Es liegen Konjugationsprotokolle für das Markieren eines breiten Bereichs von Biomolekülen mit Goldkolloid wie z.B. Protein A, Avidin, Streptavidin, Glucoseoxidase, Meerrettichperoxidase und IgG vor (M. A. Kerr et al., Hrsg., Immunochemistry Labfax BIOS Scientific Publishers, Ltd., Oxford, U. K. 1994). Auf der Verwendung von Nanoteilchenkonjugaten basierende Affinitätsbindungstests sind in US 5 898 004 , WO 9 804 740, WO 9 833 070 und US 5 779 97 ? offenbart.
Metallische Nanohüllen sind ein neuer Typ von "Nanoteilchen", die aus einem nichtleitenden Halbleiter bzw. einem dielektrischen Kern bestehen, der mit einer ultradünnen metallischen Lage überzogen ist. Wie ausführlicher in S. J. Oldenburg et al. (1998) Chem. Phys. Lett., 288: 243–247 und S. L. Westcott et al. (1998) Langmuir 14: 5396–5401, beschrieben erbringen metallische Nanohüllen wirklich einzigartige physikalische Eigenschaften. Beispielsweise ist entdeckt worden, dass metallische Nanohüllen über attraktive optische Eigenschaften ähnlich denjenigen von Metallkolloiden verfügen, d.h. über eine starke optische Absorption und eine äußerst große und rasche optische Polarisierbarkeit nichtlinearer dritter Ordnung (NLO), die mit ihrer Plasmonresonanz assoziiert ist. Im Resonanzbereich verfügen Verdünnungslösungen aus konventionellem Goldkolloid über einige der stärksten elektronischen NLO-Suszeptibilitäten aller bekannten Substanzen. (Hache, F. et al. App. Phys. 47: 347–357 (1988)) Jedoch hängt im Unterschied zu einfachen Metallkolloiden die Plasmonresonanzfrequenz von metallischen Nanohüllen von der relativen Größe des Kerns der Nanoteilchen und von der Dicke der metallischen Hülle ab (Neeves, A. E. et al. J. Opt. Soc. Am. B6: 787 (1989); und Kreibig, U. et al. Optical Properties of Metal Clusters, Springer, New York (1995)). Die relative Dicke oder Tiefe jeder der teilchenbildenden Lagen bestimmt die Wellenlänge ihrer Absorption. Somit können durch ein Einstellen der relativen Kern- und Hüllendicken sowie durch die geeignete Materialauswahl metallische Nanohüllen hergestellt werden, die das Licht bei jeder Wellenlänge über den größten Teil des Ultraviolett-, Sichtbarkeits- und Infrarotbereichs des elektromagnetischen Spektrums hinweg absorbieren oder streuen. Ob das Teilchen die einfallende Strahlung absorbiert oder streut, hängt von dem Verhältnis des Teilchendurchmessers zu der Wellenlänge des einfallenden Lichts ab. In dem biomedizinischen Gebiet sind verbesserte empfindlichere Vorrichtungen und Verfahren zur Durchführung der In Vivo-Erfassung von chemischen oder biologischen Analyten hoch erwünscht. Weiterhin sind einfachere, schnellere und empfindlichere Verfahren und Reagenzien zur Durchführung von In Vitro-Bestimmungen für Analyte wie z.B. Autoantikörper, antivirale oder antibakterielle Antikörper, Serumprotein-Antigene, Zytokine, Hormone, Arzneimittel und ähnliches erwünscht.
Es liegen Verfahren für die In Vitro- und In Vivo-Erfassung von chemischen oder biochemischen Analyten unter Verwendung der SERS-verstärkten Raman-Spektrosokopie vor. Spezielle metallbeschichtete Teilchen ("metallische Nanohüllen") mit oder ohne konjugierte Biomoleküle, mit Durchmessern, die von einigen wenigen Nanometern bis zu etwa 5 μm reichen, und mit einer definierten Wellenlängenabsorbanz bzw. festgelegten Streuungsmaxima über den Ultraviolett- bis zu dem Infrarotbereich des elektromagnetischen Spektrums werden in den Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung verwendet.
Ein Aspekt der Erfindung bezieht sich auf eine für biologische Erfassungsanwendungen nützliche Zusammensetzung. In bestimmten Ausführungsformen umfasst die Zusammensetzung eine Mehrzahl von Teilchen und einen Träger. In einigen Ausführungsformen weist der Träger ein Medium wie z.B. eine Hydrogelmatrix auf. In anderen Ausführungsformen umfasst der Träger ein Substrat, auf dem die Teilchen gruppiert sind. Jedes Teilchen verfügt über einen nichtleitenden Kern mit einem unabhängig defi nierten Radius und eine an dem Kern anhaftende Metallhülle mit einer unabhängig definierten Dicke. Die Begriffe "unabhängig definierter Radius" und "unabhängig definierte Dicke" beziehen sich darauf, dass die erwünschte Dicke sowohl der Hülle wie des Kerns unabhängig davon ausgewählt und ausgebildet werden können, dass eine bestimmte Dicke der anderen Teilchen vorgeschrieben oder notwendig ist. Jedes Teilchen hat ein definiertes Verhältnis von Kernradius zu Hüllendicke sowie eine definierte Absorbanz oder Maximalstreuungswellenlänge (bei der Messung in dem gleichen Medium) in dem Ultraviolett- bis Infrarotbereich des elektromagnetischen Spektrums. Ebenfalls hat das Teilchen eine Oberfläche, die eine oberflächenverstärkte Raman-Streuung induzieren kann, und optional ist/sind ein oder mehrere Biomoleküle mit der Teilchenoberfläche konjugiert. In einigen Ausführungsformen ist ein Reportermolekül mit der Hülle oder mit dem Biomolekül konjugiert. Ein Reportermolekül könnte ein Enzym, ein Farbstoffmolekül, eine Raman-empfindliche Chemikalie oder ähnliches sein. In einigen Ausführungsformen hat das konjugierte Biomolekül oder die Hüllenoberfläche selbst eine Affinität für den Analyt, wodurch mindestens einige Analytmoleküle an der Oberfläche des Teilchens absorbiert bzw. unter nahem Abstand mit ihr assoziiert werden (wobei der Abstand von der Teilchenoberfläche z.B. etwa 50–100 nm und vorzugsweise von etwa 10–20 nm beträgt). In einigen Ausführungsformen hat der Träger oder ein Teil des Trägers eine Affinität für den Analyt, die ausreicht, ihn ähnlich wie oben in der Nähe der Oberfläche der Teilchen anzuordnen. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen der Zusammensetzung liegen die Teilchen und das Medium in der Form einer Matrix wie z.B. einem Hydrogel vor, die für den jeweiligen fraglichen Analyt permeabel ist. In einem weiteren Aspekt der Erfindung werden Verfahren zur Herstellung einer optisch abgestimmten Nanohülle insbesondere für eine Verwendung in biologischen Erfassungsanwendungen bereitgestellt. Der Begriff "optisch abgestimmte Nanohülle" bezieht sich darauf, dass das Teilchen derart hergestellt worden ist, dass es über eine vorbestimmte oder definierte Hüllendicke, eine definierte Kerndicke und ein Verhältnis von Kernradius zu Hüllendicke verfügt, und dass die Wellenlänge, bei der das Teilchen das Licht signifikant, oder vorzugsweise und im Wesentlichen maximal absorbiert oder streut, ein erwünschter vorgewählter Wert ist. Beispielsweise kann die gewählte Wellenlänge der signifikanten Absorbanz einem Absorbanzmaximum (Spitze) entsprechen, oder sie kann jeder stark absorbierten Wellenlänge entsprechen, die auf die "Schulter" einer Absorbanzspitze fällt, oder die gewählte Wellenlänge kann in einen stark absorbierenden Plateaubereich der Teilchenabsorbanz-Spektralkurve fallen. Es sollte sich verstehen, dass der Begriff "maximale Absorbanz" dann auch diese Bedeutung einschließt, wenn es der Kontext erfordert. Die Teilchenwellenlänge der signifikanten Absorbanz kann ausgewählt werden, um im Wesentlichen einer bestimmten Laserspitzenwellenlänge zu entsprechen. Eine bevorzugte Ausführungsform dieses Verfahrens beinhaltet die Auswahl der erwünschten Wellenlänge des Lichts (λ_max), bei der das Licht einer gewählten Wellenlänge durch das Teilchen signifikant absorbiert oder gestreut wird. Ein nichtleitender Kern mit einem Radius R_c wird ausgebildet und anschließend wird eine Metallhülle auf dem Kern anwachsen gelassen oder abgeschieden, wobei die abschließende Hülle eine Dicke T_s aufweist. Ebenfalls beinhaltet dieses Verfahren eine derartige Steuerung des Verhältnisses von R_c : T_s, dass die durch das Teilchen maximal absorbierte oder gestreute Lichtwellenlänge ungefähr λ_max in dem UV- bis Infrarotbereich des elektromagnetischen Spektrums beträgt. In einigen Ausführungsformen wird/werden ein oder mehrere für den Analyt spezifischen Moleküle, der/die ein Biomolekül wie z.B. ein Antikörper, ein Antigen oder ein Enzym ist/sind, mit der Hülle konjugiert. In bestimmten Ausführungsformen wird stattdessen oder zusätzlich ein Reportermolekül mit der Hülle oder dem für den Analyt spezifischen Molekül konjugiert. Das gewählte λ_max entspricht vorzugsweise der zu verwendenden erwünschten Wellenlänge des einfallenden Lichts, wenn die Nanohüllen in einer jeweiligen biologischen Erfassungsanwendung benutzt werden.
Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung bezieht sich auf ein In Vitro-Verfahren zum Bestimmen eines biologischen Analyts in einer Probe (z.B. Blut, Serum oder anderes Körperfluid). Der biologische Analyt könnte beispielsweise ein chemisches oder ein Biomolekül wie z.B. Proteine (z.B. Antikörper, Antigene und Enzyme), Peptide, Oligonukleotide und Polysaccharide oder ein Konjugat daraus sein.
Gemäß bestimmter Ausführungsformen umfasst das In Vitro-Testverfahren die Auswahl einer oder mehrerer optisch abgestimmter Nanohüllen mit einer Absorptions- oder Streumaximalwellenlänge, die der Wellenlänge einer erwünschten Quelle elektromagnetischer Strahlung im Wesentlichen entspricht. In einigen Ausführungsformen beinhalten die ausgewählten Nanohüllen eine oder mehrere konjugierte Biomoleküle. Ebenfalls umfasst das Verfahren die Assoziierung der Nanohüllen mit einem oder mehreren Molekülen des erwünschten in der Probe enthaltenen Analyts, sodass ein Analyt/Nanohüllen-Komplex ausgebildet wird. In bestimmten Ausführungsformen beinhaltet das Verfahren die Assoziierung der Nanohüllen mit einem Reportermolekül, wobei in diesem Fall ein Reporter/Analyt/Nanohüllen-Komplex ausgebildet wird. Jeder Komplex kann bei einer Bestrahlung durch die gewählte Quelle ein Raman-Signal erzeugen. Vorzugsweise liegt die Quelle in dem Nahinfrorot-Bereich des elektromagnetischen Spektrums. Weiterhin umfasst das Verfahren das Bestrahlen des Komplexes mit einer einfallenden elektromagnetischen Strahlung bei der vorbestimmten Wellenlänge, sodass eine oberflächenverstärkte Raman-Streuung ausgelöst wird. Ein Raman-Streusignal von dem Komplex wird erfasst und das Signal wird mit dem Vorliegen und/oder der Menge des Analyts in der biologischen Probe korreliert. In bevorzugten Ausführungsformen wird auch ein SERS-Signal in dem Nahinfrarotbereich erfasst. Ein Hauptvorteil der biologischen Nanohüllen-Erfassungstechnologie der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass der Bedarf nach Indikatorenzymen in vielen Typen biologischer Bestimmungen beseitigt wird, wodurch eine Analyse biologischer Proben mit nur wenigen oder gar keinen vorgängigen Reinigungsschritten ermöglicht wird. Da ein starkes SERS-Signal von den Molekülen unmittelbar an der Oberfläche der Nanohüllen erhalten werden kann, überlagern andere "verunreinigenden" Moleküle in der ungereinigten oder rohen Probe wie z.B. Serum oder Vollblut nicht die spektralen Ansprechmessungen des fraglichen Moleküls.
In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Set zum Durchführen von auf Nanohüllen basierenden Immunsorbenstests bereitgestellt. Diese Tests können vom Sandwich-Typ oder direkte bzw. indirekte Tests analog zu den jeweiligen konventionellen Immunsorbanttests sein. In einer Ausführungsform beinhaltet das Set eine Menge eines ersten Antikörper-Nanohüllen-Konjugats und wahlweise eine Menge eines Kontrollantigens mit einer Affinität für eine Bindung mit dem ersten Antikörper. Optional kann dieses Set auch eine Menge eines sekundären Antikörpers aufweisen, der eine Affinität für eine Bindung an einem Konjugat aus Antigen, erstem Antikörper und Nanohülle hat. In einigen Ausführungsformen wird ein Reportermolekül an den zweiten Antikörper angebunden. Die Nanohüllen in dem Set verfügen über einen nichtleitenden Kern mit einem unabhängig definierten Radius, eine an dem Kern anhaftende Metallhülle mit einer unabhängig definierten Dicke, ein definiertes Verhältnis von Kernradius zu Hüllendicke, ein definiertes Absorbanzwellenlängenmaximum in dem Ultraviolett- bis Infrarotbereich, sowie über eine Oberfläche, die eine oberflächenverstärkte Raman-Streuung auslösen kann.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf die Verwendung der Nanohüllen für einen In Vivo-Nachweis eines biologischen Analyts durch die Überwachung einer Menge von optisch abgestimmten metallischen Nanohüllenteilchen in einem Subjekt an einer erwünschten biologischen Erfassungsstelle in dem Körper. In bestimmten Ausführungsformen ist diese Stelle einem fraglichen Analyt und ebenfalls einer extern zugeführten elektromagnetischen Strahlung zugänglich. In anderen Ausführungsformen ist diese Stelle dem Analyt zugänglich und wird ebenfalls durch eine intern angeordnete Lichtquelle wie z.B. in einem vollständig implantierbaren System bestrahlt. Die Teilchen werden optisch derart abgestimmt, dass die Wellenlänge des Lichts, das durch die Teilchen maximal absorbiert oder gestreut wird, der Wellenlänge desjenigen Lichts, das von einer vorbestimmten Quelle elektromagnetischer Strahlung in dem Ultraviolett- bis Infrarotbereich abgegeben wird, im Wesentlichen entspricht. Beispielsweise könnte die mittlere Spitzenwellenlänge einer Gruppe von Teilchen zwischen etwa 10 und 15 nm der Wellenlänge eines Nd:Yag-Lasers von 1064 nm liegen. Bevorzugte Ausführungsformen des Verfahrens beinhalten die Auswahl einer Quelle elektromagnetischer Strahlung, die Licht bei einer Wellenlänge abgibt, welche der maximal absorbierten oder gestreuten Wellenlänge entspricht. In bestimmten Ausführungsformen haben die Teilchen eine Affinität für den Analyt und in einigen Ausführungsformen beinhalten sie ein Reportermolekül, das in bestimmten Ausführungsformen eine Raman-aktive funktionale Gruppe aufweist. Ebenfalls umfasst das Verfahren die externe Strahlungszufuhr zu den Teilchen und jeglichen den Teilchen zugeordneten Analytmolekülen, sodass ein SERS-Signal erzeugt wird. Das Verfahren beinhaltet die Bewertung des Signals und die Korrelierung der Signalbewertung mit dem Vorhandensein und/oder der Menge des Analyts an der biologischen Erfassungsstelle.
Bestimmte Ausführungsformen der In Vivo-Verwendung beinhalten die Erzeugung einer Menge optisch abgestimmter Teilchen, sodass die Wellenlänge des durch die Teilchen maximal absorbierten oder gestreuten Lichts im Wesentlichen der Wellenlänge desjenigen Lichts entspricht, das von einer vorbestimmten Quelle an elektromagnetischer Ultraviolett-Infrarot-Strahlung abgegeben wird.
Das auch als eine Metallnanohülle bezeichnete Teilchen umfasst einen nichtleitenden oder dielektrischen Kern mit einem unabhängig definierten Radius, eine eng an dem Kern anhaftende Metallhülle mit einer unabhängig definierten Dicke und ein definiertes Verhältnis von Kernradius zu Hüllendicke. Ebenfalls weist das Teilchen eine definierte oder vorbestimmte Wellenlängenabsorbanz- oder streuungsmaximum in dem Bereich des elektromagnetischen Spektrums von 300 nm bis 20 μm auf. In einigen Ausführungsformen liegt das definierte Wellenlängenabsorbanz oder -streuungsmaximum in dem Nahinfrarotbereich. In einigen Ausführungsformen wird die maximale Absorbanzwellenlänge des Teilchens auf etwa 800–1300 nm oder etwa 1600–1850 nm eingestellt. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen hat das Teilchen ein Wellenlängenmaximum, das der Spitzenwellenlänge einer gegebenen Quelle von elektromagnetischer Strahlung im Wesentlichen entspricht, sowie eine Oberfläche, die eine oberflächenverstärkte Raman-Streuung induzieren kann. In bestimmten Ausführungsformen hat die Metallhülle eine Oberfläche mit einer Affinität für die Assoziierung der Analytmoleküle.
In einigen Ausführungsformen des Teilchens der Erfindung hat das Teilchen ein oder mehrere mit der Metallhüllenoberfläche konjugierte Analytbindungsmoleküle. In bestimmten Ausführungsformen ist das Analytbindungsmolekül ein Biomolekül wie z.B. ein Protein, Polypeptid, Oligonukleotid oder Polysaccharid. In einigen Ausführungsformen ist das Analytbindungsmolekül ein Gemisch aus Spezies von mit der Hülle konjugierten Biomolekülen. In bestimmten Ausführungsformen ist das Biomolekül Glucoseoxidase und der Analyt ist Glucose, und in bestimmten anderen Ausführungsformen ist das Biomolekül ein Antikörper und der Analyt ist ein Target-Antigen für den Antikörper. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen weist die Hülle Gold oder Silber und der Kern ein Material wie z.B. Siliziumdioxid, Goldsulfid, Titandioxid, Polymethylmethacrylat (PMMA), Polystyrol oder ein Makromolekül wie z.B. ein Dendrimer auf. Eine bevorzugte Ausführungsform des Teilchens der Erfindung, das sich besonders für die Verwendung in der biologischen Erfassung eignet, verfügt über eine Goldhülle und einen Siliziumdioxidkern. Andere bevorzugte Nanohüllen haben eine Silberhülle und einen Siliziumdioxidkern. Der Durchmesser einiger dieser Teilchen beträgt bis zu etwa 5 μm, wobei der Kerndurchmesser etwa 1 nm bis nahezu 5 μm beträgt, und die Hüllendicke liegt bei etwa 1–100 nm. In bestimmten der bevorzugteren Ausführungsformen hat der Kern einen Durchmesser zwischen 1 nm und 2 μm und die Hülle ist weniger als 40 nm dick. In dieser Ausführungsform ist die Hülle mit dem Kern durch ein Vernetzungsmolekül verknüpft und das Teilchen hat eine Wellenlänge der maximalen Absorbanz oder Streuung zwischen 300 nm und 20 μm. In einigen Ausführungsformen hat das Teilchen einen Durchmesser von etwa 210 nm, einen Kernradius von etwa 100 nm, eine Hüllendicke von etwa 10 nm, ein Verhältnis von Kernradius : Hüllendicke von etwa 10 : 1 sowie eine maximale Absorbanzwellenlänge (λ_max) von etwa 1064 (Standardabweichung ±10 nm), was im Wesentlichen der in einem FT-Raman-Laser-Spektrometer verwendeten Nd:YAG-Quelle mit einer Spitze von 1064 nm entspricht. Bevorzugte Ausführungsformen des Teilchens der Erfindung weisen eine Gold- oder Silberhülle auf. Bevorzugte Ausführungsformen des Teilchens haben einen Kern, der Siliziumdioxid, Goldsulfid, Titandioxid, Polymethylmethacrylat (PMMA), Polystyrol und Makromoleküle wie z.B. Dendrimere aufweist. In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird eine chemische Erfassungsvorrichtung bereitgestellt, die bestimmte der oben beschriebenen Teilchen aufweist. Die chemische Erfassungsvorrichtung kann beispielsweise ein volloptischer Sensor sein, der geeignet entworfene Nanohüllen und eine SERS-Spektrosokopie zum Nachweisen und Quantifizieren eines Arzneimittels oder Plasmaproteins wie z.B. eines bestimmten antiviralen oder antibakteriellen Antikörpers oder eines gegebenen Zytokins verwendet.
Weitere Ausführungsformen, Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus den nachfolgenden Zeichnungen und der Beschreibung.
Zeichnungen
1 ist ein Graph, der die berechneten optischen Resonanzen metallischer Nanohüllen mit einem Siliciumdioxidkern und einer (in Wasser suspendierten) Goldhülle über einen Bereich an Verhältnissen von Kernradius zu Hüllendicke darstellt.
2 ist ein Graph, der die berechnete optische Resonanzwellenlänge gegenüber dem Verhältnis von Kernradius zu Hüllendicke für metallische Nanohüllen mit einem Siliciumdioxidkern und einer Goldhülle (in Wasser) zeigt.
3 stellt Transmissions-Elektronenmikroskopbilder von Siliciumdioxidkern/Goldhüllen-Nanohüllen während des Hüllenwachstums dar.
4A ist ein Graph, der das Wachstum von Goldhüllen auf Siliciumdioxid-Nanoteilchen mit einem Durchmesser von 120 nm zeigt.
4B ist ähnlich wie 4A beschaffen, jedoch mit der Ausnahme dass hier das Wachstum von Goldhülle auf Siliciumdioxidteilchen mit einem Durchmesser von 340 nm dargestellt ist.
5 ist ein Graph, der die SERS-Verstärkung von Mercaptoanilin mit Siliciumdioxid/Gold-Nanohüllen zeigt. Die obere Linie (a) ist das Spektrum von 10^–5% Mercaptoanilin kombiniert mit den Siliciumdiosid/Gold-Nanohüllen. Die untere Linie (b) ist das Hintergrund-Raman-Spektrum von ausschließlich den Nanohüllen mit einem Durchmesser von 120 nm.
6 ist ein Graph, der die Glucoseotidase-Aktivität von GO-konjugierten Goldnanohüllen über einen 7-stündigen Zeitraum bei einem pH-Wert von 4,5 bis 7 darstellt.
7A–B sind konzeptuelle Illustrationen von Glucose erfassenden Goldnanohüllen. 7A zeigt einen Glucosesensor, der aus (nicht funktionalisierten) Goldnanohüllen besteht, die in einer glucosepermeablen Membran oder Matrix integriert sind. 7B stellt einen Glucosesensor dar, der aus Glucoseotidase-Nanohüllen-Konjugaten besteht, die in einer glucosepermeablen Membran integriert sind.
8A–C illustrieren auf konzeptuelle Weise einen ELISA-Test, der dadurch modifiziert ist, dass die Ausgangsantikörper direkt an Nanohüllen anstatt an einem typischen makroskopischen Träger verknüpft sind. 8A stellt ein Antikörper-Nanohüllen-Konjugat vor dem Test dar. 8B zeigt ein Antikörper-Nanohüllen-Konjugat nach dem Aussetzen an den Antigenanalyt. 8C zeigt die Nanohülle analog zu dem abschließenden ELISA-Sandwich-Immuntestschritt, wobei optional enzymverknüpfte Antikörper an die Antigen-Antikörper-Komplete gebunden sind.
9A–C sind Graphen, welche die oberflächenverstärkte Raman-Streuung von mit Dimethylaminoazobenzol markierten-IgG (DAB-IgG) konjugierten Nanohüllen in biologischen Proben darstellen. 9A zeigt die Raman-Intensität gegenüber der Raman-Verschiebung (cm^–1) für eine Probe von DAB-IgG konjugierten Nanohüllen, die in einer phosphatgepufferten Salzlösung (PBS) suspendiert sind. 9B ist ein ähnlicher Graph für eine in Fetal Bovine Serum (FBS) suspendierte Probe, und 9C ist ein ähnlicher Graph für eine in Vollblut suspendierte Probe.
Metallische Nanohüllen
Die metallischen Nanohüllen, die wie in US-6 344 272 beschrieben hergestellt wurden, stellen die funktionalen Strukturen bereit, welche die Grundlage für die hier offenbarten bevorzugten biologischen Erfassungsanwendungen bilden. Die für das biologische Erfassen verwendeten Nanohüllen sind vorzugsweise Teilchen, deren Durchmesser bis zu mehreren Mikrometern reicht, die einen dielektrischen Kern, einen metallischen Überzug bzw. Hülle sowie ein definiertes Verhältnis von Kernradius zu Hüllendicke haben. Die Kerndurchmesser der biologisch erfassenden Nanohüllen reichen von etwa 1 nm bis zu 4 μm oder mehr und die Hüllendicke reicht von etwa 1 bis 100 nm. Für jede gegebenen Kern- und Hüllenmaterialien hängt die maximale Absorbanz- oder Streuungswellenlänge des Teilchens von dem Verhältnis der Dicke (d.h. dem Radius) des Kerns zu der Dicke der Hülle ab. Basierend auf den durch das neue Syntheseverfahren bewerkstelligten Verhältnissen von Kernradius zu Hüllendicke (Kern : Hülle) können Nanohüllen, die sich von dem Ultraviolett- zu dem Infrarotbereich bis zu ungefähr 5 μm erstreckende Plasmonresonanzen erbringen, auf einfache Weise hergestellt werden. Die Sichtbarkeits- und im Nahinfrarotbereich liegenden Bereiche des elektromagnetischen Spektrums sind für eine biologische Analyse oder Erfassungsanwendung von besonderem Interesse.
1 stellt die berechneten Goldnanohüllen-Plasmonresonanzen für Teilchen mit einem zunehmenden Verhältnis von Kernradius zu Hüllendicke dar. Eine Mie-Streuungsberechnung der Wellenlängenverschiebung der Nanohüllen-Plasmonresonanz ist als eine Funktion der Nanohüllen-Zusammensetzung für eine Nanohülle gezeigt, die auf einem Siliciumdioxidkern abgeschiedene Goldlage aufweist. In dieser Figur sind der Kern und die Hülle der Nanoteilchen in einem relativen Maßstab direkt unter ihren entsprechenden optischen Resonanzen dargestellt. In 2 ist ein Auftrag des Verhältnisses von Kernradius zu Hüllendicke (Kern zu Hülle) gegenüber der Resonanzwellenlänge für ein Nanoteilchen mit Goldhülle und Siliciumdioxidkern dargestellt. Durch die Variierung der Bedingungen der Metallabscheidungsreaktion wird das Verhältnis der Dicke der Metallhülle zu dem Kernradius auf eine vorhersag- und kontrollierbare Weise variiert. Dementsprechend können Teilchen mit einem äußerst weiten Bereich von Verhältnissen des Kernradiuses zu der Hüllendicke aufgebaut werden. Einige der bevorzugteren Verhältnisse von Kern zu Hülle betragen etwa 2–1000. Dieser große Verhältnisbereich führt in Verbindung mit der Steuerung der Kerngröße zu einem Teilchen, das eine große frequenzagile Absorbanz über die UV-, Sichtbarkeits- und Infrarotbereiche des Spektrums aufweist.
Im Vergleich dazu fallen die bei der Plasmonresonanz von Goldkolloid mittels Adsorption molekularer Spezies ausgelösten Verschiebungen ziemlich klein aus und betragen typischerweise 10 nm oder weniger (Kreibig, U. et al. Optical Properties of Metal Clusters, Springer, New York 1995). Die nichtlinearen optischen (NLO) Eigenschaften von metallischen Nanohüllen oder Nanohüllen bildenden Materialien können durch eine besonnene Platzierung der Plasmonresonanz bei oder nahe bei den infrage kommenden optischen Wellenlängen resonanzverstärkt werden. Somit verfügen metallische Nanohüllen über ein ausgeprägtes Potenzial für optische Vorrichtungsanwendungen in dem Nahinfrarotbereich, der ein Wellenlängenbereich von besonderer technologischer Bedeutung ist. Die agile "Abstimmbarkeit" der Plasmonresonanz ist eine Eigenschaft, die wirklich einzigartig für metallische Nanohüllen ist. In keiner anderen Molekular- oder Nanoteilchenstruktur kann die Resonanz der optischen Absorptions- und NLO-Eigenschaften systematisch über einen derart extrem weiten Bereich an Wellenlängen entworfen werden.
Averitt, R. D. et al. (Phys. Rev. Lett. 78: 4217–4220 (1997)) untersuchten die optischen Eigenschaften bestimmter durch Gold abgeschlossener Goldsulfid-Nanoteilchen ausführlich. Es wurde eine quantitative Übereinstimmung zwischen der Mie-Streuungstheorie von 1 und der optischen Absorption in den Au/Au₂S-Nanoteilchen bewerkstelligt. Wie in US-6 344 272 beschrieben ist ein weiter verallgemeinertes Verfahren für das Wachstum einer gleichförmigen metallischen Lage mit einer Dicke im Nanometerbereich auf einem dielektrischen Kern entwickelt worden; siehe auch Oldenburg, S. J. et al. Chem. Phys. Lett 288: 243–247 (1998). Kurz gesagt beinhaltet ein bevorzugtes Verfahren das Züchten oder Erhalten von dielektrischen oder Halbleiter-Nanoteilchen, die in Lösung dispergiert sind. Sehr kleines (d.h. 1–2 nm großes) "ausgesätes" metallisches Kolloid wird mittels molekularer Bindungen an die Oberfläche der Nanoteilchen gebunden. Diese Saatkolloide überziehen die dielektrischen Oberflächen der Nanoteilchen mit einer diskontinuierlichen Metallkolloidlage. Anschließend wird zusätzliches Metall auf den "Saat"-Metallkolloidadsorbaten mittels einer chemischen Reduktion in Lösung gezüchtet.
Dieser Ansatz ist erfolgreich zum Züchten von sowohl Gold- wie Silbermetallhüllen auf Siliciumdioxid-Nanoteilchen verwendet worden. Verschiedene Stufen in dem Wachstum einer metallischen Goldhülle auf einem funktionalisierten Siliciumdioxid-Nanoteilchen sind in 3 dargestellt. Der Begriff "funktionalisiert" bezieht sich auf ein Vernetzungsmolekül und das an das Vernetzungsmittel gebundene Goldkolloid. 3 stellt Transmissions-Elektronenmikroskopbilder von Siliciumdioxidkern/Goldhüllen-Nanohüllen während des Hüllenwachstums dar. Die relative Länge von 20 nm ist unter den Bildern dargestellt.
4A–B sind Graphen, welche die optische Signatur der Koaleszenz und des Wachstums von Nanohüllen für zwei unterschiedliche Kerndurchmesser der Nanohüllen darstellt. 4A zeigt das Wachstum der Goldhülle auf Siliciumdioxid-Nanoteilchen mit einem Durchmesser von 120 nm. Die unteren Spektralkurven folgen der Formierung der optischen Absorption bei einem Fortschreiten der Koaleszenz der Goldlage. Ist die Hülle vollständig, wird die Spitzenabsorbanz zu kürzeren Wellenlängen hin verschoben. Die entsprechenden theoretischen Spitzen sind in gestrichelten Linien aufgetragen. 4B stellt das Wachstum von Goldhülle auf Siliciumdioxidteilchen mit einem Durchmesser von 340 nm dar. Hier fallen die Spitzenverschiebungen deutlicher aus, wobei nur die Schulter der mittleren Kurve in dem Bereich des in den Test verwendeten Instruments sichtbar ist. Das Wachstum metallischer Nanohüllen durch dieses Verfahren kann nur einige wenige Sekunden dauern und Erträge von über 98% erbringen. Nanohüllen können einfach in Filme oder Matrixmaterialien integriert werden und sind in einem weiten Bereich von organischen und wässrigen Lösungsmitteln stabil.
Obgleich in bevorzugten Ausführungsformen die Nanohüllenteilchen eine sphärische Form aufweisen, kann der Kern auch andere Formen wie z.B. kubische, zylindrische oder hemisphärische Formen haben. Unabhängig von der Geometrie des Kerns ist es bevorzugt, dass die Teilchen in bevorzugten Ausführungsformen eine homogene Größe und Form aufweisen. Vorzugsweise enthalten Zusammensetzungen aus einer Mehrzahl metallischer Nanohüllen Teilchen mit einem im Wesentlichen gleichförmigen Durchmesser, der in Abhängigkeit von dem erwünschten Absorbanzmaximum der Teilchen bis zu mehreren Mikrometern reicht. Zum Beispiel können monodisperse Kolloid-Siliciumdioxidkernteilchen durch die basekatalysierte Reaktion von Tetraalkoxysilanen mittels Techniken erzeugt werden, die dem Fachmann wohlbekannt sind. Alternativ sind geeignete Siliciumdioxidteilchen leicht von bekannten kommerziellen Quellen verfügbar. Nahezu sphärische Siliciumdioxidkerne sind bevorzugt, deren Größe von 10 nm bis zu mehr als 4 μm reicht und deren Variation des Teilchendurchmessers nur einige wenige Prozent beträgt.
Geeignete dielektrische Kernmaterialien beinhalten, ohne sich jedoch darauf zu begrenzen, Siliziumdioxid, Goldsulfid, Titandioxid, Polymethylmethacrylat (PMMA), Polystyrol, und Makromoleküle wie z.B. Dendrimere. Das Material der nichtleitenden Lage beeinflusst die Eigenschaften des Teilchens. Wenn die dielektrische Konstante der Hüllenlage beispielsweise relativ zu einem Teilchen mit einem Kern mit einer gegebenen dielektrischen Konstante größer ausfällt, wird das Absorbanzmaximum des Teilchens relativ zu einem Teilchen mit einem Kern mit einer niedrigeren dielektrischen Konstante zu Blau hin verschoben sein. Ebenfalls kann der Kern aus einer Kombination oder einer in Lagen angeordneten Kombination von dielektrischen Materialien wie z.B. den oben angeführten Materialien bestehen.
Geeignete Metalle zum Ausbilden der Hülle oder Außenlage beinhalten Münz- sowie Edelmetalle, jedoch können auch andere elektrisch leitende Metalle verwendet werden, wobei die jeweilige Auswahl von der erwünschten Verwendung abhängt. Für die Verwendung in Hüllen besonders geeignete Metalle beinhalten Gold, Silber, Kupfer, Platin, Palladium, Blei, Eisen oder ähnliches, ohne sich jedoch hierauf zu begrenzen. Gold und Silber sind bevorzugt. Ebenfalls können Legierungen oder nicht-homogene Gemische aus derartigen Metallen verwendet werden. Die Hüllenlage ist vorzugsweise von 1 bis 100 nm dick und überzieht die Außenfläche des Kerns gleichförmig, oder sie kann den Kern teilweise mit atomaren oder molekularen Clustern überziehen.
Beispiel 1. Oberflächenverstärkte Raman-Streuung (SERS) unter Verwendung metallischer Nanohüllen
Da metallische Nanohüllen über eine Plasmonresonanz verfügen, die für das Teilchen durch eine Einstellung des Verhältnisses von Teilchenkern zu Hülle entworfen ist, kann ihre Plasmonresonanz während des Wachstums der Hülle verschoben werden, um mit den Anregungswellenlängen von im Nahinfrarotbereich liegenden Laserquellen wie z.B. der in einem FT-Raman-Laser-Spektrometer verwendeten Nd:YAG-Quelle mit 1064 nm zusammenzufallen.
In einer Reihe neuerer Experimente wurden die SERS-Verstärkungseigenschaften von metallischen Nanohüllen untersucht (Oldenburg, SJ. et al. J. Chem. Phys. 111: 4729–4735 (1999). Die Nanohüllen-Plasmonresonanz wurde auf nominell 900 nm gesetzt, sodass die Schulter der Plasmonspitze sich mit der Raman-Anregungswellenlänge überlappte. 5 stellt die SERS-Verstärkung dar, die in dieser Studie für das Molekül Mercaptoanilin beobachtet wurde. Es wurde eine Verstärkung von 600.000 in dem Raman-Signal beobachtet. In diesem Fall führte die starke Interaktion zwischen Mercaptoanilin und der Goldnanohüllenoberfläche zu einer (wahrscheinlich kovalenten) Bindung dieser Moleküle an den Oberflächen der Nanoteilchen. Die beobachtete Verstärkung sättigte sich bei einer Mercaptoanilin-Konzentration entsprechend des Einzelschichtüberzugs der Oberflächen der Nanohülle, wodurch bestätigt wurde, dass die Raman-Verstärkung tatsächlich ein lokaler Oberflächeneffekt der Nanoteilchen ist. In dieser Studie konnte kein Anteil einer Nanoteilchenaggregation an der Nanohüllen-SERS-Verstärkung festgestellt werden, da keine Teilchenaggregation erfasst wurde. Die beobachtete SERS-Verstärkung kam ausschließlich aus den Beiträgen von nicht aggregierten Nanohüllen zustande, die in Lösung dispergiert waren. Falls möglich ist es vorteilhaft, diesen Effekt bei dem Entwurf von Biosensoren auszunützen. Die hier beschriebenen metallischen Nanohüllen und konjugierten Nanohüllen stellen eine einzigartige und breitere Gruppierung von SERS-Verstärkungsteilchen als die in obiger Studie verwendeten Au/Au₂S-Teilchen bereit.
Beispiel 2. Biokonjugation von Goldnanoteilchen/Nanohüllen
Da die Reduzierung der metallischen Außenlage von Goldnanohüllen unter Verwendung der gleichen chemischen Reaktion wie bei der Goldkolloidsynthese bewerkstelligt wird, fallen die Oberflächen der Goldnanohüllen wahrscheinlich chemisch so gut wie identisch zu den Oberflächen der Goldnanoteilchen aus, die in konventionellen Biokonjugatanwendungen universell verwendet werden. Bestehende Konju gationsprotokolle für das Markieren eines breiten Bereichs von Biomolekülen mit Goldkolloid (z.B. Protein A, Avidin, Streptavidin, Glucoseoxidase, Meerrettichperoxidase und IgG) (M. A. Kerr et al., Hrsg., Immunochemistry Labfax BIOS Scientific Publishers, Ltd., Oxford, GB 1994) werden für die Verwendung mit Goldnanohüllen direkt wiederholbar oder auf einfache Weise anpassbar sein. Ebenfalls ist zu erwarten, dass ähnliche Konjugationstechniken leicht an eine Konjugation von Nanohüllen angepasst werden können, die andere Kernmaterialien aufweisen. In einem Satz von Experimenten wurde eine Anbindung von Glucoseoxidase (GO) zu Goldnanohüllen mit einem Durchmesser von 150 nm gemäß eines veröffentlichten Protokolls für die Goldkolloidkonjugation bewerkstelligt (Chen, X.-Y. et al. Biochem. Biophys. Res. Comm. 245: 352–355 (1998)). Nachfolgend wurde die Aktivität des GO-Nanohüllen-Konjugats unter Verwendung konventioneller Techniken überwacht. Die Anbindung mittels Adsorption erwies sich über einen Bereich von pH-Werten als erfolgreich. Im Unterschied zu parallelen Untersuchungen, bei welchen unter Verwendung von mit Citrat stabilisiertem Goldkolloid eine pH-Wert-abhängige Ausflockung über einen Zeitraum von mehreren Stunden auftrat, wurde keine Ausflockung des GO-Nanohüllen-Komplexes über einen Zeitraum von mehreren Tagen beobachtet. Nach einer wiederholten Zentrifugierung wurde die Aktivität des GO-Nanohüllen-Komplexes bei einem Vorliegen von Glucoselösung unter Verwendung eines optischen Standardnachweises überwacht (Indigokarmin-H₂O₂-Redoxpaar). Die relative pH-Wert-abhängige Aktivität von GO-konjugierten Nanohüllen ist in 6 dargestellt. Andere Biomoleküle können mit den metallischen Nanohüllen in einer ähnlichen Weise konjugiert werden.
Beispiel 3. Auf Goldnanohüllen basierende Biosensoren
Eine bevorzugte biologische Erfassungsstrategie kombiniert die durch die metallischen Nanohüllen bereitgestellten enormen SERS-Verstärkungen mit dem Vermögen zu einer oberflächlichen Biokonjugation von Goldnanohüllen-Oberflächen. Diese Kombination stellt eine hoch empfindliche Spektralprobe mit einer hohen Informationsdichte bereit, die für die Überwachung spezifischer, physiologisch wichtiger biochemischer Verfahren geeignet ist. Sichtbares Licht ist für eine optische In Vivo-Überwachung wegen seiner Absorption durch Hämoglobin nicht geeignet. Ultraviolettlicht ist aufgrund des Potenzials für eine photochemische Transformation von Proteinen und DNA ebenfalls nicht geeignet. Eine Raman-Streuung in dem Nahinfrarotbereich, die durch die Plasmonresonanz der Goldnanohüllen angereichert ist, weist diese Nachteile nicht auf und es wird von den Erfindern vorhergesagt, dass sie die gleiche nachgewiesene SERS-Empfindlichkeit in Bereichen hoher physiologischer Transmissionsgrade wie z.B. "Wasserfenstern von 800–1300 nm und 1600–1850 nm erleichtert (Anderson, R. R. et al. J. Invest. Dermatol. 77: 13–19 (1981); und Duck. F. A., Physical Properties of Tissue: A Comprehensive Reference Book, Academic Press, San Diego, CA (1990)). Das Kern : Hüllen-Verhältnis der Nanohüllen wird so ausgewählt, dass das erwünschte Absorptions- oder Streuungsmaximum der erwünschten auftretenden Wellenlänge, die in der SERS-Spektroskopiemessung eines bestimmten Analyts verwendet werden soll, entspricht. Dieses Entwurfsmerkmal macht Goldnanohüllen als ein mikroskopisches biologisches Erfassungssubstrat für volloptische In Vitro- und In Vivo-Erfassungsanwendungen einzigartig geeignet. Die Verwendung von Metallnanohüllen-Resonanzsubstraten zur Verbesserung des SERS-Signals beseitigt den Bedarf nach makroskopischen Metallsubstraten sowie nach einer Resonanzkonjugation von Biomolekülen für viele SERS-aktive Analyte. Allerdings können auf Wunsch Biomoleküle und/oder Reportermoleküle mit der Nanohülle zur Verbesserung des SERS-Nachweises und der SERS-Quantifizierung konjugiert werden.
Es versteht sich unmittelbar, dass der Nanohüllenteilchen-Durchmesser, die Hüllendicke, Kerndicke, und das Verhältnis von Kern zu Hülle der Nanohüllen auf eine ähnliche Weise ausgewählt werden kann, damit ein erwünschtes Absorptionsmaximum in den sich ergebenden Nanohüllen erhalten wird, welches einer erwünschten Wellenlänge entspricht, um einen bestimmten Analyt in dem Ultraviolett-, Sichtbarkeits- oder im Nahinfrarotbereich liegenden Bereich des elektromagnetischen Spektrums zu messen.
Beispiel 4. Volloptische In Vivo-Glucose Erfassung
Die optische Glucoseerfassung zielt darauf ab, eine nicht-invasive Möglichkeit der Überwachung von Blutglucosepegeln bereitzustellen. Eine derartige Technik wäre bei der Behandlung von Diabetes nützlich, einer Krankheit, an der weltweit Millionen Menschen leiden. Im Vergleich zu den anderen heutzutage verwendeten Ansätzen für die In Vivo-Glucose Messung bietet die Raman-Spektrosokopie mit einer Anregung im Nahinfrarotbereich die einzigartige Fähigkeit zu einer Diskriminierung zwischen Spektren von unterschiedlichen Analyten selbst dann, wenn die Signale klein sind. Eine auf metallischen Nanohüllen basierende Glucoseerfassung überwindet die Hauptbeschränkung bestehender Glucoseüberwachungssysteme auf Raman-Basis, indem die Empfindlichkeit der Erfassung in großem Umfang verbessert wird. Der Bedarf nach einer Datenerhebung über einen langen Zeitraum hinweg und nach multivariaten Analysetechniken für die Signalextraktion entfällt durch die Verwendung von Nanohüllen-Biosensoren. Die auf Nanohüllen basierende Raman-Glucoseüberwachung ist auf die Verwendung metallischer Nanohüllen angewiesen, um ein stark SERS-verstärktes Glucosesignal unter einer Anregung im Nahinfrarotbereich bereitzustellen. Auf Wunsch können ein Glucose bindendes Biomolekül und/oder ein SERS-aktives Reportermolekül zur Verbesserung des SERS-Nachweises und der SERS-Quantifizierung mit der Nanohülle konjugiert werden. Es ist bevorzugt, die Hülle und die Kerndicke auf eine derartige Weise herzustellen, dass die Plasmonresonanz der Nanohüllen der Wellenlänge des für die SERS-Erfassung verwendeten Anregungslasers entspricht. Auf diese Weise wird ein Spektrum des unelastisch gestreuten Lichts erhalten.
Obwohl in dem vorliegenden Beispiel Glucose beschrieben wurde, sollte sich verstehen, dass jeder andere biologische Analyt und insbesondere ein Analyt, der ein starkes Raman-Signal ergibt, auf ähnliche Weise analysiert werden kann. Der in 7A dargestellte Glucosesensor beinhaltet Nanohüllen, die in einem Gel dispergiert sind, aus dem das Glucose-Raman-Signal von benachbart zu den Sensoren befindlichen Glucosemolekülen direkt überwacht werden kann. Ein derartiger Glucosesensor umfasst (unkonjugierte) Goldnanohüllen, die in einer glucosepermeablen Membran oder Matrix wie z.B. einem Hydrogel integriert sind. Vorzugsweise werden die Nanohüllen mit Plasmonresonanzen hergestellt, die der Raman-Anregungs-Laserwellenlänge entsprechen. Häufig ist ein Einbetten der Nanohüllen in einer Hydrogelmatrix erforderlich, um das Immunansprechen auf die Biokonjugat-Nanohüllen zu reduzieren und eine Phagozytose oder Migration der Nanohüllen zu verhindern. Ein bevorzugtes Hydrogel wird aus Polyethylenglykoldiacrylat (PEGDA) ausgebildet, obgleich stattdessen auch andere geeignete Hydrogelmaterialien benutzt werden könnten. Die Eignung eines jeweiligen Hydrogels kann dadurch bewertet werden, dass Raman-Studien an Proben von in Hydrogel eingebetteten Nanohüllen zur Bestimmung der Empfindlichkeit auf die fragliche chemische Spezies durchgeführt werden. Auf diese Weise können die am besten arbeitenden Kandidaten von Hydrogelmatrizen für eine gegebene Anwendung ausgewählt werden.
PEGDA ist ein Material, das gezeigtermaßen ausgezeichnete Eigenschaften für eine In Vivo-Verwendung aufweist und für Glucose hoch permeabel ist (Hill, R. S. et al. Ann. N. Y. Acad. Sci 831: 332–343 (1997); und Quinn, C. P. et al. Biomaterials 16: 389–396 (1995)). PEGDA-Hydrogele sind in einer Anzahl an Biomaterialanwendungen einschließlich der Immunisolierung von auf Glucose ansprechende Langerhanssche Inselchenzellen der Bauchspeicheldrüse und als ein glucosepermeabler Überzug für einen Glucosesensor auf Redoxbasis verwendet worden. PEGDA-Hydrogele können durch ein Verfahren, das als Grenzflächen-Polymerisation bezeichnet wird (Hill-West, J. L. et al. Natl Acad. Sci. USA 91: 5967–5971 (1994)), in dünnen Überzügen (2–100 μm) ausgebildet werden. Dies ermöglicht die Erzeugung sehr dünner Nanohüllen enthaltenden Hydrogele, die vor Ort subkutan in einem vollständig spritzfähigen System benutzt werden können. Nach der Implantation des biologischen Erfassungsmaterials auf Injektionsbasis erfolgt die Glucoseüberwachung vollständig nicht-invasiv und wird optisch über die Haut hinweg taxiert. Obgleich für viele biologische Erfassungsanwendungen bevorzugt, ist es nicht notwendig, in sämtlichen Anwendungen die Nanohüllen in einem Hydrogel für die Vermeidung einer Migration der Biosensorteilchen oder anderer Probleme einzubetten. Beispielsweise könnten die Nanohüllen auf einem dünnen Film oder einem anderen Typ eines implantierbaren Substrats abgeschieden oder gruppiert werden.
Ein alternativer Ansatz für eine Verwendung von Nanohüllen in der biologischen Erfassung ist konzeptuell in 7B dargestellt, wobei ein aus funktionalisierten Nanohüllen wie z.B. Glucoseoxidase-Nanohüllen-Konjugaten bestehender Glucosesensor gezeigt ist. Die konjugierten Nanohüllen werden wie oben beschrieben vorzugsweise in eine glucosepermeable Membran integriert. In diesem Fall sind die metallischen Nanohüllen mit dem Enzym Glucoseoxidase konjugiert worden, bevor sie in einem Hydrogel oder in Hydrogelvorläufern dispergiert und in ein Subjekt implantiert werden. Zusätzlich zu dem Spektralsignal benachbarter Glucosemoleküle ist eine Vielzahl anderer spektraler Merkmale für die optische Überwachung verfügbar. Beispielsweise können Konformationsänderungen in Glucoseoxidase nach der Glucosebindung oder die Produkte der Glucoseoxidation, namentlich Gluconsäure und H₂O₂, überwacht werden. Da die Biokonjugation der Nanohüllen mehrere alternative Erfassungsoptionen bereitstellt, besteht die Möglichkeit zu einem Einbau mehrerer Redundanzen in das Überwachungssystem, damit die nach der Datenerhebung erfolgende Signalanalyse entweder vereinfacht oder beschleunigt wird.
Ein Typ von Glucoseerfassungssystem beinhaltet zunächst die In Vitro-Bewertung der Raman-Signale von Glucose, um die mit Resonanznanohüllen unter "idealen" Bedingungen erhaltenen SERS-Verstärkungen zu bestimmen. Anschließend werden Bindungstests mit Bicinchoninsäure (BCA) der Biokonjugat-Nanohüllen durchgeführt, um das gesamte adsorbierte Protein und die absoluten Aktivitäten einzuschätzen. Dann werden Raman-Studien der In Vitro-Glucoseüberwachung mit Biokonjugat-Nanohüllen zur Bestimmung der Empfindlichkeit auf den Reaktant, das Adsorbat und die Produktspezies durchgeführt. Der nächste Schritt besteht in der Integration von Nanohüllen in glucosepermeable Hydrogele wie z.B. Polyethylenglycoldiacrylat (PEGDA), Polyvinylalkohol oder Alginat, wobei eine bekannte Technik bzw. ein bekanntes chemisches Protokoll zum Einbetten von Sphären in Hydrogelen benutzt wird. Die In Vivo-Demonstration des biologischen Erfassungssystems kann Raman-Studien von zuckerkranken und nicht zuckerkranken Ratten mit subkutan implantierten, auf Nanohüllen basierenden Sensoren sowie eine Korrelation der optisch gemessenen Glucosepegel mit traditionell gemessenen Blutglucosepegeln beinhalten. Beispielsweise kann einer Gruppe von SDD-Ratten (genetisch zuckerkranke Ratten) an einer Stelle in dem Körper, an der die Glucoseerfassung erwünscht ist, subkutan eine geeignete Menge an geeignet ausgelegten Nanohüllen in einem akzeptablen, pharmakologisch nicht störenden Träger injiziert werden. Alternativ könnte das injizierte Material Hydrogel bildendes Material wie z.B. 0,1 ml an 20% w/v PEGDA mit 1 μm Eosin Y in einer sterilen physiologischen Salzlösung aufweisen, die die Biokonjugat-Nanohüllen enthält. Das konjugierte Biomolekül könnte ein Molekül sein, das auf eine derartige Weise mit Glucose interagiert, dass ein Raman-aktives Spektralmerkmal bereitgestellt wird. Ein geeignetes Raman-aktives Reportermolekül könnte auf Wunsch verwendet werden. Nach der Injektion der Hydrogelvorläufer wird eine rasche Photopolymerisation (< 5 s) in situ durch eine Darbietung an Licht von einer Xe-Bogenlampe bewerkstelligt. Dieses Verfahren kann auf sichere Weise in direktem Kontakt mit Zellen und Geweben durchgeführt werden, ohne dass eine beobachtbare Beschädigung auftritt. Nachfolgend (z.B. zu Beginn des dritten postoperativen Tages) erfolgt eine Messung des Glucosepegels an der Stelle der Hydrogelimplantation durch Raman-Spektrosokopie. Gleichzeitig kann Blut von jedem Tier zur Überwachung des Blutglucosepegels mittels konventioneller Techniken entnommen werden. Das Raman-Signal wird mit einem Glucosepegel korreliert und kann durch einen Vergleich mit dem unter Verwendung konventioneller Techniken erhaltenen Blutglucosepegel in den zuckerkranken und normoglykämischen Ratten verifiziert werden.
Obgleich in dem obigen Beispiel ein direktes Glucoseerfassungsverfahren und ein Verfahren beschrieben worden sind, das eine Biokonjugation von Glucoseoxidaseenzymen für die Glucoseerfassung verwendet, versteht sich natürlich, dass andere Chemikalien oder Analyte auf ähnliche Weise überwacht und dass andere Proteine oder Biomoleküle auf ähnliche Weise an anderen Nanohüllen mit einem geeigneten Entwurf von Kern zu Hülle und optischen Eigenschaften adsorbiert werden können. Das vorliegende Beispiel beschreibt bevorzugte biologische In Vivo-Erfassungstechniken, die eine Bereichsstrahlung im Nahinfrarotbereich verwenden. Obgleich weniger als eine im Nahinfrarotbereich liegende Bereichsanregung und Nachweisverfahren bevorzugt, kann für viele Anwendungen stattdessen eine Strahlung im Sichtbarkeits- oder UV-Bereich zusammen mit geeignet entworfenen Nanohüllen verwendet werden, die SERS in dem Sichtbarkeits- oder UV-Bereich aufweisen und befriedigende spektroskopische Messungen bereitzustellen vermögen.
Beispiel 5. Auf Nanohüllen basierende Immunsorbattests (MSA)
Es ist zu erwarten, dass Biokonjugat-Nanohüllen signifikant zu einer Effizienzverbesserung einer Vielzahl von Immuntestverfahren beitragen. Auf Nanohüllen basierende Immunsorbattests stellen volloptische biologische Bestimmungen bereit, die beispielsweise zur Ersetzung von Tests vom ELISA-Typ verwendet werden können. Die Analysetechnik des enzymverknüpften Immunadsorbattests (ELISA) und der damit in Verbindung stehenden Techniken sind inzwischen die am besten bekannten Immuntests. Eine riesige Anzahl an kommerziellen Tests auf ELISA-Basis ist für den Nachweis von Antikörpern (Autoantikörper, antivirale oder antibakterielle Antikörper) oder von Antigenen (Serumproteine, Zytokine, Hormone, Arzneimittel, usw.) verfügbar (M. A. Kerr, et al., Hrsg. Immunochemistry Labfax BIOS Scientific Publishers, Ltd., Oxford, U. K. 1994). Sie ermöglichen den Nachweis von Antikörpern oder Antigenen mit einer beträchtlichen Genauigkeit und Empfindlichkeit. Die Stufen einer konventionellen ELISA-Prozedur beinhaltent im Allgemeinen das anfängliche Adsorbieren eines Antikörpers auf einem festen Träger. Nach der Inkubation mit einer Plasmaprobe wird ein Antikörper-Targetprotein-Komplex ausgebildet. Der abschließende Sandwich-Immuntest-Komplex weist typischerweise ein Indikatorenzym auf, welches optische Messungen der Antigenkonzentration ermöglicht. Diese Tests werden üblicherweise in Streifen oder Platten mit Mikrotitrierungsmulden mit flachen Böden durchgeführt und dauern mehrere Stunden. Da der abschließende Nachweis die Überwachung eines optischen Signals beteiligt (üblicherweise eine Farbveränderung oder Fluoreszenz des abschließenden Sandwich-Komplexes), führt dies zu bestimmten Zwängen bezüglich der Probenherstellung. So muss die Lösung beispielsweise in dem sichtbaren Bereich, in welchem die Farbveränderung erfasst werden würde, hoch transparent sein. Da die Zellmembrane mit der Proteinadsorption in dem Test stören, müssen die Proben azellulär sein, weshalb Blutproben zu Plasma verarbeitet werden müssen. Konventionelle Techniken vom ELISA-Typ tendieren dazu, sehr zeitraubend zu sein, weshalb sie in klinischen Settings, in welchen lange Zeitverzögerungen bei dem Erhalt von Testergebnissen problematisch sind, zu wenig verwendet werden.
In einem mit Nanohüllen modifizierten ELISA-Verfahren können wie in 8A dargestellt beispielsweise die anfänglichen Antikörper, anstatt an einem makroskopischen Träger gebunden zu werden, direkt mit geeignet ausgelegten Nanohüllen verknüpft werden. 8A ist eine konzeptuelle Illustration eines Antikörper-Nanohüllen-Konjugats vor dem Test. Wie in dem Fall des oben beschriebenen Glucosesensors werden die Nanohüllen so hergestellt, dass ihre Plasmonresonanz der Raman-Anregungswellenlänge im Nahinfrarotbereich entspricht, wodurch die resultierenden Spektren SERS-verstärkt werden. Dies ermöglicht die Analyse und/oder den Nachweis in Vollblutproben. Die biokonjugierten Nanohüllen werden mit genau bekannten Konzentrationen von spezifischen, an ihre Oberflächen gebundenen aktiven Antikörperspezies hergestellt, die unter Verwendung eines Bindungstests mit einem BCA-Test quantifiziert werden. Anschließend werden diese biokonjugierten Nanohüllen zu einer Fluidprobe hinzugefügt, die den Analyt enthält, wodurch wie in 8B dargestellt Antikörper-Targetprotein-Komplexe ausgebildet werden. Sowohl bevor wie nachdem der Analyt an die Antikörper angebunden worden ist, werden die Raman-Spektren unter Anregung im Nahinfrarotbereich überwacht. Es ist zu erwarten, dass diese beiden Stufen SERS-verstärkte Raman-Signale ergeben und die Möglichkeit für eine quantitative Analyse bieten. 8C zeigt analog eine Nanohülle für einen Sandwich-Immuntest, d.h. eine Anbindung eines konjugierten Antikörpers an den Antikörper-Targetprotein-Komplex. Bei einer Verwendung von Nanohüllen ist der "Sandwich"-Schritt nicht wesentlich, aber er stellt redundante Informationen bereit, die sich für die Bestätigung oder Kalibrierung einer Technik als besonders nützlich erweisen können. Die biologische Erfassung mit Nanohüllen kann mit jeder der in den 8A–C dargestellten Konfigurationen bewerkstelligt werden.
Ein weiterer Typ eines auf Nanohüllen basierenden In Vitro-Immuntests beinhaltet das Konjugieren eines komplexen Gemisches aus Biomolekülen mit einer Oberfläche der Nanohülle. Das Biomolekülgemisch weist das spezifische fragliche Antigen auf. Ein geeigneter Antikörper mit einer Affinität für das Anbinden an das Antigen wird anschließend als eine Probe für das Vorliegen des Antigen-Antikörper-Komplexes mittels SERS verwendet. Der Antikörper wird mit einem Reportermolekül oder Farbstoff markiert, der einen großen Raman-Querschnitt aufweist, wie dies z.B. für Dimethylaminoazobenzol (DAB) oder Rhodamin der Fall ist.
Wie in dem Fall der In Vivo-Erfassung von biologischen Analyten liegen auch bei der Verwendung der Raman-Spektrosokopie im Nahinfrarotbereich für In Vitro-Test-Techniken signifikante Vorteile vor. In auf Proteinadsorption basierenden Bestimmungen stören die Zellen die erwünschte Bindung und erzeugen fehlerhafte Antworten. Dies macht zusätzliche zeitraubende Trennungs- und Reinigungsschritte in der Probenherstellung vorgängig vor der biologischen Bestimmung notwendig. Ein im Nahinfrarotbereich liegender biologischer Test auf Raman-Basis untersucht diese Proben in einem spektralen Bereich hoher Transmissionsgrade, wodurch ein großer Anteil dieser zeitraubenden Probenvorbereitung entfällt.
Beispiel 6: Störungsfreiheit von Plasmaproteinen in Nanohüllen-SERS
Ein wichtiger Vorteil bei der Verwendung von Nanohüllen-SERS für In Vitro-Bestimmungen besteht darin, dass eine Störung des Nahinfrarot-SERS-Signals durch Fremdproteine in der biologischen Probe durch die Verwendung geeignet entworfener Nanohüllen oder konjugierter Nanohüllen vermieden werden kann. Dies wurde dadurch demonstriert, dass Proben aus mit Dimethylaminoazobenzol markierten-IgG (DAB-IgG) konjugierten Nanohüllen entweder in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), in Fetal Bovine Serum (FBS), oder in Vollblut suspendiert wurden und einer Strahlung im Nahinfrarotbereich unter Verwendung eines Nd:YAG-(Impuls)-Lasersystems mit 1064 nm ausgesetzt wurden. Das im Nahinfrarotbereich liegende SERS-Signal jeder Probe wurde gemessen und die Ergebnisse sind in den 9A–C dargestellt. 9A zeigt die gemessene Raman-Intensität gegenüber der Raman-Verschiebung (cm^–1) für die in PBS suspendierte Probe. Die 9B und 9C stellen die Ergebnisse dar, die mit ähnlichen Proben von mit DAB-IgG konjugierten Nanohüllen erhalten wurden, welche in FBS bzw. Vollblut suspendiert waren. Es wurde beobachtet, dass die Serumproteine das Nahinfrarot-SERS-Signal nicht stören (9B) und dass in Vollblut eine nur sehr geringe Abschwächung des Signals beobachtet wurde (9C). Die Nanohüllen verfügten über einen SiO₂-Kern mit einem Durchmesser von annähernd 200 nm, eine annähernd 10 nm dicke Goldhülle und einen Durchmesser von etwa 110 nm (Standardabweichung ± etwa 10%). Die maximale Absorbanzwellenlänge einer Gruppe von Ag/SiO₂-Teilchen wurde dahingehend optisch abgestimmt, der Laserwellenlänge von 1064 nm (Spitze) ungefähr zu entsprechen (±10–15 nm, vorzugsweise nicht mehr als etwa 10 nm außerhalb der Spitze). Die Konjugation des DAB-Ig wurde unter Verwendung einer Prozedur bewerkstelligt, die ähnlich zu dem oben beschriebenen Verfahren zum Konjugieren von Glucoseoxidase mit Nanohüllen ausfiel.
Die auf Raman-Spektrosokopie basierende In Vitro-biologische Bestimmung ermöglicht eine sehr rasche Quantifizierung von Plasmaproteinen einschließlich Antikörpern (wie z.B. antivirale oder antibakterielle Antikörper), Zytokine oder Arzneimittel. Es ist zu erwarten, dass diese Technik signifikant einfacher als konventionelle biologische Bestimmungen wie z.B. der ELISA-Test oder der Strahlungsimmuntest ausfällt. In dieser neuen Art biologischer Bestimmung wird Vollblut (entweder in einem Abstrich eines einzelnen Tropfens oder in einem Teströhrchen) mit den geeigneten Biokonjugat-Nanohüllen inkubiert und danach sofort mittels Raman-Spektrosokopie analysiert. Genaue Ergebnisse der biologischen Bestimmung sind in Minuten anstatt typischerweise in 24–48 Stunden erhältlich. Obgleich in dem obigen Beispiel eine anfängliche Anbindung eines Antikörpers an die Nanohüllen beschrieben worden ist, kann in vielen alternativen Immuntests ein Antigen statt eines Antikörpers anfänglich mit der Nanohülle verknüpft werden.
Die hier beschriebenen spezifischen Ausführungsformen verstehen sich lediglich als exemplarisch, nicht jedoch als einschränkend. Es sind viele Variationen und Modifikationen der hier spezifisch veranschaulichten Erfindung möglich. Dementsprechend wird der Rahmen der Erfindung nicht durch die obige Beschreibung, sondern ausschließlich durch die nachfolgenden Ansprüche begrenzt.

Claims

Verfahren zum Bestimmen eines biologischen Analyts von Interesse in einer Probe, jedoch nicht umfassend Verfahren zur Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers mittels Chirurgie oder Therapie oder am menschlichen oder tierischen Körper ausgeführte Diagnoseverfahren, wobei im Zuge des Verfahrens: mindestens eine optisch abgestimmte Nanohülle ausgewählt wird, die eine maximale Absorptions- oder Streuwellenlänge hat, die im wesentlichen der Wellenlänge einer gewünschten Quelle elektromagnetischer Strahlung entspricht, wobei die besagte Nanohülle ein Biomolekül aufweist, welches in der Lage ist, sich mit dem mit der Oberfläche der Nanohülle verknüpften Analytteilchen zu verknüpfen; mittels des verknüpfenden Biomoleküls der mindestens einen Nanohülle mindestens ein Molekül des Analyts in der Probe zugeordnet wird, optional in Anwesenheit eines Reportermoleküls, um so einen Analyt/Nanohüllen-Komplex oder einen Reporter/Analyt/Nanohüllen-Komplex zu bilden, der in der Lage ist, bei Bestrahlung bei der besagten Wellenlänge ein Raman-Signal zu erzeugen; der Komplex mit einer einfallenden elektromagnetischen Strahlung der besagten Wellenlänge bestrahlt wird, so dass eine oberflächenverstärkte Raman-Streuung induziert wird; und ein Ramanstreusignal des Komplexes erfasst wird; und das Streusignal mit dem Vorhandensein und/oder der Menge des Analyts in der biologischen Probe korreliert wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, bei welchem das Biomolekül Glucoseoxidase ist und das Analyt Glucose ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, bei welchem das Biomolekül ein Antikörper ist und das Analyt ein Target-Antigen für den Antikörper ist.
Verfahren gemäß einem er Ansprüche 1 bis 3, bei welchem die Wellenlänge eine Wellenlänge im nahen Infrarotbereich ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, bei welchem die Wellenlänge zwischen 800 bis 1300 nm oder zwischen 1600 und 1850 nm liegt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, bei welchem das Analyt eine chemische Verbindung, ein Biomolekül, oder ein Biomolekülkonjugat ist.
Verfahren gemäß Anspruch 6, bei welchem das Biomolekül aus Proteinen, Peptiden, Oligonukleotiden und Polysacchariden ausgewählt ist.
Verfahren gemäß Anspruch 7, bei welchem das Protein einen Antikörper aufweist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, bei welchem das mindestens eine Analytbindungsmolekül ein Gemisch von Arten von Biomolekülen ist, die mit der Hülle konjugiert sind.
Verfahren gemäß Anspruch 1, bei welchem das Biomolekül ein Antigen umfasst.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei welchem die Hülle ein Metall umfasst, das aus der aus Gold und Silber bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei welchem der Kern ein Material umfasst, welches aus der aus Siliziumdioxid, Goldsulfid, Titandioxid, Polymethylmethacrylat (PMMA), Polystyrol und Dendrimeren bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verfahren gemäß Anspruch 11, bei welchem der Kern Siliziumdioxid umfasst und die Hülle Gold umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 11, bei welchem der Kern Goldsulfid umfasst und die Hülle Gold umfasst.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei welchem das Teilchen einen Durchmesser von bis 5 μm, einen Kerndurchmesser von 1 nm bis weniger als 5 μm und eine Hüllendicke von 1 bis 100 nm aufweist.
Verfahren gemäß Anspruch 15, bei welchem der Kern einen Durchmesser von 1 nm bis 2 μm hat, die Hülle weniger als 40 nm dick ist und mit dem Kern mittels eines Vernetzungsmoleküls verknüpft ist.
Verfahren gemäß Anspruch 16, bei welchem das Teilchen einen Durchmesser von etwa 210 nm hat, einen SiO₂-Kern mit einem Radius von etwa 100 nm aufweist, eine Goldhülle mit einer Dicke von etwa 10 nm, einem Verhältnis von Kernradius zu Hüllendicke von etwa 10 : 1 und einer maximalen Absorbanzwellenlänge von etwa 1064 (SD ± 10 nm) aufweist.
Verwendung bei der Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Verwendung bei einem Diagnoseverfahren zum Bestimmen eines biologischen Analyts von Interesse in einer Probe einer Zusammensetzung bestehend aus: mindestens einer optisch abgestimmten Nanohülle mit einer maximalen Absorptions- oder Streuwellenlänge, die im wesentlichen der Wellenlänge einer gewünschten Quelle elektromagnetischer Strahlung entspricht, wobei die besagte Nanohülle ein Biomolekül aufweist, welches in der Lage ist, sich mit dem mit der Oberfläche der Nanohülle verknüpften Analytteilchens zu verknüpfen; wobei die Nanohülle in der Lage ist, mittels des verknüpfenden Biomoleküls die mindestens eine Nanohülle mit mindestens einem Molekül des Analyts in der Probe zu verknüpfen, wahlweise in Anwesenheit eines Reportermoleküls, um so einen Analyt/Nanohüllen-Komplex oder einen Reporter/Analyt/Nanohüllen-Komplex zu bilden, der in der Lage ist, bei Bestrahlung mit der besagten Wellenlänge ein Raman-Signal zu erzeugen.
Verwendung gemäß Anspruch 18, bei welchem das Biomolekül Glucoseoxidase ist und das Analyt Glucose ist.
Verfahren gemäß Anspruch 18, bei welchem das Biomolekül ein Antikörper ist und das Analyt ein Target-Antigen für den Antikörper ist.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 18 bis 20, bei welchem die Wellenlänge eine Wellenlänge im nahen Infrarotbereich ist.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 18 bis 20, bei welchem die Wellenlänge zwischen 800 und 1300 nm oder zwischen 1600 und 1850 nm liegt.
Verwendung gemäß Anspruch 18, bei welchem das Analyt eine chemische Verbindung, ein Biomolekül, oder ein Biomolekülkonjugat ist.
Verwendung gemäß Anspruch 23, bei welchem das Biomolekül aus Proteinen, Peptiden, Oligonukleotiden und Polysacchariden ausgewählt ist.
Verwendung gemäß Anspruch 24, bei welchem das Protein einen Antikörper umfasst.
Verwendung gemäß Anspruch 18, bei welchem das mindestens eine Analytbindungsmolekül ein Gemisch von Arten von Biomolekülen ist, die mit der Hülle konjugiert sind.
Verwendung gemäß Anspruch 18, bei welchem das Biomolekül ein Antigen umfasst.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 18 bis 27, bei welchem die Hülle ein Metall aufweist, das aus der aus Gold und Silber bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 18 bis 28, bei welchem der Kern ein Material aufweist, das aus der aus Siliziumdioxid, Goldsulfid, Titandioxid, Polymethylmethacrylat (PMMA), Polystyrol und Dendrimeren bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verwendung gemäß Anspruch 29, bei welchem der Kern Siliziumdioxid aufweist und die Hülle Gold aufweist.
Verfahren gemäß Anspruch 29, bei welchem der Kern Goldsulfid aufweist und die Hülle Gold aufweist.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 18 bis 31, bei welchem das Teilchen einen Durchmesser von bis zu 5 μm, einen Kerndurchmesser von 1 nm bis weniger als 5 μm und eine Hüllendicke von 1 bis 100 nm aufweist.
Verwendung gemäß Anspruch 32, bei welchem der Kern einen Durchmesser von 1 nm bis 2 μm hat, die Hülle weniger als 40 nm dick ist und mit dem Kern mittels eines Vernetzungsmoleküls verknüpft ist.
Verwendung gemäß Anspruch 33, bei welchem das Teilchen einen Durchmesser von etwa 210 nm hat, einen SiO₂-Kern mit einem Radius von etwa 100 nm aufweist, eine Goldhülle mit einer Dicke von etwa 10 nm, einem Verhältnis von Kernradius zu Hüllendicke von etwa 10 : 1 und einer maximalen Absorbanzwellenlänge von etwa 1064 (SD ± 10 nm) aufweist.